REVISO AVALIAO DA CONTAMINAO HUMANA POR HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS (HPAS) E SEUS DERIVADOS NITRADOS (NHPAS): UMA REVISO

METODOLGICA Annibal D. Pereira Netto Departamento de Qumica Analtica - Instituto de Qumica - Universidade Federal Fluminense - Outeiro de So Joo Batista, s/n - Valonguinho - 24020-150 - Niteri - RJ Josino C. Moreira, Ana Elisa X. O. Dias Centro de Estudos da Sade do Trabalhador e Ecologia Humana - Escola Nacional de Sade Pblica - Fundao Oswaldo Cruz (CESTE/ENSP/FIOCRUZ) - Av Brasil, 4365 - 21041-210 - Rio de Janeiro - RJ Graciela Arbilla Departamento de Fsico-Qumica - Instituto de Qumica - Universidade Federal do Rio de Janeiro - Ilha do Fundo - Rio de Janeiro - RJ Luiz Filipe V. Ferreira, Anabela S. Oliveira Centro de Qumica-Fsica Molecular - Complexo Interdisciplinar - Instituto Superior Tcnico - Av. Rovisco Pais, 1096 Lisboa - Portugal Jiri Barek Department of Analytical Chemistry - Charles University - Albertov 2030 - Prague - Czech Republic Recebido em 19/10/99; aceito em 30/5/00

EVALUATION OF HUMAN CONTAMINATION WITH POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAHS) AND THEIR NITRATED DERIVATIVES (NHPAS): A REVIEW OF METHODOLOGY. Polycyclic aromatic hydrocabons (PAHs) and their nitroderivatives (NPAHs) are ubiquitous in the environment and they are produced in several industrial and combustion processes. Some of these compounds are potent carcinogens/mutagens and their determination in biological samples is an important step for exposure control. A review of the analytical methodologies used for the determination of PAHs and their metabolites in biological samples is presented. Keywords: polycyclic aromatic hydrocarbons and nitroderivatives; human contamination; carcinogenic/mutagenic coumpounds.

INTRODUO Os hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs) constituem uma famlia de compostos caracterizada por possurem 2 ou mais anis aromticos condensados. Estas substncias, bem como seus derivados nitrados e oxigenados, tm ampla distribuio e so encontrados como constituintes de misturas complexas em todos os compartimentos ambientais. De maneira geral, tanto os HPAs quanto seus derivados esto associados ao aumento da incidncia de diversos tipos de canceres no homem1-4. A elevada taxa de mortalidade (cerca de 6,5 milhes de pessoas morrem de cncer anualmente) e o fato de que os tratamentos para estas doenas so dispendiosos, demorados e normalmente trazem muito sofrimento aos doentes, expem claramente os benefcios potenciais que o entendimento, a avaliao e o controle da exposio humana a substncias que possuam atividade carcinognica/mutagnica podem trazer, particularmente quando sabe-se que a grande maioria dos canceres resulta de interaes genticas e ambientais, sendo as causas externas (ambientais), em conjuno com fatores de suscetibilidade adquirida, as mais importantes73. No caso dos HPAs e seus derivados, isto feito geralmente atravs do monitoramento dos nveis ambientais desta substncias, do conhecimento das suas vias de penetrao no organismo, de seu metabolismo, bem como da avaliao precoce de seus efeitos biolgicos. Vrios componentes deste grupo so capazes de reagir diretamente, ou aps sofrerem transformaes metablicas, com o DNA, tornado-se potenciais carcingenos e eficientes mutgenos1,5-9. Dentre suas inmeras fontes, podem ser citados os processos de combusto de material orgnico (particularmente a exausto de motores a diesel ou a gasolina), a queima de carvo, as fotocopiadoras, a exausto de plantas de incinerao de
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rejeitos, a fumaa de cigarro alm de vrios processos industriais como, por exemplo, a produo de alumnio e a gaseificao do coque, etc3,8-13. A composio e a complexidade das misturas de HPAs dependem das fontes emissoras. Em geral essas misturas so bastante complexas, contm uma grande variedade de HPAs em diferentes nveis de concentrao. Os HPAs, por suas ubiqidades, constituem uma ameaa potencial para a sade de toda a populao. No entanto, alguns grupos populacionais, como por exemplo aqueles constitudos por pessoas que residem ou trabalham em ambientes diretamente influenciados por estas fontes, esto submetidos a um risco maior. A seriedade dos efeitos que a exposio aos HPAs pode ter sobre o organismo humano fez com que especial ateno fosse dedicada ao desenvolvimento de metodologias analticas hbeis para identificao e determinao de bioindicadores da concentrao absorvida (dose interna), da concentrao presente nos stios de ao biolgica crticos (dose biolgica efetiva) assim como de quaisquer efeitos precoces. Em todos os casos, a variabilidade da composio das misturas, a complexidade das amostras e as baixas concentraes que, em geral, so observadas, exigem a utilizao de mtodos analticos altamente seletivos e de elevada sensibilidade. Esta reviso apresenta alguns aspectos do metabolismo humano destas substncias e sumariza as principais metodologias analticas utilizadas para avaliao da exposio humana, procurando realar a necessidade de maiores investimentos nesta rea. ABUNDNCIA, CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS E EXPOSIO HUMANA A exposio humana aos HPAs se d principalmente atravs da contaminao ambiental. Estudos realizados na Inglaterra
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estimam que um total de cerca de 54.000 toneladas destas substncias contaminam atualmente o ambiente no territrio do Reino Unido. Processos de combusto de matria orgnica seriam responsveis pela introduo de cerca de 1000 toneladas/ano, das quais os veculos motorizados responderiam por cerca de 80 toneladas/ano. Esta contribuio mais significativa (> 35%) nas grandes cidades11,14,15, mas outros processos, como incndios em florestas, tambm podem emitir quantidades significativas de HPA para atmosfera77-79. Os nveis de HPAs encontrados em amostras ambientais e biolgicas so mostrados da Tabela 1. Tabela 1. Nveis de HPAs encontrados em amostras ambientais e biolgicas46. Tipo de amostra Ar Solo gua Plantas Alimentos Concentrao 1,3 a 500 ng/m3 0,8 ng/kg 100 mg/kg 2,5 a 500 ng/L < 150 ug/kg 0,1 A 20 ug/kg

Em geral, as concentraes ambientais de seus derivados nitrados e oxigenados so cerca de 100 a 1000 vezes inferiores quelas dos correspondentes HPAs. Algumas propriedades fsico-qumicas importantes para se entender o comportamento ambiental e biolgico de representantes do grupo dos HPAs so mostradas na Tabela 2. Como pode ser observado na Tabela 2, estas substncias so pouco solveis em gua e, em geral, sua solubilidade diminui com o aumento do numero de anis. HPAs apresentam tambm,

coeficientes de partio octanol/gua superiores a 1000, demonstrando grande afinidade lipoflica que aumenta com o nmero de anis aromticos da molcula. Por outro lado, a volatilidade destes compostos diminui com o aumento do peso molecular e, consequentemente, HPAs de pesos moleculares mais baixos so mais volteis e apresentam maiores presses de vapor que os mais pesados. O mesmo observado com os valores da constante de Henry que diminui com o aumento do peso molecular destas substncias16. Como conseqncia destas propriedades, na atmosfera, estas substncias podem ser encontradas tanto na fase gasosa quanto adsorvidas no material particulado. A concentrao de cada componente em ambas as fases funo de sua volatilidade e de sua afinidade pelas superfcies das partculas atmosfricas. No solo, HPAs encontram-se geralmente adsorvidos no material constituinte e ficam retidos nas camadas superiores. As meias vidas dos compostos de maior peso molecular so relativamente elevadas e indicam que sua degradao lenta37. Em virtude de suas propriedades fsico-qumicas e da grande distribuio ambiental, o risco de contaminao humana por estas substncias significativo. De fato, devido ao seu carter lipoflico, HPAs e seus derivados podem ser absorvidos pela pele, por ingesto ou por inalao, sendo rapidamente distribudos pelo organismo. A quantidade absorvida por inalao varia de acordo com o grau de contaminao atmosfrico, que est diretamente relacionado com a urbanizao, ao trfego de veculos automotores (principalmente motores diesel) e com o tipo e a industrializao da rea. Em ambientes fechados, a fumaa de cigarro e as fontes de aquecimento podem contribuir para o aumento dos nveis ambientais de HPAs. Alguns processos industriais (Tabela 3) tambm contribuem significativamente para o aumento da concentrao atmosfrica destas substncias.

Tabela 2. Propriedades fsico-qumicas de alguns HPAs e NHPAs16,5. Substncia Naftaleno Acenaftileno Fluoreno Fenantreno Antraceno Pireno Benzo[a]pireno Benzo[ghi]perileno Coroneno 1-Nitronaftaleno 1Nitropireno (*) d = dias e a = ano Tabela 3. Evidncias de carcinogenicidade e/ou mutagenicidade de alguns processos industriais e misturas complexas19. Processos/misturas Produo de alumnio Gaseificao de carvo Produo de coque Produo de eletrodos de carbono Betumes (extratos) Negro de carvo Exausto de motores a diesel Exausto de motores a gasolina leos minerais (no ou pouco tratados) leo de xisto Fuligem Evidncias epidemiolgicas Suficientes Suficientes Suficientes Suficientes Inadequadas Limitadas Inadequadas Suficientes Suficientes Suficientes Evidncias experimentais Suficientes Suficientes Suficientes Suficientes suficientes suficientes Classificao pelo IARC; grupo 1 1 1 1 2 B 2 B 2 A 2 B 1 1 1 Peso molecular (g/mol) 128 152 166 178 178 202 252 276 300 173 247 Presso de vapor (Pa, 25o C) 36,8 4,14 0,71 0,113 0,0778 0,0119 2,13x10-5 2,25x10-5 1,98x10-10 6,38x10-6 Log K(o/a) 3,37 4,00 4,18 4,57 4,54 5,18 6,04 6,5 6,75 3,32 4,69 Constante de Henry 1,74x10 -2 3,39x10 -3 3,18x10 -3 1,31x10 -3 1,60x10 -3 3,72x10 -4 1,86x10 -5 3,03x10 -5 1,72x10 -7 Solubilidade em gua (mg/L) 31 16,1 1,9 1,1 0,045 0,132 0,0038 0,00026 0,00014 18 tempo de meia vida no solo * <125 d 43 60 d 32 d 2 d 50 d 1,3 a 210 d 5,2 a 269 d 8,2 a <9,5 a -

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A absoro drmica bastante importante em algumas atividades industriais, podendo ser a responsvel por at 90% da quantidade absorvida pelo organismo17,18. Os alimentos so considerados outra importante fonte de exposio humana, tanto devido formao de HPAs durante o cozimento, quanto devido deposio atmosfrica sobre gros, vegetais e frutas. Estudos realizados com pessoas no fumantes e no ocupacionalmente expostas estimam uma ingesto diria de cerca de 3,12 g de 8 HPAs (benzo[a]antraceno, criseno, benzo[b] fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, indeno[1,2,3-cd]pireno, dibenzo[a,h]antraceno e benzo[ghi]perileno) sendo os alimentos, responsveis por cerca de 96% desta ingesto. O restante absorvido diretamente do ar (1,6%), da gua (0,2%) e do solo (0,4%). Fumantes que consomem 1 mao de cigarros sem filtro por dia podem ingerir um adicional entre 1 - 5 g17. Quando absorvidos diretamente da fase gasosa, os HPAs so rapidamente metabolizados e eliminados pelo organismo (o BaP, por exemplo, eliminado em cerca de 1 hora). Entretanto, quando esto associados a partculas respirveis, esta eliminao bem mais demorada podendo levar semanas. Por serem rapidamente metabolizados nos tecidos corpreos, a bioacumulao no observada, mesmo nos tecidos ricos em gorduras. As maiores rotas de eliminao destas substncias aps metabolismo heptico, so as fezes e a urina. GENOTOXICIDADE (MUTAGENICIDADE E CARCINOGENICIDADE) DOS HPAS E DE SEUS DERIVADOS O primeiro indcio de carcinogenicidade qumica de produtos de combusto orgnica foi publicado em 1775, quando foi observada uma maior incidncia de canceres em limpadores de chamins19. Muitos anos depois desta publicao esta atividade carcinognica foi atribuda presena de benzo[a]pireno (BaP) nas amostras.

Posteriormente foi comprovado experimentalmente que a presena do BaP, por si s, no justificava toda a atividade carcinognica observada nestas amostras, sendo este excesso de carcinogenicidade, atribudo presena conjunta de outros membros da famlia dos HPAs e de alguns de seus derivados, principalmente nitroderivados. Dados sobre a carcinogenicidade, genotoxicidade e mutagenicidade de alguns HPAs e seus derivados encontram-se na Tabela 4. Estudos posteriores conduziram identificao de vrios processos industriais e misturas complexas dotados de potencial mutagnico e/ou carcinognico atribudos a presena destas substncias. Alguns destes processos e misturas so mostrados na Tabela 3. METABOLISMO DOS HPAS E DE SEUS DERIVADOS NITRADOS A biotransformao dos HPAs envolve uma srie de enzimas que catalisam reaes de oxidao, reduo e hidrlise (oxigenases de funo mista, citocromo P 450, NADPHcitocromo-c-redutase) e de enzimas que catalisam reaes de conjugao (sulfotransferase, epxido hidrolase, glutation-Stransferase e UDP-glicotransferase). Estas enzimas esto distribudas em todos os tecidos orgnicos75. Monoxigenases dependentes do citocromo P 450 (CYP1A) so responsveis pela oxidao enzimtica dos HPAs. Elas agem principalmente sobre a regio de elevada densidade eletrnica ou a nvel da regio angular da molcula do HPA formando xidos de arenos (epxidos) que podem espontaneamente formar fenis ou, por ao das epxido hidrolases, produzirem di-hidrodiis vicinais46,75. Destes fenis, alguns so oxidados a quinonas e outros podem sofrer nova epoxidao levando formao de epxidos secundrios (di-hidrodiolepxidos). O carbono benzlico dos dihidrodiolepxidos capaz de reagir com as bases nucleoflicas

Tabela 4. Dados relativos aos efeitos carcinognicos, genotxicos e mutagnicos de alguns HPAs e NHPAs37,5. HPA Fluoreno Fenantreno Antraceno Fluoranteno Pirene Benzofluorenos Benzofluorantenos Ciclopenta[cd]pireno Benzo[a]antraceno Criseno Trifenileno Benzo[e]pireno Benzo[a]pireno Perileno Indeno[1,2,3-cd]pireno Dibenz[ac]antraceno Dibenz[a]antraceno Dibenz[aj]antraceno Benzo[ghi]perileno Antantreno Coroneno Dibenzo[ae]fluoranteno Dibenzopirenos 2-nitronaftaleno 1-nitropireno Dinitropireno Carcinogenicidade I I N N N I S L S L I I S I S L S L I L I L S N I Genotoxicidade L L N L L I I S S L I L S I I S S I I I I N I L S Mutagenicidade + + + ? + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Dados disponveis para a comprovao do efeito: S = suficientes; I = insuficientes; L = limitados; N = no carcinognico Genotoxicidade foi avaliada atravs dos testes de deteriorao do DNA; aberrao cromossmica, mutagenicidade. Mutagenicidade (teste de Ames): + (positivo); - (negativo); ? (inconclusivo)

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do DNA, notadamente a guanidina e, eventualmente, iniciar um processo mutagnico. Reaes semelhantes so observadas com outras macromolculas tais como a albumina e a hemoglobina46,75. Os di-hidrodiolepxidos so altamente instveis e, quando no reagem rapidamente, so hidrolizados a tetris, cuja formao pode ser utilizada como bioindicador da formao de diolepxidos. Os fenis, as quinonas e os di-hidrofenis podem sofrer conjugao formando sulfatos e glucuronatos. Os xidos de arenos, as quinonas e os diolepxidos tambm reagem com o glutation e podem ser eliminados atravs da urina sob a forma de tioteres. Uma representao simplificada do metabolismo do BaP pode ser vista na Figura 1.

REATIVIDADE COM MACROMOLCULAS BIOLGICAS Alguns trabalhos relacionando a atividade carcinognica/ mutagnica dos vrios HPAs com suas estruturas qumicas tm sido publicados23-34. Conforme dito anteriormente, os HPAs no so mutagnicos diretos e necessitam sofrer ativao metablica preliminar para se tornarem capazes de reagir com o DNA e outras macromolculas. Quatro mecanismos35 tm sido propostos para explicar a ativao de HPAs: 1) oxidao enzimtica seguida de hidrlise com a formao de diolepxidos ( o mecanismo mais aceito); 2) formao de steres benzlicos, eletroflicos, atravs de uma srie de reaes de substituio34; 3) produo de radicais catinicos atravs da oxidao enzimtica com envolvimento de um eltron e 4) de-hidrogenao enzimtica dos metablitos di-hidrodiis produzindo quinonas capazes de reagirem diretamente com o DNA ou capazes de reagirem com O2 gerando espcies oxigenadas reativas, como radicais hidroxilas ou nions superxidos que atacam o DNA, conforme representado nas Figura 2. Estes mecanismos no so excludentes, podendo ocorrer simultaneamente35.

Figura 1. Representao esquemtica simplificada do metabolismo de benzo[a]pireno em humanos 75.

Os NHPAs so, comprovadamente, potentes mutgenos para Salmonella typhimurium (teste de Ames), para bactrias e clulas eucariticas.(clulas de ovrio de hamsters, clulas epiteliais de ratos -RL4). Estas substncias so capazes de provocar mutaes mesmo sem sofrerem qualquer tipo de ativao metablica. Mononitro derivados so geralmente metabolisados atravs de processos oxidativos gerando espcies semelhantes quelas formadas pelos HPAs (diolepxidos e aminodiolepxidos) capazes de formar adutos por reao com a deoxiguanosina. Sofrem igualmente reduo do grupo nitro a N-hidroxilamina com formao de um intermedirio capaz de reagir com C-8 da deoxiadenosina formando adutos21. Os dinitro derivados sofrem geralmente reduo de um dos grupos nitro envolvendo um ou dois eltrons. Em geral os dinitroderivados so mais potentes mutgenos que os mononitro. Estudos tm atribudo aos NHPAs cerca de 50% da mutagenicidade observada em material particulado coletado em residncias urbanas22.

Figura 2. Representao esquemtica dos diversos mecanismos de formao de adutos entre HPAs e DNA35.

De acordo com a hiptese atualmente mais aceita, a ligao entre os diolepxidos, resultantes da ativao metablica destas substncias e o DNA so favorecidas quando diolepxidos vicinais so formados (regio de baa), principalmente nas molculas no lineares, como o benzo[a]antra ceno, cujo produto de ativao metablica pode ser visto na Figura 3. provvel que o ataque eletroflico do DNA aos epxidos ocorra atravs de um mecanismo do tipo SN1 e se processe atravs de estados de transio nos quais os hidrocarbonetos exibem significante carter de on carbonium. Assim a reatividade com o DNA e, consequentemente a capacidade carcinognica destes

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Tabela 5. Bioindicadores utilizados na avaliao da exposio a HPAs e seus derivadosadaptada das referncias 42,44. Bioindicador Substncia qumica e/ou seus metablitos em material biolgico (urina, etc) Mutagenicidade urinria Tioteres urinrios Adutos com protenas Adutos com DNA (RNA) Protenas oncogncias Mutaes celulares Aberraes cromossmicas Troca de cromatides irms Microncleos Sntese no programada de DNA Tipo de informao

Figura 3. Representao esquemtica do benz[a]antraceno com diolepxido na regio de baa (A) e de fjord ou regio K (B) adaptada
das referncias 28,30.

compostos, estaria diretamente relacionada com a facilidade de formao destes ons. De fato, a reatividade observada para os metablitos possuindo diolepxido na regio de baa comparada com aqueles que a possuem na regio K (fjord) mostram maior reatividade dos primeiros, provavelmente como resultado do acesso mais fcil aos orbitais 13. Algumas relaes tm sido encontradas entre modelos tericos que envolvem alguns parmetros moleculares como o orbital molecular vago de mais baixa energia, a hidrofobicidade e o numero de anis aromticos e a mutagenicidade36 Resultados de testes laboratoriais realizados com diversos HPAs para a verificao de suas atividades carcinognicas, mutagnicas ou genotxicas mostraram que os efeitos dos diferentes compostos so variveis, como mostrado na Tabela 4. Tambm pode ser observado nos dados da Tabela 4 que a capacidade carcinognica e mutagnica dos diferentes HPAs significativa para aqueles que possuem mais de 4 anis aromticos fundidos e maior para os que tm 5 ou 6 anis. A substituio de hidrognio por grupos qumicos, tambm pode afetar drasticamente a atividade dos HPAs dependendo da posio onde a substituio se d e do grupo substituinte37. A presena simultnea de vrios destes compostos no ambiente faz com que a avaliao de suas genotoxicidades a partir de amostras ambientais seja muito difcil. Isto tambm dificulta estudos de correlao pois a via de introduo de HPAs no organismo influencia seu poder carcinognico/mutagnico bem como a localizao dos tumores. Estas caractersticas variam de uma espcie animal para outra38 e na espcie humana, a via respiratria considerada a mais importante, particularmente para indivduos ocupacionalmente expostos, mas em muitos casos, a via drmica pode ser to ou mais importante39. Muitas destas substncias tm efeito negativo sobre o sistema imunolgico animal, caracterstica que parece estar associada capacidade carcinognica40. Um esquema proposto para a carcinognese por exposio ambiental considera as seguintes etapas: exposio ambiental, ativao metablica, formao de adutos entre os HPAs e o DNA, mutao em genes crticos como, por exemplo, o P 53 (gene repressor de tumor) e sucesso de mutaes em outros genes41. importante realar que o aparecimento do cncer um processo que envolve vrias etapas (no apenas a formao de adutos com o material gentico), sendo tambm influenciado por suscetibilidade individual e outros fatores, tais como gnero, etnia, idade, estado de sade, nutrio e polimorfismo gentico73,75. Em geral, maior concentrao de adutos HPAs-DNA encontrada em fumantes ou pessoas ocupacionalmente expostas75. MONITORAMENTO BIOLGICO DA EXPOSIO A HPAS E A SEUS DERIVADOS NITRADOS O monitoramento biolgico da exposio a estas substncias pode ser feito atravs da avaliao das mesmas como mistura ou individualmente, da determinao da concentrao de seus metablitos em fluidos biolgicos ou ainda atravs do acompanhamento de um efeito bioqumico resultante de sua presena no organismo, como aqueles apresentados na Tabela 5.
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Dose interna* Dose interna Dose interna Dose biolgica efetiva** Dose biolgica efetiva Dose biolgica efetiva Efeito biolgico precoce Efeito biolgico precoce Efeito biolgico precoce Efeito biolgico precoce Efeito biolgico precoce

* - Um indicador biolgico de dose interna indica a quantidade total da substncia introduzida no organismo. usualmente a prpria substncia ou um de seus metablitos presentes em fluidos biolgicos. ** - Um indicador de dose biolgica efetiva indica a quantidade da substncia que atingiu sitios biolgicos significativos. Geralmente esta indicao dada atravs de produtos de interao da substncia ou seus metablitos com macromolculas celulares (DNA, RNA ou proteinas)42. Tcnicas Cromatogrficas Tcnicas cromatogrficas de cromatografia lquido de alta eficincia com deteco fluorimetrica (CLAE-FLUO) e de cromatografia gs de alta resoluo acoplada espectrometria de masssas (CGAR-EM) tm sido utilizadas para estudos da exposio humana a HPAs atravs da determinao urinria alguns de seus metablitos (fenantrenos hidroxilados43 e principalmente, de 1-hidroxipireno44). Em geral estas metodologias so bastante simples, no trabalhosas e podem ser utilizadas rotineiramente, como aquela preconizada para a determinao do 1-hidroxipireno. Entretanto a utilizao destes procedimentos tcnicos bastante restrita como metodologia de avaliao geral, uma vez que a composio das misturas de HPAs bastante varivel e a avaliao de apenas um metablito pode dar origem a uma avaliao equivocada da exposio a HPAs44. Geralmente, a determinao dos metablitos excretados atravs da urina (indicadores de dose interna), no fornece informaes exatas sobre o risco carcinognico, sendo este, melhor avaliado por determinao de outros bioindicadores, tais como os adutos formados por reao com o DNA. De fato, a grande maioria das substncias consideradas carcinognicas para o homem formam adutos com o DNA. Embora a grande maioria dos adutos seja eliminada por processos de reparao, alguns persistentes podem causar mutaes permanentes resultando em crescimento celular aberrante e cncer45. Tcnicas que utilizam a Fluorescncia HPAs e seus metablitos apresentam fluorescncia molecular devido a sua estrutura eletrnica. O uso de espectroscopia de fluorescncia convencional isto , em soluo, limitada pelo alargamento das bandas de emisso causado pela multiplicidade de estados vibracionais e rotacionais, tem pouca seletividade e no consegue distinguir molculas semelhantes como por exemplo os HPAs, seus metablitos (diolepxidos) e os adutos correspondentes, exigindo uma etapa prvia de separao 46,47. Para contornar os problemas observados na espectroscopia de fluorescncia convencional, alguns mtodos alternativos tm sido propostos, tais como, a espectroscopia de fluorescncia
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sincronizada (EFS), a espectroscopia de fluorescncia com Efeito Shpolski (EFES) e a espectroscopia de fluorescncia com varredura rpida (EFVR). A EFS uma tcnica onde uma varredura simultnea dos comprimentos de onda de excitao e de emisso feita a uma diferena de comprimento de onda constante, correspondente diferena energtica entre os estados S2 e So. Por exemplo, no caso do estudo de adutos de benzo[a]pireno esta diferena de 34 nm. Esta tcnica tem sido proposta para a determinao de adutos de HPA com macromolculas e pode ser usada temperatura ambiente48. A EFES uma tcnica de alta resoluo na qual as medidas so realizadas em condies criognicas, geralmente em solues de hidrocarbonetos alifticos, podendo ser usadas fontes convencionais ou laseres para a excitao. A estrutura policristalina formada favorece orientaes moleculares bem definidas dando origem a espectros de linhas47,49,50 j que est em jogo apenas a diferena de energia entre o estado fundamental e o estado excitado. Esta tcnica tem sido utilizada na determinao de HPAs tanto em amostras ambientais de diferentes origens50-52 quanto biolgicas52. A EFVR tambm uma tcnica criognica de alta resoluo e seus detalhes foram descritos recentemente48. Laseres (de corantes) so usados para a excitao das molculas de interesse e os microambientes moleculares (devidos a diferentes grupos) podem ser usados na identificao de diferentes molculas. Esta tcnica tem sido proposta para a identificao de adutos de dibenzo[a,l]pireno e DNA produzidos in vitro em microsomas de fgado53. Estes mtodos exigem, em geral, tratamento preliminar das amostras bastante simples. A maioria dos HPAs e alguns de seus derivados so fluorescentes e esta propriedade pode ser usada para suas determinaes nos mais diversos tipos de matrizes, com grande sensibilidade. Limites de deteco da ordem de 10 -9 - 10-11 M so relatados. Imunoensaios Imunoensaios tm sido extremamente teis para a determinao dos HPAs e de seus metablitos em matrizes biolgicas. A facilidade de aplicao destes mtodos e a disponibilidade de kits para sua realizao coloca-os como alternativas viveis e baratas aos mtodos que exigem o uso de equipamentos caros e sofisticados. Vrios imunoensaios tm sido utilizados na determinao de adutos de HPA-DNA com utilizao de anticorpos especficos 54. Os tipos mais utilizados so o ELISA e os radioimunoensaios. Nos ensaios do tipo ELISA os anticorpos so imobilizados por adsoro em uma fase slida (tubo plstico, partculas polimricas ou magnticas). Esta imobilizao permite a separao entre os analitos de interesse e outros componentes da amostra, aps reao, por simples lavagem. A amostra contendo os HPAs e uma concentrao conhecida de HPA marcado com uma enzima (geralmente peroxidase) (HPA-E) adicionada ao tubo contendo o anticorpo imobilizado. Tanto as molculas de HPAs livres quanto as de HPA-E competem pelo anticorpo imobilizado e o equilbrio atingido em funo das concentraes relativas de ambos. Aps remoo da amostra e lavagem, um substrato capaz de reagir com a enzima imobilizada formando um produto colorido adicionado. A cor desenvolvida medida e correlacionada com a concentrao do analito existente (relao inversa: quanto mais intensa a cor menor a concentrao do analito). Testes de ELISA tm sido propostos para a determinao de metablitos de NHPAs na urina. Neste procedimento o extrato previamente purificado por passagem atravs de uma coluna de SPE, permitindo determinaes entre 8,7 e 217 ng/ml 55,56 .

Nos casos de radioimunoensaios utiliza-se um marcador radioativo ou um substrato previamente marcado (geralmente com um lantandeo), uma vez que a determinao ser feita radioquimicamente. A sensibilidade relatada para estes tipos de procedimento de 1 aduto para 108 DNA. Entretanto, reaes cruzadas com outros HPA-DNA adutos podem conduzir a resultados errneos e a especificidade depender exclusivamente do tipo de anticorpo utilizado. Radioimunoensaios (RIA) tm sido utilizados na determinao de benzo[a]pireno e de seus metablitos no soro sanguneo. Este procedimento exige extrao com hexano e clean up com slica gel. Nestas condies, BaP pode ser medido entre 15 e 40 ng/ml 57. Vrios HPAs e seus metablitos podem tambm serem analisados em amostras de urina sem qualquer tratamento preliminar por RIA58,59. CLAE-FLUO utilizando como fase estacionria octadecilslica (C18) tambm tem sido utilizada na separao e quantificao de adutos. Antes da separao cromatogrfica, o DNA isolado dos leuccitos e o tetrol correspondente ao HPA separado do DNA por hidrlise cida. Limite de deteco de 1 aduto para 108 nucleotdeos. Esta mesma metodologia tem sido proposta para a determinao de adutos formados entre o benzo[a]pireno e o DNA em grupos de trabalhadores expostos a este HPA. Diferentes valores foram encontrados para diferentes atividades60. Tioteres urinrios De modo geral, substancias que so metabolizadas com a produo de intermedirios eletroflicos (potencialmente genotxicas) sofrem reaes de conjugao com grupamentos sulfidrila das molculas de glutation (tripeptdeo formado por glicina, cisteina e -glutamina) catalizadas por enzimas da famlia glutation-S-transferase. Os produtos formados so normalmente eliminados atravs das fezes ou da urina, juntamente com produtos de seu catabolismo (uma srie de tiocompostos dentre os quais os cidos mercaptricos, tiis e disulfetos) 44,61,62. A determinao destes tioteres tem sido proposta para o monitoramento humano da exposio a substncias eletroflicas dentre as quais aquelas carcinognicas/mutagnicas 63,64. A metodologia analtica envolvida nestas determinaes inclui, geralmente, trs etapas: 1) extrao com acetato de etila ou eter etlico em pH 1 ou 2; 2) hidrlise alcalina a 100o C, no escuro; e 3) derivatizao com reativo de Ellmann (cido 5,5'ditiobis-2-nitro-benzico) seguida de determinao espectrofotomtrica a 412 nm. Entretanto estes testes no so especficos, apresentam alguns confundidores srios como por exemplo o fumo e no apresentam sensibilidade suficiente para avaliao da exposio a concentraes moderadamente baixas de HPAs (<10 g/m3). Outros testes relacionados na Tabela 3, como por exemplo, o de mutagenicidade urinria, so igualmente inespecficos, pouco sensveis e no so utilizados rotineiramente65-67. DETERMINAO DE ADUTOS COM DNA E OUTRAS MACROMOLCULAS Em geral, substncias eletroflicas so capazes de reagir com stios nucleoflicos de macromolculas biolgicas formando adutos. Uma vez que a formao de adutos com o DNA uma etapa crtica na carcinognese qumica, a determinao destes compostos pode servir como um bioindicador precoce para o cncer68. Vrios mtodos tm sido propostos para se determinar a formao de adutos entre os HPAs e o DNA e entre HPAs e protenas. Estes, em geral, utilizam ensaios com marcao atravs do 32P, imunoensaios, espectroscopia por fluorescncia e CLAE.

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Um dos procedimentos mais utilizados para a quantificao dos adutos de DNA aquele feito por ps marcao com 32 53,56 P . Nestes casos o DNA modificado isolado e hidrolizado enzimaticamente produzindo deoxiribonucleosideo-3-monofosfato. A seguir, a OH livre da posio 5 deste nucleosideo [32 P]fosforilada atravs de reao com [ 32P]ATP em presena de polinucleotideo quinase, a pH 9,5, produzindo deoxiribonucleosideo-3,5-bifosfatos. Os produtos resultantes desta reao (nucleotideos normais marcados e adutos marcados) podem ser separados por cromatografia em camada fina bidimensional em placas de celulose/polietilenoimina (PEI) ou CLAE. Sensitividade da ordem de 1 aduto para 10 7 10 8 nucleotdeos normais pode ser obtida para adutos hidrofbicos. Procedimentos para melhorar este limite tm sido desenvolvidos e consistem basicamente na utilizao de extrao com butanol antes da marcao radioqumica69 ou utilizao de uma etapa prvia de digesto preferencial dos nucleotideos normais com nuclease P170. Outros procedimentos, como por exemplo a utilizao da imunoafinidade para o enriquecimento dos adutos ou a combinao do enriquecimento enzimtico com a extrao com solventes orgnicos e separao por CLAE tambm tm sido propostos. Estes procedimentos tm possibilitado determinao de 1 aduto para 109-10 nucleotideos normais (0,3 3 x 10-18 Mol/g DNA). Como neste tipo de ensaio pode-se determinar o total de adutos formados pelos diferentes HPAs ou derivados, o mesmo um bioindicador de exposio a HPA total. Uma vantagem da utilizao desta tcnica que ela no especfica para um dado tipo de aduto, possibilitando determinaes mltiplas. Por outro lado, a inexistncia de um protocolo analtico reconhecido internacionalmente, a falta de especificidade da anlise dos adutos atravs da radiao , a baixa capacidade resolutiva da cromatografia em camada fina e a inexistncia de padres dos diferentes adutos, constituem srias limitaes. Este ltimo aspecto particularmente importante nos casos de exposies mltiplas. Em geral, a identificao de adutos desconhecidos ainda problemtica devido a baixa sensibilidade da espectrometria de massas. Alm disto, uma relao clara entre a exposio aos HPAs e a formao de adutos HPA-DNA ainda no est bem estabelecida. Estes procedimentos so operacionalmente muito trabalhosos, o que limita suas utilizaes como metodologia de rotina. Alguns mtodos utilizados para a determinao de adutos de DNA so mostrados na Tabela 6. Adutos com protenas A avaliao quantitativa do DNA quimicamente alterado por formao de adutos, normalmente no fcil devido s pequenas concentraes em que estes produtos so formados, eficincia dos mecanismos biolgicos de reparo, diluio dos adutos devido a diviso celular e dificuldade de se Tabela 6. Mtodos para a deteco de adutos de DNA71. Mtodo

amostrar DNA humano, especialmente tendo-se em conta a grande variedade de rgos-alvo dos diversos HPAs. Por isto, especial ateno tem sido dada ao estudo dos adutos formados nas reaes entre os agentes carcinognicos e protenas, como indicadores dos nveis reao com o DNA. Ou seja, acredita-se que os intermedirios eletroflicos que reagem com os stios nucleoflicos do DNA tambm reagiro com grupos nucleoflicos de outras macromolculas, como a albumina, a hemoglobina, etc. De fato, todas as substncias qumicas capazes de reagir com o DNA, j estudadas, reagem tambm com a hemoglobina42. A correlao entre as concentraes de adutos formados atravs de reaes com protenas e aquela formada por reao com o DNA tem sido observada em alguns casos, mas no se trata de um fator universal. Mesmo assim, as reaes de formao de adutos com as protenas so teis no estudo da exposio a formas ativas de carcinognicos. O monitoramento feito por esta via apresenta uma srie de vantagens como por exemplo a maior facilidade de se obter maiores quantidades dos adutos. As protenas, por apresentarem baixa taxa de renovao, podem servir como indicadoras de exposio por vrios meses. A hemoglobina uma das protenas que tem sido utilizada nestas tcnicas e tem um tempo de meia vida de aproximadamente 120 dias, podendo servir como indicador da exposio a agentes mutagnicos durante este perodo. A albumina tambm tem sido utilizada e tem um tempo de vida de cerca de 20-24 dias. Neste procedimento, os tetris correspondentes aos HPA so isolados dos adutos por hidrlise cida e purificados por extrao em fase slida antes da determinao por CLAE-FLUO. Adutos de hemoglobina tm sido considerados como possveis indicadores de exposio mas at agora apenas alguns poucos experimentos so disponveis. Algumas limitaes tem sido relacionadas a esta metodologia72. Por exemplo, a hemoglobina humana forma carboxilatos com anti-benzo[a]pirenodiolepxido que pode ser hidrolisado a benzo[a]pireno-tetrol e utilizado para determinao da exposio a este HPA. O metabolismo urinrio dos HPAs produzem fenis que so excretados livres ou associados a sulfato ou glucurondeo. Pequenas quantidades de quinonas podem tambm ser formadas35. O benzo(a)pireno, por exemplo, metabolizado a 1-hidroxipireno que forma 1-hidroxipireno-glucuronideo e 1,2-di-hidroxi1,2-di-hidropireno que so excretados pela urina74. A formao de adutos com a hemoglobina humana, aps protelise enzimtica e separao por imunocromatografia tem sido utilizada para a quantificao dos adutos em indivduos expostos 20. O aduto criseno-Hb pode ser separado e quantificado por CLAE com deteco fluoromtrica a partir de uma frao parcialmente purificada por imunoafinidade. A confirmao dos criseno tetrahidrotetrois feita por CGAR-EM 18. Adutos de hemoglobina com nitroderivados de HPAs tm sido utilizados como biomarcadores de exposio a gases de exausto de motores a leo diesel. Limites de deteco da ordem de 0,01 - 0,08 pMol/g de hemoglobina so relatados 76.

Quantificao Nmero de adutos por 10 18 mol/g nucleotideos normais DNA 1/107 109 1/107 1/108 1/108 1/109 1/1010 3 300 300 30 30 3 O,3

Quantidade mnima de DNA por ensaio 1 mg 100 g 50 g 100 g 100 g 1 g

Marcao com 3H ou 14C CLAE com deteco por fluorescncia Imunoensaios (RIA, ELISA, etc) Espectroscopia de fluorescncia sincrona CLAE-EM ou CGAR-EM Marcao com 32P

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CONCLUSO A procura de bioindicadores confiveis para a o estudo da exposio humana aos HPAs e seus derivados constitui ainda matria para muita pesquisa. Alguns indicadores espcficos, como por exemplo o 1-hidroxipireno, tm sido propostos e utilizados com sucesso nos estudos da exposio humana a determinados HPAs. Muitos dos bioindicadores propostos para estudo da exposio a misturas apresentam limitaes que vo desde a baixa sensibilidade at a grande variabilidade dos resultados obtidos, mostrando a influncia de fatores no totalmente controlados sobre a metodologia e reforando a necessidade da validao metodolgica. Em muitos casos, a existncia de outros agentes que podem influenciar os resultados, tais como o hbito de fumar ou mesmo as dificuldades tcnicas limitam a utilizao. Vrias tcnicas, como por exemplo os imunoensaios, so bastante promissoras e constituem reas de pesquisa ainda pouco exploradas e que necessitam desenvolvimento. A importncia e atualidade do tema em conjuno com as limitaes analticas das tcnicas atualmente disponveis justificam investimentos cientficos e fazem com que esta rea seja bastante atraente para desenvolvimentos futuros. AGRADECIMENTOS Os autores gostariam de agradecer CAPES e ao CNPq pelo suporte recebido. REFERNCIAS 1. ONeil, I. K.; Fishbein, K.; Intern. J. Environ. Anal. Chem. 1986, 26, 229. 2. IARC; Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans: Chemicals, Industrial Processes and Industries Associated with Cancer in Humans, vol. 1 - 55, IARC, Lyon, 1970 - 1997. 3. IARC; Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans: Polynuclear Aromatic Compounds; vol. 32-35, Parts 1-4, IARC, Lyon, 1983 - 1995. 4. International Programme on Chemical Safety (IPCS): Environmental Criteria 202. Seleceted Non-heterocyclic PAHs; World Health Organization, Geneva, 1998. 5. Moreira, J. C.; Barek, J.; Quim. Nova 1995, 18, 362; Moreira, J. C.; Kuryiama, G. S.; Barek, J; In Idrocarburi policiclici aromatici negli ambienti de vita e di lavoro: esposicione ed effetti; Apostoli, P.; Minoia, C.; Alessio, L., Eds.; ATTI, Gargnano, 1996, p 63; Cvacka, J.; Barek, J.; Fogg, A. G.; Moreira, J. C.; Zima, J.; Analyst 1998, 123, 9R; Barek, J.; Cvacka, J.; Moreira, J. C.; Zima, J.; Chem. Listy 1996, 90, 805. 6. Wishnok, J. S.; Anal. Chem. 1992, 64, 1126 A. 7. Selkirk, J. K.; In Carcinogenesis: A Comprehensive Survey: Modifiers of Chemical Carcinogenesis; vol 5; Slaga, T. J.; Ed.; Raven Press, N.Y., 1980. 8. Fiedler, H.; Mucke, W.; In The Handbook of Environmental Chemistry; vol 3G; Hutzinger, O., Ed.; Springer Verlach, Berlin, 1991. 9. Jacob, J.; Karcher, W.; Belliardo, J. J.; Dumler, R.; Boenke, A.; Fresenius J. Anal. Chem. 1991, 340, 755. 10. White, C.M.; Nitrated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Huetchig, Heidelberg, 1985. 11. Harvey, R. G.; In Polycyclic Hydrocarbons and Carcinogenesis, Harvey, R. G.; Ed.; American Chemical Society, Washington, DC, 1985, p. 371. 12. Lopes, W. A.; de Andrade, J. B.; Quim. Nova 1996, 19, 497. 13. Fetzer, S. M.; Huang, C-R.; Harvey, R. G.; LeBreton, P. R.; J. Phys. Chem. 1993, 97, 2385.

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