Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioqumica

Prtica: Propriedades Fsico-Qumicas de Protenas e Dosagem de Protenas pelo Mtodo do Biureto Alunos: Juliana Esteves Patrcia Sbano Renata Gudergues Ryanna Soares Turma: Fm 161 Professores: Rafael Mesquita e Renato Carvalho Data da realizao da prtica: 25/08/2010 Data da entrega do relatrio: 08/09/2010 Avaliao: Critrio: Apresentao Introduo Objetivos Mtodos Resultados Discusso Bibliografia Total: Nota:

I. Introduo i.i) Desnaturao de Protenas As protenas so molculas grandes, presentes em todos os seres vivo e formadas por sequncias de aminocidos ligados por ligaes peptdicas apresentando, portanto, uma estrutura nica e tridimensional. Essa estrutura o que determinar sua funo no organismo dos seres vivos. Quando a protena est em sua condio mais estvel termodinmicamente, exercendo uma funo especfica biolgica, denominamo-la nativa. Mas, as protenas podem sofrer um processo de desnaturao, ou seja, perder a sua conformao, j que as ligaes fracas responsveis pelas estruturas secundria, terciria e quaternria so rompidas (pontes dissulfeto e/ou ligaes de hidrognio e/ou interaes hidrofbicas e/ou pontes salinas), levando precipitao da protena, perda de sua conformao mais estvel e, consequentemente, a perda de sua funo biolgica. Agentes fsicos e qumicos podem levar a tal situao, como: temperatura, solventes orgnicos, altas concentraes salinas, cidos fortes e agentes caotrpicos. O aumento da temperatura rompe interaes por conta da agitao das molculas, os detergentes e a uria so capazes de romper interaes hidrofbicas, o pH influencia na carga lquida da protena, a fora inica interfere na solubilidade da protena frente a adio de diferentes quantidades de sal, aumentando ou diminuindo a camada de solvatao. A constante dieltrica provoca a exposio de radicais hidrofbicos em soluo apolar, processos de oxidao e reduo so responsveis pela quebra de pontes dissulfeto e o agente caotrpico responsvel por fazer pontes de hidrognio uma vez que apresenta em sua composio tomos eletronegativos, desestruturando, assim, a protena. importante realar que na desnaturao de protenas somente so rompidas as interaes fracas, e no as ligaes peptdicas, umas vez que essas tm carter de ligao dupla e s so rompidas por aes enzimticas catalticas ou em meio extremamente cido (H2SO4 ou HCl concentrados) associado a altas temperaturas. i.ii) Dosagem de Protenas pelo Mtodo do Biureto. O biureto uma substncia formada pela mistura de cobre, hidrxido de sdio e um complexo que estabiliza essa mistura. Dessa forma, quando em soluo que contenha protenas, essas formam um complexo prpura, em solues salina, uma vez que o on cuproso se liga ao nitrognio dos aminocidos. Assim, podemos estimar a concentrao da soluo que contenha protenas, quando colocamos a amostra em um espectrofotmetro, emitindo luz monocromtica de comprimento de onda de 540 nm. No deve ser utilizado o comprimento de onda de 270 nm, uma vez que a probabilidade de outros aminocidos ou substncias absorverem luz nesse comprimento e interferirem negativamente no resultado alta. Temos ainda que, pela lei de Lambert-Beer a absorbncia A diretamente proporcional concentrao do soluto absorvente. Podemos, ento, calcular a concentrao de uma amostra de protenas desconhecida fazendo uso da seguinte frmula;

Onde;

a absorbncia; o coeficiente de extino molar, o caminho ptico e C a

concentrao. Para comparar as concentraes das amostras, utilizado um tubo branco, contendo somente biureto. Dessa forma, o espectrofotmetro ajustado de modo que identifique absorbncia zero. Ao final das medies, possvel montar o grfico da curva padro da protena. 2

II. Objetivos: Propriedade Fsico-Qumicas das Protenas. Analisar o comportamento das protenas ovoalbumina e casena sob o efeito de diversos fatores: temperatura, solventes orgnicos, altas concentraes salinas, cidos fortes e agentes caotrpicos. Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto Atravs do mtodo biureto, com as leituras das absorbncias obtidas pelo espectofotrmetro construir um grfico da Curva Padro de Casena e com isso calcular a concentrao da soluo desconhecida de casena. III. Material e Mtodos. III. A. Material: Propriedade Fsico-Qumicas das Protenas. Material por grupo: 12 Tubos de Ensaio de Centrfuga 2 Pipetas de 2 mL 3 Pipetas de 5 mL 1 Pipeta de 10 mL 2 Pr-Pipetes Solues: 15 mL de Soluo de Uria 8M em um bquer 50 mL de Soluo Tampo Fosfato (PBS) pH 7,4 em um bquer 20 mL de Ovoalbumina (clara de ovo diluda em PBS 1:25 v/v) em um bquer 20 mL de Casena (diluda em PBS 1 mg/ml) em um bquer Acetona (na capela) com 1 Pipeta de 5 mL e 1 Pr-Pipete Soluo de cido Sulfrico com 1 Pipeta de 5 mL e 1 Pr-Pipete Equipamentos: 1 Banho Maria ALPAX ISO 9.001 (2000) Water Bath Logen Scientific Centrfuga Clnica TDL80-2B CENTRIBIO Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto Material por grupo: 7 Tubos de Ensaio 3 Pipetas de 2 mL 1 Pipeta de 5 mL 1 Pr-Pipete 1 Bquer de 50 mL 6 Cubetas 3

Solues: Soluo Padro de Casena (5 mg/mL) em PBS pH 7,4 Amostra de Casena de Concentrao desconhecida em PBS pH 7,4 Reagente do Biureto: CuSO4 . 5 H2O 0,15% p/V Tartarato Duplo de Sdio e Potssio 0,60% p/V KI 1,00% p/V PBS pH 7,4 (Tampo Fosfato com Salina em pH 7,4) KCl 2,680 mmol/L KH2PO4 1,470 mmol/L NaCl 0,137 mmol/L Na2HPO4 . 7 H2O 8,060 mmol/L Esquipamentos: Espectrofotmetro UVmini 1240 UV-VIS SPECTOR PHOMETERS/120V (E) SHIMADZU Vortex Marca: Vertex, modelo: QL-901 III. B. Mtodos: Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas: Com o auxlio de pipeta e pr-pipete, foram transferidas alquotas das solues de protenas para 10 tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo: Nmero do tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ovoalbumina 4 mL 2 mL 1 mL 2 mL 2 mL Casena 4 mL 2 mL 1 mL 2 mL 2 mL

Para a verificao do efeito da temperatura, os tubos 1 e 2 foram colocados em banho-maria fervente durante 10 minutos. Observou-se o aspecto das amostras, e reservou-se. Os tubos 3 e 4 foram levados para a capela, e l acrescentou-se 2 mL de acetona, homogeneizando os mesmos. O aspecto das amostras foi observado, e os tubos de ensaio foram reservados. Para a observao do efeito das altas concentraes salinas, foram transferidos 4 mL da soluo de (NH4)2SO4 para os tubos 5 e 6, homogeneizando-os. O aspecto das amostras foi observado, e estas foram reservadas. Para a visualizao do efeito de cidos fortes, foram transferidos, na capela, 2 mL de H2SO4 para os tubos 7 e 8, homogeneizando-os. Observou-se o aspecto das amostras, e reservou-se. Para os tubos 9 e 10, foram transferidos 2 mL da soluo de uria, homogeneizando-os. Os resultados foram observados e o material, reservado. 4

Feito isto, os tubos que sofreram alteraes foram separados. Com o auxlio de uma balana ordinria, estes tubos foram tarados e aps, centrifugados a 3000 RPM por 5 minutos em uma centrfuga clnica. Os resultados obtidos foram verificados. Foi descartado o sobrenadante dos tubos onde houve a formao de precipitado (pellet), com o devido cuidado, para que no houvesse a ressuspenso do pellet. Posteriormente, foram adicionados 6mL da soluo de tampo fosfato (PBS) aos precipitados e, com o auxlio do vortex, os mesmos foram homogeneizados, a fim de que houvesse a ressolubilizao dos precipitados. Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto Foram adicionados, a um bquer, aproximadamente 7 mL da soluo de casena, este foi levado para pipetar na bancada. Em outro bquer foram adicionados 10 mL da soluo de PBS, levando-o para pipetar na bancada. Com o auxlio de uma pipeta e pr-pipete, foram transferidas alquotas das solues de protena para tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo: Tubo PBS (mL) Soluo Padro de Casena (mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 Soluo [?] de Casena (mL) 2,0 Biureto (mL)

B 1 2 3 4 5

2,0 1,5 1,0 0,5 -

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Feito isto, os tubos foram homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente, o contedo de cada tubo foi transferido para uma cubeta, enchendo-a acima da metade. Esta cubeta foi levada para o espectofotmetro, para que fossem lidas as absorbncias, contra o tubo branco, no comprimento de onda de 540 nm. Os valores obtidos foram anotados. IV. Resultados: Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas: Obtivemos os seguintes resultados nos ensaios com a Ovoalbumina e a Casena: Nmero do Tubo 1 Ovoalbumina Casena Colorao Antes do Ensaio Incolor Ensaio Colorao Aps o Ensaio Soluo levemente esbranquiada Soluo incolor Soluo branca Soluo incolor 5

4 mL

Efeito da temperatura Efeito da temperatura Efeito de solventes orgnicos Efeito de solventes

2 3

2 mL

4 mL -

Incolor Incolor

2 mL

Incolor

1 mL

Incolor

1 mL

Incolor

2 mL

Incolor

orgnicos Efeito de altas concentraes salinas Efeito de altas concentraes salinas Efeito de cidos fortes Efeito de cidos fortes

2 mL

Incolor

2 mL

Incolor

10

2 mL

Incolor

Efeito de agentes caotrpicos Efeito de agentes caotrpicos

Soluo levemente esbranquiada Soluo com poucos precipitados Soluo esbranquiada homognea Soluo contendo muitos precipitados Soluo com um nico precipitado Soluo incolor

Aps a centrifugao e a pesagem dos tubos que sofreram alteraes, observamos que: Tubo 1 3 Colorao antes da centrifugao Soluo levemente esbranquiada Soluo branca Colorao aps da centrifugao Soluo incolor Formao de precipitados (pellet) ao fundo do tubo Formao de poucos precipitados (pellet) Formao de poucos precipitados (pellet) ao fundo do tubo Formao de precipitado (pellet) ao fundo do tubo Formao de precipitado (pellet) ao fundo do tubo Soluo incolor Pesagem 14,05 g 13,30 g

5 6

Soluo levemente esbranquiada Soluo com poucos precipitados Soluo esbranquiada homognea Soluo contendo muitos precipitados Soluo com um nico precipitado

15,60 g 15,88 g

14,51 g

14,65 g

13,90 g

Considerando que o tubo de ensaio contendo gua pesava 14,40 g. Por fim, aps adicionarmos o PBS aos tubos que continham precipitado, observamos: Tubos 3 Colorao aps a centrifugao Formao de precipitados Resultado aps adio de PBS No houve modificaes no 6

5 6

7 8

(pellet) ao fundo do tubo Formao de poucos precipitados (pellet) Formao de poucos precipitados (pellet) ao fundo do tubo Formao de precipitado (pellet) ao fundo do tubo Formao de precipitado (pellet) ao fundo do tubo

precipitado Houve ressolubilizao do precipitado Houve ressolubilizao do precipitado No houve modificaes no precipitado So houve modificaes no precipitado

Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto A partir do preparo dos tubos de ensaio com casena, PBS e biureto e a utilizao do espectrofotmetro, obtivemos os seguintes resultados: Tubo PBS (mL) Soluo Padro de Casena (mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 Soluo [?] de Casena (mL) 2,0 Biureto (mL) Abs (540nm)

B 1 2 3 4 5

2,0 1,5 1,0 0,5 -

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

0 0,101 Abs 0,161 Abs 0,241 Abs 0,323 Abs 0,135 Abs

A partir do valor da absorbncia e da concentrao de cada tubo, conseguimos desenhar uma curva padro da casena e, assim, calcular o valor da concentrao de casena desconhecida. - Clculos para obteno da quantidade de casena em cada tubo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

- Pela lei de Lambert-Beer: onde, no caso, o caminho ptico, que ser de 1cm, o comprimento da cubeta; tendo ento: . No caso, C a concentrao e A a absorbncia e assumir o valor da constante de proporcionalidade, dada por:

- Clculo para achar a concentrao da amostra com concentrao desconhecida: 7

Obs: a curva padro da casena est em anexo. V. Discusso: Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas: A ovoalbumina e a casena so protenas encontradas no ovo e no leite, respectivamente. Nos processos de desnaturao pudemos fazer algumas observaes e comparaes entre as duas. No primeiro efeito, o de temperatura, observamos que somente a ovoalbumina formou precipitado. Sabendo que o efeito da temperatura na desnaturao de protenas de provocar um aumento na vibrao molecular, causando a ruptura de algumas interaes fracas. Desse modo, podemos concluir que as interaes intra e intercadeias da cistena so mais difceis de serem quebradas, podemos congitar, ento, a presena de pontes dissulfeto, cuja ruptura ocorre principalmente por oxidao. A colorao levemente esbranquiada no tubo contendo ovoalbumina pode nos dar a concluso da ruptura de interaes fracas. Os resultados quando adicionados solventes orgnicos, permitiu-nos concluir que a ovoalbumina uma protena ou apresenta partes hidrofbicas, pois o solvente orgnico apresenta caractersticas hidrofbicas, dessa forma, possibilitaria interaes hidrofbicas com a protena, resultando a mudana de sua conformao nativa e percipitando-a. A casena, por no ter apresentado modificaes quando adicionado o solvente, podemos concluir que no ou no possui parte hidrofbicas. No efeito das altas concentraes salinas, percebemos precipitados nos dois tubos. Isso porque o efeito do aumento excessivo da concentrao salina (tambm conhecido como salting out) interfere nas cargas eletrostticas da protena alm de diminurem a camada de solvatao da mesma, levando a sua precipitao. Foi possvel a ressolubilizao das amostras uma vez que foi adicionado o PBS. Tornando o processo reversvel. O efeito causado pela adio de cidos fortes explicado e visto nos dois tubos, pois um meio altamente cido apresenta grande concentrao de ons positivos (H3O+) esse excesso de carga influencia na carga lquida da protena, causando sua desnaturao. Por fim, o efeito causado pela adio de agentes caotrpicos, no apresentou efeito, praticamente, uma vez que o precipitado observado no tubo contendo ovoalbumina poderia ser uma impureza. Algumas literaturas consideram a temperatura como agente caotrpico, mas consideremos o agente caotrpico sendo a uria, um composto txico ao organismo e que apresenta amnia em sua composio, a qual favorece o rompimento de interaes fracas, principalmente pela formao de pontes de hidrognio entre amostra e agente, desnaturando a protena. Ao observamos mudanas aps a prtica do vortex nos tubos que apresentavam precipitados formados por cido forte e solvente orgnico porque o PBS no apresento resultados devido a desnaturao irreversvel causada por tais efeitos. Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto O mtodo do biureto bastante eficiente quando se deseja encontrar a concentrao de uma amostra de protena. Com o auxlio de um espectrofotmetro e a aplicao da lei de Lambert-Beer, observando a absorbncia, e tendo outras solues para ser possvel a produo da curva padro da protena ou possuir o coeficiente de extino molar (tambm chamado de coeficiente de absoro molar) que constante a um dado comprimento de onda. 8

Podemos afirmar, a partir da prtica, que, levando-se em conta o mesmo comprimento de onda e o mesmo comprimento da cubeta, a absorbncia diretamente proporcional a concentrao. No caso, a concentrao da soluo padro era constante, o que variava era a massa de casena presente na amostra. Verificamos, ento, a veracidade da Lei de Lambert-Beer apresentada na introduo do relatrio. O tubo branco utilizado teve a funo de calibrar o espectrofotmetro para a medida das solues a partir da soluo do tubo branco. VI. Referncias bibliogrficas LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry vol. I. 4th Edition. W H FREEMAN & Co., 2004. 1125p. ZAIA, D.A.M; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J.; Determinao de Protenas Totais Via Espectrofotometria: Vantagens e Desvantagens dos Mtodos Existentes. So Paulo.1998. 7f Disponvel em <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040421998000600020&script=sci_arttext&tlng=es>. Acesso em 6 de setembro de 2010. QUINTINO, D.; SAMPAIO, F.; CHUCHA, A. Doseamento das Protenas pelo Mtodo do Biureto. Instituto Politcnico de Santatm Escola Superior Agrria. Curso de Engenharia da Produo Animal Bioqumica. Disponvel em: http://www.slideshare.net/dnpquintino/doseamentodas-protenas-pelo-mtodo-do-bioreto-relatrio-bioqumica . Acessado em 6 de setembro de 2010. Bioqumica/Bioqumica I Prtica Introduo Terica (espectrofotometria). Disponvel em: http://www.anaseca.uac.pt/pdf_bioquimica/introd_espectrof.pdf. Acessado em 7 de setembro de 2010. AIRES-BARROS, M.R.; Biocatlise em Solventes Orgnicos. Centro de Engenharia Biolgica e Qumica. Lisboa. Disponvel em: http://deqb.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/BiocatSolOrg.pdf. Acessado em 7 de setembro de 2010. DE SOUZA, R.C.S.; Separao da Lisozima, Conalbumina e Ovoalbumina Presentes na Clara do Ovo: Aspectos Tecnolgicos e Termodinmicos. Viosa Minas Gerais Brasil. 2008. Disponvel em: http://www.tede.ufv.br/tedesimplificado/tde_arquivos/39/TDE-2008-0826T063324Z-1284/Publico/texto%20completo.pdf . Acessado em 7 de setembro de 2010.