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Viriología
 2008‐ 2009 
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Viriología
 2008‐ 2009
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Virología


 Jorge Oller Pedrosa 1º de Bioquímica UAM

Jorge Oller Pedrosa 1º de Bioquímica UAM

Viriología
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Tema 1 : concepto básico de virus

Un virus (de la palabra latina virus, toxina o veneno) es una entidad biológica capaz de autoreplicarse utilizando la maquinaria celular. Es un agente potencialmente patógeno compuesto por una cápside (o cápsida) de proteínas que envuelve al ácido nucléico, que puede ser ADN o ARN. Esta estructura puede, a su vez, estar rodeada por la envoltura vírica, una capa lipídica con diferentes proteínas (en virus no desnudos, en los virus desnudos sin envoltura lipídica), dependiendo del virus. El ciclo vital de un virus siempre necesita de la maquinaria metabólica de la célula invadida para poder replicar su material genético, produciendo luego muchas copias del virus original. En dicho proceso reside la capacidad destructora de los virus, ya que pueden perjudicar a la célula hasta destruirla. Pueden infectar células eucarióticas o procarióticas (en cuyo caso se les llama bacteriófagos, o simplemente fagos). Algunos indicios parecen demostrar que existen virus que infectan a otros virus (llamados viroides). Algunos virus necesitan de enzimas poco usuales por lo que las cargan dentro de su envoltorio como parte de su equipaje. En resumen, se puede diferenciar de las células al menos en tres aspectos:

1)

Organización simple y acelular

2)

Presencia de DNA o RNA como material genético pero no ambos en la fase de viroide.

3)

Su incapacidad de reproducirse independientemente, obligado a utilizar la maquinaria celular para tal fin., sin

metabolismo propio.

Parásitos intracelulares obligados

Los virus son parásitos intracelulares obligados. Desde los años treinta se sabe que los virus se componen principalmente de ácido nucleico y proteínas, estas últimas forman la cápside que se conoce también como envoltura protéica. Esto quiere decir que necesitan un huésped (hospedante u operador) ya que no poseen metabolismo propio por lo que en vida libre no sobreviven. Se sabe que los virus pueden vivir alrededor de unos cuarenta días sin que tengan algún hospedante en el cual reproducirse. También se han encontrado virus que presentan lípidos aunque estos son tomados de la célula que infectan(virus no desnudos). Hasta ahora todos los virus que se conocen presentan un solo tipo de ácido nucleico como material genético en el interior de la cápside (ya sea ADN o ARN), el cual puede ser de una o de dos cadenas y puede ser segmentado. Para que el ácido nucleico pueda replicarse, necesita utilizar la maquinaria enzimática y estructural de una célula viva, y por otra parte, solamente dentro de una célula viva tienen los virus las funciones de autoconservación que junto con la reproducción caracterizan a los seres vivos.

Ciclo vital (generalidades)

caracterizan a los seres vivos. Ciclo vital (generalidades) Un virus presenta un ciclo vital que si

Un virus presenta un ciclo vital que si le resumimos grosso modo podemos decir que consta de dos fases -una fase extracelular en forma de virión- y una fase intracelular infectiva que es cuando el virus se reproduce y su genoma es activo. Los virus constituyen un grupo único de agentes infecciosos cuya característica diferencial reside en su organización simple y acelular (no son células, al carecer de metabolismo!)

1-fase extracelular:

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Es el “viaje” desde la célula huésped original hasta la siguiente siendo transportado pasivamente en el medio (difundiendo en él).Cuando el virus está en fase extracelular se podría decir que sería el transporte del genoma vírico (recubierto de estructuras proteícas y a veces lípidos, por el medio extracelular hostil) hasta la siguiente célula huésped. Una partícula vírica en fase extracelular se la denomina virión que es una partícula vírica completa. En fase de virión es totalmente inerte su genoma careciendo de los monómeros necesarios ni las enzimas necesarias para a replicación

o trascripción con lo cual el virus por ello debe de ser en un agente patógeno intracelular obligado para poder

reproducirse. El virión posee capacidad de infectar, gracias a unas proteínas que poseen dominios hacia el medio externo (los llamados antireceptores) que se unen a los receptores de membrana de la célula a infectar. Estos receptores realmente son proteínas transmembrana de la célula que son para otro uso pero el virus se las ha ingeniado para

sacarle su propio beneficio. Una vez unido al receptor, por varios mecanismos dependiendo del tipo de virus, es introducido en el interior celular.

2-Fase intracelular Durante esta fase e virus dispara su ciclo vital utilizando la maquinaria metabólica y génica del huésped se multiplica y completa su ciclo vital, para dar lugar a la descendencia viral que saldrán fuera de la célula Una vez en la célula huésped, se produce el desensamblaje de las cubiertas (gracias a que las cubiertas son

sensibles a cambios del medio) quedando el genoma descubierto y éste por diferentes mecanismos se expresa produciendo la progenie viral (virus hijos) que en una etapa posterior saldrán de la célula infectada en forma de virión.(

el tipo de reproducción vírica se basa crecimiento exponencial y no binario como el bacteriano , a partir de un virus

padre). En esta fase su genoma es activo (duplica, transcribe y traduce a proteínas). Algunos virus no producen progenie viral inmediatamente sino que se integran en el DNA celular, beneficiándose de las divisiones celulares ya que con ellas se duplica también el material génico del virus. Comportándose éste como un gen más de la célula huésped, así aumenta su número pasivamente, convirtiéndose éste en provirus. Una vez inducido (Activándose la replicación del provirus) el virus se hace activo, se reproduce y suele terminar con la vida de la célula infectada. En este caso se les denomina virus latentes en eucariontes (SIDA) en el caso de los virus bacterianos se les denominan fagos lisogénicos (que producen lisogenia en bacterias). No confundir términos!. Es una entidad molecular formado por macromoléculas que sufre dos fases:

1-historia (breve, no examen)

El desarrollo de la Virología

¨ Literatura china del siglo X a.J.C.: Se describe una enfermedad similar a la viruela.

¨ Desde el siglo XVIII se vacuna contra la viruela vacuna (Jenner).

¨ En 1884 Pasteur desarrolló un virus atenuado para la vacunación frente a la rabia.

¨ Los postulados de Koch fueron aplicados también a enfermedades virales:

- Se tiene que aislar el agente infeccioso

- Reproducir los síntomas en animales

- Aislar de esos animales el agente infeccioso…

¨ Importantísimo: Finales del siglo XIX, Iwanowsky demostró que el virus del mosaico del tabaco podía pasar a

través de filtros cuyos poros retenían a las bacterias.

¨ 1899. Beijerinck ya habla de “virus filtrable” transmisible de un hospedador a otro.

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¨

Comienzos de siglo: Rous demuestra la etiología vírica de un sarcoma de pollo.

¨

1915. Twort describe los primeros bacteriófagos.

¨

1952. Hershey y Chase observan que en los bacteriófagos, solo el ácido nucleico de los virus penetran en la

bacteria (cosa que no ocurre en virus animales).

¨ 1956. Fraenkel-Conrat confirma que el ácido nucleico es el portador de la información genética (virus mosaico

del tabaco).

¨ Desde mediados de los 50 se desarrollan las vacunas contra la polio (Salk y Sabin)

¨ 1957. Isaacs y Lindenman descubren el Interferón. Antiviral de amplio espectro.

¨ 1970. Temin y Baltimore descubrieron la transcriptasa inversa del virus del sarcoma de Rous.

Este concepto y su existencia tubo que ser aceptado en la comunidad científica. Este concepto surgió cuando la microbiología se consolida como ciencia: 1850-1880 a finales del siglo XIX gracias a los desubrimientos de Pasteur, y Koch ellos y sus escuelas desarrollaron la microbiología como ciencia y métodos.

Experimentos clave de Pasteur: existía en el ambiente gérmenes microscópicos = microorganismos que eran los responsables de producir las fermentaciones y descomponer la materia orgánica. Hacía pasar a través de un tubo de vidrio con diferencias de presión hizo pasar el aire a un algodón. Después lo disocia en un porta y observó la existencia de partículas microscópicas en al aire que las concentra en el algodón por lo tanto el aire no está completamente limpio y éstas partículas están presentes de forma bastante regular. Si coloca un recipiente con caldo de cultivo que previamente había esterilizado con calor y después introduce en se recipiente ese algodónn y lo cierra, el caldo fermenta y se llena con las mismas partículas encontradas en el aire en grandes cantidades. Con ello descubrió que los microorganismos están presentes en el aire y están vivos y que las fermentaciones tienen un origen microbiano. Además de este experimento, realizó el experimento famoso del cuello de cisne Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asestó el golpe definitivo y zanjó la cuestión a favor de la teoría biogénica. En un informe a la Académie des Sciences de París, en 1860 (“Expériences rélatives aux générations dites spontanées”) y en escritos posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calentó infusiones en matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, haciéndolo largo, estrecho y sinuoso, y dejándolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el aire; tras esta operación demostró que el líquido no desarrollaba microorganismos, con lo que eliminó la posibilidad de que un “aire alterado” fuera la causa de la no aparición de gérmenes. Antes bien, comprobó que los gérmenes del aire quedaban retenidos a su paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del recipiente donde se encontraba la infusión, quedando ésta estéril indefinidamente. Sólo si se rompía el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de líquido a la porción de cuello, los gérmenes podían contaminar la infusión y originar un rápido crecimiento. Sus comprobaciones eran contrarias a la generación espontánea que era dogmática desde Aristóteles. Este es el principio de la teoría germinal que realizó junto con Koch.

El descubrimiento de los microorganismo como causa de enfermedades:

Durante el siglo XIX la atención de muchos naturalistas se había dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que vivían como parásitos de otros organismos. Este interés se redobló tras la publicación de los libros de Darwin, estudiándose las numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parásitos habían adquirido en su peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicación de propiedades de parásitos a los microorganismos vino del campo médico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el origen germinal de las enfermedades infecciosas.

Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenzó a diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando finalmente a China y Japón. A instancias de su maestro Jean Baptiste

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Dumas, Pasteur aceptó el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se había enfrentado con un problema de patología. Es más que probable que Pasteur viera aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones podían tener una extensión hacia los procesos fisiológicos del hombre y de los animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extraño, creyendo durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiológicas. Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extraídas, inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de medidas de control, ésta comienza a remitir de modo espectacular.

La intervención de bacterias como agentes específicos en la producción de enfermedades fue descubierta a raíz de una serie de investigaciones sobre el carbunco o ántrax, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. C. Davaine, entre 1863 y 1868, encontró que en la sangre de vacas afectadas aparecían grandes cantidades de microorganismos a los que llamó bacteridios; además, logró inducir la enfermedad experimentalmente en vacas sanas, inoculándoles muestras de sangre infectada. En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en 1876 el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas, fijadas y teñidas con azul de metileno. Más tarde (1881), Koch y sus colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos y más resistentes que éstos a una variedad de agentes. Pero más fundamental fue su demostración de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculándoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios líquidos.

Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue llevado a una ulterior perfección en 1882, con la publicación de “Die Äthiologie der Tuberkulose”, donde se comunica por primera vez la aplicación de los criterios que Henle había postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de Koch, son los siguientes:

1. El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos.si realmente un microorganismo es causante de una enfermedad, se debe de aislar de un animal o persona enfermo y no de un animal/persona sana.

2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro.

3. La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.

4. El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma experimental.

Fue asimismo Koch quien demostró el principio de especificidad biológica del agente infeccioso: cada enfermedad infecciosa específica está causada por un tipo de bacteria diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiología Médica sobre firmes bases científicas.

El problema viene con micorganismos difícil de cultivar, y la experimentación para enfermedades humanas y no animales. Problemática: si hay otros tipos de agentes infecciosos diferentes que no lo cumplen:

La Virología ha sido la ciencia microbiológica de origen más tardío, habiendo surgido como resultado del hallazgo de enfermedades infecciosas en las que la demostración de implicación de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se vivía en los ámbitos científicos y

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médicos, al asociarse a la edad de oro de aislamiento de bacterias patógenas, se plasmó en el prejuicio de que la

incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se debía a una técnica inapropida o mal

aplicada.

El botánico ruso Dimitri Iwanovski había observado (1892) que la enfermedad del mosaico del tabaco podía ser reproducida experimentalmente usando el fluido (homogenado) que atravesaba los filtros de porcelana Chamberlain (Discípulo de Pasteur, que con este filtro esteriliza el medio) que normalmente retenían a las bacterias, pero siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandonó la investigación. Pocos años más tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del trabajo de Iwanovski, Beijerink realizó experimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrentándose a los conceptos de la época, avanzó la idea de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, según su expresión), debía de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducción. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio “virus filtrables”, quedando más tarde su denominación simplemente como virus. Aquel mismo año de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901 Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su técnica de multiplicación de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous aisla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911).

lo largo del siglo XX se hizo para algunas enfermedades animales-humanos y pasaba algo parecido en algunas enfermedades: se acumulan evidencias. Había dos tendencias:

1.- Ortodoxa de Koch: no lo podemos cultivar en cultivos puros. Eran microorganismos: no se encontraba el medio adecuado para el cultivo, era un problema técnico y no un nuevo concepto. 2.- No ortodoxa: como este filtro bloquea las bacterias “normales” pero dejarían pasar las pequeñas, con lo cual eran microorganismos. (física) Ninguna de las dos tendencias no reconocen el nuevo concepto, estaban equivocados durante 30 años.

En 1940-50 :se reconoció un agente infeccioso diferente de una célula-bacteria, la infección produce la relación de 1-

1000 y no de 1-2 como las bacterias. Para el cultivo se necesita un cultivo viviente con células.

Una contribución decisiva: microscopía electrónica “una imagen vale más de mil palabras”.

.

Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no alcanzó la elegancia y claridad del desarrollado poco más tarde por el canadiense Félix d'Hérelle (1917); fue éste quien acuñó el término

bacteriófago, y supuso correctamente que el fenómeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicación de los fagos como elementos bactericidas para uso médico no pudo satisfacerse, la contribución de los virus bacterianos al avance de la genética y biología

moleculares ha sido decisiva: de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicación virásica se realizaron sobre fagos de Escherichia coli, lo que suministró modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En

1925 Bordet y Bal describen por primera vez el fenómeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos lítico y

lisogénico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de André Lwoff (1950).

La primera visualización de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacteriólogo inglés Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera fotografía de un virus a microscopio electrónico. Pero los avances más significativos en el estudio de la composición y estructura de los virus se inician con la purificación y cristalización, por Wendell M. Stanley, del virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935), aplicando procedimientos típicos de la cristalización de enzimas. Inicialmente Stanley comprobó que el TMV contenía gran proporción de proteína, pero poco más tarde detecta, además, la presencia de ácido nucleico. A partir de aquí la Virología entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y genetistas, en un esfuerzo interdisciplinar que da origen a la moderna Biología Molecular

Los recientes progresos en las numerosas técnicas de biología molecular han propiciado una auténtica explosión de

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descubrimientos sobre la biología de los virus y de sus células hospedadoras; baste citar la replicación del genomio de ARN de los retrovirus por reversotranscripción a ADN, los fenómenos de transformación oncogénica virásica y su aplicación a los estudios generales del cáncer, el diseño de vacunas recombinantes por manipulación in vitro de genomios virásicos, la próxima aplicación clínica de la primeras terapias génicas en humanos recurriendo a vectores virásicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología existente ha permitido la rápida identificación y caracterización del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se está traduciendo en una intensa y racional búsqueda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de SIDA.

En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvirásicas: T.O. Diener describió en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos en plantas, a los que llamó viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas aparentemente desprovistas de material genético, a las que bautizó como priones.

Durante su Ciclo vital: produce miles de virus, diferente a la división binaria de las células al infectar a la célula hay una fase que no hay virus parental ni progenie, se esta replicando pero no hay ninguna entidad infecciosa que no podemos identificar como virus, esta fase se denomina fase de eclipse, radicalmente distinta de las bacterias/células. Se formula una pregunta filosófica más que científica: ¿si los virus están vivos o no? Los virus tienen una fase extracelular que se comportan como la materia inanimada, inerte que no se comportan ante estímulos, sin metabolismo, y forman cristales (típico de los minerales). Evidencias de que están vivos: su composición, los virus están formados por macromoléculas biológicas, no son elementos simples minerales sino complejos. Formados por los mismos componentes de los demás seres vivos. Los virus se replican dentro de las células siguiendo un código genético idéntico al que comparte con todos los seres vivos del planeta con lo cual argumenta que la vida en la tierra tiene un origen único. Poseen la posibilidad de evolucionar, de cambio de forma y de propiedades, esto es una propiedad de lo vivo. Evolucionan más rápidamente que los operadores (huéspedes) que los organismos superiores a los que infecta.

Han pasado a ser modelos que se estudia procesos fundamentales de la BM y que se aplican a la Biología celular- molecular de otros seres vivos ya que son más sencillos.

Uno de los argumentos de estudiar virología: las enfermedades infecciosas es la cuarta parte de las muertes mundiales, los cánceres una buena parte están causados por virus (50% ¿) y también son causantes de desórdenes cardiovasculares. La mayor causa de muerte es las infecciones pulmonares inferiores, dentro de las cuales hay bacterianas y virales (Como la gripe que mata miles de personas al año). La segunda es el SIDA en África subsaharina. Y bacterianas después el sarampión. Aparecen nuevos virus constantemente, emergidos en la última década recientemente. Evolucionan rápidamente, siendo muy virulentos en la especie humana. Por ejmplo el Hantavirus síndrome pulmonar sin nombre virus. Lo trasmiten los roedores Herpes humano 8, pacientes de sida, cuando hay una inmunodepresión severa. Todos tenemos estos virus, emerge con mayor virulencia y nos permite identificarlo. Gripe aviar H5N1, ÉBOLA , SAARS…

Antes, hace 10 años se tardaba bastante en estudiar un virus en concreto ahora en apenas 1 año podemos tener la vacuna, secuencia etc. Hay muy pocas vacunas que funcionen. Emergencias y reemergencias. África como fuente de nuevos virus y microbios. Con las comunicaciones tan rápidas cualquier brote de virus en apenas poco tiempo se extienden a todo los continentes. Ejemplo: West nile virus en USA. En África hay primates superiores próximos a la especie humana, que pueden saltar al hombre, salto de especie, es un reservorio y una fuente. Además influye el régimen de vida.

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La emergencia de un nuevo virus es complejo hay varios factores: genéticos, sociales, humanos, ecológicos, físicos, es bastante complejo. Continuamente están surgiendo nuevos virus, nuevas interacciones, solamente unos pocos que si que causan epidemias, son los observables.

Origen de los virus:

Lo vivo esta dividido en 3 dominios: Bacteria, Archaea, Eukarya. Se supone que tiene un origen común LUCA, comparten el código genético. Faltan los virus, es imposible colocarlos en un árbol tan simple, está construido este árbol por homología del RNAr. Los virus no tienen ribosomas, y no se le puede colocar en este árbol. Hay virus que son capaces de infectar varios dominios-reinos (bacterias y células eucariotas etc) no respetan estos árboles. Como se originaron los virus? En la base de la vida , los antecesores celulares, debieron de tener genomas basados en RNA, en ese contexto , pudieron surgir los primeros virus Hipótesis de escape:

Célula de RNA, genoma fragmentado , un fragmento es independiente, pero si se mete dentro de una célula es capaz de reproducirse. Lo que busca es la maquinaria de traducción, para poderse replicar. Reduccionista: una célula que se hace más sencilla, y que inicialmente tiene su maquinaria traduccional , en algún momento pierde los ribosomas y le queda solo el RNA. Como apareció en DNA? Se supone el mundo de RNA primitivo, el RNA en algún momento se hace DNA-U con uracilo, luego apareció la T. En la transición de RNA a DNA, pudo jugar un papel importante los virus, habría unas células primitivas en un mundo de RNA, que no llegan a llamarle células. En ese mundo se generan virus RNA, evolucionan A DNA, PORQUE SON MÁS SENCILLOS Y EVOLUCIONAN MÁS RÁPIDAMENTE PASARÍAN a virus de DNA. Los virus de DNA al infectar a sus operadores de RNA les cambiaron a DNA, dejaron su impronta evolutiva, integrándose en sus operadores. Los tres dominios de la vida, podrían haber surgido los virus de DNA que infectaron a estos 3 dominios, así se formaron estos dominios.

TEMA 2: taxonomía y clasificación de los virus: criterios evolutivos y fenotípicos, el ICTV

TEMA 2:

taxonomía y clasificación de los virus: criterios evolutivos y fenotípicos, el ICTV

La taxonomía se basa en clasificar los organismos en taxones (grupos de conjunto de individuos que tienen relaciones filogenéticas estrechas), desde los años 50-60 muchos virus fueron descubiertos, durante los años 60-65 surgieron los primeros congresos intencionales de virus, por entonces se concluyó se necesitaba clasificar los virus de alguna forma. Se creo un comité internacional de taxonomía de virus “ICTV “, esta organización es abierta, voluntaria, se dedican a reunirse y clasificar los virus. Se van renovando con el tiempo.

Es un campo abierto todavía hay mucho por hacer. Taxones (Conjunto de organismos que comparten propiedades) en virología: Especie, el género, familia, y orden. Especie: conjunto de virus que comparten una serie de propiedades básicas Genero: conjunto de especies que comparten “”””” Familia: conjunto de género que “”””””” Hay términos a su vez de subespecie, variante, cepa que están por debajo de la categoría de especie. El taxón básico y fundamental es la familia: nombre acaba en –viridae, Género : -virus Especie: adjetivo, es en inglés. No ha habido forma de hacerlo en latín. Orden : -virales La diversidad evolutiva hace que sea difícil de clasificarlos. Además es difícil de agruparlos, el orden solamente aún hay un orden aprobado: mononegavirales (-ssRNA), el comité estima que solamente hay un grupo de familias que

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tienen características comunes para agruparlas en un solo orden ya que las demás podría ser polifiléticas. El criterio para signar la especie es arbitrario, un lugar, una forma, una enfermedad, un síntoma etc. Hay clasificados en familias 1.500 virus, pero hay 1.500 en lista de espera.

Criterios del comité:

exigir que se clasifique siempre y cuando esté secuenciado su genoma para que se clasifique según homología de secuencia. Pero sacar la secuencia lleva su tiempo, pero como además tienen una diversidad tan grande por su evolución tan rápida que es imposible hacerlo por homología de nucleótidos, este criterio sólo valdría hasta género pero no grandes taxones como son las familias.

hasta género pero no grandes taxones como son las familias. Criterios de clasificación: 1.- Hospedador o

Criterios de clasificación:

1.- Hospedador o Huésped al que infecta: virus animales, vegetales, microorganismos. Pero hay virus que infectan plantas, se trasmiten por los insectos vectores, que incluso puede infectarlo. Ni siquiera lo más básico nos sirve para clasificar. Hay virus entonces que infectan a varios hospedadores de incluso diferente taxón/reino. 2.- Tipo de genoma: “método de Baltimore” en 1971 David Baltimore descubridor del VIH, propuso clasificarlos por su genoma, y por su mecanismo para dar un mRNA. Por ejemplo:

clase I: dsDNA, para hacer su mensajero, sólo transcriben. El mRNA por consenso posee un sentido +, quiere decir que se puede traducir. Si es +, su genoma, puede ser directamente traducido por los ribosomas. Si el virus es de RNA+ Su propio genoma podría ser un mensajero, pero les hay de –RNA , el antimensajero, no se puede traducir, tiene que ser copiado a +RNA para traducirse en los ribosomas. Las células no poseen enzimas para poder hacer RNA de RNA, por lo que los virus de tales características deben de tener polimerasas especiales. Los virus +RNA no lo necesitan. Además les hay de dsRNA. Esto surgió por el descubrimiento de los retrovirus que posee +ssRNA, pero hacen DNA-, hacen después dsDNA y de aquí al mensajero. Por ello salió la idea de que se clasifique por el mecanismo de formación de mRNA, es útil pero es insuficiente.

3.- La morfología: son muy diversos, pero pueden reducirse en dos formas de simetría. Poliédricos, con varias caras con forma particulada icosaédrica-esférica a alta resolución se ven bien, pero a baja resolución se aprecia una forma circular. Forma de varilla + o – flexible ( en 1 o varios fragmentos en forma de varillas, ejemplo el virus de la gripe) Los fagos combinan las dos propiedades tanto en varilla y poliédrica. En algunos casos tanto unos virus como otros tienen una envuelta de lípidos donde pueden tener proteínas ancladas “Spikes”. Hay virus que no se ajustan a ninguna de estas formas: virus complejos, por ejemplo la familia de poxviridae. Se incluyen año a año nuevos virus:

Caja grande( no en los apuntes hoja anexa) tipo de hospedador. Hay aparentemente diferente distribución, según el hospedador esto no es real ya que los virus están distribuidos de forma homogénea pero sabemos más de los virus que infectan a humanos de los demás La más pequeña: tipo de genoma Morfología, por tamaño y general. En general los virus de DNA son poliédricos y de RNA en forma de varilla.

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NOTA: incluyo información en inglés de la clasificaciónn de Baltimore y del ICTV: NO EN CLASE!

Baltimore classification

Baltimore y del ICTV: NO EN CLASE! Baltimore classification The Baltimore Classification of viruses is based

The Baltimore Classification of viruses is based on the method of viral mRNA synthesis

Baltimore classification (first defined in 1971) is a classification system which places viruses into one of seven

groups depending on a combination of their nucleic acid (DNA or RNA), strandedness (single-stranded or double-

stranded), Sense, and method of replication. Other classifications are determined by the disease caused by the virus

or its morphology, neither of which are satisfactory due to different viruses either causing the same disease or

looking very similar. In addition, viral structures are often difficult to determine under the microscope. Classifying

viruses according to their genome means that those in a given category will all behave in a similar fashion, offering

some indication of how to proceed with further research. Viruses can be placed in one of the seven following

groups:

I: dsDNA viruses (e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses)

II: ssDNA viruses (+)sense DNA (e.g. Parvoviruses)

III: dsRNA viruses (e.g. Reoviruses)

IV: (+)ssRNA viruses (+)sense RNA (e.g. Picornaviruses, Togaviruses)

V: (-)ssRNA viruses (-)sense RNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses)

VI: ssRNA-RT viruses (+)sense RNA with DNA intermediate in life-cycle (e.g. Retroviruses)

VII: dsDNA-RT viruses (e.g. Hepadnaviruses)

DNA viruses

For more details on this topic, see DNA virus.

Group I: viruses possess double-stranded DNA and include such virus families as Herpesviridae (examples like

HSV1

(oral

herpes),

HSV2

(genital

herpes),

VZV

(chickenpox),

EBV

(Epstein-Barr

virus),

CMV

(Cytomegalovirus)), Poxviridae (smallpox) and many tailed bacteriophages. The mimivirus was also placed into

this group.

Group II: viruses possess single-stranded DNA and include such virus families as Parvoviridae and the important

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bacteriophage M13.

Group VII viruses have a DNA genome but are classified as retroviruses instead of DNA viruses.

Virus Family

Examples (common names)

1.Adenoviridae

Adenovirus

2.Papillomaviridae

Papillomavirus

3.Parvoviridae

Parvovirus B19

4.Herpesviridae

Herpes simplex virus, varicella-zoster virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus

5.Poxviridae

Smallpox virus, vaccinia virus

6.Hepadnaviridae

Hepatitis B virus

7.Polyomaviridae

Polyoma virus; JC virus (progressive multifocal leucoencephalopathy)

8.Circoviridae

Transfusion Transmitted Virus

RNA viruses

For more details on this topic, see RNA virus.

Group III: viruses possess double-stranded RNA genomes, e.g. rotavirus. These genomes are always segmented.

Group IV: viruses possess positive-sense single-stranded RNA genomes. Many well known viruses are found in

this group, including the picornaviruses (which is a family of viruses that includes well-known viruses like

Hepatitis A virus, enteroviruses, rhinoviruses, poliovirus, and foot-and-mouth virus), SARS virus, hepatitis C

virus, yellow fever virus, and rubella virus.

Group V: viruses possess negative-sense single-stranded RNA genomes. The deadly Ebola and Marburg viruses are

well known members of this group, along with influenza virus, measles, mumps and rabies.

Virus Family

Examples (common names)

1.Reoviridae

Reovirus, Rotavirus

2.Picornaviridae

Enterovirus, Rhinovirus, Hepatovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Poliovirus, Parechovirus, Erboviru

3.Caliciviridae

Norwalk virus, Hepatitis E virus

4.Togaviridae

Rubella virus

5.Arenaviridae

Lymphocytic choriomeningitis virus

6.Flaviviridae

Dengue virus, Hepatitis C virus, Yellow fever virus

7.Orthomyxoviridae

Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Isavirus, Thogotovirus

8.Paramyxoviridae

Measles virus, Mumps virus, Respiratory syncytial virus

9.Bunyaviridae

California encephalitis virus, Hantavirus

10.Rhabdoviridae

Rabies virus

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11.Filoviridae

Ebola virus, Marburg virus

12.Coronaviridae

Corona virus

13.Astroviridae

Astrovirus

14.Bornaviridae

Borna disease virus

Reverse transcribing viruses

For more details on this topic, see Reverse transcribing virus.

Group VI: viruses possess single-stranded RNA genomes and replicate using reverse transcriptase. The

retroviruses are included in this group, of which HIV is a member.

Group VII: viruses possess double-stranded DNA genomes and replicate using reverse transcriptase. The

hepatitis B virus can be found in this group.

. The hepatitis B virus can be found in this group. ICTV classification The International Committee

ICTV classification

The International Committee on Taxonomy of Viruses began to devise and implement rules for the naming and

classification of viruses early in the 1990s, an effort that continues to the present day. The system shares many

features with the classification system of cellular organisms, such as taxon structure. Viral classification starts

at the level of order and follows as thus, with the taxon suffixes given in italics:

Order (-virales)

Family (-viridae)

Subfamily (-virinae)

Genus (-virus)

Species

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So far, five orders have been established by the ICTV: the Caudovirales, Herpesvirales, Mononegavirales, Nidovirales,

and Picornavirales. These orders span viruses with varying host ranges. Caudovirales are tailed dsDNA (group I) bacteriophages, Herpesvirales contains large eukaryotic dsDNA viruses, Mononegavirales includes non-segmented (-) strand ssRNA (Group V) plant and animal viruses, Nidovirales is composed of (+) strand ssRNA (Group IV) viruses with vertebrate hosts, and Picornavirales contains small (+) strand ssRNA viruses that infect a variety of plant, insect, and animal hosts. Other variations occur between the orders, for example, Nidovirales are isolated for their differentiation in expressing structural and non-structural proteins separately. However, this system of nomenclature differs from other taxonomic codes on several points. A minor point is that names of orders and families are italicized, as in the ICBN.[2] Most notably, species names generally take the form of [Disease] virus. The establishment of an order is based on the inference that the virus families contained within a single order have most likely evolved from a common ancestor. The majority of virus families remain unplaced. Currently (2008) 82 families and 2,083 species of virus have been defined[3].

Tema 3:

Ensayos y métodos empleados en Virología. Cultivos de células primarias y líneas establecidas,. Aislamiento, valoración y diagnóstico de enfermedades virales

En este tema nos centramos en los métodos para valorar virus, como les cuantificamos y como podemos usar técnicas para bioquímica clínica. Métodos : valoración de virus y diagnóstico.

Los virus podemos analizarlos de dos formas: como entidades de macromoléculas biológicas tratándolos entonces como cualquier macromolécula biológica (western, nothern) gracias a métodos físico-químicos que nos permite cuantificar macromoléculas. O gracias a métodos específicos que valoran sus virus midiendo su infectividad, como propiedad de infectar y no como una macromolécula cualquiera (propiedad inherente que le distingue de una simple macromolécula biológica).

Infectividad: capacidad de formar placas de lisis ( se valora con el método clásico que sigue siendo relativamente fácil de utilizar) esta es una forma de medir infectividad, que es la capacidad de producir una lesión o muerte celular en una monocapa de células. Si cultivamos células en una placa de Petri, el virus encuentra a una célula susceptible, la infecta, se multiplica y se expande a las células vecinas por difusión deja un halo de lisis, un “hueco” sin células destaca sobre un fondo de células no destruidas: placa de lisis.

De forma clásica gracias a los estudios con bacteriófagos pero aún no en células eucariontes porque no había técnicas de cultivos de éstas células. En 1958 Dulbecco la adaptó para virus animales observando que también tenían la capacidad de formar estas placas. Hay que tener en cuenta que cada placa de lisis se origina por una partícula infectiva (en origen) esta partícula se la denomina unidad formadora de placa o UFP en inglés es PFU. No todos los virus son capaces de producir placas de lisis ya que esto depende de su biología. Dulbecco tubo que desarrollar la tecnología de cultivos de células eucariotas. Dulbecco lo puso a punto gracias a ese esfuerzo desde entonces las células eucariotas se pueden cultivar. Hoy en día dependemos de líneas celulares que nos permite cultivar virus o ver las placas de lisis de los virus. Una idea esencial de cultivos de células: se realiza sobre soportes, que en la mayoría de los casos son placas de Petri donde las células de adhieren al soporte, y las mantenemos en un medio e cultivo adecuado, la placa es Petri, el medio de cultivo que generalmente es Dulbecco, y la placa de cultivo están realizadas con plásticos especiales que permiten la adherencia celular. Las células para crecer deben de tener un soporte donde adherirse (Excepto las sanguíneas) para sobrevivir. Sobre las placas podemos observar que cuando entran en mitosisis se redondean, se dividen y vuelven a adherir al soporte, salen en suspensión durante un tiempo para volver al fondo del mismo. El medio de Dulbecco consiste en aminoácidos esenciales, fuentes de energía como la glucosa, sales para el equilibrio osmótico y además sales que funcionan como cofactores, y un tampón. Inicalmente este medio fue diseñó por Eagle pero lo modificó Dulbecco , se denomina actualmente DMEM.

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En el ATCC podemos comprar líneas celulares se suele utilizar 3T3, de fibroblastos de ratón, (3 semanas para establecer la línea celular) muy susceptibles a infecciones de virus. Humanas: HeLa : Helen Lane, carcinoma humano PK= pig kindey. El origen de las células pueden modificar los resultados, entonces es conveniente poner en el paper el origen y que tipo celular se ha utilizado.

Para ver las placas de lisis hay que añadir un medio semisólido debajo de las células para que el virus no se expanda por toda la placa, impide la libre difusión del virus, sino el virus destruir toda la monocapa (Se le ha olvidado).

Ensayo adecuado para valorar los virus: Ensayo de placas de lisis puesto en el laboratorio. Por ejemplo, en un tubo tenemos una suspensión de virus de una muestra de agua, para que veamos la cantidad de virus de un cierto tipo del agua de Madrid. ¿Cuántas unidades formadores de placa hay por mililitro en ese tubo? UFP/ml3 hay que diluirlo porque normalmente si hay demasiados virus (0.1ml + 0.9 de h20 = dilución 10-1). De ahí se hace lo mismo = 10-2…. 10-3… De ahí inoculamos en placas que el día anterior hemos sembrado de células susceptibles, lo expandimos, y vemos si hay placas de lisis con el tiempo. 10-3 sale 1 placa en 10-1 hay muchas placas: lisis confluente se fusionan y 10-2 hay varias pero distinguibles el titulo: contamos las placas. La lisis confluente no nos vale El 10-3 solo 1: error estadístico enorme no nos vale El 10-2 es contable. 7 placas de lisis en esa dilución = 7 x 102 placas de lisis en 0,1 mililitros , por lo tanto el título es 7000 UFP/ml. No sabemos que tipo de virus hay ahí.

Primero al saber de donde viene el agua, si es el grifo debería de haber poco= no diluimos. En Aguas fecales, habría de todo, habría que hacer muchas diluciones. Para algunso fagos podemos conseguir 1015 UFP/ml. Cristalizado 1020 UFP/ml. Como mucho se suele hacer hasta 10-12, 10-14.

Esto es aplicable a otras técnicas: diluciones. Virus de plantas Hojas de las plantas también se forman placas de lisis, también llamadas lesiones foliares, sobre árboles, en forma de focos, en muchos casos las hojas funcionan como una monocapa de células. La propia textura de las hojas limita su expansión. Estos virus de plantas se trasmiten a través de insectos.

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Para cultivarlos : Desde la suspensión viral, se aplica sobre una hoja, pero para que la atraviesen la epidermis y las células de las hojas que tienen una gruesa pared que los bloquea éstas deben de ser dañadas , en la naturaleza estos daños son provocados por los insectos o el polvo. Por lo tanto usamos un Abrasivo por ejemplo arena que frotamos produciendo lesiones en las hojas permitiendo que entre el virus. Puede conseguir que el numero de lesiones sea uniforme, y la valoración sea viable. También se usa en este caso diluciones. Además en las plantas cada virus produce un tipo de daño diferente para un cierto huésped por lo que podríamos saber hasta la especie del virus.

Método de Reedy y Munch: valorar virus con otros patrones Suspensión de virus: diluciones igualmente como en el otro caso 10-1… 10-4. Inoculamos con 0.1ml por ejemplo, una serie de placas de cultivo pequeñas por ejemplo 6 por cada dilución. Sin agar:

esperamos unos días y vemos si ya no hay células o no, infectamos cada dilución con el mismo número de placas por ejemplo 6. En aquellas placas que ha caído virus hay destrucción de monocapa o no. Por ejemplo en 10-4 todas prosperan, en 10-1 sólo hay una buena, las demás están destruidas. En 10-3 hay 5 pocillos bien y uno destruido, y en 10-2 50% . por azar puede que de así (Distribución estadística). Dosis infecciosa 50 DI50 a la cantidad de virus que infecta en el 50% De los casos. En este caso es el 10-2. Como esté título lo tenemos a 10-2, el título es una dosis de DI50 x 100x 0’1ml de inoculado, por lo tanto este tubo tiene 103 DI50/ML Sino realizamos la representación gráfica y extrapolamos para saber la dilución, y dividiríamos por la cantidad de muestra añadida. Habría que hacerlo: 1/10^-2 : 0.1.

Dependiendo de la unida de ensayo puede ser entre 10 UFP y 104 UFP. Estudio de virulencia de virus. la virulencia: capacidad del virus de producir una enfermedad que puede llegar a ser letal en un hospedador: Utilizamos animales de experimentación como ratones. Hacemos diluciones de un suspensión, inoculamos a un volumen constante en unos ratones y vemos la dosis en la cual la mitad de los ratones mueren o padecen la enfermedad. Dosis Letal 50 DL50, es variable, nos podemos encontrar un virus de referencia silvestre WT y sus cepas. Puede que el silvestre tenga una dosis letal 50 a 104, la variante A requiere 10 vemos y la variante B 10 veces más. La variante A es virulento y el atenuado el B.

Métodos físico-químicos: como macromoléculas biológicas: componentes proteicos o bien los ácidos nucleicos. Muestra de proteínas de virus: un ensayo de wester blott, se separa en un gel de acrilamida, y se pasa sobre un soporte donde se une a anticuerpos. Semicuantitaivo-cuantitativo.

se

adsorben a los eritrocitos por interacciones no covalentes, cuando esa correcta correlación, se puede hacer una interacción múltiple haciendo que aglutine la sangre. En un tubo acabado en U se mezclan ambos componentes, se deja un tubo quieto para que la sangre decante o no. Si la glutatión es positiva la sangre forma una maya, un gel en todo el tubo y ese gel hace que las células no sedimenten quedando un gel uniforme. Sino hay esta reacción, las células con el tiempo sedimentan en el fondo del tubo: hemaglutinación negativa. En pocillos: punto rojo al fondo de este : ha ocurrido la sedimentación. Esta técnica es rápida 2h, no miramos actividad porque puede que no estén activas, pero solo vemos partículas víricas. 1 UHA (1 unidad de hemaglutinación: depende del ensayo, depende de tamaño usado de tubo y cantidad de sangre usada, es la cantidad mínima de virus para producir la hemaglutinación. Es 1/dilución usada, el virus de la gripe es necesario una concentración de 10^7 virioides para hemaglutinar. También podemos verlos como partículas virales: ME, en rejilla, podemos contar directamente las partículas de virus que hay en una rejilla, y siguiendo la dilución, deducir el número de partículas/ml pero no todos se adsorven bien en la rejilla, y si hay impurezas podemos no distinguirlos bien. Podemos meter bolas de látex pequeñas con una concentración conocida y relacionamos la cantidad de virus con las bolas por ello es mucho más seguro.

Hemaglutinación: empleamos la propiedad que tienen algunas partículas virales de interaccionar G

rojos,

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Ácidos nucleicos:

PCR, así amplificamos en cadena a partir de los oligonucleótidos, esa molécula va a ser amplificada, cuantificar la cantidad de las moléculas susceptibles a la amplificación, muy sencillo, y muy fiable y muy sensible. Saber el número de ciclos y la cantidad final medible podemos saber la cantidad inicial casi inapreciable. Si el virus posee RNA como genoma, se debe de pasar previamente por una retrotrascriptasa antes de iniciar los ciclos normales de la PCR, por ello la técnica se denomina RT-PCR. Podemos realizar psterior un southern blot, para luego cuantificar gracias a computación.

Depende de casa caso, utilizaremos uno o a otro. Una suspensión de virus, la sometemos a una batería de ensayo:

En infectividad: 10 7 UFP/ml reedy-much en animales : 104 DL50/ml Físico químicos, ME: 1010 partículas físicas/ml, y si obtenemos 10 6 UHA /ml. Siempre hay que decir la magnitud que hemos medido, porque dependiendo del tipo de ensayo saldrá un valor u otro, con las unidades correctas. Se pueden sacar deducciones interesantes. Infectividad: 103 UFP/DSL50 : mil ufp para matar 1 animal se necesitan 1000 UFP.

SI COMPARAMOS ufp CON LAS PARTÍCULAS FÍSICAS 103 1000 partículas físicas es una UFP. Nos puede decir que en este preparado, hay varias partículas inactivadas o sin inactividad durante la preparación o en la propia muestra, pero también nuestro ensayo de infectividad puede no ser sensible, a lo mejor solo detectamos 1 porque no funciona bien el ensayo, no es adecuado ese ensayo, pero puede ser útil. Con las UHA: 104 hace falta para una unidad e hemaglutinación.

15-X-08

Diagnóstico: los métodos de valoración de virus nos sirve también para diagnosticar. Deben de ser sensibles y fiables (falsos +), facilidad de ser implementado, complejidad del método. Costes: aspectos en gran escala que importan en el dignóstico. Las UFP son métodos buenos para ver infectividad peor son poco sensibles, no es bueno para diagnóstico inicial, peor sí para aislamiento de virus. Es mucho más importante que se impone en los laboratorios es la PCR tiene estos requisitos: gran sensibilidad, hasta 1 molécula sería suficiente teóricamente, es muy fiable, pocos falsos positivos, pero es fácil contaminar un tubo con otro, los diagnósticos es necesario hacerlo más de una vez. ( aire filtrado, estéril, etc para no contaminar la muestra), es una técnica universal, la única limitación es poseer oligos necesarios para amplificar, debemos saber que queremos amplificar, pero es un problema para diagnosticar un nuevo virus o nuevo variante… debemos de correr en un gel de agarosa el resultado, y a partir de los fragmentos del gel, podemos secuenciar ese fragmento. Genomas virales: no ve los anticuerpos, la respuesta inmune. Puede haber tenido el virus, pero ahora no o está en fase atenuado: ser seropositivo. ELISA: tiene micropocillos, un plástico que permite la adherencia todo tipo de proteínas, el pocillo aplicamos la suspensión del antígeno adecuado y éste se queda adsorbido a la pared, a continuación incubamos con una muestra prueba con anticuerpo (plasma) 1-2horas , se une específicamente al antígeno, todos estos pasos se realizan con lavados, amplificar con un 2º anticuerpo, secundario contra ese anticuerpo general contra la IngG humana , ese anticuerpo va unido a un enzima, que generalmente da una reacción coloreada, permite la detección del anticuerpo, visualmente o no. Y podemos ver si es positivo si hay producto o no. Podemos hacer lo mismo con el antígeno, pero lo primero que aplicamos es el anticuerpo para luego unirlo al antígeno. El elisa reúne las características de sensibilidad fiabilidad, poca complejidad, u bajos costes Dependiendo del curso de la enfermedad usamos un método u otro. Al principio por ejemplo una infección aguda, que prospere en el hospedador, aumenta su cantidad de forma exponencial, para después caer cuando se produce la respuesta inmune puede ser comitante con la subida de anticuerpos. La zona primaria cuando no ay aún anticuerpos, se suele utilizar la PCR, en etapas tardías puede haber sido eliminado (PCR-) , las técnicas de elisa pueden ser mucho más revelantes

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TEMA 4: ESTRUCTURA DE LAS PARTÍCULAS VIRALES , TIPOS DE SIMETRÍAS MÁS COMUNES. ET TAMAÑO MEDIO TIENEN 20-200NM, NO SON VISTOS A Microscopía óptica, peor sí en el electrónico (10-100 Aª) resolución alta que nos permitirían ver los virus. Chorro de electrones, atraviesa una región donde está la muestra y el resultado de esa trasmisión de electores se recoge en una pantalla fluorescente que vemos en un ocular. Una imagen se forma se hay un contraste (diferencias de permeabilidad a los electrones) esa diferencia de trasparencia electrónica da lugar a una imagen. Utilizamos unas rejillas de cobre 2mm (un soporte comparable al porta) hay que hacerle un vacío una vez metido en el miscrocopio. Los virus son permeables la chorro electrónico todo el no se forma ninguna imagen. Ay que utilizar metales pesados que son opacos a los electrones. Técnica del sombreado: se generan sombras, por la sombra que deja cuando se somete a un chorro del metal pesado, desde un filamento a alto volaje produce una nuve de metal pesado. Si se sombrea dede un ángulo, dejarán zonas sin cubrir o cbiertas: sombras. Las zonas de las sombras son permeables a los electrones, lo que veos son la sombra, se puede saber la forma, el diámetro que tiene. Tinción on c acetato de uranilo u óxido de osmiode átomos pesados, opaca al chorro electrónico. Tinción positiva: sales que se pegan a la sproteínas del virus, vemos en negro el material bº (óxido de osmio) a veces se tiñe de forma negativa, tiñe todo menos el material biológico (acetato de uranilo).

FALTE 1 DÍA, APUNTES A MANO DE HELENA.

22-x-08

el número t: el número de triangulación, el úmeor de subunidades que tenemos, los virus puedne tener diferente svalores de t , t= 1 es un icosaedro perfecto, el numero de triángulos que tiene en la cara icosaédrica. Es muy variable, el t3 es muy usado, el t=12 también… como se puede calcular los valores de T. ¿Cómo calcular números T en la naturaleza? Ver hoja El triángulo grande está girado, las subcaras no coincide con los triángulos pequeños, sin embargo hay un número entero de triángulos internos, el número de triángulos elementales pequeños es un número entero. El número T es el numero de triángulo pequeños en una cara del icosaédrico T= area del triángulo grande/ el área del triángulo pequeño. Cálcular el área de un triángulo pequeño. De lado L : base x altura /” para un triángulo equilatero de lado l el área es a= (l^2 · raiz 3)/ 2. Sabiendo el lado sabemos el área. El lado a-b será la hipotenusa de un triángulo equilátero. Para el área del grande L2 RAIZ DE 3/” B2+BC+C2 =

B2+BC+C2

Identificar 2 vértices pentaméricos, ir de ahí a otro, y luego contar el número de pasos. Los adenovirus: las alteraciones en la simetríaa de la cáspicda es compensada con proteínas que estabilizan las cápsidas, proteínas del cemento. Se intercalan entre capsomeros cementan la cápsida y da estabilidad. Rompiendo las reglas de la asimetría. Virus SV40 polyomavirus, la cápsida está formada por vértices pentaméricos , toda la cápsida, no hay pentaméricos y hexamércios, no son 12 son más de 12 y no son hexamércios. Rompe la teoría de Cuasiequivalencia. El virus sus subunidades, en el extremo carboxilo se produce un bucle o clip , un gancho engarzados unos con otros, ese conjunto de enganches, es la que confiere estabilidad ala partícula. Una solución biológica. Como se agregan la subunidades d eproteína. Una mayor resolución: cristalizar, desde los años 80 se consiguieron los primeros critales de virus: difracción de rayos X, con mapas atómicos de los aa de las cápsidas. Los cristales muy dificil de conseguir: en grandes cantidades, muy puros, (en plantas fueron los primeros) y por fortuna puede formarse cristales o no. Los virus con envuelta y flexible son cristalizan, no tenemos resolución atómica.

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Pa k coño vale estoooooooo? Porque forman una cápsida, estables que prevalecen en la naturaleza, esturtcura 3º tal que interaccioanna con las subunidades etre ellas, mediante láminas B , forman verdaderas nuves hidrofóbicas que confiere estabilidad a la partícula.

La superficie, las partículas virales, lo k observamos esque las superficies no son uniformes, es como una sierra con montañas y valles, donde hay mucha información biológica, esta topologíaa tiene un significado biológico importnate con diferentes funciones.

Un parvovirus, un punto central es un vértice pentamérico, con sucors (cañones) regió deprimida rodeando a un vértice pentamérico, hay 5 picos alrededor, hay gran diferencia entre esto y el surco. Los puntos más prominentes: interacciones con anticuerpos, las regiones más antigénicas sistema inmune reacciona más fuerte y las depresiones con receptores que reconocen las células.

Virus Helicoidales. Por ejemplo el Ébola varilla flexible, sin envuelta, Virus de la gripe, las varillas están plegadas, con envuelta etc, poco parecido a simple vista pero comparten la misma simetría. Simetria helicoidal, muy frecuente en biología, las proteínas de la varilla, interaccionan con el ácido nucleico de manera regular, (diferencia con al icosaédrica no interviene el acido nucleico en la formación de la cápsida) suelen ser virus de RNA en cada subunidad de proteína hay un surco donde se aloja la molécula de RNA. Se llama nucleocápsidas, interacciona directamente. El ácido nucleico con las proteínas. Se suele hablar de pitch “paso de rosca” distancia lineal entre dos pasos de la hélice , vuelta de 360º.el número n: número de subunidades de proteína por vuelta de la hélice. Y el diámetro de la hélice: parámetro que nos define características de cada virus. El ángulo que forma respecto al ángulo de la hélice 2 sub de proteína. TMV con simetría helicoidal, forma una varilla muy rígida con morfología definida casi cristalina. Diferencia química:

están en los enlaces dentro de la partícula, ocurren entre las subunidades de proteína y el AC.nucléico. hay una profusión de enlaces entre el RNA y cada subunidad proteica. En as subunidades con frecuencia son alfa hélices y no

b laminal como los icosaédricos 1 vuelt de hélice: 2 subunidad de proteína y un 2 vueltas de RNA.

Surgen Enlaces hidrofóbicos: entre las bases de RNA y los aminoácidos hidrofóbicos de la proteína. Son fuertes, surge en toda la partícula viral y da rigidez y fuerza. Enclaces iónicos: aminoácidos cargados + con – del PO4.

Envueltas de los virus:

Envuelta lipídica, la membrana en sí está derivada por la membrana de la célula (golgi, nuclear, RE…mp) la adquiere de la célula huésped no tiene metabolismo para fabricarla. En esta membrana lipídica tenemos con frecuencia dispuestas las proteínas ancladas en la membrana del virus, muy prominentes ancladas en la envuelta del virus: proteínas codificadas pro el virus, glicoproteínas. En forma de espículas, por ejemplo los coronaviridae (espículas muy prominentes ) densidad de glicoproteínas es menor o menos prominentes, como en el caso de la gripe. Juegan un papel importante en el ciclo vital, no hacen fundones de las células huésped. Interaccionan con los receptores de la células, inician la infección serán objeto, de la respuesta inmune, del hospedador, contra dominios de

la proteína, como el virus evade la respuesta inmune.

Son proteínas de membrana de a célula, poseen un paso de sínteis y segregación similar de las proteínas de la célula, con frecuencia, tienen su extremo amino con aa hidrofóbicos: péptidos señal, esta señal, permite a la proteína asociarse a los lípidos de RE (Como cualquier proteína de membrana , su paso inicial) . ese dominio hidrofóbico interacciona con la partícula de reconocimiento de la señal, SRP interacciona con interacciones hidrofóbicas con la proteína naciente del ribosoma, lleva al RE donde hay receptores para la srp. La proteína es depositada finalmente en el lumen del RER, cuando la bisoínteis continua, se secreta al RER, la proteína madura no tienen péptidos señal, hay procesaiento postraduccional, y eso permite que la proteína vaya sintetizándose, , pasan a las membranas del goly , y llegan a la mp de la célula infectada.

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Esa maduración, se añade azúcares, puede fosforilarse, adquiere su plegamiento correcto, formando oligómeros muy variados. Estos azúcares suelen ser manosa NAGlucosamina, la manosa es muy abundante al principio y puede sustituirse posteriormente, no hay reglas en absoluto, son muy variables, los azúcares para el mismo virus, puede ser muy distintos. Durante algun tiempo se creia que de forma directa modulaba la sfunciones de la proteína pero se

cree hoy en dia que no, peor sí controla que s epliege bien. La nucleocápsida se esta sintetizando a parte y al final la cápsida, va a reconocer con su envuelta, la adquiere y sale

de la célula infectada.

HIV hay dos proteínas llamadas gp (gliproteína) gp120 y gp41, la interacción con el receptor, lo realiza la gp120, pero la

gp41, tiene funcione simportantes. La membrana es la membrana de célula. Un dominio transmembrana : señal de anclaje, hidrofóbicos. (+ señal perdida para entrar en la vía secretora) el principal dominio de la proteína es extraviral, globular, tiene azúcares, es muy variable, dependiendo de la célula que infecte virus, tiene importancia en el plegamiento y no en el reconocimiento del receptor.

Hay una región inmunodominante: especialmente antigénica. Péptido de fusión, permite al virus, cuando encuentre una célula mediante el receptor, va seguida por la gp41: péptidos

de fusión, los virus con envuelta entran en la célula por fusión de membranas. Este péptidos es hidrofóbico, y se va a

intercalar entre los lípidos de la célula y va a promover la fusión de ambas membranas.

No hay una secuencia definida sino el carácter hidrofóbico es lo importante.

El gp41, ese péptidos de fusión es una propiedad universal. Realiza esa función en un momento preciso de la entrada

del virus, una vez unido el 120 al receptor, se inducen cambos conformacional en gp41, exponiendo el péptidos de fusión, fusionando las membranas. Virus de la gripe

Proteína muy prominente HA, hemaglutinina (aglutinación de eritrocitos) le permite hincar la infección, el receptor de

la célula res reconocido por la hemaglutinina. Esta proteína tiene péptidos de fusión. Fusionar membranas, está en la

misma proteína. es una proteína muy prominente, con señal de anclaje, y con un dominio enorme extraviral, son alfa hélices que confieren la conformación de la proteína, hay láminas beta donde exponen los tios de glicosidación, hay que ver la cantidad que hay de ellos, se ha propuesto que estos azúcares impiden la acción de los anticuerpos, sale

de la respuesta inmune, la proteína tiene un péptidos de fusión, no interviene hasta el momento adecuado, el dominio

del receptor esta en la parte más distal, definida pro las láminas beta, el dominio del recptor está bastane deprimido, está bastante conservada, los variantes de cada año, en base de su capacidad de variabilidad genética, hay una region no puede cambiar mucho reconocer al receptor, esa región está deprimida, en la parte distal de la proteína, es difícil que

el sistema inmune reconozca esa parte, así pude evadir el sistema inmune.

Hay interacciones de la nucleocápsida entre las proteínas virales y esta, por lo tanto, concentra las proteínas de los virus, y salen pro gemación, el virus, solamente suele tener proteínas víricas.

Tema 6:análisis GENÉTICO DE LOS VIRUS:

donde están qué genes tienen y cómo están dispuestos en el genoma. Localizarlos y mapearlos en el genoma del virus . Es esencial disponer de mutantes respecto a un virus silvestre “WT “queremos aislar mutantes que tengan alteradas algunas funciones virales: ver que función tiene, interacciones con el hospedaros o funciones en el ciclo vital del virus. Estos mutantes tendrán alterado el genotipo, alterado su secuencia de núcleotidos, y el fenotipo, el comportamiento del virus en el organismo, y esa alteración fenotípica podemos rastrearlo, nos dicen cosas sobre las funciones de los genes. Obtención de mutantes:

O bien les creamos por métodos de ingeniería genética o bien podemos aislarlos a partir de poblaciones de virus que

tienen mutantes. (ingienería genética vs genética clásica).

Genética clásica:

En ocasiones las poblaciones de virus, tienen una diversidad genética alta, como los de RNA, cambios frecuentes de material genético, de manera espontánea. Los virus DNA tienen frecuencias de mutación más baja,aislar mutantes es

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más difícil. Si queremos entonces obtener una gran variabilidad, podemos inducir mutaciones para aumentar la fr de mutantes. Con agentes mutagénicos: químicos biológicos, físicos. Nitrosoguanidina, ultravioleta

Tipos de mutantes:

1) Mutantes de morfología de placa: muy común muy visible. Si tenemos un virus silvestre, que sabemos la morfología que da las placas de lisis, si a partir de esta muestra la irradiamos con UV , si se añade sobre una monocapa de células susceptibles: encontrar alteraciones en las placas de lisis. Cada una de estas placas de lisis vine de un clon (conjunto de individuos de genotipo idéntico) podemos picarlas y ahí podemos obtener un mutante. El por qué: la placa de lisis es muy sensible a los cambios genéticos del virus, cambios del genotipo a muchos niveles: EJEMPLO: más pequeña la placa de lisis , puede tener una mutación en el receptor a la célula huésped, tendrá problemas para infectar. Más grandes: las polimerasas pueden ser mucho mas activas.

2) Mutantes resistentes a anticuerpos: podemos tener un virus, en el que puede ser reconocido por un anticuerpo que hemos obtenido, es más útil tener un anticuerpo monoclonal Mab, que casi siempre lo hemos obtenido en ratón, reconoce sólo un epítopo de la partícula. Cando el virus silvestre se pone en contacto con un monoclonal no forma placas de lisis , está neutralizado, es incapaz de infectar se lo impide el anticuerpo. Hay mutantes que podrían escapar al anticuerpo: aparecerían placas de lisis, se les llama MAR (Monoclonal antibody resistant). Deben de tener un cambio genético que les permite ser resistente , de interés seguro para entender el mecanismo de infección, analizamos estos mutantes MAR, analizamos el genoma , observamos los cambios genéticos, que serán los responsables de la cápsida, definan un dominio de la cápsida donde podemos suponer que se une el anticuerpo. EXAMEN: ¿ Cómo definirías el dominio que reconoce el anticuerpo?, gracias a los mutantes MAR. Porque además es incapaz de infectar? Pude que reconozca es aparte el receptor de la célula.

3) Mutantes resistentes a fármacos-drogas: tienen actividad contra virus, son antivirales . Ejemplo HIV en placas de lisis (teórico) tenemos un antiviral eficaz AZT de los primeros que se produjeron, si es eficaz, no forma placas de lisis. Pude aparecer de forma espontánea resistentes a la AZT, podemos ver de forma espontánea mutantes resistentes son virus AZT R , realmente son mutantes o se han escapado? , clonamos este virus, y lo volvemos a plaquear en presencia de AZT, si realmente es mutante debe de dar miles de placas de lisis. Los mutantes AZT R son bastante comunes, tiene gran capacidad d emular, cuando se inició tratamientos de hace 10 años con AZT, los virus que circularon por Madrid eran sensibles hoy el porcentaje de resistencia se acerca al 50%, se seleccionan, la selección de mutantes que tienen ventaja. Estos resistentes tienen mutantes en la reverso-trascriptasa, por estructura, podemos localizar las mutaciones que permiten que sean resistentes, permiten con bastante precisión el sitio de unión con este fármaco, sino estamos seguro sería cristalizar la proteína junto con el fármaco. Interesa que se unen en varios puntos , varios fármacos diferentes y la inhiban. Intentamos predecir un fármaco a partir de la estructura, que fármaco diseño para que se una en un punto y la inhiba.

4) Mutantes de rango de huésped u hospedador : “horst range” en este caso tenemos un virus silvestre que infecta células re ratón, ero sin embargo en células humanas es incapaz, hay virus con un rango de hospedador muy amplio y otros muy estrecho. Podemos inducir mutaciones con algún mutágeno o bien dar pases forzar una adaptación, inoculamos los virus en la monocapa, al cabo de esos días destruimos en la monocapa, volvemos a inocular eso en la monocapa hacemos un homogenado, lo inoculamos esos en una monocapa sana de células humanas, puede tener la oportunidad de adaptarse, repetirlo n veces, darle pases, forzándole, acabo en el número de pases podemos adaptar los virus, tenemos un mutante de rango de hospedador, ha saltad de especie. Para ver que tiene este mutante HR, tendrá las mutaciones que sea que se pueda adaptar a este tipo de hospedador. Son experientos “prohibidos”, normalmente e sal revés para saber modelos de enfermedades humanas.

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Una vez que tenemos los mutantes debemos de localizar los genes afectados, llevaría a hacer un mapa genético, nuestro objetivo es tener un orfen genético en el genoma del virus, sabiendo como están ordenados en el genoma. No es distinto a lo que se hace con otros organismos, hoy en día con la secuenciación automática, podemos ver las diferencias de genotipo y por ello localizar el gen, con lo cual hoy en día no se suele hacer mapeo genético de forma convencional por recombinantes. Mutagénesis dirigida: cambiamos el genoma en el punto exacto y un cambio determinado. Por ejemplo una proteína, una zona determinada es la que reconoce el anticuerpo? Si cambiamos el aminoácido por otro, podemos sintetizar un oligoucleótido, exacto a la secuencia de alrededor, excepto un núcleotido del codón del aminoácido. Por ejemplo de leucina a aspártico, producimos un cambio radical. Vemos el fenotipo del fenotipo para ver si corrobora con la hipótesis. Lo primero trabajamos en u plásmido, que tengamos el fragmento del virus que queremos mutagenizar, en este pelasmido hacemos la mutagénesis con el oligo con mutación puntal, lo hacemos mediante PCR, una vez mutada hacemos una inserción con una enzima de restricción y una ligasa.

Si alteramos la funciones en los mutantes el reto es ver que genes está afectada , clásicamente se hacía con mapeado genético, ahora es al revés ocn la ingienería genética, a partir el gen mutad se intenta observar la función de ese gen. Mutantes defectivos interferentes, estos mutantes llamados DI, estos mutantes son típico sde virus de RNA, se generan en poblaciones de virus de RNA, porque con frecuencia tienen sus polimerasas de baja fidelidad (Cometen muchos errores)

El virus debe de replicarse en el interior celular debe de tener una polimerasa que haga copias de RNA a partir de RNA,

porque no la tiene las células, tienen sus propias polimerasas para hacerlo, cometiendo muchos errores. Errores: uno está copiando omitiendo un trozo produciendo delección. “se cae del molde” y luego reinicia la síntesis porque tienen estructuras secundarias los RNA omite un bucle de zona secundaria, se produce una delección

importante en la progenia del virus.

A

veces se han encontrado genomas que aparecen con morfologías curiosas, se cae del molde pero vuelve a copiarse a

mismo, produciendo una estructura plegada en si mismo: delecciones importantes del genoma parental.

Los mutantes de delección la mayoría de ellos no son seleccionado porque carecen de genes esenciales, pero alguna spartículas DI pueden seleccionarse positivamente, se enriquecen, van ganando terreno al virus silvestre en las coinfecciones. No se sabe muy bien porqué a veces, se ha sugerido que estas estructuras dobladas a sí mismo, las polimerasas las reconocen mejor, las replica más, es un fenómeno revelante sucede tanto en el labatorio como en la naturaleza, puede se run mecanismo por el cual atenúan las enfermedades, las infecciones que producen, puedne tene runa ventaja evolutiva, si WT es muy agresivo y mata, no tiene una ventaja evolutiva porque no quiere cargarse al hospedador, Las partículas defectivas interferentes sirve para atenuar las enfermedades y permitir que prevalezca la

naturaleza, como atenuantes.

Evolución en virus:

Mecanismos genéticos, que generan diversidad genética y que sobreactúa la selección , la selección elimina la diversidad, así prevalezca unos cambios genéticos sobre otros, dejando mayor cantidad de individuos que posean mayor eficacia biológica o fitness. Mecanismos que generan diversidad:

1) mutación tiene que ver con lo anterior, con la fidelidad de las pilimerasas, se generan sobre todo en la naturaleza, por las polimerasas del virus cuando copian los genes. En el mundo de DNA la frecuencia d emutación cuando es replicado está en torno a 10-8, 10-11, en el mundo de RNA esta frecuencia puede oscilar entre 10-3, y 10-6, de cada 1000 veces 1 vez va a cometer un error en la replicación en ese punto específico. Es muy importate en la naturaleza así evolucionan más rápidamente que los hospedadores. Lo hacen con un millón de veces más frecuente, tienen una capacidad de evolución 1 millón de veces más rápido, esto e smuy revelante para la vida de los virus RNA. (porque los virus de RNA son tan difíciles de eliminar como la gripe o VIH) es un arma muy poderosa. En el mundo de DNA tienen mecanismo de reparación, y en el RNA no hay mecanismos de reparación ni sus polimerasas lo tienen, por lo que las mutaciones prevalecen en vez de eliminarse.

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En os virus de RNA todos los individuos no son iguales, las poblaciones no hay homogeneidad genética por lo que se ha acuñado el término de cuasi-especie.paradógicamente, si le hace uan secuencia a toda la población, y la secuencia promedio es idéntica a la suencia homogénea, pero si clonas los clones son diferentes, cada una de los cambios genéticos, no lo ves con una secuanción porque te saca el promedio, ningún individuo tendrá la secuencia prototípica de la especie. Si hay una presió selectiva d etal forma que todos los indivíduos desaparece excepto uno (solo prospera un tipo de genómico) (por ejemplo en salto de especie) cuando empiece a replicar ene la nueva especie, produce su cuasiespecie, la secuencia promedio es la secuencia del primer virus que pudo infectar pero ninguno de sus descendientes lo tienen. Con mucha frecuencia mete mutaciones letales, muchos individuos son inviables o próximos a la extinción de baja variabilidad, la especie prevalece porque son poblaciones muy grandes (Característica de cuasi-especie). Hay virus de RNA que no generan cuasiespecie, no son muy diversos.

2) Recombinación, sucede en virus de RNA y DNA, pueden reocminar porque las polimerasas puedne saltar de molde, cambiando de molde para generar genoma recombinantes “copy –choice” peor no genera la diversidad genética de la mutación. 3) Reordenamiento: virus que portan en su genoma , en forma fragmentada, por ejemplo el caso de la gripe, Reovirus , genomas RNA en forma de fragmentos, en estos casos se pueden generar una especie de “recombinación monstruosa” hay intercambio de fragmentos de virus, virus reordenados. Bruscamente aparece virus que teiene genes enteros fragmentos enteros de diferentes virus. Como en el virus de la gripe 8 fragmentos en la naturaleza evoluciona por mutación y quasiespecies de manera brusca, formando epidemias anuales, muchos casos se generan por este mecanismo, formándose virus distindos de golpe, virus distintos que intercambian fragmentos. Muchos de ellos puede que no sean viables pero puede que tengan mejor adaptación

4)

Falta un dia

Interacción con las células:

Inducción de lisis celular Transformación: inducir la proliferación celular, y la formación muchas veces de cánceres y tumores Esquema libro Infección crónica, cuando los virus prevalece en las células no son eliminados, dentro de las infecciones crónicas se Puede sublcasificar:

Persistentes: el virus y la célula prevalecen , hay una interacción en que se van dividiendo y prevalecen, el virus no mata la célula, el virus va con las células descendientes, el virus podemos verlo que está ahí pero no lisa las células. De vez en cuando una célula entra en lisis produciendo progenie viral, otras que lo tienen en forma persistente, y otras células se hacen resistente al virus. La persistencia es común, y establece una relación virus-hospedador muy evolucionada, implica una convolución del virus y de la célula el virus inicial cambia genéticamente para infectarlas mejor, y las células se hacen más resistentes, son seleccionadas genéticamente para impedir que las células mueran por el virus. Crónica latente: es igual que la anterior pero a diferencia, de la anterior no vemos partículas virales, si el material genético, con una expresión limitada o nula genéticamente, puede haber ciclos de activación que puede desencadenar ciclos líticos, peor antes que se produzca prevalece en las células sin que haya producción de partículas virales, n vemos partículas. La latencia no es producto del azar, ni nada de eso, sino que es una estrategia vital del virus, muy adaptados a los hospedadores. Un mismo virus puede interaccionar de diferentes maneras con las células hospedadoras.

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Efecto citopático, en términos genéricos estamos asignando un cambio celular en una infección viral, estos cambios son de distinto tipo:

Morfológicos a raíz de una infección viral, por ejemplo los fibroblastos en cultivo, las células redondean y pierden el contacto con las placas de cultivo, y se levantan del soporte , pierden adherencia. Estos cambios morfológicos puede dar lugar a al lisis celular hay una desorganización general de la célula el citoesqueleto se desorganiza, las membranas pierde las estructuras, el golgi desaparece, la membrana nuclear puede destruirse, y la membrana plasmática se lisa. La lisis es el reflejo de cambios profundos en las macromoléculas de las células. Cuerpos de inclusión: cualquier estructura en el citoplasma que corresponde a sitios de las células donde se están ensamblando virus, pueden ser nucleares o citoplasmáticos, se les llama también factorías, puntos donde se están produciendo virus. Pueden llegar a ser prominentes.

Sincitios son el producto de la fusión de las membranas infectadas, aparecen células multinucleadas, lo realizan virus con envuelta, con membranas, van a promover la fusión de membranas celulares. Transformación: aparece focos de transformación, efecto citopático.

En células normales aparecen monocapas, cuando aparece una virus trasformarte, las células pierden la adherencia y se producen abultamientos de varias capas de células, perdiendo el control del ciclo celular Cambios bioquímicos, en el metabolismo de las células que pueden afectar a la síntesis de proteínas ac. Nucléicos… Alteración de la síntesis de proteínas, lo que quieren es propagarse, necesitan la maquinaria celular, y en una célula infectada compite con la maquinaria celular por la síntesis de la célula. Pueden tener el mecanismo de inhibir la síntesis de proteínas de la célula, shut-off “ corte brusco” por ejemplo poliovirus infectando a las HeLa. Infectamos un cultivo, cada hora añadimos metionina-S35 radiactivo para trazar la síntesis de proteínas, cada hora, damos pulsos de una hora y vemos el patrón de proteínas que están sintetizando. En la primer ahora vemos en la autorradiografía del gel un patrón complejo a partir de la 4º hora, el patrón se simplifica y se selecciona las proteínas del virus a la 5º y 6º hora son proteínas del virus, proteínas estructurales y no estructurales, (podemos verlo con un western blot) ya no hace proteínas de las células, es un efecto espectacular . Muchas veces no podemos explicarlo molecularmente. El complejo de iniciación, para que sea estable, hace falta la contribución de factores, de iniciación eucariotas EIF para que pueda empezar la traducción, aquí es donde actúa mucos mecanismos de regulación. EIF4G , aglutina a otros muchos, este factor va a ser degradado específicamente por proteínas del virus, proteasas, en sitios de corte exactos ( HIV, poliovirus) en casos de que esté intacto todo el mRNA podrá traducirse, peor cuando se corta, los RNA normales de la célula con un cap, y poliA no podrán ser traducidos, no es operativa se forma el complejo de iniciación , sólo se traducen RNA del virus con estructuras llamadas IRES con una iniciación interna, no en el extremo del CAP. Si se clona el fragmento IRES en un gen, será también independiente del EIF4G . Lo primero que se produce es la proteasa, por lo que al poco tiempo, cuando la proteasa esté lista de funcionar, sólo se sintetiza proteínas del virus. En el caos de la polio actúa a nivel de 4g igual que HIV, el virus de la fiebre aftosa, y hay virus a nivel de otros factores, ya sean por degradación o por modificaciones postraduccionales. Uno de los mecanismos mejor conocidos y aparentemente de mayor eficacia de resistir a los virus a nivel tradicional es la kinasa PKR, que es una kinasa citoplasmática, se activa cuando aparece en el citoplasma RNA de doble banda dsRNA, producto de la replicación de muchos virus, no existe en la células eucariotas. Dispara a la actividad de la PKR que tiene dominios de reconocimiento el resultado es una fosforilacion del EIF2 inacción de la traducción 2 se fosforila fuertemente por la kinasa. No hay iniciación de la síntesis de la proteínas, a otro nivel, no son funcionales de la traducción, el resultado es que no hay traducción de ninguna clase. Inmunidad innata de las células. Naturalmente el resultado la célula acaba muriendo, peor cumple su objetivo de detener la infección del virus. La evolución sigue y surgen virus para evitar el mecanismo de la PKR, los virus hacen proteínas que inactivan a la PKR como muchs virus, como adenovirus, y herpes codifican proteínas que se unen a la pKR y la modifican, y por otra parte hay también estructuras del RNA hay IRES determinados que permiten la traducción aunque EIF2 esté fosforilado Producto de la evolución. Una vez que se ensambla la subunidad grande, se traduce de todas formas, los factores 1A Y 1B que regulan la traducción a este nivel , que son factores diana de la acción viral.

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Virus de la gripe, los mensajeros de la gripe consiguen la mayor eficacia a nivel de traducción. Dentro del pool de mRNA tienen distintas capacidades de traducción, con diferente eficacia, dependiendo de la secuencias 5’ próximas al Cap, +- afines a los ribosomas, este virus, los mensajeros de la célula los degrada en 5’ y aquellos extremos con mayor afinidad por los ribosomas, las captura las roba y las añade a los mensajeros , como consecuencia tienen mayor afinidad a los ribosomas, y les permite iniciar la traducción con mayor eficacia: cap-snatching.

FALTA 1 DÍA JC Atravesar las membranas para que la partícula entre en la célula. Virus de DNA, invadir el núcleo porque está la maquinaria transcripcional de la célula polimerasas etc, por lo que tienen que ir al núcleo. La membrana nuclear es distinta a la membrana de la célula, porqué está flanqueada por los poros nucleares que no son admitidas por tamaño, hay partículas como el Herpes que va al poro y una vez allí inyectan el DNA al núcleo otros muchos, no sabemos como lo hacen.

El polyomavirus, virus de DNA, desoxivirus, de desarrollo nuclear, modelo de desarrollo nuclear, el más conocido es el SV40, virus oncogénico, fe modelo molecular en los años 60-70. El virus entrega su DNA en el núcleo aunque el camino es más difícil . El DNA puede utilizar la maquinaria transcripcional y de replicación celular para replicar su genoma. El proceso comienza la trascripción se hace mRNA, se traduce en el citoplasma en proteínas vuelven al núcleo a través del poro nuclear porque tienen secuencias cariofílicas, donde completan el ciclo vital del virus. Los virus cuando infectan las células tienen un programa de expresión génica, sus genes no se expresan de forma caótica sino que se expresa de forma ordenada en el tiempo para que todo vaya bien. Hay etapas de transcripción tempranas y tardías, esto aparece en todos los virus. La transcripción temprana o early y transcripción tardía o later. Para evitar su autocompetencia, para ordenar mejor su potencial de expresión génica, que la cantidad de partículas virales sea la mayor posible. Entre las dos etapas está la etapa de síntesis de DNA, replicación, se abre ala orquilla de replicación, y cuando se transcribe es a través de un promotor de DNA de doble banda. Cuando hay replicación no hay transcripción y viceversa, se para la transcripción temprana, se hacen muchos genomas y se hace la trascripción tardía a partir de los genomas que se han originado. La transcripción temprana lo que quieren expresar es maquinaria de replicación suya, la primera transcripción no está dirigida a componentes estructurales sino no estructurales que permita la replicación del genoma: óptima para adueñarse y competir con el genoma celular para replicarse el suyo. La tardía: sobre todo a componentes estructurales cápsidas para empaquetar el DNA que se ha sintetizad previamente y para formar el máximo número de viroides. Esta etapa se la concoe como encapsidación e genoma , conoce porque proteínas estructurales vuelven al núcleo e interaccionan con el DNA para ensamblarlo en cápsida, cuando el genoma del virus se encapsida, la morfogénesis del virus, son etapas no muy bien conocidas en muchos casos. Hay todo tipos de soluciones, hay virus que la molécula de DNA interacciona con las subunidades de proteínas, las va nucleando para formar la cápsida, es el DNA el que dirige la encapsidación. Primero se conoce una cápsida vacía, no totalmente compacta porque permite la entrada del genoma. Deja algunos poros, físicamente que se pueden ver y a partir de estos poros, entra la molécula de DNA y se encapsida. Porque las proteínas forman la cápsida: per-se tienen esos barriles beta que interaccionan entre ellas y forman las cápsidas, interaccionan entre ellas por sus dominios de interacción. Las partículas salen del núcleo por un proceso que no se conoce muy bien, pueden que lo destruyen o de forma activa no destructiva. Poliovirus: virus de RNA de desarrollo citoplasmático. El núcleo no participa en nada en su replicación y ciclo vital Entra a través de un receptor, es un virus de +RNA , puede actuar como un mRNA, se copia a dsRNA a través de una polimerasa de RNA, se genera a partir de este dsRNA se forman RNA que son mensajeros. Esto se generaliza al RNA. Una cosa para replicarse que pasa a través de RNAds, y otra cosa es que ahcer RNAM transcripción. En seguida libera su genoma, interacciona con el receptor y enseguida la cápsida se abre y libera el RNA, cambios de conformación del acápsida, apsa a ser un mensajero más de la célula es te RNA accide a los ribosomas y es traducido. Entonces en el caso de la polio, hay ods proceos distintos complementarios, uno es la traducciónnd e proteínas y otro es el metabolismo del virus, replicación y transcripción, sucee en estas vesículas grandes de las

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celulas en una especie de nucleo que el virus que fabrica a partir de las vesiculas celulares dos compartimentos, dedicaso da prtoteinas y al replicarse. Todo el genoma del virus se transforma en una gran proteina que va a ser procesada a las proteínas que la compone pro cortes proteolíticos para dar lugar a las proteína del vius, es muy importante en poliovirus. Maximizan el potencial genetico, dependiendo del corte da lugar a una proteina u otra. Estas proteinas hay polimerasas del virus, que replican y transcriben los RNA viruales. Hace estso intermedios de doble banda, hay un paso de doble banda y una vez así, se transcribe por la prolimerasas del virus, esta fábrica de mensajeros, van saliendo estas vesículas, y van a los ribosomas , a mayores cantidades, y todo va aumentando en cascada. L RNA no se sabe como atraviesa la vesículas. Otas veces estos mrna interaccionan con proteínas de la cápsida y se forman las partículas virales, organiza el citoplasma a su medida para expresar su material genético de forma genética, se forman factorías, donde se hacen macromoléculas del virus (Rna o proteínas, estas vesículas serían factorías). -RNA: rhabdovirus ejemplo el de la rabia, en estos casos el virus, tiene envuelta, y tiene una nucleocápsida helicoidal, entran a través de receptores el RNA se libera en el citosol, este RNA es un RNA- , no pude ser traducido a los ribosomas, y es una molécula de RNA que se quiere replicar en el citoplasma y no puede traducir y replicar, su propia partícula lleva alguna molécula de polimersas, de forma que el RNA del propio virus, sin que haya traducción, va a ser copiado mensajeros del virus, y alguna replicación, el virus se relaja su estructura y as polimerasas queda rodeadas en el RNA que lo protegen y lo usa para transcribir, hay una transcripción localizada, y se producen los primeros mensajeros, entonces, estos mensajeros van a ser traducidos y se producen proteínas que disparan el ciclo vital del virus, algunas de esas proteínas son polimerasas, replican las proteínas para que el ciclo amplifique su cascada. -RNA s propia polimersasa se produce mensajeros + (pequeños) que se van a traducir, y va a ver copia a doble banda, que van a servir como olde para hacer mas mensajeros. Moforgénesis de un virus con envuelta es diferente, la morfogénesis : hay dos caminos de producir virus, las proteínas de la envuelta y las proteínas d ela nuclocápisda, las proteína de la envuelta va a la via de la exportación, RER, GOLGI y se anclan a la membrana de la célula, la célula infectada esta llenado su membrana de proteínas del virus, para madurar la propia membrana plasmática, a partícula se forma en la propia membrana plasmática. Sucede pero una interacción proteína proteína entre la nucleocápsida helicoidal que se acaba de hacer y la proteina anclada. Para formar la morfología de bala de cañón. Virus icosaédricos que maduran en membranas. La interacción entre las proteínas del virus excluyen las proteínas de las células. Salida por gemación nunca emos partículas nacientes en el citosol, solo las veríamos en la membrana.

Familias principales de virus:

Camino inverso de RNA a DNA, agrupa a estos virus en una familia con mucho éxito Biológico. Generalidades: envuelta con glicoproteínas, cuyo interior tiene una nucleocápsida proteica. Tienen envuelta, las glicoproteínas suelen ser dos gp1 gp2. El genoma son dos molécula de RNA en forma de genoma diploide, no se sabe el porqué. Se pueden dividir su genoma en 3 genes: gag pol env Env envuelta, glicoproteínas del virus con un dominio transmembrana y una proteína más exterior (generalmente unida covalentemente a la anterior). Pol se agrupan la sporteinas que replican el genoma: la reversotranscriptasa y la integrasaintegra el genoma del virus en una célula. Estas dos proteínas están en el interior de la partícula viral, el virion. Los genes gag, antígenos de grupo, “gag” las proteínas que permiten clasificar los virus por serotipos, aquí hay que agrupar a la cápsida, la nucleocápsida, el genoma asociado a ciertas proteínas que la acompañan. Matriz, capa de proteína en virus con envuelta, entre la propia envuelta y la cápsida, se le llama la matriz. las funciones muchas veces no son conocidas. Y la proteasa permite procesar sus proteínas. En los extremos del RNA del virus encontramos una secuencia repetida o R, importante en la replicación y a coninuación en un extremo única, en el extremo 5’ está U5 y en el 3’ U3 RU5 GAG POL ENV U3R

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TIENEN DOS FORMAS DE TRANSMISIÓN:

RETROVIRUS EXÓGENOS, PARTÍCULS DE RETROVIRUS QUE SE TRANSMITEN DE UN HOSPEDADOR A OTRO. HAY UN IMPORTANTE GRUPO QUE SON ENDÓGENOS. En este caso forman parte del patrimonio genético de las especies se transmiten por la línea germinal. en muchos casos no llegan a madurar como viroides sino que son unos genes más. En roedores: muy representados, se observa un número de copias abundante , muestran gran plasticidad genética , característicos de especie, asociados a leucemias espontáneas, cepa-específicas causadas por estos virus. En humanos encontramos también estos virus, relacionados con los primates, se observan en general baja numero de copias, en muchos casos se expresan en la placenta, incluso partículas viroides, en principio no está asociado a leucemias. Familia muy distribuida, comparten características morfológicas básicas. Retrovirus de tipo A, estos son retrovirus endógenos, que no maduran, hay expresión de antígenos de grupo, partículas vacías, no maduran a un virión maduro. Los retrovirus llamados oncovirus de tipo B, son virus que tienen cápsidas en las cuales la nucleocápsida tiene una disposición no central, excéntrica. Mmtv “Mouse mamary tumor virus, muy conocido, bases genéticas del cáncer. c) oncoVirus que maduran en la membrana plasmática no excéntricos, de la célula mientras los otros en el citoplasma. Se multiplican con las celulas no las lisan, forman parte de las líneas celulares, es difícil eliminarlos. El RSV, el sarcomas de Rous sarcoma virus (primer retrovirus 1911, pollo) transmisión de cánceres por agentes filtrables. HTLV I , II también , forman lecucemias himanas MoMLV leucemia murina de moloney prototipo molecular devirus de tipo C. Tipo D) morfología centrado madura en el citosol. Lentivirus HIV, Spumavirus no madura, son endógenos pero generan degeneración celular, vacuolas , y membranas forman espumas en los cultivos celulares. Retrovirus, cilco vital: se fusionan las membranas entran en el citosol y la cápsida se relaja perdida de estructura, facilita los pasos subsiguientes, es un porceos ímico, es la conversión de RNA a DNA. La retrotransciptasa, lo realiza en el citosol asociado a esta partícula del virus, , una vez formado DNA asociado a proteínas que se produce en en la cáspida. Una vez dfroamdo va al nucleo, no se sabe como va al nucleo, es un proceos complejo, los retrovirus de tipo c no son capaces de atravesar la envuelta nuclear. Esperan a la mitosis, solo puedne infectar a células mitóticas. los distinguen del tipo C de los lentivirus como el HIV si son capaces de atravesarla, a todos los tipos de células. Parece que interviene secuencias de localizacion nuclear la NLS que tiene proteínas del virus , como la integrasa y la

matriz e incluso secuencias de DNA, que contribuyen a entrar al núcleo. Entra en contacto con el genoma de la célula y se va a producir la inserción que la realiza la integrasa, del genoma del virus del dna. Va a formar parte del patrimonio genético de la célula como un gen más, el retrovirus se expresa o no, latencia o bien puede haber activación de la expresión génica se trascriben a RNA. Hay mensajeros que peude dar lugar

a proteínas estructurales gal y pol, y otros mensajeros que van a dar lugar a proteínas de la envuelta, los genes env , los genes de la envuelta, siguen la vía secretora RER, GOLGI- MEMBRANA ancladas. y ahí permanecen esperando la maduración del virus, van ensamblándose hasta asociarse a proteínas de la envuelta, se encuentran incluso RNA del virus, en el tipo C se produce el ensamblaje cercano a la mb. Es muy simple y eficaz. No hay replicación del genoma del virus, porque solo hay transcripción, los RNA que se trascriben también son el genoma del virus, es la propia molécula de RNA. Peor no hay replicación como tal. No destruyen a las células, porque son poco virulentos, no se expresan con gran avidez, se multiplican peor no dañan a las células. La integración ocurre casi en cualquier parte del genoma casi al azar a diferencia de otros virus que son más específicos.

Se eliminan dos nucleotidos en el extremo del genoma, y en el punto de inserción del genoma,s e corta palindrómico, quebrado, es este punto se inserta el genoma levirus se liga, y se repara el punto de inserción, el sitio de integración hay una seucneci arepetida directa porq lel corte quebrado , y encontramos el genoma del retrovirus qu faltan dos núcleotidos, la integración, no tenemos los pasos no lo sabemos aún, siempre eesá flanqueado por secuencias directa

y le falta dos núcleotidos.

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Retrotranscripción. Hay muchos modelos , es bastante complicada. Lo hace la RT que lo porta el virión, es una

polimerasa que es capaz de hacer DNA a partir de RNA, es una DNA polimerasa DNA dependiente, trabaja en la dirección 5’-3’, tiene una actividad RNAsaH, Degrada RNA/DNA híbridos. Es un complejo proteico.

Hay síntesis de DNA y degradación de RN. El proceso comienza: tenemos la molécula RNA del virus, que están flanqueados por una secuencia única, U5 y R , es el comienzo, de síntesis de DNA para ello el virus utiliza un TRNA que es complementaria a la región PB, el virión porta, además de su genoma de RNA, además tiene Trna de la célula

ensamblados en la partícula, le sirve al virus para comenzar la síntesis, es complementaria a la región PB primer biding, del extremo, se copia las regiones u5-r hasta el final.

A

continuación el enzima degrada el DNA de este híbrido, , de las regiones R y U5, este extremo es complementario a

R

del otro extremo, salta al otro extremo. Luego el resto lo copia desde 5’-3’ lo pasa a DNA y lo va degradando con

la

RNAasa H.hay una región del genoma del virus no degradada, región pp , región del primer, el trna hace una síntesis,

degrada el genoma genómico, salta de primer de la región repetida, además deja una región sin degradar pp pequeña que actua de primer, sintetiza todo el resto de la cadena, empieza a copiar la segunda haciéndola hibrida con RNA, degrada

la parte de RNA peor sige por la zona Tru5 3’, una vez sinterizado la doble banda hacia el extremo 3’, el trna es

degradado le permite circularizarse porque esta repetida los extremos R, ahora es extendida en las dos direcciones, el resultado es, que la distensión, la molécula completa, es un LTR en los extremos U3ru5----u3ru5. Si la extendemos en los dos sentidos, nos da una molécula completa del virus completa. Mientras que la molécula inicial , teníamos GAGPOL ENV, CUANDO SE HA REPLICADO Y CONVERTIDO A dna, LOS EXTREMOS DEL GENOMA DEL VIRUS HAN CAMBIADO, HAN CRECIDO, TENEMOS DOS SECUENCIAS REPETIDAS, u3 r u5 CONSECUENCIA DE LA rt, SECUENCIA DIRECTA, REPETIDA DE FORMA REPETIDA ltr, LONG terminal repeat. Es una región reguladora. Esa integración, sucede probablemente en un intermedio circular o no, hay una eliminación de dos nucleótidos en os extremos de la secuencia U3, estos dos nucleótidos, como el genoma hospedador se corta en forma cohesiva, el genoma se inserta , se une por ligasas, se rellena la secuencia del genoma celular, los dos nucleótidos eliminados se vuelven a multiplicar, y encontramos secuencias repetidas directas por el corte quebrado que produce la inegrasa. El sitio de unió es más o menos la azar. Una vez insertado se pueden expresar, el control de la expresión depende de la secuencia LTR, más ampliada:

U3 encontramos enhancer de trascripción, tatabox que son reconocidas por la DNA pol de la célula , es una región potente que permite la transcripción potente del virus.sucede como un gen más de la cé´lula, no hay replicación del genoma del virus, se expresan los mRNA que darán las proteínas delvirus.la expresión génica, Se sitentiza un mrna genómico, desde r, galg pol env, dará lugar que se expresen la sproteinas gag y pol, par ala expresión de env, hay un procesamiento de este RNA, para dar lugar a un mRNA procesado o env , que permite la expresión de los genes de la envuelta. Hay un stop entre gag y env, por lo que hay dos mrna el de gang pol y env y el mrna de env. Como conseguimos sacar dos genes, los genes gag y pol, son proteínas istintas a partir de un único mRNA, cada mensajero da lugar a una proteína, la máquina es monocistrónica, la solución a la paradoja, que es bastante complicada, los retrovirus solucionana este problema de distinta forma, pero todos ellos jugando con una alteración de la maquinaria tradicional, fidelidad del ribosoma, esta alteración la consiguen porque hay unas estructuras, en forman de tallos que perturban la fidelidad de la traducción del ribosoma, cuando encuentran estas estructuras, el ribosoma es retenido en ese punto, no es capaz de deshacer esta estructura secundaria, cuando lo consigue es por un eroor, qe implica un cambio de fase de lectura. Según resuelven la expresión de gal y pol en los virus hay 5 clases:

Clase II, cambio de fase de lectura que da lugar a los genes gag cuando llega a las estructuras en forma de tallo, inicia la traducción de la segunda proteína ero en otra fase, dando lugar a otra proteína, incluso hay marcha atrás, porque los genes gag y pol están superpuestos, en su momento fue increible. Como sacar más de una proteína a partir de un mRNA.

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La clase 1 , hay genes gag y pol y en el medio hay un stop, la maquinaria traduccional, leería los genes gaga y no empezaría con los genes pol, no sería capaz de iniciarla, los retrovirus hacen que el codón stop, no lo respete el ribosoma , se lo salte y forma una proteina grande gag-pol, que será procesada. Obvia un codón de terminación. De esta proteína se libera las proteínas gag y proteínas pol, rt y la integrasa la RT tiene dos subunidades . Una vez procesado, se produce un splicing, que puede ser entonces usado el gen env, que forma una proteina larga, y se corta para dar lugar a las dos proteínas de la envuelta. Muchas veces son asintomáticas, porque se produce baja cantidad de virus, y la célula no muere. Sin embargo en otras ocasiones, están asociados a la producción de tumores, de cáncer, antes de la aparición del sida, en los años 60, atrajeron el interés porque son virus que están asociados a la producción de tumores, de cáncer. En la oncogénesis por retrovirus, hay que distinguir dos mecanismos:

Retrovirus que portan oncogenes en su genoma, onc+, son distintos a virus oncogénicos onc-. Además de los genes gaga pol env, porta un oncogén que puede ser el mic, sar, es una proteína mitogénica, las mutaciones han perdido los dominios de regulación, por lo que no es regulada por la célula, por ejemplo un receptor de membrana que en respuesta del factor de crecimiento que cuando se une manda señales mitogénicas al núcleo de la célula, lo es peor es un factor truncado, no se puede unir al FG, que continuamente manda señales mitogénicas independientemente del GF, es un oncogen. los RT que portan oncogenes llevan os oncogenes mutados, son ya oncogenes activos y vemos que están insertados en el genoma del virus en distintas posiciones y es así como se transmiten en la naturaleza. Ls nombres de los oncogenes , proceden en los RT que se aislaron y no al revés. El encogen SRC sarcomoa de rous Myc, myeloblastosis aviar. El virus mc-29 por ejemplo son defectivos, no pueden dar lugar a un ciclo vital por ellos mismos, se acompañan por virus silvestre, helper, que le soportan a las que las infecciones se propaguen, aportan el encogen y el silvestre los genes estructurales. El virus del sarcoma de Rous, este retrovirus, por una razón no muy bien conocido puede trasmitir el encogen src, y además los estructurales. La expresión de oncogenes, la posibilidad de producir un cáncer está ligada a que no son líticos, se insertan como un gen más , adquiere el encogen y por ello la célula empieza a dividirse, hace que la célula se transforme y lleve a cáncer. Sin llevar oncogenes provocaban cáncer: lo hace de forma más lenta y producen generalmente leucemias, se vio en este caso que aislando los genomas de las leucemias que se podrían inducir experimentalmente, cuando se estudió las leucemias, buscando el retrovirus, aparecen insertados , próximo a oncogenes, aunque el virus no lleve oncogenes cuando lo hace es en puntos próximos, altera profundamente es la expresión encogen, en un dominio vecino al punto de inserción es la alteración se puede realizar de varias formas, derivan en el echo que la LRT es un enhancer poderoso , que aumenta la expresión génica abundante de este encogen, el promotor que regulaba ha sido sustituido por la LTR del virus. Si se ha insertado en la mitad del encoge y ha eliminado un exón, va a producir una eliminación de un dominio por ejemplo el control del receptor, la inserción si es al azar, porque se inserta ahí? Esto es el resultado de una selección, el RV se inserta en muchos sitios, peor cuando se inserta en estos sitios, se va a seleccionar, va a llevar a una leucemia, y ese es el fenotipo que observamos, es la selección ya que proliferan las células infectadas más por ello, se seleccionan +. Es la selección la que produce la enfermedad.

Faltan 3 días helena 11-xii-08

DNAss Los virus de DNA parvovirus son capaces de evolucionar, el parvovirus fue capaz de infectar al perro proveniente del gato, cambio de 2 aa , que puede reconocer el receptor del perro, los retos es intentar cristales de complejos de la cápsida unido al receptor. Podemos ver aa resistentes a anticuerpos monoclonales, MUTANTES mar, LOS CAMBIOS DE LA CÁPSIDA SE SITÚAN EN REGIONES EXPUESTOS DE LA PARTÍCULA, DEFINEN SITIOS INMUNODOMINANTES.

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Ependovirus o virus AAV asociados a adenovirus, con gran interés en terapia génica, en ausencia de un virus helper se inserta en un determinado locus en el genoma humano, que no confiere ninguna enfermedad ni alteración genética, actualmente muchas empresas están volcadas en aplicar estos virus en terapias monogénicas. Ya están en fase clínica. Estrategia básica para obtener vectores recombinantes de AV. Para insertar un gen de interés en un vector de AV, este gen esté en la cápsida de AV, posición del vector recombinante de AV, el principal limitación de AV, es su tamaño de la cápsida, el genoma de los parvovirus está entorno a 5 Kb, genes mayores no son capaces de empaquetarse , las icosaédricas tienen un DNA limitado. El gen de interés se flanquea de secuencias de los extremos del genoma de parvovirus, secuencias ITR secuencias terminales e invertidas, importante para el empaquetamiento del DNA en la cápsida. El gen de interés, le clonamos en un plásmido entre secuencias ITR, por ingeniería genética, tenemos que clonar otro plásmido con las proteínas de replicación y cápsida. Con el genoma completo de AV, pero queremos evitar que el plásmido se inserte en las cápsidas, por lo que eliminamos las secuencias ITR ON LOS GENES ns Y vP, PERO SIN itr. son los que introducimos con una cotransfección la coinfectamos con estos plásmidos y el adenovrus silvestre. Será empaquetado sólo el virus recombinante y no el silvestre ya que carece de las secuencias para empaquetar, además salen los WT, debemos de separarlos por separación en gradientes de densidad etc. Para eliminar el adenovirus. Se inserta en el locus P1 porque hay parte de homología de secuencia. La betagalactosidasa, con un AV recombinante que aporta el gen Bgal, 5Kba, marcadores ideales, se mostraba como los av si se inyectan en el cerebro de mono. Se observa la expresión de Lac Z en neuronas del hipocampo. Sin efecto patológico, efector previos, como podrían estar estables, en una región delicada como es el hipocampo. Experimentos reales en los que los virus aportan genes exógenos. Para que se inserte hay que meter las proteínas Ns, QUEDIRIGE el genoma al locus NS, es un reto que a veces se usa más de un virus. Polyomaviurs y papillomairus, son virus pequeños de DNA oncogénicos, que pueden causar tumores. Son dos familias distintas antes se les agrupaba en la misma. Los Polyomavirus se llaman así porque Poly (varios) oma (tumores) + virus descrito por cross 1965, en ratón virus oncogéncio. En muchos tejidos. Se estudia bases moleculares del cáncer, dispersa agresivos. Sv40 (virus de simio que puede infectar células humanas, bases genéticas del cáncer en los años 70) en humanos no existe este tipo de cáncer tan agresivo. En humanos están los papillomavirus, que sí que producen cáncer. DNA de doble banda circular, d eun tamaño de 5KpB. Tienen cadena doble . unos de los genomas mas estudiado en funciones génicas, SV40 se descubrieron los Cap de RNAS poliA… se descubrieron en etse virus. Como modelo de cáncer. Tenemos el ORi de replicación, se emplea hay en día para meterlo en plásmido que replicado en la célula transfectada. En este sitio solapando con el ori, están el origen de transcripción, se lanza la sonda de transcripción, porlo tanto el ciclo vital del virus, el origen coincide cuando hay replicación no puede haber transcripción. La transcripción sucede en las dos direcciones, los genes no estructurales del virus, antígenos T. Los antígenos T, proteínas responsables de tumores, el antígeno grande large T y el antígeno pequeño Small ST. EN POLIOMAVIRUS ETÁ ADEMÁS EL MIDDLET MT proteínas no estructurales, implicadas en replicación parecidas a las NS de parvovirus. Estos antígenos T se sintetizan a partir de RNA en dirección 5’-3’ como toda la transcripción celular hasta el otro sitio opuesto del genoma, con la adición de poliA, medio genoma se trascribe hasta que llega el terminador, este RNA en el mundo eucariota lo consigue por un procesamiento alternativo, codifica el antígeno T pequeño y el antígeno t pequeño, fases alternativas permite la producción de proteínas diferentes. Las estructurales se consiguen por una transcripción en dirección opuesta 5’3’ si es en dirección opuesta, la banda que se transcribe sea distinta, una de otra. VP1 VP2 VP3 tres proteínas estructurales. De las más estudiadas pero aun n se las conoce bien. El ciclo vital del virus, esquematizado, la partícula icosaédrica entra por endocitosis mediada por receptor, el DNA se inyecta en el núcleo de la célula no se sabe bien , por los poros? Interviene proteínas de la cápsida. El DNA es reconocido por la maquinaria transcripcional de la célula y replicación, no tienen que portar enzimas propias , lo hace por ellos la célula. Es reconocido inicialmente, tiene transcripción temprana, se expresan mRNA de proteínas no estructurales, antígenos T, van al citoplasma para traducirse, vuelven al núcleo porque tienen señales de localización

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nuclear NLS, secuencias ricas en K R, se describieron estas señales en SV40, CONTRIBUYEN A LA REPLICACION, , EN ESTE MOMENTO NO HAY transcripción, aumenta el número de genomas, cuando acaba la replicación comienza la transcripción tardía como molde más moléculas de DNA, esta trascripción tardía se expresan RNA tardíos que van al citoplasma que se traducen a proteínas VPS o estructurales, vuelven al núcleo para empaquetar el DNA del virus en el núcleo. Por una sola partícula viral que entra, se puede producir varias partículas de virus, la partícula sale del núcleo por procesos líticos o no, e inicia infecciones nuevas a las células. Quien ordena el ciclo del virus es el antígeno T grande sobre todo. El ciclo vital del virus hay que entenderlo interconectado con el ciclo celular. De las células que infecta. La mayoría de las células están en reposo en el sistema digestivo o del sistema hematopoyético, está en fase G0 normalmente, deben de entrar en ciclo en fase G1 si quiere pasar a mitosis. Los parvovirus se inserta en fase S y los polyomavirus, produce una promoción del ciclo celular el LT, induce a una célula en reposo a que entre en el ciclo. Esa entrada lo realiza el LT actúa cuándo contra proteínas reguladoras del ciclo celular, proteínas supresoras de tumores, RB y P53 estas proteínas encargadas , que gobiernan a las células del ciclo celular, proponen el reposo. Serán reguladas por el LT . promueven la fosforilación, adición de fosfatos, cuando RB se fosforila hace que esta proteína pierda afinidad con factores de transcripción importantes como es E2F. La liberación de E2F promueve la entrada de S. (G2 SE PRODUCE LA FOSFORILACION DE RB). Coincide con la trascripción temprana del virus expresa LT. Cuando la célula ha entrado en fase S, observamos que LT tiene unas modificaciones de la proteínas menores, inicialmente cuando se expresa está muy fosforilado y esto le permite interaccionar con RB, en fase S, tiene mucha menos fosforilación le permite unir el DNA del virus en la zona del Ori y promover la replicación del genoma del virus. La molécula se encarga de que el engranaje sea adecuado en el tiempo es el antígeno LT. Lo que hace es abrir el ORI. Permite la entrada de polimerasas. Cuando acaba la fase S, el número de genoma de virus ha sido replicado a niveles elevados, el antígeno Tlt VUELVE A FOSFORILARSE , Y ESO LE HACE QUE PIERDA AFINIDAD POR EL dna, SE detenga la replicación del DNA y comience la transcripción tardía.

12-12-08

la proteína RB a lo largo del ciclo celular, sufre distintos grados de fosforilación, proteína central para regular el ciclo, en condiciones normales, tienen RB poco fosforilado, con la entrada en ciclo en proliferación rb se fosforila, cambia radicalmente las propiedades interactivas, cuando entran en fase S , rb deja de interaccionar con factores de transcripción, es lo que hace que las celulas proliferen en el estado hiperfosforilado de RB, la progresión del ciclo celular es gracias a RB y los estados de fosforilacion regulado por las CDKs que fosforilan a RBno es de extrañar que rb sea una diana del antígeno T , permite la entrada de la fase S, en condiciones de reposo, RB interaccionando con factores de transcripción, inactivados, por ejemplo E2F, la entrada de fase S, en condiciones fisiológicas lo hace por hiperfosforilacion de RB, le hace perder afinidad por factores como E2F, actuando como promotores de otros genes e inducir la fase S. Estos virus actúan sobre RB, el antígeno LT tienen afinidad de RB se aloja donde está E2F con mayor afinidad, sin que este fosforilado, fuerza a entrar en fase S, desplazando E2F , quedado libre. La entrada de ciclo, la que diferencia los tejidos es el punto de restricción, una vez que entran en fase s deben de terminar o morir, el check proteínas de G1-S donde están paradas casi todas las células, es promovido por los virus. P53 supresora de tumores, son proteínas que promueven el reposo, el estado quiescente. Es un factor transcripcional, y promueve la interacción positiva con P21, estas reclutan a CDKS unidas a ciclinas, y a PCNA, la sobre expresión de P21 bloquea las CDKSdependiente de ciclina, RB esta poco fosforilado: reposo. P53 es diana de LT, dominios de afinidad, lo inactiva, por lo que P21 baja, las CDKS entran en actividad y hay más fosforilación RB se fosforila , explota lo dos caminos para entrar en fase S.

Cuando el LT está bajo fosforilado, forma dos rodillos que tienen gran afinidad por el ori: subunidad de antígeno LT, hexámero, el complejo que se forma son dos rodillos, hexámero de LT, un rodillo, gira en dirección contraria al otro, contra-tornillo, relaja la doble banda. Una vez que abre el DNA entra la polimerasa alfa, esta actividad de relajación es fundamental para replicar el virus.

Todas estas actividades, tienen que ver con la génesis del cáncer, son oncogénicos.

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En

papillomavirus: los virus oncogénicos son limitados no hay modelos como polyomavirus, de forma agresivas, están

muy adaptados, lo hacen de forma sutil, en muchos casos son peligrosos por esa adaptación a la especie humana.

Son controvertidos si producen o no:

Papillomavirus si se les tomó como claramente el grupo de virus más oncogénicos en humanos, carcinomas de piel y

de cuello de útero.

Son virus de dsDNA 8KBS , un grupo muy amplio. Se estudio primero los bovinos BPV, y después el HPV, hay 100

serotipos de HPV. Dos grandes tipos: papilomas de grabes riesgo: génesis del cáncer en humanos virus asociado a…

O bajo riesgo cuyas infecciones no producen cáncer, el de alto riesgo: 8-6-18 de bajo riesgo el resto.

Porque produce siempre en epitelios? : epitelios estratificado como es la piel, solamente se multiplican en epitelio estratificado, por eso son virus que en condiciones normales producen verrugas, manchas, infecciones benignas, que pueden degenerar en cáncer. Lo que sucede es que los virus infectan solamente a piel, y lo hace en las células basales, las proliferativa. El córneo están muertas, se replican en las células vivas solamente. Los virus infectan el estrato basal : trascripción temprana, la replicación lo hacen el espumoso, y la tardía en el estrato granuloso. Donde forma las cápsidas donde madura en el estrato córneo sale para escapar e intentar otra infección. Siempre en la epidermis, no hay respuestas inmunes porque no aparece en sangre. No se pueden crecer en líneas celulares, solamente requieren ene estos tipos celulares y en estos tipos celulares, se han conseguido cultivos de piel hace 6 años, ante son se podía estudiar, se utilizaba el BPV. Genoma:

Ns recuerda bastante a un polyoma, mas complicado, hay una región que están para proteínas no estructurales , E (Early, no estructurales) TIENE QUE VER CON REPLICACION Y RPOMOCION EN FASE s. Algunas se ignoran sus funciones, sin saber claramente lo que hacen, la otra mitad a la producción de la cápsidas, L1 y L2 late. Se hacen pocos RNA pero se procesan de forma alternativa por Splicing, dando lugar a diferentes proteínas.

Procesamiento alternativo de RNA. Los papillota tienen la capacidad de promover la entrada en fase S, la transición, sacar las células de reposo, promover

la división celular, papiloma: promoción de que las células lo liberen, actuando contra las mismas dianas, RB y P53,

dianas de papiloma.

Estas dos familias no tienen homología de secuencia actúa sobre las mismas dianas.

El caso de papiloma son 2 proteínas para interaccionar con P53, contra P53 E 6 y E7 contra RB. También se habla de

los adenovirus oncogénicos de DNA, también contra p53 y RB. Concepto: cómo perturban la fase S:

Interacción de E7 con RB, de alta afinidad cuando RB poco fosforilado, depilada a E2F. Promueve entrada en S. RB queda inactivado. Estas interacciones son importantes para la génesis del cáncer, los papilomas de alto riesgo, tiene mucha más afinidad que las proteínas equivalentes de bajo riesgo, una buena interacción molecular la dificultad de asignar un virus a un papiloma, que puede surgir 10-5 años después de una infección primaria, los médicos lo entiendan es complicado. Evidencias:

Unos de los experimentos más luz aportó, fueron modelos de ratones transgénicos, se sobrexpresan E6-E7 se observa las consecuencia. Los animales transgénicos expresamos estas proteínas, queremos hacer modelos de cáncer. Si queremos modelar el cáncer humano, si el cáncer se produce en el epitelio estratificado, habría que restringir la expresión del gen en el tejido diana donde se produce la patología , los genes específicos de piel , como las queratinas de la piel, esas proteínas se expresan ahí , se controla por promotores y enhancers, usando esos promotores hacemos que solo se expresen en piel. Cuando estos animales se consiguieron, se observó que el nacimiento era correcto con el desarrollo correcto, con el tiempo, forma más lesiones de piel, mas frecuentemente que los control,, formaban papilomas o verrugas, algunas de ellas daba cáncer, con desarrollo convincente para los médicos. Cáncer de cuello de útero, complejo y secuencial, es virus es el inductor, pero no es responsable final. Las células estratificadas cambian su morfología y su tasa reproductiva, produce un tejido desordenado, acaban en un carcinoma invasivo. Produce metástasis en otros tejidos.

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E6 Y E7 forman parte del ciclo vital del virus, luego los virus hacen cápsidas los virus se destruyen, si hay destrucción celular no se entiende como hay cáncer, o se destruyen o proliferan, tiene que estar abortado. Se aclaró gracias a realizar análisis de tumores, qué pasaba con el virus, qué genes tenía etc. Lo que se observó de forma consistente , los carcinomas de cuello de útero , aparece DNA integrado en el genoma humano, inesperada, y además con grandes delecciones, típicamente vemos delecciones de proteínas estructurales, proteínas L, mientras que encontramos genes tempranos E6 y E7 de forma infecta, se observa en explantes de tejido, en carcinoma, sin duda estas delecciones impide la replicación del virus. en fin, tenemos dos estados, el inicial y el final, tenemos el estado final. Carcinoma con el virus integrado, no tenemos la película, podemos simular lo que sucede es que hay una infección primaria que induce la proliferación, muchas serán líticas, a un mayor título de virus en el tejido, en la mayoría de los casos es eliminada, pero si es un papillota de alto riesgo, en algunas células infectadas puede producirse una integración en el genoma celular puede llevar años que suceda, generalmente no pasa nada, peor algunas veces es tan favorable, que se eliminen proteínas estructurales y queden las no estructurales E6- E7, queda continuamente estimulada a crecer, entra en riesgo para se produzcan otras lesiones genéticos, para que hiperprolifere y además sea invasiva. las vacunas no son eficaces porque no hay cápsidas en torrente sanguíneo.

18-10-08

herpes virus: inducción de fase S aunque los propios genomas de herpes llevan sus propias polimerasas, la fase S no es estrictamente dependiente para que se replique. Genes cuyos significado tiene a nivel de organismo, ya que poseen genes que reprime la respuesta inmune, sistémico. Tienen un genoma bastante grande. El DNA ds, 150-200KPB son icosaédricos con envoltura, tienen la capacidad de ser latentes, prevalecen en los organismos que infecta en que haya una expresión génica patente, demostrada. Resultado de la evolución, tiene un programa genético de latencia. Para silenciar su expresión génica y prevalecer en la naturaleza. De dentro hacia fuera: entre la membrana y la nucleocápside se llama tegumento de función casi desconcocido, una nucleocápsida, con DNA empaquetado con proteínas. Están muy distribuidos en la naturaleza, muy bien asentados prevalecen e muchas especies. Virus grandes adaptados a la prevalencia en al naturaleza haciendo poco “daño” al hospedador. En simios etc, virus de otras especies etc. Los herpes humanos se pueden clasificar en tres grandes grupos según la célula diana donde establece diana:

Herpes alfa, beta y gamma. Alfa: infecta neuronas, neurotropicos Beta: herpes que infecta riñón y glándulas salivales Gamma: linfocitos, linfotropicos

Alfa:

Herpes simplex humanos HSV. I, II Varicela-Zoster HZV Beta:

CITOMEGALOVIRUS: CMV Gamma:

Virus de Epstein bar EBV, sistema inmune debilitado pacientes con sida se activan también el HHV 6 HH8 (sarcoma de Kaposi). Inducen fase S , células a proliferar, causantes de cáncer. En modelos de biología molecular es el herpes simplex. I y II Herpes: su estructura genómica, de su DNA. Los herpes tienen DNA de gran tamaño variables, con secuencias repetidas en su genoma. El virus CCV virus del pez gato del canal. Repetida directa en os extremos.

Repeticiones en tándem de ambos extremos del genoma,

Repeticiones pequeñas en tándem en los extremos, Epstein bar, y dentro otras.

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Repeticiones invertidas/Directas etc. Los simplex realmente su genoma son complejos, el genoma dividido en regiones de secuencias repetidas e invertidas. Si este se desnaturaliza y se vuelve a renaturalizar se forma DSDNA pero otros, pueden aparearse estas secuencias invertidas, y producir estructuras en forma de dos globos, separado de un puente de secuencias repetidas e invertidas. Círculo rodante etc… estrategias de replicación. Herpes mejor conocidos:

Herpes simplex, su ciclo vital productivo. Las partículas de herpes entran por las proteínas de envuelta, se produce una fusión con el endosoma, la cápside se adhiere en el núcleo nuclear, se adhiere al núcleo e inyecta su DNA. Una vez en el núcleo, puede ser reconocido, por la maquinaria de transcripción de la célula que inicia la transcripción, lo realiza las polimerasas de la célula sobre todo la II, hay tres ondas de expresión génica bien definidos se les llama Alfa beta y gamma. Interacciones de tipo : inducción de fase S, modulan la respuesta del hospedador, inhiben la respuesta inmune, y muchos de ellos regulan la expresión génica de la célula, factores de transcripción. Estos genes alfa, se trascribe dan lugar a mensajeros algunos de ellos son factores de tracripcion, promueven la transcripción de beta. Beta: proteínas de replicación DNApol en esta fase del ciclo del virus hay una replicación del genoma del virus en el que no hay transcripción, por los genes Beta. La fase de replicación coincide con la fase S, la célula es inducida a proliferar. Algunos de ellos son factores de trascripción que promueven la siguiente onda :

inducen la expresión de los genes gamma. Estos genes gamma son proteínas estructurales. Han organizado su complejo genoma, en esto, expresión génica ordenada. Miminizan interfernecia de expresión génica maximizando su expresión. Primero surge en forma de cápsida poco compacta, procápsida, se encapsida el genoma, va madurando adquiere envueltas las adquiere primero de las membranas nucleares, viaja por el citoplasma, se fusiona con la siguiente consecutivamente (RER-GOLGI-MB) salen sin lisar las células. Composiciónn génica del virus simplex humano 150Kpb, el virus se circulariza en la replicación-transcripción. En torno a 200 genes. Asignar funciones génicas, cada caja es un orf, con lo cual es un gen. Proteína principal de la cápsidas. Helicasa, DNasa… No hay orden de los genes, puedne estar agrupados o parcialmente peor generalmente no. Herpes simplex: se transmite desde el principio de la vida, desde la cavidad bucal, llega a las terminaciones nerviosas de las cuales viaja hasta alcanzar en el soma neuronal, es generalmente, neuronas del ganglio dorsal de la espina dorsal. Prevalecen a lolargo de toda la vida, encontramos el virus en estado latente. esta en forma de episoma , DNA lineal no integrado. es demostrable por PCR. si hacemos un explante y la disociamos sobre células susceptibles en cultivo, produce ciclos líticos en cultivo. la varicela, produce una infección más extendida sistética, formando eritemas, forman también estado de latencia en los somas neuronales, puede reactivarse, entra en ciclo lítico, produce lesiones en los epitelios que inherban. Bajada de defensas etc. lesiones benignas producto de la reactivación del soma de los ganglios dorsales. el herpes se mantiene el mismo no cambia el hérpes e spara siempre. el varicela-zoster, se activa formando un zóster, culebrilla, pueden ser dolorosas, inflama el nervio, en inmunocompetencia normal se controlan por el sistema inmune. Respuesta immune del hospedador:

Presentación de péptidos por células infectadas, presentados a linfocitos TC, se hace por una moleculas MLHCI. Este complejes reconocido por el TCR este complejo dispara la respuesta citotóxica del linfocito. Esa presentación del péptido extraño suelen ser casi todas las células del organismo, permite que el linfocito se active, y produce la lisis celular, respuesta inmune contra virus más importante que los anticuerpos. Puede evitar que maduren miles o decenas de virus.

Los organismos evolucionan para bloquear los virus y los virus al contrario. Los herpes impiden la presentación de péptidos por MHCI, que los presente al TC. Distintas proteínas de los hérpes interfierne en el viaje del RER. Interfiere con el MHCI sacarlo fisicamente del RER, lo lleva al proteasoma para que sea degradado, disminuye los niveles de MHCI, no presenta bien a los péptidos. No se entendía porqué, no había célula citotóxica en la célula inhibición de transporte MHCI, también lo tienen los poxvirus.

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Virus del Epstein Bar EBV:

Fue difícil relacionar el agente causal con la enfermedad, que se la consideraba rara. Herpes humano, que está asociado a diferentes enfermedades en diferentes partes del mundo, tipo gamma linfotrópico, que infecta a linfocitos

e tipo B sobre todo.

En occidente, está asociado a una infección llamada mononucleosis infecciosa MI produce una proliferación controlada de linfocitos, aumenta por encima de lo normal en sangre, cansancio, fiebre… la enfermedad del beso normalmente no tiene más complicación. Puede producir linfomas, cuadros preocupantes, hiperproliferación de linfocitos, peor es excepcional, normalmente dura una semana y desaparece pero realmente no desaparece, pasa a estado latente peor está con nosotros. El mismo virus puede producir:

En África está asociado con el linfoma de burkitt agresivo, produce metástasis. Carcinoma nasofaríngeo, cáncer en la cavidad bucal, asociado a infecciones de Epstein Bar, sucede en china. Porque sucede esto? Esta diferencia? Un mismo virus en diferentes partes del mundo produce diferentes enfermedades. Cuando esto se enfrentó en los años 80 la mentalidad clásica era que había diferentes variables, que en diferentes partes del mundo da diferentes enfermedades. Se secuenció el genoma del virus y ver los cambios genéticos que den estas diferencias, forma de pensar clásica. Se encontró que no era así no existen diferentes variantes, es genéticamente homogéneo, produce diferentes enfermedades. La MI, cuando el virus es controlado pasa a estar en latencia, la latencia del Epstein Bar, es sorprendente de su programa genético de latencia, es una estrategia evolutiva para prevalecer. Se observa lo siguiente: está en forma de episoma, peor en contra del simplex, hay alguna expresión génica, como la LMP latent membrane protein, los antígenos nucleares: EBNA (EB nuclear antigen), produce el estado de latencia, el

EBNA1,2 replica el virus con el linfocito para mantener la población del virus, y el LMP, induce mitosis. En occidente, generalmente el número de linfocitos es pequeño, lo controla el S.inmune, y no genera linfomas. Tiene diferentes consecuencias en diferentes partes del mundo; en el caso de África: el virus se transmite en una población infantil malnutridos, la respuesta inmune es ineficaz, puede infectar a muchos más linfocitos, y esa población no es controlada adecuadamente por el sistema inmune, esos linfocitos estimulados a proliferar, adquiere otras mutaciones que produce que sea un linfoma agresivo. Es una cuestión de cantidad. Se relacionó con la malaria peor no es así, los mapas de la malaria de África. El linfoma de Burkit después de un par de años aumentaba en la zona, no era causa-efecto sino que se relaciona por: la malaria debilita el sistema inmune hace que el número de linfocitos infectado son sea eliminado, por lo que hay cooperación entre parásitos pero la base está en la incompetencia del sistema inmune. nOSOFARÍNGEO: No SE SABE BIEN LA CAUSA, Causa esta enfermedad en china, da igual donde vivan sino más bien

d ela raza, no está clara, pero puede ser por base genética de la población china, la infección del virus puede cooperar

para producir este cáncer o con regimenes alimenticios o de vida.

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poxvirus:

virus complejos, estructura poco definida, son partículas virales grandes, con un contorno oval, son virus que les

diferencia en que son capaces de replicar en el citoplasma de las células. No invaden el núcleo no utilizan la maquinaria de replicación de la célula. Encontramos viriones en forma oval, con un nucleoide bicóncavo, producto del DNA compactado con proteínas, rodeado de varias membranas 2-3-+ y ambos lados del nucleoide hay 1-2 cuerpos laterales, no se sabe cuál es su función. Por lípidos de proteínas. Sn bastante grandes, 300nm, casi se llegan a ver en MO. En el límite de resolución. Esta familia de virus, está bien representada den la naturaleza. Pox= pústula, alude a las lesiones que produce, estructurales en la piel. Muchos de los nombres tiene que ver con la palabra pox. Canaripox, pájaros, capripox (Cabra). Lepóridos , conejos o liebres, levoripoxvirus: myxoma. Produce myxomatosis.

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“mueren los conejos , diezma la población, y los cazadores tienen que cazar otras cosas” Especies proximas a humanos y a monos. Vriuela en humanos:

Orthopoxviurs. Cowpoxvirus Monkeypoxvirus Variola Smallpoxvirus viruela humana, sus pústulas era pequeñas pero la enfermedad era letal el virus que ha matado más gente en la historia de la humanidad. Ramses II murió de viruela? Proyecto ara resucitar el virus de la viruela ¡. Relacionado con monkeypox relacionado con smallpox, antgénicamente relacionado con el cowpox. Variola: viruela menor, más benigna que la viruela. 1960: campaña de la OMS WHO para erradicar la viruela, gracias a la guerra fría hubo competencia entre las dos potencias para impulsar una campaña de erradicuación del virus. Se erradicó en 1978 al ser un virus muy estable. Se diagnosticaba a primer golpe de vista. “ se diagnosticaba casi desde helicóptero y si veían un rostro picado bajaban y vacunaban” No hay reservorio animal. Vacuna muy eficaz. Arranca, desde 1789 Jenner en Inglaterra los introdujo la vacunación, observó que las personas que trabajaban con vacas no padecian la viruela. Cogiendo pústulas de las vacas e inoculándolo en personas sanas, prevenía la enfermedad. El Cowpox , previene del smallpox. Ya que están relacionados antigénicamente. Paradójicamente la vacuna que se utiliza, es el virus Vaccinia. N se sabe donde viene, puede que venga del Cowpox peor no se sabe, parece que los laboratorios evolucinó a una cepa muy venigna. Es menos agresivo que el cowpox. produce una enfermedad benigna. Liofilizado, producían una herida en la piel y la inoculaban. En 1982 se “escapó” del laboratorio, 8 muertos. Se ordenó eliminarlo de los laboratorios. Solamente hay 2 laboratorios de viruela. (USA, Y MOSCU) arma biológica ideal. “Si se produce un ataque biológico con viruela, yo no moriré y vosotros si porque estoy vacunado contra la viruela” hay vrus en la naturaleza que podría producir un nuevo virus que infecte a humanos: desde monkeypox por ejemplo. En África hay pequeños brotes de moneypox. Que diferencias genéticas: parece que son demasiado distintos. Carlos II: Balmis, llevando la vacuna a Sudamérica, siglo XVIII.

Vaccinia: modelo molecular. Entran directamente por fusión de mb con la célula, todo el ciclo vital trabscurre en el citoplasma, no utiliza para nada el núcleo. El virus tiene sus propias RNAp y DNAp. Les permite ser autónomos y entrar en el citoplasma sin usar la maquinaria celular. Se produce una primera transcripción de los genes tempranos de los virus. Esta transcripción temprana es posible porque el propio virus tiene moléculas de RNAp. Si cogeos los viriones, vaccinia con núcleotidos marcados UTP P32, tampones, y nada más que esto, los propios virus pueden fabricar RNA sin entrar en las células el virus, por sí solo es capaz de expresar su material génico. Sus primeros RNA son RNA de la DNAp puede entonces una vez relajado: hay replicación casi sin expresión génica. Posteriormente en la etapa de Replicación se inicia la tardía. Dando lugar a proteínas estructurales: maduración. El pox es tan grande, con una morfología tan característica. Es fácil seguir la maduración. Es muy llamativo, una transcripción y replicación de una célula eucariota. Esto ha hecho que los pox, hayan sido utilizado por biólogos moleculares para estudiar transcipción y replicación.

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estos virus son bastantee eficaces es mucho más simple que los demás al ser más independiente de las células la expresión génica maduración etc., son los más rápidos y eficaces al ser autónomos; tienen una enorme ventaja. En horas forma placas de lisis. Entorno a las 6 h se forma la progenie viral. Su RNAp, expresa todos los genes del virus. Va a ser atraída a promotores tempranos o tardías por factores de transcripción tempranos o tardíos. ETF (tempranos); intermedios ITF, tardíos LTF. Posibilidad de utilizar estos virus como vectores para vacunar de otras enfermedades.

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Por ejemlo el sida y otras enfermedades:

El virus vaccinia, dentro de los pox, es bioseguro, portar virus recombinantes. Como hacer un virus recombinante que porte un virus exógeno. Recombinación natural. Contruir un plásmido, que prote un gen de interés exógeno por ejemplo la GP120 de HIV, flanqueado de unas secuencia de vaccinia de un gen dispensable, el virus sigue siendo infeccioso. Por ejemplo el gen de la TK , de virus vaccinia, este plásmido lo introducimos en una célula y esa célula la infectamos con un virus helper normal. Cuando se replique, habrá recombinaciones con una frecuencia baja, pero existe algunos. Finalmente tenemos un virus vaccinia donde se ha insertado el gen de interés a la vez que ha inactividado el gen de la TK. Este recombinante es viable. Y se puede selleccionar (ing genética) Se ha hecho para el sida, y se ha dejado a personas para ver si con el tiempo llegan a desarrollarlo o no. El virus de la rabia, rabdovirus, enfermedad difícil de controlar y vacunar ya qe hay un reservorio animal. Si introducimos pedazos de carne con el vaccinia recombinante con el virus de la rabia, baja la incidencia de la zona de la rabia, parece que funcionó. En realidad se utiliza poco, problemas de virulencia, aunque funciona bien en personas sanas, si se utilizan en niños desnutridos están comprometidos pudiendo a ser letales. En la vacunación contra la viruela merecía la pena porque era muy grabe y muy mortal, mientras que la vacuna mataba 1/50.000-100.000 se intenta rebajar antes de lanzarlos a gran escala. Proteínas interferentes que bloquean o impiden la respuesta inmune: importante en la virulencia y se intenta combatir. Receptores solubles que bloquean interleuquinas e interferón. Expresan receptores solubles sin anclados a las células, que bloquean las interleuquinas. Ay una unió de alta afinidad, la respuesta inmune se verá muy afectada, es muy frecuente tienen esta capacidad de disminuir la producción de mHCi la presentación de antígenos de las células infectadas y por ellos la presentación al TCR de los TC y por ello la respuesta citotóxica. Se está intentando eliminar estos genes para bajar la incidencia de muerte. Se intenta utilizar la mutagénesis dirigida y por recombinación como en el caso de arriba. Vías de entrada que usan los virus para infectar el organismo. La piel es una barrera infracreable en general. La piel ,esa capa de células muertas, es la primera que para los microorganismos. Peor hay orificios con el exterior, con células vías: vía de netrada. Vía respiratorio a através del aire. La gripe, rhinovirus, vaccinia, variola, alcanzan las respiratorias altas y en algunos casos alcanzaban los pulmones. Desde los pulmones pueden quedarse ahí o bien repartirse por todo el cuerpo Las vías de entrada: restringidos a la zona de entradA: infecciones locales. Epitelio de las células epiteliares, queda confinado ahí O sistémicas: a todo el organismo. (Virus del resfriado común, no baja nunca al sistema respiratorio profundo) por una razón térmica, crecen muy bien a 30-32º no crecen bien a 37º, (los vapores: aumenta la temperatura de la nasofaringe) Papilomas, se replican en la piel, en la capa de células vivas, no entran al torrente sanguíneo, es una razón de diferenciación. Ojos: adenovirus y herpes (neurotrópico, puede ir al nervio óptico produciendo cegeras e infecciones del SNC) Enterovirus: al sistema digestivo: reovirus, coronavirus (navidad reovirus en Madrid, con diarreas) poliovirus, entra por la vía digestiva, desde las temrianciones nerviosas del digestivo puede ir al sistema nervioso central y producir parálisis. Sexual: papilomas , HIV, Hérpes, Hay virus capaces de atravesar la barrera placentaria, parvovirus B19, produce abortos, rubeola, produce abortos citomelagovirus, Heridas en la piel: agujas encisiones, HIV, linfotrópicos, rábia por mordeduras, hepatitis B, transmisión parenteral. Todas las células de las vías de entrada hay defensa innata: macrófagos, mucus, ciliadas,

“los enterovirus no entran enteros”

viremia: ver los niveles de virus, esta viremia es combatida por el sistema de macrçófagos y células fagocíticas todo ese sistema son las células de Kuppfler macrófagos entre hepatocitos. Si vemos el tiempo que esta viremia es combatida por las células de kuppfler es el aclarado,” como las labadoras”

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en general depende del tamaño del virus, como el VV es rápido, y el más pequeños como un polivirus o picornavirus son más lentos. Bacteriófago T4 por ejemplo que no es infectivo: lo elimina por el tamaño, hay excepciones pero depend Edel tamaño, aplcia a la mayoría de los virus. Faltan 2 días. Vacunas/protección. Clásicas DNArecombinante Muertas Vectores:

Poxvirus

Picornavirus

Adenovirus

Vectores: cualquier virus puede ser desarrollado como vector. Todos los vectores tiene la marca de la bioloía del virus. Además de eficacia cínica de gran escala, hay ahí determinados vectores que van pro delante en su impacto social:

Poxvirus: ya mencionado por sus capacidades para clonar, su tamaño tan grande que puede tolerar inserciones tan grandes. Además de la patogenia etc. Le siguen de cerca, los picornavirus, concretamente poliovirus es un vector con el aval de la vacuna contra la olio. Se podría erradicar. Estos virus, desde el punto de vista de ser empleados como vectores, tienen la desventaja del tamaño, porque son pequeños no se puede meter un gen exógeno porque no podría empaquetarse. Pequeñas proteínas, péptidos exógenos que son presentados por la vía humoral como la sepa sarín, introducimos una secuencia exógena, en un punto del genoma flanqueado por el sitio de corte de la proteasa del virus, estos tipos de RNA+ hace una poliproteína que es procesada por su proteasa. Para que se exprese correctamente: flanqueado un sitio de corte, flanqueado por la proteína y presentado al sistema inmune. Polio tiene una ventaja adicional, un poco más difícil de ver:

Componentes del sistema INME en sangre o tejido linfoide, la respuesta inmune: importancia apara constituir una barrera. Inmunidad que lo confiere la inmunoglobulina A esos epitelios son sitios donde el organismo producimos esta inmunoglobulina que va a parar muchos patógenos. Potencial la respuesta inmune en los epitelios, no solo la sérica o de suero. Esta producción de iGA está inducida por los antígenos inducidos en el epitelio intestinal, en las placas de peyer, se reunen en microestructuras células presentadoras de antígen APC, linfocitos y células M. Son eficiente eficaces a la hora de procesar antígenos extraños que entran por la vía entérica, esas placas, dispara una respuesta inmune humoral, que se produce IGA en el epitelio que entró el patógeno y además epitelios mucosos lejanos que lo llvan los linfocitos. Encuentra una respuesta en todas las mcosas para proteger las sucesivas infecciones de este organismo. Este virus que estimula este circuito: el principal es la cepa sarín de polio. Esto es un aval que tiene la cepa arin: es un impotente inductor de la respuesta humoral. Adenovirus, “de pequeño me decían, ¡pinta un virus! y yo pintaba un adenovirus, es hasta infantil”

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para manipularlo: eliminable algún gen dispensable peor tiene un genoma muy compactado, nada dispensable, hay una región del virus:

región late: estrcuturales VP región temprana early donde se codifican genes tempranos reguladores. Los más importantes son E1A y E1B proteínas que inducen proliferación celular, interaccionan con p53 y Prb La manipulación clásica es introducir en únaselula que se utilizará como vector: las proteínas E1A e1B : INDUCEN INMORTALIZACION: LINEAS ESTABLES, AHORA, SON TRANSFECTADAS POR UN ADENOVIRUS QUE HEMOS REEMPLAZADO LOS GENES E1A E1B POR UN gen exógeno. De tamaño similar. Así´se produzcan adenovirus recombinantes, con el gen X que queremos expresar.

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Terapia géica , adenovirus que infecten selectivamente tumores que estén sobreexpreados p53 y pRB. Se manipulen los genes e1a y e1b que se expresen en tumores con alto p53 y prb: terapia oncolisis. Lo que se construye son virus con estos genes alterados de forma que solamente crecen en células que tienen estos niveles alterados. Diversidad de formas Ciclos vitales y eso les permite una presenca importante en la biosfera, infectan a todas las formas de vida, asentados en nuestros propios genomas. Responsables de enfermedades, revelantes, además de funcionalmente darán emergencias o reemergencias. Conviene seguir estudiando vrologia porque puedne reaparecer patógenos. Modelos de biologíaa molecular, inmunlogía, estc “los virus son profesores en biología” terapias

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FIN1!!!!!!

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