InmunohematobasicaII (2011)

Escuela de Tcnicos en Hemoterapia e Inmunohematologa UBA Hospital de Clnicas Procedimientos serolgicos seleccionados. Uso de agentes reductores.
Sustancias solubles de grupos sanguneos. Adsorcin. Elucin: diferentes tcnicas. Titulacin. Disociacin de IgG por cloroquina. Micromtodos. Automatizacin. Uso de anticuerpos monoclonales.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Empleo de reactivos sulfhidrilo

Ditiotreitol (DTT) 2-Mercaptoetanol (2-ME) 2-Aminoetilisotiouronio (AET) Mecanismo de accin
Clivan los puentes disulfuro que unen las subunidades monomricas de los pentmeros de IgM (19S en 7S) Los puentes intercatenarios de las IgG monomricas son bastante resistentes al clivaje
Reactivos sulfhidrilo Usos
Determinacin de la clase de inmunoglobulina de los Acs Identificacin de las especificidades en mezclas de Acs, IgM e IgG (desenmascarar) Determinacin del monto relativo de IgG e IgM en una especificidad dada Disociacin de aglutinatos eritrocitarios por IgM (crioglobulinas)
Reactivos sulfhidrilo Usos
Destruccin de antgenos eritrocitarios seleccionados para investigacin de Acs
(Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)
Combinacin con enzimas proteolticas, para disociar los Acs IgG de GR (ZZAP)

DTT + Papana activada con cistena La cistena forma puentes disulfuro que contribuyen al plegamiento de las protenas
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Empleo de reactivos sulfhidrilo para distinguir los anticuerpos IgM e IgG

Principios El tratamiento de los Acs IgM, anula las actividades aglutinante y fijadora de complemento La visualizacin de la actividad de los Acs antes y despus del tratamiento con sulfhidrilos es til para determinar la clase de inmunoglobulina El tratamiento con sulfhidrilos tambin se emplea para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y permitir la deteccin de IgG coexistentes
Ditiotreitol (DTT) 0,01 M

Preparacin
2 a 6 C
Conservacin
Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3
Los reactivos sulfhidrilos en baja concentracin debilitaran los Ag del sistema Kell Pudiera observarse gelificacin de la muestra
Causas Preparacin incorrecta del DTT o concentracin superior a 0,01 M. Incubacin de suero y DTT prolongada
Dr. Silvio Rosell
Las muestras gelificadas no pueden estudiarse

24/10/2011
Pruebas de inhibicin de la hemaglutinacin
Algunos antgenos de grupo sanguneo estn presentes en formas solubles en saliva, orina y plasma Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la reactividad de los anticuerpos correspondientes La inhibicin tambin permite neutralizar anticuerpos que enmascaran la presencia de otros no neutralizables
Adsorcin
Para los procedimientos de adsorcin no existe un procedimiento nico ideal Para incrementar la captacin de anticuerpos puede aumentarse la proporcin de antgenos utilizando un volumen celular mayor La temperatura de incubacin debe ser la de reactividad ptima de los anticuerpos
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Adsorcin
Las pruebas de adsorcin requieren un volumen importante de GR Los eritrocitos testigos de los paneles comerciales resultan insuficientes
las fuentes mas convenientes pueden ser unidades donadas o muestras de sangre del personal de los fenotipos deseados
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Elucin
Las tcnicas de elucin liberan las molculas de Acs de los GR sensibilizados Los Acs fijados pueden liberarse:
por modificacin de la termodinmica de las reacciones Ag-Ac neutralizacin o reversin de las fuerzas de atraccin que mantienen unidos a los complejos alteracin de la concordancia estructural entre los Ag y los puntos de fijacin en las molculas de Acs
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Elucin Usos
Las tcnicas de elucin pueden servir para:
Investigar una PAD positiva Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresin dbil e identificar especificidades mltiples (junto a adsorcin) Preparar GR sin Acs para fenotipificacin o estudios de adsorcin autlogos.
Elucin
Si el eluato reacciona con todas las clulas

Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos
Si el paciente no fue transfundido en fecha reciente y no existen Acs sricos inesperados no se requieren estudios serolgicos adicionales
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Tcnicas para elucin de anticuerpos

Calor (56C) Calor suave (45C) Congelacin-descongelacin Fro-cido Digitonina-cido Diclorometano (DCM) Glicina-HCl / EDTA CLOROFORMO XILENO ETER
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Calor (56C)
Ventajas
Desventajas
Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO Rpido y fcil
Recuperacin escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguneo
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Congelacin-descongelacin
Ventajas Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO Rpido y fcil Requiere un volumen celular reducido
Desventajas Recuperacin escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguneo
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Fro-cido
Ventajas Rpido y fcil Sensibilidad comparable a digitonina-cido Desventajas Menos sensible para auto y aloanticuerpos reactivos en caliente
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Digitonina-cido

Ventajas No peligroso Recuperacin adecuada de la mayora de los Acs significativos Kit comercial
Desventajas El lavado del estroma es lento Baja sensibilidad sistema Kidd
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Diclorometano (DCM)
Ventajas Adecuado para anti-K No inflamable Desventajas Txico Recuperacin escasa de anti-Fyb
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Glicina-HCl / EDTA
Ventajas Desventajas Apropiado para preparar Desnaturaliza los eluatos y obtener Ag del sistema clulas PAD negativas Kell No destruye las clulas tratadas Sensibilidad comparable a digitonina-cido
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
CLOROFORMO
Ventajas Mtodo de accin rpida Lquido no inflamable Recuperacin de la mayora de los anticuerpos significativos
Desventajas Sustancia reconocida como carcinognica Altamente txico Efecto narctico inhalatorio
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
XILENO
Ventajas Buena recuperacin de la mayora de los Acs significativos
Desventajas Carcinognico Txico Narctico Provoca hemlisis
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
ETER
Ventajas Excelente recuperacin de la mayora de los Acs de grupo sanguneos
Desventajas Narctico Txico Explosivo Muy inflamable Poca recuperacin de anti-S-s
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Titulacin
Principios Es un mtodo semicuantitativo que se emplea para determinar la concentracin de Acs en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresin antignica en distintas muestras de GR
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Titulacin
Aplicaciones Estimar actividad de Acs en embarazadas alosensibilizadas Definir la especificidad relativa de los autoanticuerpos Caracterizar Acs de ttulo alto baja avidez (TABA)
Ejemplo
Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre el comportamiento de los Acs (IgG o IgM) Monitoreo de IgG en embarazadas
Dr. Silvio Rosell
Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH
24/10/2011
Titulacin
Interpretacin Observar la mayor dilucin que produce aglutinacin 1+ El ttulo es la inversa de la dilucin Si se advierte aglutinacin en el tubo que contiene el suero mas diluido no se alcanz el punto final En los estudios comparativos la diferencia significativa en los ttulos es de 3 diluciones Los ttulos solos sin la evaluacin adicional de la intensidad de la aglutinacin pueden ser engaosos
Titulacin
Score
Asignar un valor numrico a la intensidad de la aglutinacin La suma correspondiente a todos los tubos representa el score El umbral significativo arbitrario para comparar los puntajes es de 10 ms
Por ser un mtodo semicuantitavo la variabilidad tcnica puede desviar los resultados
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Titulacin
Claves Tcnicas

Calidad de las pipetas y su utilizacin Respetar tiempo y temperatura de incubacin Duracin y potencia de centrifugacin La antigedad, el fenotipo y la concentracin de las clulas influyen en los resultados
Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad

Las comparaciones son vlidas con anlisis simultneos
Se disminuye la variabilidad con la utilizacin de mayores volmenes

Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Disociacin de la IgG de los GR con PAD positiva
Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse con reactivos que requieran una tcnica de AGH En condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de la membrana de los GR sin afectar su integridad. Esto permite la fenotipificacin completa de los GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos en caliente
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Cloroquina Reactivos Necesarios
Solucin de difosfato de cloroquina

preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N

2 a 6 C
Conservacin
Se necesitan GR de control portadores de una dosis simple de los antgenos a fenotipificar Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecfico
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Cloroquina
No disocia el complemento de la membrana celular Incubacin no > de 2 hs.
Limitaciones tcnicas
causa hemlisis y/o prdida de reactividad antignica
Los Ag del sistema Rh podran experimentar cierta desnaturalizacin. Pudieran no eliminarse por completo los Acs de los GR sensibilizados
slo atenuar la intensidad de la PAD
La cloroquina atena la expresin de Ag HLA de Clase I eritrocitarios

Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Micromtodos, Microplacas
Utilizan antgenos o anticuerpos inmovilizados. Existen mtodos manuales, semiautomatizados y automatizados En la prueba indirecta si las clulas indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reaccin es positiva Si sedimentan no se produjo reaccin Ag-Ac
Anticuerpos monoclonales
Una clula B estimulada da origen a una progenie clonal que produce Acs especficos para un eptopo El sobrenadante del cultivo de un clon de clulas B contiene Acs de especificidad nica.
Los eventos posteriores a la activacin pueden inducir diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas la especificidad idiotpica codificada en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas no se modifica.
Hibridomas La fusin de clulas plasmticas normales, productoras de anticuerpos, con clulas plasmticas neoplsicas permite obtener lneas celulares con capacidad reproductiva infinita.
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales Aplicaciones
Los Acs que reaccionan en forma especfica e intensa con un solo eptopo, que forma parte de Ag multivalentes, pudieran no reconocer al Ag ante la falta de esa configuracin particular
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales Aplicaciones
Los reactivos usados en los bancos de sangre son mezclas de distintos productos monoclonales que permiten incrementar las variantes fenotpicas que el antisuero puede reconocer
Solos o mezclados suelen reaccionar con mayor intensidad con los Ag de expresin dbil que los sueros inmunes
Para individualizar y caracterizar sistemas antignicos complejos se utilizan bateras de diferentes especificidades monoclonales
Las especificidades antiglobulnicas monoclonales se emplean para reconocer distintas clases de inmunoglobulinas o fracciones del complemento sobre la membrana eritrocitaria Las mezclas de varios reactivos monoclonales se utilizan para elaborar los reactivos poliespecficos
Hacemos un breve intervalo
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Procedimientos Inmunohematolgicos en paciente con autocontrol o PAD positiva
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Verificar Hemlisis
Macroscpica BI Haptoglobina LDH Hemoglobina libre en plasma y orina
Si no hay clnica ni laboratorio de hemlisis no se justifican estudios adicionales
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
Paciente con autocontrol o PAD positiva

Siempre comenzar por verificar la existencia de antecedentes transfusionales recientes
Puede tratarse de:

Autoanticuerpos reactivos en fro Autoanticuerpos reactivos en caliente
Autoanticuerpos reactivos en caliente
La reactividad de la mayora de los autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta con el uso de PEG y enzimas Es conveniente realizar la DAI sin los medios potenciadores habituales Si los resultados son negativos puede emplearse el mismo procedimiento para la prueba de compatibilidad sin necesidad de adsorciones
Transfusiones recientes
Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podra haber clulas recubiertas con Acs que determinan una PAD positiva con campo mixto La elucin podra ser til en especial cuando las pruebas sricas no son concluyentes
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
En el paciente con PAD positiva transfundido en fecha reciente o no, podra ser difcil obtener el fenotipo exacto de los GR Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar resultados vlidos a pesar de la PAD positiva
24/10/2011
Dr. Silvio Rosell
La elucin concentra las pocas molculas de inmunoglobulina presentes en los GR de la preparacin inicial en un volumen reducido Es excepcional que las clulas transfundidas generen un control positivo en otras fases de la prueba, pero puede ocurrir si existen neo o crioaloanticuerpos
Dr. Silvio Rosell
24/10/2011
Pensemos
Implementacin de algoritmos operativos para la utilizacin racional de los recursos

Gracias por su atencin
Vale disfrutar si el esfuerzo no fue en vano
medicinatransfusional@hotmail.com

InmunohematobasicaII (2011)

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Empleo de reactivos sulfhidrilo

Reactivos sulfhidrilo Usos

Reactivos sulfhidrilo Usos

Destruccin de antgenos eritrocitarios seleccionados para investigacin de Acs

(Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)

Dr. Silvio Rosell

Empleo de reactivos sulfhidrilo para distinguir los anticuerpos IgM e IgG

Ditiotreitol (DTT) 0,01 M

Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3

Las muestras gelificadas no pueden estudiarse

Pruebas de inhibicin de la hemaglutinacin

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Dr. Silvio Rosell

Si el eluato reacciona con todas las clulas

Tcnicas para elucin de anticuerpos

Tcnicas para elucin de anticuerpos

Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO Rpido y fcil

Recuperacin escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguneo

Dr. Silvio Rosell

Tcnicas para elucin de anticuerpos

Desventajas Recuperacin escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguneo

Dr. Silvio Rosell

Tcnicas para elucin de anticuerpos

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Tcnicas para elucin de anticuerpos

Desventajas El lavado del estroma es lento Baja sensibilidad sistema Kidd

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Tcnicas para elucin de anticuerpos

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Tcnicas para elucin de anticuerpos

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Ventajas Buena recuperacin de la mayora de los Acs significativos

Desventajas Carcinognico Txico Narctico Provoca hemlisis

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Ventajas Excelente recuperacin de la mayora de los Acs de grupo sanguneos

Desventajas Narctico Txico Explosivo Muy inflamable Poca recuperacin de anti-S-s

Dr. Silvio Rosell

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Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH

Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad

Se disminuye la variabilidad con la utilizacin de mayores volmenes

Disociacin de la IgG de los GR con PAD positiva

Cloroquina Reactivos Necesarios

Solucin de difosfato de cloroquina

preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N

No disocia el complemento de la membrana celular Incubacin no > de 2 hs.

causa hemlisis y/o prdida de reactividad antignica

slo atenuar la intensidad de la PAD

La cloroquina atena la expresin de Ag HLA de Clase I eritrocitarios

Dr. Silvio Rosell

Dr. Silvio Rosell

Anticuerpos monoclonales Aplicaciones

Dr. Silvio Rosell

Anticuerpos monoclonales Aplicaciones

Hacemos un breve intervalo

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Dr. Silvio Rosell