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Separacin y purificacin de enzimas INTRODUCCIN

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, protenas inertes, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificacin. EXTRACCION DE ENZIMAS Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las clulas, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificacin. Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecnicos, en muchos complejos enzimticos estn involucradas fuerzas especficas; de la naturaleza de las mismas depende el mtodo a emplear.
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En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenizado, que implica lisis celular y transferencia de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por: a) Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0.25 M, NaCl 0,9%, KCl 0.15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar el pH. b) Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos). c) Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.

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d) Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc. e) Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro. PURIFICACION Los mtodos a elegir dependen de la fuente biolgica y de la concentracin de la enzima, y se basan en las distintas propiedades fisicoqumicas de las protenas. El primer paso consiste en la separacin de los distintos componentes intracelulares, generalmente por centrifugacin. Las partculas que difieren en densidad o tamao sedimentan a distintas velocidades por aplicacin de una fuerza centrfuga (campo gravitacional, g). Una centrifugacin diferencial permite la separacin del homogenizado en varias fracciones. Un esquema tipo es el siguiente:

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Cada una de las fracciones precipitadas puede tratarse con agentes qumicos para solubilizar las enzimas. A partir de aqu inicia la purificacin.
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Los procesos de purificacin utilizan las tcnicas clsicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase lquida (electroforesis o filtracin en geles) o en la transicin de sustancias de una fase a otra (cromatografa o precipitacin). La eleccin de un determinado procedimiento es un problema de prueba y error: es necesario probar procedimientos y seleccionar. En general, la repeticin de un paso es ventajoso, ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos, aunque a veces provoca grandes prdidas de actividad total. Una vez llevado a cabo un paso satisfactorio, la cantidad de material resultante debe ser manejable antes de pasar al paso posterior. Aparentemente los mtodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina experimentalmente. Existen sin embargo ciertas restricciones que hacen que haya un orden lgico. Por ejemplo, el calentamiento tiene por objeto eliminar grandes cantidades de protenas inespecficas y no requiere el agregado de grandes volmenes de lquido; es lgico, por lo tanto, que se haga al principio. En muchos casos no es practicable por la inestabilidad de la enzima o por la presencia de enzimas proteolticas que la daaran mucho al elevar la temperatura, o bien porque no aumenta el grado de purificacin.
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ANLISIS DE LOS DATOS Para juzgar si un mtodo de purificacin es adecuado, deben calcularse la recuperacin y el grado de purificacin alcanzados. Considerando las unidades enzimticas totales de la etapa inicial como el 100% puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales. Para calcular el grado de purificacin, debe obtenerse primero el valor de actividad especfica alcanzado en cada paso. Si se considera la actividad especfica inicial como unidad de purificacin, el grado de purificacin de cada etapa se calcula haciendo el cociente entre la actividad especfica de dicha etapa y la del primer paso.

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OBJETIVOS a) b) Extraer la enzima del caldo de cultivo y concentrar la enzima Determinar cantidad de enzima por determinacin de protena

Cuestionario prelaboratorio 1. Cules son los mtodos tradicionales de produccin de enzimas? 2. Determine los mtodos de purificacin fsicos 3. Determine los mtodos de purificacin qumicos 4. Qu es y cmo se determina el rendimiento?

Materiales. Centrifuga Matraz Earlenmeyer de 250 mL (por equipo) Tubos eppendorf Potencimetro (por grupo) Vaso de precipitado de 250 mL (por equipo) Espectrofotmetro Celdas de UV-Vis Micropipetas de 2-20 y 100-1000 L Gradillas para tubos eppendorf Sulfato de Amonio Buffer fosfato
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Reactivo Bradford Buffer de pH = 7 y pH = 4 Procedimiento 1. El cultivo obtenido de la prctica anterior se coloca en tubos falcon nivelados, los cuales son colocados en la centrifuga por 7 minutos a la velocidad mxima del equipo. 2. Despus de este tiempo se separa el sobrenadante, el cual es colocado nuevamente en tubos falcon y se le agrega una solucin de sulfato de amonio saturado, hasta obtener precipitacin y se centrifuga por 7 min a la velocidad mxima del equipo.

3. Para preparar buffer de fosfato, se procede de la siguiente manera. Solucin A (NaH2PO4 0.2 M): disolver 27.6 g de NaH2PO4 . H2O en agua destilada, completando un litro. Solucin B (Na2HPO4 0.2 M): 53.65 g de Na2HPO4*7 H2O se disuelven en agua destilada, llevando el volumen final a 1 litro. Preparar solo la cantidad necesaria.
Solucin A (ml) 342.5 225 195 115 80 Solucin B (ml) Agua destilada (ml) 500 500 500 500 500 pH

157.5 275 305 385 420

6.5 6.9 7 7.3 7.5

4. El precipitado obtenido se dispersa en una solucin de tampn de fosfatos (pH = 7) 0.5 mL.
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Determinar protena por el mtodo se Bradford a la solucin de enzima. (Hacer diluciones si es necesario). Tomar 0.25 mL de muestra (esta cantidad depender de lo obtenido en la separacin de la enzima), adicionar 0.75 mL de solucin de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva estndar obtenida previamente. Reporte los resultados de concentracin de enzima en el medio de cultivo, y % de recuperacin. Cuestionario Postlaboratorio 1. Menciona tres mtodos de precipitacin de enzimas 2. Cules son las condiciones de centrifugacin que se emplean industrialmente (T y rpm)? 3. Cules son los mtodos para lisis para liberar enzimas intracelulares? 4. Investigue por lo menos un mtodo cromatogrfico para separar enzimas 5. Investigue el uso de membranas en la purificacin de enzimas Referencias: Dubois, T., Jacquet, A., Scheneck, A. G. and Looze, Y. (1988). The thiol proteinases from the latex of Carica papaya L. I. Fractionation Purification and Preliminary Characterization. Biological Chem Hoppe-Seyler. 369: 733-740. Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, Jeremy Berg, John Tymoczko. (2008). Bioquimica. Editorial Revert. 217-225. Segel H. Irwin. (1976). Biochemical Calculations How to solve mathematical problems in general biochemistry. John Wiley & Sons, Second Edition.

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