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1.1.
1.2. 1.3.
Determinar efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno, sobre la morfologa y desarrollo de cultivos bacterias aislados en la prctica anterior. Aprender tcnicas de siembra y lectura de crecimiento en cultivos slidos y lquidos, y en cultivos en anaerobiosis Realizar tcnica de microcultivo de Hongos para optimizar las observaciones y caracterizacin de estructuras vegetativas y reproductivas
Para estudiar un microrganismo es necesario previamente poder aislarlo y cultivarlo en las condiciones del laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cules son las condiciones medioambientales y los nutrientes que requieren para su ptimo desarrollo y reproduccin. En general, cuando se habla de desarrollo o crecimiento microbiano este puede ser definido por un aumento de la masa celular, en el caso de las bacterias la mayora de las veces nos referimos a un crecimiento poblacional mediado por los procesos de replicacin del ADN y divisin celular, donde cada clula aislada o UFC (Unidad Formadora de Colonia) origina primero 2 clulas hijas por fisin binaria hasta conformarse una colonia y es una medida cuantitativa del nmero de bacterias iniciales. En los hongos podramos hablar de un crecimiento celular ya que de una misma hifa o espora se puede generar una gran cantidad de masa celular sobre el medio de crecimiento formndose, y una vez que esporula cada espora es un individuo potencial y hablamos de crecimiento poblacional. En esta oportunidad nos vamos a centrar en los factores medioambientales o abiticos que condicionan las capacidades metablicas de los microrganismos y por lo tanto su crecimiento, dejando de lado las relaciones intra e inter-especficas que pueden afectar la dinmica del crecimiento microbiano.
Ya sea que hablemos de crecimiento poblacional o celular factores como la temperatura, el pH, la presin osmtica, la tensin de oxgeno, la intensidad lumnica y la presin atmosfrica afectan, retardan, aceleran o definitivamente detienen el crecimiento de los microrganismos y los llevan a la muerte. El identificar la influencia sobre el desarrollo y crecimiento microbiano de dichos factores nos ayudar a explicar su distribucin en la naturaleza y a disear mtodos para su control o inhibicin total (ver 6. Lectura complementaria). No todos los microrganismos responden de la misma forma a un factor ambiental determinado, convirtindose en una herramienta til a la hora de su aislamiento, cultivo, clasificacin e identificacin en el laboratorio, dependiendo de si el microrganismos es patgeno (causante de enfermedad), saprfito (flora inocua que vive en la materia orgnica muerta y ayuda a su descomposicin) u oportunista (puede causar enfermedad o no dependiendo de los factores nutricionales, estructurales e inmunes del husped y del medio), siendo este ltimo el que puede adaptarse a rangos ms amplios de dichas condiciones. De hecho una condicin ambiental puede ser daina para un microrganismo o beneficiosa para otro, pueden tolerar algunas condiciones adversas, que rebasadas nos les permiten crecer y por lo tanto debemos diferenciar entre las condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproduccin. a. Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de ms de 2000 reacciones bioqumicas de una gran diversidad, y la velocidad con que se efectan dichas reacciones esta influida por la temperatura, l cuela puede determinar en parte la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microrganismos. Las variaciones en temperatura pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa celular. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn esto en los siguientes grupos: Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de los 15 C. Ej: Flavobaterium sp Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. Ej: Escherichia coli Euritermfilas: termfilas facultativas, aquellas que son capaces de crecer en temperaturas de las mesfilas. Ej: Bacillus stearothermophilus Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C. Ej: Thermococcus celer Hipertermfilas: crecen a temperaturas superiores a los 80 C 1 Pyrodictium brockii
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Hasta hace poco la temperatura ms alta de crecimiento reportada era de 105 C, entonces se crea que el lmite de temperatura para la vida era de 100 C (punto de ebullicin del agua). Se han encontrado bacterias que crecen en chimeneas calientes hidrotermales o "black smokers" (fumarolas negras) ubicadas en las grietas del suelo ocenico que expulsan aguas bentnicas a temperaturas superiores a los 350 C. Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 C.
b. Potencial de hidrgeno, es un de los factores ms importantes ya que condiciona la disponibilidad de nutrientes del medio para el microrganismo y refleja a la vez los efectos sobre el medio del metabolismo mismo del microrganismo. Algunos microrganismos toleran cambios de pH de 3 o 4 unidades. Los microrganismos que soportan pH cidos se denominan acidfilos y pueden llegar a crecer en ph 4, los que soportan pH bsicos se llaman basfilos o alcalinfilos. Como ya se sabe el pH depende del tipo de soluciones que se encuentren presentes y disociadas en el medio, y as mismo el pH puede cambiar por los procesos metablicos de los microrganismos que generan sustancias cidas o bsicas que son liberadas al medio por la clula: Utilizacin de carbohidratos---->Produccin de cidos orgnicos----> Acidificacin Catabolismo de protenas---->Produccin de materiales nitrogenados----> Alcalinizacin Aunque los microrganismos crecen a menudo en medios con amplios rangos de pH, su tolerancia tiene un lmite ya que variaciones intensas pueden alterar la membrana citoplasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras, la muerte bacteriana se produce su el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5, los cambios de pH pueden ionizar los nutrientes disminuyendo su disponibilidad por el organismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn o buffer que mantenga el pH del medio regulado durante todo el crecimiento para que no se vea afectado por el metabolismo del microrganismo. Uno de los ms utilizados en microbiologa es la combinacin de Fosfatos de Potasio (KH2PO4 y K2HPO4, manteniendo el pH del medio en aprox. en 6,8) tambin se usa la peptona. El pH del medio se puede ajustar antes de esterilizarlo, titulando parte del medio con Hidrxido de Sodio (NaOH) o Acido Clorhdrico (HCL) y ajustando el resto con las mismas sustancias. De acuerdo al rango de pH ptimo de crecimiento los microrganismos pueden clasificarse como: Acdofilos: 0 a 5,5 Ej: Thiobacillus thiodoxidans, ptimo 2,0 a 3,5 Neutrofilos: 5,5 a 8.0 Ej: Escherichia coli, ptimo 6,0 a 7,0 Basfilos o Alcalfilos: 8,5 a 11,5, Ej: Bacillus alcalophilus, ptimo 10,6 (alcalfilo extremo) c. Presin osmtica/Disponibilidad del agua: Los medios de cultivo deben ser ligeramente hipotnicos que el interior de la clula, ya que de esta manera se facilita el flujo de agua con nutrientes disueltos hacia el interior de las clulas. Aunque para la mayora de los microrganismos el Cloruro de Sodio (NaCl) no es indispensable para su crecimiento (salvo para las bacterias marinas (%NaCl=3) que requieren de
Requerimiento O2
Si
Metabolismo
Ejemplo
Respiracin aerbica
Micrococcus luteus
Intestino Lagos
Para los microaerfilos que no soportan tensiones de oxgeno atmosfricas mayores (20%) se deben suministrar tensiones de 2 al 10%. Entre bacterias y protozoos podemos encontrar todos los 5 grupos de tolerancia e intolerancia al O2, los hongos son normalmente aerbicos, las levaduras anaerobias facultativas y las algas son aerbicas obligadas. El oxgeno puede llegar a ser txico para algunos organismos ya que muchas enzimas se inactivan cuando se oxidan. Cuando los organismos tienen como aceptor de electrones al oxgeno, deben protegerse a si mismos sintetizando enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa, ya que los productos de la reduccin del oxgeno mismo son extremadamente txicos, como el radical superxido, el perxido de hidrgeno y el radical hidrxilo. Estas enzimas son ausentes en los anaerobios estrictos. e. Suministro de luz: Los organismos fotosintticos o fototrfos debern ser expuestos a una fuente de iluminacin ya que la luz es su fuente de energa, como es el caso de las cianobacterias y algas. Esta fuente de iluminacin no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor. Para reproducir los microrganismos en el laboratorio es necesario suministrarles adems de las condiciones ptimas para su desarrollo, los nutrientes necesarios: fuentes de carbono (principalmente azcares), sales inorgnicas (macro y oligoelementos), protenas (aminocidos y N orgnico) y factores de crecimiento (vitaminas) necesarias a travs de la formulacin de medios de cultivo sintticos o la utilizacin de materias primas naturales. Sea cual fuere el origen del medio, este debe prepararse y esterilizarse de tal forma que facilite la observacin del
Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras tomadas por cada grupo. 3.1. Efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno. Materiales por grupo:
temperatura 3 cajas de petri pequeas con Agar Nutritivo AN Temperaturas a cultivar: 4 C, 37oC, 60o C 1 tubo de ensayo con TSB Caldo Triptona Soya efecto temperatura de o ebullicin (100 C) pH 3 Cajas de petri pequeas con AN con los siguientes pH 1 caja con pH 2 1 caja con pH 6.8 1 caja con pH 8.5 presin osmtica 4 tubos de ensayo con CN con las siguientes concentraciones: 1 tubo con [0.85%] de NaCl 1 tubo con [3%] de NaCl tensin de oxgeno 1 tubo de ensayo con AN sin solidificar para siembra con prueba de tensin de O2 1 caja de petri pequea con AN para cultivo en anaerobiosis Caja de galletas o frasco de boca ancha de 30 cms, 2 velas
Nevera, Incubadoras (37oCy 60oC), Bao Mara Procedimiento. 1. Realizar pases de la cepa purificada y caracterizada con asa redonda en cada uno de los medios segn sea lquido o solido, y de acuerdo a las pruebas de temperaturas, pH, presin, etc. 2. Salvo las pruebas de temperatura incubar el resto de los medios sembrados a 37 oC 3. Realizar pase de la cepa en tubo de ensayo con TBS, someter 15 minutos a 100 C en Bao Mara, realizar extensin y tincin con Gram y luego incubar a 25 oC 4. Realizar siembra profunda de la cepa, aplicando AN fundido para observar efecto de la tensin de oxgeno sobre el crecimiento 5. Realizar siembra en caja de petri con AN y someter en cmara de anaerobiosis (caja de galletas con velas encendidas) 6. Realizar lecturas comparando crecimiento, morfologa macro y micro de la cepa purificada para determinar efecto de la temperatura y los otros factores sobre la cepa 6. Mantener cepa purificada en nevara sellado con vinipel, no descartar el primer aislamiento.
Figura 1. Tcnica de Microcultivo Procedimiento. Se deposita un cuadrado del medio estril sobre un portaobjetos previamente esterilizado. Se siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjeto sobre el cuadrado de medio, se lleva a incubadora de 25oC, hacen observaciones a las 24, 48 y 72 horas. Cuando se verifica crecimiento de micelio del hongo sobre el medio y por ende en el cubreobjeto, se toma este cuidadosamente y se coloca sobre una gota de azul de lactofenol o azul de metileno, se sella con esmalte y se observa al microscopio para hacer descripcin microscpica de las estructuras vegetativas y de reproduccin del hongo. Anote en cuadro sobre estudio de su cepa de hongo que viene complementando desde la clase anterior Otros materiales. Coloraciones de Gram, Azul de Lactofenol, Azul de Metileno Portas y cubreobjetos Microscopio, Hipoclorito, Alcohol, Solucin salina (0,85%), Asas, Pinzas, Gradilla y Mechero
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Medio SIM: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
5.1.
5.2.
5.3.
Investigue otros 2 ejemplos de microrganismos, segn la clasificacin realizada de acuerdo las condiciones de temperatura, pH, tensin de oxgeno, presin osmtica, Investigue otros ejemplos de medios de cultivo segn los tipos presentados, cual es la composicin y el principio de lectura del medio SIM que se utilizo para ver motilidad Cules con los organismos barotolerantes y barfilos, donde se encuentran, cite ejemplos.
Anote y dibuje de esta manera sus observaciones de las cepas aisladas/ sembradas en los diferentes medios y factores (temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno), referenciado los resultados de crecimiento4 y morfologa macro y microscpica de la cepa
No. Grupo/ Muestra Morfologa 4 C previa Morfo Macro y Crecimiento Macro y Micro del Micro Aislamiento 25 C
Crecimiento
60 C
Crecimiento
100 C
Crecimiento
pH 8.5
Crecimiento
0.85% Na Cl
Crecimiento
15% NaCl
Crecimiento
Morfo.
Morfo.
15% Sacarosa
Crecimiento
Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en cuenta la siguiente clasificacin:
O2
Aerbico Facultativo
Microarerfilo
Anaerobio Aerotolerante
CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y DESINFECCION Reconocer las principales tcnicas de control de las poblaciones microbianas: Esterilizacin y Desinfeccin, revisin terica
a. Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas. b. Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos. c. Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microrganismos e incluso pueda matarlos. d. Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microrganismos al campo de trabajo. e. Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo. f. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microrganismos (antibacterianos, antifngicos, etc.) g. Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microrganismo (bactericida, fungicida, etc.). h. Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microrganismos (bacteriostticos, fungistticos, etc.). i. Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. j. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. k. Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones. l. Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas malignas. m. Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo
Otro aspecto necesario y crtico en el trabajo en microbiologa es el lavado, desinfeccin y esterilizacin adecuados segn el tipo de material y su uso. En general se utiliza material de vidrio y algunas veces de plstico como el polipropileno, polietileno y el niln (entre ms opaco el material como el niln ms soporta calor y puede ser esterilizado. En todos los casos debe ser esterilizado primero el medio de cultivo o material usado o contaminado antes de descartarlo, luego se retira con cepillo y agua los desechos y se sumerge por 3 horas en detergente, se lava bien y se deja secar en un horno o a temperatura ambiente. Si se requiere estril se lleva al autoclave, el
a. Temperatura: a mayor temperatura mayor accin. b. Tipo de microrganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms susceptibles que las esporas. c. Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que las viejas. d. Ambiente: El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetracin del agente. Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia trmica de los organismos. La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de los agentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microrganismo.
a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los mtodos ms efectivos para destruir microrganismos. Hay que distinguir entre calor hmedo y calor seco. El hmedo mata los microrganismos porque coagula sus
a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que sea voltil as como txico para los microrganismos, de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H). b. Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.
a. Tcnica de dilucin en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada tubo se le aade la misma cantidad de una suspensin del microrganismo utilizado como