Sunteți pe pagina 1din 5

CURS VII

CULTURA DE PROTOPLATI I HIBRIDAREA SOMATIC

Cultura de protoplati
Din sistematica vegetal i animal se cunoate faptul c speciile sunt delimitate prin bariere de incompatibilitate sexual, ceea ce reduce posibilitile de ncruciri interspecifice. Creterea variabilitii genetice, att de necesar n lucrrile de ameliorare i selecie, implic gsirea unor metode de rupere a barierelor de incompatibilitate care izoleaz speciile ntre ele. Aceasta a devenit realizabil prin crearea de protoplati din celulele somatice izolate i fuziunea lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice i mitocondriale. La esuturile vegetale, membrana celulozic i stratul petic care asigur sudura dintre celule face imposibil manipularea direct a celulelor n scopul fuzionrii lor. De aceea s-a urmrit gsirea unor tehnici de dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungnd la forma de protoplati. Definiie. Protoplatii sunt celule somatice nude lipsite de membrane pectocelulozice rigide (perete celular) care au capacitatea de a fuziona, de a se divide n continuare i de a da natere la noi plante. Primele ncercri de rezolvare a protoplatilor din esuturile vegetale au fost fcute de Klercker (1892) care a elaborat metoda mecanic de separare a celulelor prin plasmolizare total i microdisecia membranelor. Aceast metod era ns traumatizant i puin eficient. Mai trziu, n 1960, Cocking n Anglia, Otsuki i Takebe (1969) n Japonia au elaborat metoda enzimatic de producere a protoplatilor, metod n care se folosesc enzime extrase din microorganisme ce diger peretele rigid al celulelor vegetale. Metoda elaborat de Cocking, utilizat pn n prezent, permite obinerea unei cantiti mari de material biologic modificat, cu meninerea viabilitii i structurii nealterate a celulelor. Takebe (1971) a obinut primii protoplati viabili, prin digerarea enzimatic a membranelor celulozice de la celulele frunzelor de tutun. Au urmat realizri privind obinerea de protoplati la Daucus carota (morcov) - Grambow (1972) i la Petunia hybrida (Hess,1973). Protoplatii pot fi izolai din toate organele i esuturile plantelor, mai ales din mezofilul frunzelor, esuturi epidermale, rdcini i nodoziti ale rdcinilor, muguri, petale, gruncioare de polen n curs de germinare, fructe, semine i din esuturi cultivate in vitro. Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care se ia epiderm inferioar prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obine circa un milion de protoplati i cteva milioane de plante noi. Mai recent, au nceput s fie utilizate fragmente de calus, izolate din culturi de esuturi in vitro (care au o cretere rapid dac sunt asigurate condiii riguros controlabile). Protoplatii se obin de obicei prin tratarea esuturilor vegetale genitoare, secionate n fragmente nguste, n condiii aseptice, cu un amestec de enzime, capabile s degradeze peretele celular, n soluii care conin stabilizatori osmotici (protectori) necesari pentru a pstra structura celular i a menine viabilitatea acestora. Principalii stabilizatori osmotici folosii n doze reduse sunt: manitol, sorbitol, amestec de polivinilpirolidin (2%) cu zaharoz. Tehnologia culturilor de protoplati Tehnologia culturilor de protoplati necesit cunoatera i stpnirea complet a diferitelor etape care pornesc de la explantul donor pn la planta regenerat: obinerea de protoplati viabili; regenerarea pereilor celulari; inierea diviziunilor celulare; meninerea diviziunilor pn la obinerea microcalusurilor; regenerarea plantelor din aceste calusuri. 1

Etape ale cultivrii protoplatilor 1. Izolarea protoplatilor se poate realiza prin 2 metode: - metoda mecanic (presupune tierea esutului vegetal plasmolizat n prealabil, n fii subiri i microdisecia membranelor) - metoda enzimatic Izolarea protoplatilor prin metoda enzimatic n compoziia peretelui celular au fost identificate 3 componente de baz: celuloz, hemiceluloz i substane pectice. De aceea, dup o plasmolizare uoar, pentru izolarea protoplatilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, celuloze i hemiceluloze care sunt introduse n esuturi prin metoda infiltraiei in vacuum. Aceste enzime cu activitate hidrolizant sunt extrase din microorganisme (Aspergilus niger, Trichoderma viride) i dispersate n soluii apoase cu concentraii cunoscute. n prezent produsul comercial cel mai utilizat n tehnologia protoplatilor este celuloza Onazuka R-10, iar dintre pectinaze o larg utilizare o au preparatul Macerozyme R-10). Tratamentul cu enzime se realizeaz timp de 4-18 ore, la temperatura de 25-27 0C, pentru a asigura hidrolizarea pectinelor i a moleculelor de celuloz din membrane. ntre factorii implicai n izolarea cu succes a protoplatilor vegetali, pe lng tipul i concentraia enzimelor hidrolitice se menioneaz: specia vegetal, explantul utilizat (frunze, cotiledoane, rdcini, calus), alegerea agentului plasmolizant corespunztor, metodele i condiiile de incubare (durat, temperatur, lumin), metodele de purificare. Izolarea protoplatilor din mediul de incubaie se face prin 2-3 centrifugri la viteze reduse, timp de 7-10 minute (asigurnd sedimentarea lor), dup care urmeaz splarea restului de enzime cu soluie de zaharoz (15-20 %) i NaCl. 2. Purificarea. Procesul de izolare a protoplatilor este urmat de etapa de purificare, care este necesar pentru obinerea unor suspensii celulare pure, necontaminate cu resturi de celule distruse sau perei celulari nedigerai. Purificarea se realizeaz prin centrifugri i resuspendri succesive n soluia cu stabilizator osmotic. Dup centrifugare, la interfaa dintre cele dou soluii se formeaz un inel de culoare verde n care sunt concentrai protoplati viabili, iar resturile nedigerate i celulele moarte se depun la fundul eprubetei. 3. Incubarea. Timpul de incubare variaz n funcie de natura i vrsta materialului biologic iniial utilizat pentru izolare. Protoplatii n stare purificat sunt trecui n alte medii lichide. Mediul de cultur este foarte complet, bogat n sruri minerale, vitamine, substane stimulatoare de cretere, asigurnd regenerarea unui nou perete celular. La unele specii, protoplatii regenereaz peretele celular n 2-3 zile i concomitent intr n diviziune. Dup 20-25 zile se formeaz o colonie celular, din care va apare un calus (30-45 zile). Din calus vor genera lstari vegetativi sau rdcini, n funcie de suplimentarea mediului nutritiv cu citochinine sau auxine. Plantulele nrdcinate (mature) se formeaz n 4-6 luni, dup care sunt transplantate n ser (pe perlit sau sol). Testarea viabilitii protoplatilor. nainte de a se efectua o cultur de protoplati este necesar s se determine viabilitatea acestora. Se realizeaz prin examinarea suspensiei de protoplati la microscopul optic. Protoplatii viabili prezint cureni citoplasmatici, evideniai prin deplasri ordonate ale mitocondriilor, au form perfect sferic, iar cloroplastele sunt aranjate 2

ordonat n stratul citoplasmatic periferic. Protoplatii mori (distrui) prezint forme neregulate, iar cloroplastele formeaz aglomerri la unul din polii celulei. Testarea viabilitii protoplatilor se face i prin metode colorimetrice. Analizarea suspensiei de protoplati la microscopul optic cu fluorescen, permite distincia ntre protoplatii viabili care prezint o fluorescen galben-verzuie, datorit prezenei clorofilei i cei neviabili care au o fluorescen roie. Aplicaii la plantele floricole Protoplatii sunt celule vegetale folosite pentru manipularea materialului genetic. Pot fi utilizai pentru fuzionare i hibridare somatic, pentru transformare cu ADN exogen, pentru transferul de cromozomi, nuclee i diverse organite celulare, pentru studiul virozelor vegetale, pentru elucidarea modului de aciune al agenilor patogeni bacterieni i fungici. Aceast tehnic permite: cercetri aprofundate asupra funcionrii celulei; aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate; obinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci i chiar duntori; permite manipulri genetice ca introducerea sau substituirea de gene. n momentul de fa lista speciilor de plante floricole de interes economic la care s-a realizat regenerarea de plante de la protoplati este destul de cuprinztoare. Ex.: Digitalis lanata, D. purpurea, Helianthus annuus, Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus, Nicotiana sp., etc. Tehnologia culturilor de protoplati necesit cunoatera i stpnirea complet a diferitelor etape care pornesc de la explantul donor pn la planta regenerat: obinerea de protoplati viabili, regenerarea pereilor celulari i inierea diviziunilor celulare, meninerea diviziunilor pn la obinerea microcalusurilor i regenerarea plantelor din aceste calusuri.

2. Hibridarea somatic
Const n fuzionarea (contopirea) a doi sau mai muli protoplati i refacerea unei noi celule care conine material genetic (nuclee, cromozomi, organite citoplasmatice) provenit din celule care aparin aceleiai specii sau la specii diferite (fr a recurge la hibridarea sexuat). Cu alte cuvinte, hibridarea somatic prin fuziunea protoplatilor este o metod de obinere a hibrizilor ntre plante aparinnd aceleiai specii sau unor specii diferite, imposibil de realizat prin metode clasice. S-a constatat c protoplatii izolai enzimatic sunt capabili s fuzioneze spontan, dar cu o frecven relativ mic (8% la Datura innoxia i 11 % la Lilium longiflorum), deoarece sunt ncrcai cu sarcin electric negativ. Keller i Melchers (1973) au elaborat prima metod eficient de inducere a fuzionrii protoplatilor prin neutralizarea sarcinilor electrice, folosind ioni de Ca++ i K+ cu sarcin electric pozitiv (CaCl2, KH2PO4), la temperatura de 370 C i pH alcalin (9,5-10,5). Ulterior, s-a elaborat metoda de fuzionare prin tatament cu polietilenglicol (care este indicatorul cel mai eficient), aplicat n concentraie de 25-40 %. Totui, acesta prezint o oarecare toxicitate care poate atinge 50% din protoplati, ducnd n unele cazuri la formarea de celule multinucleate, prin fuziuni ale mai multor protoplati. Zimmermann (1981) a elaborat o metod mai modern n care fuziunea protoplatilor este indus ntr-un cmp electric alternativ discontinuu, aceasta realizndu-se ntr-un procent de 80 -100%, cu o eficien mult mai mare dect prin tratamentul cu polietilenglicon, deoarece nu afecteaz viabilitatea protoplatilor. Prin fuzionarea protoplatilor de la diferite specii este posibil manipularea informaiei genetice i hibridarea celular interspecific, cu rol deosebit n lucrrile de ameliorare, oferind 3

numeroase posibiliti de combinri genomice pentru a crea forme cu totul noi. Se obin celule hibride, interspecifice sau intergenerice, cu o nou zestre ereditar i cu caracteristici noi. n urma fuzionrii protopltilor se formeaz produi de fuziune homocariotici (n cadrul celulelor ce aparin aceleiai specii) i heterocariotici (n cazul fuzionrii celulelor ce aparin la dou specii diferite). Hibridarea somatic ntre dou specii diferite const din urmtoarele faze: - preluarea materialului iniial folosind esuturi de meristem foliar; - izolarea celulelor prin tratamente enzimatice; - obinerea de protoplati i fuzionarea lor pn la realizarea heterocarionului; - nceperea diviziunilor mitotice; - formarea calusului; - obinerea plantelor prin culturi de calus selecionat; - regenerarea plantelor ntregi transplantate la sol. Uneori din hibridarea celular nu regenereaz plante, ci se obin numai linii celulare hibride. Binding i Nehls (1978) au obinut astfel de linii celulare hibride ntre speciile Vicia faba * Pethunia hybrida din care a generat un calus, fr a evolua n formarea de plante ntregi. Alte hibridri somatice, capabile s rup barielele interspecifice s-au mai realizat ntre Pethunia parodii i Pethunia parviflora, Pethunia hybrida i Atropa belladona, Datura innoxia i Atropa belladona, etc. Aplicaii ale hibridrii celulare ntre reproducerea sexuat la plantele superioare i fuzionarea protoplatilor exist diferene eseniale. n cadrul reproducerii sexuate, informaiile citoplasmatice sunt transmise n general numai de planta mam i nu exist surse de variabilitate citoplasmatic. De asemenea, nu apar recombinri ntre diferite tipuri de formaiuni cloroplastice sau mitocondriale. 1) Obinerea de varaii somaclonale. n cazul hibridrii de protoplati, prin combinarea genotipurilor de la speciile incompatibile apropiate sau ndeprtate din punct de vedere taxonomic, se obin varaii somaclonale din care pot fi selecionate noi forme valoroase sub aspect genetic, utilizate ca material iniial n lucrri de ameliorare. 2) Obinerea de hibrizi celulari (cibrizi) Cnd fuziunea de hibrizi de protoplati este urmat de o recombinare genetic, se poate realiza o hibridare att a nucleilor, ct i a organitelor citoplasmatice (cloroplaste, mitocondrii). Dac unul dintre nuclei este eliminat n cursul divizunilor succesive, se obin hibrizi citoplasmatici numii cibrizi n care apar, cel mai frecvent, recombinri mitocondriale. Def. Cibrizii sunt hibrizi celulari care mbin genele nucleare ale unui genitor cu cele extranucleare ale celuilalt. Din heterocarioni rezult hibrizi somatici, care nglobeaz cromozomii celor 2 specii, sau cibrizi care nglobeaz cromozomii i genele nucleare de la o specie, cu genele extranucleare de la cealalt. n unele cazuri apar himere formate din esuturi i celule diferite genetic. De aceea, selecia adevrailor produi de hibridare somatic este o problem cheie a hibridrii parasexuale. La plantele superioare, regenerarea de organisme noi, pornind de la genotipuri ndeprtate genetic i protoplati transformai prin recombinare genetic, constituie o metod eficient de ameliorare. Astfel se realizeaz creterea variabilitii materialului iniial de selecie i transformarea fondului genetic. Prin fuzionarea de protoplati s-au realizat muli hibrzi somatici vegetali i animali, unii dintre acetia dovedindu-se a fi adevrate himere sau aberaii biologice. n sectorul vegetal pot fi menionai cibrizii: gru + orz, tomate + cartofi, Vicia + Petunia, ntre specii de Nicotiana, etc. 4

3) Transferul de material genetic n protoplasti Elaborarea unor metode eficiente de obinere a unor cantiti mari de protoplati a fcut posibil folosirea acestora n vederea unor manipulri genetice la plante. Transferul direct de gene, prin hibridare somatic se poate realiza n faza de protoplast, protejat la exterior numai de membrana plasmatic (plasmalema). Includerea n protoplaste a unor microorganisme, virusuri, organite, macromolecule exogene se poate realiza pe 3 ci: - prin endocitoz prin strbaterea membranelor plasmatice dup degradarea peretelui celular. Pe aceast cale au fost incluse n protoplati: alge, virusuri, bacterii, drojdii, nuclei, cloroplaste, mitocondrii, ADN exogen, etc. Membrana plasmatic poate fi uor traversat de molecule de ADN extern care va migra pn la nucleu i se va integra n cromozomi. - fuzionarea membranelor; - transfer prin intermediul lipozomilor, care sunt vezicule artificiale de fosfolipide ce pot include diverse materiale, inclusiv ADN, pe care l pot transfera n protoplati, prin fuzionarea acestor tipuri de celule. Tehnologia ADN-ului recombinat, prin fuziunea protoplatilor a devenit n prezent o ramur de vrf a biologiei (care va reui s elaboreze produse cu rol esenial n dezvoltarea economiei mondiale). 4) Mrirea rezistenei plantelor la factorii chimici sau fizici (toxine, erbicide) i la factori abiotici (ger, secet, salinitatea solului) Tehnicile de inginerie genetic, molecular i celular pot contribui la crearea unor noi forme adaptate la stresul biotic i osmotic, prin cercetri care vizeaz funcionarea sistemelor enzimatice, reglarea i transferul informaiei genetice de la formele rezistente la cele sensibile. 5) Ameliorarea planelor i crearea de soiuri noi Rezultatele obinute pn n prezent arat c ameliorarea plantelor i biotehnologiile sunt domenii complementare care pot asigura progrese remarcabile pentru viitor, prin valorificarea realizrilor ingineriei genetice privind hibridarea somatic interspecific i intergenetic. Hibridarea somatic a devenit o surs important de variabilitate, fie la nivel nuclear (recombinri ntre genomuri), fie la nivel citoplasmatic (modificri de ADN mitocondrial sau ADN - cloroplastic). Totodat, este posibil apariia unui numr ct mai mare de mutaii, precum i livrarea de hibrizi somatici i cibrizi. Hibridarea somatic poate fi un mijloc rapid de introducere a unor gene strine n interiorul unei specii cultivate. Transferul unor caractere de la speciile slbatice la cele cultivate asigur mrirea rezistenei plantelor hibride, att la factori patogeni, ct i la factori abiotici, inclusiv pesticide. Tehnologia hibridrii prin fuziuni de protoplati este relativ simpl n comparaie cu alte tehnici de inginerie genetic, n mod particular cu tehnologia ADN-recombinat. Pn n anul 1992 au fost regenerate pornind de la culturi de protoplati circa 50 de specii ornamentale, att monocotiledonate, ct i dicotiledonate (Ochatt i Power - 1992). Exemple de genuri i specii regenerate: - Chrysanthemum Otsuka i col.-1985; Gaillardia grandiflora Binding - 1981; Pelargonium hortorum Yarrow i col. 1987, etc. Cercetrile actuale ce se efectueaz prin culturi de protoplati vizeaz numeroase aspecte: introducerea de gene responsabile de fixarea azotului atmosferic, de sinteza de noi pigmeni, de rezistena la frig, secet, poluare etc. Protoplatii sunt izolai de obicei din fragmente de limb, acestea sunt introduse ntr-o soluie unde au loc dou operaii simultane: plasmoliz i degradarea peretelui celular. Plasmoliza se realizeaz cu ajutorul zahrului din soluie i este necesar pentru a evita spargerea celulelor dup dispariia peretelui celular i pentru a detaa celula de peretele ei scheletic. Degradarea peretelui pectocelulozic se face cu enzime care se determin pentru fiecare specie. 5

S-ar putea să vă placă și