PRCTICA N 3

LPIDOS CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA: SEPARACIN DE FOSFOLPIDOS.

OBJETIVO: Este trabajo prctico tiene por objetivo separar los fosfolpidos presente en la yema del huevo, utilizando la tcnica de Cromatografa en capa delgada. FUNDAMENTO TERICO: Los lpidos cumplen en el cuerpo humano varias funciones: son componentes estructurales de las membranas celulares, constituyen una importante fuente de energa mediante la oxidacin de los cidos grasos, siendo esta fuente energtica acumulada como reserva en forma de triacilglicridos en el tejido adiposo. Adems existen cuatro vitaminas (A, D, E y K) de naturaleza lipdica, y de las prostaglandina, sustancias que intervienen en procesos diversos: como la contraccin del msculo liso y la regulacin intercelular, son derivados lipdicos. Desde el punto de vista de la salud, el transporte de lpidos en la sangre es un tema extremadamente importante, ya que anormalidades en este proceso puede ser un factor importante en el desarrollo de la arteriosclerosis. La obesidad resulta del depsito excesivo de lpidos en el organismo. La Diabetes Mellitus, la Icteria obstructiva, la Pancreatitis, estn asociados con anormalidades en los lpidos sanguneos. Por ltimo, no pueden dejar de mencionarse enfermedades genticas no muy difundidas, denominadas Lipidosis causadas por la acumulacin de esfingolpidos en diversos rganos. Por esta razn es necesario familiarizarse con los fundamentos de la bioqumica de los lpidos y su metabolismo, para comprender los efectos metablicos asociados a los trastornos patolgicos a los que se hizo mencin. Los lpidos se han clasificados de diversas manera, una de las formas ms satisfactoria es la que se basa en la estructura de sus esqueletos. Los lpidos complejos que se caracterizan por tener cidos grasos como componente, tambin son llamados lpidos saponificables por que producen jabones por hidrlisis alcalina. Los lpidos sencillos no tienen cidos grasos, y por lo tanto no son saponificables. Tipo de lpido Complejos (saponificables) Acilglicridos Fosfoglicridos Esfingolpidos Ceras Simples (insaponificables) Terpenos Esteroides Prostaglandina Esqueleto Glicerina 3-fosfato glicerol Esfingosina Alcoholes no polares de PM elevado PROCEDIMIENTO: Experiencia N 1 1. Preparacin de las placas: Tomar con pinzas dos portaobjetos limpios y desengrasados; sumergirlo en una solucin de slicagel. Dejar secar en posicin horizontal. Llevar las placas a una estufa a 120 durante 1 hora, para activarlas. Guardarla en un desecador si no se las utilizan de inmediato. 2. Extraccin de fosfolpidos de la yema de huevo: A 1 ml de solucin de yema de huevo agregar 4 ml de una mezcla de cloroformo: etanol (2:1); agitar. Separar las fases con una pipeta Pasteur. Descartar la superior. 3. Siembra del material: Sembrar una pequea gota en la fase clorofrmica en un punto medio a 0.5 cm del borde inferior de la placa. El borde inferior es aquel hasta el cual llega la capa de slicagel, siendo el borde superior aquel con una franja libre que permita manipular la placa. 4. Preparar el Solvente: Cloroformo: metanol: agua (65: 35: 4) 5. Desarrollo del cromatograma: Colocar la placa con el borde sembrado hacia debajo de modo que la capa de slicagel quede sumergida 1 o 2 ml en el solvente (el nivel de este no debe llegar al lugar de siembra). Tapar la cuba. Dejar correr hasta que el frente de solvente llegue casi al borde superior. Sacar la placa de la cuba y dejar secar en posicin horizontal. Tapar la cuba para evitar la evaporacin del solvente. 6. Revelado de las placas: Colocar las placas en un frasco conteniendo yodo slido. Se produce la tincin de los lpidos por accin de los vapores de yodo. Experiencia N 2 1. Preparacin de las placas: Tomar con pinzas dos portaobjetos limpios y desengrasados; sumergirlo en una solucin de slicagel. Dejar secar en posicin horizontal. Llevar las placas a una estufa a 120 durante 1 hora, para activarlas. Guardarla en un desecador si no se las utilizan de inmediato. 2. Extraccin de la muestra: macerar 10 gr de hgado o tejido adiposo 3 ml de una mezcla de cloroformo: etanol (2:1); agitar. Separar las fases con una pipeta Pasteur. Descartar la fase acuosa. 3. Siembra del material: sembrar 10 l en un punto medio a 0.5 cm del borde inferior de la placa. El borde inferior es aquel hasta el cual

4. 5.

6.

7.

llega la capa de slicagel, siendo el borde superior aquel con una franja libre que permita manipular la placa. Preparar el Solvente: Eter de petrleo Eter etlico- Ac. Actico (80: 20: 1) Desarrollo del cromatograma: Colocar la placa con el borde sembrado hacia debajo de modo que la capa de slicagel quede sumergida 1 o 2 ml en el solvente (el nivel de este no debe llegar al lugar de siembra). Tapar la cuba. Dejar correr hasta que el frente de solvente llegue casi al borde superior. Sacar la placa de la cuba y dejar secar en posicin horizontal. Tapar la cuba para evitar la evaporacin del solvente. Revelado de las placas: Colocar las placas en un frasco conteniendo yodo slido. Se produce la tincin de los lpidos por accin de los vapores de yodo. Revelado de Colesterol: rociar un spray de una solucin (Ac. Sulfrico Ac actico (1:1) y llevar a estufa a 90 C durante 5 a 10 min. OBSERVACIN:

RESULTADOS Se realizaron 8 muestras a las cuales se les tomo medidas de las placas. Fueron 5 muestras de hgado de pollo y 3 muestras de yema de huevo. Se llevaron acabo todos los procedimientos paso a paso pero no obtuvimos buenos resultados ya que a causa de factores como el tiempo, la solucin no recorri toda la muestra como debera ser. es por eso que los resultados variaron y las mediadas no salieron bien.