Tema 13 Replicacin

Replicacin
Transcripcin Traduccin

DNA

RNA

Protenas

-Caractersticas Generales -Enzimas implicadas: Caractersticas -Proceso de Replicacin: 1-Iniciacin 2-Elongacin 3-Terminacin -Replicacin en Eucariotas

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin del DNA

La transferencia de la informacin gentica de una generacin a otra requiere la copia exacta de la informacin gentica incluida en el DNA.

A C T A A T G G G G A T C C 3 T G A T T A C C C C T A G G A C T A A T G G G G A T C C 3 T G A T T A C C C C T A G G A C T A A T G G G G A T C C T A C C C C T A G G

3 5 3 5

T G A T

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Caractersticas generales de la replicacin del DNA

El mecanismo de replicacin del DNA fue sugerido a partir del modelo estructural del DNA propuesto por Watson y Crick en 1953. La replicacin del DNA implica la separacin de ambas cadenas para permitir que sean copiadas

La replicacin del DNA: La replicacin del DNA:

* es un proceso semiconservativo. * es un proceso bidireccional. * es un proceso semidiscontnuo. * la enzima clave en la replicacin del DNA es la DNA polimerasa. 5 3

Dependiente de molde Requiere un cebador 3-OH libre

1-Replicacin: es semiconservativa

Experimento de Meselson y Stahl (1958)

2-Generalmente Bidireccional:A partir de un Origen de Replicacin dos Horquillas de Replicacin

Unidireccional: Mitocondrias Otras Estrategias de Replicacin, Virus (crculo Rodante)

3-Semidiscontinua
Fragmentos de Okazaki Una de las hebras es copiada de forma continua. Llamada hebra continua
La otra hebra es copiada de en forma de FRAGMENTOS de 1000-2000 bases, en Procariotas o 100-200 bases en Eucariotas. Llamada Hebra Discontinua o Hebra Retrasada o Retardada
Estos Fragmentos se conocen como Fragmentos de OKAZAKI

Enzimas Implicadas en la Replicacin DNA Polimerasas

Caractersticas Generales

1-Sustratos DNA monocatenario Desoxinucleotidos Trifosfatos (dNTP) Extremo 3-OH libre 2-Reaccin: Formacin de un enlace Fosfodiester Cataliza el ataque nucleoflico de un extremo 3-OH libre Sobre el fosfato alpha del dNTP Polimerizacin en sentido 5---- 3 3-Procesativas o Progresivas (frente a dispersivas). Son capaces de catalizar multiples Ciclos. No abandonan el sustrato (DNA monocatenario) . Cataliza una serie de pasos sucesivos de polimerizacin sin liberar el molde

4-Tienen Actividad Autocorrectora

La tasa de error determinada exclusivamente por el apareamiento entre bases es alta (1 error /1000 Nucletidos.

La tasa de error de la DNA polimerasa de E. Coli es de 10-7 . Autocorreccin Actividad Exonucleasa 3-5
Algunas DNA polimerasas tambin tienen actividad Exonucleasa 5--3.

Dominio de Klenow

5-Necesitan un Cebador para polimerizar. No son capaces de iniciar la sntesis de DNA

Tipos de DNA polimerasas de E. coli Pol I Peso Molecular Nmero molculas clula V max Nucleotidos/s 3 exonucleasa 5 exonucleasa Procesividad Funcin 103000 400 16-20 Si Si 3-200 Reparacin DNA Procesamiento Cebadores Pol II 90000 100 2-5 Si No 10.000 Reparacin? Respuesta SOS? Pol III 130000 10 250-1000 Si No 500.000 Elongacin en la replicacin

Tema 12: Replicacin y Reparacin

DNA polimerasa III

* Holoenzima formada por 10 tipos de cadenas polipeptdicas diferentes.

* Es un dmero asimtrico.

* El complejo tiene una masa de aproximadamente 900 kd.

* Puede copiar ms de 4.5 millones de nucletidos (4.5 megabases) sin separarse del DNA (1 kilobase /segundo).

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se organiza este complejo ?

Core : actividad polimerasa. Complejo (, , , , ) : responsable de la unin del complejo DNA polimerasa III al DNA. Cataliza (ATP) la unin de un dmero (anillo) a la cadena de DNA.

Dmero : mantiene unido el complejo y el core.

Dmero : acerca el core al DNA aumentando la procesividad de la polimerasa.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se organiza este complejo ?

Modelo de la subunidad de la DNA polimerasa III rodeando el DNA

Otras Protenas implicadas en la Replicacin:

Helicasas o dnaB: Desenrollan la doble hlice. Consumen ATP

Protena SSB: Unin al DNA monocatenario. Mantiene al DNA desplegado

Primasa: RNA polimerasa. Sntesis de cebadores

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en procariotas
Iniciacin

Se inicia en un punto determinado como la regin ori C de E. Coli.

Producen un sper Enrrollamiento. Separacin de las hebras

Iniciacin de la Replicacin, Procariotas

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en procariotas
* El superenrrollamiento del ADN circular en un punto concreto (ori C) provoca la separacin de la doble hlice (fuerza de torsin).

* DnaB (DNA helicasa): se une a una secuencia de cadena sencilla y se desplaza a lo largo de la secuencia de DNA y cataliza (ATP) la rotura de los puentes de H entre los nucletidos complementarios permitiendo la separacin de las dos cadenas de DNA.

* SSB (Single-Stranded DNA binding): mantiene la estructura de la doble hlice desenrrollada para permitir la copia por parte de la DNA polimerasa.

Replisoma

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

* En E. Coli, la replicacin del cromosoma bacteriano se inicia en un punto concreto denominado ori C que tienen una extensin de 245 pb.

* A partir de este punto la horquilla de replicacin se desplaza en ambos sentidos hasta completar la replicacin total del cromosoma circular bacteriano.

* En la hebra de DNA en sentido 3-5 la DNA polimerasa empieza la replicacin y avanza a lo largo del cromosoma, polimerizando en sentido 5- 3.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en procariotas
* La primasa (DnaG), sintetiza una molcula de RNA que acta como cebador o punto de inicio de la replicacin.

* DNA polimerasa: a partir de una secuencia de cadena sencilla, que usa como molde, puede sintetizar una cadena complementaria de DNA.

* La DNA polimerasa polimeriza en sentido 5-3, es decir, lee la cadena molde en sentido 3-5.

* La DNA polimerasa III es la principal responsable de la replicacin del DNA bacteriano. Es una holoenzima formada por al menos 10 subunidades diferentes.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

* A partir de este punto la horquilla de replicacin se desplaza en ambos sentidos hasta completar la replicacin total del cromosoma circular bacteriano.

* En la hebra de DNA en sentido 3-5 la DNA polimerasa empieza la replicacin y avanza a lo largo del cromosoma, polimerizando en sentido 5- 3.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se replica la hebra 5 - 3?

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se replica la hebra 5 - 3?

* La replicacin de esta cadena se realiza de forma discontinua.

* La primasa (DnaG), sintetiza una molcula de RNA que acta como cebador, o punto de inicio de la de la replicacin.

* A medida que la horquilla de replicacin avanza y se desenrolla el DNA, la DnaG sintetiza nuevos cebadores de RNA que son utilizados como puntos de inicio de la replicacin en la cadena 5 - 3.

* Estos fragmentos de RNA-DNA reciben el nombre de fragmentos de Okazaki.

* Este mecanismo de replicacin implica que la DNA polimerasa III, unida por los dmeros a la hebra de DNA, se libere y se una de nuevo en cada fragmento de Okazaki.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

* Finalmente, detrs de la horquilla de replicacin (downstream) la DNA polimerasa I elimina los fragmentos de Okazaki (actividad exonucleasa 5 - 3) y completa los huecos con DNA.

* La DNA ligasa sellar los huecos entre un grupo 3-OH y un 5-grupo fosfato vecinos.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

La replicacin avanza de manera simultanea en ambas cadenas

Replicacin

Enzimas Implicadas en la Replicacin 1- Una DNA girasa, en procariotas. 2- Protenas que separan las hebras del DNA en la horquilla de replicacin: helicasas 3- Protenas que impiden la nueva unin de las hebras antes de la replicacin: protena SSB 4- Enzimas que sintetizan cebadores de RNA:primasa 5- Una DNA polimerasa 6- Una enzima que elimina los cebadores de RNA: Pol I actividad exonucleasa 5 3 7- Una enzima que une los fragmentos de Okazaki contiguos: ligasa

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Cmo se desarrolla la replicacin ?

* La replicacin del cromosoma bacteriano termina en el locus Ter o t.
Ori c

Cont/Disc

Disc/Cont

Ter

Formada por un nmero de secuencias cortas de DNA, orientadas en ambos sentidos para bloquear a las dos horquillas de replicacin. La secuencia consenso: 5-GTGTGTTGT-3

Protena Tus

Regin Ter

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Regin Ter

Protena Tus

Regin Ter

La protena Tus se une al DNA en la regin Ter. Es una contrahelicasa que evita que se desenrolle el DNA e inhibe la actividad helicasa de la protena DnaB.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Terminacin de la Replicacin Regin Ter

Inhibicin de las helicasas

tus

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Replicacin en eucariotas
* Ocurre en la fase S del ciclo celular.

* El DNA eucariota est organizado en cromosomas que se encuentran en el ncleo celular.

* La replicacin del DNA ocurre en mltiples orgenes de replicacin (replicones) de manera simultnea, que se distribuyen a lo largo de cada cromosoma.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en eucariotas
* Ocurre en la fase S del ciclo celular. * El DNA eucariota est organizado en cromosomas que se encuentran en el ncleo celular.

* La replicacin del DNA ocurre en mltiples orgenes de replicacin (replicones) de manera simultnea, que se distribuyen a lo largo de cada cromosoma.

* La replicacin comienza con la activacin del ORC (Origin Recognition Complex).

* Primero se forma un pre-complejo de replicacin por la unin al ORC de la protena Cdc6p.

* Posteriormente se unen las protenas MCM al cromosoma para permitir la replicacin del DNA.

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en eucariotas

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en eucariotas
* Formado el pre-complejo la replicacin se inicia por la accin de protenas kinasas: ciclina B-CDK. * La fosforilacin de las protenas que forman el ORC provoca su separacin y degradacin de las mismas as como el inicio de la replicacin.

Ensamblaje del complejo e inicio de la Replicacin (Levaduras)

Pre-RC (Pre-Replicative Complex)
Pre-RC assembly Cdc45 Cdc6 Cdt1 ORC Sld3 Initiation of DNA replication MCMs G1 S S-CDK
DDK

Ori

SPF (S-phase Promoting Factor)

M G2 Pre-RC disassembly Post-replicative state

Cdk1 Clb5,6

Cdc7 Dbf4

S-CDK

DDK

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Replicacin en eucariotas
DNA Polimerasas de eucariotas

Mass (kD) Native Catalytic core Other subunits Location Associated functions 3' -> 5' exonuclease Primase Properties Processivity Fidelity Replication Repair >250 165-180 70, 50, 60 Nucleus No Yes Low High Yes No

170 125 48 Nucleus Yes No High High Yes ?

256 215 55 Nucleus Yes No High High Yes Yes

36-38 36-38 None Nucleus No No Low Low No Yes

160-300 125 35, 47 Mitochondria Yes No High High Yes No

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Replicacin en eucariotas
DNA Polimerasas de eucariotas
Interviene sntesis de la hebra retardada. Sntesis del cebador: 10 nucletidos de ARN y 25 de ADN. Sntesis de la hebra continua y retardada (Proliferating cell nuclear antigen) Sntesis de la hebra retardada Unin Fragmentos de Okazaki ? Reparacin Unin de los fragmentos de Okazaki ? Sntesis ADN mitocondrial.

ADN Pol /primasa ADN Pol /PCNA

ADN Pol ADN Pol ADN Pol

Tema 12: Replicacin y Reparacin

Diferencias procariotas eucariotas

Prokaryotes Three polymerases I - repair enzyme II - unknown III- main polymerizing enzyme

Eukaryotes Five polymerases - makes primers , begins synthesis - repair enzyme - mitochondrial DNA synthesis - main polymerizing enzyme - polymerizing enzyme, primer removal Not all polymerases are exonucleases Several origins of replication Okazaki fragments of 150-200 residues long Histones complexed with DNA

Polymerases are also exonucleases One origin of replication Okazaki fragments of 1000-2000 residues long No proteins complexed with DNA

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Replicacin de los telmeros

* Los telmeros son secuencias cortas de 5-8 pb, ricas en G, repetidas en tandem, localizadas al final de los extremos de los cromosomas lineales de la mayora de los eucariotas. Son secuencias no codificantes * Son necesarios para el mantenimiento y la estabilidad de los cromosomas.

* La DNA polimerasa no puede replicar los extremos 5 puesto que necesitan un cebador sobre el que iniciar la replicacin.

* Por tanto, los extremos 5 de los cromosomas se veran acortados en cada ciclo de replicacin.

TELMEROS

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Replicacin de los telmeros

* La telomerasa es una Ribonucleoprotena con actividad DNA polimerasa.

* El componente RNA acta como molde para la sntesis de las secuencias telomricas de DNA que extienden el extremo 3de la hebra molde.

* Finalmente esta secuencia extendida es copiada por el mecanismos convencional y posteriormente eliminada.

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Replicacin de los telmeros