FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAO DA AO DE DIFERENTES ANTIBITICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENO DO ETANOL

ARAATUBA 2010

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAO DA AO DE DIFERENTES ANTIBITICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENO DO ETANOL

Trabalho de Graduao apresentado Faculdade de Tecnologia de Araatuba, do Centro Estadual de Educao Tecnolgica Paula Souza, como requisito parcial para concluso do curso de Tecnologia em Biocombustveis sob a orientao da Profa. Dra. Valria Garcia Pereira.

ARAATUBA 2010

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE ARAATUBA CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTVEIS GREICE KELLY CARDOSO DA SILVA

AVALIAO DA AO DE DIFERENTES ANTIBITICOS SOBRE O CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA A OBTENO DO ETANOL
Trabalho de Graduao apresentado Faculdade de Tecnologia de Araatuba, do Centro Estadual de Educao Tecnolgica Paula Souza, como requisito parcial para concluso do curso de Tecnologia em Biocombustveis examinado pela banca examinadora composta pelos professores

_________________________________ Profa. Dra. Valria Garcia Pereira Orientadora- Fatec-Araatuba

Profa. Ms. Mrcia Maria de Souza Moretti

Profa. Dra. Cludia Dorta Fatec- Marlia

Araatuba 2010

Dedico este trabalho a Deus por me dar o privilgio de viver, sonhar e sempre acreditar nos meus sonhos. Por me ensinar a arte da vida. Aos meus queridos e amados pais, pela dedicao, estmulo e apoio em todos os momentos.

Agradecimentos

Agradeo primeiramente a Deus por Tua doce presena que me impulsiona a viver a cada dia. minha amada famlia pelo amor, apoio e sensibilidade, que tornaram meus passos possveis. minha av Sudaria pela fora em todas as suas oraes. Ao Vinicius, futuro esposo e companheiro de todas as horas, por sempre acreditar em mim. Aos meus pastores Lgia e Jorge Sabino, educadores presentes que me permitiram acreditar que a transformao possvel. minha querida professora Valria, pela dedicao e pelo convite a aprender. usina Alcoazul S/A, por ter cedido os materiais para as anlises, pela disponibilidade em nos receber e permitir assim que este trabalho fosse realizado. empresa Reibrand, por contribuir com as fichas tcnicas, pela disponibilidade e ateno, contribuindo para que este trabalho se tornasse completo. professora Mrcia, que em to pouco tempo me ensinou a acreditar que posso ir alm. diretora Daniela, pelo entusiasmo e abertura a tantas mudanas e descobertas. minha prima Joice, pelo brilho no olhar em nossas deliciosas conversas. s minhas amigas sempre presentes Natlia, Letcia e Andria, por estarem presentes quando mais precisei com conselhos e carinho. minha turma por estes breves anos de convivncia e aprendizado, em especial ao Teruo, Osmar e Jonathan que me ensinaram o que as palavras no dizem e invisvel aos olhos. Verinha, amiga de sala, pela contribuio que ajudou muito toda turma nestes quase trs anos de graduao.

O nico lugar em que sucesso vem antes de trabalho no dicionrio

Albert Einstein

RESUMO

O processo fermentativo para a produo de etanol pode sofrer contaminaes por microrganismos indesejveis, o que prejudica o desempenho da levedura utilizada. Vrios so os mtodos preconizados para tratamento e inibio dos microrganismos indesejveis, e dentre eles o uso de antibiticos bastante difundido. Este trabalho avaliou o efeito da ao inibitria de alguns antibiticos utilizados na fermentao alcolica industrial atravs do uso de um antibiograma. Para realizao destes testes foram utilizados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo isolados do processo fermentativo industrial. Os microrganismos foram inoculados em meio de cultivo gar Padro de Contagem de Placas (ACP) e submetidos dosagem recomendada de antibiticos, por meio de perfuraes no gar, criando poos de cerca de 5milmetros de dimetro, onde foram adicionados 25L das substncias inibidoras. Os halos de inibio para cada um dos antibiticos foram avaliados, e a clindamicina HLC+tetraciclina apresentou o maior valor mdio (20,5 mm) na inibio do coco. Para o bacilo a penicilina apresentou o maior valor mdio de inibio (14,5 mm), porm para ambos os microrganismos, a anlise estatstica no demonstrou diferena significativa na comparao dos resultados.

Palavras-chave: antibitico, fermentao alcolica, contaminao bacteriana, inibio.

ABSTRACT

The fermentation process for ethanol production can suffer from contamination by undesirable microorganisms, which impairs the performance of yeast used. Several methods are recommended for treatment and inhibition of undesirable microorganisms, and among them the use of antibiotics is widespread. This study evaluated the effect of the inhibitory action of some antibiotics used in ethanol fermentation through the use of an agar diffusion test. To conduct these tests we used one Gram-positive cocci and one Gram-positive rod, isolated from fermentation industrial process. The microorganisms were inoculated in agar gar Standard Plate Count (ACP) and submitted to the dosage of antibiotics, through perfurations in the agar, creating pools of approximately 5milmetros in diameter, which were added with 25L of the inhibitory substances. The inhibition zones of each antibiotic were evaluated and clindamicin HLC+tetraciclin showed the higher average (20,5 mm) for cocci inhibition. For the rod inhibition penicilin showed the greater average (14,5 mm), but for both microorganisms, statistical analysis showed no significant difference between results.

Key-words: antibiotic, alcoholic fermentation, bacterial contamination, inhibition.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Atividade inibidora da oxitetraciclina sobre o coco Gram-positivo ........................40 Figura 2 - Atividade inibidora da clindamicina HCL + tetraciclina sobre o coco Gram-positivo ..................................................................................................................................................41 Figura 3 - Atividade inibidora da Penicilina sobre o coco Gram-positivo...............................42 Figura 4- Atividade inibidora da Penicilina sobre o bacilo Gram-positivo..............................44

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Fabricante e princpio ativo dos agentes inibidores utilizados................................36 Tabela 2 - Inibio (halo em mm) do coco Gram-positivo contaminante, por diferentes antibiticos usados comercialmente. ........................................................................................39 Tabela 3 - Inibio (halo em mm) do bacilo Gram-positivo contaminante, por diferentes antibiticos usados comercialmente..........................................................................................42

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP - Adenosina Trifosfato CO2 - Dixido de Carbono DNA - cido Desoxirribonuclico Dy - Potencial Eltrico H+ - ons H+ H2SO4 - cido Sulfrico K+ - Concentrao de ons K+( Potssio) LAB - Latic acid bacteria (Bactria cido Ltica) mL - Mililitros mm - Milmetros pH - Potencial de Hidrogeninico ppm - Parte por Milho Prolcool - Programa Nacional do lcool SO2 - Dixido de Enxofre

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 - Visualizao dos valores das mdias e do desvio padro dos halos de inibio(mm) descritos na Tabela 1 para o coco Gram-positivo............................................42 Grfico 2 - Visualizao dos valores das mdias e do desvio padro dos halos de inibio(mm) descritos na Tabela 2 para o bacilo Gram-positivo............................................44

SUMRIO

INTRODUO................................................................................................................... .....13 1 REVISO DE LITERATURA .............................................................................................15 1.1 Importncia do Etanol Brasileiro........................................................................................15 1.2 Processo Fermentativo para Obteno de Etanol ...............................................................18 1.3 Principais Microrganismos Contaminantes ........................................................................21 1.4 Distrbios Operacionais Decorrentes da Contaminao na Fermentao..........................24 1.5 Principais Mtodos Usados no Controle da Contaminao na Fermentao .....................26 1.6 Antibiticos Usados no Controle da Contaminao na Fermentao Alcolica................28 2. METODOLOGIA.................................................................................................................31 2.1 Materiais .............................................................................................................................31 2.1.1 Microrganismos contaminantes.......................................................................................31 2.1.2 Antibiticos utilizados.....................................................................................................31 2.2 Mtodos ..............................................................................................................................32 2.2.1 Isolamento dos Microrganismos contaminantes..............................................................32 2.2.2 Ativao dos Microrganismos contaminantes.................................................................32 2.2.3 Ensaios de inibio ..........................................................................................................32 2.2.4 Anlise Estatstica ...........................................................................................................33 3. RESULTADOS ....................................................................................................................34 3.1 Microrganismos contaminantes..........................................................................................34 3.2 Atividade inibidora dos antibiticos testados.....................................................................34 4. DISCUSSO ........................................................................................................................40 CONSIDERAES FINAIS ...................................................................................................42 REFERNCIAS .......................................................................................................................43

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INTRODUO

Como fontes alternativas de energia, os biocombustveis so utilizados com a finalidade de diminuir o uso dos combustveis fsseis, visto que so energias renovveis. Dentre os biocombustveis existentes, o etanol o que ocupa maior destaque na atualidade, por ter sua produo economicamente vivel, seja por motivos tecnolgicos ou pelo rendimento apresentado, o que no ocorre com os demais. A utilizao de etanol no Brasil como biocombustvel encontrou seu pice na dcada de 70, com a criao do programa Prolcool, que surgiu devido crise internacional do petrleo (SOUZA, 2007). Atravs da implantao do Prolcool, Programa Nacional do lcool, em 14 de novembro de 1975, a produo de etanol brasileiro cresceu de 556 milhes de litros em 1975/76 para 17,8 bilhes de litros na safra de 2006/07 (UNICA, 2007). Com a implantao do programa, o Brasil conquistou uma tecnologia nica no mundo para utilizao em larga escala de um combustvel renovvel que no depende do petrleo. A maior diferena ambiental do lcool est em sua origem renovvel (FILHO, 2003). Mesmo o Brasil sendo um grande produtor de etanol, neste processo ainda existem problemas que diminuem o rendimento etanlicocom a contaminao da fermentao por microrganismos, estes podem sobreviver durante o processo industrial de produo do etanol, mesmo aps o tratamento trmico do caldo, passando pelos trocadores de calor, at a chegada s dornas de fermentao, onde existe um expressivo aumento da populao bacteriana (ALCARDE, 1995). O conhecimento do processo fermentativo fundamental na busca por aprimoramento, j que toda a produo do lcool ocorre por esta via. A infeco bacteriana na fermentao pode causar danos ao processo tais como: consumo de acar, formao de goma, floculao do fermento, inibio e queda da viabilidade das leveduras devido s toxinas e cidos orgnicos excretados no meio. Por conseqncia, ocorre reduo no rendimento e na produtividade da fermentao (AMORIM e OLIVEIRA, 1982). A degradao de sacarose e a formao de cido ltico e actico so os maiores prejuzos causados pela contaminao bacteriana. Eles podem ocasionar perda de acar significativa e intoxicao das leveduras (OLIVA NETO e YOKOYA, 2001). A indstria sucroalcooleira faz uso de mtodos tradicionais para o tratamento do caldo de cana-de-acar fermentado, com o objetivo de reduzir sua carga microbiana contaminante, preconizando o uso de antibiticos e de cido sulfrico concentrado. Os antibiticos microbiocidas so especficos, com ao seletiva sobre as principais bactrias contaminantes

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da fermentao. A maioria dos princpios ativos empregados na indstria do etanol obtida do metabolismo de microrganismos selecionados, sendo que o grau de pureza de cada molcula depende do refinamento do processo seqencial de purificao. A sensibilidade das bactrias contaminantes frente a novos agentes antimicrobianos tem sido largamente estudada (CHERUBIN, 2003). Os antibiticos so agentes quimioteraputicos especiais, geralmente obtidos a partir de metablitos de microrganismos que, em quantidades muito pequenas, podem matar ou inibir outros microrganismos. Os antibiticos englobam uma grande diversidade de substncias que podem ser classificadas segundo o mecanismo de ao (EGUCHI, 1989). Considerando o conceito de que h gastos elevados com a aquisio destes produtos pelas destilarias, existe a necessidade de se avaliar o princpio ativo destes produtos bem como identificar os contaminantes principais. A identificao dos contaminantes principais facilitaria a aquisio do antibitico mais especfico possvel, enquanto que avaliar o desempenho dos principais produtos utilizados nas destilarias poderia contribuir com a eliminao de custos (SOUZA, 2007). O presente trabalho tem como objetivo analisar o mosto contaminado, coletado de processo real de usina sucroalcooleira, para isolar microrganismos responsveis pela contaminao, e avaliar o efeito inibitrio de alguns antibiticos de uso comercial, sobre tais microrganismos isolados, identificando qual deles apresentou o melhor efeito inibidor.

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1 REVISO DE LITERATURA

1.1 Importncia do Etanol Brasileiro

Aps a crise do Petrleo na dcada de 70, o conceito de etanol foi mudado por meio da busca por fontes alternativas de combustveis. O impulso foi dado aps o governo retomar as pesquisas e os investimentos para o desenvolvimento do lcool como combustvel (BERTELLI,1992). A criao do Programa Nacional do lcool Prolcool em 1975 foi um grande momento deste perodo e visava estimular a produo do lcool pelos empresrios do setor, pela oferta de emprstimos a juros favorecidos e a garantia de altos preos de vendas. O estmulo foi estabelecido at a implementao do parque industrial e do alcance da produtividade a nveis considerveis. Este programa ajudou o Brasil a conquistar uma tecnologia nica no mundo para o uso em larga escala de um combustvel renovvel que no depende do mercado internacional do petrleo (CAVALCANTI, 2007). Segundo Bertelli (1992), com o lanamento do programa houve um crescimento progressivo na produo de lcool de 500 milhes de litros em 1975 at 12,7 bilhes de litros na safra de 1991/1992. O etanol no Brasil era produzido por processo de fermentao descontnua, batelada simples. A partir da implantao do Prolcool, segundo Zaperlon e Andrietta (1992), todas as novas destilarias foram montadas baseando-se no processo MelleBoinot (batelada alimentada com reciclo de clulas). Essa troca mostrou ser conveniente e satisfatria com relao operao e eficincia na converso de acares em lcool. J visando a reduo dos custos de produo e aumento da produtividade, a fermentao alcolica contnua mostrou ser um processo atrativo. O Brasil responde por 15 milhes de litros de lcool de um total de quase 40 bilhes de litros da produo mundial. Presume-se que at 25 bilhes de litros sejam usados para fins energticos. O lcool utilizado em mistura com gasolina no Brasil, Estados Unidos, Unio Europia, Mxico, ndia, Argentina, Colmbia e, mais recentemente, no Japo. A utilizao exclusiva do lcool como combustvel est concentrada no Brasil. O lcool pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a cana-de-acar a realidade econmica atual.

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Investimentos esto sendo realizados para viabilizar a produo de lcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhes de litros de lcool poderiam ser obtidos desta fonte nos EUA. No Brasil, as pesquisas se voltam, principalmente, para o desenvolvimento de enzimas que permitam extrair a celulose do bagao da cana .O benefcio ambiental associado ao uso de lcool enorme, pois cerca de 2,3t de CO2 deixam de ser emitidas para cada tonelada de lcool combustvel utilizado, sem considerar outras emisses, como o SO2 (MOREIRA, 2009). O setor sucroalcooleiro tem demonstrado dinamismo considervel e participa com parcela relevante da atividade agrcola paulista e brasileira. O mercado interno do lcool vem se destacando no segmento agroindustrial brasileiro, gerado pela retomada do aumento do consumo domstico em conseqncia do preo competitivo do combustvel em relao gasolina. Por outro lado, h um potencial de crescimento nas vendas externas do lcool, que possivelmente ser utilizado para atender parte da demanda mundial por etanol. A expanso do lcool est acontecendo por se tratar de um combustvel ainda barato, renovvel e cujo emprego como alternativa para a matriz energtica mundial est em fase de crescimento. A tendncia de aumento da produo de lcool no Brasil ocorre por vrios fatores, como aumento da frota de carros bi-combustvel (demanda interna), Protocolo de Quioto (demanda externa) e aumento do preo do petrleo, entre outras coisas (TORQUATO, 2005). A produo de etanol no Brasil tem como matria-prima a cana de acar, sendo produzido nas regies Centro-Sul e Norte-Nordeste. Sendo considerado pelos especialistas como lcool etlico de biomassa, o etanol para uso combustvel ou industrial, inclusive na produo de bebidas industrializadas, excluindo, entretanto, o lcool contido em bebidas originais como cachaa, rum, vodka, whisky, bourbon, conhaque e outras. A produo de etanol, neste sentido, composta pelo lcool anidro e lcool hidratado. O Brasil e os Estados Unidos so atualmente os maiores produtores de etanol, embora os Estados Unidos extraiam esse produto do milho, e no da cana-de-acar como acontece no Brasil. Devido especialmente ao crescimento do consumo interno e as exportaes de etanol, suas projees referentes a produo, consumo e exportao, refletem grande dinamismo desse produto. A produo de etanol estimada para 2017 de 38,6 bilhes de litros, mais que o dobro da produo de 2006. O consumo interno para 2017 est projetado em 28,4 bilhes de litros e as exportaes em 10,3 bilhes. A Secretaria de Produo e Agroenergia do MAPA projetam para 2010, vendas de automveis flex de 1,0 milho de veculos, quase o dobro a mais que os automveis a gasolina, cujas vendas projetadas so de 467 mil unidades. A

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expanso do setor automobilstico e o uso crescente dos carros flex atualmente o principal fator responsvel pelo crescimento da produo de etanol no Brasil (MINISTRIO DA AGRICULTURA PECURIA E ABASTECIMENTO, 2005). Segundo relatrio divulgado pela Unio da Indstria de Cana-de-Acar (nica) a moagem de cana-de-acar no Centro-Sul do pas totalizou 19,29 milhes de toneladas na primeira quinzena de abril, reflexo do aumento no nmero de usinas em operao - na segunda quinzena de maro 74 empresas estavam em operao, nmero que cresceu para 207 unidades nesta quinzena. No acumulado, a moagem na safra 2010/2011 atingiu 26,22 milhes de toneladas, 52,20% superior ao volume processado no mesmo perodo do ano anterior, que foi de 17,23 milhes de toneladas. Esse crescimento reflete a antecipao do incio da safra em um nmero considervel de empresas. Na primeira quinzena de abril, a produo de acar totalizou 756,70 mil toneladas e a de etanol 710,00 milhes de litros, sendo 92,40 milhes de etanol anidro e 617,60 milhes de hidratado. No acumulado desde o incio da safra, a produo de acar chegou a 972,90 mil toneladas. A produo de etanol, por sua vez, alcanou 984,70 milhes de litros, sendo 131,20 de etanol anidro e 853,50 milhes de etanol hidratado (NICA, 2010). A grande diferena ambiental do lcool est em sua origem renovvel. Alm de possuir propriedades desejveis como combustvel, tambm traz benefcios com respeito qualidade do ar urbano e do clima global. Com essas vantagens, existe um grande interesse no seu uso, tanto na forma pura como misturado gasolina. O etanol produzido atualmente a partir da cana-de-acar no Brasil e a partir do milho e de outros amilceos nos Estados Unidos. Existem tambm outras fontes que podem servir como matria-prima barata e renovvel. Novas tecnologias para converso de materiais lignocelulsicos em etanol esto sendo estudadas e disponibilizadas, mas o custo ainda no muito competitivo com o preo da gasolina no mercado mundial (LIMA, et al., 2002). Por ser a segunda maior fonte de energia renovvel do Brasil, a cana-de-acar tem participao na matriz energtica atual com 12,6%, considerando-se o lcool combustvel e a cogerao de eletricidade, a partir do bagao. Dos 6 milhes de hectares plantados de canade-acar no Brasil, cerca de 85% esto na Regio Centro-Sul (concentrada em So Paulo, com 60% da produo) e os 15% restantes na Regio Norte-Nordeste (MOREIRA, 2009). Em relao a outros pases, o Brasil possui vrias vantagens na produo de etanol, pois possui total domnio da produo desse combustvel. O pas possui uma rea extensa de terra propcia ao plantio dessa cultura e tambm mo-de-obra disponvel. O custo de produo por litro em comparao a outros pases menor (MICHELLON et al., 2008). A vantagem

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principal do etanol brasileiro o custo de sua produo, garantido por suas mquinas que so movimentadas por energia que gerada pela queima do prprio bagao de cana. Isto proporciona independncia quanto aos combustveis fsseis e aumenta a relao custobenefcio, pela regularidade do ndice pluviomtrico e pelo nvel de insolao (ANDRADE, 2009).

1.2 Processo Fermentativo para Obteno de Etanol A fermentao alcolica um processo qumico de transformao dos acares em lcool. Este processo desencadeado geralmente por leveduras, onde acares como sacarose, glicose e frutose so transformados em etanol. Para que o acar (glicose) seja transformado em etanol e gs carbnico so necessrias 11 reaes em seqncia ordenada, conhecida como via glicoltica. Nesta via, cada reao catalisada por uma enzima especfica. O processo fermentativo pode ser afetado pela ao de diversos fatores sofridos por estas enzimas glicolticas, como quantidade de nutrientes, presena de inibidores, vitaminas, pH, temperatura, entre outros. Por gerarem ATP, as rotas produtoras de energia necessitam de diversas coenzimas para realizao das diferentes reaes de biossntese. O cido pirvico, um produto final importante em todas as rotas, em anaerobiose precursor dos cidos, alcois e outros produtos (WARD, 1991). Nos ltimos 15 anos, a bactria Zymomonas mobilis vem despertando muito interesse pelo seu potencial na produo de etanol, produzindo cerca de 1,9 mol de etanol por mol de glicose, com velocidade trs a quatro vezes maior que Saccharomyces cereviseae. Mesmo com as vantagens apresentadas por Zymomonas mobilis perante as leveduras (fermentaes mais rpidas com maior rendimento em etanol, condies de crescimento mais simples, maior taxa especfica de produo de lcool e consumo de substrato, maior tolerncia a elevadas temperaturas, concentrao de acar e etanol) o rendimento fermentativo diminui quando se utiliza sacarose como carboidrato para a fermentao. Isto se deve, segundo alguns autores, formao de subprodutos como levana e sorbitol (ERNANDES et al., 2009). A utilizao de bactrias na fermentao vem sendo estudada em busca de reduzir o tempo da fermentao alcolica. Por apresentarem atributos tecnolgicos que favorecem seu uso na fermentao alcolica em escala industrial, as bactrias Zymomonas mobilis causam um grande interesse no mundo cientifico, biotecnolgico e industrial. Trata-se de uma

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bactria que possui habilidades de transformar acares em etanol e gs carbnico em condies comparveis s exigidas pelas leveduras (GUERESCHI et al., 2009). Outro microrganismo potencialmente interessante tanto do ponto de vista gentico como fisiolgico para ser usado em processos industriais a Escherichia coli. Este microrganismo possui a capacidade de fermentar com eficincia uma grande variedade de acares que fazem parte da biomassa lignocelulsica, mas produz uma mistura de produtos de fermentao de pequeno valor (LIMA et al., 2002). A rota tecnolgica no Brasil, adotada na poca do Prolcool para a produo de etanol a partir de cana-de-acar prev a utilizao de leveduras como sendo os microrganismos responsveis pela fermentao. As leveduras fornecem um plo enzimtico para o processo, sendo responsvel pelo desdobramento dos acares em lcool. (SOUZA, 2007). A levedura Saccharomyces cerevisiae a mais usada nessa tecnologia mas no capaz de fermentar pentoses. Nos ltimos anos, estudos esto sendo realizados na busca de microrganismos fermentadores de uma variedade de acares j que um dos objetivos aumentar a produo etanlica a partir do bagao da cana hidrolisado (LIMA, 2002). Para o processo de fermentao do mosto de caldo de cana-de-acar e melao para produo de acar e etanol so empregadas cepas selecionadas da levedura Saccharomyces cerevisiae (SOUZA, 2007). Na obteno de etanol por via fermentativa, as leveduras so os microrganismos mais importantes. Elas fazem parte do grupo de ascomicetos denominados fungos superiores, so unicelulares, eucariticos e heterotrficos. So geralmente maiores que as bactrias, possuem formas arredondadas quase sempre, ovais ou elpticas, mas podem variar em suas dimenses com limites desde 1 a 5 comprimento (PELCZAR et al., 1980). Este microrganismo usado comercialmente na fermentao alcolica, pois promove um alto rendimento e elevada produtividade, sendo estes os principais critrios tecnolgicos para sua escolha. O alto rendimento e a elevada produtividade esto relacionados com a rpida converso de acar em lcool com baixa produo de componentes secundrios (PATARO et al., 1998). A levedura realiza a fermentao do acar com o objetivo de conseguir energia qumica necessria para sua sobrevivncia, sendo o etanol apenas um subproduto deste processo. Para que o homem consiga se beneficiar dessa habilidade preciso conferir s leveduras condies ideais para que as mesmas trabalhem seu favor, produzindo etanol com eficincia. A fermentao alcolica ocorre no citoplasma da clula da levedura enquanto que a oxidao total do acar (respirao) ocorre na mitocndria (TOSETTO, 2002). m de largura e 5 a 12 m de

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Para ser econmico, o processo biotecnolgico de obteno do etanol depende de trs fatores principais: 1) eficincia do microrganismo; 2) explorao da matria prima, com especial considerao ao pr-tratamento e desintegrao e 3) sistema apropriado do biorreator para a fermentao. Rpida fermentao e alto nvel de etanol so desejveis para o processo ser economicamente vivel (ANDRADE, 1997). Em escala industrial o processo de fermentao pode ser conduzido de maneira contnua ou em bateladas, sendo que nas destilarias brasileiras, a levedura pode ser recuperada ao final do ciclo e reaproveitada na fermentao seguinte. Na maioria das usinas de acar e lcool usa-se o processo Melle-Boinot para produzir etanol. Ele baseado na alimentao semi-contnua de uma srie de dornas de fermentao onde adicionado o inculo de leveduras obtido em um ciclo anterior. A cana-de-acar lavada para remoo de impurezas neste processo antes de iniciar a extrao do caldo que tratado por mtodos qumicos e trmicos. A composio bsica do mosto de caldo tratado e de melao e nutrientes, em alguns casos. Os acares do mosto so convertidos em lcool, dixido de carbono e outros subprodutos aps a adio do inculo de leveduras. Na centrifugao do mosto fermentado obtido o vinho e o leite. O vinho que rico em lcool segue para a destilao e o leite rico em leveduras comumente tratado com cido sulfrico para reaproveitamento (LIMA, 1982). Por no possurem unidades de esterilizao, as destilarias brasileiras so consideradas abertas do ponto de vista microbiolgico. Elas utilizam diferentes cepas comerciais com populaes mistas, ou seja, vrias linhagens de leveduras presentes. As linhagens podem ser selecionadas, ou seja, aquelas que so adquiridas de forma pura para serem usadas como inculo nas partidas do processo. Existem tambm as leveduras nativas, que so encontradas no processo, apresentam boas condies fermentativas, mas so diferentes das selecionadas. J as linhagens selvagens so aquelas que podem estar presentes nos processos, mas so consideradas contaminaes por no apresentarem caractersticas boas para fermentao (ANDRIETTA, 2007). Mesmo sendo considerado um processo teoricamente simples, a fermentao alcolica, pode ser drasticamente afetada em seu rendimento por diversos fatores, entre os quais, a contaminao bacteriana se destaca. O incio da contaminao bacteriana na fermentao na lavoura com a matria-prima. A cana-de-acar contaminada, e os problemas de eficincia no tratamento do caldo, levam um grande nmero de bactrias e produtos de seu metabolismo para o processo fermentativo (AMORIM e OLIVEIRA, 1982).

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1.3 Principais Microrganismos Contaminantes

O processo fermentativo etanlico industrial muitas vezes, processado em condies tecnicamente adversas. Segundo Mutton (1998) comum encontrar canas cortadas h muitos dias, secas, mostos ricos em impurezas minerais, canas contaminadas com diversos tipos de microrganismos. Na etapa do processo de produo de lcool, a fermentao alcolica, as leveduras convertem os acares presentes no substrato em etanol e gs carbnico. Nesta fase podem ocorrer vrios problemas. Entre os principais merece destaque a contaminao bacteriana, que consiste em uma das principais preocupaes das agroindstrias de acar, lcool e cachaa (CHERUBIN, 2003). Leveduras e bactrias lticas so freqentemente encontradas juntas nos ecossistemas naturais e podem competir pelos mesmos nutrientes (ALEXANDER, 1971). Essa intensa preocupao com os contaminantes encontrados nos processos de fermentao est relacionada aos transtornos que estes microrganismos podem provocar. A presena destes microrganismos tem origem no campo e atingem os colmos atravs de infestaes de pragas, danos por operaes de corte, transporte, carregamento, facilitando assim a infeco. O corte da cana tambm tem grande influncia sobre a contaminao, sendo que no corte manual h uma rea exposta bem menor para penetrao de microrganismos, enquanto que no mecanizado h um aumento dessa rea. Os ptios normalmente encontrados nas unidades industriais para receber as entregas de matria-prima devem ter seu estoque renovado em at 24 (vinte e quatro) horas. Um tempo maior que esse acentuaria a deteriorao da cana. Assepsia nas operaes de moagem, peneiragem, bem como o uso de antisspticos pode ajudar na diminuio desses microrganismos (MUTTON, 2008). A planta da cana-de-acar possui uma microflora distribuda tanto no sistema vascular como em sua camada perifrica. Ela levada junto com o caldo bruto no momento de sua obteno atravs da moagem das plantas. O nmero total de bactrias presentes no caldo bruto de cana-de-acar pode ser aumentado sensivelmente tanto por perodos prolongados entre o corte e a moagem da planta como pela falta de assepsia na moenda, filtros, bombas e tubulaes que entram em contato direto com o referido material (ALQUATI, 1990). A biodiversidade bacteriana nas dornas de fermentao grande, predominando as bactrias lticas, mas poucas so aquelas que j foram caracterizadas quanto ao seu perfil metablico e seus efeitos sobre a fermentao (BASSO, 2007). Amorim e Oliveira (1982)

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destacaram Acetobacter, Lactobacillus, Clostridium, Bacillus, Aerobacter, Streptococcus e Leuconostoc como sendo as bactrias mais comumente encontradas na fermentao alcolica, o que gera um comprometimento no rendimento alcolico e altera a viabilidade celular das leveduras. Bastonetes Gram-positivos identificados como Lactobacillus e Bacillus foram encontrados por Gallo (1989) em mosto resfriado e vinho final durante um estudo da contaminao bacteriana em leite com leveduras antes e aps ser adicionado o cido sulfrico. Outras pesquisas realizadas na rea de fermentao tambm destacam que bactrias do grupo Gram-positivo predominam na fermentao alcolica como microrganismo contaminante. Os gneros Bacillus e Lactobacillus so os de maior ocorrncia (ROSALES, 1989). De acordo com Warren e Heist (2005), as bactrias mais problemticas na indstria do etanol combustvel so as bactrias Gram-positivas produtoras de cido ltico (LAB), dos gneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc e Weissella. O ambiente cido anaerbio de uma reao de fermentao combinado com abundantes acares fermentveis, imita as condies ideais para o crescimento das LAB. Alm disso, o intervalo de temperatura de fermentao tpico o ideal e as LAB so etanol tolerante. Ao contrrio do fermento, que converte os acares em etanol, as LAB convertem acares em cido ltico e/ou cido actico, dependendo da espcie. Os organismos Gram-negativos, incluindo espcies de Acetobacter e Gluconobacter tambm contaminam as reaes de fermentao. Ao contrrio das LAB, este segundo grupo requer condies aerbias e prolifera onde o oxignio est disponvel, por exemplo, durante a propagao do fermento. Em sua pesquisa Warren e Heist (2005) utilizaram bactrias que foram isoladas de fermentaes em indstrias de etanol combustvel. Doze cepas diferentes de bactrias foram coletadas e utilizou-se o seqenciamento gentico para identificar as mesmas. Assim, das doze cepas isoladas, foram identificados sete lactobacilos de quatro espcies diferentes. Foram encontrados tambm Leuconostoc, Weissella, Pediococcus e Acetobacter, e desta forma os autores sugeriram que essas bactrias tambm so muito comuns. Esforos nesta rea podero contribuir significativamente para uma imagem mais clara para o setor e manter uma alta prioridade para a investigao. Outros autores descrevem na literatura que os gneros de microrganismos comumente encontrados em caldos do processo so: Bacillus, Lactobacillus, Acetobacter, Clostridium e Leuconostoc (ALTHERTHUM et al., 1984). Esses gneros podem ser distribudos de acordo com a fase do processo em que se encontram, em funo da temperatura, pH, concentrao de acar e inibidores, o que os levar a se desenvolver com maior ou menor intensidade. O que se observa, entretanto, que independentemente da fase em que se encontram, todos esses

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microrganismos produzem quantidades significativas de cidos orgnicos (butrico, actico, frmico, ltico), como tambm lcool e CO2 (AMORIM e OLIVEIRA 1982). Em um estudo de caracterizao da microbiota bacteriana em amostras de leite de levedura diludo antes e aps o tratamento cido, de mosto de alimentao e de vinho final, GALLO (1989) constatou a predominncia de bactrias Gram-positivas (98,52%), de bastonetes (87,76%) e de no esporulados (73,95%) As LAB, por estarem mais relacionadas com o substrato da cana-de-acar, esto sempre presentes em trabalhos que se propem a isolar microrganismos habitantes dos processos de produo de acar e lcool. Entre elas, o gnero Leuconostoc tem um papel importante como contaminante, principalmente na produo do acar. Essa bactria utiliza o acar do caldo para a produo de goma (ANDRIETTA, 2006). Segundo Purchase (2001, citado por Andrietta, 2006) a presena da goma no processo alm de contribuir para a queda do rendimento provoca problemas na etapa da cristalizao da sacarose. A presena de Leuconostoc mesenteroides promove o aumento da viscosidade o que, alm de dificultar a recuperao da sacarose, aumenta a presena desse acar no melao. Outros microrganismos como Klesbsiella e Acetobacter formam goma sendo tambm citados como habitantes das linhas de caldo (YOKOYA, 1989). Em uma amostragem dos microrganismos presentes nas etapas de fermentao, realizada por Rosales (1989), os gneros que predominaram no processo foram Lactobacillus (45,04%), Leuconostoc (14,41%), Bacillus (9,46%), Acetobacter (7,21%), Enterobacter (6,75%) e Sporolactobacillus (3,60%), entre outros. Inmeros microrganismos infectantes na fermentao alcolica so provenientes da flora e do solo que ficam aderidos a cana-de-acar e so transportados at as destilarias onde se multiplicam. Sendo natural do solo, o gnero Bacillus pode ser transportado para os equipamentos de extrao do caldo pelo solo aderido na prpria matria-prima, a cana-deacar. Quando h condies favorveis, esses microrganismos podem se multiplicar e causar problemas ao processo da usina (YOKOYA, 1989). O caldo de cana apresenta altos teores de nutrientes orgnicos e inorgnicos, altos teores de acar, temperatura e pH favorveis para o desenvolvimento de microrganismos contaminantes (GALLO e CANHOS, 1991). A contaminao pode ser concebida no somente pela cana, mas por focos de contaminao das esteiras, moendas e outros equipamentos. No so todos os microrganismos que so capazes de crescer no caldo de cana, embora seja um meio propcio. A quantidade, e o tipo de microrganismos presentes, vai depender das condies de cada etapa do processo de fermentao. As bactrias lticas, por

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exemplo, so altamente adaptadas a se desenvolverem no caldo misto, que uma mistura de caldos de diferentes estgios da moenda. Em outras ocasies, por exemplo, quando o meio apresentar pH cido, ocorrer uma limitao ao crescimento microbiano, mas poder favorecer o desenvolvimento de bactrias termfilas esporuladas, como Bacillus subtilis, Geobacillus e espcies de Clostridium (BEVAN e BOND, 1971). Conhecer e combater os microrganismos contaminantes do processo de produo de lcool vem sendo uma das principais preocupaes da indstria sucroalcooleira devido aos prejuzos provocados por elas. Alm dos inmeros problemas gerados pelos contaminantes como o comprometimento na viabilidade da clula da levedura por meio de excrees de toxinas no meio, floculao do fermento e formao de gomas, sabe-se tambm que leveduras selvagens podem chegar a dominar o processo caso sejam mais resistentes s condies do processo do que as leveduras inoculadas, reduzindo o rendimento em etanol (BASSO et al., 1996).

1.4 Distrbios Operacionais Decorrentes da Contaminao na Fermentao

Por ser bastante favorvel ao desenvolvimento de microrganismos, os processos para obteno do lcool e acar devem ser cercados de cuidados na assepsia, desde a moagem, para no haver contaminao com microrganismos indesejveis fermentao (ANDRADE, 1997). Os problemas gerados pela contaminao bacteriana nas reaes de fermentao so multifatoriais. Essas bactrias competem diretamente com o fermento de acares fermentveis e convertem os acares em cidos orgnicos em vez de etanol. Se as bactrias alcanarem um nmero crtico, perdas significativas de etanol so inevitveis. Por isso, o controle da contaminao bacteriana uma preocupao sria (WARREN, 2005). Mesmo a contaminao da matria-prima sendo proveniente do campo, existem condies nas etapas do processo de cada usina, que propiciam a seleo de determinadas espcies ou linhagens de microrganismos, os quais podem favorecer o controle dos contaminantes, evitando alguns problemas. As leveduras da fermentao alcolica competem pelo substrato com bactrias que normalmente habitam as dornas (CHERUBIN, 2003).

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A falta de assepsia da sala de fermentao falta de limpeza das dornas e canalizaes, refrigerao insuficiente das dornas de fermentao, dornas abertas e expostas ao ambiente, ausncia de controle da acidez e nutrientes do mosto, variaes nas formas de colheita, qualidade da matria-prima, e condies climticas so alguns dos fatores que contribuem para o aumento significativo da populao de microrganismos (GALLO e CANHOS, 1991). As bactrias provocam prejuzos fermentao e inibem o crescimento de levedura pela produo de cido ltico e de outros cidos orgnicos (AMORIM e OLIVEIRA, 1982). De acordo com um estudo realizado por Amorim et al. (1981), quando a contaminao bacteriana atinge nveis superiores a 1,0 x 107 clulas/mL de mosto, pode ocorrer uma significativa queda no rendimento alcolico. Os autores fizeram uma associao s bactrias contaminantes com perdas a nveis de at 55% do valor terico. Elas ocasionam uma reduo na velocidade da fermentao, podendo gerar certos problemas como aumento de fundo de dorna, entupimento nas tubulaes e dificuldade de operao das centrfugas por causa do entupimento dos bicos (SERRA et al., 1979). A floculao tambm provoca dificuldades no tratamento cido do creme de levedura e reduz tambm a eficincia dos antibiticos e centrfugas normalmente usados (CHERUBIN, 2003). De fato ocorre a reduo no rendimento fermentativo pelas bactrias lticas, quando uma molcula de glicose convertida em duas de cido ltico e resultam em duas molculas de etanol que deixaram de serem produzidas pelas leveduras. Muitos nutrientes tambm deixam de ser aproveitados pela levedura, pois so desviados para a multiplicao bacteriana (CHERUBIN, 2003). Diversos autores verificaram influncia dos cidos actico e ltico na inibio do crescimento e na queda da viabilidade celular de Saccharomyces cerevisiae, quando em cultura mista com bactrias contaminantes da fermentao alcolica (FREDERICK, 1994). Vrios fatores podem levar formao de floculao, dentre eles destacam-se: contato com gomas sintetizadas pelas bactrias, ou pelo contato entre bactrias indutoras da floculao e leveduras, ou ainda devido contaminao por leveduras floculantes (SERRA, 1979). No setor de fermentao e destilao as bactrias lcticas so as principais promotoras de fermentaes indesejveis, especialmente, o gnero Lactobacillus que resistente ao etanol (YOKOYA, 1991). Com o aumento da floculao h um aumento da acidez do vinho (mosto fermentado e centrifugado), causando uma queda significativa no rendimento alcolico e tambm na viabilidade das leveduras (ALTHERTUM, 1984). Apesar dos transtornos gerados pela floculao das leveduras devido a bactrias indutoras da floculao na indstria

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sucroalcooleira, no existem ainda mtodos de controle industrial para caracterizar e monitorar estes agentes (LUDWIG et al., 2001). Segundo Skinner-Nemec et al. (2007), bactrias contaminantes da produo de etanol podem formar biofilmes sob condies de laboratrio. Resultados de seus estudos explicam porque a contaminao persistente e de difcil controle em plantas de produo comercial. Os biofilmes so considerados, geralmente, resistentes limpeza e aos antibiticos e, alm da superfcie imediata do tanque fermentador, existem outros locais para sua formao, incluindo tubulaes e trocadores de calor. Para o controle da infeco bacteriana e de suas conseqncias no processo de obteno de etanol visando uma fermentao sadia, rpida e eficiente, fundamental a busca de solues prticas e viveis para atenuar ou eliminar a floculao do fermento nas destilarias, reduzindo assim o custo do etanol (LUDWIG et al., 2001).

1.5 Principais Mtodos Usados no Controle da Contaminao na Fermentao

Para maximizar o rendimento, a produtividade e a flexibilidade do processo de fermentao, necessrio manter o equilbrio entre as populaes microbianas em meio favorvel s leveduras. Neste sentido, o controle microbiolgico considerado um instrumento de extrema importncia (CASTRO, 1995). Nas indstrias sucroalcooleiras so normalmente empregados antibiticos, e cido sulfrico concentrado, para reduzir a carga microbiana contaminante. H muitos estudos relacionados sensibilidade das bactrias frente a novos agentes antimicrobianos (ALCARDE, 2000). O cido sulfrico um cido forte de frmula H2SO4, possui alto poder corrosivo, sendo de uso sistemtico no processo de fermentao Melle-Boinot, adotado em praticamente todas as unidades produtoras de etanol no Brasil. Embora tenha papel fundamental na acidificao do meio, de modo a tornar o meio desfavorvel s bactrias contaminantes, o cido sulfrico um dos maiores responsveis pela inibio e morte de clulas de S. cerevisiae. A crescente demanda por esse insumo, de ampla utilizao na indstria qumica e de fertilizantes, tem obrigado o setor sucroalcooleiro a se abastecer de produtos de origens

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diversas, no raro obtidos como subprodutos de outros processos, de onde carregam resduos txicos, em especial metais pesados, como por exemplo, chumbo. (VENTURA, 2009). Quando feita a adio de cido sulfrico, as clulas de levedura so lavadas aps a fermentao. Biocidas so por vezes obrigados a ser adicionados ao caldo de cana, tais como carbamatos, compostos quaternrios, fenis halogenados e antibiticos. O alto custo, a necessidade de aplicao peridica e seleo de microrganismos resistentes a antibiticos, so os principais pontos fracos sobre a utilizao destes biocidas. Por esta razo, a contaminao bacteriana, em nmero de 105 UFC/mL um limite aceitvel para as unidades de lcool de funcionamento, no sendo economicamente vivel o ato de reduzir o nvel (ALCARDE et al., 2003). Os antibiticos so microbiocidas especficos, com ao seletiva sobre as principais bactrias contaminantes da fermentao. A maioria dos princpios ativos empregados na indstria do etanol obtida do metabolismo de microrganismos selecionados, sendo que o grau de pureza de cada molcula depende do refinamento do processo seqencial de purificao. Entretanto, no rara a utilizao de produtos proibidos para uso em alimentao animal, ou que contenham coadjuvantes inertes prejudiciais levedura. Recentemente, essa classe de produtos tem sido alvo de monitoramento e regulamentao em levedura seca por parte das autoridades regulatrias dos pases compradores, em funo da deteco de residual de monensina acima do esperado em lotes exportados (VENTURA, 2009). A radiao pode ser uma alternativa de descontaminao do mosto de cana-de-acar. Segundo Alcard et al. (2003) houve uma eficincia na reduo microbiolgica contaminante do mosto de cana-de-acar por radiao gama. A irradiao pode mudar o DNA celular, afetando as funes celulares e induzir a morte das clulas (URBAIN, 1986). Certos tomos possuem a propriedade de emitirem ondas ou partculas de acordo com a instabilidade de seus ncleos, esta propriedade chamada de radioatividade. Alguns elementos, como o rdio e o urnio, so naturalmente radioativos, pois possuem seus ncleos instveis, outros so produzidos artificialmente, como o cobalto 60 e csio 137. Para fins de esterilizao industrial as fontes de raios beta e gama so as utilizadas (CAPELLAZO e QUELHAS, 1997). Outra alternativa para eliminar estes contaminantes a utilizao de um antibitico produzido a partir da extrao de CO2 contido na flor feminina do lpulo. Este produto contm predominantemente a frao -cidos naturais de extrato de lpulos dissolvidos em Propileno Glicol de grau alimentcio, sendo fornecido na forma lquida. De acordo com Wallerstein (representante da Hopsteiner, empresa norte-americana que produz o Extrato de Lpulo Beta cido 45%) que realizou em parceria com a consultoria brasileira Fermentec

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estudos e testes com o produto na fermentao alcolica de usinas do Brasil, o produto chegar ao mercado aps quatro anos de estudos. Estes estudos sero divididos em testes de laboratrio, simulaes industriais e fermentaes reais dentro das usinas. O efeito da aplicao foi analisado em diferentes bactrias com diversas dosagens. Os resultados mostraram que o Beta cido possui propriedades antimicrobianas e so particularmente ativos contra bactrias Gram-positivas. As pesquisas tambm revelaram que a atividade contra bactrias Gram-negativas insignificante. Outra descoberta indica que o produto no produz nenhum efeito malfico na levedura (WALLERSTEIN, 2007).

1.6 Antibiticos Usados no Controle da Contaminao na Fermentao Alcolica

O ritmo de produo das destilarias de etanol e a exigncia de alta produtividade requerem a aplicao de uma srie de insumos de origem qumica, na maioria das vezes. Eles promovem o aceleramento do processo e incrementam o rendimento. Muitos so os produtos usados, entre eles os de contato direto com a levedura na fermentao alcolica: cido sulfrico, suplementos minerais, formulaes anti-espumantes, biocidas e os antibiticos (VENTURA, 2009). Os antibiticos so microbiocidas especficos que possuem ao seletiva sobre as bactrias principais que causam contaminao na fermentao. Os princpios ativos empregados na indstria de etanol, em sua maioria, so obtidos do metabolismo de microrganismos selecionados. H restries quanto ao uso excessivo de antibiticos no tratamento de leveduras secas destinadas a alimentao animal. Todavia, no raro o uso de produtos proibidos para uso de alimentao animal. Como no h uma regulamentao no Brasil para uso dos produtos especficos na fermentao alcolica, isso promove liberdade para uso de produtos no permitidos na Europa. Essa situao aliada falta de boas prticas e procedimentos de fabricao, podem resultar na produo de levedura seca com resduos de antibiticos que no so permitidos e assim causar embargos a lotes especficos de produto exportados pelo Brasil (VENTURA, 2009). O uso contnuo de antibiticos na indstria acaba provocando a seletividade das bactrias, sendo uma de suas srias limitaes. Com isso, as bactrias se tornam cada vez menos sensveis ao dos antibiticos, provocando um desequilbrio natural da microbiota

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contaminante, pois as bactrias Gram-negativas, em geral, no so afetadas (STROPPA, 1998). Segundo Oliveira et al. (1996) os antibiticos Kamoran WP e Penicilina, o primeiro base de monensina, so os mais utilizados, sendo que a concentrao industrialmente utilizada de Kamoran WP na poca dos estudos era de 1 a 3 ppm. Hoje a dosagem de 4 ppm, o que sugere a resistncia dos contaminantes a este agente ao longo dos anos. A monensina considerada mais eficiente na ao contra bactrias Gram-positivas, maiores produtoras de hidrognio, precursor de metano, do que contra as Gram-negativas (MORAIS et al 2006). O Kamoran WP um antibitico que age seletivamente como bactericida e bacteriosttico. Ele produzido atravs da fermentao da bactria Streptomyces cinnamonensis. Tem como princpio ativo a molcula Monensina Sdica Cristalina, que atua no controle de bactrias Gram-positivas. De acordo com Qumica Real (2009), essa molcula desorganiza o transporte de ctions na membrana das bactrias Gram-positivas, interferindo na absoro de soluto pela clula e promovendo maior gasto energtico para a manuteno do balano osmtico. Como essas bactrias dependem da fosforilao do substrato para formao de ATP, tendem a se romper e desaparecer. As bactrias presentes nas dornas de fermentao expelem prtons ativamente (via ATPase) atravs da membrana celular, e mantm o interior mais alcalino. As bactrias mantm, internamente, concentraes de K+ muito altas, maiores que no meio externo. Algumas bactrias mantm a concentrao de K+ interna cerca de 70 vezes maior que a externa. As concentraes internas altas de K+ so necessrias no s para a sntese de protena, como tambm o gradiente de K+ que se forma importante para tamponar o pH intracelular por meio do mecanismo de troca de K+/ H+. necessrio que o excesso de prtons H+ seja expulso da bactria para que o pH interno se estabilize. Esse gradiente de pH (delta pH) cria um gradiente qumico de prtons; como o interior da membrana mais negativo que o exterior, criado tambm um potencial eltrico (Dy). Delta pH e Dy so responsveis pela formao da fora motriz de prtons, que pode ser utilizada para importar solutos para dentro da membrana (QUIMICA REAL, 2009). No caso da penicilina, ocorre uma inibio da biossntese de constituintes essenciais da membrana, interferindo no transporte ativo da mesma (EGUCHI, 1989). Os antibiticos beta-lactmicos (penicilinas e cefalospirinas) interferem na sntese da parede celular bacteriana, atravs de sua ligao com a protena PBP. A penicilina acopla em um receptor presente na membrana interna bacteriana PBP ( Penicillin Binding Protein) inibindo a enzima envolvida na transpeptidao, responsvel pela ligao entre as cadeias de tetrapeptdeos do

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peptideoglicano. Com isso, h o impedimento da formao das ligaes entre tetrapeptdeos de cadeias adjacentes de peptidioglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede celular. Como o interior desta hiperosmtico, sem a existncia de uma parede rgida h o afluxo de gua do exterior e a bactria lisa. Um outro sistema de ao da penicilina a inativao de enzimas autolticas na parede celular, resultando na degradao da parede. A resistncia pelas bactrias penicilina baseia-se na produo de penicilinases, que so enzimas que degradam a penicilina e impedem sua ao. H dois tipos de penicilina, a penicilina V e G, sendo a penicilina V a mais utilizada pois ela absorvida muito mais rpido pelo organismo e no provoca efeitos secundrios (WIKIPDIA, 2010). Sendo um antibitico de largo espectro, a oxitetraciclina atua contra bactrias Gramnegativas e Gram-positivas. Ela vem sendo usada por um longo perodo na avicultura no combate s doenas dos tratos respiratrio e digestivo. Como todo antibitico do grupo das tetraciclinas, pode controlar cepas resistentes com um simples ajuste de dosagem, o que no acontece com os outros antibiticos comumente utilizados. Tem ao comprovada contra Clostridium spp.. O cido ctrico, quando utilizado, tem a funo de potencializar a ao do produto, por meio da diminuio da formao de quelatos da oxitetraciclina com o clcio e o magnsio presentes na dieta dos animais, melhorando sua absoro e atingindo nveis sangneos mais elevados (DES-FAR LABORATRIOS LTDA, 2004). A virginiamicina um antibitico que vem sendo usado na produo animal desde a dcada de 50. Ela tem ao quase que exclusivamente sobre bactrias Gram-positivas (IAFIGLIOLA, 2000). Estreptograminas formam um grupo relativamente pequeno e homogneo, e englobam compostos muito relacionados como pristinamicina, virginiamicina, micamicina e vernamicina. Estes compostos atuam por meio de ligao com os ribossomos, inibindo a sntese de protena (NICODEMO, 2001). A clindamicina um antibacteriano do grupo das lincosamidas, derivado da lincomicina e produzido por uma cepa de Streptomyces lincolnensis. Sua atividade sistmica dada pela inibio da sntese protica do microrganismo suscetvel, atravs da ligao subunidade 50S ribossmica bacteriana, impedindo a formao da ligao peptdica. Geralmente a clindomicina considerada bacteriosttica, no entanto pode ser bactericida em altas concentraes, ou contra organismos altamente suscetveis (PHARMACOTCNICA, 2006).

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2. METODOLOGIA

2.1 Materiais Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Microbiologia da Faculdade de Tecnologia de Araatuba Prof. Fernando Amaral de Almeida Prado.

2.1.1 Microrganismos contaminantes Os microrganismos utilizados como contaminantes foram isolados a partir de amostra de mosto contaminado, retirado da dorna de fermentao, gentilmente cedido pela usina Alcoazul S/A . Foram utilizados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo, a serem identificados posteriormente.

2.1.2 Antibiticos utilizados O Quadro 1 a seguir, de autoria prpria, mostra a relao dos antibiticos utilizados nos experimentos. As amostras dos agentes inibidores foram gentilmente cedidas por um dos fabricantes e tambm pela usina Alcoazul S/A.

Tabela 1 - Fabricante e princpio ativo dos agentes inibidores utilizados. FABRICANTE PRINCPIO ATIVO Buckman Phibro Qumica Real Buckman Buckman Reibrand Comercial Reibrand Comercial Buckman oxitetraciclina virginiamicina A monensina A monensina B monensina C penicilina clindamicina HCL + tetraciclina virginiamicina B

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2.2 Mtodos

2.2.1 Isolamento dos Microrganismos contaminantes O mosto retirado da dorna de fermentao foi diludo decimalmente com gua peptonada estril a 0,1%, e a partir destas diluies foram feitos plaqueamentos em meios de cultivo gar Sabouraud e Agar Padro para Contagem de Placas, pelos mtodos de Semeadura em Superfcie e Pour Plate, respectivamente. As placas de Petri foram incubadas em estufa bacteriolgica a 35C por 24-48 horas, at crescimento das colnias. Decorrido o perodo de incubao, foi realizada a contagem dos microrganismos e isolamento de colnias selecionadas para identificao pelo mtodo de colorao de Gram. Os microrganismos selecionados foram repicados em tubo de ensaio contendo gar nutriente, e mantidos em refrigerao para posterior utilizao.

2.2.2 Ativao dos Microrganismos contaminantes Inculos do coco e do bacilo foram preparados com 24 horas de antecedncia. Para o coco Gram positivo foi passada uma alada da cultura estoque em gar nutriente para 5 mL de gua peptonada 1%. Para o bacilo Gram positivo, foi passada uma alada da cultura estoque em gar nutriente para 5 mL de leite desnatado a 10%, previamente esterilizados em autoclave sob vapor fervente. Ambos foram incubados a 35 1C por 24 horas, para posterior utilizao nos ensaios de inibio.

2.2.3 Ensaios de inibio Decorrido o perodo de incubao, 1mL da diluio 10-3 do inculo do coco Grampositivo em gua peptonada 1% ou 1 mL do inculo em leite estril do bacilo Gram positivo, foi transferido para tubo de ensaio contendo 12 mL de gar de Contagem de Placas (ACP) fundido, previamente esterilizado. Imediatamente o gar foi vertido para as placas de Petri descartveis e deixado sobre a bancada para solidificao. Aps a solidificao e com auxlio de ala de platina previamente flambada, foram perfurados 2 poos de cerca de 5 milmetros de dimetro cada, para posterior adio dos antibiticos.

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Os antibiticos utilizados foram preparados seguindo as instrues dos fabricantes, e foram utilizados tambm nas concentraes recomendadas pelos fabricantes: 5ppm. Os antibiticos foram adicionados na quantidade de 25L (micro litro) em cada pocinho. As placas foram deixadas em estufa a 32-34C por 2 horas, com a tampa para cima, para que os antibiticos pudessem penetrar e serem absorvidos pelo gar. Posteriormente, elas foram invertidas para finalizar o tempo de incubao, para crescimento dos microrganismos teste (bacilo e coco) e atuao dos antibiticos. Transcorrido o perodo de incubao, a eficincia das substncias testadas foi avaliada, por meio da inibio do crescimento dos microrganismos, verificada pela formao de halos de inibio do crescimento em volta do poo onde o antibitico foi adicionado. Os halos de inibio foram medidos em mm com auxlio de uma rgua, considerando um dimetro de cerca de 5 milmetros do poo perfurado no gar.

2.2.4 Anlise Estatstica Utilizou-se um delineamento inteiramente ao acaso e teste de Tukey (Programa InStat) para p < 0,05. Comparou-se as mdias dos resultados dos halos de inibio dos microrganismos contaminantes, pelos antibiticos comerciais testados, separadamente para o coco Gram positivo e para o bacilo Gram positivo.

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3. RESULTADOS

3.1 Microrganismos contaminantes Foram isolados um coco Gram-positivo e um bacilo Gram-positivo, a serem identificados posteriormente.

3.2 Atividade inibidora dos antibiticos testados A Tabela 1 a seguir, apresenta os resultados dos testes de inibio do coco Grampositivo pelos antibiticos testados. Os demais antibiticos avaliados que no se encontram listados, no demonstraram nenhum halo de inibio.

Tabela 2 - Inibio (halo em mm) do coco Gram-positivo contaminante, por diferentes antibiticos usados comercialmente. Antibitico Penicilina Clindamicina HLC+tetraciclina Oxitetraciclina Virginiamicina B Inibio* 15,75 20,50 15,00 11,00** Desvio Padro 3,77 3,10 0 0

* Mdia (n=4) do dimetro do halo de inibio; P < 0,05. Dimetro inicial do poo (orifcio) no gar = 5 mm. ** Mdia (n=2) do dimetro do halo de inibio; P < 0,05. Dimetro inicial do poo (orifcio) no gar = 5 mm.

O princpio ativo clindamicina HLC+tetraciclina apresentou o maior halo de inibio (25 mm) em uma das repeties e tambm a maior mdia (20,5 mm) quando comparada com as obtidas pelos outros antibiticos. Mesmo assim a anlise estatstica de todos os dados demonstrou que no houve diferena significativa (p<0,05) na comparao entre a maioria dos antibiticos testados quanto inibio do coco contaminante. Porm, quando se comparou a mdia dos resultados do antibitico clindamicina HCL+tetraciclina (20,5 mm) com a mdia dos resultados do antibitico virginiamicina B (11 mm), foi verificada uma

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diferena

significativa,

demonstrando

maior

efeito

inibitrio

da

clindamicina

HLC+tetraciclina, porm considerando p<0,01. A partir destes resultados possvel concluir que o antibitico clindamicina HLC+tetraciclina no foi o melhor entre os demais antibiticos utilizados, mas foi melhor que o antibitico virginiamicina B. As figuras 1 a 3 apresentam a visualizao dos halos de inibio verificados aps incubao do coco Gram-positivo contaminante em ACP (gar de contagem de placas) e adio dos antibiticos oxitetraciclina, clindamicina HCL + tetraciclina e penicilina.

Oxitetraciclina

Sem inibio

Figura 1 - Atividade inibidora da oxitetraciclina sobre o coco Gram-positivo

36

Sem inibio

Clinda + Tetra

Figura 2 - Atividade inibidora da clindamicina HCL + tetraciclina sobre o coco Gram-positivo

Sem inibio

Figura 3 - Atividade inibidora da Penicilina sobre o coco Gram-positivo .

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Em uma anlise dos desvios padres calculados possvel perceber que os antibiticos oxitetraciclina e virginiamicina B apresentaram uma maior repetibilidade dos resultados, quando comparados com a clindamicina HLC+tetraciclina e com a penicilina, sendo que este ltimo apresentou o maior valor do desvio padro (3,775 mm). Porm, importante frisar que a virginiamicina B somente apresentou inibio da bactria em duas das quatro repeties realizadas. O grfico 1 a seguir, permite visualizar melhor os resultados obtidos.

Figura 1. Visualizao dos valores das mdias e do desvio padro dos halos de inibio(mm) descritos na Tabela 1 para o coco Gram-positivo.

A Tabela 3 a seguir, mostra os resultados dos testes de inibio do bacilo Gram-positivo pelos antibiticos testados. Os demais antibiticos avaliados que no se encontram listados, no demonstraram nenhum halo de inibio. Tabela 3. Inibio (halo em mm) do bacilo Gram-positivo contaminante, por diferentes antibiticos usados comercialmente. Antibitico Penicilina Clindamicina HCL+tetraciclina Oxitetraciclina Inibio* 14,50 12,75 14,00 Desvio Padro 2,51 2,87 4,16

* Mdia (n=4) do dimetro do halo de inibio; P < 0,05. Dimetro inicial do poo (orifcio) no gar = 5 mm.

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Ficou demonstrado atravs da anlise estatstica que mesmo a penicilina apresentando o maior valor mdio de inibio (14,5 mm) ou a oxitetraciclina apresentando o maior valor isolado (19 mm), no houve diferena significativa (p<0,05) na comparao entre os resultados de inibio dos 3 (trs) antibiticos avaliados. A figura 4 a seguir, apresenta a visualizao do halo de inibio verificado aps incubao do bacilo Gram-positivo contaminante em ACP (gar de contagem de placas) e adio do antibitico penicilina.

Sem inibio

Figura 4. Atividade inibidora da Penicilina sobre o bacilo Gram-positivo

A penicilina tambm foi o antibitico avaliado onde se verificou maior repetibilidade dos resultados, com um desvio padro de 2,517 mm, seguido pela clindamicina HCL+tetraciclina (2,872 mm) e pela oxitetraciclina (4,163 mm). O grfico 2 a seguir, permite visualizar melhor os resultados obtidos.

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Figura 2. Visualizao dos valores das mdias e do desvio padro dos halos de inibio(mm) descritos na Tabela 2 para o bacilo Gram-positivo.

Os antibiticos monensina A e monensina C apresentaram resultados isolados de inibio do bacilo Gram positivo (7 mm e 13 mm, respectivamente), ou seja, somente em uma das quatro repeties, e por isso estes resultados no foram analisados em conjunto com os demais.

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4. DISCUSSO

Mesmo no sendo estatisticamente significativos, os resultados obtidos a partir do uso dos antibiticos clindamicina HCL+tetraciclina e penicilina demonstraram os maiores valores mdios de inibio para o coco e para o bacilo, respectivamente. Segundo Aquarone et al. (1968) o emprego de penicilina como desinfetante em processo Melle Boinot resultou num maior rendimento em lcool, vinho de menor acidez e ainda um menor tempo de fermentao. O autor destaca o baixo custo e a produo local de penicilina como vantagens. Resultados bastante prximos aos encontrados neste estudo. Em sua pesquisa, Rodini (1989) verificou a ao de penicilina e pentaclorofenol sobre bactrias dos gneros Acinetobacter, Bacillus, Micrococcus, Pediococcus e Leuconostoc. Acinetobacter cresceu com concentraes de at 400ppm de penicilina e 100ppm de pentaclorofenol. As bactrias dos 3 ltimos gneros testados mostraram-se resistentes a 400ppm de penicilina e foram eliminadas a 40ppm de pentaclorofenol. Estes valores so muito maiores dos que os utilizados neste estudo, mostrando uma maior eficincia em nossos ensaios de inibio. De acordo com Mota (2008), as paredes de bactrias Gram-negativas e Gram-positivas apresentam diferenas marcantes. Bactrias Gram-negativas possuem uma parede composta de fina camada de peptidioglicana e uma membrana externa que diferem na sua composio qumica e, conseqentemente mais complexa que a parede das Gram-positivas que, apesar de mais espessa, apresenta predominantemente um nico tipo de macromolcula. Esta a razo pela qual as bactrias Gram-positivas so mais sensveis penicilina do que as bactrias Gram-negativas, que so mais susceptveis ao rompimento mecnico, pelo fato deste antibitico impedir a formao do peptidioglicano. Em outro estudo realizado por Stroppa (1998) na utilizao de Biopen, antibitico a base de penicilina V potssica, comparando sua ao com a do antibitico Kamoran que tem como princpio ativo a monensina, mostrou que o Biopen reduziu a populao das bactrias estudadas em um menor perodo de tempo. Por outro lado, o produto Kamoran foi mais eficiente ao final de quarenta e oito horas. Diferentemente dos resultados do pesquisador citado, em nossos estudos, o produto Kamoran no demonstrou nenhuma inibio dos microrganismos contaminantes. Segundo a empresa que fabrica o antibitico base de clindamicina HCL+tetraciclina, este princpio ativo indicado para o controle das principais bactrias do gnero Gram (+) e

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Gram (-), contaminantes dos processos de fermentaes alcolicas, sendo elas: Bacillus subtilis, B. brevis, B. megaterium, B. coagulans, B. cereus; Lactobacillus plantarum, L. fermentum, L. buchneri, l. coryniformis, L. vaccimostercus, L. confusus, L. fructosus, L. yamanashiensis, L. acidophilus; Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum, L. acidilactici; Escherichia coli; Salmonella; Enterobacter; Xanthomonas; Aerobacter; Clostridium; Streptococcus faecalis, S. mutants; Klebsiella; Candida; Pseudomonas e Streptomyces. Em sua pesquisa, Oliva-Neto e Yokoya (2001) analisaram o efeito antimicrobiano de vrios produtos, incluindo formulaes comerciais usualmente utilizadas em usinas de acar e lcool, por meio do Teste da Concentrao Mnima Inibitria (CMI), usando contaminantes naturais como Lactobacillus fermentum e Leuconostoc mesenteroides. De acordo com os autores, a penicilina V cida e a clindamicina foram os mais efetivos contra o crescimento bacteriano em vinte e quatro horas, demonstrando resultados que poderiam ser comparados aos de nosso presente trabalho, a partir da identificao do bacilo e do coco Gram positivos testados. Sabendo-se que os gneros de bactrias mais freqentemente encontrados na contaminao do processo fermentativo so as LAB Gram-positivas, como Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, e outras como Bacillus, faz-se necessria a identificao dos microrganismos isolados a fim de comprovar a eficincia e utilidade dos antibiticos testados. Os resultados encontrados no presente estudo tambm demonstraram a importncia de se avaliar o efeito de diferentes substncias na inibio dos microrganismos contaminantes, para evitar o uso indevido dos antibiticos, pois tal prtica pode levar ao surgimento da resistncia bacteriana e ineficincia quanto ao efeito desejado. vlido ressaltar que o controle da contaminao bacteriana nos processos fermentativos necessita de muito mais do que mtodos corretivos. Uma limpeza rigorosa, seguida de uma devida sanitizao, podem ser institudas e contriburem no controle destes microrganismos. A reviso das principais fontes de contaminao bacteriana poderia auxiliar da mesma forma na preveno e economia com gastos futuros desnecessrios.

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CONSIDERAES FINAIS

Houve diferenas quanto inibio das bactrias contaminantes testadas, com relao a cada antibitico testado, mas elas no foram estatisticamente significativas. A repetio de valores aproximados por alguns dos antibiticos demonstrou que a ao destes seguiu um mesmo patamar e no foi to alterado, demonstrando que alguns dos antibiticos no apresentaram nenhum efeito nos microrganismos isolados. Os antibiticos foram coletados de uma usina sucroalcooleira que estava passando por problemas reais de contaminao bacteriana. O fato que devido a resistncia bacteriana, h trocas aleatrias de antibiticos no local. O caldo de cana-de-acar fermentado foi coletado da mesma usina sucroalcooleira no dia em que a contaminao bacteriana ocorreu. Sabe-se que as bactrias mais problemticas na indstria do etanol combustvel so as Gram-positivas bactrias do cido ltico (LAB) da Lactobacillus gneros Pediococcus, Leuconostoc e Weissella. Isso demonstra que os microrganismos isolados podem ser os causadores da contaminao no processo de fermentao alcolica. Atualmente, a forma mais fcil e mais custo-efetiva para controlar a contaminao bacteriana atravs do uso de antibiticos. O uso indevido desses produtos est relacionado a uma das causas da resistncia bacteriana e conseqentemente gera altos custos ao estabelecimento. A utilizao de antibiticos nas dosagens recomendadas podem maximizar o controle dos microrganismos no desejveis, possibilitando a conduo eficaz do processo ferementativo dentro dos parmetros que visam a otimizao do rendimento industrial da destilaria. O controle da contaminao bacteriana nos processos fermentativos necessita de muito mais do que mtodos corretivos para no se tornar um problema fora de controle. Uma limpeza rigorosa e saneamento podem ser institudos e contriburem no controle da contaminao. Fazer uma reviso das principais fontes de contaminao bacteriana tambm pode auxiliar atravs da preveno e posteriormente uma economia em gastos futuros desnecessrios.

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