Detector

Um detector ideal para a CLAE deve possuir: a) Alta sensibilidade e baixo limite de deteco; b) Resposta rpida a todos os solutos; c) Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na vazo da fase mvel; d) Resposta independente da fase mvel; e) Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector; f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto; g) No destrua do soluto;

h) Segurana e convenincia de uso; I) Informao qualitativa do pico desejado; Infelizmente, no existe um detector que apresente todas

estas propriedades, a no ser que ele seja desenvolvido.

Detectores mais utilizados CLAE Espectrofotomtricos UV-Vis seletivo ndice de Refrao universal Fluorescncia - seletivo Espectrmetros de Massas universal Eletroqumicos - seletivo

Detector Espectrofotomtrico UV-Vis

Baseado na absorbncia de luz por parte da amostra ao passar atravs dela qualquer radiao eletromagntica, normalmente isto ocorre no UV at o IV, em um dado comprimento de onda.

Existem 2 tipos de detectores na regio UV-Vis: Comprimentos de onda fixos (fotomtrico)que funciona com um ou dois comprimento de onda; Comprimento de onda varivel (espectrofotmetros), que so de aplicao mais variada e sensvel, mas tambm mais caro;

Espectrofotmetro de Comprimento de Onda Fixo

Maioria dos detectores operam em um comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm. Sendo sensvel, econmico e mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Em timas condies, pode-se atingir sensibilidades de at 0,001 unidades de absorbncia, se o composto absorve intensamente na faixa de UV, possvel detectar quantidades de amostras da ordem de nanogramas (10-10 g). Normalmente insensvel a variaes de vazo e temperatura. Quando se aplica gradiente na FM e ela apresenta variao significativa de absorbncia para o UV, necessrio utilizar a cela de referncia para compensar esta variao.

Espectrofotmetro de comprimento de onda fixo

Espectrofotmetros de comprimentos de onda varivel Faixa de 190-800 nm, Monocromador que seleciona o comprimento de onda desejado; Lmpadas de deutrio (UV) e ou tungstnio (Vis); Vantagens 1- Apresenta alta absorbncia para vrios componentes devido escolha de comprimento de onda, possuindo maior sensibilidade. 2- Permite maior seletividade, desde que um determinado comprimento de onda pode ser escolhido, onde o soluto de interesse absorve bastante e outros no. 3-Permite obter o espectro de absorbncia de cada componente em separado aps parar a vazo da FM e deter a substncia na cela do detector;

4-Promove eficincia em eluio por gradiente atravs da habilidade de selecionar um comprimento de onda onde os componentes da FM no apresentam uma variao de absorbncia para diferentes concentraes. Arranjo de Diodos Detecta vrios comprimentos de onda simultaneamente; Permitem levantar o espectro da substncia durante a eluio.

Este detector denominado detector de rede de diodos (diode array detector) fila de fotodiodos; Espectros tridimensionais, e tambm o conhecimento do espectro de absorbncia de cada composto presente na amostra permite selecionar o comprimento de onda mximo.

Detectores por ndice de Refrao

o segundo detector mais usado na CLAE. Este detector acompanha continuamente a diferena de ndice de refrao entre a FM pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra.

Para solutos que no absorvem no UV ou visvel, e no so detectados por detectores fotomtricos, a melhor escolha o detector por ndice de refrao.

A resposta deste detector universal e sua sensibilidade na ordem de micrograma (10-6 g). Nvel de concentrao corresponde a uma diferena no ndice de refrao entre a amostra e a FM de aproximadamente 10-7 unidades de ndice de refrao. Deve ter controle de temperatura o que normalmente conseguido por circulao de gua ou fonte termostatizada, atravs do refratmetro ou um bom controle da temperatura ambiente. Possui sensibilidade s variaes de vazo e mudanas na composio da FM, que impedem o uso de gradiente por ser difcil encontrar um par de solventes com ndices de refrao idnticos. Qualquer mudana na composio da mistura mudar o ndice de refrao da FM cela de referncia ter que mudar, o que quase impossvel.

Detectores por Fluorescncia

Mtodo de deteco dos mais sensveis da atualidade, especfico para compostos que fluorescem. Em boas condies possvel detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que comparvel aos detectores por captura de eltrons em CG.

 A FM empregada nos detectores de fluorescncia deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emisso depende do meio em que se encontra a amostra. Dificulta algumas de suas aplicaes, tais como anlise quantitativa e eluio por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da FM para no atrapalhar a fluorescncia. Detectores para fluorescncia tambm podem proporcionar espectros de emisso das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Uma fonte de UV necessria em ambos os detectores, por absorbncia no UV e por fluorescncia, eles podem ser combinados em um s detector.

Detectores de Espectrometria de Massas (CLAE/MS)

Alta sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilizao muito grande. A maior dificuldade na utilizao destes detectores o Interfaceamento com o sistema de CLAE e o seu alto custo quando comparado aos outros detectores mais usados.

Detectores Eletroqumicos
Oferecem a mais promissora soluo para o problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensvel e no baseado em absorbncia de luz. Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta sensibilidade (10-12 g) muito bons para as anlises de traos; Este detector seletivo, porque detecta somente as espcies que se oxidam (ou reduzem) em um potencial inferior ou igual ao fixado; Os detectores eletroqumicos so bons para as modalidades de cromatografia que usam FM aquosas tais como a cromatografia por troca inica, por excluso ou com fase reversa;

Tabela 1 Alguns detectores usados na CLAE

Principais caractersticas escolha de um equipamento para CLAE

a) Versatilidade Equipamento deve analisar amostras de diferentes tipos; Servir a distintas tcnicas cromatogrficas; Realizar o mximo de operaes, tais como, gradiente de FM, coleta das fraes, reciclagem de fraes, etc., necessrias s anlises sofisticadas.

b) Rapidez Para anlises rpidas, deve-se obter as melhores condies: FM de baixa viscosidade; Bomba de alta presso; Colunas com partculas de pequeno dimetro (grande rea de superfcie, que ajuda os processos de separao).

c) Reprodutibilidade e Estabilidade: Caractersticas essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. Equipamento deve ter controle adequado sobre os parmetros de operao, como vazo, temperatura, presso e composio da FM.

d) Sensibilidade: Um bom equipamento - deve gerar sinais de intensidade aprecivel (pequenas quantidades de amostra).

Anlise Quantitativa
Em CG os picos so altos e finos Em CLAE os picos tm perfil gaussiano

Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de pico, a sua rea pode ser calculada coma a do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico.

 O princpio bsico da quantificao que a rea dos picos registradas no cromatograma proporcional massa do composto injetada. Assim, fundamental para a confiabilidade da anlise que a rea dos picos seja medida o mais exata e reprodutvel possvel. Existem vrios modos de se medir a rea de um pico cromatogrfico: Manual Automtico

Curva Analtica
Curva Analtica a relao entre sinais : reas Quantidades do analito Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as quantidades do analito em amostras.

Amostras a serem analisadas so preparadas da mesma maneira que as solues-padro; A corrida realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de padres e as reas do analito nas amostras so determinadas.

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos cromatogrficos mais modernos utilizados em anlise (CLAE analtica) e separao/purificao de misturas (CLAE preparativa). De uma mistura de compostos presentes em analgsicos: aspirina (A), cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases mveis diferentes, no modo isocrtico, em uma mesma coluna. Responda:

(a) Porque este tipo de fase mvel foi escolhida? (b) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase mvel mais adequada para utilizao em escala analtica, considerando um grande nmero de amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta.

(c)

Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes trs experimentos? Justifique sua resposta. (d) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de reteno?