CICLO CELULAR Y EL CRECIMIENTO NDICE: 1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO 2 CICLO CELULAR PROCARITICO 2.

1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN 2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR 3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS 3.1 MEDIDA DE MASA CELULAR 3.1.1 MTODOS DIRECTOS 3.1.2 MTODOS INDIRECTOS 3.2 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS 3.2.1 MTODOS DIRECTOS 3.2.2 MTODOS INDIRECTOS 4 CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO) 4.1 EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO 5 CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS ABIERTOS). QUIMIOSTATO 6 CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS 6.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LQUIDO 6.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS 1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individual A escala poblacional Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas: inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos (vase tema 7); segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas; sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular (tema 5); seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular. El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos: cintica del crecimiento; factores que afectan al tiempo de generacin (g); factores ambientales que limitan el crecimiento. En el presente captulo nos dedicaremos al estudio de algunos aspectos del ciclo celular procaritico, pero sobre todo nos centraremos en el crecimiento de poblaciones (que es el ms frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos), con una visin de algunos mtodos para obtener crecimientos balanceados. La influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento son el objeto de los temas 13 (agentes fsicos) y 14 (agentes qumicos). 2 CICLO CELULAR PROCARITICO

Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comienza con la formacin de una nueva clula y termina cuando dicha clula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van

produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procaritico son: fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico; fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular; fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica. Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min. 2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN

Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qu ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generacin. Cuando g>C+D Cuando g=C+D Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas condiciones podemos observar ntidamente periodos diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin celular). Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir, cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la clula inicia la divisin celular). Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que haya terminado la divisin celular del anterior (superposicin parcial entre fases C y D). ya no se puede detectar fase D como tal. La sntesis de ADN es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicacin cromosmica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un tpico patrn de replicacin dicotmica y en que dichos cromosomas pasan a cada clula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicacin.

Cuando g<C+D Cuando g<C

Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est en un medio rico son ms grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre. 2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR

De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento entre las ondas de replicacin y la divisin celular. Este es un campo de investigacin an joven, del que no conocemos todava todos los detalles. Las copias de cromosomas recin replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citoplsmica (unidas a sendos mesosomas?) probablemente unidas a travs de sus respectivos orgenes de replicacin (oriC). No se sabe muy bien cmo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una clula hija. Se sabe que en este reparto o particin de los cromosomas intervienen varias protenas, entre ellas ParA y ParB, que en las clulas a punto de dividirse se sitan en los dos polos opuestos. Es posible que exista algn mecanismo activo para separar estos cromosomas, pero parece ser que tambin intervienen los mecanismos pasivos de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento. Tambin se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicacin del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los bacilos) para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formacin del tabique. El comienzo de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de muchas unidades de la protena DnaA (unida a ATP) al origen de replicacin (oriC). Una vez que se ha iniciado una ronda de

replicacin en oriC, esta regin queda hemimetilada, pero en vez de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa Dam y de la maquinaria de replicacin. Se sugiere que en este fenmeno est implicada una protena (SeqA), que a su vez ayudara a esconder a oriC en la membrana. Slo ms tarde (y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporcin entre sitios de inicio y algn parmetro celular como masa o volumen), vuelven a quedar las secuencias oriC disponibles para su metalicin y uso en una nueva ronda. NOTA: La metilasa Dam es una enzima que metila las dos adeninas de la secuencia GATC/CTAG. El alumno seguramente sabr ya que esta metilasa metila las adeninas de esa secuencia a partir de ADN hemimetilado. El ADN de la clula est totalmente metilado en esas secuencias, pero cuando pasa la horquilla de replicacin, la cadena recin sintetizada carece de esa modificacin, hasta que llega la metilasa Dam, que reconoce la secuencia hemimetilada y metila la adenina de la cadena no metilada. Un rasgo curioso de la regin oriC para el inicio de la replicacin cromosmica es que contiene una proporcin de secuencias GATC/CTAG muy superior a la media del resto del genoma. El comienzo de la tabicacin parece que requiere dos seales: por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas deben de estar separadas en extremos opuestos por otro lado, la clula debe haber alcanzado una longitud umbral Como ya vimos en el captulo 5, llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta entonces estaba diseminada por toda la clula), se concentra ahora en la parte central, sealando el plano de la tabicacin: se forma un anillo citocintico o divisoma, en el que la FtsZ se va contrayendo hacia el interior (hidrolizando GTP hasta GDP). A continuacin se van ensamblando en el divisoma varias protenas Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una transglucosidasa-transpeptidasa especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. La terminacin del tabique seala el final del ciclo celular. 3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS

En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del captulo nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con algunos mtodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales sern aprendidos en vivo por el alumno en las prcticas de laboratorio. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin de: aumento de masa del cultivo aumento del nmero de clulas Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo). 3.1 3.1.1 MEDIDA DE MASA CELULAR MTODOS DIRECTOS

En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas. 1) Determinacin del peso hmedo: se tara un tubo de centrfuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl. 4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc. Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales. 3.1.2 MTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la supensin). Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml. b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro. 3.2 3.2.1 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS MTODOS DIRECTOS

1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: excavacin con 0.02 mm de profundidad; rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos.

O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml. Ventajas: es un mtodo muy rpido. Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato). 3.2.2 MTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la prctica correspondiente, que se suele realizar en la 3 tanda). Mientras tanto, y para luego repasar esa prctica, puedes realizar un experimento on-line sobre crecimiento bacteriano Precauciones: para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin; hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa. 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso: M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [protenas]/[protenas] = ... = K As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden: velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente} Tambin se puede decir que el no de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera: aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado. 4.1 EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO

Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de individuos. a) En funcin del aumento de masa celular: , y por lo tanto, dM = Mdt

Si integramos, resulta: M/M0 = e

(t-t0)

Aplicando logaritmos neperianos: {12.1}

De aqu se puede deducir que el coeficiente es

{12.2}

b) En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que partimos de una clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc: tenemos una serie geomtrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es el nmero de generaciones transcurridas). Si en vez de partir de una clula partimos de N0 clulas iniciales, tenemos: N = N02n ; por lo tanto:

N/N0 = 2n

{12.3}

Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g):

Sustituyendo esta expresin en la frmula {12.3} tenemos: N/N0 = 2(t-t0)/g Apliquemos logaritmos neperianos: {12.4}

Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemticas {12.1} y {12.4} que hemos deducido (la de la seccin A, basada en masa, y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes: , y por lo tanto:

(t-t0) = (t-t0)/gln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento exponencial: , expresado en h-1 {12.5}

Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del tiempo medio de generacin (g). En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es = mx, o sea, el mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido. En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo, segn la frmula emprica siguiente (ecuacin de Monod):

donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; KS es la constante de saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente es semimximo. Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por ) es una funcin hiperblica de la concentracin del sustratro (nutriente) limitante (ver grfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc. Ejemplos de KS: la KS para la glucosa en E. coli es 110-6M la KS para el triptfano en esta bacteria es 210--7 M Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas de membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptacin evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos en

nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen ser ms concentrados). Como veremos en el apartado 6, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho. 5 CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS ABIERTOS). QUIMIOSTATO

El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de: una cmara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan o separan los productos txicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero). Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema est en estado estacionario, con las clulas creciendo exponencialmente. Los parmetros a tener en cuenta son: flujo (f), medido en ml/h volumen de la cmara de cultivo (v, en ml) densidad celular en la cmara (x) factor de dilucin D = f/v (en h-1). Existe una prdida de clulas por el rebosadero: -dx/dt = xD El crecimiento bruto es dx/dt = x Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x - xD = x( - D) Si logramos que el coeficiente de crecimiento () se haga igual al factor de dilucin (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentracin de clulas se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinmico de equilibrio. Las prdidas de clulas por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento.

Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el llamado quimiostato: en el quimiostato podemos controlar de modo independiente la densidad de la poblacin celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de dilucin (D), mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentracin del nutriente limitante en la cmara reservorio (SR). En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento exponencial El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un nutriente o sustrato presente en una concentracin suficientemente baja como para limitar la densidad de poblacin. As pues, el quimiostato tambin permite elegir la densidad de clulas a la que se quiere trabajar.

Algunos comentarios sobre el grfico: La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilucin (D). Este margen es el ms adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generacin (g) vara ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.Sin embargo, a valores extremos de dilucin, se puede ver que el equilibrio se rompe: A altas tasas de dilucin la concentracin microbiana cambia rpidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilucin crtica). Es decir, el cultivo se lava porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de dilucin. A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energa. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energa slo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energa de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energa de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovacin de protenas. Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato: Aportan una fuente continua de clulas en fase exponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas, de antibiticos, de aminocidos, etc). En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar: aspectos fisiolgicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante); seleccin de mutantes estudios ecolgicos. 6 CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulacin de desechos.

6.1

CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LQUIDO

Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar: 1) Fase de retardo (fase lag): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de varios factores: tamao del inculo; bondad del inculo (estado metablico previo del inculo): si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas deben reponerlos en el medio fresco. si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos. si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase logartmica, el lag es ms corto. medio del que procede el inculo: si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms corto; si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la fase de retardo se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica, cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qu?: necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco; porque se produce dilucin de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentracin de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, ste no arranca. Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrfica en un medio ligeramente cido, sometido a aireacin: en un principio, se produce dilucin de CO2, por lo que se retardan reacciones de

carboxilacin que requieren este CO2, y se produce un retardo 2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a 3) Fase de crecimiento exponencial (= fase logartmica). La fase 2 se debe a que cada clula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compaeras. Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las mismas condiciones fisiolgicas. Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto: El valor del tiempo de generacin (g) depende de: composicin del medio temperatura pH osmolaridad (tonicidad), etc. Los microorganismos heterotrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microoorganismos tienen, a su temperatura ptima tiempos de generacin muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen ms lentamente, con tiempos de generacin que pueden ser de varias horas o incluso das. 4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a 5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono). En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logartmica: las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de que se haya detenido el incremento de masa; suelen ser ms resistentes a agentes fsicos y qumicos; existe reciclado de ciertos materiales intracelulares; baja el contenido en ARN. 6) Fase de transicin hacia 7) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada). Te recuerdo que puedes hacer un experimento "virtual" con la curva de crecimiento de una bacteria. Que disfrutes. 6.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS

Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia. Los tipos de gelificantes usados para los medios slidos (ms explicaciones en la 2 tanda de prcticas): agar-agar (o simplemente, agar): es el ms comnmente empleado; gelatina (inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente bajas, y adems, algunos microorganismos lo degradan por gelatinasas); silicagel (o gel de slice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautotrofos. Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esptula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri (ver prcticas). Tras la incubacin a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupacin bacteriana que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulacin de clulas, visible a simple vista, denominada colonia. La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 clulas para una colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, a diferencia del lquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio slido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminacin continua de productos de desecho (por difusin desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de clulas. Como el alumno comprobar en prcticas (2 tanda), cada especie bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una serie de caractersticas de las colonias (caracteres culturales): tamao (relativo) forma general forma de los bordes de la colonia aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato color consistencia, etc.

ELABORACIN DE MODELOS PREDICTIVOS DE CRECIMIENTO MICROBIANO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS. VALIDACIN EN PRODUCTOS CRNICOS ENVASADOS AL VACIO . Autor: CASTILLEJO RODRGUEZ ANA M.. Ao: 2001. Universidad: CORDOBA. Centro de lectura: VETERINARIA. Centro de realizacin: FACULTAD DE VETERINARIA. Resumen: En este estudio se han elaborado modelos predictivos de crecimiento de Staphylococcus aureus a partir de medidas de absorbancia en Bioscreen C en funcin del efecto combinado de las variables temperatura (7-19C), nivel de pH (4,5-8,5), concentracin de cloruro sdico (0-8%) y de nitrito sdico (0-200 ppm) bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis en Caldo Triptona Soja. Como resultado de la comparacin de los parmetros cinticos, tasa mxima especfica de crecimiento y fase de adaptacin, obtenidos a partir de medidas de absorbancia y de recuento en placa, se demostr que la turbidimetra es una tcnica rpida, precisa y conveniente para la obtencin de datos destinados a la elaboracin de los modelos predictivos de crecimiento de S.aureus. La temperatura, concentracin de cloruro sdico y nivel de pH fueron, en este orden, los factores que ms influyeron en la tasa mxima especfica mientras que la fase de adaptacin de S.aureus estuvo influenciada principalmente por la temperatura y nivel de pH. La concentracin de nitrito sdico no tuvo efecto en la respuesta de crecimiento del microorganismo. El modelo de Respuesta en Superficie ha sido el ms adecuado para describir la tasa mxima especfica mientras

que el modelo de Davey lo ha sido para la fase de adaptacin segn la validacin matemtica realizada, comparando las estimaciones obtenidas por los modelos con los valores observados en experimentos adicionales. Para la validacin en productos crnicos cocidos envasados al vaco se inocularon muestras de jamn cocido, pechuga de pavo y de pollo y se compararon los resultados obtenidos. El modelo de Raz Cuadrada fue el que proporcion las predicciones ms seguras y ms exactas en la estimacin de la tasa mxima especfica de crecimiento en los productos crnicos, con un valor para factor sesgo (Bf) de 1,12 y un factor de exactitud (Af) de 1,49. Mientras que, el modelo de Davey fue el ms adecuado para definir la fase de adaptacin con unos valores para Bf=Af=1,94, menos preciso que el anterior. ELABORACION DE MODELOS PREDICTIVOS DE CRECIMIENTO MICROBIANO PARA ESCHERICHIA COLI O157:H7. VALIDACION EN PRODUCTOS CARNICOS COCIDOS . Autor: BARCO ALCALA ELENA. Ao: 2000. Universidad: CORDOBA. Centro de lectura: VETERINRIA. Centro de realizacin: FACULTAD DE VETERINARIA. CAMPUS RABALNALES CORDOBA. Resumen: En este trabajo se ha realizado un modelo predictivo de crecimiento de E. Coli O157:H7 mediante medidas automatizadas en Bioscreen C y su validacin en productos carnicos cocidos. El modelo se realiz en Caldo Triptona Soja controlando las siguientes variables: temperatura (9-21C), concentracin de NaC1(0-8 %) y NaNO2(0-200 ppm), pH (4.5-8.5) y condiciones de aerobiosis/anaerobiosis. A partir de estos datos se elaboraron las curvas de crecimiento y se estimaron los parmetros cinticos de tasa mxima de crecimiento y fase de adaptacin mediante las ecuaciones de gompertz y la de Baranyi y Roberts. Esta ltima opcin nos proporcion un menor error y mejor ajuste de los datos. Se observ que la temperatura, el NaC1 y el pH fueron, en este orden, las variables ms influyentes en el desarrollo de E. Coli O157:H7 y que la concentracin de NaNO2 y la condicin de anaerobiosis/aerobiosis no ejercieron una influencia importante. Con los parmetros de crecimiento estimados se elaboraron los modelos secundarios, utilizando dos tecnicas diferentes: la forma tradicional de respuesta en superficie y utilizando redes neuronales artificiales, como nueva alternativa a los mtodos convencionales de prediccin del crecimiento microbiano. En ambos casos se han utilizado, por un lado los parmetros de crecimiento obtenidos directamente a partir de los datos de absorbancia, y por otro lado los obtenidos transformando previamente los datos de absorbancia en recuentos microbianos a travs de una curva de calibracin. En todos los casos las redes neuronales han demostrado un menor error al predecir la respuesta microbiana que los modelos de respuesta en superficie. Tras la elaboracin de los modelos se ha llevado a cabo la validacin de stos en tres etapas y valindose de representaciones grficas e ndices de sesgo y precisin de Ross. En primer lugar se realiz la validacin matemtica, enfrentando las estimaciones del modelo con resultados de crecimiento de E. Coli O157:H7 bajo condiciones adicionales no incluidas en el modelo, que evidenciaron una correlacin satisfactoria. Tras esta validacin se estableci una relacin entre los parmetros de crecimiento obtenidos directamente de absorbancia y mediante su traduccin en recuentos, tras lo cual se propuso un tercer modelo, que se incluy en las siguientes fases de validacin. En segundo lugar se realiz la validacin con los programas informaticos Food MicroModel y Pathogen Modeling Program que confirmaron la fiabilidad denuesros modelos. Por ltimo, la validacin en el producto se llev a cabo comparando nuestras predicciones con la evolucin de E.coli O157:H7 en productos crnicos cocidos (jamon cocido, pechuga de pavo y fiambre de pollo) inoculados en el laboratorio y otros datos obtenidos de la bibliografia. Se demuestra y confirma que el tercer modelo es capaz de predecir de forma segura el comportamiento de E.coli O157:H7 en un alimento real, por lo que se escogi este modelo como el ms adecuado. Estos resultados nos confirman que la tcnica utilizada para la elaboracin de los modelos es ptima y comparable a tecnicas tradicionales y ms laboriosas como el recuento en placa, pero con la ventaja de obtener un gran nmero de datos que son necesarios en la microbiologa predictiva. Finalmente, se ha realizado un ejemplo de aplicacin de los modelos predictivos en la Valoracin del Riesgo del consumo de un producto crnico cocido, con el cual se demuestra la valiosa aportacin de los modelos predictivos en el Analisis de Riesgos.

Qu factores influyen en el crecimiento y supervivencia de los microorganismos en los alimentos?

Virginia Leyva1, Tamara K. Martino2,Dra. Yamila Puig3, Dr. Jos Carrera4, Dr. Mateo Rolando Cabrera5 Departamento de Microbiologa de los Alimentos. Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos Microorganismos y alimentos Los alimentos que consumimos raramente, por no decir nunca, son estriles sino que contienen asociaciones microbianas cuya composicin depende de qu organismo llegan a l y de cmo se multiplican, sobreviven e interaccionan en el alimento en el transcurso del tiempo. Los tipos y cantidad de microorganismos sern determinados por las propiedades del alimento, por la manipulacin del mismo durante el proceso de elaboracin y por las condiciones de almacenamiento hasta su consumo. En el proceso de elaboracin de alimentos cuando se cumple con las reglas de higiene o con las buenas prcticas de elaboracin, en toda la cadena del proceso, esta microbiota no ejerce un efecto negativo y el alimento puede ser consumido sin consecuencias adversas. Crecimiento microbiano en los alimentos El crecimiento microbiano es un proceso autocataltico: no habr crecimiento sin la presencia de al menos una clula viable y la tasa de crecimiento aumentar de acuerdo con la cantidad de biomasa viable presente. La pauta de crecimiento es la misma para bacterias y para hongos. Por tales razones es muy importante tener en cuenta la calidad de las materias primas para la elaboracin de los alimentos Las bacterias requieren ciertas condiciones para multiplicarse rpidamente, esta multiplicacin rpida es la que causa problemas con relacin a la seguridad del alimento. En condiciones ideales este crecimiento rpido puede llegar a un tiempo de generacin menor de 20 minutos. Si llevamos a cabo el experimento de determinar el nmero de microorganismos en relacin con el tiempo y despus representamos en una grfica el logaritmo frente al tiempo, obtendremos la curva que se representa en la figura 1. Un anlisis simple de esta curva puede diferenciar tres fases principales, en la fase I (fase de latencia), no existe crecimiento visible mientras el microorganismo se adapta al medio, y se le crean condiciones para su multiplicacin. Esta fase de latencia se puede alargar mediante la correcta conservacin de los alimentos, de no ser as se pasara a la fase III (fase exponencial o de crecimiento logartmico), que se caracteriza por una alta actividad fisiolgica, se produce un aumento en el nmero de clulas hasta que se agotan los nutrientes y el alimento se deteriora, pasando a la fase V (fase estacionaria). Es en la etapa exponencial donde los microorganismos patgenos, presentes en un alimento, al ser consumidos provocan la enfermedad. Aunque hay microorganismos que no se multiplican en los alimentos, ya que su dosis infectiva es extremadamente baja, como es el caso de Shigella que con solo 10 clulas por gramo, ocasiona la enfermedad, al ser consumido el alimento.

Figura 1. Fases de la curva de crecimiento Factores que influyen en el crecimiento microbiano en los alimentos Entre los factores ms importantes que influyen en el desarrollo de las asociaciones microbianas en los alimentos, tenemos: los nutrientes, el pH, la actividad de agua, el potencial redox (presencia de oxgeno o no en el ambiente en que se encuentre el alimento) y la temperatura. Nutrientes: Muchos microorganismos son capaces de utilizar de los alimentos los nutrientes y la energa que requieren para su desarrollo y en dependencia de los nutrientes que tenga un alimento en particular, ste se

considerar de mayor o menor riesgo. pH: En general, las bacterias crecen con mayor rapidez a pH comprendido entre 6,0 y 8,0; las levaduras entre 4,5 y 6,0 y los hongos filamentosos entre 3,5 y 4,0. Si a un alimento se le cambia el pH ya sea por encima o por debajo del neutro, los microorganismos crecern ms lentamente. La capacidad del pH bajo para limitar el crecimiento microbiano, ha sido aprovechada deliberadamente desde los tiempos ms antiguos en la conservacin de alimentos, con la adicin de los cidos acticos y lctico. En los alimentos con pH menores a 4.0, no se produce crecimiento de microorganismos patgenos o indicadores de contaminacin fecal tales como, Salmonella spp., Escherichia, coli, Staphylococcus coagulasa positiva, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, entre otros. Potencial redox: En relacin con los microorganismos, el potencial redox indica las relaciones de oxgeno entre los mismos y es utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas. Los microorganismos aerobios necesitan para crecer valores redox positivos (presencia de oxgeno), mientras que los anaerobios requieren valores redox negativos (ausencia de oxgeno). La mayora de los microorganismos importantes para la salud pblica en los alimentos, son facultativos, o sea, pueden crecer en presencia y ausencia de oxgeno. Una forma de reducir el crecimiento microbiano es controlando la atmsfera de los alimentos, creando condiciones de anaerobiosis. Actividad de agua (Aa): Es el agua que se encuentra en los alimentos no involucrada con el soluto. La mayora de los microorganismos y especialmente las bacterias se desarrollan a Aa cercanas a 1 (0.993-0.998). La Aa del agua pura es 1. A valores inferiores de Aa, la velocidad de crecimiento o la masa celular final disminuye y la fase de latencia aumenta, conservndose mejor los alimentos. Entre las prcticas ms frecuentes que ha empleado el hombre para alargar la vida til de un alimento se encuentra la deshidratacin, como es el proceso de salazonados (utilizando sal como soluto para eliminar el agua de los alimentos, tales como carnes, pescados); tambin se han utilizado azcares para aumentar la presin osmtica del producto, este es el caso de los dulces en almbar, las mermeladas, las conservas de guayabas, mangos, etc. Los alimentos se pueden clasificar en funcin de su Aa en perecederos (tienen una vida til corta y requieren refrigeracin para detener la proliferacin microbiana; semiperecederos, (tienen una vida til un poco ms larga que los perecederos), y no perecederos (pueden conservarse a temperatura ambiente). Temperatura: Los microorganismos segn sus caractersticas poseen temperaturas ptimas, mnimas y mximas de crecimiento. Tambin pueden ser termolbiles y termorresistentes, la mayora de los microorganismos que no poseen esporas, se destruyen a temperaturas de pasteurizacin, por ello se recomienda que al cocinar los alimentos su centro trmico alcance como mnimo 75 C. Entre los microorganismos importantes a travs de los alimentos estn las enterobacterias, tales como Salmonella, Escherichia coli, Shigella, entre otras y microorganismos pertenecientes al gnero Vibrio, como Vibrio cholerae. La temperatura ptima para conservar los alimentos perecederos es de 4 C, y la de alimentos congelados es de -18 C. Los alimentos refrigerados y congelados que se conservan en los hogares deben ser consumidos en el tiempo ms breve posible, ya que los refrigeradores domsticos no alcanzan casi nunca estas temperaturas ideales. En el caso de los alimentos calientes destinados a consumo inmediato, no deben pasar ms de dos horas a temperatura ambiente para su consumo, de lo contrario se deben mantener en una mesa caliente a 65 C. Los factores que influyen en el crecimiento microbiano en los alimentos y por tanto las asociaciones que se desarrollan, tambin determinan la naturaleza de una alteracin en ellos y cualquier riesgo para la salud. La longitud de la fase de latencia de crecimiento puede alargarse, si se controlan estos factores de crecimiento. Tambin hay que tener en cuenta que para la conservacin de los alimentos se realiza, generalmente, una combinacin de factores. Referencias bibliogrficas
1. ICMSF. Ecologa microbiana de los Alimentos. Factores que afectan la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Vol 1. Editorial Acribia. Espaa 1980 2. ICMSF. Ecologa microbiana de los Alimentos. Productos alimenticios. Vol II. Editorial Acribia Espaa 1980. 3. Jay James. Microbiologa moderna de los Alimentos. Tercera edicin, Editorial Acribia. Zaragoza Espaa. 1994.