Virologia Veterinaria - Flores

VIROLOGIA VETERINRIA
Eduardo Furtado Flores (ORG.)
VIROLOGIA VETERINRIA
Santa Maria, 2007
Reitor Vice-reitor Diretor da Editora Conselho Editorial
Clovis Silva Lima Felipe Martins Mller Honrio Rosa Nascimento Ademar Michels Daniela Lopes dos Santos Eduardo Furtado Flores Eliane Maria Foleto Maristela Brger Rodrigues Honrio Rosa Nascimento Jorge Luiz da Cunha Marcos Martins Neto Ronai Pires da Rocha Silvia Carneiro Lobato Paraense Maristela Brger Rodrigues Luzia de Lima Santanna Marcio Oliveira Soriano sobre fotograa de microscopia eletrnica de clulas de cultivo infectadas com herpesvrus bovino. Carolina Isabel Gehlen Lase Miolo Morais, Marcio Oliveira Soriano, Eduardo Furtado Flores
Reviso lingstica Normalizao referncias bibliogrcas Capa Projeto grco e diagramao Ilustraes
V819
Virologia veterinria / Eduardo Furtado Flores (organizador). Santa Maria : Ed. da UFSM, 2007. 888 p. ; 30 cm. 1. Medicina veterinria 2. Virologia I. Flores, Eduardo Furtado CDU 619:578
Ficha catalogrca elaborada por Maristela Eckhardt CRB-10/737 Biclioteca Central da UFSM
Direitos reservados : Editora da Universidade Federal de Santa Maria Prdio da Reitoria - Campus Universitrio Camobi - 97119-900 - Santa Maria - RS Fone/Fax: (55) 3220.8610 e-mail: editora@ctlab.ufsm.br www.ufsm.br/editora
COLABORADORES
Alice Aleri, MV, MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970. aleri@uel.br
Cludio Wageck Canal, MV, MSc. Doutor Departamento de Patologia Clnica Veterinria Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 claudio.canal@ufrgs. br
Amauri A. Aleri, MV, MSc.Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970. aleri@uel.br
Diego Gustavo Diel, MV, MSc. Laboratrio de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 diegodiel@pop.com.br
Ana Cludia Franco, MV, MSc.,PhD Departamento de Microbiologia Instituto de Cincias Bsicas da Sade Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 90050-170 anafranco@ufrgs.br Elisabete Takiuchi, MV., MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970 elisabete.takiuchi.@gmail.br
Ana Paula Ravazzolo, MV, D.Sc. Faculdade de Veterinria Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 ana.ravazzolo@ufrgs.br
Elizabeth Rieder, PhD. Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport NY 11944 USA elizrieder@yahoo.com
Clarice Weis Arns, MV, DSc. Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biologia Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Campinas, SP, Brasil. 13081-970 arns@unicamp.br
Fernanda Silveira Flores Vogel, MV, MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 fervogel@smail.ufsm.br
Fernando A. Osorio, MV, MSc. PhD Clarissa Silveira Luiz Vaz, MV, MSc., Embrapa Sunos e Aves (CNPSA) Concrdia, SC, Brasil. 89.700-000, clarissa.vaz@ufrgs. br Department of Veterinary and Biomedical Sciences University of Nebraska/Lincoln Lincoln, Nebraska, USA. 68583-0905 fosorio@unlnotes.unl.edu
Fernando Rosado Spilki, MV, MSc., Doutor Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biologia Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Campinas, SP, Brasil. 13083-970 fernandospilki@yahoo.com.br
Julia Ridpath. PhD National Animal Disease Center ARS - USDA 2300 Dayton Avenue. P.O. Box 70 Ames, IA, USA. 50010 jridpath@nadc.ars.usda.gov
Letcia Frizzo da Silva, MV, MSc. Gael Kurath, PhD Microbiologist Western Fisheries Research Center 6505 NE 65th St. Seattle, Washington, 98115. USA gael_kurath@usgs.gov Laboratrio de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 diegodiel@pop.com.br
Gustavo Delhon, MV, MSc.PhD Department of Pathobiology College of Veterinary Medicine University of Illinois at Urbana-Champaign Urbana, Illinois, USA. gadelhon@uiuc.edu
Luciane Teresinha Lovato, MV, MSc., PhD Departamento de Microbiologia e Parasitologia Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 llovato@smail.ufsm.br
Luiz Carlos Kreutz, MV, MSc., PhD Helena Beatriz de Carvalho R. Batista, MV, MSc. Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 hruthner@yahoo.com.br Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria Universidade de Passo Fundo (UPF) Passo Fundo, RS, Brasil. 99001-970 lckreutz@upf.tche.br
Hernando Duque Jaramillo, MV, MSc. PhD Plum Island Animal Disease Center USDA-APHIS-VS-NVSL-FADDL Greenport, New York USA. 11944-0848
Luis L. Rodriguez, MV. PhD Foreign Animal Disease Research Unit Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport NY 11944. USA. lrodriguez@piadc.ars.usda.gov
Janice Reis Ciacci-Zanella, MV, MSc.PhD Embrapa Sunos e Aves (CNPSA) Concrdia, SC, Brasil. 89.700-000, janice@cnpsa.embrapa.br
Marcelo de Lima, MV, MSc. Department of Veterinary and Biomedical Sciences University of Nebraska/Lincoln Lincoln, Nebraska, USA. 68683-0905 mdelima2@unlnotes.unl.edu
John D. Neill, DVM, PhD National Animal Disease Center, USDA, ARS 2300 Dayton Avenue. P.O. Box 70 Ames, Iowa.USA. 50010 jneill@nadc.ars.usda.gov Maria Elisa Piccone, PhD Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport, NY. 11944. USA maria.piccone@ars.usda.gov
Mariana S e Silva, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 msaesilva@yahoo.com.br
Renata Servan de Almeida, MV, MSc.Doutor CIRAD - Dpartement Systmes Biologiques UPR 15 Controle ds Maladies Animales Exotiques et Emergentes 34398 Montpellier cedex 5 France renservan@yahoo.com.br
Mrio Celso Speroto Brum, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 mcsbrum@yahoo.com.br
Rudi Weiblen, MV, MSc., PhD Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 rudi@ccr.ufsm.br
Sheila Wosiacki, MV., MSc. Doutor Mauro Pires Moraes, MV, MSc., Doutor Departamento de Veterinria Universidade Federal de Viosa Viosa, MG, Brasil. 36570-000 mpmoraes@ars.usda.gov Centro de Cincias Agrrias, Universidade Estadual de Maring (UEM) Campus Umuarama Maring, PR, Brasil. 87020-900 wosiacki@yahoo.com.br
Paulo Michel Roehe, MV, MSc.PhD Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor FEPAGRO Sade Animal Eldorado do Sul, RS, Brasil. 92 990-000 & Instituto de Cincias Bsicas da Sade Departamento de Microbiologia Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil 90 050 -170 proehe@gmail.com
Ubirajara M. da Costa, MV, MSc.Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e Tecnologia Centro de Cincias Agroveterinrias Universidade Estadual de Santa Catarina (UDESC) Lages, SC, Brasil. 88520-000 biravetvirus@yahoo.com.br
Zlia Ins Portela Lobato. MV, PhD. Escola de Veterinria Departamento de Medicina Veterinria Preventiva
Paulo Renato dos Santos Costa, MV, MSc., Doutor Departamento de Veterinria Universidade Federal de Viosa Viosa, MG, Brasil. 36570-000 prenato@ufv. br
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) Belo Horizonte, MG, Brasil. 34992-101 ziplobat@vet.ufmg.br
Renata Dezengrini, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 renatadezengrini@yahoo.com.br
INTRODUO
A presente obra foi concebida para preencher uma lacuna existente na bibliograa dedicada Virologia Veterinria na lngua portuguesa. O crescimento notvel do ensino e pesquisa em Virologia Animal no Brasil, nas ltimas dcadas, infelizmente no foi acompanhado por um aumento equivalente na literatura disponvel. Neste perodo, o acmulo fantstico de conhecimentos acerca da gentica e biologia dos agentes virais, proporcionado pelo desenvolvimento e popularizao das tcnicas moleculares, tem tornado algumas obras clssicas gradativamente desatualizadas e obsoletas. Existem bons livros de Virologia Animal e excelentes tratados de Virologia Geral e Molecular na lngua inglesa. No entanto, esses textos so temporariamente inacessveis a uma parcela considervel dos estudantes de graduao que se interessam e ingressam no mundo fascinante da Virologia. Esta obra, pois, tem por objetivo fornecer aos iniciantes em Virologia, que, porventura, sejam tambm iniciantes na lngua inglesa, um contedo atualizado e abrangente da Virologia Animal, com nfase aos animais de interesse veterinrio. O presente texto direcionado aos iniciantes em Virologia, sejam eles estudantes de graduao, ps-graduao ou mdicos veterinrios; e tem como objetivo fornecer informaes bsicas sobre a estrutura, biologia, patogenia, diagnstico e controle dos principais vrus de interesse veterinrio. Os principais aspectos da biologia molecular e replicao viral so abordados de maneira simples e de fcil compreenso, para embasar o entendimento da patogenia, resposta imunolgica e diagnstico dessas infeces. A omisso de informaes mais detalhadas sobre a biologia molecular dos vrus foi intencional. Tal detalhamento est um pouco alm da informao usualmente buscada por iniciantes em livros-texto. Por outro lado, os estudantes em nveis mais avanados podem recorrer a excelentes livros existentes na lngua inglesa. Um grande desao enfrentado durante a elaborao deste texto foi acompanhar a dinmica das descobertas e constataes na rea da Virologia Molecular. A dinmica do conhecimento gerado nesta rea exigir atividades de reviso e atualizao constantes do contedo, sob a pena de deix-lo obsoleto em poucos anos. Os avanos nas reas de vacinologia e teraputica antiviral tambm se intensicaram neste perodo, permitindo aos autores relatar as mais recentes conquistas cientco-tecnolgicas nessas reas. A dinmica das interaes dos vrus com os seus hospedeiros no ambiente natural tambm representa um desao para a elaborao de textos descritivos. No perodo de elaborao desta obra aproximadamente trs anos surgiram novos vrus e novas doenas; e vrus j conhecidos cruzaram a barreira de espcies e infectaram hospedeiros inusitados. Ou seja, a evoluo natural das infeces vricas no ambiente natural to dinmica que exige uma reviso contnua de conceitos. Este livro encontra-se dividido em duas partes. A parte inicial aborda os aspectos gerais da Virologia Animal, discorrendo sobre a estrutura, classicao e nomenclatura, gentica e evoluo, mtodos de deteco e identicao de vrus, aspectos gerais da replicao viral, replicao de vrus DNA e RNA, patogenia das infeces, epidemiologia, imunidade a vrus, diagnstico laboratorial e vacinas. Embora o enfoque desta parte seja direcionado para a Virologia Animal, os conceitos e aspectos nela tratados so tambm aplicveis a vrus que infectam humanos. Assim, este texto pode til tambm para os demais estudantes das reas biomdicas.
A segunda parte trata individualmente das famlias virais de importncia em medicina veterinria. Os captulos foram elaborados seguindo algumas orientaes com relao organizao e contedo. Dessa forma, cada captulo especco dividido em duas partes: a seo inicial aborda os aspectos gerais da respectiva famlia, a estrutura dos vrions, a estrutura e organizao genmica, expresso gnica, replicao do genoma e o ciclo replicativo. Um dos maiores desaos enfrentados na elaborao deste texto foi obter um equilbrio entre o nvel de aprofundamento nos aspectos biolgicos e moleculares com a nfase necessria nos aspectos epidemiolgicos, clnico-patolgicos e diagnsticos. Os aspectos moleculares da biologia dos vrus foram abordados de maneira simplicada para facilitar o entendimento por iniciantes da rea. Um maior detalhamento nos aspectos biolgicos e moleculares da estrutura e replicao dos vrus pode ser encontrado nos livros especializados. A segunda parte de cada captulo especco dedicada s doenas de importncia veterinria causadas por membros das respectivas famlias. Esta seo discorre acerca das caractersticas do agente, epidemiologia, patogenia, sinais clnicos e patologia, diagnstico, controle e prolaxia das doenas por ele causadas. Algumas famlias possuem vrios vrus associados com doenas animais de importncia sanitria e econmica; enquanto outras possuem poucos patgenos animais. Por isso, a disparidade de contedo e extenso dos diferentes captulos. O ltimo captulo apresenta algumas famlias virais que possuem importncia limitada em medicina veterinria. Algumas dessas famlias abrigam patgenos exclusivamente humanos; outras abrigam vrus que infectam somente animais sem interesse econmico ou afetivo; enquanto outras congregam vrus cujo interesse maior reside nos seus aspectos biolgicos e moleculares.
Os autores
AGRADECIMENTOS
Uma obra deste porte somente poderia ser elaborada com a colaborao de vrias pessoas. E nada mais justo do que agradecer a todos aqueles que tornaram possvel concretiz-la. Aos colegas colaboradores, pela disposio em dedicar uma parte importante do seu tempo na elaborao dos captulos. desnecessrio list-los aqui, pois os seus nomes se encontram nos respectivos captulos ou sees. Aos colegas e amigos de longa data, com quem a elaborao de um livro de Virologia Veterinria foi tema de inumerveis conversas e planos em congressos e reunies cientcas nestes ltimos 15 anos. Janice Ciacci-Zanella, Clarice Arns, Ana Paula Ravazollo, Amauri Aleri, Luciane Lovato, Mauro Moraes, Paulo Roehe, Luiz Carlos Kreutz e Rudi Weiblen, entre outros, o meu agradecimento e a certeza de que este livro representa a concretizao de um sonho de todos ns. O agradecimento aos colegas estrangeiros, que entenderam a importncia de um livro-texto como este e dedicaram parte de seu tempo para auxiliar a elabor-lo: Drs. Julie Ridpath, John Neill, Luis Rodriguez, Gael Kurath, Fernando Osorio, Maria Elisa Piccone, Gustavo Delhon, Elisabeth Rieder e Hernando Duque. Devo um agradecimento especial a trs colegas que contriburam muito alm da elaborao dos respectivos captulos, participando de vrios outros, enviando sugestes, traduzindo, revisando e reformulando os textos submetidos: Dr Luiz Carlos Kreutz, Dra. Fernanda Silveira Flores Vogel e Md. Vet. doutoranda Renata Dezengrini. Gostaria de externar o meu reconhecimento e gratido equipe do Setor de Virologia da UFSM, composta por mestrandos e doutorandos, que participaram ativamente de todo o processo de elaborao, edio e reviso desta obra. Grande parte da qualidade e propriedade deste texto se deve s interminveis discusses e revises de captulos, patrocinadas por um grupo cheio de entusiasmo e motivao. Ao Mrio Celso S. Brum, Diego G. Diel, Evandro Winkelmann, Sabrina R. Almeida, Sandra Arenhart, Andria Henzel, Renata Dezengrini, Mariana S e Silva, Helton dos Santos, Letcia Frizzo da Silva e Marcelo Weiss, com certeza de que vocs possuem parte importante nessa obra. Agradeo tambm aos colegas professores Slvia Hbner (UFPEL) e Valria Lara Carregaro (UFSM) pelas revises e colaborao em captulos especcos. profa. Maristela Brger Rodrigues, pela reviso gramatical; Carolina Gehlen, pela diagramao; Zlide Bayer Zucheto e prof. Honrio Rosa Nascimento, da Editora da UFSM, pelo apoio para que a edio deste livro fosse possvel. Alm do apoio da Editora da UFSM, parte do trabalho grco (elaborao de guras, diagramao, reviso gramatical) e pagamento de direitos autorais foram custeados com recursos da taxa de bancada de Produtividade em Pesquisa do CNPq do Organizador. A arte nal e capa somente foram possveis com o auxlio do Centro de Cincias Rurais, na pessoa do seu Diretor, prof. Dalvan Jos Reinert, e da vice-reitoria, pelo Prof. Felipe Mller, a quem agradecemos. Quero tambm manifestar o meu agradecimento e admirao pelo trabalho grco magnco realizado pelos acadmicos do Curso de Desenho Industrial da UFSM, Lase Miolo Moraes e Mrcio Oliveira Soriano. Eles foram os responsveis diretos por grande parte das ilustraes desta obra; e responsveis indiretos pela parte restante, cuja confeco lhes foi subtrada pelo seu entusiasmado aprendiz. Ao nal do trabalho, tivemos como resultados: um conjunto formidvel de ilustraes; dois
acadmicos de Desenho Industrial com certo conhecimento de Virologia e um virologista accionado pela arte de ilustrar gracamente a biologia dos vrus. E isso s o incio...
Eduardo Furtado Flores, MV. MSc. PhD Professor Associado Departamento de Medicina Veterinria Preventiva (DMVP) Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 ores@ccr.ufsm.br
Eduardo Furtado Flores natural de Santa Maria, RS (25/10/61); com graduao (1983) e mestrado (1989) em Medicina Veterinria pela Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Possui PhD em Virologia Molecular pela Universidade de Nebraska/Lincoln, Estados Unidos (1995). professor do Departamento de Medicina Veterinria Preventiva da UFSM desde 1991, responsvel pelas disciplinas de Epidemiologia Geral Veterinria e Sade Pblica Veterinria na graduao; e pelas disciplinas Epidemiologia Veterinria, Virologia Molecular e Introduo Biologia Molecular na ps-graduao. Faz parte do Conselho Editorial da Editora da UFSM; pesquisador de produtividade em pesquisa (1C) do CNPq desde 1997; e editor adjunto de Virologia da revista Pesquisa Veterinria Brasileira. Divide as suas atividades didticas e editoriais com a rotina de diagnstico virolgico no Setor de Virologia (SV/UFSM) e com a orientao de bolsistas de iniciao cientca, mestrado e doutorado. Coordena pesquisas nas reas de epidemiologia molecular e patogenia das infeces pelos vrus da diarria viral bovina e herpesvrus bovino tipos 1 e 5.
SUMRIO
Parte I - Virologia Geral

1 Estrutura e composio dos vrus
Eduardo Furtado Flores
19
2 Classicao e nomenclatura dos vrus

Luciane Teresinha Lovato
37
3 Deteco, identicao e quanticao de vrus

Mrio Celso S. Brum & Rudi Weiblen
59
4 Gentica e evoluo viral

Mauro Pires Moraes & Hernando Duque Jaramillo
87
5 Replicao viral
Eduardo Furtado Flores & Luiz Carlos Kreutz
107
6 Replicao dos vrus DNA

Gustavo Delhon
137
7 Replicao dos vrus RNA

Maria Elisa Piccone & Eduardo Furtado Flores
165
8 Patogenia das infeces vricas

189
9 Resposta imunolgica contra vrus

Luiz Carlos Kreutz
237
10 Epidemiologia das infeces vricas

261
11 Diagnstico laboratorial de infeces vricas

295
12 Vacinas vricas
Cludio Wageck Canal & Clarissa Silveira Luiz Vaz
327
Parte II - Virologia Especial

13 Circoviridae
Janice R. Ciacci-Zanella
361
14 Parvoviridae
Mauro Pires Moraes e Paulo Renato da Costa
375
15 Papillomaviridae
Amauri Aleri, Alice Aleri & Sheila Wosiacki
397
16 Adenoviridae
Mauro Pires Moraes & Paulo Renato da Costa
413
17 Herpesviridae
Ana Cludia Franco & Paulo Michel Roehe
333
18 Poxviridae
Cludio Wageck Canal
489
19 Asfarviridae
Gustavo Delhon
513
20 Caliciviridae
John Neill
525
21 Picornaviridae
Elisabeth Rieder & Mrio Celso S. Brum
537
22 Flaviviridae
Julia Ridpath & Eduardo Furtado Flores
563
23 Togaviridae
593
24 Coronaviridae
Luciane Teresinha Lovato & Renata Dezengrini
613
25 Arteriviridae
Marcelo de Lima & Fernando A. Osorio
639
26 Paramyxoviridae
Clarice Weis Arns, Fernando R. Spilki & Renata Servan de Almeida
657
27 Rhabdoviridae
Luis Rodriguez, Helena R. Batista, Paulo Michel Roehe & Gael Kurath
689
28 Orthomyxoviridae
Eduardo Furtado Flores, Luciane T. Lovato, Mariana S e Silva, Renata Dezengrini & Diego G. Diel
721
29 Bunyaviridae
Fernanda Silveira Flores Vogel
755
30 Reoviridae
Amauri Aleri, Alice Aleri, Elisabete Takiuchi & Zlia I. P. Lobato
773
31 Retroviridae
Ana Paula Ravazzollo & Ubirajara da Costa
809
32 Outras famlias virais

Fernanda Silveira Flores Vogel & Eduardo Furtado Flores Abreviaturas e siglas Glossrio
839
861 871
PARTE I VIROLOGIA GERAL
ESTRUTURA E COMPOSIO DOS VRUS

1
21 21
23 25 28 29
1 Introduo 2 Estrutura das partculas vricas

2.1 O genoma 2.2 O capsdeo 2.3 O envelope 2.4 A matriz
3 Protenas virais 4 Outros componentes dos vrions

4.1 Enzimas 4.2 Outras protenas virais 4.3 Lipdios 4.4 Carboidratos 4.5 cidos nuclicos celulares 4.6 Protenas celulares
30 31
31 31 31 31 31 32
5 Partculas vricas anmalas 6 Propriedades fsico-qumicas 7 Bibliograa consultada
32 33 33
1 Introduo
Os vrus so os microorganismos menores e mais simples que existem. So muito menores do que clulas eucariotas e procariotas e, ao contrrio destas, possuem uma estrutura simples e esttica. Esses agentes no possuem a maquinaria necessria para a produo de energia metablica e para a sntese de protenas e, por isso, necessitam das funes e do metabolismo celular para se multiplicar. Fora de uma clula viva os vrus so estruturas qumicas. A sua atividade biolgica s adquirida no interior de clulas vivas, por isso so parasitas intracelulares obrigatrios. O genoma viral cido ribonuclico (RNA) ou desoxirribonuclico (DNA) codica apenas as informaes necessrias para assegurar a sua multiplicao, empacotamento do genoma e para subverso de funes celulares em benefcio da sua multiplicao. Ao contrrio de clulas eucariotas e procariotas, os vrus no crescem ou se dividem; e sim so produzidos pela associao dos seus componentes pr-formados no interior da clula infectada. A palavra vrus utilizada para designar o agente biolgico, o microorganismo. A estrutura fsica denominada partcula viral, partcula v-
rica ou simplesmente vrion. A nomenclatura utilizada para designar as diversas hierarquias da classicao taxonmica dos vrus (ordem, famlia, subfamlia, gnero, espcie) ser apresentada no Captulo 2. No presente captulo, a terminologia vernacular ser utilizada. Por exemplo: o termo picornavrus ser utilizado para referir-se aos membros da famlia Picornaviridae; os membros da famlia Orthomyxoviridae sero chamados de ortomixovrus.
2 Estrutura das partculas vricas

A unidade fundamental o indivduo dos vrus denominada partcula vrica, partcula viral ou simplesmente vrion. As dimenses, morfologia e complexidade das partculas vricas variam amplamente entre os vrus das diferentes famlias. A grande maioria dos vrions possui dimenses ultramicroscpicas, com dimetro que varia entre 15 e 22 nanmetros (nm) nos circovrus; e entre 200 e 450 nm nos poxvrus; e s pode ser visualizada sob microscopia eletrnica (ME). As excees so alguns poxvrus que so maiores e podem ser visualizados sob microscopia tica (Figura 1.1).
Poxvrus Clulas animais Bactrias Vrus e ribossomos Protenas
10-2 (1cm)
10-3 (1mm)
10-4 (0,1mm)
10-5 (10m)
10-6 (1m)
10-7 (0,1m)
10-8 (10nm)
10-9 (1nm)
10-10 (1A)
Microscopia tica Microscopia eletrnica
Fonte: adaptado de Flint et al.(2000).
Figura 1.1. Escala logartmica mtrica, ilustrando as dimenses dos vrus comparativamente com clulas animais, bactrias e macromolculas. O poder de resoluo das microscopias tica e eletrnica indicado por barras.
22
Captulo 1
De acordo com a estrutura bsica das partculas, dois grupos principais de vrus podem ser reconhecidos: os vrus sem envelope e os vrus com envelope (Figura 1.2). Os vrions mais simples so compostos pelo genoma recoberto por uma camada simples de protena, denominada capsdeo. Os vrus mais complexos possuem genomas longos associados com vrias protenas, recobertos por capsdeos complexos, revestidos externamente por uma membrana lipoprotica de origem celular, denominada envelope. As camadas proticas que envolvem o genoma (capsdeo, envelope) so freqentemente denominadas de envoltrios virais. Os conceitos principais relacionados estrutura e componentes dos vrions esto apresentados no Quadro 1.1.
Genoma
Capsdeo
B
Envelope
condies ambientais que rapidamente inativariam o cido nuclico. Por isso, o capsdeo e o envelope so crticos para a manuteno da integridade e viabilidade do genoma, que contm as informaes essenciais para a multiplicao do vrus. Outras funes importantes dos componentes superciais das partculas vricas so o reconhecimento e interao com estruturas da membrana da clula hospedeira. Essas interaes so essenciais para a penetrao do agente na clula e incio da sua replicao. A arquitetura e modo com que as partculas vricas so construdas devem permitir o desempenho de duas funes fundamentais: a) proteo do genoma durante o transporte entre clulas e entre hospedeiros, e b) liberao do genoma ntegro e vivel aps a penetrao na clula hospedeira. A evoluo fez com que a arquitetura das partculas vricas tenha sido adequada para cumprir essas tarefas. Ou seja, os vrions so resistentes o suciente para proteger o genoma no exterior das clulas e so facilmente desintegrados ao penetrarem na clula hospedeira, para permitir a pronta liberao do genoma no seu interior. Essas duas propriedades, aparentemente opostas, que so particularmente bem evidentes em alguns vrus sem envelope, caracterizam o que se convencionou denominar de estrutura metaestvel.
VRUS - DEFINIES E CONCEITOS

Genoma
- O genoma constitudo por RNA ou DNA. - O capsdeo a camada protica que recobre o genoma. - Os protmeros so as unidades proticas que compe o capsdeo. - Os capsmeros so as unidades morfolgicas do capsdeo.
Capsdeo
Figura 1.2. Estrutura fundamental das partculas vricas e seus componentes. Representao esquemtica de um vrion sem envelope (A) e com envelope (B).
- O nucleocapsdeo a estrutura formada pelo genoma + capsdeo. - O envelope a membrana lipoprotica que recobre o nucleocapsdeo - O vrion a partcula vrica completa, infecciosa.
A funo primordial dos envoltrios virais (capsdeo e envelope) proteger o genoma de danos fsicos, qumicos ou enzimticos durante a transmisso entre clulas e entre hospedeiros. Nessa etapa, os vrions podem ser expostos a
Quadro 1.1. Conceitos e definies fundamentais.
Estrutura e composio dos vrus
23
2.1 O genoma
O genoma dos vrus constitudo por molculas de cido ribonuclico (RNA) ou desoxirribonuclico (DNA), nunca pelos dois. Por isso, esses agentes so comumente denominados de vrus RNA ou vrus DNA. Em geral, os vrus das diversas famlias contm apenas uma cpia do genoma por vrion (so haplides). Uma exceo so os retrovrus, que possuem duas cpias idnticas do genoma (so diplides). A extenso, estrutura, organizao genmica e o nmero de genes contidos no genoma variam amplamente entre os diferentes vrus. Os menores vrus animais (circovrus) possuem uma molcula de DNA com aproximadamente 1.700 nucleotdeos (1,7 quilobases, kb) como genoma; os vrus maiores possuem um genoma DNA com mais de 350 kb (poxvrus). O nmero de genes e conseqentemente o nmero de protenas codicadas tambm varia entre os diferentes vrus. Alguns vrus de plantas codicam apenas uma protena, enquanto o genoma dos poxvrus codica mais de 100. Em geral, o genoma dos vrus muito compacto e codica apenas as protenas essenciais para assegurar a sua replicao e transmisso. Resumidamente, essas funes compreendem: a) assegurar a replicao do genoma (enzimas polimerases de RNA e DNA e protenas acessrias); b) subverter funes celulares em seu benefcio (protease leader no vrus da febre aftosa [foot and mouth disease virus, FMDV]) e c) empacotar o genoma (protenas do capsdeo e envelope). Essas funes so codicadas pelo genoma de, virtualmente, todos os vrus. Alguns vrus mais complexos codicam funes adicionais que, de alguma forma, favorecem a sua multiplicao e disseminao. O tipo e estrutura do genoma de muitos vrus diferem do padro clssico observado nos cidos nuclicos de eucariotas e procariotas. Nesses organismos, o genoma constitudo por molculas de DNA de cadeia dupla (ds, double-stranded); enquanto os RNAs possuem ta simples (ss, single-stranded). Os genomas dos vrus apresentam variaes de tipo e estrutura, que incluem
desde genomas de DNA de ta simples (ssDNA) at RNA de ta dupla (dsRNA) (Tabelas 1.1 e 1.2, em anexo). A maioria dos vrus DNA possui o cido nuclico genmico como uma molcula de ta dupla. As excees so os parvovrus (cadeia simples linear), os circovrus (cadeia simples circular) e os hepadnavrus (cadeia parcialmente dupla). O termo circular refere-se continuidade da cadeia de DNA e no forma geomtrica adotada pela molcula. Ao contrrio dos genomas lineares, que apresentam as extremidades livres, os genomas circulares apresentam a cadeia contnua, sem extremidades. Os poliomavrus e papilomavrus possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla circular. Essa molcula apresenta-se enrolada/tensionada sobre o seu eixo longitudinal (do ingls: supercoiled) e est associada com protenas celulares denominadas histonas, tanto nas clulas infectadas como nos vrions. Os parvovrus possuem uma molcula de DNA de cadeia simples, cujas extremidades possuem seqncias complementares invertidas (palindromes). Essa caracterstica permite que as extremidades do genoma se dobrem sobre si mesmas, pareando com a sua regio complementar e formando estruturas semelhantes a grampos de cabelo (hairpins). Os genomas dos adenovrus e herpesvrus so molculas de DNA de cadeia dupla linear. Nos herpesvrus, o genoma linear apenas nos vrions, pois assume a topologia circular (devido ao pareamento complementar nas extremidades) logo aps a entrada no ncleo da clula. O genoma dos hepadnavrus uma molcula de DNA de cadeia parcialmente dupla (aproximadamente 3/4), o restante possui cadeia simples. As extremidades da cadeia completa fazem um pareamento de bases entre si, conferindo molcula a topologia circular (a cadeia de DNA no contnua). Os poxvrus possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla linear; porm as duas cadeias so contnuas, ou seja, no h extremidades livres. Uma ilustrao simplicada da morfologia das partculas e da topologia do genoma dos vrus DNA est apresentada na Figura 1.3.
24
Captulo 1
Circoviridae
Parvoviridae
Polyomaviridae Papillomaviridae
Adenoviridae
Herpesviridae
Poxviridae
Hepadnaviridae
Asfarviridae
Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu
Figura 1.3. Ilustrao simplificada da morfologia dos vrions e da topologia do genoma dos vrus DNA.
O cido nuclico genmico de todos os vrus RNA composto por molculas lineares. Em algumas famlias (Orthomyxoviridae e Bunyaviridae), essas molculas circularizam pelo pareamento de seqncias complementares, localizadas nas extremidades, formando estruturas que lembram cabos de panela (panhandles). A maioria dos vrus RNA possui o seu cido nuclico genmico como uma molcula de cadeia simples. As excees so os reovrus e os birnavrus, cujos genomas so formados por segmentos de RNA de cadeia dupla (10 a 12 segmentos nos reovrus, dois nos birnavrus). Os genomas dos vrus RNA de cadeia simples podem ser constitudos por uma nica molcula (no-segmentados) ou por mais de uma molcula (genomas segmentados: sete a oito molculas de RNA nos ortomixovrus, trs nos buniavrus e duas nos arenavrus). O genoma de alguns vrus RNA de cadeia simples possui o mesmo sentido do RNA mensageiro (mRNA) e pode ser diretamente traduzido pelos ribossomos da clula hospedeira. Isso
possvel porque a seqncia de nucleotdeos, que codica os aminocidos constituintes da protena, est alinhada no mesmo sentido da seqncia genmica. Esses mRNA (e os respectivos vrus) so denominados RNA de sentido ou polaridade positiva; ou simplesmente RNA+. A primeira etapa intracelular do ciclo replicativo desses vrus a traduo parcial ou total do RNA genmico, resultando na produo de protenas virais, entre as quais a enzima polimerase de RNA (replicase), que ir replicar o genoma. Outros vrus RNA de cadeia simples possuem genomas que no podem ser diretamente traduzidos, pois possuem o sentido contrrio (antissense) ao mRNA. Esses genomas (e os respectivos vrus) so denominados de RNAs de sentido ou polaridade negativa (RNA-). Esses vrus trazem a enzima polimerase de RNA nos vrions para permitir o incio da replicao do genoma. A etapa inicial da replicao a sntese de uma cpia de RNA de polaridade positiva (mRNA) a partir do RNA genmico. Ou seja, nesses vrus, a sntese protica ocorre pela traduo do mRNA, que possui sentido antigenmico. Os genomas RNA dos buniavrus e arenavrus no so diretamente traduzidos pelos ribossomos, sendo considerados RNA de sentido negativo. Esses RNAs servem de molde para a transcrio e produo de cpias de RNA de sentido positivo (RNA+ ou mRNA) de extenso parcial ou total do genoma. No entanto, em alguns desses vrus, um dos segmentos de RNA codica protenas tanto no sentido do genoma como na molcula de sentido oposto (antigenmico). Essa estratgia de expresso gnica denominada ambissense e uma caracterstica nica dessas famlias. Nos reovrus e birnavrus (genomas RNA segmentados de ta dupla), a cadeia negativa serve de molde para a transcrio e produo de mRNA (RNA- RNA+). A cadeia complementar de RNA genmico (sentido positivo) no traduzida. Essa molcula serve apenas de molde e para parear com a cadeia negativa. A Figura 1.4 apresenta uma ilustrao simplicada da morfologia dos vrions e topologia do genoma dos vrus RNA.
25
Picornaviridae
Astroviridae
Caliciviridae
Flaviviridae
Arteriviridae
Togaviridae
Coronaviridae
Retroviridae
Reoviridae
Birnaviridae
Bunyaviridae
Orthomyxoviridae
Arenaviridae
Filoviridae
Rhabdoviridae
Paramyxoviridae
Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu
Figura 1.4. Ilustrao simplificada da morfologia dos vrions e da topologia do genoma dos vrus RNA.
2.2 O capsdeo
O capsdeo (tambm chamado de cpsula) a camada protica que recobre externamente o genoma. Nos vrus que no possuem envelope, o capsdeo representa o nico envoltrio do cido nuclico viral. Alm dessa cobertura protica, o genoma de alguns vrus encontra-se associado com uma ou mais protenas de origem viral (p. ex.: adenovrus e reovrus) ou da clula hospedeira (poliomavrus e papilomavrus). As protenas que esto associadas ao genoma geralmente possuem carter bsico, sendo formadas predominantemente por aminocidos com carga positiva. Essa estrutura, geralmente compacta (genoma + protenas associadas), denominada core ou ncleo. O conjunto formado pelo core + capsdeo comumente denominado nucleocapsdeo. Nos vrus envelopados, o nucleocapsdeo recoberto
externamente pela membrana lipoprotica que constitui o envelope (Figura 1.2). A funo do capsdeo proteger o material gentico e proporcionar a transferncia do vrus entre clulas e entre hospedeiros. Nos vrus sem envelope, a superfcie externa do capsdeo responsvel pelas interaes iniciais dos vrions com a clula hospedeira no processo de penetrao do vrus. Nesses vrus, as protenas localizadas na superfcie do capsdeo tambm interagem com componentes do sistema imunolgico e so alvos importantes para anticorpos com atividade neutralizante. Os capsdeos so formados pela associao de subunidades proticas denominadas protmeros, que se constituem nas suas unidades estruturais. A associao dessas protenas pode formar estruturas tridimensionais bem denidas, geralmente na forma de pequenas salincias visveis na superfcie dos vrions. Essas estruturas consti-
26
Captulo 1
tuem-se nas unidades morfolgicas do capsdeo, tambm denominadas capsmeros. Cada capsmero pode ser formado por uma nica protena, pela associao de molculas de uma mesma protena ou por diferentes protenas (Figura 1.5).
O icosaedro se constitui em uma estrutura quase esfrica com uma cavidade interna. Os capsdeos icosadricos (tambm denominados cbicos) so formados pela associao de 20 unidades triangulares planas idnticas, unidas entre si em 12 vrtices e arranjadas ao redor de uma esfera imaginria (Figura 1.6). Eixos imaginrios traados atravs do icosaedro do origem a trs possveis planos de simetria: bilateral (two-fold), trilateral (three-fold) e pentalateral (ve-fold). O nmero de unidades que compem cada unidade triangular varivel e d origem a variaes estruturais entre os capsdeos de diferentes vrus. O icosaedro representa a otimizao estrutural para a construo de um envoltrio resistente, compacto e com mxima capacidade de armazenamento, podendo ser composto por mltiplas cpias de uma mesma protena.
Assim, o capsdeo pode ser formado por cpias de uma mesma protena (vrus do mosaico, rabdovrus) ou por diferentes tipos de protenas (mais de dez tipos diferentes nos reovrus), e todas se encontram em mltiplas cpias e so codicadas pelo genoma viral. Os capsdeos compostos por cpias mltiplas de uma mesma protena representam um exemplo de ecincia estrutural de armazenamento e economia de espao no genoma, pois um nico gene codica a protena necessria para formar todo o envoltrio viral. Independente do nmero de protenas que compem o capsdeo, a associao entre essas protenas pode resultar em capsdeos com duas simetrias principais: icosadrica e helicoidal (Figura 1.5).
27
Os capsdeos helicoidais so formados por mltiplas cpias de uma mesma protena. Essas protenas se associam entre si e com o cido nuclico, revestindo externamente o genoma. Essa associao resulta em uma estrutura espiralada alongada, exvel ou relativamente rgida (Figura 1.7). As dimenses dos nucleocapsdeos helicoidais variam muito, dependendo da extenso do genoma, podendo atingir at 1.800 nm nos lovrus.
A maioria dos vrus animais possui capsdeos icosadricos ou helicoidais, mas alguns (poxvrus, iridovrus e bacterifagos) possuem capsdeos com arquitetura mais complexa, denominados genericamente capsdeos complexos. Com base na arquitetura, simetria e complexidade de arquitetura, os vrions de diferentes famlias podem ser agrupados em cinco grupos estruturais (Figura 1.8):
1. Capsdeo icosadrico
1A
1B
2. Capsdeo helicoidal
2A
Figura 1.7. Ilustrao esquemtica de nucleocapsdeos helicoidais. A. Nucleocapsdeo helicoidal com morfologia definida; B. Nucleocapsdeo helicoidal flexvel.
2B
Os capsdeos helicoidais de alguns vrus de plantas apresentam-se como cilindros exveis ou rgidos, no interior do qual est localizado o genoma. So todos vrus sem envelope. Os vrus animais que possuem nucleocapsdeos helicoidais possuem genoma RNA de sentido negativo e so todos envelopados. O nucleocapsdeo helicoidal desses vrus formado pela associao de cpias mltiplas da protena do capsdeo com o genoma, que adota uma forma espiralada. Nos rabdovrus, o nucleocapsdeo adota uma forma bem denida, semelhante a um projtil de arma de fogo, no interior do qual se aloja o genoma espiralado (Figura 1.7A). Na maioria dos vrus, o nucleocapsdeo helicoidal exvel e enovelase sobre si mesmo e sobre o genoma sem adotar uma forma denida (Figura 1.7 B).
Fonte: adaptada de Carter et al. (2005).
Figura 1.8. Os cinco principais tipos estruturais dos vrus. 1. Vrions com capsdeos icosadricos: 1A. Sem envelope; 1B. Com envelope. 2. Vrions com capsdeos helicoidais: 2A. Sem envelope; 2B. Com envelope. 3. Vrion com simetria complexa.
28
Captulo 1
sem envelope, capsdeo icosadrico: ex: adenovrus, picornavrus; sem envelope, capsdeo helicoidal: ex: vrus do mosaico do tabaco; com envelope, capsdeo isosadrico: ex: togavrus, herpesvrus; com envelope, capsdeo helicoidal: ex: paramixovrus, rabdovrus; complexos: ex: bacterifagos, poxvrus.
2.3 O envelope
Os vrions de vrias famlias possuem os nucleocapsdeos recobertos externamente por uma membrana lipoprotica denominada envelope. O envelope formado por uma camada lipdica dupla, derivada de membranas celulares. Nessas membranas esto inseridas um nmero varivel de protenas codicadas pelo genoma viral. Na maioria dos vrus, o envelope est justaposto externamente ao capsdeo. Nos herpesvrus, entretanto, existe um espao de espessura varivel entre o capsdeo e o envelope, que preenchido por uma substncia protica amorfa, denominada tegumento. A quantidade e a forma adotada pelo tegumento so variveis e, conseqentemente, determinam a variao da morfologia e dimenses da partcula dos herpesvrus. Como o envelope derivado de membranas celulares, e estas so uidas e exveis, a superfcie externa e a morfologia dos vrus envelopados so mais exveis e menos denidas do que nos vrus sem envelope. A estrutura de um vrion com envelope est ilustrada na Figura 1.9.
nucleocapsdeo genoma membrana lipdica envelope glicoprotenas
Adaptado de Reschke, M.; www.biographix.de
Figura 1.9. Ilustrao esquemtica da estrutura de um vrion com envelope. As aberturas no envelope e no capsdeo so meramente ilustrativas, com o fim de permitir a visualizao das estruturas internas.
Os vrions adquirem a membrana lipdica que compe o envelope pela insero/protuso do nucleocapsdeo atravs de membranas celulares, mecanismo denominado brotamento. Os lipdios que constituem o envelope so derivados das membranas da clula hospedeira, e as protenas so codicadas pelo genoma viral. A estrutura lipdica dupla dos envelopes bem semelhante entre os diferentes vrus. No entanto, a espessura e composio dessa camada variam de acordo com a membrana celular que os originou. O envelope, adquirido na membrana plasmtica, contm fosfolipdios e colesterol em determinada proporo, enquanto o envelope originado das membranas celulares internas mais delgado e contm pouco ou nenhum colesterol. Os envelopes virais praticamente no contm protenas celulares. As protenas celulares da membrana so excludas da regio do brotamento por interaes entre as protenas virais que se inserem na camada lipdica. Os envelopes dos vrus podem conter um ou mais tipos de protenas codicadas pelo genoma viral (os herpesvrus possuem entre 10 e 12; os poxvrus possuem um nmero ainda maior). A maioria das protenas do envelope contm oligossacardeos (acares) associados, constituindo-se, portanto, em glicoprotenas. Essas glicoprotenas so produzidas e modicadas no retculo endoplasmtico rugoso (RER) e no aparelho de Golgi, cando inseridas na prpria membrana do RER ou sendo enviadas para a membrana nuclear do Golgi ou para a membrana plasmtica, locais do brotamento. As glicoprotenas do envelope viral possuem dimenses e estruturas variveis e a maioria formada por protenas integrais de membrana (Figura 1.10A). Essas glicoprotenas podem estar presentes na forma de monmeros, homo ou heterodmeros, trmeros e at tetrmeros. Em geral, as glicoprotenas do envelope apresentam trs regies principais em comum: a) uma regio citoplasmtica ou interna (cauda); b) uma regio transmembrana (tm) e c) uma regio externa. A cauda geralmente pequena e interage com a superfcie externa do nucleocapsdeo no processo de morfognese e brotamento. A regio tm est inserida na camada lipdica e serve de sustentao e xao da protena. A extenso dessa re-
29
gio varia de acordo com a espessura e origem da camada lipdica: entre 18 (vrus da febre amarela, que brota no retculo endoplasmtico) e 26 aminocidos (vrus da inuenza, que adquire o envelope na membrana plasmtica). A regio tm composta principalmente por aminocidos hidrofbicos. Algumas glicoprotenas do envelope possuem vrias regies tm e, assim, atravessam a membrana duas ou trs vezes. Outras no possuem regio tm e, portanto, no se encontram inseridas na membrana lipdica. Essas glicoprotenas encontram-se associadas ao envelope por interaes covalentes ou no-covalentes com outras glicoprotenas integrais de membrana e, por isso, so ditas protenas perifricas de membrana (Figura 1.10B). Exemplos desse tipo de protena so as glicoprotenas E0 dos pestivrus e a SU dos retrovrus. A regio externa geralmente maior; hidroflica e contm um nmero varivel de oligossacardeos associados. As glicoprotenas do envelope de alguns vrus formam projees na superfcie dos vrions, denominadas peplmeros, que podem ser visualizadas sob ME.
A
E
TM
d) transmisso do vrus entre clulas. Nas etapas nais do ciclo replicativo, algumas glicoprotenas do envelope auxiliam no egresso das partculas recm-formadas, permitindo a sua liberao a partir da membrana celular (neuraminidase nos ortomixovrus). As glicoprotenas do envelope tambm desempenham um importante papel na interao do vrus com o sistema imunolgico e se constituem em alvos importantes para anticorpos neutralizantes. Como as glicoprotenas do envelope mediam as interaes iniciais dos vrions com as clulas, a sua integridade e conformao natural so essenciais para a infectividade do vrus. Algumas substncias qumicas (formalina e detergentes) ou agentes fsicos (calor e radiaes) alteram a conformao dessas protenas e, conseqentemente, reduzem ou eliminam a infectividade do vrus. Solventes lipdicos, como ter e clorofrmio, tambm afetam negativamente a infectividade de vrus envelopados, pois destroem a integridade da camada lipdica que compe o envelope. Os vrions adquirem o envelope por meio de um mecanismo denominado genericamente de brotamento. Nesse processo, o nucleocapsdeo inicialmente interage com as caudas das glicoprotenas previamente inseridas na membrana. Essa interao inicial seguida da protuso/insero do nucleocapsdeo atravs da membrana, resultando na formao de vrions com uma camada lipoprotica que envolve externamente o nucleocapsdeo (Figura 1.11). O local do brotamento varia entre os diferentes vrus e pode ocorrer na membrana nuclear, do RER, do aparelho de Golgi ou na membrana plasmtica.
2.4 A matriz
Figura 1.10. Representao simplificada da estrutura das glicoprotenas do envelope viral. A. Protena integral de membrana com as regies interna (I), transmembrana (TM) e externa (E); M. membrana lipdica; B. Duas protenas associadas: uma integral de membrana (cinza) associada com uma protena perifrica (preto).
As glicoprotenas, principalmente por meio de sua regio extracelular, desempenham vrias funes na biologia do vrus, incluindo: a) ligao aos receptores celulares; b) fuso do envelope com a membrana celular; c) penetrao celular e
Alguns vrus envelopados possuem protenas que recobrem externamente o nucleocapsdeo, mediando a sua associao com a superfcie interna do envelope. Essas protenas, denominadas de matriz, so geralmente glicosiladas e abundantes, podendo corresponder a at 30% da massa total dos vrions (como nos retrovrus). As protenas da matriz so encontradas em vrios vrus envelopados, principalmente nos vrus RNA de polaridade negativa (exemplos: parami-
30
Captulo 1
Meio extracelular
3 2
Membrana plasmtica
1
Citoplasma
Figura 1.11. Etapas do brotamento e aquisio do envelope por vrus envelopados. 1. Interao do nucleocapsdeo com as caudas citoplasmticas das glicoprotenas do envelope; 2-3. Insero/protuso do nucleocapsdeo atravs da membrana; 4. Egresso da partcula completa.
xovrus e ortomixovrus). As protenas da matriz desempenham importante funo estrutural e na morfognese das partculas vricas, pois interagem simultaneamente com a superfcie externa do nucleocapsdeo e com as caudas das glicoprotenas, funcionando como adaptadores entre o nucleocapsdeo e o envelope.
PA+PB1+PB2
NP HA
3 Protenas virais
O genoma dos vrus codica duas classes principais de protenas: estruturais e no-estruturais. As protenas estruturais so aquelas que participam da construo e arquitetura da partcula vrica (Figura 1.12), ou seja, esto presentes como componentes estruturais dos vrions. Enquadram-se nessa classe as protenas do nucleocapsdeo e do envelope. As protenas do tegumento (herpesvrus) e as protenas da matriz tambm se constituem em protenas estruturais. As protenas no-estruturais so aquelas codicadas pelo genoma viral e produzidas no interior da clula hospedeira durante o ciclo replicativo, mas que no participam da estrutura das partculas vricas. So geralmente protenas com atividades enzimticas e/ou regulatrias que participam das diversas etapas do ciclo replicativo do vrus e de sua interao com as organelas e macromolculas da clula hospedeira.
NA
M2
Figura 1.12. Ilustrao esquemtica da estrutura de um ortomixovrus (vrus da influenza), indicando a localizao das protenas na partcula vrica. Glicoprotenas do envelope: HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; M2: canal de ons; M: protena da matriz. Componentes do complexo ribonucleoprotena: RNA: recoberto pela NP; NP: nucleoprotena; PA: polimerase cida; PB1: polimerase bsica 1; PB2: polimerase bsica 2.
So exemplos de protenas no-estruturais as enzimas polimerases de DNA (DNA polimerase) e RNA (RNA polimerase), enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotdeos (timidina quinase, ribonucleotdeo redutase etc.), fatores de transcrio e regulao da expresso gnica (ICP0 nos herpesvrus, protena E1A dos adenovrus,
31
antgeno T dos poliomavrus), entre outras. O nmero de protenas no-estruturais (e tambm estruturais) codicadas pelo genoma varia com a complexidade dos vrus. Os vrus mais simples codicam uma ou poucas protenas noestruturais, enquanto os poxvrus e herpesvrus codicam dezenas de protenas com atividades enzimticas e regulatrias, que desempenham funes diversas no seu ciclo replicativo. Embora estejam presentes nas partculas vricas de vrias famlias, protenas com atividade enzimtica so consideradas protenas no-estruturais.
4.2 Outras protenas

Protenas sem atividade enzimtica, mas que possuem participao no ciclo replicativo, tambm esto presentes nos vrions de algumas famlias. Os herpesvrus possuem, como parte do tegumento, a VP-16 (ou -TIF), que um transativador dos genes iniciais, e a VHS, uma protena que degrada os mRNA da clula hospedeira.
4.3 Lipdios
Os lipdios presentes nos envelopes virais so tipicamente os mesmos das membranas celulares, onde os vrions adquirem o seu envoltrio externo. Os envelopes originados da membrana plasmtica contm principalmente fosfolipdios (50-70%) e colesterol, enquanto os envelopes adquiridos em membranas celulares internas (nuclear, Golgi, RER) possuem pouco ou nenhum colesterol. Os lipdios constituem entre 20 e 35% da massa dos vrus envelopados.
4 Outros componentes dos vrions

4.1 Enzimas
Protenas com atividade enzimtica esto presentes nas partculas vricas de membros de vrias famlias de vrus DNA e RNA. Essas enzimas so necessrias para a sntese do cido nuclico viral e/ou para a biossntese de nucleotdeos e, geralmente, catalisam reaes nicas dos vrus, que no encontram fatores com funes similares nas clulas hospedeiras. Os vrus RNA de sentido negativo, por exemplo, trazem a enzima RNA polimerase (polimerase de RNA dependente de RNA) nos vrions. Os retrovrus trazem, nos vrions, a enzima transcriptase reversa (polimerase de DNA dependente de RNA; tambm polimerase de DNA dependente de DNA). Os hepadnavrus tambm trazem a enzima polimerase (polimerase de DNA dependente de DNA e tambm de RNA) nos vrions. Os poxvrus trazem, em seus vrions, enzimas RNA polimerases (com atividade equivalente s do hospedeiro), alm de enzimas que modicam o mRNA. Essas enzimas so necessrias para a realizao dessas funes no citoplasma, onde ocorre a replicao viral. Endonucleases (ortomixovrus), proteases (vrios vrus), quinases (hepadnavrus), integrase e ribonuclease (retrovrus) so exemplos de atividades enzimticas presentes em partculas virais. Os retrovrus complexos (exemplo: vrus da imunodecincia humana HIV) possuem protenas adicionais nos vrions, VPR e VIF, que so importantes para a replicao eciente em alguns tipos de clulas.
4.4 Carboidratos
Os carboidratos podem estar presentes em vrions como componentes de glicoprotenas, glicolipdios e mucopolissacardeos. Esses carboidratos esto presentes principalmente no envelope, mas os vrus complexos (poxvrus) tambm possuem carboidratos associados com protenas internas e/ou do capsdeo.
4.5 cidos nuclicos celulares

Alguns vrus podem ocasionalmente encapsidar em seus vrions, fragmentos de DNA cromossmico da clula hospedeira (poliomavrus). Os vrions dos retrovrus contm molculas de RNA transportador (tRNA) adquiridos da clula infectada. Esse tRNA desempenha um papel importante no incio do ciclo replicativo do vrus, pois serve de iniciador (primer) para a sntese da cadeia de DNA a partir do RNA genmico viral. Os vrions da famlia Arenaviridae contm ribossomos da clula hospedeira, o que lhes confere uma aparncia granular quando examinados sob
32
Captulo 1
ME (da a denominao da famlia, arena = areia). Os vrions dos ortomixovrus podem conter RNA ribossmico derivado das clulas hospedeiras.
4.6 Protenas celulares

No ncleo da clula hospedeira, o genoma DNA recm-replicado dos poliomavrus e papilomavrus associa-se com protenas celulares denominadas histonas (H), formando estruturas semelhantes cromatina celular. Essas estruturas, chamadas de minicromossomas, que contm o DNA viral, conjugado com as histonas H2A, H2B, H3 e H4, so encapsidadas durante a morfognese das partculas virais. Cabe ressaltar que cada vrion dos papilomavrus e poliomavrus contm uma cpia do genoma, ou seja, um minicromossoma. Os vrions dessas famlias, portanto, contm certa quantidade de protenas celulares.
os picornavrus podem ocasionalmente apresentar capsdeos vazios em razo da degradao do genoma; clulas infectadas com os hepadnavrus (vrus da hepatite B) produzem vrions completos (Dane particles) e tambm duas formas de partculas incompletas (partculas esfricas de 20 nm e partculas lamentosas) (Figura 1.13). As partculas incompletas so formadas por molculas da glicoprotena de superfcie (HbsAg), associadas com segmentos de membranas celulares. Para cada vrion completo, so produzidas entre 10.000 e 1.000.000 partculas esfricas. A abundncia dessas partculas no sangue de pessoas infectadas cronicamente tem sido utilizada como ferramenta para o diagnstico e, durante muitos anos, foi utilizada para a produo de vacinas.
5 Partculas vricas anmalas

Alm de partculas vricas completas e infectivas, a replicao de alguns vrus pode resultar na produo de uma quantidade varivel de partculas vricas anmalas, geralmente no-infecciosas. A freqncia e abundncia dessas partculas em relao aos vrions completos e infecciosos variam amplamente de acordo com o vrus. So muitas as causas da ausncia de infectividade nessas partculas, incluindo: ausncia do genoma viral. Clulas infectadas por poliomavrus podem produzir capsdeos vazios, sem o DNA genmico; outros capsdeos podem conter fragmentos de DNA celular. Essas partculas so denominadas pseudovrions; clulas infectadas por vrus de genoma RNA segmentado (ortomixovrus, por exemplo) podem produzir vrions com o conjunto incompleto dos segmentos genmicos; vrios vrus podem encapsidar genomas com delees em um ou mais genes. Os vrions que contm esses genomas defectivos so denominados partculas defectivas. Esses vrions no replicam autonomamente e somente so capazes de replicar quando ocorre uma co-infeco com um vrus homlogo infeccioso (denominado de vrus helper);
A. Fonte: adaptada de Flint et al. (2000). B. Fonte: Dr. Linda Stannard, www.uct.ac.za.
Figura 1.13. Partculas produzidas por clulas infectadas pelo vrus da hepatite B (hepadnavrus). A. Ilustrao esquemtica e B. fotografia de microscopia eletrnica. As partculas esfricas maiores com parede dupla so as partculas infecciosas (dane particles); as esfricas menores e as filamentosas so partculas defectivas, compostas por protenas de superfcie e pores de membranas celulares.
33
6 Propriedades fsico-qumicas
Vrios agentes fsicos e qumicos podem afetar a integridade funcional e infectividade dos vrions, incluindo a temperatura e o pH. A ao deletria da temperatura sobre a viabilidade dos vrus possui importncia durante a manipulao e remessa de material clnico para o diagnstico, como tambm para a preservao de estoques virais na rotina laboratorial. Alm disso, pode ser um fator limitante para a sua disseminao entre hospedeiros. Temperaturas de 55 a 60C desnaturam as protenas de superfcie, sobretudo as do envelope, em poucos minutos, tornando os vrions incapazes de interagir produtivamente com receptores celulares e iniciar a infeco. Temperaturas ambientais altas tambm afetam negativamente a infectividade dos vrus. Os vrus envelopados so geralmente muito mais sensveis ao deletria de altas temperaturas sobre a infectividade. Alguns vrus, como os paramixovrus, so particularmente susceptveis a temperaturas ambientais e tambm perdem a infectividade quando submetidos a congelamento e descongelamento. A conservao de vrus em suspenso lquida por longos perodos deve ser realizada a temperaturas de -70C ou em nitrognio lquido (-196C). Outra forma segura e eciente de armazenar vrus por longos perodos sem perder infectividade por meio de liolizao (dessecao a temperaturas de congelamento) e conservao do material liolizado (p) a 4C ou -20C. Para vrus em suspenso, temperaturas de 4 a 6C so compatveis com a preservao da infectividade apenas por horas ou poucos dias; temperaturas de 4 ou -20C no so indicadas para conservao por longos perodos. A resistncia a diferentes condies de pH varia amplamente; alguns vrus sem envelope (rotavrus, alguns picornavrus) mantm a infectividade mesmo em condies de pH cido e so chamados de cidoresistentes; outros, sobretudo os envelopados, so inativados j em pH um pouco abaixo do neutro (5 a 6) e so chamados de cido-lbeis. Agentes qumicos que possuem ao desnaturante sobre protenas e/ou solventes e detergentes lipdicos possuem ao deletria sobre a infectividade dos
vrus e muitos so utilizados como desinfetantes de materiais, equipamentos e ambientes. Em geral, os vrus sem envelope so muito mais resistentes a agentes qumicos e condies ambientais do que os vrus com envelope.
7 Bibliograa consultada
BAKER, T.S.; JOHNSON, J.E. Principles of virus structure determination. In: CHIU, W.; BURNETT, R.M.; GARCEA, R.L. (ed). Structural biology of viruses. New York, NY: Oxford University Press, 1997. p.38-79. CANN, A.J. Principles of molecular virology. 2. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1997. 310p. CASPAR, D.L.D.; KLUG, A. Physical principles in the construction of regular viruses. Cold spring harbor symposium on quantitative biology, v.27, p.1-24, 1962. CHAPMAN, M.S.; GIRANDA, V.L.; ROSSMANN, M.G. The structures of human rhinovirus and mengo virus: relevance to function and drug design. Seminars in virology, v.1, p.413-427, 1990. DULBECCO, R.; GINSBERG, H.S. Microbiologia de Davis: virologia. 2. ed. So Paulo: Harbra, 1980. v.4, 1763p. FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. GARCEA, R.L.; LIDDINGTON, R.C. Structural biology of polyomaviruses. In: CHIU, W.; BURNETT, R.M.; GARCEA, R.L. (eds). Structural biology of viruses. New York, NY: Oxford University Press, 1997. p.157-187. HARRISON, S.C. Principles of virus structure. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds.). Fields virology. 4. ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.3, p.53-85. HUNTER, E. Virus assembly. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.8, p.171-197. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. MURRAY, P.R. et al. Medical microbiology. 2. ed. St. Louis: Mosby Year Book, 1994, p.573. QUINN, P.J. et al. Clinical microbiology. London: Wolfe, 1994. 648p. RIXON, F.J. Structure and assembly of herpesviruses. Seminars in virology, v.4, p.135-144, 1993. ROSSMANN, M.G. et al. Structure of a human cold virus and structural relationship to other picornaviruses. Nature, v.317, p.145-153, 1985.
34
RYAN, K.J. Sherris medical microbiology: an introduction to infectious diseases. 3. ed. Norwalk, CT: Appleton & Lange, 1994. 890 p. STEWART, P.L.; BURNETT, R.M. The structure of adenovirus. Seminars in virology, v.1, p.477-487, 1990. WHITE, D.O.; FENNER, F. Medical virology. 4. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1994. 603 p. WILSON, J.A.T.; SKEHEL, T.S.; WILEY, D.C. Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of inuenza virus at 3A resolution. Nature, v.289, p.366-373, 1981.
Captulo 1
WIMMER, E. Cellular receptors for animal viruses. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. 526p. WISE, D.J.; CARTER, G.R.; FLORES, E.F. General characteristics, structure and taxonomy of viruses. In: CARTER, G.R., WISE, D. J.; FLORES; E.F. (Eds.). A concise review of veterinary virology. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: <http://www.ivis.org>. Acesso em: 20 set. 2006.
Anexos
Tabela 1.1. Caractersticas morfolgico-estruturais dos vrions e do genoma dos vrus DNA
Famlia Capsdeo Envelope Dimenses e morfologia do vrions Caractersticas do genoma
FITA SIMPLES
Circoviridae
Icosadrico
No
15-22 nm, esfrico-icosadricos
DNA de cadeia simples, circular, 1.7-2,2kb
Parvoviridae
Icosadrico
No
25nm, icosadricos
DNA de cadeia simples, linear, seqncias complementares nas extremidades, flexionadas sobre si (hairpins), 5 kb DNA de cadeia dupla, circular, superenrolada, 5 kb
Polyomaviridae
Icosadrico
No
45nm, esfrico-icosadricos
Papillomaviridae
Icosadrico
No
55nm, esfrico-icosadricos
DNA de cadeia dupla, circular, superenrolada, 8 kb
Adenoviridae
Icosadrico
No
80-110nm, icosadricos
DNA de cadeia dupla, linear, com uma protena nas extremidades, 30-44 kb
FITA DUPLA
Herpesviridae
Icosadrico
Sim
120-200 nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos
DNA de cadeia dupla, linear, 120-235 kb
Poxviridae
Complexo
Sim
170- 200 x 300-450nm, ovides/retangulares
DNA de cadeia dupla, linear e contnua, 130-375 kb
Iridoviridae/ Asfaviridae
Complexo
Sim
175-215nm, quase esfricos ou com aspecto de prismas hexagonais
DNA de cadeia dupla, linear e contnua, 170-190kb DNA de cadeia parcialmente dupla (3/4), com as extremidades pareando entre si (pseudo-circular), 3.2 kb
Hepadnaviridae
Icosadrico
Sim
40-48nm, esfricos, ocasionalmente pleomrficos, partculas subvirais em excesso
35
Tabela 1.2. Caractersticas morfolgico-estruturais dos vrions e do genoma dos vrus RNA
Famlia Capsdeo Envelope Dimenses e morfologia do vrions Caractersticas do genoma
duas cpias idnticas de RNA, cadeia simples (+), linear, 7-11kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'IRES, 3'polyA, 7.2 8.5kb RNA de cadeia simples (+), linear, protena na ext. 5, 3'polyA, 7.4 -7.7kb RNA de cadeia simples (+), linear, 3'polyA, 7.2-7.9kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap, 3'polyA, 20-32kb
Retroviridae
Icosadrico
Sim
80-100nm, esfricos
Picornaviridae
Icosadrico
No
28-30nm, esfrico-icosadricos 30-38nm, esfrico-icosadricos
Caliciviridae
Icosadrico
No
POLARIDADE POSITIVA
Astroviridae
Icosadrico
No
28-30nm, esfricos
Coronaviridae
Helicoidal
Sim
80-220nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos
Arteriviridae
Icosadrico
Sim
50-70nm, aproximadamente esfricos
RNA de cadeia simples (+), linear ,5'cap, 3' polyA, 15kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap, 3'polyA, 9.711.8kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap/IRES, 3'polyA/poliC, 9.5-12.5kb RNA de cadeia simples (-), linear, 15-16kb
Togaviridae
Icosadrico
Sim
70nm, esfricos
Flaviviridae
Icosadrico
Sim
45-60nm, esfrico
FITA SIMPLES
Paramyxoviridae
Helicoidal
Sim
150-300nm, pleomrficos, aproximadamente esfricos, filamentosos
Rhabdoviridae
Helicoidal
Sim
70-85 x 130-380 nm, forma de projtil
RNA de cadeia simples (-), linear, 13-16kb
POLARIDADE NEGATIVA
Filoviridae
Helicoidal
Sim
80 x 780-970nm (at 14.000), pleomrficos (filamentosos, forma de U ou 6
RNA de cadeia simples (-), linear, 19.1kb
Bornaviridae
Sim
90nm, esfricos (?)
RNA de cadeia simples (-), linear, 8.9kb 6 a 8 segmentos de RNA de cadeia simples, (-), lineares, extremidades complementares permitem circularizao, 10-13.6kb 3 segmentos de RNA de cadeia simples (-), lineares, extremidades complementares permitem circularizao, 11-21kb 2 segmentos de RNA de cadeia simples (-), lineares, 10-14kb 2 segmentos de RNA de cadeia dupla, lineares, 5.7-5.9kb 10, 11 ou 12 segmentos de RNA de cadeia dupla, lineares, 16-27kb
Orthomyxoviridae
Helicoidal
Sim
80-120nm, ovides, filamentosos, aproximadamente esfricos, pleomrficos
Bunyaviridae
Helicoidal
Sim
80-120nm, pleomrficos ou esfricos.
Arenaviridae
Helicoidal
Sim
50 x 300nm , esfricos ou pleomrficos
FITA DUPLA
Birnaviridae
Icosadrica
No
60nm, icosadricos
Reoviridae
Icosadrica
No
60-80nm, aproximadamente esfricos
CLASSIFICAO E NOMENCLATURA DOS VRUS

Luciane Teresinha Lovato
2
39 39 41 41 42
42 42 43 44 44 45 46 46 47 47 48 48 49 49 50 50 51 51 52 52 52 53 54
1 Introduo 2 Taxonomia dos vrus 3 Nomenclatura dos vrus 4 Critrios utilizados para a classicao dos vrus 5 Famlias de vrus
5.1 Vrus com genoma DNA 5.1.1 Poxviridae 5.1.2 Asfarviridae 5.1.3 Herpesviridae 5.1.4 Adenoviridae 5.1.5 Papillomaviridae 5.1.6 Polyomaviridae 5.1.7 Parvoviridae 5.1.8 Circoviridae 5.1.9 Hepadnaviridae 5.2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo 5.2.1 Picornaviridae 5.2.2 Caliciviridae 5.2.3 Astroviridae 5.2.4 Togaviridae 5.2.5 Flaviviridae 5.2.6 Coronaviridae 5.2.7 Arteriviridae 5.3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo no-segmentado 5.3.1 Paramyxoviridae 5.3.2 Rhabdoviridae 5.3.3 Filoviridae 5.3.4 Bornaviridae
5.4 Vrus com genoma RNA de sentido negativo segmentado 5.4.1 Orthomyxoviridae 5.4.2 Bunyaviridae 5.4.3 Arenaviridae 5.5 Vrus com genoma RNA de ta dupla 5.5.1 Reoviridae 5.5.2 Birnaviridae 5.6 Vrus com genoma RNA que realizam transcrio reversa 5.6.1 Retroviridae
54 54 54 55 56 56 56 57 57
57
1 Introduo
Existe um nmero muito grande de vrus circulando nas diferentes espcies de seres vivos, desde vrus que infectam bactrias at aqueles que infectam organismos superiores, como os mamferos e plantas. Dentre estes, existem vrus altamente patognicos e outros que no causam doena nos seus hospedeiros, passando despercebidos. Atualmente, so reconhecidas mais de 1.500 espcies de vrus, que abrangem mais de 30.000 cepas, isoladas ou variantes. A classicao e nomenclatura dos vrus no seguem as regras determinadas para os demais microorganismos. medida que foram sendo identicados, os vrus foram sendo agrupados de forma aleatria, de acordo com os aspectos considerados mais importantes pelos grupos que os identicavam. Nas dcadas de 1950 e 1960, houve um grande avano na Virologia, resultando na identicao de um grande nmero de novos vrus. Com o intuito de determinar regras bsicas para classicar esses vrus, vrios comits foram formados, o que acabou gerando uma grande confuso taxonmica. Durante o Congresso Internacional de Microbiologia, realizado em Moscou, em 1966, foi criado o Comit Internacional para Nomenclatura de Vrus (ICTV). Esse comit teve a incumbncia de desenvolver um sistema nico de classicao e nomenclatura para todos os vrus. At hoje, o ICTV o rgo que determina as regras a serem seguidas para a classicao dos vrus at o nvel de espcie. Esse comit se rene periodicamente, com o m de revisar e atualizar os critrios de classicao, de modo que as novas descobertas biolgicas e moleculares possam ser incorporadas aos critrios taxonmicos j existentes. Com isso, a classicao dos vrus nas diversas hierarquias tornou-se dinmica e pode ser alterada medida que novas informaes biolgicas ou moleculares assim o justiquem. A classicao apresentada neste texto est de acordo com a ltima reviso do ICTV, datada de 07 de julho de 2007.
2 Taxonomia dos vrus

De acordo com os vrios critrios adotados, os vrus so classicados hierarquicamente em ordens, famlias, subfamlias, gneros e espcies. O suxo virales utilizado para designar a ordem. Para a denominao de famlia, utiliza-se o suxo viridae; para subfamlia, utiliza-se virinae; e para gnero, o suxo virus. Por exemplo, o vrus da cinomose canina est classicado na ordem Mononegavirales, famlia Paramyxoviridae, subfamlia Paramyxovirinae, gnero Morbillivirus e, nalmente, espcie, como vrus da cinomose canina (canine distemper virus, CDV). As famlias so os agrupamentos fundamentais dos vrus, agrupando agentes que possuem caractersticas estruturais, morfolgicas, genticas e biolgicas em comum. Algumas famlias a minoria so agrupadas em nveis hierrquicos superiores: as ordens. Da mesma forma, nem todas as famlias so divididas em subfamlias; algumas delas apresentam o gnero como nvel hierrquico imediatamente inferior, ou seja, nem todos os vrus so classicados em todos os nveis hierrquicos possveis, possuindo complexidades de classicao diferentes entre si. Os vrus que apresentam algumas caractersticas biolgicas, estruturais e moleculares em comum so agrupados em uma mesma famlia. Por exemplo, todos os membros da famlia Herpesviridae possuem vrions grandes, com envelope contendo vrias glicoprotenas, capsdeo icosadrico, uma camada protica denominada tegumento entre o capsdeo e o envelope. O genoma composto por uma molcula de DNA de ta dupla linear. Esses vrus so capazes de estabelecer infeces latentes em seus hospedeiros. Os vrus que apresentam essas caractersticas (e que por isso compem a famlia Herpesviridae) podem ser subdivididos em subfamlias, de acordo com algumas caractersticas que possuem em comum e que so diferentes dos outros vrus da famlia. Os membros da subfamlia Alphaherpesvirinae possuem um amplo espectro de hospedeiros, apresentam um ciclo rpido e ltico em clu-
40
Captulo 2
las de cultivo e estabelecem infeces latentes em neurnios sensoriais e autonmicos. Essas caractersticas diferem dos membros das outras subfamlias: Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Os vrus de uma famlia ou de uma subfamlia podem ser divididos em gneros, de acordo com propriedades biolgicas, e, principalmente, moleculares, como a estrutura e organizao genmica: a subfamlia Alphaherpesvirinae possui dois gneros, o Simplexvirus e o Varicellovirus. Dentro de cada gnero se encontram as espcies, que so grupos de vrus muito semelhantes entre si (a exemplo de espcies de animais), mas que apresentam algumas diferenas que justicam a sua classicao como vrus diferentes (e tambm diferentes dos vrus do outro gnero). Por exemplo, no gnero Varicellovirus, encontram-se classicados os herpesvrus bovinos tipos 1 e 5 (BoHV-1 e BoHV-5), o herpesvrus suno (SuHV1) ou vrus da doena de Aujeszky (PRV), entre outros. A classicao dos vrus em espcies no consensual entre os virologistas. A denio de espcie aceita pelo ICTV foi estabelecida em 1991 e diz o seguinte: espcie de vrus uma classe polythetic1 de vrus que constitui uma linhagem replicativa e ocupa um nicho ecolgico particular. Uma classe polythetic denida em termos de um amplo grupo de critrios sendo que nenhum dos critrios isoladamente necessrio ou suciente. Dessa forma, cada membro da classe deve possuir um nmero mnimo de caractersticas, mas nenhum dos aspectos necessita ser encontrado em todos os membros de uma classe. Assim, diferentes caractersticas podem ser usadas em diferentes grupos de vrus. A classicao em subespcies, cepas, variantes e isolados no existe de forma ocial, embora seja reconhecida a sua importncia para o diagnstico, para estudos biolgicos e moleculares e tambm para a produo de vacinas. A seguir so apresentadas algumas denies desses termos. O termo isolado (ou amostra) refere-se a um vrus que foi obtido por isolamento de uma determinada fonte de infeco (animal infectado),
A traduo para o termo polythetic no consta em dicionrios ociais; por esta razo o termo foi escrito na sua forma original e a denio colocada logo em seguida no texto.
1
por exemplo: o SV-299/04 um BoHV-5 isolado do crebro de um bovino que desenvolveu meningoencefalite no estado do Rio Grande do Sul. A denominao SV-299/04 foi dada pelo laboratrio que realizou o isolamento do vrus e referese ao nmero do protocolo. Qualquer vrus que tenha sido isolado de material clnico e sobre o qual se conhea pouco, alm de sua identidade, constitui-se em um isolado ou amostra. O termo cepa utilizado para designar amostras de vrus que j foram bem caracterizadas e sobre as quais j se possui certo conhecimento. A denominao cepa tambm pode ser utilizada para se referir a isolados de um vrus que podem apresentar pequenas variaes sem deixar de pertencer s mesmas categorias taxonmicas. Por exemplo, o vrus da doena de Newcastle (NDV) pode apresentar diferentes nveis de virulncia, dependendo da cepa do vrus que est causando a doena. Existem trs cepas desse vrus em ordem crescente de virulncia: as lentognicas, as mesognicas e as velognicas. Assim, aqueles isolados do vrus que apresentam alta virulncia pertencem cepa velognica, os que apresentam virulncia moderada so mesognicos, e os de baixa virulncia so os lentognicos. Cepas de referncia so cepas amplamente caracterizadas e reconhecidas nacional ou internacionalmente, que so utilizadas como referncia para determinado vrus em testes de diagnstico, pesquisa e para a produo de vacinas. Por exemplo, a cepa Cooper do BoHV-1 serve de referncia para comparaes de isolados desse vrus e amplamente utilizada em diagnstico e na produo de vacinas. A terminologia wild-type refere-se cepa original do vrus que circula na natureza. No caso da existncia de mutantes, o wild-type a cepa que deu origem aos mutantes. Em portugus, utilizam-se os termos cepa de campo (ou vrus de campo), no caso dos vrus circulantes na populao; e cepa original ou parental no caso da produo e/ou comparao com mutantes. Variantes ou mutantes so vrus que diferem do wild-type em alguma caracterstica fenotpica, como, por exemplo, o vrus da vacina contra a doena de Aujeszky um mutante de deleo que foi produzido a partir da cepa Bartha do herpesvrus suno tipo 1 (SuHV-1).
Classicao e nomenclatura dos vrus
41
3 Nomenclatura dos vrus

No uso formal, as palavras que designam as famlias, subfamlias e gneros devem iniciar com letra maiscula e devem ser escritas em itlico ou sublinhadas. O nome da espcie do vrus no deve iniciar com letra maiscula (a no ser que este nome corresponda a um nome prprio de regio, cidade etc.) e deve ser escrito com fonte normal, sem itlico. No uso formal, a hierarquia (txon) deve preceder a unidade taxonmica. Exemplo: a famlia Parvoviridae; o gnero Parvovirus. No uso informal (ou vernacular) os termos referentes famlia, subfamlia, gnero e espcie devem ser escritos com letras minsculas, sem itlico ou sublinhado. Neste caso, o suxo formal no includo e o nome do txon segue o termo usado para denir a unidade taxonmica. Escreve-se ento: a famlia dos poxvrus, o gnero parapoxvirus. O uso informal em portugus deve suprimir letras que no existam no alfabeto da lngua portuguesa. Exemplo: para se referir de forma vernacular aos membros da subfamlia Alphaherpesvirinae, deve-se escrever: os alfaherpesvirus. Os membros da famlia Orthomyxoviridae devem ser tratados como os ortomixovrus. No uso informal, o nome do txon , muitas vezes, suprimido, o que pode resultar em confuses. Isto se deve raiz comum das palavras utilizadas para denir as unidades taxonmicas nos diferentes nveis. Dessa forma, dependendo do contexto, a palavra avivrus pode estar sendo usada para referir-se tanto famlia Flaviviridae como ao gnero Flavivirus. Para evitar essa ambigidade, aconselha-se o uso do txon precedendo o termo usado. Exemplo: vrus do gnero Flavivirus. A nomenclatura ocial dos vrus utiliza abreviaturas, que so constitudas pelas iniciais do nome da espcie viral. No presente texto, sero utilizadas as abreviaturas derivadas da nomenclatura na lngua inglesa, por exemplo, herpesvrus bovino tipo 1 (do ingls bovine herpesvirus type 1, BoHV-1). No uso informal, muitos vrus podem ser denominados de duas ou trs formas diferentes,
de acordo com a sua denominao original e com a nomenclatura ocial preconizada pelo ICTV. As recomendaes do ICTV so de que a sua nomenclatura substitua as anteriores, embora alguns deles continuem a ser denominados pela nomenclatura tradicional. Citam-se como exemplos o SuHV-1, que tambm conhecido como vrus da doena de Aujeszky (ADV) ou vrus da pseudoraiva (PRV), e o BoHV-1, que tambm conhecido como vrus da rinotraquete infecciosa bovina (IBRV). Exemplos de nomenclatura de vrus: a) Formal: famlia: Picornaviridae; gnero: Aphtovirus; espcie: vrus da febre aftosa (foot and mouth disease vrus, FMDV); Vernacular: Os aftovrus so sensveis ao pH baixo [...]. b) Formal: famlia: Herpesviridae, subfamlia: Alphaherpesvirinae, gnero: Alphaherpesvirus, espcie: herpesvrus suno tipo 1 (vrus da doena de Aujezsky); Vernacular: O vrus da doena de Aujeszky um alfaherpesvrus [...]. c) Formal: ordem: Mononegavirales; famlia: Paramyxoviridae; subfamlia: Pneumovirinae; gnero: Pneumovirus, espcie: vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV); Vernacular: Os pneumovrus causam doena respiratria [...]. d) Formal: famlia: Flaviviridae; gnero: Flavivirus; espcie: vrus da febre amarela (YFV); Vernacular: O vrus da febre amarela um avivrus transmitido por mosquitos.
4 Critrios utilizados para a classicao dos vrus

A evoluo nos mtodos de deteco e caracterizao dos vrus determinou uma evoluo nos critrios utilizados para a sua classicao. A diferenciao entre vrus e os demais microorganismos foi o primeiro passo na classicao dos agentes virais e essa diferena foi determinada, inicialmente, pela ltrabilidade dos vrus. Enquanto as bactrias eram retidas no ltro, os vrus passavam por ele, surgindo a denominao de agentes ltrveis.
42
Captulo 2
No incio, as caractersticas ecolgicas e de transmisso, sinais clnicos da doena e tropismo por determinado rgo ou tecido foram os critrios utilizados na classicao dos vrus. O desenvolvimento da microscopia eletrnica possibilitou a classicao de acordo com a morfologia das partculas virais. Ao longo dessa evoluo, outras caractersticas foram sendo mais conhecidas e consideradas para descrever os vrus. Aspectos como a composio qumica, o tipo de genoma, distribuio geogrca, vetores, estabilidade e antigenicidade dos vrus foram adquirindo importncia. Atualmente as tcnicas de biologia molecular tm sido utilizadas para renar e detalhar a classicao dos vrus, especialmente o seqenciamento e comparao entre seqncias do genoma. Estratgias de expresso gnica, homologia de nucleotdeos entre seqncias correspondentes, estrutura e funes de protenas virais tambm foram incorporadas aos critrios de classicao dos vrus. De acordo com o ICTV, as seguintes caractersticas so atualmente levadas em considerao para classicar os vrus em ordem, famlias, subfamlias e gneros: tipo de cido nuclico e organizao do genoma, estratgia de replicao e estrutura do vrion. A classicao em espcies, embora no regulamentada pelo ICTV, segue os seguintes critrios: a) homologia da seqncia do genoma; b) hospedeiros naturais; c) tropismo de tecido e clulas; d) patogenicidade e citopatologia; e) forma de transmisso; f) propriedades fsico-qumicas; g) propriedades antignicas. Uma outra classicao prtica, no ocial, regularmente usada entre os virologistas. Nesse caso, so levados em considerao os critrios epidemiolgicos e/ou clnico-patolgicos para agrupar os vrus. De acordo com esse critrio, os vrus so classicados em: a) respiratrios: vrus que penetram no hospedeiro por inalao e produzem infeco e doena primariamente no trato respiratrio. Ex: rinovrus, calicivrus;
b) entricos: vrus que penetram pela via oral e replicam no trato intestinal. Ex: coronavrus, rotavrus; c) arbovrus: vrus que replicam e so transmitidos por vetores artrpodos. Ex: vrus da encefalites eqinas leste e oeste; d) vrus oncognicos: vrus com potencial para induzir transformao celular e tumores nos hospedeiros. Ex: retrovrus, papilomavrus.
5 Famlias de vrus
A seguir sero apresentadas as famlias de vrus que contm patgenos de animais (Figuras 2.1 a 2.25). Em cada gnero, sero mencionados os principais vrus que causam doenas em animais de interesse para a medicina veterinria, ou seja, animais de produo e animais de companhia. Tambm sero citados os principais patgenos humanos. Cabe ressaltar, por essa razo, que esta lista no se constitui na relao completa dos vrus de cada famlia.
5.1 Vrus com genoma DNA 5.1.1 Famlia: Poxviridae

Subfamlia: Chordopoxvirinae (infectam vertebrados) Gneros: Orthopoxvirus: vrus da vaccinia (VACV), poxvrus bovino (varola bovina), vrus da ectromelia (camundongos); Parapoxvirus: vrus do ectima contagioso dos ovinos (ORFV), vrus da estomatite papular bovina (BPSV); Avipoxvirus: vrus da bouba aviria (FWPV), poxvrus do canrio (CNPV); Capripoxvirus: poxvrus dos caprinos (GTPV), poxvrus dos ovinos (SPPV), vrus da doena Lumpy Skin (LSDV); Leporipoxvirus: vrus do mixoma de coelhos (MYXV), vrus do broma de coelhos (RFV); Suipoxvirus: poxvrus suno (SWPV); Molluscipoxvirus: vrus do molusco contagioso (MOCV); Yatapoxvirus: vrus Tanapox (TANV) e Yatapox dos macacos (YMTV).
43
Subfamlia: Entomopoxvirinae (infectam insetos) Gneros: Alphaentomopoxvirus; Betaentomopoxvirus; Gammaentomopoxvirus. Os poxvrus so os maiores vrus de animais. Os vrions possuem uma forma retangular ou ovide, com simetria complexa e, geralmente, possuem envelope lipdico (algumas partculas podem no possuir). As dimenses das partculas virais podem variar de 220 a 450 nm de extenso x 140 a 260 nm de largura x 140 a 260 nm de espessura. O genoma consiste de uma nica molcula de DNA, linear, cadeia dupla, com 130 a 375 kbp. Esses vrus trazem, nos vrions, um nmero considervel de enzimas e fatores auxiliares; e realizam o ciclo replicativo inteiramente no citoplasma das clulas hospedeiras. A maioria das doenas produzidas por esses vrus caracteriza-se pela formao de leses vesiculares e crostosas na pele e/ou mucosas dos animais. O vrus da varola humana (smallpox) o mais importante vrus dessa famlia. Dentre os patgenos de animais domsticos, o mais comum em nosso meio o ORFV, uma doena caracterizada por leses vesiculares e pustulares na regio dos lbios, narinas e cascos.
5.1.2 Famlia: Asfarviridae

Gnero: Asvirus Espcie: vrus da peste suna africana (AFSV).
Fonte: Dra Sharon Brookes, Pirbright, UK (ICTVdB).
Figura 2.2. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Asfarviridae(ASFV).
Fonte: Dr Stewart McNulty (web.qub.ac.uk).
Figura 2.1. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Poxviridae.
O ASFV o nico vrus classicado nessa famlia. Os vrions do ASFV possuem envelope lipoprotico e um capsdeo icosadrico formado por 1.892 a 2.172 unidades estruturais. O dimetro das partculas virais varia entre 175 e 215 nm. O genoma consiste de uma molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 170 a 190 kb. O vrus replica no citoplasma da clula hospedeira. O ASFV transmitido por carrapatos do gnero Ornithodoros, constituindo-se no nico arbovrus entre os vrus DNA. Esse vrus mantido na natureza em sudeos selvagens e, ocasionalmente, transmitido aos sunos domsticos. O vrus encontrado na frica, mas j foi esporadicamente introduzido na Europa, onde causou doena em sunos de alguns pases. A peste suna africana caracterizada pela produo de hemorragias, principalmente nos rgos linfides. O nico relato da doena no Brasil ocorreu em 1978, no Rio de Janeiro. Atualmente o ASFV considerado extico no Pas.
44
Captulo 2
5.1.3 Famlia: Herpesviridae

Subfamlia: Alphaherpesvirinae Gneros: Simplexvirus: herpesvrus bovino tipo 2 (BoHV-2) ou vrus da mamilite herptica (BMH), herpesvrus B (macacos), vrus do herpes simplex humano (HSV-1, HSV-2); Varicellovirus: BoHV-1 ou vrus da rinotraquete (IBRV), BoHV-5, SHV-1 ou PRV, herpesvrus eqino tipos 1, 3 e 4 (EHV-1, EHV-3, EHV-4), herpesvrus canino 1 (CaHV-1), herpesvrus felino tipo 1 (vrus da rinotraquete felina, FeHV-1), herpesvrus caprino tipo 1 (CpHV-1); Mardivirus: vrus da doena de Marek; Iltovirus: vrus da laringotraquete infecciosa das galinhas (ILTV); Subfamlia: Betaherpesvirinae Gneros: Cytomegalovirus: citomegalovrus suno; Muromegalovirus: citomegalovrus do camundongo 1; Roseolovirus: herpesvrus humano 6 (HHV6). Vrios betaherpesvrus animais ainda no foram classicados em gneros. Subfamlia: Gammaherpesvirinae Gneros: Linphocriptovirus: vrus Epstein-Barr (EBV) humano; Rhadinovirus: vrus da febre catarral maligna (MCFV); Ictalurivirus: herpesvrus do catsh de canal. A famlia Herpesviridae abriga um grupo grande e diverso de vrus encontrados em virtualmente todas as espcies de vertebrados. Os vrions contm envelope, capsdeo icosadrico e o dimetro pode variar entre 120 e 300 nm. Entre o capsdeo e o envelope, existe uma camada protica denominada tegumento. O genoma consiste de uma molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 120 a 250 kb. Os vrus dessa famlia possuem uma importante propriedade biolgica em comum, que a capacidade de estabelecer infeces latentes nos seus hospedeiros. Embora todos os herpesvrus apresentem algumas caractersticas em comum, os vrus das trs subfamlias apresen-
tam diferenas biolgicas e moleculares. Os vrus da subfamlia Alphaherpesvirinae apresentam um ciclo replicativo rpido e ltico em cultivo celular, estabelecem infeces latentes em neurnios e produzem leses vesiculares em membranas mucosas. Vrios vrus animais so classicados nessa subfamlia, cujo prottipo o HSV-1. Os vrus da subfamlia Betaherpesvirinae apresentam uma replicao lenta em cultivo celular e estabelecem infeces latentes em glndulas secretrias e no tecido linforeticular. O herpesvrus humano tipo 5 (HHV-5) ou citomegalovrus humano (CMV) o prottipo dessa subfamlia. Os vrus da subfamlia Gammaherpesvirinae infectam linfcitos de forma ltica ou latente e alguns deles possuem potencial oncognico. Nesta subfamlia, est classicado apenas um patgeno de animais, o MCFV, uma doena sistmica de bovinos. O EBV, agente de mononucleose e tumores em humanos, o prottipo dessa subfamlia.
Fonte: Dra Linda Stannard (web.uct.ac.za).
Figura 2.3. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Herpesviridae (HSV-1).
5.1.4 Famlia: Adenoviridae

Gneros: Mastadenovirus: vrus da hepatite infecciosa canina (CAdV-1), vrus da traqueobronquite infecciosa canina (CAdV-2), adenovrus sunos (SAV-1-9), adenovrus bovinos (BAV-1-9), adenovrus eqino (EAV-1 e 2); Aviadenovirus: vrus da sndrome da queda de postura; Atadenovirus: adenovrus ovino D; Siadenovirus: adenovrus dos perus B.
45
Fonte: Dra Cornelia Bchen-Osmond (ICTVdB).
Figura 2.4. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Adenoviridae.
Os adenovrus possuem vrions icosadricos grandes (dimetro de 80 a 100 nm), sem envelope e apresentam bras de 9 a 35 nm nos vrtices. O capsdeo envolve uma nica molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 36 a 44 kb. Os adenovrus replicam no ncleo das clulas hospedeiras e, como alguns outros vrus DNA, a transcrio dos genes realizada pela maquinaria clula e ocorre de forma ordenada. Alguns produtos dos genes virais interferem com o controle do ciclo celular, e alguns adenovrus possuem potencial oncognico. O vrus tambm codica produtos que antagonizam os mecanismos inatos da resposta imunolgica. Os adenovrus so encontrados em humanos, diversas espcies de mamferos e aves e, em geral, so pouco patognicos. Quando associados com manifestaes clnicas, geralmente esto envolvidos em sinais respiratrios leves em animais e humanos. A doena de maior repercusso causada por esses vrus em animais provavelmente seja a hepatite infecciosa canina. Os adenovrus tm sido intensivamente estudados como vetores para terapia gentica e vacinas.
Deltapapillomavirus: papilomavrus do alce europeu (EEPV), papilomavrus de cervdeos (DPV), papilomavrus bovino (BPV-1 e BPV-2) e papilomavrus ovino (OvPV-1 e OvPV-2); Epsilonpapillomavirus: papilomavrus bovino tipo 5 (BPV-5); Zetapapillomavirus: papilomavrus eqino 1 (EcPV-1); Etapapillomavirus: papilomavrus de aves (FcPV); Thetapapillomavirus: papilomavrus dos psitacdeos (PePV); Iotapapillomavirus: papilomavrus dos Mastomys natalensis (MNPV); Kappapapillomavirus: papilomavrus dos coelhos (CRPV e ROPV); Lambdapapillomavirus: papilomavrus oral canino (COPV), papilomavrus felino (FDPV); Mupapillomavirus: papilomavrus humano (HPV-1 e HPV-63); Nupapillomavirus: papilomavrus humano 41 (HPV-41); Pipapillomavirus: papilomavrus oral do hamster (HaOPV); Xipapillomavirus: papilomavrus bovinos (BPV-3, BPV-4 e BPV-6); Omikronpapillomavirus: papilomavirus dos cetceos (PsPV).
5.1.5 Famlia: Papillomaviridae

Fonte: www.oralcancerfoundation.org
Gneros: Alphapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-32); Betapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-5); Gammapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-4);
Figura 2.5. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Papillomaviridae (Papilomavrus humano).
Os papilomavrus so vrus pequenos, sem envelope, com 52 a 55 nm de dimetro e simetria icosadrica. O capsdeo formado por 72 cap-
46
Captulo 2
smeros, envolvendo o DNA circular de cadeia dupla de aproximadamente 8 kbp. Os vrus replicam no ncleo de clulas epiteliais do tecido descamativo, e as sucessivas etapas da replicao ocorrem em clulas com estgios diferentes de diferenciao. As etapas nais da replicao ocorrem apenas nas clulas maduras das camadas granulosa e crnea da pele. Os papilomavrus so agentes etiolgicos dos papilomas, tambm denominados verrugas, que consistem em leses nodulares na pele e mucosas de animais e humanos. Alguns desses vrus podem induzir a produo de tumores malignos. Esse problema particularmente importante no caso das verrugas genitais humanas, tambm conhecidas como condilomas. Existem mais de 60 sorotipos diferentes de papilomavrus causando doenas em humanos, e alguns deles so considerados de alto risco para a produo de tumores, como o caso dos HPV 16 e HPV 18, que esto envolvidos no desenvolvimento de cncer de colo de tero em mulheres. As espcies bovina, eqina e canina so as mais freqentemente afetadas por papilomas, no entanto, o desenvolvimento de tumores malignos nessas espcies no comum. A participao de papilomavrus na induo de tumores em animais parece ser limitada ao carcinoma de esfago, induzido pela ingesto de samambaia em bovinos.
vrus prottipos: Pa (papilomavrus de coelhos); po (poliomavrus de camundongos) e va (agente vacuolizante, SV-40). Atualmente, os poliomavrus e o prottipo SV-40 so classicados separadamente, na famlia Polyomaviridae. O interesse maior nesses vrus iniciou-se com a descoberta de que o SV-40 e outros poliomavrus eram capazes de produzir tumores em hamsters (por isso foram denominados pequenos vrus DNA tumorais). Embora estudos extensivos realizados durante dcadas no tenham sido capazes de demonstrar associao entre o SV-40 e tumores humanos, estudos recentes demonstraram a presena de seqncias de DNA e antgenos do SV-40 em certos tumores raros em humanos, renovando o interesse por esse vrus. Os poliomavrus foram muito estudados como modelos para Virologia e biologia molecular. O prottipo da famlia o SV-40, um vrus encontrado como contaminante de vacinas contra a poliomielite nos anos 1950.
5.1.6 Famlia: Polyomaviridae

Gnero: Polyomavirus: vrus smio 40 (SV-40), poliomavrus de camundongos (PoV), vrus BK (humanos), vrus JC (humanos), vrios poliomavrus de mamferos e aves. Os poliomavrus esto entre os menores vrus DNA. Possuem vrions icosadrico-esfricos com 45 nm, sem envelope, e uma molcula de DNA de ta dupla circular como genoma (5 kb). Os vrions so compostos por 72 capsmeros, formados por trs protenas: VP1, VP2 e VP3. O genoma est associado com histonas celulares, formando uma estrutura semelhante cromatina celular. A famlia Polyomaviridae era classicada anteriormente como uma subfamlia da Papovaviridae, cuja denominao derivava dos
Fonte: PHIL Library, CDC.
Figura 2.6. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Polyomaviridae.
5.1.7 Famlia: Parvoviridae

Subfamlia: Parvovirinae Gneros: Parvovirus; Patgenos animais: parvovrus canino tipos 1 e 2 (CPV-1; CPV-2), parvovrus felino (vrus da panleucopenia felina, FPLV), parvovrus suno (PPV), parvovrus bovino (BPV); Erythrovirus: vrus B19 humano;
47
Dependovirus: vrus adeno-associado 2 (AAV); Amdovirus: Aleutian mink disease virus; Bocavirus: parvovrus bovino, vrus minuto dos ces.
tivas na suinocultura. O parvovrus humano B-16 tem sido associado com abortos em mulheres.
5.1.8 Famlia: Circoviridae

Gneros: Circovirus: circovrus suno tipos 1 e 2 (PCV-1; PCV-2), vrus da doena das penas e bicos dos psitacdeos (BFDV), circovrus dos pombos (PiCV), circovrus dos gansos (GoCV), circovrus do canrio (CaCV); Gyrovirus: vrus da anemia das galinhas (CAV). Os vrus dessa famlia so os menores vrus conhecidos que infectam animais. O dimetro dos vrions, que no possuem envelope, pode variar entre 17 e 22 nm. Esses vrions apresentam uma aparncia esfrica microscopia eletrnica. O ncleo do vrion formado por uma molcula de DNA circular de cadeia simples. A replicao viral ocorre no ncleo da clula hospedeira, na fase S do ciclo celular. Essa famlia possui um nmero pequeno de patgenos animais, entre os quais o agente da CAV e o vrus da doena debilitante dos leites (PCV-2). Circovrus tambm j foram identicados em humanos.
Figura 2.7. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Parvoviridae.
Subfamlia: Densovirinae Gneros: Densovirus: densovrus da Junonia coenia; Iteravirus: densovrus da Bombyx mori; Brevidensovirus: densovrus do mosquito Aedes aegypti; Pefudensovirus: densovrus da Periplaneta fuliginosa. Os parvovrus so vrus muito pequenos e, at h pouco tempo, eram considerados os menores vrus de animais e/ou humanos. Os vrions possuem um dimetro de 25 nm, no possuem envelope e apresentam uma aparncia esfrica microscopia eletrnica. Os vrus dessa famlia apresentam um DNA de cadeia simples linear de, aproximadamente, 5.2 kb. Alguns membros dessa famlia necessitam de uma co-infeco viral para realizar a sua replicao (Dependovirus), o que no o caso do gnero Parvovirus, no qual esto classicados importantes patgenos de animais e humanos. A replicao ocorre no ncleo de clulas que esto em processo de mitose, mais especicamente na fase S do ciclo celular. Os principais agentes de doena dessa famlia so os parvovrus que causam doenas gastroentricas em caninos e felinos. O parvovrus suno um importante agente etiolgico de perdas reprodu-
Fonte: Dr Stewart McNulty (web.qub.ac.uk).
Figura 2.8. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Circoviridae.
5.1.9 Famlia: Hepadnaviridae

Gneros: Orthohepadnavirus: vrus da hepatite B humana (HBV), vrus do esquilo do solo (GSHV),
48
Captulo 2
vrus das marmotas (WHV) e outros recentemente identicados em vrias espcies; Avihepadnavirus: vrus da hepatite B dos marrecos (DHBV).
5.2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo 5.2.1 Famlia: Picornaviridae
Gneros: Enterovirus: enterovrus bovinos 1 e 2 (BEV-1, BEV-2), enterovrus suno 1-13 (PEV-113), poliovrus (PV); Rhinovirus: rinovrus bovino 1-3, rhinovrus humanos (HRV-2-100); Hepatovirus: vrus da hepatite A humano (HAV); Cardiovirus: vrus da encefalomiocardite murina Theiler (EMCV); Aphtovirus: vrus da febre aftosa (FMDV); Parechovirus: parechovrus humano; Erbovirus: vrus da rinite eqina B (ERBV); Kobuvirus: Aichi vrus (AiV); Teschovirus: teschovirus suno 1 (PTV).
Figura 2.9. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Hepadnaviridae (vrus da hepatite B).
Os vrus da famlia Hepadnaviridae causam hepatite em humanos e em algumas espcies de animais. Esses vrus freqentemente estabelecem infeco persistente, e a persistncia viral no hospedeiro est associada com cirrose heptica e hepatocarcinoma. As clulas infectadas pelos hepadnavrus produzem trs tipos de partculas vricas: os vrions completos possuem um dimetro de 42-47 nm e so compostos por um nucleocapsdeo icosadrico envolto por um envelope lipoprotico. Partculas esfricas e lamentosas, compostas apenas pelas protenas do envelope e pores da membrana plasmtica, tambm so produzidas pelas clulas infectadas. O genoma viral composto por uma molcula de DNA circular de cadeia parcialmente dupla. O ciclo replicativo dos hepadnavrus ocorre parte no ncleo e parte no citoplasma da clula hospedeira e envolve uma etapa de transcrio reversa. Os hepadnavrus possuem tropismo marcante por clulas hepticas e, freqentemente, produzem infeces hepticas persistentes/crnicas. O HBV o nico patgeno humano classicado nessa famlia. O vrus animal mais conhecido dessa famlia o DHBV, que causa uma doena muito similar hepatite B humana.
Fonte: www.vetsciences.free.fr
Figura 2.10. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Picornaviridae (poliovrus).
Os picornavrus possuem vrions esfricos pequenos, no-envelopados, com 28 a 30 nm de dimetro. O capsdeo icosadrico formado por 60 cpias de cada uma das quatro protenas VP1, VP2, VP3 e VP4. Alm das protenas do capsdeo, cada vrion possui tambm uma protena denominada VPg, associada ao cido nuclico na extremidade 5. O genoma composto de uma cadeia simples de RNA, de sentido positivo de 7.2 a 8.4 kb. A replicao do vrus ocorre inteiramente
49
no citoplasma, e o RNA traduzido diretamente pelos ribossomas. A infeco geralmente aguda e citoltica, ocorrendo a liberao dos vrions pela lise celular. Essa famlia contm vrios patgenos muito importantes para humanos e animais, como o vrus da poliomielite, o vrus da hepatite A, os rinovrus, os enterovrus, o FMDV, entre outros.
5.2.2 Famlia: Caliciviridae

Gneros: Vesivirus: calicivrus felino (FCV), vrus do exantema vesicular dos sunos (SVEV), vrus dos lees marinhos de San Miguel (SMSV); Lagovirus: vrus da doena hemorrgica dos coelhos (RHDV), vrus da doena hemorrgica das lebres pardas (EBHSV); Norovirus: vrus de Norwalk (humano); Sapovirus: vrus de Sapporo (humano).
ta uma protena (VPg) covalentemente ligada na extremidade 5. Em clulas infectadas, tambm detectado um RNA subgenmico de 2.2 a 2.4 kb. A replicao do vrus ocorre no citoplasma, e os vrus so liberados por lise celular. O patgeno animal mais conhecido dessa famlia o calicivrus felino, associado com doena respiratria em gatos. Um calicivrus (norovrus) tem sido considerado um dos principais agentes de diarria em pessoas de todas as idades.
5.2.3 Famlia: Astroviridae

Gneros: Mamastrovirus: astrovrus humanos e de vrias espcies de animais domsticos; Avastrovirus: astrovrus dos perus. Os astrovrus so pequenos, com 28 a30 nm de dimetro, sem envelope e com capsdeo icosadrico. A superfcie de algumas partculas vricas apresenta estruturas que lembram estrelas de cinco ou seis pontas, o que originou o nome da famlia. A replicao ocorre no citoplasma, e os vrus so liberados por lise celular. Os astrovrus tm sido isolados de casos de gastrenterite de bovinos, sunos, ces, gatos, perus, patos e humanos. Na grande maioria das espcies, a doena se manifesta como uma diarria passageira e raramente h complicaes. Entretanto, em patos, uma hepatite com altos ndices de mortalidade tem sido descrita.
Fonte: www.fli.bund.de
Figura 2.11. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Caliciviridae.
Os calicivrus so vrus pequenos (dimetro entre 30 a 40 nm) sem envelope. O capsdeo formado por 60 cpias de uma nica e grande protena. microscopia eletrnica, o vrus apresenta depresses caractersticas na superfcie, que lembram copos ou clices, o que originou a denominao da famlia. O genoma consiste de um cido nuclico RNA linear de cadeia simples e sentido positivo, com extenso de 7.4 a 7.7 kb. Semelhante aos picornavrus, o RNA dos calicivrus apresen-
Figura 2.12. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Astroviridae.
50
Captulo 2
5.2.4 Famlia: Togaviridae

Gneros: Alfavirus: vrus das encefalites eqinas do leste (EEEV), oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV), alm de outros arbovrus zoonticos (Semliki Forest virus, SFV; Ross River virus, RRV; Sindbis, SIN); Rubivirus: vrus da rubola (humano). Os togavrus possuem vrions esfricos, com dimetro aproximado de 70 nm. O capsdeo envolto por um envelope lipdico que apresenta peplmeros formados por duas glicoprotenas. O genoma consiste de uma molcula de RNA linear, de sentido positivo, com extenso de 9,7 a 11.8 kb. As protenas no-estruturais so sintetizadas a partir de uma poliprotena traduzida diretamente do RNA genmico. As protenas noestruturais so produzidas pela traduo de um mRNA subgenmico, sintetizado a partir de uma cpia de RNA de sentido anti-genmico. A replicao ocorre inteiramente no citoplasma e a liberao da prognie viral ocorre por brotamento na membrana plasmtica. Os Alfavirus so transmitidos por insetos e a maioria deles zoontica. Os EEEV, WEEV e VEEV de maior importncia para a Veterinria esto classicados no gnero Alfavirus. O vrus da rubola, tambm classicado nessa famlia, um agente que infecta exclusivamente humanos.
5.2.5 Famlia: Flaviviridae

Gneros: Flavivirus: vrus da febre amarela (YFV, humano e de primatas), vrus da dengue (humano), vrus da encefalite japonesa (JEV), vrus Murray Valley (MVEV), vrus do Nilo Ocidental (WNV), vrus Wesselsbron (WBV), vrus do Louping Ill. Com possvel exceo do vrus da dengue, os demais vrus so zoonticos; Pestivirus: vrus da diarria viral bovina tipos 1 e 2 (BVDV-1; BVDV-2), vrus da peste suna clssica (CSFV), vrus da doena da fronteira (BDV); Hepacivirus: vrus da hepatite C (humano).
Figura 2.14. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Flaviviridae (vrus do Nilo Ocidental).
Fonte: Dra Tuli Mukhopadnyay (ICTVdB).
Figura 2.13. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Togaviridae.
Os membros da famlia Flaviviridae possuem vrions envelopados, com capsdeo possivelmente icosadrico e com 45-60 nm de dimetro. Apresentam um genoma RNA linear de sentido positivo (9.5 a 12.5 kb), que traduzido em uma poliprotena, posteriormente clivada nas protenas individuais por enzimas virais e celulares. O genoma organizado de forma semelhante em todos os membros da famlia, com as protenas estruturais codicadas no primeiro tero (extremidade 5) e as no-estruturais nos teros nais (extremidade 3). No gnero Flavivrus, esto classicados vrios agentes de doenas hemorrgicas e encefalites transmitidas por mosquitos, entre elas o YFV, o vrus da dengue e o WNV. Im-
51
portantes patgenos para a medicina veterinria so classicados no gnero Pestivrus, entre eles o BVDV e o CSFV. O vrus da hepatite C de humanos o nico membro do gnero Hepacivirus.
5.2.6 Famlia: Coronaviridae
capsdeo helicoidal, que possui uma molcula de RNA linear de cadeia simples e sentido positivo. Dentre os vrus RNA, os coronavrus possuem o maior genoma, podendo variar de 27 a 32 kb. A sntese de um grupo de RNAs subgenmicos durante a replicao viral na clula infectada um aspecto comum aos vrus dessa famlia, assim como aos demais vrus da ordem Nidovirales. A replicao ocorre inteiramente no citoplasma. Esses vrus causam importantes doenas entricas em animais, incluindo a gastrenterite transmissvel dos sunos (TGE) e a peritonite infecciosa dos felinos (FIP). Os coronavrus humanos esto associados principalmente com os resfriados comuns. O vrus da SARS, agente de doena respiratria severa na sia entre 2003 e 2004, tambm classicado nessa famlia.
5.2.7 Famlia: Arteriviridae

Figura 2.15. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Coronaviridae (SARS CoV).
Ordem Nidovirales Gnero: Coronavirus: vrus da bronquite infecciosa das aves (IBV), coronavrus dos perus (TCoV), vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos (TGEV), coronavrus felino (FeCoV), vrus da peritonite infecciosa felina (FIPV), coronavrus canino (CCoV), coronavrus bovino (BCoV), coronavrus humano (HuCoV), vrus da pneumonia asitica (SarsCoV humano); Torovirus: torovrus eqino (EToV), torovrus bovino (BToV), torovrus suno (SToV), torovrus humano (HToV), vrus Berne (BeV), vrus Breda (BrV). A morfologia dos vrions, quando observada ao microscpio eletrnico, deu origem ao nome da famlia. Os vrions do gnero Coronavrus possuem dimetro de 80 a 220 nm e forma esfrica; os do gnero Torovrus, de 120 a 140 nm e aparncia bacilar ou na forma de rim. Vrus de ambos os gneros apresentam envelope lipdico com peplmeros que se projetam externamente por at 20 nm, e que do ao vrion o aspecto de coroa. Os coronavrus apresentam um nucleo-
Ordem: Nidovirales Gnero: Arterivirus: vrus da arterite eqina (EVAV), vrus elevador da lactato desidrogenase (LDEV), vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV).
Fonte: Dr D. Robinson, South Dakota State University.
Figura 2.16. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Arteriviridae (PRRSV).
O nome dessa famlia originou-se da patologia induzida por esses vrus em eqinos, a arterite. Os arterivrus apresentam dimetro de 50 a 70 nm e possuem envelope. O genoma consiste de uma molcula de RNA linear de sentido positivo,
52
Captulo 2
com extenso entre 13 e 15 kb. De forma similar ao que ocorre com os coronavrus, RNAs subgenmicos so produzidos durante a replicao desses vrus no citoplasma das clulas infectadas. A liberao dos vrus se d por exocitose aps brotamento dentro de vesculas no citoplasma. Alm do vrus da arterite eqina, est tambm classicado nessa famlia o PRRSV. Ambas as doenas so consideradas ocialmente exticas no Brasil. Entretanto, estudos sorolgicos demonstraram a presena de anticorpos contra o EVAV em eqinos de alguns estados brasileiros.
5.3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo no-segmentado 5.3.1 Famlia: Paramyxoviridae
Ordem: Mononegavirales Subfamlia: Paramyxovirinae Gneros: Respirovirus: vrus da parainuenza bovina tipo 3 (bPI-3V), vrus Sendai (camundongos); Morbillivirus: vrus da cinomose canina (CDV), vrus da peste bovina (Rinderpest), vrus da peste dos pequenos ruminantes, morbilivrus dos golnhos, morbilivrus de focas (PhDV), vrus do sarampo (humanos); Rubulavirus: vrus da parainuenza canina tipo 2 (cPIV-2), vrus da caxumba (humanos); Henipavirus: vrus Hendra (HeV), vrus Nipah (NiV); Avulavirus: vrus da doena de Newcastle (NDV), paramixovrus das aves 2 a 9 (APMV-29). Subfamlia: Pneumovirinae Gneros: Pneumovirus: vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV) e humano (hRSV); Metapneumovirus: metapneumovrus das aves AMPV (vrus da rinotraquete dos perus). Os vrus dessa famlia so grandes, pleomrcos, envelopados, com dimetro variando de 150 a 350 nm. Possuem um genoma RNA linear de sentido negativo, cadeia simples, com 16 a 20 kb. No envelope, so encontradas as glicoprotenas hemaglutinina (HN) e de fuso (F). Em alguns vrus, as glicoprotenas de superfcie
apresentam tambm uma atividade de neuraminidase. A hemaglutinina a protena viral responsvel pela ligao ao receptor celular, e a protena F realiza a fuso do envelope viral com a membrana da clula. A replicao e reunio dos componentes virais ocorrem no citoplasma, e a liberao feita por brotamento da membrana plasmtica. Na partcula viral, tambm so encontradas algumas cpias da enzima polimerase, que necessria para iniciar a replicao do vrus. Esses vrus esto associados principalmente com doenas respiratrias e foram identicados apenas em mamferos e aves. Alguns morbilivrus podem causar infeco persistente. Entre os vrus classicados nessa famlia e que causam doena em animais incluem-se o CDV e o NDV em aves, entre outros. O hRSV, o vrus do sarampo e da caxumba so patgenos importantes de humanos.
Fonte: Dr Samuel Baron (ICTVdB).
Figura 2.17. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Paramyxoviridae (vrus Sendai).
5.3.2 Famlia: Rhabdoviridae

Ordem: Monegavirales Gneros: Vesiculovirus: vrus da estomatite vesicular (VSV), vrios outros vrus isolados de insetos, alguns que infectam mamferos; Lyssavirus: vrus da raiva (RV), lissavrus de morcegos Lagos; Efemerovirus: vrus da febre efmera dos bovinos (BEFV);
53
Novirhabdovirus: vrus da necrose hematopoitica infecciosa (HNV); Cytorhabdovirus: vrus da necrose amarela da alface (LNYV); Nucleorhabdovirus: vrus do tomate pequeno amarelo (PYDV).
5.3.3 Famlia: Filoviridae

Ordem: Mononegavirales Gneros: Marburgvirus: vrus de Marburg; Ebolavirus: vrus ebola. Os vrus dessa famlia apresentam formas lamentosas, pleomrcas, com dimetro de 80 nm e extenso que pode atingir at 14.000 nm. Podem ser vistas formas de U, de 6 ou, ainda, formas circulares. O genoma consiste de uma nica molcula de RNA linear, de cadeia simples e sentido negativo, compondo um nucleocapsdeo helicoidal. A replicao ocorre no citoplasma e o vrus liberado por brotamento na membrana plasmtica. Os vrus dessa famlia causam doenas hemorrgicas em humanos. Infeco natural com vrus de Marburg e a cepa Reston do vrus ebola tambm causa doena hemorrgica em macacos. Doena experimental pode ser induzida atravs de inoculao em macacos, cobaias, hamsters e camundongos. A manipulao desses vrus s permitida em laboratrios de nvel 4 de biosegurana. O vrus ebola um dos vrus mais letais j identicados para humanos. A histria natural desses vrus ainda no bem conhecida.
Fonte: Dr. F. Murphy (ICTVdB).
Figura 2.18. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Rhabdoviridae.
Os vrions dessa famlia possuem uma morfologia caracterstica, lembrando um projtil de arma de fogo, com uma das extremidades arredondadas e a outra romba. O dimetro dos vrions varia de 70 a 85 nm, e o comprimento pode variar de 130 a 380 nm. O vrus envelopado e apresenta peplmeros de 8 a 10 nm na superfcie; o nucleocapsdeo helicoidal. O genoma consiste de uma cadeia simples de RNA linear de sentido negativo e extenso de 10 a 13 kb. A replicao ocorre no citoplasma. O RNA genmico de sentido negativo inicialmente transcrito em RNAs subgenmicos, que so traduzidos nas protenas necessrias formao de novas partculas virais. A replicao do genoma ocorre a partir de um intermedirio positivo. O RV, que um dos vrus zoonticos mais importantes, o principal vrus dessa famlia. O VSV outro importante patgeno animal, capaz de infectar vrias espcies. Vrios rabdovrus de peixes e de plantas tambm so agrupados nessa famlia.
Fonte: Dr F. Murphy (ICTVdB).
Figura 2.19. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Filoviridae (vrus Ebola).
54
Captulo 2
5.3.4 Famlia: Bornaviridae

Ordem: Mononegavirales Gnero: Bornavirus: vrus da doena de Borna (BDV). Os bornavrus so esfricos e envelopados, com dimetro de 90 nm. Possuem um genoma RNA de cadeia simples, sentido negativo e 8.9 kb. Apesar do genoma RNA, os vrus replicam no ncleo, onde produzem corpsculos de incluso. Esses vrus so agentes etiolgicos reconhecidos de doena neurolgica em ovinos e eqinos, mas j foram isolados tambm de gatos e bovinos. Alm disso, dados sorolgicos e moleculares recentes tm associado os bornavrus com doenas neuropsiquitricas humanas.
genoma ocorre no ncleo das clulas hospedeiras. Posteriormente, o vrus liberado da clula por brotamento na membrana plasmtica. Os vrus do gnero inuenza so os agentes etiolgicos da gripe. O vrus inuenza A causa gripe em humanos, aves, sunos, cavalos, martas, focas e baleias. O vrus inuenza B patgeno somente de humanos, e os de inuenza C, de humanos e sunos. A natureza segmentada do genoma desses vrus facilita a troca dos segmentos genmicos entre vrus das diferentes espcies quando infectam a mesma clula. Esse mecanismo permite, eventualmente, o surgimento de vrus bastante virulentos.
5.4 Vrus com genoma RNA de sentido negativo segmentado 5.4.1 Famlia: Orthomyxoviridae
Gneros: Inuenzavirus A (FluAV): vrus da inuenza A (humanos, aves, eqinos, sunos, recentemente ces e feldeos); Inuenzavirus B (FluBV): vrus da inuenza B (humanos); Inuenzavirus C (FluCV): vrus da inuenza C (humanos, sunos); Thogotovirus: vrus Thogoto de carrapatos (THOV), vrus Dhori (DHOV). Tem sido detectada sorologia positiva em bovinos e camelos; Isavirus: vrus da anemia infecciosa do salmo (ISAV). Os ortomixovrus possuem vrions envelopados pleomrcos, com 80 a 120 nm de dimetro. No envelope, esto inseridas as glicoprotenas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NE) que se extendem externamente por 10 a 14 nm. O genoma consiste de oito (vrus inuenza A), sete (vrus inuenza B) ou seis (vrus inuenza C) segmentos de RNA linear, sentido negativo de cadeia simples, com extenso total de 10 a 13.6 kb. Cada segmento genmico empacotado em um nucleocapsdeo helicoidal. A replicao do
Figura 2.20. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Orthomyxoviridae (influenza A).
5.4.2 Famlia: Bunyaviridae

Gneros: Orthobunyavirus: vrus Bunyamwera (BOTV), vrus La Crosse (LACV), vrus Akabane (AKAV); Hantavirus: vrus Hantaan (hantavrus HTNV) de roedores e humanos; Nairovirus: vrus de Dugbe (DUGV), vrus da febre hemorrgica Crimean Congo (CCHFV), vrus da doena das ovelhas de Nairobi (NSDV); Phlebovirus: vrus da febre do vale Rift (RVFV); Tospovirus: vrios vrus de plantas.
55
Figura 2.21. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Bunyaviridae.
Os buniavrus possuem vrions esfricos ou pleomrcos, envelopados, com dimetro entre 80 e 120 nm. O genoma consiste de trs segmentos de RNA de cadeia simples e sentido negativo, organizados em nucleocapsdeos helicoidais. Esses vrus replicam no citoplasma. O ressortimento possvel entre vrus do mesmo gnero devido segmentao do genoma. Existe um grande nmero de vrus classicados nessa famlia, muitos deles no infectam animais domsticos ou seres humanos, apenas insetos. Os vrus patognicos dessa famlia so agentes de doenas respiratrias severas, hepatite, nefrite e encefalite em animais e humanos. Esses vrus so geralmente citopticos quando inoculados em clulas de vertebrados, mas so no-citopticos em clulas dos vetores invertebrados. A grande maioria dos vrus dessa famlia composta de arbovrus isolados ou transmitidos por mosquitos, carrapatos e outros artrpodos. Os vrus do gnero hantavrus so excees, uma vez que so mantidos e transmitidos por roedores. Alguns desses vrus (como o RVFV e o CCMFV) s podem ser manipulados em laboratrio de segurana nvel 4.
rus de roedores e humanos (LASV), vrus Junin (JUNV),vrus Machupo (MACV), vrus sabi (SABV), vrios outros vrus identicados em roedores e/ou causando doena em humanos. So vrus envelopados e pleomrcos, cujo dimetro varia de 100 a 300 nm. Possuem um genoma RNA de cadeia simples, sentido negativo e ambissense, com dois segmentos de extenso de 14 a 16 kb. Os vrus replicam no citoplasma e saem da clula por brotao da membrana plasmtica. Os arenavrus infectam diferentes espcies de roedores nas Amricas, frica e Europa de forma crnica e, na maioria das vezes, assintomtica. Alguns desses vrus causam doenas severas em humanos, algumas delas com aspectos hemorrgicos. Por isso esto entre os agentes mais importantes das febres hemorrgicas. A transmisso ocorre geralmente atravs de aerossis provenientes da urina contaminada desses animais. Entre os arenavrus causadores de doena em humanos est o vrus Lassa, agente etiolgico de febre hemorrgica em algumas regies da frica. No continente americano, j foram descritos o MACV na Bolvia, JUNV na Argentina, Guanarito na Venezuela e SABV no Brasil. Todos esses vrus so agentes de doenas hemorrgicas.
5.4.3 Famlia: Arenaviridae

Gnero: Arenavirus: vrus da coriomeningite linfoctica dos camundongos (LCMV), LassavFonte: Scientific American (ICTVdB).
Figura 2.22. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Arenaviridae.
56
Captulo 2
5.5 Vrus com genoma RNA de cadeia dupla 5.5.1 Famlia: Reoviridae
vrus, e 12 segmentos e 27 kb para o Coltivrus. A replicao e montagem dos vrions ocorrem no citoplasma, de onde os vrions so liberados. O ressortimento de segmentos de RNA pode ocorrer quando mais de um vrus do mesmo gnero infectam a mesma clula. O BTV e os rotavrus de vrias espcies de mamferos so exemplos de patgenos importantes em veterinria. Os rotavrus so importantes causadores de diarria, sobretudo em crianas, em pases subdesenvolvidos.
5.5.2 Famlia: Birnaviridae

Gneros: Aquabirnavrus: vrus da necrose pancretica infecciosa (IPNV); Avibirnavrus: vrus da doena de Gumboro (IBDV); Entomobirnavrus: vrus X da drosla.
Fonte: Dra. Bchen-Osmond (ICTVdB)
Figura 2.23. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Reoviridae (rotavrus).
Gneros: Orthoreovirus: orthoreovrus de mamferos (MRV), orthoreovrus de aves (ARV), orthoreovrus de babunos (BRV); Orbivirus: vrus da lngua azul (BTV-1 a 24), vrus da encefalose eqina (EEV-1 a 7), vrus da peste eqina (AHSV-1 a 9); Rotavirus: rotavrus de todas as espcies (A a G); Coltivirus: vrus da febre do carrapato do Colorado (CTFV); Aquareovirus: aquareovrus A (ARV-A a F); Seadornavirus: virus kadipiro (KDV). Existem ainda os gneros de vrus que infectam plantas e insetos: Cypovirus, Idnoreovirus, Fijivirus, Oryzavirus e Phytoreovirus. Os reovrus possuem vrions complexos, sem envelope, compostos por duas ou trs camadas de protenas arranjadas de forma concntrica. O dimetro desses capsdeos pode variar de 60 a 85 nm e possui simetria icosadrica. O genoma consiste de molculas de RNA de cadeia dupla. O nmero e a extenso desses segmentos variam entre os gneros; sendo de 10 segmentos e 23 kb para o Reovrus, 10 segmentos e 18 kb para o Orbivrus, 11 segmentos e 16-21 kb para o Rota-
Fonte: Dr. Stewart McNulty, (www.qub.ac.uk).
Figura 2.24. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Birnaviridae.
Esses vrus possuem um genoma RNA linear de cadeia dupla com dois segmentos, denominados A e B. A extenso total do genoma varia entre 5.7 e 7 kb. Os vrions so formados por um capsdeo icosadrico, sem envelope, e dimetro de 60 nm. Os RNAs mensageiros so sintetizados a partir dos dois segmentos do genoma RNA e uma poliprotena produzida e, posteriormente, clivada. Maiores detalhes da replicao no so conhecidos. O patgeno mais conhecido dessa famlia o IBDV, que afeta galinhas.
57
5.6 Vrus com genoma RNA que realizam transcrio reversa 5.6.1 Famlia: Retroviridae
Subfamlia: Orthoretrovirinae Gneros: Alpharetrovirus: vrus da leucose aviria (ALV), vrus do sarcoma Rous (RSV); Betaretrovirus: vrus do tumor mamrio do camundongo (MMTV), retrovrus Jaagsiekte dos ovinos (JSRV); Gammaretrovirus: vrus da leucemia felina (FeLV), vrus da leucemia murina (MuLV); Deltaretrovirus: vrus da leucose bovina (VLB), vrus da leucemia de clulas T humano (HTLV-1 e 2); Epsilonretrovirus: vrus do sarcoma dermal de Walleye (WDSV); Lentivirus: vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), vrus da imunodecincia felina (FIV), vrus da artrite-encefalite caprina (CAEV), vrus Maedi-Visna (MMV), vrus da imunodecincia dos smios (SIV), vrus da imunodecincia humana (HIV-1 e 2); Subfamlia: Spumaretrovirinae Spumavirus: vrus foamy do chimpanz.
ral complexa, incluindo uma etapa de transcrio reversa. Os retrovrus so envelopados e possuem um capsdeo icosadrico. O dimetro dos vrions pode variar entre 80 e 100 nm. O genoma diplide, consistindo de duas cpias de RNA cadeia simples e sentido positivo. A replicao dos retrovrus ocorre em parte no citoplasma e em parte no ncleo. A replicao viral envolve a sntese de uma cpia DNA do RNA genmico (provrus), que integrada no cromossomo celular. A sntese de mRNAs, para a sntese protica e do RNA genmico, ocorre pela transcrio do provrus pela maquinaria celular de transcrio. Pelo fato de integrar o seu provrus ao DNA da clula, os retrovrus infectam o hospedeiro para o resto da vida. Os vrus dessa famlia esto associados principalmente a doenas tumorais e imunossupressivas. O ALV e o EIAV esto entre os vrus de importncia veterinria classicados nessa famlia. O vrus da AIDS (HIV) o retrovrus de maior repercusso em sade humana.
CONDIT, R.C. Principles of Virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.2, p.19-51. DE VILLIERS, E.M. et al. Classication of papillomaviruses. Virology, v.324, p.17-27, 2004. FAUQUET, C.M.; FARGETTE, D. International Committee on Taxonomy of Viruses and the 3,142 unassigned species. Virology Journal, v.2, p.64, 2005. ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4. BNCHENOSMOND, C. (Ed). New York, USA: Columbia University. KOCI, M.D.; SCHULTZ-CHERRY, S. Avian astroviruses. Avian Pathology, v.31, p.213-227, 2002. MAYO, M.A. Names of viruses and virus species - an editorial note. Archives of Virology, v.147, p.1463-1464, 2002. MURPHY, F. A. Virus Taxonomy. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.2, p.15-57. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. PRINGLE, C.R. Virus nomenclature. Archives of Virology, v.144, p.1463-1466, 1999. PRINGLE, C.R. Virus taxonomy--1999. The universal system of virus taxonomy, updated to include the new proposals ratied
Fonte: University of Otaga, NZ (ICTVdB).
Figura 2.25. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Retroviridae (HIV).
Nessa famlia, esto classicados vrios patgenos de interesse na Medicina Veterinria em diversas espcies. Esses vrus apresentam, como principal caracterstica, uma replicao vi-
58
by the International Committee on Taxonomy of Viruses during 1998. Archives of Virology, v.144, p.421-429, 1999. PRINGLE, C.R. Virus taxonomy--San Diego. Archives of Virology, v.143, p.1449-1459, 1998. THIEL, H.J.; KONIG, M. Caliciviruses: an overview. Veterinary Microbiology, v.69, p.55-62, 1999. VAN REGENMORTEL, M.H. Virologists, taxonomy and the demands of logic. Archives of Virology, v.151, p.1251-1255, 2006. VAN REGENMORTEL, M.H.; MAHY, B.M. Emerging issues in virus taxonomy. Emerging Infectious Diseases, v.10, p.8-13, 2004.
Captulo 2
DETECO, IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DE VRUS

Mrio Celso S. Brum & Rudi Weiblen
3
61 61
61 63 63 65 65 65 66 67 67 68 68 68 68 69 69 70 70 73 73
1 Introduo 2 Mtodos de deteco e identicao de vrus

2.1 Deteco direta por microscopia eletrnica 2.2 Deteco de propriedades biolgicas dos vrus 2.2.1 Hemaglutinao 2.2.2 Hemadsoro 2.3 Deteco de antgenos 2.3.1 Imunouorescncia 2.3.2 Imunoperoxidase 2.3.3 Ensaio imunoenzimtico 2.3.4 Radioimunoensaio 2.3.5 Imunocromatograa 2.3.6 Aglutinao em ltex 2.3.7 Imunodifuso em gar 2.3.8 Imunoblots 2.4 Deteco/identicao de cidos nuclicos 2.4.1 Tcnicas de hibridizao (Southern, Northern blot) 2.4.2 Hibridizao in situ 2.4.3 Reao de polimerase em cadeia 2.4.4 Anlise de restrio 2.4.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida
3 Multiplicao de vrus
3.1 Inoculao em animais susceptveis 3.2 Inoculao em ovos embrionados 3.3 Inoculao em cultivo celular
73
74 74 75
4 Quanticao de vrus
4.1 Diluio limitante 4.2 Ensaio de placa 4.3 Outros mtodos de quanticao
81
81 81 83 84 84 84 85 86
5 Identicao e caracterizao de um isolado

5.1 Sensibilidade a solventes orgnicos 5.2 Concentrao e puricao por ultracentrifugao
6 Biossegurana laboratorial 7 Bibliograa consultada
1 Introduo
Os grandes avanos no entendimento dos mecanismos de replicao, transmisso e patogenia de vrios agentes virais somente foram possveis aps o desenvolvimento de mtodos de propagao e deteco de vrus in vitro. No princpio da Virologia, antes mesmo da classicao dos vrus como agentes ltrveis, as alteraes produzidas nos animais durante as infeces virais j eram observadas e descritas. No entanto, a falta de conhecimentos sobre o agente e de equipamentos adequados fez com que a diferenciao entre as infeces fosse realizada apenas entre as enfermidades com sinais clnicos caractersticos. Inicialmente, o nico mtodo de propagao viral era a inoculao em animais susceptveis. Embora essa forma de amplicao viral tenha sido muito til nos primrdios da Virologia, esse mtodo de amplicao restringiu o estudo dos vrus devido diculdade de manuteno de animais e tambm pela baixa reprodutibilidade da maioria das enfermidades vricas. A maior revoluo na Virologia ocorreu aps o advento dos antibiticos, o que possibilitou o estabelecimento de cultivos celulares livres de contaminantes bacterianos. O uso dos cultivos celulares contribuiu de maneira decisiva para a deteco e multiplicao dos vrus com diversas nalidades, viabilizando o diagnstico, estudos bioqumicos e moleculares e produo de vacinas. Nesse sentido, a citopatologia, produzida por alguns vrus em clulas de cultivo durante a sua replicao, uma caracterstica amplamente utilizada para demonstrar a presena do agente em material clnico, permitindo a realizao do diagnstico. As tcnicas de deteco viral foram desenvolvidas inicialmente com ns diagnstico, ou seja, para pesquisar vrus em amostras clnicas; porm passaram a ser utilizadas para uma ampla gama de nalidades em laboratrios de virologia. A conrmao da presena do vrus em tecidos, secrees ou excrees pode ser realizada pelo uso de tcnicas que demonstrem o agente, o efeito da replicao em cultivo celular, produtos intermedirios do processo replicativo (protenas, corpsculos de incluso) ou o material gentico (DNA ou RNA viral). Muitas vezes recorre-se
realizao de duas ou mais tcnicas para a conrmao denitiva da presena do agente. A escolha de uma determinada tcnica de deteco est diretamente relacionada com a forma de infeco e com o tropismo do vrus por determinados tecidos e rgos. Por outro lado, a disponibilidade de equipamentos, qualidade dos reagentes e de pessoal capacitado para a execuo das tcnicas tambm podem determinar a escolha da tcnica a ser empregada. A simples deteco do agente viral em uma amostra clnica deve ser considerada com cautela, pois a sua presena pode no ser um indicativo seguro da etiologia da doena. Os mtodos de deteco dos agentes virais podem ser divididos em mtodos diretos e indiretos. Os mtodos diretos compreendem as tcnicas em que o agente viral diretamente detectado, ou seja, a partcula viral observada e identicada de maneira precisa. A nica tcnica que se enquadra nesse princpio a microscopia eletrnica. Os mtodos de deteco indireta identicam as propriedades biolgicas ou produtos resultantes da replicao viral, como protenas ou cidos nuclicos. Neste captulo, sero apresentadas e discutidas as tcnicas utilizadas para a deteco de partculas vricas, protenas ou material gentico viral. A aplicao dessas tcnicas, com nalidades diagnsticas, ser abordada no Captulo 11. Alm disso, sero abordadas as maneiras de multiplicao, quanticao e caracterizao viral, bem como alguns aspectos de segurana laboratorial.
2 Mtodos de deteco e identicao de vrus

2.1 Deteco direta por microscopia eletrnica
A maioria dos agentes virais possui partculas vricas com caractersticas morfolgicas e estruturais peculiares s famlias as quais pertencem. Com base nesse aspecto, o mtodo mais simples de deteco e identicao de vrus a visualizao direta das partculas na amostra (Figura 3.1). Exemplos clssicos do uso da microscopia eletrnica (ME) com ns diagnsticos incluem a deteco de partculas vricas em crostas de leses causadas pelo ectima contagioso dos ovinos
62
Captulo 3
e pseudo-varola bovina (parapoxvrus) ou, ainda, a deteco do parvovrus em fezes caninas e

A
rotavrus ou coronavrus em fezes de bezerros com diarria.

B
Figura 3.1. Microscopia eletrnica. (A) Partculas de parapoxvrus em material coletado de leses de ovinos suspeitos de ectima contagioso (50.000x); (B) Partculas tpicas de rotavrus em fezes bovinas diarricas (260.000x); (C) Partculas caractersticas de calicivrus em clulas de cultivo, inoculadas com secreo nasal de um felino com doena respiratria (40.000x); (D) Partculas tpicas de herpesvrus no ncleo de clulas de cultivo, inoculadas com material coletado de um touro com balanopostite (48.000x); (E) Partculas do vrus da parainfluenza bovina 3 (bPI-3), observadas em sobrenadante de cultivo celular (260.000x); (F) Arranjo cristalino de partculas tpicas de picornavrus no citoplasma de clulas de cultivo, inoculadas com material coletado de um bovino com doena gastrentrica e respiratria (315.000x).
Deteco, identicao e quanticao de vrus
63
A ME possuiu grande aplicabilidade na pesquisa e identicao de vrus que no replicam com ecincia em cultivo celular. Essa tcnica permitiu a identicao de vrios agentes entricos de difcil cultivo, tais como: poxvrus, rotavrus, calicivrus, astrovrus, entre outros. Quando as partculas vricas esto presentes em grande quantidade, so facilmente observadas nas fezes de animais com diarria ou em lquidos vesiculares de infeces cutneas. A maior restrio da ME a sua baixa sensibilidade. Amostras clnicas que contenham quantidade inferior a 106-107 partculas vricas por mililitro no so detectadas como positivas por essa tcnica, gerando resultados falso-negativos. Essa quantidade de vrus geralmente encontrada em uidos vesiculares e fezes, o que no ocorre com tanta freqncia em secrees respiratrias. A sensibilidade, no entanto, no o nico limitante dessa tcnica. O custo elevado do equipamento e a exigncia de tcnicos altamente capacitados para a operao e interpretao dos resultados tambm representam limitaes. O perodo necessrio para a obteno dos resultados varia entre 15 minutos, nos casos em que o material observado diretamente no microscpio, at alguns dias quando h necessidade do processamento prvio da amostra para aumentar a possibilidade de deteco. Pode-se tambm realizar a ME em clulas de cultivo previamente inoculadas com o material suspeito. A sensibilidade da ME pode ser aumentada pelo uso de tcnicas que permitam a concentrao e facilitem a visualizao das partculas vricas. A claricao de amostras por centrifugao de baixa rotao empregada para remover partculas e substncias que possam interferir na tcnica. A ultracentrifugao utilizada com o objetivo de concentrar as partculas virais. A aglutinao com soro hiperimune rotineiramente utilizada e denomina-se imunoeletromicroscopia. Nesta metodologia, utiliza-se um soro hiperimune especco contra o agente suspeito, cujos anticorpos iro se ligar e promover a concentrao das partculas, facilitando a visualizao. Anticorpos marcados com micropartculas de ouro (tcnica de imunogold) tambm so utilizados para au-
mentar a sensibilidade do teste. Aps o processo de claricao e concentrao, a amostra corada negativamente, geralmente com tungstnio, e examinada sob ME. Alm do seu uso em diagnstico, a ME tem sido utilizada para o estudo da morfologia e ultra-estrutura de partculas vricas e tambm em estudos de patogenia. As caractersticas observadas para a identicao e caracterizao do agente so: o dimetro dos vrions, morfologia do nucleocapsdeo, presena ou no de envelope, presena de projees na superfcie das partculas, organizao dos agregados de partculas e a localizao celular dos vrions.
2.2 Deteco de propriedades biolgicas dos vrus 2.2.1 Hemaglutinao

Vrios vrus possuem protenas de superfcie que se ligam a eritrcitos, provocando a sua agregao e aglutinao, fenmeno denominado hemaglutinao (HA) (Tabela 3.1). A propriedade de aglutinar eritrcitos restrita a algumas famlias de vrus (exemplos: ortomixovrus e paramixovrus) e, para cada um desses vrus, a HA ocorre apenas com eritrcitos de determinadas espcies animais. Nos vrus da inuenza, por exemplo, a ligao entre a protena do envelope viral (hemaglutinina ou HA) com o cido N-acetilneuramnico da membrana dos eritrcitos de galinha a responsvel pela aglutinao. Baseando-se nesse princpio, a tcnica de HA pode ser utilizada para a deteco dos vrus que possuem essa propriedade biolgica. O teste realizado pela incubao de uma suspenso de eritrcitos com o material suspeito (puro ou em diluies) em microplacas com fundo em V ou U. Aps o perodo de incubao, a presena do agente hemaglutinante ser indicada pela formao de uma rede difusa de eritrcitos no poo. Em amostras negativas (ausncia do agente hemaglutinante), as hemcias no sero aglutinadas, iro rolar e se acumular no fundo da cavidade, formando um boto bem denido (Figura 3.2). Esse teste de fcil execuo, porm falha em detectar quan-
64
Captulo 3
Tabela 3.1. Vrus com atividade hemaglutinante sobre eritrcitos animais Vrus
BOVINOS
Adenovrus bovino (BAdV) Coronavrus bovino (BoCV) Parainfluenza 3 bovino (bPI-3) Encefalomielite eqina (EEEV, WEEV)
Fonte de vrus
Sobrenadante de cultivo celular Amostras fecais e sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Macerado de crebro de camundongo Sobrenadante de cultivo celular ou lquido amnitico Sobrenadante de cultivo celular Suspenso de crebro de camundongo Sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Fluido alantide Extratos de tecidos fetais ou sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Amostras fecais ou sobrenadante de cultivo Amostras fecais ou sobrenadante de cultivo Fluido alantide Fluido alantide Fludo corioalantide
Eritrcitos (espcie)
Rato, bovino ou macacos rhesus Camundongo, hamster e rato Bovino e cobaia Ganso ou pinto de 1 dia Galinha e cobaia Rato ou macaco rhesus Ganso ou pinto de 1 dia Suno Galinha, rato, camundongo e hamster Galinha Humano, macaco, camundongo, cobaia, gato, galinha e rato Rato, macaco rhesus, humano e aves Suno ou macaco rhesus Suno ou macaco rhesus Mamferos e aves Galinha Galinha
EQINOS
Influenza eqina Adenovrus eqino (EAdV) Encefalite japonesa (JEV) Peste suna africana (ASFV)
SUNOS
Encefalomielite hemaglutinante dos sunos Influenza suna (SIV) Parvovrus suno (PPV)
CANINOS e FELINOS AVES LEPORINO
Adenovrus canino (CAdV) Parvovrus canino (CPV) Panleucopenia felina (FPLV) Influenza aviria (AIV) Doena de Newcastle (NDV) Bronquite infecciosa aviria (IBV)
Doena hemorrgica dos coelhos (RHDV)
Suspenso de tecidos e sobrenadante de cultivo
Humano do tipo O
tidades pequenas de vrus. Outra restrio que a atividade hemaglutinante uma propriedade restrita a algumas famlias de vrus, ou seja, a tcnica no possui aplicao universal. A atividade hemaglutinante pode ser inibida pela presena de anticorpos anti-hemaglutininas especcos. Os anticorpos especcos iro ligar-se protena hemaglutinante do vrus, impedindo a ligao desta com os eritrcitos. Dessa maneira, um mtodo para se detectar e quanticar anticor-
pos antivirais no soro de animais foi desenvolvido e denomina-se inibio da hemaglutinao (HI). A tcnica de HI pode ser utilizada tanto para a deteco de anticorpos antivirais como para a identicao de vrus hemaglutinantes. Aps a deteco da atividade HA, a tcnica de HI realizada, utilizando-se um anti-soro especco contra o vrus suspeito para conrmar o diagnstico. A aplicao desse mtodo em diagnstico ser abordada com detalhes no Captulo 11.
65
para a deteco de ortomixovrus, paramixovrus e asfarvrus.
+
Amostra suspeita Eritrcitos Incubao 1 hora
2.3 Deteco de antgenos virais 2.3.1 Imunouorescncia

A imunouorescncia (IFA) uma tcnica de deteco de antgenos e baseia-se na reao de anticorpos especcos com o antgeno presente no material suspeito. Os anticorpos so conjugados com uma substncia que emite luminosidade uorescente (uorescena) quando exposta luz ultravioleta (UV). A presena do antgeno no material revelada pela emisso de luminosidade uorescente. Essa metodologia pode ser aplicada em monocamada de clulas, em esfregaos celulares, em tecidos frescos, congelados ou includos em parana. Geralmente, o material deve ser previamente xado em etanol, metanol ou acetona. Aps a xao, incuba-se o material com o anticorpo especco marcado com o uorocromo (FITC isotiocianato de uorescena ou Texas Red). Posteriormente, sucessivas lavagens so realizadas para a remoo do anticorpo no-ligado. O material , ento, examinado ao microscpio de luz UV. A colorao verde-ma ou vermelha (para anticorpos marcados com FITC e Texas Red, respectivamente), visualizada contra um fundo escuro, indica a presena de antgenos virais na amostra. A emisso de uorescncia resulta da excitao do uorocromo conjugado ao anticorpo quando exposto luz UV. O resultado nal a observao de uma regio ou de toda a clula corada, pois as protenas virais esto dispersas no seu interior (Figura 3.3). Existem basicamente duas variantes da tcnica: a imunouorescncia direta (IFD) e a indireta (IFI). Na IFD, o anticorpo primrio (monoclonal ou policlonal) especco para o agente marcado com o uorocromo e adicionado diretamente sobre a amostra. No caso da IFI, a tcnica realizada em duas etapas. A primeira incubao realizada com o anticorpo primrio especco para os antgenos virais e, aps a remoo dos anticorpos que no se ligaram aos antgenos, por sucessivas lavagens, adiciona-se o anticorpo secundrio, marcado com o uorocromo. O anti-
Amostra positiva
Amostra negativa
Figura 3.2. Teste de hemaglutinao (HA) para a pesquisa de vrus. A amostra suspeita de conter o vrus misturada com uma suspenso de eritrcitos e incubada a 37 C por 1 hora. (A). A presena do vrus indicada pela aglutinao dos eritrcitos e formao de uma rede fina difusa no fundo da cavidade; (B). Na ausncia do vrus, os eritrcitos rolam para o fundo da cavidade, formando um boto de contorno bem definido.
2.2.2 Hemadsoro
Durante o ciclo replicativo de alguns vrus em cultivo celular, determinadas protenas virais so expostas na superfcie das clulas infectadas. Algumas dessas protenas possuem a capacidade de se ligar a eritrcitos quando esses so adicionados ao meio de cultivo. Esse processo denominado hemadsoro (HAD), e restrito interao de alguns vrus com eritrcitos de certas espcies de mamferos e aves. A HAD um indicativo da presena desses vrus no material suspeito. Essa tcnica de simples execuo, sendo empregada
66
Captulo 3
corpo secundrio (especco para a espcie animal na qual foi produzido o anticorpo primrio) reconhece e se liga ao anticorpo primrio. A IFA uma tcnica simples e se constitui em uma das tcnicas mais utilizadas em Virologia, possuindo diversas aplicaes, incluindo o diagnstico de infeces vricas. A aplicao dessa tcnica em diagnstico ser abordada no Captulo 11. Como desvantagens, incluem-se a necessidade de um microscpio de luz UV e a possibilidade de alguns tecidos ou clulas emitirem uorescncia natural, o que pode dicultar a interpretao do resultado.
A
Imunofluorescncia direta
B
Imunofluorescncia indireta
Clula infectada Antgenos virais Anticorpo antivrus-FITC
Anticorpo antivrus Anticorpo anti-IgG-FITC
ou peroxidase) ou a fosfatase alcalina (AP). O termo IPX tem sido utilizado quase como sinnimo, embora deva ser ressaltado que essa no a nica enzima utilizada na tcnica. Essa tcnica pode ser aplicada em monocamadas celulares, esfregaos ou diretamente em tecidos, sendo denominada de imunocitoqumica (ICQ) ou imunoistoqumica (IHC), respectivamente. A metodologia semelhante IFA, existindo tambm a IPX direta e indireta. Na IPX direta, o material xado incubado com o anticorpo antiviral marcado com a enzima, seguido da lavagem e adio do substrato. A presena do antgeno no material revelada pela ao da enzima no substrato. Utilizam-se substratos cromognicos (aminoetilcarbazol AEC; diaminobenzidina DAB; ou 4-cloronaftol) que produzem uma colorao marrom ou marrom-carmim pela ao da enzima e formam um precipitado na clula positiva (Figura 3.4). A IPX indireta utiliza o anticorpo primrio especco para o antgeno, e o anticorpo secundrio marcado com a enzima. Essa variao da
A Imunoperoxidase direta B Imunoperoxidase indireta
Clula infectada Antgenos virais Anticorpo antivrus HRPO
Anticorpo antivrus Anticorpo anti-IgG-HRPO

Substrato
Figura 3.3. Ilustrao demonstrativa da tcnica de imunofluorescncia para a deteco de antgenos virais em clulas. (A) Imunofluorescncia direta (IFD); (B) Imunofluorescncia indireta (IFI).
2.3.2 Imunoperoxidase
A tcnica de imunoperoxidase (IPX) baseiase no mesmo princpio da IFA, com a diferena que os anticorpos so marcados com uma enzima, que pode ser a horseradish peroxidase (HRPO
Figura 3.4. Ilustrao demonstrativa da tcnica de imunoperoxidase (IPX) para a deteco de antgenos virais em clulas. (A). Imunoperoxidase direta; (B) Imunoperoxidase indireta.
67
tcnica apresenta maior sensibilidade devido amplicao do sinal. A tcnica de IPX possui as mesmas aplicaes da IFA, porm apresenta a vantagem de no necessitar do microscpio de luz UV, j que as reaes podem ser visualizadas sob microscopia tica comum.
2.3.3 Ensaio imunoenzimtico

O teste imunoenzimtico (ELISA) pode ser utilizado para a deteco de antgenos virais e tambm de anticorpos. uma tcnica que apresenta vantagens, tais como: a boa sensibilidade, especicidade, baixo custo, repetibilidade e versatilidade. Em alguns casos, o uso da tcnica permite a deteco de at 1 ng (nanograma) de antgeno por grama de tecido coletado diretamente do animal. Os testes podem ser executados em amostras individuais, como recurso diagnstico em clnicas ou consultrios; ou em grande escala, como realizado em laboratrios totalmente automatizados. A tcnica permite uma variao de formas e aplicaes, dependendo do objetivo e da disponibilidade de reagentes. Basicamente, os testes de ELISA podem ser classicados em diretos, indiretos ou de competio. A tcnica baseia-se na imobilizao da reao antgeno-anticorpo em um suporte slido (placas de poliestireno), seguida de uma reao colorimtrica. Por se tratar de uma tcnica que apresenta inmeras variaes, neste captulo ser apresentado apenas o fundamento geral da tcnica. Para um detalhamento maior, recomenda-se a literatura especca. Um exemplo simplicado para facilitar o entendimento da tcnica ser brevemente descrito. No ELISA de captura direto (Figura 3.5) para deteco de antgenos virais, placas de 96 cavidades so recobertas com anticorpos especcos para um determinado agente. A amostra suspeita da presena viral (sangue, secrees ou leite) adicionada e incubada por um determinado tempo. Nesse perodo, ocorre a captura do antgeno (amostras positivas) pelo anticorpo xado na placa. Aps essa etapa, so realizadas lavagens para a remoo de substncias inespeccas. A seguir adiciona-se um segundo anticorpo, especco
para o vrus, conjugado com a enzima (HRPO ou AP). Novamente os anticorpos que no se ligaram so removidos por lavagens. A conrmao da presena do antgeno viral evidenciada pela adio de substrato e desenvolvimento da colorao especca nas amostras negativas. A leitura realizada pela inspeo visual ou pelo uso de fotocolormetro.
A
Anticorpos antivirais Incubao da amostra suspeita
Lavagem
Antgenos na amostra suspeita Anticorpo antivrus Lavagem
Anticorpos marcados Adio do substrato Mudana de cor Positivo Negativo
Figura 3.5. Ilustrao demonstrativa do ensaio imunoenzimtico (ELISA) para a deteco de antgenos. (A) Amostra positiva; (B) Amostra negativa.
2.3.4 Radioimunoensaio
O mtodo de radioimunoensaio (RIA) de deteco de antgenos foi muito utilizado antes do surgimento dos testes de ELISA. A diferena bsica entre os dois mtodos reside no tipo de marcao utilizada. Na RIA, utiliza-se um istopo radioativo em vez de enzima. O mtodo muito sensvel e pode ser automatizado, porm os equipamentos requeridos so caros. A principal restrio do teste refere-se ao uso de substncias radioativas e ao descarte dos reagentes. Dessa forma, a tcnica encontra-se em desuso progressivo.
68
Captulo 3
2.3.5 Imunocromatograa
A imunocromatograa uma tcnica de visualizao simples, geralmente realizada em dispositivos plsticos, podendo ser executada em clnicas e ambulatrios. A prova baseada na reao antgeno-anticorpo, em que a amostra suspeita (vrus ou antgenos virais) passada atravs de um ltro e, ento, impregnada em uma membrana, onde reagir com o anticorpo especco previamente imobilizado. A presena do antgeno revelada pelo aparecimento de focos ou bandas coloridas, pois os reagentes so conjugados com substncias cromgenas. O resultado depende essencialmente da qualidade dos reagentes. Um dos problemas do teste o seu custo elevado. Vrios testes diagnsticos so baseados nesse princpio (Captulo 11).
matriz de gar. As amostras difundem-se radialmente pelo gel e, ao se encontrarem, proporcionam a reao antgeno-anticorpo, seguida da insolubilizao e precipitao. A precipitao deste complexo forma linhas opacas no gel (linhas de precipitao), que podem ser visualizadas a olho nu, com o auxlio de uma fonte de luz (ver Figura 11.9, no Captulo 11). A IDGA uma tcnica bastante difundida para a deteco de anticorpos, porm sem muita aplicabilidade para a deteco de antgenos ou partculas vricas.
2.3.8 Imunoblots
O princpio dos imunoblots semelhante ao da IPX. Os antgenos virais so detectados pelo uso de anticorpos marcados com enzimas, que agem no substrato, provocando mudana de cor. A diferena fundamental entre a IPX e os imunoblots que o material suspeito deve ser previamente solubilizado e imobilizado em um suporte slido, geralmente membranas de nitrocelulose ou nylon. A membrana , ento, incubada com o anticorpo antiviral no-marcado (anticorpo primrio), seguido de lavagem e incubao com um anticorpo antiespcie do anticorpo primrio (anticorpo secundrio) conjugado a uma enzima. A presena do antgeno pesquisado revelada pela adio do substrato, que muda de colorao pela ao da enzima. Substratos que emitem luminosidade capturvel em lmes de raios X tambm tm sido utilizados e aumentam a sensibilidade da tcnica (Figura 3.6). Existem duas variaes principais dos imunoblots: os dot/slot blots e o Western blot (WB). No dot/slot blot, o homogenado de protenas diretamente imobilizado na membrana, em pontos (dots) ou fendas (slots), seguida pela deteco com os anticorpos. Essa variao da tcnica mais simples e rpida, porm no fornece informaes acerca da massa da protena detectada. No WB, as protenas solubilizadas so separadas por eletroforese em um gel de poliacrilamida (SDSPAGE), transferidas para a membrana e, ento, submetidas deteco com os anticorpos marcados. Essa tcnica permite a deteco da protena e tambm a determinao de sua massa molecular, pelo padro de migrao no gel.
2.3.6 Aglutinao em ltex

O ensaio de aglutinao em ltex provavelmente seja o mtodo mais simples de deteco de antgenos virais. O princpio da tcnica baseia-se na mistura do material suspeito com anticorpos previamente adsorvidos a partculas de ltex. A presena do antgeno resultar na sua ligao aos anticorpos e na aglutinao das partculas. A leitura da reao visual e pode ser realizada imediatamente aps a sua execuo. Esta tcnica tem aceitao por pequenos laboratrios e entre tcnicos de campo. As suas principais restries referem-se baixa sensibilidade e especicidade. Por isso, resultados falso-negativos so freqentes, a no ser que grandes quantidades de antgenos estejam presentes no material suspeito. A resoluo dos problemas de sensibilidade e especicidade pode aumentar a sua aplicabilidade.
2.3.7 Imunodifuso em gar

O teste de IDGA foi desenvolvido para a deteco de antgenos, porm tem sido mais utilizado para a deteco de anticorpos. A prova baseada na precipitao de complexos antgenoanticorpos em gel de gar. O ensaio realizado pela adio da amostra suspeita e do soro controle em orifcios em posies opostas em uma
69
Amostra positiva
Substrato Anticorpo anti-IgG-HRPO Anticorpo antivrus (IgG) Antgeno viral Membrana
Amostra negativa
Removidos pelas lavagens
Membrana
- + -
nsticos, deve ser realizada com cautela. O resultado positivo pode no signicar necessariamente a associao do agente suspeito com a doena em questo. O material gentico de agentes que produzem infeces latentes, como os herpesvrus, pode ser detectado sem que os agentes estejam, necessariamente, associados com a enfermidade em questo. A deteco de cidos nuclicos possui aplicao especial para os vrus de difcil adaptao ao cultivo celular; casos em que o material suspeito contenha pequenas quantidades do agente, que esteja com viabilidade comprometida por problemas de conservao e em estudos retrospectivos. Essas tcnicas tambm possuem aplicaes importantes na deteco de infeces latentes, quando o nico indicador da infeco a presena do genoma do agente.
Figura 3.6. Western blot para a deteco de protenas virais. Os antgenos so separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, transferidos e imobilizados em uma membrana de nitrocelulose. A membrana incubada com o anticorpo primrio (anti-antgeno) e subseqentemente com o anticorpo secundrio conjugado com a enzima peroxidase. A presena do antgeno revelada pela ao da enzima no substrato que resulta na marcao do filme de raios X no local correspondente migrao da protena-alvo.
2.4.1 Tcnicas de hibridizao (Southern/Northern blot)

A deteco de cidos nuclicos virais pelo uso de sondas marcadas com istopos radioativos ou com enzimas tem sido muito utilizada em Virologia, tanto em diagnstico como em pesquisa. A tcnica baseia-se na complementaridade das molculas de DNA ou RNA. Inicialmente, escolhe-se a regio-alvo do genoma a ser detectado, que deve ser um segmento conservado entre isolados de campo. A sonda deve ser sintetizada com base na seqncia de nucleotdeos da regio-alvo e deve ser exatamente complementar a esta. Essa sonda pode ser um oligonucleotdeo sinttico, um segmento de DNA inserido em um plasmdeo ou um produto de PCR. A sonda , ento, conjugada com um istopo radioativo ou com uma enzima, para possibilitar a sua deteco. O material suspeito imobilizado em uma membrana, seguido pela incubao com a sonda marcada e de lavagens para remover as sondas no-ligadas. Na presena do cido nuclico do vrus suspeito, a sonda ir hibridizar com a seqncia-alvo. A presena da sonda revela-se pela exposio da membrana a um lme de raios X ou pela adio de substrato (Figura 3.7).
2.4 Deteco/identicao de cidos nuclicos

As seqncias nicas de nucleotdeos do genoma dos vrus, associadas com tcnicas de amplicao e hibridizao de cidos nuclicos, proporcionaram o desenvolvimento de metodologias para a deteco e identicao de agentes virais em uma variedade de amostras. As tcnicas de hibridizao e a reao em cadeia da polimerase (PCR) tornaram-se muito teis para a deteco e identicao de agentes virais e impulsionaram os estudos da biologia molecular desses agentes. A disponibilidade das seqncias genmicas dos vrus em bancos de dados possibilitou a identicao de regies conservadas, viabilizando a sntese de primers e de sondas, utilizadas nas tcnicas de PCR e hibridizao, respectivamente. A interpretao dos resultados dessas tcnicas, principalmente quando utilizadas com ns diag-
70
Captulo 3
Filme de raios X
Amostra positiva Radioatividade
C CAT GACA ' ''' '' A T C G 'G' T A C 'T'G T T A T T
C CA TG A CA
Amostra negativa Removidas pelas lavagens

C C A T
Sonda marcada DNA/RNA viral
Membrana
Membrana
Figura 3.7. Tcnica de hibridizao de cidos nuclicos (dot blot). O material gentico do vrus extrado de tecidos e imobilizado em reas de uma membrana. Posteriormente a membrana incubada com uma sonda com seqncia de nucleotdeos complementar ao DNA do vrus, marcada com uma substncia radioativa. A presena do DNA viral revelada pela marcao do filme de raios X pela emisso radioativa da sonda.
A tcnica de hibridizao possuiu variaes de acordo com o cido nuclico a ser detectado e com a forma como o material imobilizado na membrana. Quando o cido nuclico (DNA, RNA) imobilizado diretamente na membrana, a tcnica denominada dot ou slot blot. A presena do cido nuclico ser demonstrada pelo aparecimento de uma marca ou borro no local onde foi aplicado o material. Porm, se o material for previamente submetido eletroforese, para a separao das molculas de cido nuclico de acordo com o tamanho, e ento transferido para a membrana, a tcnica denomina-se Southern blot (para DNA) ou Northern blot (para RNA). A reao positiva aparece na forma de bandas marcadas na membrana, correspondentes migrao do cido nuclico durante a eletroforese. Em razo da necessidade da eletroforese e transferncia para a membrana, as tcnicas de Southern e Northern blot so mais trabalhosas e demoradas, porm os resultados so mais informativos. As tcnicas de hibridizao possuem boa sensibilidade e especicidade, e, quando implementadas na rotina do laboratrio, permitem a obteno dos resultados em poucos dias. Outra vantagem que podem ser aplicadas a qualquer agente infeccioso, necessitando-se apenas de uma sonda especca. As restries dessas tcnicas referem-se necessidade de pessoal especializado e disponibilidade de reagentes.
Essa metodologia tem sido amplamente utilizada para a localizao espacial e temporal da presena e expresso de determinados genes. Tambm utilizada na identicao de agentes causadores de tumores. O princpio da tcnica o mesmo da anterior, porm o cido nuclico detectado diretamente nos cortes de tecido. A reao revelada pelo uso de sondas marcadas com substncias radioativas ou com protenas que so, posteriormente, detectadas com o auxlio de anticorpos. As reaes positivas podem ser visualizadas pela exposio a lmes radiogrcos lquidos ou com uso de substncias cromgenas, permitindo a localizao e identicao das clulas infectadas. Devido ao fato de ser trabalhosa e demorada, a ISH no utilizada na rotina laboratorial, sendo empregada em casos especcos, principalmente em estudos de patogenia.
2.4.3 Reao da polimerase em cadeia

A reao da polimerase em cadeia (PCR) uma tcnica altamente especca e sensvel, que consiste na sntese in vitro de uma grande quantidade de cpias de um segmento de DNA existente na amostra. Ou seja, consiste em amplicar o nmero de molculas a partir de uma molcula-alvo original, denominada template ou molde. Essa amplicao pode ser realizada a partir de uma quantidade mnima do cido nuclico-alvo; uma PCR bem padronizada, teoricamente, capaz de detectar e amplicar at uma nica cpia do molde existente na amostra. A regio-alvo a ser amplicada delimitada por primers, que so oligonucleotdeos sintticos de aproximadamente 20 nucleotdeos. Esses pri-
2.4.2 Hibridizao in situ

A hibridizao in situ (ISH) detecta a presena do material gentico do agente (DNA ou RNA) diretamente em cortes histolgicos de tecidos.
71
mers hibridizam com suas regies complementares, que se localizam nas cadeias opostas do DNA, nas regies anqueadoras da seqnciaalvo. Os primers so sintetizados de acordo com a seqncia a ser amplicada, e a sua especicidade depende do seu grau de conservao e complementaridade com a seqncia-alvo. A reao de PCR envolve a realizao de vrios ciclos (entre 30 e 40) de desnaturao (separao da ta dupla), hibridizao dos primers e polimerizao da cadeia de DNA a partir dos primers, pela enzima DNA polimerase. A cada ciclo o nmero de mo-
lculas correspondentes seqncia-alvo duplica e, no nal da reao, acumulam-se milhes de cpias idnticas correspondentes seqncia-alvo inicial. Essas molculas, denominadas genericamente de produtos de PCR (ou amplicons), podem, ento, ser detectadas visualmente em gis de agarose, corados com brometo de etdio, sob luz UV (Figura 3.8). Os produtos de PCR podem tambm ter a sua identidade conrmada por hibridizao com sondas especcas. Essa tcnica tem tido inmeros usos nos diversos campos da Biologia e Medicina.
Seqncia-alvo Molcula de DNA 270pb Denaturao (95C)

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' Primer 2 ''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Reduz a temperatura 1 ciclo 50-60C
Primer 1 ''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Eleva a temperatura 72C
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Eleva a temperatura
Anelamento dos primers
Polimerizao
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
30 ciclos
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
O nmero de cpias duplica a cada ciclo
Gel de agarose
250pb
Figura 3.8. Ilustrao demonstrativa da tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR). A partir da molcula molde original (genoma viral), um segmento especfico amplificado por sucessivas etapas de sntese de DNA. O produto da amplificao pode ser visualizado sob luz UV em um gel de agarose corado com brometo de etdio, aps migrao por eletroforese. O tamanho dos produtos pode ser comparado com um marcador molecular de massa conhecida. (M) marcador molecular, (1) controle negativo, (2) controle positivo, (3, 4 e 5) amostras teste.
72
Captulo 3
A grande difuso da PCR somente foi possvel aps a identicao de uma enzima polimerase de DNA resistente ao calor (Taq Thermophilis aquatics), o que levou simplicao da tcnica associado com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais acessveis. Essas novas tecnologias proporcionaram um domnio maior da tcnica e o desenvolvimento de variaes, como a nested-PCR, multiplex-PCR, RT-PCR e real-time PCR. A nested-PCR realizada em duas etapas. Na primeira etapa, um determinado segmento amplicado pelo mtodo tradicional. Uma segunda etapa , ento, realizada, utilizando-se o produto da primeira reao como molde e um outro conjunto de primers, complementares s seqncias localizadas internamente no produto da primeira reao. Com isso, uma seqncia interna do primeiro produto reamplicada (Figura 3.9).
Seqncia-alvo 1 DNA molde
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Primer 1
Primer 2
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Primeira reao
30 ciclos
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Produtos da primeira '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' reao
Seqncia-alvo 2 DNA molde

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Primer 3
Primer 4
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Segunda reao
30 ciclos
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
Produtos da segunda ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' reao
Figura 3.9. A reao de PCR-nested realizada em duas etapas. Na primeira etapa, utilizado um par de primers externos (1 e 2), que permitem a amplificao de um segmento do genoma viral (seqncia-alvo 1). A segunda etapa utiliza o produto da primeira reao como molde. Esta utiliza um par de primers internos (3 e 4), que permitem a amplificao de um segmento interno seqncia inicial (seqncia-alvo 2). O PCR- nested utilizado para aumentar a sensibilidade e especificidade da amplificao.
Em relao PCR tradicional, a nested-PCR possui as vantagens de maior sensibilidade (duas etapas de amplicao) e especicidade. Uma variao dessa tcnica o semi-nested PCR, em que, na segunda reao, utiliza-se um primer interno e em conjunto com um dos primers da primeira reao. O mtodo da multiplex-PCR baseia-se na utilizao de dois ou mais pares de primers na mesma reao. Cada conjunto de primer especco para uma regio do agente ou de diferentes agentes. Devido a sua versatilidade, essa tcnica utilizada para a busca de variantes do mesmo vrus ou no diagnstico de enfermidades que podem ser causadas por diferentes agentes. Um exemplo o diagnstico de aborto em bovinos, quando realizada uma reao com diferentes pares de primers, cada conjunto sendo especco para um dos agentes suspeitos. A tcnica de RT-PCR (reverse transcriptase PCR) consiste na amplicao de segmentos de RNA. Atravs da transcrio reversa, realizada pela ao da enzima transcriptase reversa, uma cpia de DNA complementar (cDNA) sintetizada a partir da RNA viral (genoma ou produto intermedirio do processo de replicao). Essa nova molcula sintetizada ser usada como template (molde) para a reao de PCR convencional. O desenvolvimento desta tcnica proporcionou um grande avano no estudo e diagnstico dos vrus RNA. O PCR em tempo real (real time PCR) uma variao do PCR, com a capacidade de se detectar e quanticar a amplicao do produto medida que vai sendo sintetizado. Essa tcnica utiliza, alm dos primers, uma sonda marcada com um uorocromo. A sonda complementar a uma regio interna do produto e marcada com uma substncia uorognica. A cada ciclo de sntese, o uorocromo liberado da sonda e essa liberao captada e medida na forma de intensidade luminosa. Esta tcnica tem grande aplicabilidade quando a quanticao do cido nuclico presente na amostra necessria. Tambm possui aplicabilidade em diagnstico de viroses de importncia sanitria estratgica (exemplos: febre aftosa e peste suna clssica), pois permite a obteno dos resultados em poucas horas.
73
2.4.5 Anlise de restrio

Diferentes isolados de vrus podem ser identicados e distinguidos entre si pela anlise dos fragmentos gerados pela clivagem de seus genomas por enzimas de restrio (endonucleases, Figura 3.10). Essas enzimas clivam o DNA em seqncias especcas, compostas por quatro a oito bases; a alterao em uma dessas bases alGenoma BoHV - 1 135.301bp Genoma BoHV - 5 138.390bp
Stios de clivagem da enzima BamHI
tera o stio e resulta em falha de clivagem. Assim, o genoma de um determinado vrus DNA clivado com um conjunto de enzimas, produzindo um conjunto de fragmentos de determinados tamanhos. Outros isolados do vrus que possuam diferenas em quaisquer dos stios de clivagem iro gerar padres de clivagem distintos, podendo-se, assim, fazer a diferenciao entre isolados. A anlise por restrio enzimtica (REA) foi muito utilizada na classicao e caracterizao de isolados de campo. Atualmente, o advento e difuso do seqenciamento de DNA substituiu, com algumas vantagens, essa tcnica, que se encontra restrita a alguns vrus ou em desuso.
2.4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida

9 locais de clivagem 16 locais de clivagem
DNA viral genmico Enzima de restrio BamHI = Digesto do genoma em fragmentos
Eletroforese em agarose
A tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), alm de ser usada para separao de protenas nos passos iniciais do WB, tambm utilizada para a deteco do genoma e em estudos epidemiolgicos de rotavrus, cujo genoma composto por vrios segmentos de RNA. Uma caracterstica dos rotavrus a presena de sorogrupos (ver Captulo 30), que so correlacionados com diferenas na extenso desses segmentos. Essas diferenas iro produzir um padro de migrao na eletroforese, e isso ser utilizado para a identicao do agente e classicao em sorogrupos. A metodologia consiste na extrao do RNA a partir de fezes, separao dos fragmentos por SDS-PAGE e colorao do gel com nitrato de prata. Aps a realizao desse procedimento, as bandas correspondentes aos segmentos genmicos so analisadas, e os padres de migrao dos segmentos so comparados. O SDS-PAGE possui boa sensibilidade e especicidade quando comparado com outras tcnicas de deteco dos rotavrus.
BoHV - 1
Figura 3.10. Ilustrao demonstrativa da anlise de restrio do genoma do herpesvrus bovino. A enzima BamHI reconhece e cliva o genoma do herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) em nove stios (A) e o genoma do BoHV-5 em 16 locais (B). Os produtos da digesto so separados por eletroforese em agarose e visualizados sob luz UV. Os diferentes padres de clivagem resultam em fragmentos de tamanho diferentes, cuja anlise comparativa permite a identificao dos respectivos genomas. No exemplo acima, os locais de clivagem e o tamanho dos fragmentos so meramente ilustrativos.
BoHV - 5
3 Multiplicao de vrus
A obteno de vrus em grandes quantidades essencial para diversos procedimentos virolgicos. Aps o seu isolamento, o vrus deve ser identicado e caracterizado. Para isso, deve ser amplicado a partir da amostra original. Quantidades considerveis de vrus so necessrias
74
Captulo 3
para a realizao de testes sorolgicos (soro-neutralizao SN, HI), produo de antgenos para a imunizao de animais (obteno de anti-soros ou anticorpos monoclonais) ou para uso como imungenos em vacinas. A reproduo da manifestao clnica de uma enfermidade, sob condies experimentais, tambm requer altos ttulos do vrus. Em resumo, a rotina de um laboratrio de virologia envolve necessariamente etapas repetidas e contnuas de multiplicao de vrus com nalidades diversas. Como os vrus necessitam clulas vivas para se multiplicar, sistemas biolgicos so utilizados com esse propsito. Trs sistemas biolgicos tm sido classicamente utilizados para a multiplicao de vrus: animais susceptveis, ovos embrionados de galinha (OE) e cultivos celulares.
dongos lactentes ocasionalmente utilizada para o diagnstico do FMDV. Para alguns vrus que no replicam ecientemente em cultivo celular, como o vrus da peste suna africana (ASFV), a inoculao de animais, para se obter altos ttulos do vrus, empregada.
3.2 Inoculao em ovos embrionados

Vrios vrus de aves e alguns de mamferos replicam com ecincia em tecidos de embrio de galinha. A habilidade desses vrus em se multiplicar nesse sistema biolgico tem sido utilizada para a multiplicao de vrus em laboratrio, seja para a deteco de vrus em material clnico, seja para a amplicao de vrus. Essa metodologia teve grande difuso antes do desenvolvimento e estabelecimento dos cultivos celulares, porm, nos dias atuais, est limitada a poucos vrus, principalmente queles que no replicam em cultivos. O material pode ser inoculado por vrias vias, dependendo do agente suspeito (Figura 3.11). A presena do agente pode ser evidenciada pelo desenvolvimento de leses macro e microscpicas caractersticas no embrio e/ou nas membranas vitelnicas (Tabela 3.2). Tambm se pode observar retardo no desenvolvimento e morte do embrio. A presena do agente e a sua quanticao tambm pode ser detectada pela pesquisa da atividade biolgica do agente (HA), de antgenos (IFI) ou de cidos nuclicos virais (hibridizao, PCR).
Cavidade amnitica
|| || || || || || || || || ||
3.1 Inoculao em animais susceptveis

Durante muitos anos, a reproduo da doena em animais se constituiu na forma mais objetiva de deteco de vrus em material suspeito. A inoculao de animais tambm serviu para a amplicao do agente para diversos ns, entre eles a produo de vacinas. Os fatores limitantes para esse procedimento incluem o custo elevado de manuteno, a imunidade prvia dos animais ao agente e a baixa reprodutibilidade da enfermidade. Nos ltimos anos, questes ticas referentes ao uso experimental de animais somaram-se a essas restries. No princpio do sculo, os bovinos eram inoculados com o vrus da febre aftosa (FMDV) no epitlio lingual. Aps o desenvolvimento de vesculas, o uido era coletado, inativado e utilizado para a produo de vacinas. A utilizao de extratos de crebro de camundongos infectados com o vrus da raiva (RabV), para a produo de vacinas, outro exemplo da inoculao em animais. Com o desenvolvimento dos cultivos celulares, essa metodologia deixou de ser utilizada. Atualmente, a multiplicao de vrus pela inoculao de animais possui uso muito restrito, dentre os quais se destacam a prova biolgica para o diagnstico da raiva em camundongos lactentes (Captulo 11). A inoculao de camun-
Casca
Embrio
Albumina
Saco da gema
|||||||||||||||||||||||||||
Membrana crio-alantide
Figura 3.11. Vias de inoculao de vrus em ovos embrionados.
||
|| |
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
Cavidade alantide
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
75
Tabela 3.2. Vrus animais que replicam em embries de pinto e efeitos da replicao Vrus
Varola bovina
Idade do embrio
10-11 dias 7 dias 7 dias 10-11 dias 10-11 dias
Via de inoculao
Membrana corioalantide Membrana corioalantide ou cavidade alantide Membrana corioalantide Cavidade alantide Qualquer via
Leso/conseqncia
Focos esbranquiados (pocks) na membrana, morte do embrio Morte do embrio Pocks na membrana crio -alantide. Morte do embrio
BOVINO
Vrus da estomatite vesicular (VSV) Lumpy skin vrus (LSDV)
EQINO
Influenza eqina Encefalomielite eqina (EEE, WEE e VEE) Vrus da lngua azul (BTV)
OVINOS
9-11 dias
Intravenosa
Morte do embrio
Vrus da doena de Aujeszky (PRV)
10 dias
Membrana corioalantide
Leses na membrana corioalantide, invaso do sistema nervoso central, e protuso cerebral do embrio, morte do embrio. Retardo do crescimento, distrofia muscular, encefalomalcia
CANINOS e FELINOS
SUNO
Raiva (RabV)
7 dias
Gema
AVES
Newcastle (NDV) Influenza aviria (AIV)
9-11 dias 9-11 dias
Membrana corioalantide ou cavidade alantide Cavidade alantide
Morte do embrio Morte do embrio
3.3 Inoculao em cultivo celular

A deteco e identicao de vrus em amostras clnicas, aps a sua multiplicao em cultivo celular, constituram-se em uma das primeiras formas de deteco viral. O advento dos antibiticos contribuiu de forma decisiva para o desenvolvimento da Virologia, pois somente a partir da foi possvel estabelecer cultivos celulares em grande escala. A propagao do agente em cultivo celular permite que quantidades mnimas de partculas vricas viveis sejam detectadas, amplicadas e, posteriormente, caracterizadas. Para os vrus que replicam bem em clulas de cultivo, esse sistema biolgico possui aplicaes virtualmente ilimitadas, incluindo: a) isolamento e identicao com ns diagnsticos; b) obteno de estoques virais para caracterizao biolgica e molecular; c) uso em testes sorolgicos; d) produo de estoques virais para estudos de patogenia; e) produo de antgeno para a imunizao de animais (produo de anti-soro ou anticorpos monoclonais); f) produo de vacinas, entre outros.
O isolamento em cultivo celular considerado a prova ouro (golden standard) em diagnstico virolgico, sendo utilizada como padro de comparao com qualquer outro mtodo. Esse mtodo tambm capaz de detectar amostras ocasionais de vrus em material clnico. Vrios agentes virais conhecidos resultaram de achados acidentais em cultivo de clulas, entre estes o circovrus suno (PCV-1) e o vrus smio 40 (SV-40). Os cultivos celulares ainda se constituem na forma mais simples e econmica de obteno de grandes quantidades de vrus vivel para a pesquisa e produo de vacinas. Devido ao fato de nenhuma linhagem celular ser susceptvel a todos os vrus, muitos laboratrios mantm cultivos celulares susceptveis a diferentes agentes. A escolha de um tipo celular para o isolamento ou multiplicao do vrus est, muitas vezes, associada com a espcie de origem do material e com o histrico clnico da enfermidade. Geralmente, so utilizadas clulas originrias da espcie animal de origem do vrus. No entanto, isso no regra, pois existem vrios vrus que replicam em clulas de cultivos de ou-
76
Captulo 3
tras espcies. Por exemplo, o FMDV cultivado em clulas de rim de hamster (BHK-21); o vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos (PRRSV) cultivado em clulas de rim de macacos (MA-104); e o herpesvrus eqino (EHV) cultivado em clulas de rim de coelhos (RK-13) ou em clulas de rim de macaco-verde africano (Vero). Basicamente existem dois tipos principais de cultivos celulares: cultivos primrios e as linhagens contnuas. Cada um desses tipos apresenta vantagens e restries. Os cultivos primrios originam-se da remoo de um rgo fresco de um embrio ou feto recm-sacricado. O rgo removido submetido a um processo mecnico e enzimtico para fracionamento do tecido e individualizao das clulas. As clulas individualizadas so cultivadas em frascos ou garrafas, onde iro aderir e formar uma monocamada. O cultivo realizado com meio nutritivo e promotores de crescimento, a temperatura de incubao de 37C. Nesse processo, a diviso celular bastante restrita, com uma propagao lenta e limitada, podendo-se dizer que ocorre uma diviso celular a cada 24 horas. Assim, necessria a realizao de subcultivos peridicos, e isso realizado atravs da individualizao da monocamada pela ao enzimtica, ressuspenso e semeadura em novos frascos de cultivo. Nesses novos cultivos, o nmero celular ir duplicar ou quadruplicar em poucos dias. Aps um nmero varivel de subcultivos (10 a 30 passagens, dependendo do tipo celular), as clulas comeam a apresentar taxas reduzidas de multiplicao e, eventualmente, cessam a multiplicao. Os cultivos primrios so os preferidos para a realizao da multiplicao viral, pois possuem caractersticas morfolgicas e siolgicas bastante semelhante s clulas dos rgos originais. Sendo assim, possuem uma maior sensibilidade para a infeco viral. A restrio que esse tipo de cultivo apresenta o nmero limitado de subcultivos, gerando necessidade de preparao contnua nos laboratrios com alta demanda celular. As linhagens celulares ou linhagens contnuas so derivadas de clulas tumorais ou de tecidos normais que sofreram transformao in vitro. Esses tipos de cultivos celulares so cultivados de maneira semelhante aos cultivos primrios e pos-
suem capacidade de multiplicao quase indenida. Por estarem bem adaptadas s condies do cultivo, so de fcil manipulao e propagao. A maioria dos laboratrios d preferncia a esse tipo de cultivo celular devido sua uniformidade, estabilidade e facilidade de manuseio. Por causa dessa alta taxa de propagao em laboratrio, as linhas celulares podem sofrer alteraes morfolgicas e siolgicas que alteram a sensibilidade infeco viral. No entanto, a sensibilidade infeco com alguns vrus pode ser inferior nas linhagens celulares em comparao com os cultivos primrios, mas as vantagens citadas acima compensam este aspecto. Linhagens celulares podem ser obtidas pela transferncia entre laboratrios ou pela aquisio junto a bancos depositrios. Diversas linhagens celulares so utilizadas rotineiramente em laboratrios de virologia em atividades de diagnstico e pesquisa. O nome dessas linhagens geralmente est relacionado com o rgo de origem e freqentemente contm as letras iniciais do nome do descobridor ou outra caracterstica marcante. Alguns exemplos de linhagens celulares comumente utilizadas em Virologia Veterinria so: MDBK (Madin-Darby bovine kidney), MDCK (Madin-Darby canine kidney), CRFK (Crandell feline kidney), CRIB (cell resistant to infection with bovine viral diarrhea vrus), RK13 (rabbit kidney), PK15 (porcine kidney 15), SK6 (swine kidney), BHK-21 (baby hamster kidney clone 21), IBRS2 (Instituto Biolgico rim de suno clone 2), clulas Vero, entre outras. Existem ainda cultivos de clulas que se multiplicam em suspenso, ou seja, no necessitam de uma superfcie de contato para adeso e multiplicao. Uma grande vantagem desse tipo de cultivo a concentrao do nmero de clulas, reduzindo a relao do nmero de clulas, tamanho do frasco e volume de meio utilizado. Essa uma caracterstica desejvel e amplamente utilizada para a produo de vacinas. Clulas BHK-21 que se multiplicam em suspenso so utilizadas para a multiplicao e produo de estoques do RabV e o FMDV para uso em vacinas. Alguns vrus no replicam ecientemente em clulas de cultivo, assim, a sua amplicao requer o uso de outro sistema biolgico, como animais susceptveis (animais de laboratrio ou os hospedeiros naturais) ou ovos embrionados.
77
Outros vrus no replicam em quaisquer dos sistemas biolgicos utilizados atualmente, como os papilomavrus, vrus da hepatite C de humanos e os vrus causador da hepatite B (famlia Hepadnaviridae). O processamento de amostras que potencialmente contenham vrus deve ser realizado rapidamente e seguir algumas regras para aumentar a probabilidade de deteco e multiplicao do agente. Para o diagnstico, as amostras devem ser inoculadas em cultivos celulares o mais brevemente possvel. A inoculao consiste na deposio do material suspeito sobre as monocamadas, seguido de incubao por 1 a 2 horas (perodo de adsoro). Posteriormente, o incu-
lo desprezado, e a monocamada lavada para remover ou reduzir a presena de substncias txicas e/ou contaminao bacteriana e fngica. Aps, o meio de cultivo reposto, e as clulas so incubadas a 37C, com uma atmosfera de 5% de CO2. As monocamadas devem ser observadas diariamente para a presena de alteraes morfolgicas celulares associadas com a replicao viral (Figura 3.12). Essas alteraes, conseqncias do processo replicativo dos vrus, so denominadas genericamente de efeito citoptico (ECP cytopathic effect). Uma grande parcela dos vrus produz alteraes morfolgicas nos cultivos celulares, que, muitas vezes, so caractersticas de um determinado agente ou grupo de vrus. As altera-
Figura 3.12. Efeito citoptico produzido pela replicao viral em clulas de cultivo. Clulas de linhagem de rim bovino no-infectadas (A) ou inoculadas com o BoHV-1 (B); BVDV (C); BoHV-2 (D); enterovrus bovino (E); e PI-3v (F). Pode-se observar diferentes tipos de efeito citoptico. Para descrio detalhada ver tabela 3.3.
78
Captulo 3
es freqentemente produzidas pelos vrus so vacuolizao citoplasmtica, formao de clulas gigantes multinucleadas (sinccios) e arredondamento celular entre outros. Na Tabela 3.3, esto
descritos os efeitos citopticos produzidos pelos principais vrus de interesse veterinrio. A visualizao dessas alteraes ao microscpio ptico apenas um indicativo da presena
Tabela 3.3. Principais vrus animais, clulas susceptveis para replicao in vitro e efeito citoptico
Vrus
Adenovrus bovino (BAdV) Vrus da diarria viral bovina (BVDV) Herpevrus bovino tipos 1 e 5 (BoHV 1 e 5)
Tipo celular
Clulas de origem renal ou primrias de testculos de bovinos.
Efeito citoptico
Arredondamento e desprendimento celular, formao de focos infecciosos como cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Vacuolizao citoplasmtica, degenerao celular, enrugamento do tapete, desprendimento e lise celular (somente as amostras citopatognicas).
Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular; formao de focos infecciosos com o aspecto de cachos de uva, lise. Corpsculos intranucleares.
Arredondamento, citomegalia e refringncia celular, formao de grandes sinccios, desprendimento das clulas. Corpsculos intracitoplasmticos.
MDBK, SK-6, PK15, BT, cultivos primrios de pulmo, corneto nasal, rim e testculo de bovino. MDBK, CRIB, HeLA, BT, EBTr e cultivos primrios de pulmo, corneto nasal, rim e testculo de bovino. MDBK, BT, HELA e cultivos primrios de corneto nasal e de rim de bovino. MDBK, BT, cultivos primrios de clulas do trato respiratrio de bovinos.
Parainfluenza bovina tipo 3 (bPI-3) Vrus respiratrio sincicial bovino (BRSV) Rotavrus bovino (BRV) Coronavrus bovino (BCoV) Parvovrus bovino (BPV) Virus da mamilite herptica (BoHV-2) Vrus da leucose bovina (BLV)
Arredondamento e refringncia celular, formao de pequenos sinccios e desprendimento das clulas. Corpsculos acidoflicos intracitoplasmticos. Vacuolizao citoplasmtica, degenerao e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos.
Formao de sinccios.
Citomegalia e refringncia celular, arredondamento e desprendimento.
CV-1, VERO, MA-104, BSC-1, Aubek, MDBK VERO, HRT-18, cultivos primrios de rim de bovino. MDBK, EBTr, BT e cultivos primrios de rim de feto bovino. MDBK, CRIB e cultivos primrios de origem bovina.
Cultivo primrio de bao e pulmo bovino e clulas embrionrias diplides de humanos. BHK-21, IB-RS-2 cultivos primrios de tireide bovina, cultivos primrios de rim de suno, bovino ou cordeiro.
Bovinos
Arredondamento celular, sinccios multinucleares. Corpsculos eosinoflicos intranucleares.

Formao de sinccios.
Vrus da febre aftosa (FMDV) Vrus da estomatite vesicular (VSV) Vrus da estomatite papular (BPSV) Vrus da varola e pseudovarola bovina Rinderpest (RPV)
Condensao nuclear, arredondamento, desprendimento e lise celular.
VERO, BHK-21 ou IB-RS2. BT, cultivo de rim de fetos bovinos.

Cultivos primrios de clulas de testculo bovino. VERO ou cultivos primrios de rim de terneiros.
Arredondamento, retrao e desprendimento celular, lise.

Arredondamento, agregao, lise celular. Corspsculos intracitoplasmticos. Formao de sinccios. Corpsculos intracitoplasmticos.
Arredondamento e refringncia celular, seguido de retrao com alongamentos citoplasmticos pontes e formao de sncicios. Corpsculos intracitoplasmticos.
Vrus da doena Lumpy Skin LT ou cultivos primrios de origem (LSDV) bovina, caprina ou ovina (preferencialmente de raas lanferas). Vrus da febre do vale Rift (RVFV) Vrus da febre catarral maligna (MCFV)
Arredondamento e retrao da membrana celular e marginalizao da cromatina nuclear. Corpsculos intracitoplasmticos. Arredondamento e rpida lise celular.
VERO, BHK-21, CER e cultivos primrios de rim de terneiro e cordeiro.
Cultivos primrios de clulas de rim, bao, tireide, pulmo, testculo e plexo coride de fetos ovinos ou bovinos.
Sinccios grandes, contrao, arredondamento e desprendimento celular da monocamada. Corpsculos intranucleares.
79
Tabela 3.3. Continuao.
Vrus
Lngua azul (BTV) Ectima contagioso (ORFV)
Tipo celular
BHK-21, VERO
Efeito citoptico
Arredondamento celular, fuso.
Arredondamento celular, aglomerao e desprendimento celular. Corpsculos de incluso intracitoplasmticos eosinoflicos.
Ovinos e caprinos
HeLa, VERO, cultivos primrios de rim e testculo ovino e bovino; fibroblastos de galinhas e patos. Clulas da membrana sinovial de fetos caprinos e cultivos primrios de testculos de caprinos. Cultivos de pulmo fetal, de clulas do plexo coride de ovino ou de leuccitos sangneos perifricos. Cultivos primrios de testculo de cordeiro.
Artrite e encefalite caprina (CAEV) Pneumonia progressiva dos ovinos Maedi-Visna (OPPV) Poxvrus ovino e caprino
Formao de sinccios.
Formao de sinccios e degenerao celular.
Vacuolizao nuclear. Corpsculos intracitoplasmticos eosinoflicos. Arredondamento, agregao celular e formao de sncicio com o ncleo na forma circular. Vacuolizao de algumas clulas. Corpsculo de incluso intracitoplasmticos e intranucleares.
Peste dos pequenos ruminantes (PPRV)
VERO e cultivo primrio de rim de cordeiro
Herpesvrus eqino (EHV 1, 2, 3 e 4)
VERO, ED, RK-13, MDBK, BHK-21 e cultivos primrios de rim eqino e fibroblastos da derme eqina.
Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular; formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Formao de sinccios somente em leuccitos.
Lise celular
Eqinos
Anemia infecciosa eqina (EIAV) Encefalomielite eqina (EEE, WEE e VEE) Arterite viral eqina (EAV)
ED, PBMC eqino, fibroblastos de derme eqina. VERO, RK-13, BHK-21 e cultivos de fibroblastos de embrio de galinhas e patos. RK-13, VERO, LLC-MK2 e cultivos primrios de clulas de macaco, coelho e eqino. MDCK
Desprendimento celular do tapete, lise
Influenza eqina (EIV)
Arredondamento, desprendimento celular
Doena de Aujeszky (PRV ou SuHV-1)
PK-15, SK6, MDBK, cultivos primrios de origem suna.
Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Citomegalia e arredondamento celular, desprendimento das clulas da monocamada. Copsculos intranucleares.
A . maioria dos isolados no causa citopatologia
Adenovrus suno
Cultivos primrios de rim suno, PK-15 e SK6.
Sunos
Peste suna clssica (CSFV) Sndrome respiratria e reprodutiva suna (PRRSV) Enterovrus suno (PEV)
SK6, PK-15. MARC-145, MA-104 e clulas de origem de smios.
Aumento de tamanho, arredondamento e agregao celular, lise.
PK-15, IB-RS-2, SST e cultivos de clulas de rim e testculos de sunos.

Cultivos primrios de rim suno, ST, PK-15 e SK6.
Lise e desprendimento celular, destruio da monocamada.
Parvovrus suno (PPV)
Arredondamento celular e picnose. Corpsculos intranucleares.
80
Captulo 3
Tabela 3.3. Continuao.
Vrus
Parvovrus canino (CPV) Coronavrus canino (CCoV) Rotavrus canino Herpesvrus canino (CaHV)
Tipo celular
CRFK, MDCK, A-72 e cultivos primrios de clulas de rim e pulmo de canino e felino.
Efeito citoptico
Aumento do ncleo, enrugamento da membrana celular, arredondamento das clulas, lise.
Formao de sinccios.
CRFK, A-72 e cultivos de rim, timo e sinvia de canino. MA-104, A-72, CRFK e cultivos primrios de rim de canino. MDCK e cultivos primrios de rim de canino.
Vacuolizao citoplasmtica, degenerao e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos. Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Formao de sinccios, desprendimento celular do tapete, incluses intracitoplasmticas.
Caninos e Felinos
Vrus da cinomose (CDV) Adenovrus canino (CAdV) Vrus da raiva (RabV) Calicivrus felino (FCV) Vrus da rinotraquete felina (FeHV)
VERO, MDCK e PBMC de caninos e furo.
MDCK, cultivos primrios de testculo ou rim de canino e felino.

CV-1, BHK-21, VERO, HeLa e cultivos de fibroblastos de embrio de galinhas.
Arredondamento e desprendimento celular, lise e destruio do tapete. Corpsculos intranucleares. Arredondamento e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos. Arredondamento e desprendimento celular, lise e destruio do tapete. Desorganizao nuclear, arredondamento, desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares. Arredondamento e desprendimento celular.
CRFK, FCWF-4, Fe3TG, VERO e fibroblastos felinos.

CRFK e cultivos primrios de pulmo, rim e testculo de felino.
Vrus da peritonite infecciosa felina (FeCoV) Vrus da panleucopnia felina (FPLV) Vrus da imunodeficincia felina (FIV)
CRFK, A-72, FeWF e cultivos primrios de tecidos fetais de felinos. CRFK e Fe3TG. PBMC felino.
Arredondamento e aumento da refringncia das clulas. Formao de sinccios.
Galinhas e Outras Aves
Doena de Newcastle (NDV) Doena de Gumboro (IBDV)
Cultivos primrios de rim de embrio de galinhas, cultivos primrios de fibroblastos de galinhas e BHK-21.
Formao de sinccios, morte celular.
Cultivos primrios de clulas da bursa, rim e fibroblastos de embrio de galinha. CEK e cultivos de rim, fgado e pulmo de galinhas. MDCC-MSB1. CK e fibroblastos de embrio de galinhas ou patos. QT-35, cultivos primrios de rim ou derme de embrio de galinha.
. Efeito pouco discernvel
Vrus da laringotraquete aviria (ILTV) Vrus da anemia aviria (CAV) Vrus da doena de Marek (MDV) Poxvrus avirio
Citomegalia, formao de sinccios.
Citomegalia, lise celular. Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular. Corpsculos intranucleares. Arrendondamento, refringncia celular e desprendimento.
de um agente viral na amostra suspeita. Alguns vrus possuem a capacidade de infectar cultivos celulares de diversas origens, como o vrus da lngua azul (BTV), que infecta clulas de mamferos e insetos e variaes do efeito citoptico po-
dem ser observadas. No entanto, a ausncia de alteraes no indica necessariamente a ausncia de vrus. Alguns vrus infectam as clulas sem causar ECP e so denominados de no-citopticos, como o caso do circovrus suno (PCV-2).
81
Outro exemplo o vrus da diarria viral bovina (BVDV), que possui amostras citopatognicas e no-citopatognicas (Captulo 22). A conrmao e identicao do agente so, geralmente, realizadas por mtodos que detectam alguma atividade biolgica (HA ou HAD), antgenos (IFA ou IPX) ou cidos nuclicos virais (PCR, hibridizao). A neutralizao com anti-soro especco tambm pode ser usada para a identicao do agente causador do ECP nos cultivos. Colorao direta, como Giemsa ou hematoxilina e eosina (para corpsculos de incluso), tambm podem ser utilizadas para a conrmao da presena de alguns agentes.
4 Quanticao de vrus
A realizao de vrias tcnicas virolgicas requer o conhecimento da quantidade aproximada de partculas vricas presente no material. O procedimento de quanticao denominado titulao, e o valor obtido dito ttulo viral. Existem tcnicas diretas e indiretas para a quanticao das partculas vricas. As tcnicas diretas baseiam-se na contagem das partculas presentes em uma amostra e observadas ao microscpio eletrnico. Esse mtodo capaz de informar o nmero preciso de partculas, porm no diferencia partculas infecciosas de no-infecciosas. Devido a essas particularidades, o mtodo direto de quanticao viral no utilizado na rotina laboratorial. As tcnicas indiretas possuem como base a infectividade do vrus, que medida por meio de um indicador biolgico. A quanticao da infectividade de uma determinada suspenso viral requer necessariamente o uso de sistemas biolgicos para a replicao do agente (cultivos celulares, OE ou animais). Como j mencionado, os cultivos celulares so muito utilizados com esse propsito. Para os vrus que no replicam em cultivo, pode-se recorrer aos OE ou animais.
mero determinado de cultivos celulares. Quanto maior o nmero de rplicas, mais preciso ser o resultado. Essa tcnica geralmente realizada em placas de microtitulao de 96 cavidades, e cada diluio do material inoculada em oito rplicas. Aps um determinado perodo de incubao (varia entre 48 h e vrios dias, dependendo do vrus), os cultivos so monitorados em relao ao aparecimento do ECP (ou submetidos IFA ou IPX para deteco de antgenos virais), que so os indicadores da presena de infectividade na respectiva diluio. O ttulo viral geralmente expresso como a recproca da maior diluio capaz de provocar reao especca (ECP ou antgenos virais) em 50% dos cultivos e a unidade ser TCID50 (tissue culture infection dose). Quando a titulao realizada em animais ou em OE, e o indicador a morte, a unidade usada dose letal 50% (LD50). Quando o resultado da infectividade medido de outra forma que no a morte (ex.: paralisia, presena de leses de pele, prurido), a unidade empregada dose infectiva 50% (ID50). Para os vrus com capacidade hemaglutinante, aplica-se o teste de HA, ento a unidade de expresso ser unidade hemaglutinante (UH). Os valores obtidos nos ensaios de titulao so submetidos anlise matemtica, que converte os dados de infectividade em valores numricos com uma acurcia aceitvel. Alguns mtodos de clculo so utilizados, no entanto, o mtodo de Reed e Muench o mais difundido para o clculo de ttulo viral (Quadro 3.1). Os mtodos de Spearman e Krber; e Seligman e Mickey so menos populares. Esses mtodos, apesar de diferirem na metodologia aplicada, baseiam-se na observao da infectividade, portanto, somente consideram as partculas infecciosas.
4.2 Ensaio de placa

Outro mtodo muito utilizado para a quanticao de vrus o ensaio de placa, descrito inicialmente por Dulbecco, em 1952. Diluies seriadas da suspenso viral so inoculadas em tapetes celulares pr-formados, geralmente em placas poliestireno de seis cavidades. Aps a adsoro e a remoo do inculo, os tapetes so recobertos
4.1 Diluio limitante

Os testes que utilizam a diluio limitante foram os primeiros desenvolvidos e so muito utilizados pela sua simplicidade. O material inicialmente submetido diluio seriada, e cada diluio serve como inculo para um n-
82
Captulo 3
Testes de infectividade so rotineiramente utilizados para o clculo do ttulo viral (nmero de unidades infecciosas por unidade de volume), que comumente expresso por TCID50/mL ou PFU/mL. Uma unidade infecciosa definida como a menor quantidade do vrus capaz de produzir um efeito biolgico detectvel (efeito citoptico, ECP) em clulas de cultivo in vitro, ou doena clnica, ou morte em animais. No caso de cultivos celulares, uma unidade infecciosa equivaleria a uma
partcula viral vivel capaz de infectar e replicar em uma clula susceptvel. 1.TCID50 definida como a diluio de um determinado vrus necessria para infectar 50% dos cultivos celulares inoculados. Esse tipo de teste consiste na produo e deteco de ECP nas clulas infectadas. O clculo da TCID50 em uma suspenso inicial de vrus pode ser feito pelos mtodos de Reed & Muench ou Spearman-Krber.
Cultivos celulares Diluio

No-infectados
10 10
-1
ndices acumulados
Noinfectados
0 0 0 0 2 7 15 23
Infectados
8 8 8 8 6 3 0 0
Infectados
41 33 25 17 9 3 0 0
Noinfectados + infectados
41 33 25 17 11 11 15 23
Porcentagem (%) = [Infectados/(infectados + no-infectados)] X

41/41 =100% 33/33 =100% 25/25 =100% 17/17 =100% 9/11 =81% 3/11 =27% 0/15 =0% 0/23 =0%
0 0 0 0 2 5 8 8
-2
10-3 10
-4
10-5 10
-6
10-7 10
-8
Para o clculo dos ndices acumulados dos cultivos noinfectados (isto , onde no se observou ECP), soma-se os valores dos cultivos no-infectados, iniciando-se a partir da -8 menor diluio (10 ). J o clculo do ndice dos cultivos infectados, realizado pelo somatrio das culturas infectadas -1 (onde o ECP foi visualizado) a partir da maior diluio (10 ). Assim, a diluio apresentada no Quadro 3.1 necessria para a infeco de 50% dos cultivos celulares, obviamente estar entre -6 -5 as diluies 10 (27% infectados) e (10 ) (81% infectados). A distncia proporcional entre essas duas diluies calculada da seguinte forma: (% positivo acima de 50%) - 50 ------------------------------------------------------------------------ = (% positivo acima de 50%) - (% positivo abaixo de 50%) Assim, tem-se: 81-50 81-27 = 0,57
Este ndice ou distncia proporcional utilizado para o clculo do ttulo viral pelo uso da equao: (fator da diluio onde se observou ECP em mais de 50% das culturas de clulas) + (ndice ou distncia proporcional multiplicado pelo logaritmo do fator de diluio). Assim, tem-se (-5) + (0,57 x 1) = -5,57. Desse modo, a diluio limitante da suspenso inicial do vrus capaz de infectar -5,57 50% dos cultivos celulares ser de 10 . A recproca deste nmero ser o ttulo viral por unidade de volume empregado para -5,57 a realizao da prova, ou seja, 10 TCID50 em 50L. Rotineiramente, o ttulo viral expresso em mililitros (mL). Para isso, basta multiplicar o valor obtido por 20 (1 mL contm 20 vezes o volume de 50L utilizado para a realizao da prova). -5,57 6,57 6,87 Finalmente, tem-se 10 que equivalente a 2 x 10 ou 10 TCID50/mL.
Quadro 3.1. Quantificao de vrus por diluio limitante
com uma camada de meio semi-slido base de gar ou carboximetilcelulose, e incubados por 24 a 72 horas, variando conforme o agente. As partculas virais que penetraram nas clulas durante a adsoro iro replicar e produzir prognie viral. A cobertura semi-slida, no entanto, impede que as partculas vricas produzidas se disseminem
distncia. A transmisso do vrus a partir das clulas inicialmente infectadas ocorre apenas para as clulas vizinhas, pela transmisso direta entre clulas. Aps alguns dias, so observados focos de destruio celular nos tapetes, denominados placas. Cada placa representa um determinado nmero de clulas infectadas e destrudas a par-
83
tir de uma clula originalmente infectada. O nmero de placas produzidas no tapete, portanto, corresponde ao nmero aproximado de unidades infecciosas presentes na diluio inoculada. Para uma melhor visualizao e contagem das placas, os tapetes so corados com cristal violeta (Figura 3.13). Nessa tcnica, a quanticao expressa como unidade formadora de placas por mililitro (PFU/mL). Para o clculo nal do ttulo, leva-se em considerao o nmero de placas produzidas em cada diluio e o volume utilizado para inoculao. Um exemplo de titulao, usando essa tcnica, est descrito no Quadro 3.2. Os ensaios em placa so utilizados principalmente para a quanticao de vrios vrus citopatognicos (ou citopticos), mas podem tambm ser utilizados para vrus que no induzem citopatologia. Nesses casos, os focos (e no placas) de replicao viral podem ser detectados e contados aps a realizao da tcnica de IPX. Alm de quanticao viral, os ensaios de placa so tambm utilizados com outras nalidades, incluindo: a) clonagem biolgica e puricao de vrus; b) anlise de fentipo de variantes virais; c) ensaios de neutralizao viral por anticorpos monoclonais ou policlonais; d) testes de
atividade antiviral de compostos qumicos; e) estudos de cintica e replicao viral, entre outras.
Figura 3.13. Ensaio de placa. Tapetes de clulas BHK-21 foram infectados com diferentes diluies do vrus da estomatite vesicular (VSV) e, 48 horas aps, foram corados com cristal violeta. Linha superior: a ausncia de placas indicativa da ausncia de vrus; Linha inferior: observa-se inmeros focos infecciosos, indicando a replicao viral e lise celular.
4.3 Outros mtodos de quanticao

Mtodos mais modernos que utilizam a biologia molecular tm sido empregados para a quanticao de vrus, principalmente em medi-
O ttulo de uma suspenso viral do VSV foi calculado pelo mtodo de ensaio de placa. Para isso, trs placas de seis cavidades, contendo uma monocamada prformada de clulas BHK-21 foram inoculadas. A partir da suspenso original, realizou-se oito diluies seriadas na base 10, que serviram como inculo. Cada diluio foi inoculada em duplicada e, para isso, foram
utilizados 200L/cavidade. Aps o perodo de adsoro, o inculo foi removido e meio de cultivo contendo carboximetilcelulose foi adicionado. Aps 24 horas de incubao, os tapetes celulares foram corados por cristal violeta. Os nmeros da contagem das placas esto apresentados abaixo.
Nmero de placas
Diluio 10-1 incontveis Rplicas incontveis Mdia incontveis 10-2 incontveis 10
-3
10-4 96 89 92,5
10-5 35 27 31
10-6 0 0 0
10-7 0 0 0
10-8 0 0 0
Controle 0 0 0
168 150 159
Para a obteno do ttulo, utiliza-se o nmero mdio de placas presentes na maior diluio em que foi possvel observar a replicao do vrus. Dessa maneira, tem-se: 31 5 6 x 10 PFU/200L, que o equivalente a 3,1x10 PFU/200L.
Normalmente o ttulo expresso em mililitro (mL), nesse caso, o volume inoculado foi de 200L e, para realizar a transformao, deve-se multiplicar por 5. Tem-se, ento, 6 7 15,5 x 10 PFU/mL ou 1,55 x 10 PFU/ml.
Quadro 3.2. Quantificao de vrus por ensaio de placa
84
Captulo 3
cina humana. Essas tcnicas mensuram a carga viral (ou quantidade de vrus) pela anlise quantitativa do material gentico viral presente em uma amostra clnica. A quantidade de vrus presente nas secrees e excrees de animais infectados com o FMDV pode ser estimada atravs da tcnica de real time PCR. Essa mesma metodologia tambm pode ser aplicada para os vrus da peste suna clssica (CSFV) e AFSV, entre outros. Imunoensaios quantitativos e outros procedimentos imunolgicos que fornecem a titulao e que avaliam a presena do vrus em cada diluio so amplamente usados. Esses mtodos apresentam a vantagem de permitir realizar diluies, adio de reagentes e leituras colorimtricas automatizadas. Os dados da leitura crua so posteriormente analisados por mtodos matemticos que permitem a identicao correta e precisam das unidades infectantes presentes no material testado. No entanto, esses mtodos possuem aplicabilidade restrita em medicina veterinria e dicilmente sero substitudos pelos mtodos tradicionais.
A caracterizao de uma amostra viral uma etapa posterior sua deteco e identicao. Essa etapa geralmente envolve a caracterizao antignica ou sorolgica, que pode ser denida como o perl dos antgenos de um vrus. A obteno deste perl realizada pelo uso de testes que detectam e identicam os determinantes antignicos presentes nas protenas virais. Vrias tcnicas so utilizadas com essa nalidade, incluindo a IFA com anticorpos monoclonais, soroneutralizao, xao do complemento, ELISA, alm de outras tcnicas sorolgicas. A forma de caracterizao a ser utilizada depende das particularidades de cada famlia de vrus e da disponibilidade de tcnicas e reagentes do laboratrio. A identicao de seqncias especcas pode ser realizada pelo uso de tcnicas como o PCR, anlise de restrio ou seqenciamento do genoma viral.
5.1 Sensibilidade a solventes lipdicos

Existe uma correlao entre presena do envelope e susceptibilidade dos vrus aos solventes lipdicos. Durante muito tempo, uma forma de identicao e caracterizao da presena de vrus envelopados foi o tratamento com solventes lipdicos previamente inoculao em cultivo celular ou ovo embrionado. No envelope viral, encontram-se inseridas glicoprotenas, que so responsveis pelas interaes iniciais vrus-clula. A remoo do envelope dos vrus resulta em perda de infectividade e inativao da partcula. A maioria dos vrus envelopados sensvel ao ter e/ou clorofrmio, que so os solventes normalmente utilizados (paramixovrus, herpesvrus, mixovrus entre outros); no entanto, alguns vrus, como os poxvrus, apresentam variaes de sensibilidade ao ter.
5 Identicao e caracterizao de um isolado

Os termos isolado ou amostra de vrus referem-se a um vrus que foi detectado e identicado, mas que ainda no foi completamente caracterizado. O termo cepa designa um vrus cujas principais caractersticas genotpicas e fenotpicas j foram estudadas e so conhecidas. As cepas so geralmente utilizadas como referncia em testes de diagnstico, em pesquisas e para a produo de reagentes. A primeira etapa aps a deteco de um agente viral a partir de amostras clnicas a sua identicao. Isso pode ser realizado preliminarmente pelas caractersticas do ECP produzido nos cultivos ou pelas alteraes produzidas no embrio de galinha. A ME pode ser utilizada para a identicao inicial do agente, de acordo com as suas caractersticas morfolgico-estruturais. A conrmao da identidade do agente, no entanto, depende do uso de anticorpos especcos (IFA, IPX), de anti-soro especco (SN ou HI) ou de mtodos de deteco e identicao de cidos nuclicos (hibridizao, PCR).
5.2 Concentrao e puricao por ultracentrifugao

Estudos estruturais e ultra-estruturais, produo de antgenos para imunizaes ou mtodos de deteco, entre outros, requerem solues contendo altas concentraes de vrus e com elevado grau de pureza. A obteno de solues com es-
85
sas caractersticas pode ser feita de vrias maneiras, das quais se destacam a ultracentrifugao. A ultracentrifugao um mtodo relativamente fcil, rpido e prtico, em que o material de alta qualidade obtido. Seu princpio baseia-se na taxa de sedimentao do vrus, que, por sua vez, dependente do tamanho, densidade, morfologia da partcula, bem como da natureza do meio e da fora de centrifugao. A maior restrio o custo do equipamento, que difere das centrfugas por atingir velocidades que variam entre 20.000 e 100.000 rotaes por minuto (RPM).
6 Biossegurana laboratorial
A manipulao em laboratrios de agentes infecciosos, como os vrus, pode representar risco
de infeces inadvertidas ou disseminao de enfermidades entre humanos e animais. Isso pode ser observado em vrias descries do passado. O FMDV, devido a sua alta infecciosidade, talvez tenha produzido os exemplos mais conhecidos. A infeco de pesquisadores pelo vrus Marburg, em um laboratrio da Alemanha na dcada de 1970, outro exemplo. No princpio, uma alternativa para evitar acidentes, como a disseminao do vrus febre aftosa ou introduo de agentes exticos no rebanho de um pas, foi a construo de laboratrios em ilhas, o caso mais conhecido de Plum Island Animal Disease Center, nos Estados Unidos. Posteriormente outros laboratrios de segurana elevada e acesso restrito, para manipulao de agentes virais e animais infectados, foram estabelecidos, tais como: o Australian Ani-
Tabela 3.4. Nveis de biossegurana para manipulao de agentes virais Nvel

BSL-1 BSL-2 BSL-3 BSL-4
Vrus no-zoonticos.
Associados com infeces em humanos, risco de auto-inoculao, ingesto ou exposio da pele e mucosas.
Agentes exticos ou selvagens, com potencial de transmisso por aerossol e de produzir doena severa ou letal. Normas do BSL-2, com acesso restrito e controlado, coleta de soro do trabalhadores, descontaminao de todo o lixo e resduos e esterilizao das roupas antes da lavagem.
Agentes altamente perigosos ou exticos, com risco de vida para humanos, transmitidos por aerossis, ou agentes de periculosidade desconhecida. Normas do BSL-3, com mudanas de roupas ao ingressar na rea contaminada. Requerimento de banho para sada, descontaminao de todo o material antes da remoo do laboratrio. BSL-3, utilizao de cabine de fluxo laminar tipo III ou cabines tipo I e II em ambiente com presso positiva, macaces de corpos inteiro com respiradores para todos os procedimentos.
Procedimentos
Vrus
Normas bsicas de prtica laboratorial.
BSL-1, com acesso limitado, identificao das reas de manipulao, primeiros socorros e descontaminao do lixo e resduos.
Equipamentos de proteo
Nenhum requerido.
Aventais, luvas, culos, conforme a necessidade. Manipulao de material que produz aerossol em cabine de fluxo laminar do tipo I ou II.
Requerimentos do BSL-1 e toda manipulao em cabine de fluxo laminar do tipo I ou II. Uso de luvas, aventais, respiradores, conforme a necessidade.
Equipamento de segurana
Bancada laboratorial.
BSL-1 com autoclave.
BSL-2 acrescido de separao fsica para corredores e reas de circulao, porta duplas, presso negativa nos laboratrios, sistema de filtrao do ar.
BSL-3, rea ou prdio isolado com suprimento de ar e exausto, vcuo e sistema de descontaminao.
BoHV, BVDV, BLV, BTV, PRV, CDV, outros.
Adenovrus humano, citomegalovrus, influenza A, B e C, rubola, poliovrus, parainfluenza, vrus da raiva.
Herpesvrus dos smios (vrus B), vrus da encefalite japonesa, hantavrus, febre amarela, encefalite eqina venezuelana, vrus do Nilo Ocidental.
Exemplos
Vrus Ebola, Marburg, sabi, febre do vale Rift, entre outros.
Adaptada de Murphy et al., 1999.
86
Captulo 3
mal Health Laboratory na Austrlia, o Onderstepoort Veterinary Institute na frica do Sul, o Institute for Animal Health na Inglaterra, o Center for Disease Control (CDC) em Atlanta e, mais recentemente, o Canadian Science Center for Human and Animal Health, em Winnipeg, no Cnada. A manipulao de amostras infectadas para pesquisa ou diagnstico deve seguir as normas da boa prtica laboratorial. Dessa maneira, contaminaes inadvertidas de amostras ou disseminaes da infeco entre humanos ou animais so evitadas. Conforme a infra-estrutura do laboratrio e o risco dos agentes manipulados, os laboratrios de virologia so classicados em Nveis de Segurana (BSL) 1, 2, 3 ou 4 (Tabela 3.4). O uso de tcnicas asspticas, roupas adequadas (avental, mscaras, luvas e culos) e desinfetantes apropriados so cuidados bsicos e necessrios em todo trabalho laboratorial, independente do nvel de segurana. O uso de equipamentos, tais como: cabines de uxo laminar, sistema de ltrao do ar, tratamento e esterilizao de dejetos, descarte e incinerao dos dejetos so requisitos necessrios para laboratrios que manipulem agentes com risco mdio a elevado, conforme o caso.
RICHMOND, J.Y.; McKINNEY, R.W. (Eds). Biosafety in microbiological and biomedical laboratory. 4.ed. Washington, DC: U.S. Government Printing Ofce, 1999. 265p. ROVOZZO, G.C.; BURKE, C.N. A manual of basic virological techniques. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall, 1973. 287p. STORCH, G.A. Diagnostic Virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.18, p.493-531. STRAW, B.E. et al. (eds). Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 2002. 1209p. SWAYNE, D.E. et al. A Laboratory manual for the isolation and identication of avian pathogens. 4.ed. Tallahasse, FL: Rose Printing, 1998. 311p. TIMONEY, J.F. et al. Hagan and Bruners microbiology and infectious diseases of domestic animals. 8.ed. Ithaca, NY: Comstock Publishing Associates, 1988. 951p. VERSTEEG, J. A colour atlas of virology. Weert, Netherlands: Wolfe Medical Publications, 1985. 240p.
BARTLETT, J.M.S; STIRLING, D. Methods in Molecular Biology: PCR protocols. 2.ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2003. 545p. CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.P. Veterinary diagnostic virology: a practitioners guide. St. Louis, MO: Mosby, 1992. 285p. FRESHNEY, R.J. Culture of animal cells. 2.ed. New York, NY: Wiley-Liss, 1987. 397p. HIRSCH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Malden, MA: Blackwell Science, 1999. 480p. KAHRS, R.F. Viral diseases of cattle. 2.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 2001. 324p. MAHY, B.W.J.; KANGRO, H.O. Virology methods manual. San Diego, CA: Academic Press, 1996. 374p. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. OIE. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. 3.ed. Paris, France: OIE, 1997. 723p.
GENTICA E EVOLUO VIRAL

Mauro Pires Moraes & Hernando Duque Jaramillo1
4
89
90 92 93 93 94 95 95 97 97 97 98 98
1 Gentica viral
1.1 Conceitos e denies 1.2 Mutao 1.3 Classicao genotpica 1.4 Classicao fenotpica 1.5 Taxa de mutao 1.6 Interaes genticas entre vrus 1.6.1 Recombinao 1.6.2 Ressortimento 1.7 Outras interaes virais 1.7.1 Complementao 1.7.2 Mistura fenotpica 1.7.3 Poliploidia 2 Evoluo viral 2.1 Origem dos vrus 2.2 Quando se originaram os vrus 2.3 Como os vrus ampliaram o seu repertrio protico 2.4 Capacidade de mutao viral 2.5 Estudos laboratoriais de evoluo 2.6 Exemplos de evoluo viral 2.6.1 Vrus da estomatite vesicular: tempo versus fatores ambientais 2.6.2 Mixomatose na Austrlia 2.6.3 Vrus da inuenza 2.6.4 Parvovrus canino 2.7 Concluses 3 Bibliograa consultada
99
99 100 100 100 102 102 102 103 104 105 105
106
Responsvel pela seo de Evoluo Viral.
1 Gentica viral
As populaes virais, principalmente aquelas de vrus RNA, so excelentes modelos para estudos de evoluo gentica. Devido ao ciclo replicativo dos vrus ser extremamente rpido, tanto em infeces naturais como em cultivo celular, os processos de seleo e evoluo podem ser observados em um curto espao de tempo. Assim, a gentica de populaes virais pode ser considerada uma viso minimalista e simplista da evoluo das espcies. Ao longo de sua histria natural que pode remeter h milhes de anos os vrus vm realizando um nmero incontvel de ciclos replicativos em seus hospedeiros, sendo constantemente transmitidos entre hospedeiros. Alguns necessitam utilizar diferentes espcies de hospedeiros mesmo invertebrados para assegurar a sua manuteno na natureza. As infeces naturais resultam em presso de seleo constante, que acaba moldando o perl gentico e fenotpico dos vrus, pois favorece e permite a sobrevivncia das variantes que melhor se adaptam ao hospedeiro e que so mais ecientemente transmitidas. Dentre as propriedades que favorecem a sobrevivncia e evoluo dos vrus destacam-se: a) capacidade de replicar e ser excretado em altos ttulos; b) capacidade de se adaptar a novos tecidos, rgos e/ou hospedeiros; c) capacidade de ser excretado por longo tempo; d) capacidade de se reproduzir e ser excretado sem produzir doena severa na maioria de seus hospedeiros; e) capacidade de escapar dos mecanismos imunolgicos do hospedeiro; f) capacidade de resistir no meio ambiente, tanto fora de clulas vivas como em animais vertebrados ou invertebrados, assegurando a sua sobrevivncia at alcanar um novo hospedeiro; g) habilidade de ser transmitido verticalmente entre hospedeiros. Dentre as caractersticas que apresentam relevncia na gentica das populaes virais e facilitam a compreenso da sua evoluo, destacam-se a grande quantidade de prognie viral produzida a partir da infeco de uma nica clula e o curto perodo de tempo de gerao. Para se ter uma idia desta dinmica, a infeco de uma clula, com uma nica partcula infecciosa,
pode produzir uma prognie de mais de 100.000 novos vrions em pouco mais de 10 horas. Isso corresponde a uma cpia do genoma produzida a cada meio segundo. Considerando-se infeces de hospedeiros multicelulares ou mesmo cultivos celulares as geraes se sucedem em magnitude (nmero de indivduos produzidos) e velocidade inimaginveis. Um ingrediente adicional nesta complexidade a potencial variao gentica da prognie. Nos vrus RNA, geralmente ocorre uma mutao para cada 10.000 nucleotdeos incorporados aos novos genomas, ou seja, cada novo genoma potencialmente contm, pelo menos, uma mutao e, em alguns casos, a grande maioria da prognie pode ser distinta do vrus parental. Esses eventos, em conjunto, proporcionam uma grande capacidade de adaptao dessas populaes, resultando em novas geraes de vrus com propriedades distintas das parentais, de acordo com o ambiente em que replicam. A gentica dos vrus possui implicaes em todos os aspectos de sua biologia, incluindo a evoluo e seleo de variantes adaptados ao meio, distribuio espacial e temporal, espectro de hospedeiros, patogenicidade e virulncia, interaes com o sistema imunolgico do hospedeiro, entre outros. O estudo da gentica viral tem como objetivos conhecer a composio gentica do genoma e como as informaes genticas nele contidas se reetem no fentipo do vrus. Assim, o conhecimento da gentica viral pode ter um amplo espectro de aplicaes, que vo desde a sua utilizao para otimizar o manejo sanitrio de um rebanho at a produo de recombinantes atenuados para uso em vacinas. A gentica viral clssica era baseada no isolamento e anlise fenotpica de um grande nmero de mutantes naturais, estudos de complementao, recombinao natural, determinao da ordem e posio dos genes no genoma e, nalmente, na anlise fenotpica dos mutantes para determinar a funo dos genes. Notveis avanos foram obtidos com o desenvolvimento dos cultivos celulares na dcada de 1950 e com o advento das tcnicas moleculares a partir do nal dos anos 1970. Essas tcnicas permitiram a anlise detalhada da seqncia, estrutura e funo de cidos e protenas virais e inauguraram uma nova etapa
90
Captulo 4
no estudo da gentica dos seres vivos. Embora alguns procedimentos genticos clssicos continuem em uso, grande parte foi substituda por mtodos modernos que permitem uma anlise mais detalhada e aproximada das relaes entre gentipo e fentipo. A seqncia completa do genoma de virtualmente todos os vrus de interesse humano e animal j foi determinada e, atualmente, encontra-se disponvel em bancos de dados de acesso pblico. As funes de grande parte das protenas virais tambm j foram estabelecidas, tanto por mtodos diretos como por inferncia a partir de seqncias de aminocidos e estrutura de outras protenas semelhantes. De especial relevncia para a Virologia o conjunto de procedimentos denominados genericamente de gentica reversa, que realizam a anlise fenotpica a partir da composio gentica, ao contrrio da gentica clssica. Assim, o conhecimento da gentica e a disponibilidade das tcnicas moleculares tm permitido a manipulao do genoma dos vrus, a produo de recombinantes com mutaes em genes especcos e o estudo do impacto dessas mutaes no fentipo viral. Essas tcnicas e conhecimentos adquiridos tm proporcionado um progresso notvel na Virologia, permitindo a identicao e manipulao de genes envolvidos em virulncia e nas interaes com o sistema imune, como, por exemplo, para a produo de vacinas mais ecientes e seguras. A seqncia completa de nucleotdeos do genoma dos vrus pode ser determinada por tcnicas de seqenciamento de DNA. Em se tratando de vrus RNA, a anlise e manipulao dos genomas so facilitadas pela sua converso em molculas de DNA complementar (cDNA) por meio de transcrio reversa. Genomas recombinantes, contendo delees de genes, inseres de genes heterlogos ou mutaes pontuais em nucleotdeos ou seqncias especcas podem ser obtidos pelo uso de tcnicas moleculares de manipulao enzimtica e clonagem de DNA. Vrus contendo genes de outros vrus de interesse podem ser produzidos in vitro para estudos de patogenia, usos em terapia gentica e em vacinas. Protenas virais, para uso teraputico ou vacinal, podem ser expressas em sistemas heterlogos. Essas so
apenas algumas aplicaes da tecnologia de DNA recombinante e tcnicas moleculares em geral no estudo da gentica e biologia dos vrus. Considera-se que os limites da manipulao gentica dos vrus sero impostos apenas pelas restries biolgicas, ou seja, ser possvel modicar tudo e apenas o que a biologia permitir. Este captulo abordar os principais mecanismos genticos e de evoluo das populaes virais. Dentre esses, sero discutidos os mecanismos relacionados diretamente com as caractersticas de replicao do genoma, como as mutaes; aqueles resultantes de interaes entre diferentes vrus, como a recombinao, rearranjo, complementao; algumas interaes entre vrus e hospedeiros, como a integrao; e as interaes no-genticas entre vrus. A seo de evoluo abordar alguns aspectos e hipteses sobre a origem e evoluo dos vrus, e de como esses microorganismos conseguem se perpetuar e evoluir, apesar das constantes restries impostas pelo meio e pelas defesas dos hospedeiros. Ao nal, sero apresentados alguns exemplos de evoluo de vrus humanos e animais e as conseqncias biolgicas nas interaes desses agentes com os seus hospedeiros.
1.1 Conceitos e denies

Os princpios bsicos, conceitos e terminologia utilizados em gentica de vrus so basicamente os mesmos empregados no estudo da gentica de outros organismos. Assim, eventos como mutao, recombinao e seleo possuem signicado semelhante quando aplicados aos vrus. A gentica viral, no entanto, possui algumas particularidades que so derivadas das peculiaridades da biologia desses agentes. A replicao e a conseqente expanso viral, por exemplo, um processo muito mais rpido do que em outros organismos uni- ou multicelulares. Para se ter uma idia dessa dinmica, a infeco de uma clula por uma nica partcula vrica pode resultar na produo de uma prognie de mais de 100.000 vrions em poucas horas. Considerando-se as infeces naturais em hospededeiros multicelulares vertebrados, por exemplo ou mesmo em cultivos celulares, a populao derivada de um
Gentica e evoluo viral
91
nico progenitor se expande exponencialmente em uma velocidade impressionante. Como resultado, as geraes de vrus se sucedem a uma velocidade incomparvel com aquela observada em organismos multicelulares. Essa caracterstica faz com que os vrus sejam muito utilizados como modelo para estudos genticos e evolutivos. Assim, quando se estuda os diversos aspectos da biologia e gentica dos vrus, na verdade est se estudando uma populao numerosa de indivduos (vrions), e no um indivduo isolado ou um grupo pequeno (como em estudos genticos em bovinos, por exemplo). Ento, quando se refere a uma cepa ou um mutante viral, a referncia feita ao conjunto de unidades vricas que compe aquela populao de vrus. Quando se refere a um determinado vrus vrus da cinomose (CDV), por exemplo est se referindo a uma espcie viral. Uma espcie viral denida como uma populao de vrus genetica e biologicamente muito semelhantes entre si, derivada de ancestrais comuns. Assim como os demais organismos uni- ou multicelulares, as diferentes espcies virais ou os diferentes vrus so compostos por inumerveis indivduos, que podem ser mais ou menos semelhantes entre si. Ou seja, a similaridade gentica e fenotpica entre os vrus que compem uma espcie variam entre as espcies. Os componentes de uma populao de vrus RNA (vrus da inuenza, por exemplo) so mais variveis entre si do que os vrus DNA. Em outras palavras, as populaes de vrus variam em sua homogeneidade/heterogeneidade, sendo que os vrus RNA so mais variveis. Cabe recordar que uma clula infectada com um nico vrion pode produzir centenas de milhares de novas partculas, no necessariamente idnticas em suas seqncias de nucleotdeos. Assim, uma amostra do vrus da diarria viral bovina (BVDV), isolada no Brasil, provavelmente diferente gentica e antigenicamente de amostras isoladas em outras partes do mundo. Por outro lado, os vrus DNA tendem a ser mais estveis geneticamente e pouca variao encontrada entre os vrus de uma mesma espcie. As diferenas nos nveis de homogeneidade/heterogeneidade entre os vrus DNA e RNA devem-se principalmente s propriedades das enzimas replicativas
desses vrus, que apresentam diferentes taxas de erro ao replicarem os genomas. Em razo da heterogeneidade gentica e fenotpica que pode existir em uma populao de vrus de uma mesma espcie sobretudo em vrus RNA os estudos genticos geralmente so realizados com vrus puricados. Atravs de clonagem biolgica e posterior expanso dos clones obtidos, possvel se obter populaes homogneas de vrus derivados de um nico ancestral. Os vrus puricados (ou clonados) a partir de populaes mistas so geralmente aqueles mais abundantes e predominantes na populao, sendo, por isso, os seus verdadeiros representantes. medida que esses clones so expandidos, no entanto, a tendncia que a prognie viral se torne gradualmente divergente geneticamente devido gerao contnua de indivduos com mutaes. Por isso, quando se deseja trabalhar continuamente com populaes homogneas de vrus, essas populaes devem ser periodicamente clonadas. Alm dos conceitos acima, algumas denies so tambm necessrias para o entendimento dos princpios de gentica viral, embora a sua aceitao e terminologia nem sempre sejam universais. Cabe ressaltar que as denies a seguir como j denido , referem-se aos vrus como populaes, colhidas diretamente dos hospedeiros ou de cultivos celulares onde so multiplicados: Vrus de campo (wild-type): o vrus original ou parental, a partir do qual se realiza estudos biolgicos, genticos ou moleculares. Esta populao de vrus serve de base para as comparaes genotpicas e fenotpicas feitas com populaes derivadas dela ou com outras populaes da mesma espcie viral, porm de outra origem. Embora a denominao remeta ao vrus original que foi obtido de animais infectados, os vrus de campo, utilizados em estudos biolgicos e genticos, nem sempre so exatamente iguais queles originalmente isolados. Isto porque a obteno de ttulos virais compatveis com vrios estudos requer a sua multiplicao, s vezes, por passagens sucessivas em cultivos celulares ou em ovos embrionados. Esses ciclos sucessivos de replicao podem resultar em alteraes genticas e fenot-
92
Captulo 4
picas no vrus. De forma ideal, os vrus de campo utilizados em quaisquer experimentos devem ter sido cultivados o menor nmero de vezes possvel. O termo selvagem tambm tem sido utilizado para designar os vrus de campo; Mutante: o vrus que difere do vrus parental na seqncia de nucleotdeos de seu genoma, ou seja, apresenta alteraes de bases e/ou de segmentos genmicos em comparao com o vrus de campo. Algumas mutaes no se reetem em alteraes fenotpicas e, por isso, so chamadas de mutaes silenciosas (silent mutations). Nesses casos, o fentipo do vrus mutante indistinguvel do parental e a sua identicao depende de anlise da seqncia do genoma. Por outro lado, as mutaes que resultam em alteraes fenotpicas podem ser detectadas pela observao e anlise das caractersticas fenotpicas alteradas. Vrus temperatura-sensveis (TS), por exemplo, so mutantes que no replicam bem temperatura corporal (37-38C), ao contrrio do vrus parental. Os vrus TS geralmente necessitam uma temperatura mais baixa (30-34C) para replicarem com ecincia. Mutantes de placa pequena (small plaque mutants) so vrus que se disseminam decientemente em cultivo celular, produzindo focos menores de destruio celular do que os produzidos pelo vrus parental. Esse fentipo est geralmente associado com uma capacidade reduzida de transmisso direta entre clulas. Mutantes de gama de hospedeiros (host range mutants) so vrus que diferem dos vrus parentais em relao ao espectro de hospedeiros que infectam in vivo, ou em relao aos tipos celulares que podem infectar in vitro. O termo variante usado para designar um determinado vrus (uma populao de vrus) que apresenta alguma diferena fenotpica em relao ao vrus de campo, ou seja, uma denio essencialmente fenotpica. As diferenas fenotpicas entre os vrus parentais e os seus variantes certamente so reexos de mutaes no genoma; Cepa (ou estirpe): um vrus cujas caractersticas biolgicas e/ou moleculares so razoavelmente conhecidas. Em contraste, uma amostra (ou isolado) um vrus isolado de animais sobre o qual no se tem um maior conhecimento. Amostras (ou isolados) podem se tornar cepas
a partir da sua caracterizao laboratorial. Em outras palavras, as cepas so alguns isolados ou amostras de um determinado vrus que sofreram caracterizao aps o seu isolamento. No entanto, essas denies no possuem utilizao universal, e o termo cepa , muitas vezes, utilizado para designar isolados no-caracterizados e vrus de campo. O termo cepa de referncia utilizado para designar cepas virais conhecidas que so utilizadas por diferentes laboratrios com ns diagnsticos e/ou produo de reagentes, vacinas e mesmo para estudos de patogenia.
1.2 Mutao
O termo mutao utilizado para designar alteraes na seqncia de nucleotdeos no cido nuclico genmico de um determinado organismo comparando-o com o seu parental. As mutaes surgem naturalmente como resultado da indelidade das polimerases principalmente as polimerases de RNA que incorporam nucleotdeos incorretos durante a replicao do genoma. Mutaes tambm podem ser induzidas por mtodos qumicos (hipoxantina, bromodeoxiuridina) ou fsicos (raios X, ultravioleta e gama). Acredita-se que muitas mutaes que ocorrem naturalmente resultam na produo de vrus inviveis, ou seja, constituem-se em mutaes letais. Esses tipos de mutaes no so percebidas e no possuem impacto na adaptao e evoluo viral, pois os genomas mutantes so incapazes de replicar. Logo, quando se faz referncia a mutantes, cepas, tipos ou variantes virais, sempre so consideradas as mutaes no-letais, que permitem diferenciar o indivduo e a sua prognie do vrus parental. Como foi mencionado, as mutaes podem ser espontneas (resultados de erros durante a replicao) ou induzidas (resultados de danos ao cido nuclico por agentes qumicos ou fsicos). As mutaes naturais so mais freqentes nos vrus RNA (um nucleotdeo incorreto entre 103 a 104 nucleotdeos inseridos) do que nos vrus DNA (um erro a cada 108 a 1011 nucleotdeos incorporados). A maior taxa de mutao observada nos vrus RNA deve-se menor delidade da
93
polimerase de RNA, que incorpora nucleotdeos incorretos com maior freqncia, alm da incapacidade de corrigir os erros cometidos. As polimerases de DNA, por sua vez, cometem menos erros e, ainda assim, so capazes de corrigi-los, substituindo os nucleotdeos incorretos incorporados s cadeias nascentes. Os mutantes gerados durante a replicao viral, quando apresentam uma vantagem seletiva em comparao com os parentais, sero amplicados com maior ecincia e rapidamente tornam-se predominantes na populao viral. Por outro lado, mutantes que no apresentam vantagem seletiva tendem a permanecer em proporo pequena e ocasionalmente desaparecem da populao, caso repliquem com menor ecincia do que os demais indivduos. Ou seja, a evoluo de uma determinada populao viral depende da taxa de mutao e da seleo a qual os vrus gerados so submetidos.
1.3 Classicao genotpica

Um dos critrios usados para a classicao de mutantes baseia-se nas caractersticas genotpicas da mutao. Mutaes causadas por simples substituies de nucleotdeos so chamadas de mutaes pontuais. As mutaes pontuais podem ser do tipo transio, quando h substituio de uma purina por outra purina (A ou G) ou pirimidina por outra pirimidina (C ou T); ou transverso, quando ocorre a substituio de uma pirimidina por uma purina ou vice-versa. Outras mutaes envolvem delees ou inseres de segmentos de tamanhos variveis de cido nuclico. Outra forma de classicao das mutaes pontuais considera as suas conseqncias na codicao de aminocidos, quando a mutao ocorre em seqncias codicantes do genoma. Assim, as mutaes podem ser silenciosas (silent mutations) quando a troca do nucleotdeo no resulta na codicao de outro aminocido. A protena sintetizada permanece a mesma e no ocorre mudana no fentipo do vrus. Mutaes de sentido trocado (missense) so aquelas em que a troca de nucleotdeos resulta na codicao de outro aminocido. As conseqncias dessas mutaes so variveis, dependendo do novo
aminocido incorporado protena e da possvel alterao da conformao e/ou funo protica. Mutaes missense podem ser absolutamente incuas (se o aminocido incorporado no alterar a funo da protena) ou mesmo letais (se o novo aminocido alterar drasticamente a funo da protena codicada). Mutaes sem sentido (nonsense) resultam na produo de um cdon de terminao da traduo (stop codon) em uma seqncia aberta de leitura (ORF). Com isso, ocorre a produo de uma protena truncada, cuja funcionalidade pode variar amplamente, dependendo do local onde a mutao introduzida. Essas mutaes so classicadas como mbar (amber = UAG), ocre (ochre = UAA) ou opala (opal = UGA). As conseqncias de mutaes nonsense tambm variam amplamente, e muitas delas so provavelmente letais ou, pelo menos, deletrias para a viabilidade do vrus. Embora as mutaes e suas conseqncias sejam mais estudadas em seqncias codicantes de protenas, certamente tambm so importantes em regies regulatrias de transcrio e replicao (promotores, enhancers, origens de replicao etc.), e em seqncias nucleotdicas envolvidas na encapsidao dos genomas recm-formados.
1.4 Classicao fenotpica

Os mutantes virais tambm podem ser classicados quanto s conseqncias fenotpicas de suas mutaes. Vrias caractersticas fenotpicas podem ser consideradas nesta classicao, e os mutantes podem ser selecionados pela sua habilidade em produzir placas de lise celular; por exemplo. Alguns mutantes de adenovrus podem egressar precocemente da clula infectada, em comparao com os seus parentais, e, conseqentemente, produzem maiores placas de destruio celular in vitro. Essa caracterstica pode estar relacionada com alteraes da virulncia do vrus, ou seja, mutantes virais que produzem placas maiores in vitro podem possuir maior virulncia em hospedeiros susceptveis in vivo. Este fenmeno j foi observado em diversos vrus, incluindo o vrus da peste suna clssica (CSFV). Em outros casos, pode no existir uma correlao entre tamanho de placa in vitro e virulncia in vivo. Nes-
94
Captulo 4
ses casos, o fentipo serve apenas como um parmetro para a seleo de mutantes com diferentes habilidades replicativas in vitro. Outro fentipo observado para a seleo de mutantes a capacidade de replicao a diferentes temperaturas. Como j mencionado, os mutantes TS replicam bem a temperaturas de 30-34C (denominada temperatura permissiva) e no replicam com ecincia a 37C (temperatura no-permissiva). Mutantes adaptados ao frio (cold adapted) replicam melhor sob temperaturas baixas, mas retm alguma capacidade de replicar a 37C. Freqentemente, essa caracterstica atribuda a alteraes conformacionais de determinadas protenas, especialmente as polimerases virais, dependendo da temperatura. Ou seja, pela mudana na sua seqncia de aminocidos em determinada temperatura, essa protena no manteria sua conformao secundria ou terciria e perderia a sua funo. Esses mutantes podem ser utilizados em vacinas atenuadas, pois replicam apenas em reas superciais do corpo, sem se disseminar sistemicamente no organismo. A alterao da gama de hospedeiros outra caracterstica fenotpica utilizada na classicao de mutantes. Alguns mutantes podem no replicar com a mesma ecincia nos mesmos hospedeiros que os vrus de campo, reduzindo, assim, a sua abrangncia. Um exemplo tpico um mutante do vrus da febre aftosa (FMDV) que surgiu, em 1997, na Tailndia. Esse mutante natural no possua a habilidade de infectar bovinos principal espcie hospedeira do vrus infectando apenas sunos. Uma forma importante de seleo de mutantes a resistncia a determinadas drogas. A presso de seleo exercida pelas drogas antivirais permite o seu uso para a seleo e pesquisa desses mutantes. Anticorpos neutralizantes tambm podem ser utilizados para a seleo de vrus resistentes neutralizao. Para isso, os vrus so cultivados in vitro na presena de anticorpos neutralizantes. Os mutantes originados que eventualmente no forem reconhecidos pelos anticorpos por alteraes nas protenas de superfcie so rapidamente amplicados e se
tornam predominantes na populao. Esses vrus so chamados de mutantes de escape antignico. A gerao natural de mutantes de escape uma estratgia utilizada por vrus que produzem infeces persistentes, sobretudo os retrovrus, pois podem seguir replicando no hospedeiro mesmo na presena de anticorpos. Mutantes decientes em atividade enzimtica so aqueles que apresentam mutaes nos genes que codicam determinadas enzimas, como a timidina quinase dos herpesvrus. Esses mutantes apresentam capacidade de replicao semelhante a dos vrus parentais in vitro, mas a sua virulncia atenuada quando so inoculados em animais susceptveis. A exemplo dos mutantes TS, esses vrus tambm podem ser utilizados para a produo de vacinas. Os mutantes que apresentam atenuao da virulncia, sem que necessariamente se conhea a causa, so conhecidos como mutantes atenuados.
1.5 Taxa de mutao

As taxas de mutao natural dependem basicamente da delidade da enzima polimerase e da sua capacidade de corrigir eventuais erros cometidos durante a polimerizao das novas cadeias de cido nuclico. As polimerases de DNA, que utilizam molculas de DNA como molde para a sntese de novas molculas, geralmente apresentam um sistema de correo (proofreading) para aqueles nucleotdeos incorporados erroneamente. Esse processo envolve seqncias funcionais especcas (motivos) com atividade exonuclease, que so capazes de remover os nucleotdeos incorretos e substitu-los pelos corretos. Em contraste, as enzimas que polimerizam RNA a partir de RNA no possuem a capacidade de proofreading. Como conseqncia, as polimerases de DNA apresentam uma taxa de um erro para cada 1010 a 1011 nucleotdeos incorporados, enquanto as polimerases de RNA apresentam um erro a cada 103 a 104 nucleotdeos. Isso signica que a taxa de erros cometida durante a replicao dos vrus RNA pode ser at um milho de vezes maior do que aquela resultante da replicao dos vrus DNA. A diferena nas taxas de mutao se constitui na principal causa da grande variabi-
95
lidade gentica e antignica dos vrus RNA em comparao com os vrus DNA. Os erros de incorporao so essencialmente randmicos, mas a sua deteco em mutantes naturais indica que podem existir regies onde h uma maior concentrao de erros, conhecidos como pontos quentes (hot spots). Essas diferenas esto relacionadas com a habilidade dos mutantes sobreviverem com essas mudanas. Regies mais conservadas so aquelas em que as mutaes eventualmente introduzidas no se perpetuam na populao por provocarem efeitos deletrios aos novos gentipos.
enzimas e fatores auxiliares do hospedeiro. Em tese, a recombinao homloga pode ocorrer entre o genoma do vrus e da clula e entre dois genomas virais. As conseqncias da recombinao entre dois genomas virais variam de acordo com a similaridade das seqncias recombinadas e com o seu impacto no fentipo viral. Cabe ressaltar que a recombinao entre dois vrus geralmente ocorre entre vrus da mesma espcie e depende de uma infeco concomitante por esses vrus.
Genoma A
1.6 Interaes genticas entre vrus 1.6.1 Recombinao

Classicamente, o termo recombinao utilizado para designar um intercmbio de seqncias genticas entre dois genomas. Esse processo muito estudado em molculas de DNA e ocorre, com grande freqncia, na maioria das clulas eucariotas e procariotas. Alguns mecanismos de reparo do DNA, por exemplo, baseiam-se em eventos de recombinao gentica entre os cromossomos homlogos. Mecanismos semelhantes so observados em vrus DNA e parecem fazer parte do seu processo evolutivo. Esse processo envolve o alinhamento de duas molculas com seqncias semelhantes, a clivagem da cadeia contnua do DNA, o intercmbio de uma regio do genoma e a religao da cadeia de DNA, originando molculas hbridas ou recombinantes (Figura 4.1). Por causa da necessidade do alinhamento de seqncias entre molculas semelhantes, este processo denominado recombinao homloga. Na biologia dos vrus, recombinaes podem ocorrer entre dois vrus de uma mesma espcie viral ou, ocasionalmente, entre o genoma viral e o DNA da clula hospedeira. A recombinao homloga parece ser comum entre os vrus DNA e aqueles que apresentam molculas de DNA intermedirias de sua replicao, como os retrovrus. Em clulas infectadas, esse processo realizado com o auxlio de
Pareamento e troca de um segmento
Genoma B
Genomas recombinantes A/B
Figura 4.1. Ilustrao simplificada da recombinao homloga entre duas molculas de DNA.
Nos vrus RNA clssicos, esse evento mais raro e, provavelmente, no utiliza enzimas celulares. Os picornavrus e provavelmente outros vrus RNA de genoma no-segmentado apresentam uma forma de recombinao pouco eciente e diferente da recombinao homloga. A recombinao genmica desses vrus envolve o mecanismo de escolha do molde (copy-choice). Nesses casos, a polimerase de RNA inicia a sntese da cadeia lha utilizando uma molcula de RNA como molde, mas troca de molde durante a polimerizao, resultando em molculas hbridas de RNA, com seqncias mistas derivadas de mais de uma molcula molde (Figura 4.2).
96
Captulo 4
Genoma A
A polimerase troca de molde
Genoma B
Genoma recombinante A/B
Figura 4.2. Ilustrao simplificada do modelo de recombinao de RNA pelo mecanismo de copy choice.
Alguns exemplos de recombinao de vrus RNA na natureza servem para ilustrar as suas possveis conseqncias. Um exemplo clssico
a recombinao entre RNA viral e seqncias celulares (provavelmente de RNAs mensageiros), alm de recombinaes intramoleculares, que ocorrem durante infeces persistentes com o vrus da diarria viral bovina (BVDV). Nesses casos, o vrus que produz a infeco persistente no-citoptico e replica continuamente no animal, muitas vezes sem conseqncias clnico-patolgicas. No entanto, eventos de recombinao e/ou rearranjos genmicos, envolvendo o genoma viral e seqncias celulares, ocasionalmente resultam na gerao de mutantes citopticos. A gerao desses mutantes no animal persistentemente infectado seguida do desenvolvimento de doena fatal, denominada doena das mucosas. Os mutantes citopticos podem conter uma variedade de mutaes, inseres e rearranjos genmicos (Figura 4.3.). Casos de recombinao
A
5
N
pro
Rns
E1
E2
NS2-3
NS4-A NS4-B
NS5A
NS5B
B
5
N
pro
Insero
C E
Rns
E1
E2
Ns2
Ns3
NS4-A NS4-B
NS5A
NS5B
C
5
N
pro
Insero Duplicao
C E
Rns
E1
E2
NS2-3
Ns3
NS4-A NS4-B
NS5A
NS5B
D
5
N
pro
Duplicaes
C E
Rns
E1
E2
NS2-3
pro
Ns3
NS4-A NS4-B
NS5A
NS5B
E
5
N
pro
Ns3
NS4-A
NS4-B
NS5A
NS5B
Rns
E1
E2
Ns2
Deleo
Figura 4.3. Ilustrao de genomas do vrus da diarria viral bovina (BVDV) contendo alteraes genticas. A) Genoma do vrus de campo no-citoptico; B-E) Genomas de mutantes citopticos gerados por recombinao gentica; B) Genoma contendo uma insero de seqncia celular; C) Genoma contendo uma insero de gene celular e duplicao do gene na protena NS3; D) Genoma contendo duplicaes dos genes Npro e NS3; E) Genoma defectivo contendo uma deleo que abrange os genes das protenas estruturais e a NS2.
97
de amostras de campo e cepas vacinais do BVDV, com conseqncias diversas, tambm j foram relatadas. Eventos de recombinao tambm tm sido descritos nos togavrus e coronavrus, com conseqncias que incluem o surgimento de novos vrus, apresentando espectro de hospedeiros e virulncia alterados. No entanto, esses processos ainda no esto totalmente elucidados. Provavelmente, h uma correlao direta com a estratgia de replicao utilizada por esses vrus. At o momento, no h evidncia desse tipo de recombinao em vrus com genoma RNA de sentido negativo. O mecanismo natural de recombinao tem sido explorado em laboratrio, para a produo de vrus recombinantes, com caractersticas determinadas para usos diversos, incluindo estudos genticos de virulncia e produo de vacinas.
Vrus parental A
Vrus parental B
Prognie A
Prognie A/B
Prognie B
1.6.2 Ressortimento
Esse mecanismo exclusivo dos vrus que possuem o genoma RNA segmentado (ortomixovrus, buniavrus, arenavrus, reovrus e birnavrus) e pode ocorrer quando h uma infeco concomitante por duas cepas do mesmo vrus. Nesses casos, os segmentos genmicos recmreplicados so redistribudos de maneira irregular na prognie viral, resultando em vrions que contm uma mistura de segmentos dos dois vrus parentais. Esse mecanismo tem sido bem documentado nos vrus da inuenza e tem sido responsabilizado pelo surgimento de cepas altamente patognicas resultantes do ressortimento entre vrus avirios e de mamferos (Figura 4.4). Esses eventos ocorrem com maior freqncia em sunos, que podem ser infectados tanto por vrus avirios como por vrus de mamferos. De fato, vrias cepas do vrus da inuenza que causaram surtos em humanos e sunos podem ter resultado de ressortimento entre vrus previamente existentes. Do ponto de vista evolutivo, o ressortimento representa um importante evento para o vrus, pois resulta em uma alterao gentica e fenotpica muito rpida.
Figura 4.4. Ilustrao do mecanismo de ressortimento entre dois vrus da influenza resultante de uma coinfeco em sunos.
1.7 Outras interaes virais 1.7.1 Complementao

Esta interao puramente fenotpica e funcional e no resulta de modicao do genoma viral. Por exemplo, se dois mutantes TS, determinados por mutaes em genes distintos, infectarem concomitantemente uma clula, a caracterstica fenotpica pode ser revertida e ambos os vrus podem replicar a 37C, porm as caractersticas genotpicas permanecem as mesmas. Esse tipo de complementao do tipo intergnica ou no-allica (nonallelic). Quando as mutaes determinantes dos TS ocorrem no mesmo gene, mesmo que com modicaes diferentes, pouco provvel que ocorra complementao. Com menor freqncia, a complementao pode ser intragnica ou allica (allelic). Essa complementao pode ocorrer quando o produto do gene mutante origina uma protena com mltiplas subunidades, e as subunidades que so funcionais podem complementar a decincia do complexo nal.
98
Captulo 4
O processo de complementao tambm ocorre em determinadas populaes de vrus que so submetidas a vrias passagens in vitro. Durante esse processo, so gerados genomas defectivos contendo delees em um ou mais genes. Esses genomas defectivos no so capazes de replicar autonomamente, pois no contm genes que codicam protenas essenciais para a replicao. A presena concomitante de um genoma ntegro nas clulas infectadas, no entanto, permite a complementao das funes ausentes nos genomas defectivos e, assim, esses genomas so continuamente replicados. Embora esse evento seja bem caracterizado na biologia de vrios vrus in vitro, a sua ocorrncia e signicado biolgico in vivo permanecem incertos.
Vrus parental A
Vrus parental B
Co-infeco de um hospedeiro
Prognie
1.7.2 Mistura fenotpica

Essa alterao caracterizada pela interao entre dois vrus com a produo de prognie distinta dos vrus parentais. Os vrus resultantes so caracterizados pela presena de diferentes determinantes antignicos e as partculas virais possuem componentes de ambos os vrus parentais (Figura 4.5). Como a complementao, a mistura fenotpica no envolve mudanas genticas na prognie. Ou seja, os vrions resultantes possuem componentes estruturais oriundos dos dois vrus parentais, porm os seus genomas so idnticos aos dos vrus parentais. A mistura fenotpica pode ocorrer entre vrus da mesma famlia ou de famlias diferentes. Um exemplo de mistura fenotpica entre famlias distintas ocorre entre membros da Rhabdoviridae e Paramyxoviridae. Os vrus dessas duas famlias possuem protenas distintas no envelope, porm com funes semelhantes e, quando co-infectam uma determinada clula, podem realizar a mistura fenotpica. H tambm a possibilidade de produo de pseudovrions, quando o nucleocapsdeo pertence a um vrus e o envelope a outro (exemplo: nucleocapsdeo de retrovrus e envelope de um rabdovrus). Nesse caso, o tropismo dos vrus resultantes ser o mesmo dos rabdovrus, enquanto a prognie formada ser de retrovrus.
Fentipo misto Sem alteraes no genoma Possvel: Host range alterado Resistentes neutralizao
Figura 4.5. Ilustrao da mistura fenotpica resultante da co-infeco de uma clula por dois vrus diferentes. A prognie viral pode conter vrus com fentipos mistos, porm com o genoma de um dos dois vrus parentais.
1.7.3 Poliploidia
A grande maioria dos vrus animais haplide, ou seja, possui apenas uma cpia do genoma nos vrions. Os retrovrus se constituem em excees, pois os vrions contm duas cpias idnticas do genoma (so diplides). Porm, os paramixovrus podem, ocasionalmente, apresentar mltiplas cpias de seu genoma encapsidados em mltiplos nucleocapsdeos em uma nica partcula vrica, fenmeno denominado poliploidia. Existem descries de isolados do vrus do sarampo que, ecientemente, produzem vrions com, pelo menos, duas cpias do genoma. Essas duas molculas de RNA so complementares e possuem mutaes diferentes, existindo a necessidade da presena das duas tas para ocorrer a replicao.
99
2 Evoluo viral
Quando se fala em evoluo, geralmente se relaciona esse termo com um processo longo, que ocorre durante milhes de anos. No entanto, mesmo para os vrus muito antigos (alguns com indcios de existncia por mais de 220 milhes de anos), o processo de evoluo ocorre rapidamente e permanente, em razo do grande nmero de geraes produzidas em um curto espao de tempo. As mudanas evolutivas dos vrus se produzem em questes de dias, e possvel avaliar as suas conseqncias no fentipo viral em nvel laboratorial. Essa capacidade de mudana possui implicaes importantes na emergncia de novos patgenos, como tem sido testemunhado durante as ltimas dcadas, com a emergncia de vrus como o da imunodecincia humana (HIV), o parvovrus canino (CPV) e as mudanas peridicas que capacitam os vrus da inuenza a iniciar novas pandemias. A evoluo viral tem sido tema de estudos intensos nos ltimos anos e, conseqentemente, tem permitido a compreenso dos seus mecanismos e efeitos. Esta seo no pretende ser um tratado exaustivo de um tema to complexo, apenas se trata de um resumo geral, que inclui algumas das teorias recentes sobre a origem dos vrus, sua rpida capacidade de mudana, a maneira como se estuda a evoluo em laboratrio e no campo, as implicaes da evoluo viral na patognese e aparecimento ou emergncia de novas enfermidades. O conhecimento acerca dos mecanismos utilizados pelos vrus para alterar as suas propriedades genticas e fenotpicas pode permitir a utilizao de manejos mais adequados dos surtos e o planejamento mais efetivo de programas sanitrios para o controle de infeces virais. Todos os seres vivos evoluem com o decorrer do tempo, mas a rapidez de evoluo dos vrus RNA situa-se vrias ordens de magnitude acima da velocidade de evoluo dos organismos cujo genoma formado por DNA. Essa caracterstica pode ser explicada pela indelidade e incapacidade de correo das polimerases de RNA, o que resulta em um nmero maior de erros durante a replicao do genoma.
2.1 Origem dos vrus

O estudo da origem e evoluo dos vrus realizado principalmente por alinhamento e comparao de seqncias de cidos nuclicos e protenas, anlises logenticas e por estudos das estruturas tridimensionais das enzimas e protenas estruturais. Ainda que no exista uma evidncia inequvoca que permita determinar quando se originaram e com que rapidez evoluram, podese armar que os diferentes vrus no possuem uma origem comum e que vrios grupos deles surgiram independentemente. Atravs dos anos, tm-se proposto vrias teorias sobre a origem desses agentes. A teoria regressiva prope que os vrus evoluram por simplicao ou regresso de parasitos intracelulares que perderam os genes requeridos para a replicao independente. A teoria de origem celular defende que os vrus surgiram de componentes celulares que adquiriram a habilidade de replicar de forma autnoma dentro da clula hospedeira. A teoria da co-evoluo com as clulas muito favorecida na atualidade, mas de difcil comprovao prope que tanto os vrus RNA como os vrus DNA se originaram de plasmdeos (cromossomos acessrios que replicam independentemente do DNA celular). Estes plasmdeos poderiam ter adquirido, provavelmente por recombinao com o genoma das clulas hospedeiras, genes que permitiam a sua transformao em elementos genticos com as trs caractersticas bsicas dos vrus. Essas caractersticas so: a) codicar mecanismos que permitam a replicao intracelular; b) capacidade de empacotar o cido nuclico em partculas vricas, que so biologicamente inativas e relativamente resistentes no meio extracelular; e c) capacidade de ser transmitido entre clulas. Pode-se deduzir, portanto, que antes de se converter em vrus, esses plasmdeos j continham as funes necessrias para a sua replicao independente e que alguns deles comearam a desenvolver parte da maquinaria protica (polimerases) que permite a replicao do seu material gentico. Posteriormente, teriam adquirido os genes que codicam as protenas necessrias para empacotar o seu genoma e transport-lo entre clulas. Teriam ad-
100
Captulo 4
quirido tambm um variado repertrio de protenas, para uma melhor manipulao das funes celulares, do sistema imunolgico do hospedeiro e para a produo de uma prognie mais abundante.
2.2 Quando se originaram os vrus

A dependncia de uma clula hospedeira para a ocorrncia da replicao poderia implicar que os vrus se originaram depois das clulas eucariotas. No entanto, alguns elementos que compem os vrus podem ter se originado antes da evoluo celular. O genoma dos vrus RNA, por exemplo, pode ter surgido nos primrdios da vida, em um mundo constitudo por RNA e que consistiria de molculas de RNA catalticas e auto-replicativas. Aparentemente, todos os vrus RNA se originaram de um nico ancestral ou desenvolveram solues comuns para problemas similares. A anlise comparativa das seqncias de aminocidos das polimerases dos vrus RNA (enzimas que sintetizam cpias do genoma RNA) favorece a hiptese de que o seu gene seja codicado por vrus de procariotas e de eucariotas. Essa observao indica que a molcula ancestral das polimerases de RNA provavelmente se originou antes da divergncia evolutiva em procariotas e eucariotas. Outras superfamlias de enzimas comuns a todos os vrus RNA e que, como as polimerases, apresentam um alto grau de similaridade, tambm reforam a hiptese de uma origem muito antiga e monologentica dos vrus RNA. Essas superfamlias so as helicases e algumas proteases semelhantes a quimiotripsinas.
genoma viral com o cido nuclico de outros vrus ou das clulas hospedeiras. A recombinao do genoma pode ocorrer entre vrus diferentes, inclusive entre vrus que pertenam a famlias distintas. Os vrus so muito ativos na obteno de seqncias genmicas por recombinao com outros vrus durante a sua evoluo, e essa caracterstica tem dicultado a construo de rvores logenticas nicas, que facilitem uma classicao lgica e nica. Como resultado dessas recombinaes, vrus de grupos muito distintos podem possuir genes relacionados e seqncias homlogas. A recombinao pode ocorrer entre regies do prprio genoma viral (recombinao intramolecular), resultando em duplicao de genes, delees e inseres, com a transformao em novos genes. Assim, uma determinada seqncia de nucleotdeos pode duplicar-se vrias vezes e, dessa maneira, originar famlias de genes, como ocorre nos poxvrus e no vrus da peste suna africana (ASFV). Os vrus tambm podem obter novos genes mediante a sntese de uma nova seqncia de nucleotdeos ou pelo uso de seqncias abertas de leitura (ORFs; open reading frame) alternativas. Combinaes desses mecanismos j foram descritas, como a duplicao de um gene acompanhada de mudana de ORF. Esses processos de recombinao seguem ocorrendo e podem ter conseqncias diversas na biologia dos vrus, incluindo alteraes na especicidade de hospedeiro, tropismo tecidual, patogenicidade e virulncia, como tambm podem resultar na emergncia de novos vrus.
2.3 Como os vrus ampliaram o seu repertrio protico

Aps a aquisio dos genes bsicos que permitiam a replicao e construo do capsdeo viral contendo o genoma, os vrus continuaram evoluindo e ampliando o nmero de genes do seu genoma, para codicar novas protenas, e, conseqentemente, adquirir novas funes e propriedades evolutivas. Um dos mecanismos utilizados para a aquisio de novas seqncias a recombinao do
2.4 Capacidade de mutao viral

O estudo das enzimas que catalisam a replicao dos cidos nuclicos as polimerases tem demonstrado que as polimerases de DNA celulares possuem uma alta delidade. Isto se deve, em parte, capacidade dessas enzimas de remover nucleotdeos inseridos equivocadamente. A taxa de erro dessas polimerases tem sido calculada em 10-8 a 10-11 nucleotdeos por replicao. Isso signica que, em uma molcula de DNA de um bilho de nucleotdeos polimerizados, apenas um nucleotdeo errado ser incorporado. A taxa de
101
erro das polimerases virais de DNA 20 a 100 vezes maior. Em contraste, as polimerases dependentes de RNA no possuem mecanismos de correo, e, por isso, a sua taxa de erro muito alta: entre 10-3 a 10-4 nucleotdeos/replicao. Portanto, cada novo genoma RNA viral com 10.000 nt contm uma mdia de trs mutaes pontuais (trs nucleotdeos diferentes do genoma parental). Algumas dessas mutaes podem ser prejudiciais aos vrus, enquanto outras so neutras e no possuem nenhum efeito. provvel tambm que algumas mutaes introduzidas durante a replicao resultem em benefcios para a replicao viral, conferindo vantagens evolutivas aos vrus mutantes. Uma mesma mutao pode ter efeitos diferentes para um vrus, dependendo do meio em que se encontre. Por exemplo, uma determinada mutao pode conferir vantagens para a replicao do vrus em sunos, porm pode ser adversa para a sua replicao em bovinos. Essas mutaes, que ocorrem ao acaso, so mantidas ou descartadas por meio dos processos de seleo natural por conferir maior aptido biolgica. O conhecimento das conseqncias dessas mutaes pode ser til para a manipulao viral, pois possibilita o desenvolvimento de vacinas baseadas em variantes virais atenuadas ou adaptadas a outras espcies. Como cada novo genoma de RNA viral sintetizado possui pelo menos trs mutaes, as seqncias genmicas e os vrus individuais produzidos continuamente so diferentes entre si. Essa distribuio de indivduos no idnticos, porm muito semelhantes, foi denominada por Manfred Eigen como quasispecies. Portanto, os indivduos que compem uma quasispecie apresentam pequenas variaes nas seqncias genmicas, porm aqueles indivduos que apresentam uma maior aptido biolgica e ecincia de replicao tornam-se predominantes sobre os demais e so produzidos em maior abundncia. Apesar do polimorsmo existir em virtualmente todos os seres vivos, o termo quasispecie viral utilizado para enfatizar a grande variao que os vrus componentes de uma mesma populao exibem. Esse termo utilizado para os vrus RNA pela sua grande variabilidade gentica. Assim mesmo, os diferentes vrus RNA apresentam nveis variveis de variabilidade gentica.
A caracterstica das polimerases de introduzir mutaes muito favorvel para os vrus, permitindo a produo de mutantes que, eventualmente, possam se adaptar ao hospedeiro ou a diferentes condies do meio. Em alguns casos especcos, os vrus que possuem polimerases com maior delidade apresentam decincias em sua aptido biolgica. Isso sugere que a evoluo tende a conservar esta capacidade de erro das polimerases, mas mantendo-as abaixo de um limite denominado nvel de erro limite (threshold error). Acima desse nvel no seria possvel a sobrevivncia dos vrus como espcie. Os vrus constituem a combinao da grande diversidade de indivduos, com seqncias diferentes e que possuem a propriedade de produzir prognie abundante. Como exemplo, o vrus da poliomielite (um picornavrus) produz uma descendncia de 10.000 indivduos em uma nica clula infectada. A populao viral sofrer, ento, um processo de seleo natural cada vez que as condies do meio se alterem. Assim, os indivduos com maior aptido para sobreviver a essas novas condies se tornaro tambm os mais abundantes. A alta taxa de alteraes produzidas no genoma dos vrus RNA o motor que permite a explorao rpida de novos espaos evolutivos. Em outras palavras, as mutaes no genoma podem reetir em mudanas de aminocidos e essas novas combinaes de aminocidos podem gerar novas estruturas proticas com propriedades e funes inditas. Essas propriedades e funes podem ser importantes para a adaptao do vrus a novos hospedeiros ou para escapar da vigilncia do sistema imune, por exemplo. importante tambm observar que a seleo natural faz parte do processo evolutivo. O processo de seleo faz com que os indivduos que contenham mutaes que favoream a sua replicao em determinado meio produzam maior descendncia e predominem na populao. Por exemplo, uma mutao nas protenas do capsdeo pode fazer com que um vrus escape da neutralizao por anticorpos. Esses vrus que escapam da neutralizao sofrem um processo de seleo quando infectam animais vacinados e, com o tempo, passam a predominar e substituir a populao viral original.
102
Captulo 4
2.5 Estudos laboratoriais de evoluo

O estudo da dinmica de evoluo dos vrus RNA in vitro tem sido realizado principalmente em bacterifagos e no vrus da estomatite vesicular (VSV). A freqncia de recombinao do VSV muito baixa e no detectvel. Esse fenmeno permite que se utilizem duas populaes virais competindo em clulas, sem que haja intercmbio gentico entre elas. Caso se consiga uma caracterstica ou marcador que identique e diferencie essas populaes, possvel saber as propores de cada populao ao longo de passagens seriadas em cultivos de clulas e avaliar a aptido biolgica relativa de cada populao. Uma caracterstica fenotpica utilizada nesses estudos a resistncia (ou escape) neutralizao por anticorpos, presente em uma das populaes, devido a mutaes introduzidas pela polimerase. Dessa maneira, foram isolados mutantes cujas seqncias consenso diferiam da seqncia da cepa progenitora somente em um aminocido, sendo resistentes neutralizao por um anticorpo monoclonal especco. Quando a cepa progenitora e a cepa resistente neutralizao so misturadas, possvel determinar a proporo de placas produzidas por cada uma das cepas cultivadas na presena ou ausncia do anticorpo monoclonal. No cultivo com a presena do anticorpo, somente so amplicados os vrus da cepa resistente neutralizao, enquanto no cultivo sem anticorpos so produzidas placas produzidas por vrus das duas cepas. Dessa forma, possvel quanticar a proporo de placas formadas por componentes de cada cepa e determinar qual cepa apresentou maior aptido biolgica. Esses experimentos podem ser relacionados com muitas observaes epidemiolgicas realizadas em populaes animais. As altas densidades animais nas criaes intensivas requerem programas sanitrios especiais, pois, aps a introduo de um patgeno, a aglomerao de animais favorece os ciclos de infeco iniciados com grandes populaes de vrus, e a evoluo viral contribuiria para uma maior aptido biolgica. Em contraposio, as baixas densidades de animais na populao produzem indiretamente um gargalo gentico e, como conseqncia, os vrus so
mais benignos, alguns animais no adoecem e podem desenvolver imunidade natural por contato com o vrus de baixa aptido biolgica.
2.6 Exemplos de evoluo viral

Mesmo que a capacidade terica de mutao e explorao do espao evolutivo por parte dos vrus parea ilimitada, a estrutura e funes das diferentes protenas e cidos nuclicos desses agentes, assim como as interaes com os hospedeiros, j sofreram um processo intenso e prolongado de otimizao da aptido biolgica. Portanto, provavelmente h restries que limitem a capacidade real de mudana. Por essa razo, possvel que vrus isolados de uma mesma regio com um grande intervalo de tempo sejam virtualmente idnticos. Ou seja, j teriam atingido um gentipo/fentipo equilibrado e sucientemente evoludo ou, por outro lado, j teriam esgotado a sua capacidade de evoluo. Quando se analisa a evoluo viral, podese observar como os diferentes vrus utilizam distintas estratgias evolutivas. Em seguida, so apresentados alguns exemplos que ilustram essas mudanas evolutivas que conduzem aquisio de uma maior aptido biolgica, isto , produo de prognie viral mais bem adaptada e mais numerosa. Existem vrus cujas mutaes facilitam a sua adaptao ao meio e outros cujas alteraes genticas alteram a sua virulncia. Existem tambm aqueles que alteram as suas propriedades antignicas para garantir seus ciclos contnuos de transmisso e alguns que usam estratgias que ampliam seu tropismo para outras espcies e/ou tecidos. Todas essas alteraes ocorrem com o objetivo nico de garantir a sobrevivncia e manuteno desses agentes na natureza.
2.6.1 Vrus da estomatite vesicular: tempo versus fatores ambientais

O vrus da estomatite vesicular (VSV) um vesiculovrus pertencente famlia Rhabdoviridae. O VSV infecta uma grande variedade de ruminantes e sudeos domsticos e silvestres, causando uma doena clinicamente semelhante febre
103
aftosa, caracterizada por febre e leses vesiculares na boca, focinho, patas e em regies do corpo com abrases ou leses mecnicas. As anlises logenticas de isolados do VSV de vrias regies da Amrica Central e do Norte tm demonstrado que as seqncias de cepas de uma mesma regio geogrca apresentam um alto grau de conservao, mesmo quando isoladas a grandes intervalos de tempo (at 30 anos). Essa caracterstica no observada para os vrus isolados na mesma poca em diferentes regies. A distribuio logentica mostra um melhor agrupamento dos vrus por regies geogrcas. A evoluo desse vrus depende de presses de seleo relacionadas com fatores ecolgicos, como os vetores que transmitem o vrus e os animais reservatrios que o mantm. Para esse vrus, no foi detectada a evoluo por presso imunolgica seletiva, que muito evidente para o vrus da inuenza, por exemplo.
2.6.2 Mixomatose na Austrlia

Muitos estudos clssicos demonstram a evoluo dos vrus nas populaes humanas e animais. Em um deles, observou-se como o vrus da mixomatose dos coelhos evoluiu aps a sua introduo na Austrlia. A mixomatose uma doena produzida por um poxvrus, cujos hospedeiros naturais so os coelhos americanos do gnero Sylvilagus. Essa enfermidade conhecida desde 1896, e a transmisso ocorre mecanicamente por insetos. Nos hospedeiros naturais, a infeco produz bromas localizados e benignos. Porm, ao contrrio da enfermidade branda produzida nos coelhos americanos, o vrus do mixoma produz uma infeco letal nos coelhos europeus do gnero Oryctolagus. Nas primeiras dcadas do sculo passado, coelhos europeus foram introduzidos da Austrlia propositalmente e, como no existiam predadores naturais, esses animais se reproduziram rapidamente, tornando-se uma praga para a agricultura e pecuria. Assim, em 1950, um programa de controle biolgico dos coelhos com o vrus da mixomatose foi aplicado naquele pas com o objetivo de solucionar o problema da superpopulao.
A cepa viral utilizada era oriunda do Brasil, isolada pelo Instituto Oswaldo Cruz em 1911. Inicialmente, a disseminao do vrus no foi ampla e permaneceu restrita aos habitats onde era introduzido, sem disseminao para ecossistemas vizinhos. Porm, observaram-se, posteriormente, centenas de coelhos doentes em locais muito distantes dos locais originais de introduo do vrus. A doena se distribuiu principalmente pelas margens dos grandes rios, onde os mosquitos eram mais abundantes. O vero seguinte foi mido, e a enfermidade se disseminou rapidamente, resultando em mortalidade de at 99%. No entanto, no ano seguinte, observou-se que uma variante menos virulenta do vrus estava gradativamente substituindo a cepa original de alta virulncia. A virulncia da cepa original e das cepas de campo isoladas na Austrlia foi determinada em coelhos de laboratrio e a cada isolado se atribuiu um grau de virulncia entre I e V. A cepa original foi 100% letal em 11 a 13 dias aps a inoculao (virulncia grau I). Algumas das cepas de campo produziram uma letalidade entre 70-95%, com mdia de sobrevivncia de 17 a 20 dias (virulncia grau III). Outras cepas matavam menos de 50% dos coelhos infectados e produziam uma doena mais benigna (virulncia grau IV). Aps dois anos, todos os vrus de campo recuperados na Austrlia possuam grau III. A seleo de cepas menos letais ocorreu em conseqncia da transmisso do vrus para os mosquitos, que foi prolongada para os vrus com virulncia de grau III pela maior sobrevivncia dos coelhos. Como conseqncia, os animais infectados produziam vrus por mais tempo, dando maior oportunidade aos mosquitos de se contaminar e transmitir a doena. Por outro lado, os coelhos infectados com a cepa original de grau I morriam rapidamente, e o ciclo de transmisso era interrompido. A populao de coelhos na Austrlia tambm sofreu uma seleo para a resistncia mixomatose. A nova gerao de coelhos descendeu dos 10% da populao original que sobreviveu doena. Durante sete anos, antes de comearem os surtos de mixomatose na primavera, coelhos jovens eram capturados nas reas endmicas e mantidos em cativeiro at atingirem a idade
104
Captulo 4
adulta e os nveis de anticorpos maternos desaparecerem. Esses coelhos foram desaados com uma cepa de virulncia grau III. A mortalidade foi superior a 90% no primeiro ano e somente 30% no stimo ano. Embora a mixomatose tenha sido introduzida deliberadamente na Austrlia, pode-se considerar que esse foi um caso de enfermidade emergente. Humanos infectaram coelhos europeus com o vrus da mixomatose, uma espcie na qual o vrus produz uma doena muito mais severa. A emergncia de uma enfermidade pode estar relacionada com uma mudana evolutiva no agente causal, porm a enfermidade pode emergir mesmo na ausncia de mutaes virais. No caso da mixomatose na Austrlia, o vrus evoluiu, reduzindo a sua virulncia. No entanto, no h um consenso de que todos os vrus evoluem no sentido da atenuao. muito comum se considerar que os vrus evoluem para uma forma inofensiva para o seu hospedeiro, o que, provavelmente, poderia ser melhor para o futuro da populao viral. Aos parasitas interessa no produzir muitos danos na populao hospedeira, para que esses sobrevivam e permitam a sua amplicao e transmisso. Contudo, o xito evolutivo de uma espcie depende essencialmente da gerao de uma descendncia numerosa, e isso no est necessariamente associado com atenuao da doena nos hospedeiros.
2.6.3 Vrus da inuenza

Os vrus da inuenza tm utilizado uma srie de estratgias e alteraes evolutivas que permitem a sua contnua circulao mesmo em populaes com certo grau de imunidade. Existem razes evidentes pelas quais se estuda muito esses vrus: ocorreram quatro pandemias de inuenza em um sculo e, na pandemia de 1918, morreram entre 20 e 50 milhes de pessoas. O vrus da inuenza um ortomixovrus, possui envelope e seu genoma composto por oito segmentos de RNA de sentido negativo, a maioria dos quais codica somente uma protena. O envelope viral possui duas glicoprotenas: a hemaglutinina (16 tipos) e a neuraminidase (nove tipos), e as cepas so designadas conforme
a composio da superfcie viral por estas protenas (H3N2, H5N1, H3N8). A hemaglutinina (HA) a protena que se liga a molculas da superfcie celular que possuem cido silico, que servem como receptores para o vrus. A HA tambm a protena que induz a produo de anticorpos neutralizantes e protetores pelo hospedeiro. A neuraminidase (NA) atua durante o egresso do vrus, clivando o cido silico dos glicoconjugados e permitindo, dessa maneira, que a prognie viral seja liberada da clula. Os vrus da inuenza so mestres nas mudanas genticas e antignicas. Ao se estudar os diferentes isolados, so observadas variaes antignicas pontuais e progressivas na HA. Essas pequenas variaes denominam-se drift antignico (pode ser traduzido como substituio gentica, principalmente por mutaes em ponto) e permitem ao vrus reinfectar uma populao parcialmente imune, que ainda possui anticorpos produzidos por uma infeco recente, mantendo o vrus circulante na populao. Contrastando com essas variaes pequenas, as alteraes radicais na HA e NA denominam-se shift (troca), e ocorrem pelo intercmbio dos respectivos genes entre dois vrus da inuenza quando estes co-infectam um mesmo hospedeiro. Esses shifts antignicos foram responsveis pelas pandemias de 1957 e 1968, e acredita-se que so produzidos periodicamente pela criao conjunta de aves e sunos. Ao contrrio, os segmentos genticos do vrus que causou a pandemia de 1918 se originaram completamente de um ancestral avirio. Alm do drift e shift, so detectadas inseres de seqncias e outros mecanismos que permitem o processamento proteoltico da HA, alterando o tropismo tecidual e a patogenicidade. Assim, os vrus da inuenza evoluem por meio de dois mecanismos principais: mutaes em ponto, que conferem pequenas alteraes antignicas; e ressortimento, que proporciona grandes alteraes antignicas e/ou de virulncia. A espcie animal que geralmente abriga os eventos de ressortimento a suna, que pode ser infectada tanto por vrus avirios como por vrus humanos ou sunos. Em 2005, foi publicado um artigo que descreve como o vrus que ocasionou a pandemia de
105
1918 foi recriado em laboratrio. O mais marcante deste fato que esta pandemia ocorreu muito antes da identicao do vrus da inuenza, que somente foi isolado no princpio dos anos 1930. Os segmentos genmicos de RNA do vrus foram recuperados de amostras de pulmo xadas em formalina, que estavam guardadas, e tambm de tecidos de uma vtima da pandemia de 1918 que havia sido enterrada na permafrost (terra permanentemente congelada, no Alasca). Por meio de metodologia de gentica reversa, foi possvel recriar o vrus em laboratrio e estudar algumas de suas caractersticas. As seqncias dos genes do vrus de 1918 so relacionadas com o vrus H1N1 avirio, mais do que com qualquer outro isolado H1N1 de mamfero. Esses achados aumentaram a preocupao atual com os casos de inuenza de origem aviria pelo vrus H5N1, que pode infectar humanos. At o momento, no h evidncias de que este vrus possua a habilidade de ser transmitido entre humanos, pois a replicao viral connada ao trato respiratrio inferior e provoca a morte de pessoas em poucos dias. Porm, medida que o nmero de pessoas infectadas aumente, a probabilidade de mutaes que permitam a transmisso entre humanos tambm aumentar. Os trs tipos de alteraes evolutivas descritas, drift e shift antignico e inseres na hemaglutinina conferem ao vrus da inuenza uma maior aptido biolgica, uma vez que podem reinfectar uma populao parcialmente imune ou ampliar o tropismo tecidual, produzindo uma prognie mais abundante.
Estudos das mutaes responsveis pelo cruzamento da barreira entre espcies indicam que mudanas em apenas dois cdons (posies 93 e 323) da VP2 do FPLV possibilitaram ao vrus infectar ces e linhagens celulares de origem canina. Posteriormente foi demonstrado que as mesmas substituies desses cdons no CPV pelos correspondentes do FLPV eliminam a predileo do vrus pela espcie canina. Como a populao canina no possua anticorpos contra o novo agente, os primeiros seis meses aps o surgimento do CPV foram seguidos de uma pandemia mundial, que produziu gastrenterite hemorrgica grave com altos ndices de mortalidade em ces. Esse agente foi denominado CPV-2 e, nos anos seguintes, sofreu algumas alteraes que permitiram uma adaptao maior aos hospedeiros caninos, originando os bitipos CPV-2a e CPV-2b. Um terceiro bitipo, o CPV-2c, tem sido descrito na populao canina nos ltimos anos. Acredita-se que o CPV no perdeu a sua capacidade inicial de infectar felinos, pois a infeco natural tem sido demonstrada em gatos domsticos. Os CPVs que existem atualmente circulando na populao canina so menos virulentos do que os originais, provavelmente reetindo uma evoluo do vrus no sentido de se adaptar aos novos hospedeiros.
2.7 Concluses
Os vrus so os mestres das mudanas e evoluo gentica. importante conhecer as estratgias que esses agentes utilizam para melhor reconhecer enfermidades produzidas por vrus emergentes e por vrus conhecidos que produzam doenas atpicas. medida que se intensica a explorao pecuria e se aumenta a densidade dos animais, torna-se necessria a implementao de programas sanitrios especiais que reduzam a possibilidade de introduo de novos patgenos nas criaes. importante considerar tambm que todos os vrus so importantes, mesmo os que aparentemente no produzem enfermidades no homem ou em animais, pois esses agentes podem alterar a sua gama de hospedeiros e produzir enfermidades devastadoras. Exemplos recentes incluem a infeco de humanos, ces e
2.6.4 Parvovrus canino

O parvovrus canino (CPV) surgiu subitamente como causa de enfermidade de ces na dcada de 1970 e, em 1978, foi diagnosticado simultaneamente em vrios pases, causando enfermidade grave na populao canina. Este vrus se originou a partir de um parvovrus j conhecido anteriormente, o vrus da panleucopenia felina (FPLV), por mutaes em ponto na protena VP2 do capsdeo, stio de ligao do vrion aos receptores celulares. Assim, o novo vrus foi capaz de infectar e, posteriormente, se adaptar a uma nova espcie hospedeira.
106
Captulo 4
felinos com novos subtipos do vrus da inuenza, o surgimento do SARS-CoV, que matou centenas de pessoas na sia e a inusitada infeco de mamferos marinhos com variantes do CDV, causando alta mortalidade no mar Mediterrneo. Assim, tendo em vista a sua plasticidade e capacidade de adaptao e evoluo, nenhum vrus pode ser considerado sem importncia.
PARRISH, C.R. Emergence, natural history and variation of canine, mink, and feline parvoviruses. Advances in Virus Research, v.38, p.403-450. PARRISH, C.R. et al. Global spread and replacement of canine parvovirus strains. The General Journal of Virology, v.69, p.1111-1116, 1988. PARRISH, C.R. et al. Natural variation of canine parvovirus. Science, v.230, p.1046-1048. PEARSON, H. Genetics: what is a gene? Nature, v.25, p.398-401, 2006. PLAGEMANN, P.G.W. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: origin hypothesis. Emerging Infectious Diseases, v.9, p.903-908, 2003. RAGER, M. et al. Polyploid measles virus with hexameric genome length. The EMBO Journal, v.21, p.2364-2372, 2002. SELLA, G.; HIRSH, A.E. The application of statistical physics to evolutionary biology. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v.102, p.9541-9546, 2005. TRUYEN, U. et al. There is nothing permanent except change. The emergence of new virus diseases. Veterinary Microbiology, v.43, p.103-122, 1995. WEBSTER, R.G. et al. H5N1 outbreaks and enzootic inuenza. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.3-8, 2006.
ADAMI, C. What is complexity? BioEssays: news and reviews in molecular, cellular and developmental biology, v.24, p.10851094, 2002. ADAMI, C.; OFRIA, C.; COLLIER, T.C. Evolution of biological complexity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v.97, p.4463-4468, 2000. BARRETT, T. Morbillivirus infections, with special emphasis on morbilliviruses of carnivores. Veterinary Microbiology, v.69, p.3-13, 1999. BELSHE, R.B. The origins of pandemic inuenza: lessons from the 1918 virus. The New England Journal of Medicine, v.353, p.2209-2211, 2005. CARROLL, S.B. Chance and necessity: the evolution of morphological complexity and diversity. Nature, v.409, p.11021109, 2001. DeFILIPPIS, V.R.; VILLARREAL, L.P. Virus evolution. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.13, p.353-370. DOMINGO, E. HOLLAND, J. RNA Virus mutations and tness for survival. Annual Review of Microbiology, v.51, p.151-178, 1997. GIBBS, A.J.; CALISHER, C.H.; GARCIA-ARENAL, F. Molecular basis of virus evolution. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1995. 603p. LEVINE, A.J. The origins of virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.1, p.3-18. MURPHY, F.A. et al. Viral genetics and evolution. In: ___. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap.4, p.61-80. NOVELLA, I.S. et al. Exponential increases of RNA virus tness during large population transmissions. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences of the United States of America, v.92, p.5841-5844, 1995. ORR, H.A. Adaptation and the cost of complexity. Evolution: international journal of organic evolution, v.54, p.13-20, 2000.
REPLICAO VIRAL
Eduardo Furtado Flores & Luiz Carlos Kreutz
5
109 109 110
111 114 114 114 117 118 118 118 119 119 121 122 126 131 131 132
1 Introduo 2 Conceitos bsicos: infeco, susceptibilidade, permissividade 3 Etapas da replicao

3.1 Adsoro 3.2 Penetrao 3.2.1 Penetrao por fuso na superfcie celular 3.2.2 Penetrao aps endocitose 3.2.3 Outros mecanismos de penetrao 3.3 Etapas aps a penetrao 3.3.1 Desnudamento 3.3.2 Movimentao intracelular 3.3.3 Penetrao nuclear 3.4 Expresso gnica 3.5 Replicao do genoma 3.5.1 Replicao dos vrus DNA 3.5.2 Replicao dos vrus RNA 3.6 Morfognese, maturao e egresso 3.6.1 Maturao intracelular (citoplasmtica ou nuclear) 3.6.2 Maturao por brotamento em membranas celulares
134
1 Introduo
A produo de prognie gentica e fenotipicamente semelhante ao vrus parental se constitui no evento central da existncia e perpetuao dos vrus na natureza. Por isso, por uma viso evolutiva simplista, a multiplicao dos vrus possui uma nalidade nica e objetiva: produzir prognie vivel. As alteraes da siologia celular, associadas com as infeces virais que podem resultar em doena e at em morte do hospedeiro , so meras conseqncias das interaes do vrus com as clulas; interaes que so absolutamente necessrias para o agente atingir esse objetivo. Os vrus so os organismos mais simples que existem: os mais simples so compostos por uma molcula de cido nuclico envolta por uma camada protica. Quando esto fora de clulas vivas, os vrus so estruturas qumicas, desprovidas de qualquer atividade biolgica. No possuem metabolismo prprio, no so capazes de produzir autonomamente nem os componentes mnimos para a sua multiplicao. Por isso, necessitam utilizar as organelas e o metabolismo celular para replicar o seu genoma e produzir as protenas necessrias para a construo de novas partculas vricas. Esses agentes s adquirem atividade biolgica dentro de clulas vivas. Mesmo os vrus mais complexos e evoludos so dependentes de processos biolgicos celulares para a sua multiplicao. Por isso, os vrus so, tradicionalmente, classicados como parasitas intracelulares obrigatrios. O termo replicao que em sua origem signica a sntese de molculas de cidos nuclicos a partir de um molde tem sido universalmente utilizado para designar o processo de multiplicao dos vrus como um todo e assim ser utilizado neste texto. Este captulo abordar os aspectos gerais da replicao dos vrus; os aspectos peculiares de cada famlia sero abordados nos captulos especcos.
2 Conceitos bsicos: infeco, susceptibilidade e permissividade

A palavra infeco deriva do latim infere, que signica inserir, penetrar, introduzir. No entanto,
embora a penetrao (ou infeco, no signicado estrito da palavra) seja uma etapa indispensvel replicao viral, por permitir a introduo do material gentico na clula, o termo infeco possui um signicado mais amplo em Virologia. A penetrao do vrus na clula, por si s, no assegura a produo de prognie viral, pois outras etapas intracelulares so necessrias. Por isso, o termo infeco tem sido utilizado para denir o processo replicativo do agente como um todo, incluindo a penetrao e as etapas subseqentes da replicao. A srie de etapas que inicia com a penetrao e culmina com a liberao de prognie viral tambm denominada ciclo replicativo. Se todas as etapas da infeco forem completadas e resultarem na produo de prognie viral vivel, a infeco dita produtiva. Se, aps a penetrao, o ciclo replicativo for interrompido em alguma etapa, a infeco dita abortiva. Susceptibilidade e permissividade so propriedades complementares que denem a capacidade das clulas de suportar as etapas da replicao viral. Susceptibilidade refere-se capacidade das clulas de serem infectadas naturalmente pelo vrus, enquanto permissividade refere-se s condies intracelulares para a ocorrncia da multiplicao viral. Assim, as clulas que suportam o ciclo replicativo completo, aps a infeco natural, so simultaneamente susceptveis (permitem a penetrao) e permissivas (permitem a ocorrncia das etapas intracelulares). Essas duas propriedades, no entanto, nem sempre ocorrem concomitantemente em uma clula. Em algumas situaes, clulas permissivas podem ser no susceptveis infeco, devido falta de receptores para a adsoro e penetrao do vrus. Essas clulas somente podero ser alvo de uma replicao produtiva se o material gentico viral for introduzido articialmente (i.e., por transfeco). Por outro lado, clulas susceptveis infeco natural podem apresentar um bloqueio intracelular em alguma etapa da replicao, sendo denominadas no-permissivas. Se esse bloqueio ocorrer aps algumas etapas do ciclo, essas clulas so ditas semipermissivas. Para simplicar, neste texto, o termo susceptibilidade ser utilizado para denir a capacidade das clulas de suportar todas as etapas da replicao viral aps a infeco natural.
110
Captulo 5
A susceptibilidade determinada pela interao de mltiplos fatores virais e celulares. Em razo da complexidade dessas interaes, as espcies animais (e tambm as clulas de cultivo) apresentam uma ampla variao de susceptibilidade a diferentes vrus. O termo espectro de hospedeiros (host range) utilizado para denir o conjunto de espcies animais (host range in vivo) ou de diferentes clulas (host range in vitro) que podem ser infectados naturalmente por um determinado vrus. O termo tropismo refere-se predileo do vrus por determinadas clulas, tecidos ou rgos do hospedeiro para se multiplicar. O principal fator celular mas no o nico determinante da susceptibilidade e do tropismo a presena de molculas especcas na superfcie celular, denominadas genericamente de receptores virais. Os receptores virais so molculas da membrana plasmtica que desempenham funes diversas na biologia das clulas, das quais os vrus se utilizam para se ligar e iniciar a infeco.
las e iniciam a infeco. A coleta e quanticao do vrus presente no sobrenadante dos cultivos a diferentes intervalos, aps a inoculao, permite a identicao de trs fases: eclipse, maturao e inativao (Figura 5.2).
9 1
Citoplasma 4
7 6
Ncleo
3 Etapas da replicao
A multiplicao dos diferentes vrus apresenta vrias etapas em comum, apesar da diversidade estrutural, do tipo e da organizao genmica e das diferentes estratgias de replicao. Essas etapas ocorrem de forma ordenada e seqencial e envolvem interaes complexas entre as protenas e o genoma viral com organelas e macromolculas celulares. O ciclo replicativo de todos os vrus inclui necessariamente as etapas de adsoro, penetrao, desnudamento, expresso gnica (transcrio e traduo), replicao do genoma, morfognese/maturao e egresso. Essas etapas esto ilustradas esquematicamente na Figura 5.1. A maior parte dos conhecimentos sobre os mecanismos biolgicos e moleculares da multiplicao dos vrus somente foi obtida a partir do estabelecimento dos cultivos celulares. Aps a inoculao do vrus em clulas cultivadas in vitro, os cultivos so deixados em repouso para que as partculas vricas iniciem gradativamente a entrar em contato com a superfcie celular. Essa etapa denominada adsoro. Imediatamente aps a adsoro, os vrions penetram nas clu-
Figura 5.1. Representao esquemtica do ciclo replicativo de um vrus DNA. 1) Adsoro; 2) Penetrao; 3) Desnudamento; 4) Transcrio dos genes virais; 5) Traduo dos RNA mensageiros (mRNA) e produo das protenas virais; 6) Replicao do genoma; 7) Morfognese; 8-9) Egresso.
Aps a remoo do material que foi inoculado e durante um perodo varivel, apenas uma pequena quantidade de infectividade pode ser detectada no sobrenadante. Esse perodo em que o vrus virtualmente desaparece denominado eclipse e coincide com as fases iniciais da infeco. A durao da fase de eclipse depende do ciclo replicativo de cada vrus, que varia entre quatro a seis horas nos picornavrus e mais de 40 horas em alguns herpesvrus. A fase de eclipse seguida por um perodo em que a prognie viral vai sendo produzida e gradativamente liberada pelas clulas, acumulando-se no sobrenadante (Figura 5.2). Essa fase denominada maturao. Nos vrus que produzem lise celular, a quantidade de vrus no sobrenadante aumenta at atingir um plat, que coincide com a perda da integridade funcional e estrutural das clulas. A partir da, o ttulo viral no sobrenadante tende a decrescer gradativamente dependendo do vrus devido ina-
Replicao viral
111
tivao da infectividade das partculas vricas e perda da viabilidade das clulas. Essa fase denominada inativao. Em infeces por vrus nolticos, as clulas podem produzir prognie viral indenidamente, mas o balano entre a produo e a inativao no permite que o ttulo viral no sobrenadante aumente indenidamente.
Eclipse
Maturao
Inativao
Inoculao
Horas
Figura 5.2. Fases da infeco por vrus lticos em cultivo celular: eclipse, maturao e inativao.
3.1 Adsoro
A primeira etapa da replicao a ligao especca das partculas vricas na superfcie das clulas hospedeiras evento denominado adsoro . Essa ligao mediada por protenas da superfcie dos vrions (viral attachment proteins, VAPs) que interagem com os receptores na superfcie das clulas. Nos vrus sem envelope, a funo de ligao exercida pelas protenas do capsdeo; nos vrus envelopados, pelas glicoprotenas do envelope. Os receptores celulares para os vrus so geralmente protenas (glicoprotenas) ou carboidratos (presentes em glicoprotenas ou em glicolipdios da membrana). Em comparao com os receptores proticos, os carboidratos so menos especcos, pois podem estar presentes em uma variedade de molculas de membrana. Alguns vrus so estritamente dependentes de um receptor especco (exemplos: rinovrus, poliov-
rus, vrus da febre aftosa [FMDV]) enquanto outros podem utilizar receptores alternativos para iniciar a infeco (exemplo: herpesvrus, alguns togavrus). A capacidade de utilizar mais de um receptor para iniciar a infeco pode representar uma vantagem evolutiva, pois oferece a esses vrus a possibilidade de infectar diferentes tipos de clulas e/ou hospedeiros. Os receptores celulares para vrus so molculas de membrana que desempenham funes diversas na biologia celular e que, ocasionalmente, servem para os vrus se ligarem e iniciarem a infeco. Os receptores celulares para vrios vrus animais j foram identicados (Tabela 5.1). Na maioria dos casos, a presena dos receptores determina o espectro de hospedeiros e o tropismo do vrus. Conseqentemente, a presena e distribuio dos receptores tambm so determinantes fundamentais da patogenia da infeco. O nmero de receptores na superfcie de uma clula parece ser extremamente varivel. Essas molculas podem ser raras e especcas de algumas clulas ou abundantes e amplamente distribudas em vrias clulas. Em alguns casos, as interaes entre as VAPs e os receptores no so sucientes para permitir o incio da infeco. Nesses casos, a interao dos vrions com protenas adicionais da membrana celular, denominadas co-receptores, necessria para que ocorra a penetrao. Por exemplo, a interao inicial dos adenovrus com a clula hospedeira envolve a ligao da protena ber com um receptor celular. Essa interao no suciente para assegurar a penetrao, mas necessria para que a protena viral penton interaja com uma segunda molcula da membrana celular a vitronectina e resulte em penetrao. O vrus da imunodecincia humana (HIV-1) liga-se ao receptor CD4 e utiliza como co-receptor um receptor de citocina. A interao inicial do vrus do herpes simplex humano (HSV-1) com as clulas mediada pela interao da glicoprotena gC (ou gB) com o sulfato de heparina na superfcie celular. A fuso e penetrao, no entanto, dependem de interaes secundrias entre a gD (e tambm a gH) com outras molculas da membrana.
Ttulo viral no sobrenadante
112
Captulo 5
Tabela 5.1. Receptores celulares e mecanismos de penetrao dos principais vrus animais .
Famlia Vrus Receptor Viral
Sulfato de heparina/receptor homlogo ao fator de necrose tumoral (TNF) e fator de crescimentonNeuronal (NGF)
Forma/local de Penetrao
Fuso na membrana plasmtica
Herpesviridae
Herpes simplex
Pseudoraiva
Sulfato de heparan (HS), proteoglicanos (HSPG) e coreceptores

Receptor para adenovrus e vrus Coxsackie B (CAR)
Fuso na membrana plasmtica
Adenoviridae
Adenovrus 2
Endocitose dependente de clatrina

Membrana plasmtica e/ou macropinossomo
Vrus DNA
Poxviridae
Vaccinia
Fator de crescimento epidermal (EGF)
Polyomaviridae
SV-40
Molculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe I

Integrina a-6 e molculas semelhantes ao heparan
Endocitose caveolar e/ou retculo endoplasmtico
Papillomaviridae
Papilomavrus bovino
Parvovrus canino
Endocitose dependente de clatrina

Endossomos
Parvoviridae
Receptor da transferrina
Asfarviridae
Peste suna africana

Vrus elevador da desidrogenase lctica Vrus da Hepatite dos Murinos Coronavrus humano 229E
nd
Endossomos
Arteriviridae
Molculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe II
Endossomos
Coronaviridae
Glicoprotena biliar dos murinos/ antgeno carcinoembriognico CD13 (Aminopeptidase) cido silico CD46 Molculas do MHC classe II CD46 bovino Receptor da neurotropina (p75NTR) Receptor folato a(FR-a) CD4 e receptor de citocinas Integrinas (b3) Integrinas (av) nd cido silico e molcula 1 de adeso jjuncional (JAM 1) Integrinas aVb3 e protenas cognatas do choque trmico (hscp70)
Endossomos
Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina
Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Togaviridae
Vrus da influenza Vrus do sarampo Semliki Forest Vrus da diarria viral bovina Vrus da raiva Vrus Ebola e Marburg HIV-1 Vrus Hantaan Vrus da febre aftosa nd Reovrus
Vrus RNA
Flaviviridae Rhabdoviridae Filoviridae Retroviridae Bunyaviridae Picornaviridae Caliciviridae Reoviridae
Endossomos Endocitose dependente de clatrina Caveola Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina Endocitose Endossomos Endossomos
Rotavrus
Membrana citoplasmtica (lipid rafts)
* Adaptado de Klasse et al. (1998); de Pelkmans e Helenius (2003) e referncias selecionadas. CAR: receptor de virus b coxsackie B e adenovirus. no determinado.
Replicao viral
113
Em cultivo celular e provavelmente tambm in vivo o contato de um vrion com uma clula um evento que ocorre ao acaso. Ou seja, a clula hospedeira no atrai a partcula vrica a distncia. Uma vez em contato com a superfcie da clula, componentes externos dos vrions interagem quimicamente (interaes eletrostticas, pontes de hidrognio etc.) com molculas da membrana plasmtica, podendo resultar ou no em penetrao e incio da infeco. O processo de adsoro independente de energia e do metabolismo celular e ocorre com a mesma ecincia temperatura corporal ou a 4C. Embora seja de alta especicidade, a interao de uma molcula de VAP com o receptor de fraca intensidade e, isoladamente, no seria suciente para proporcionar a ocorrncia das etapas seguintes da penetrao. Para isso, necessria a ocorrncia simultnea de dezenas ou centenas dessas interaes. Ou seja, a adsoro viral na superfcie celular um processo cooperativo, resultante de mltiplas interaes entre protenas da superfcie dos vrions com os seus respectivos receptores. Embora a adsoro dos vrions superfcie celular seja a etapa inicial e indispensvel para o incio da replicao, esse evento nem sempre resulta em infeco produtiva. provvel que um nmero muito grande de interaes entre vrions e clulas no resulte em penetrao, seja pela ausncia de receptores especcos para o vrus, seja pela debilidade dessas interaes. Partculas vricas podem se ligar superfcie da clula e no serem internalizadas. Outro cenrio possvel a ligao, porm com internalizao e liberao do nucleocapsdeo em compartimentos inadequados para a replicao (p. ex.: lisossomos). possvel tambm que vrions sejam internalizados em clulas que no possuam os componentes necessrios continuao do ciclo. Resumindo, a ligao dos vrions a molculas da membrana celular uma etapa absolutamente necessria, porm nem sempre suciente para garantir a continuidade do ciclo replicativo. Alm de proporcionar o contato inicial com a clula, as interaes dos vrions com os receptores tambm podem desencadear alteraes es-
truturais nas protenas de superfcie dos vrions. Para alguns vrus (p. ex.: poliovrus), essas alteraes so absolutamente necessrias para a penetrao, desnudamento e continuao do ciclo. Por isso, alm de servir para a ligao inicial, os receptores, para alguns vrus, podem ser necessrios para a desestabilizao das partculas vricas e conseqente liberao do genoma no interior da clula. Nos vrus envelopados, a ligao ao receptor pode induzir alteraes conformacionais nas VAPs, que promovem a fuso do envelope com a membrana celular. No caso do HIV-1, a ligao do vrion ao receptor CD4 necessria para estimular a capacidade fusognica da glicoprotena TM. Em alguns casos, a ligao dos vrions aos receptores tambm pode induzir sinais qumicos intracelulares, que podem estar envolvidos na facilitao da endocitose, no transporte intracelular dos nucleocapsdeos e at mesmo na sobrevivncia da clula. Por outro lado, a penetrao e a posterior replicao viral ativam mecanismos imunolgicos de defesa, como a produo de interferon do tipo I (IFN-I). A distribuio dos receptores na superfcie apical das clulas parece ser aproximadamente uniforme. A penetrao dos vrions, no entanto, parece ocorrer preferencialmente em alguns locais. Isso ocorre porque a ligao das partculas vricas aos receptores acompanhada de movimentos laterais dessas molculas, resultando na aglomerao dos receptores em determinados locais. Esses locais so facilmente observveis sob microscopia eletrnica (ME) e aparecem como espessamentos da membrana plasmtica. Esses espessamentos so decorrentes do acmulo de uma protena denominada clatrina, envolvida em sistemas de transporte intracelular por vesculas. A aglomerao dos vrus que penetram por endocitose mediada por receptores, em determinados locais, precede e promove a invaginao da membrana, com a conseqente formao da vescula endoctica contendo os vrions em seu interior. A endocitose mediada por receptores um processo siolgico utilizado pelas clulas para internalizar diversas molculas, das quais os vrus tiram proveito para iniciar a infeco.
114
Captulo 5
3.2 Penetrao
A penetrao a etapa subseqente adsoro e envolve a transposio da membrana plasmtica, permitindo a introduo do nucleocapsdeo (genoma viral + protenas) no interior da clula, local onde ocorrero a expresso gnica e a replicao do genoma. A transposio da membrana pode ocorrer na superfcie celular ou j no interior do citoplasma, a partir de vesculas produzidas por endocitose, fagocitose ou macropinocitose. Dependendo da biologia do vrus, a penetrao pode ocorrer sem prvia internalizao (se ocorrer na superfcie celular) ou aps internalizao (se ocorrer a partir de vesculas intracitoplasmticas). No entanto, a internalizao de vrions em vesculas endocticas no assegura a ocorrncia de penetrao. A internalizao em vesculas ou a penetrao direta so processos que ocorrem imediatamente aps a ligao dos vrions aos receptores da membrana plasmtica. Ao contrrio da adsoro, a internalizao e penetrao so processos dependentes de energia e no ocorrem ecientemente a 4C. Uma forma de sincronizar o incio da infeco viral in vitro realizar adsoro a 4C durante uma hora (ocorre adsoro sem penetrao) e, a seguir, transferir o cultivo para 37C, quando ocorrer a penetrao simultnea das partculas vricas adsorvidas. As etapas iniciais da infeco viral tm sido estudadas com o recurso da ME e com a utilizao de qumicos que inibam a internalizao e/ ou a acidicao de vesculas intracelulares (i.e., endossomos). Dessa forma, quando a infeco por um vrus prevenida por substncias inibidoras da endocitose, deduz-se que a sua penetrao dependa de prvia internalizao; quando a infeco inibida por agentes que previnam a acidicao dos endossomos, conclui-se que o pH cido dessas organelas seja necessrio para a penetrao. Em geral, os vrus penetram nas clulas utilizando um (ou alternativamente mais de um) dos seguintes mecanismos: a) penetrao por fuso na superfcie celular; b) penetrao aps endocitose (mediada por clatrina, caveolina ou agrupamentos de lipdios); c) fagocitose. Esses mecanismos esto ilustrados na Figura 5.3.
3.2.1 Penetrao por fuso na superfcie celular

Alguns vrus com envelope (p. ex.: retrovrus, paramixovrus e herpesvrus) penetram na clula aps fuso do envelope com a membrana plasmtica, evento que ocorre na superfcie celular (Figura 5.3A). A fuso resulta em um canal entre o interior da partcula e o compartimento citoplasmtico, atravs do qual o nucleocapsdeo penetra no citoplasma. A fuso entre as membranas do envelope e a plasmtica requer a ao de protenas de fuso presentes no envelope dos vrions (p. ex.: glicoprotena TM nos retrovrus e F nos paramixovrus). Nesses vrus, o mecanismo de fuso ocorre sob pH neutro, ou seja, independe de acidicao, e, por isso, esses vrus so denominados pH-independentes. A membrana plasmtica no a nica barreira que o nucleocapsdeo viral deve ultrapassar para ter acesso aos locais intracelulares apropriados para a replicao. Algumas clulas possuem um citoesqueleto cortical espesso logo abaixo da membrana plasmtica, o que impede o acesso de ribossomos e outras organelas rea imediatamente adjacente membrana. Essas estruturas tambm dicultam a progresso dos nucleocapsdeos at as regies mais internas da clula. No obstante, os vrus que penetram por fuso na superfcie celular desenvolveram estratgias para superar esses obstculos e conseguir liberar os seus nucleocapsdeos nos locais adequados.
3.2.2 Penetrao aps endocitose

Esse mecanismo caracterstico da penetrao de vrios vrus envelopados (p. ex.: avivrus e ortomixovrus) e de alguns vrus sem envelope (p. ex.: adenovrus, picornavrus e reovrus). A via endoctica parece ser o caminho mais adequado para a internalizao dos vrus, pelos seguintes aspectos: a) a endocitose um processo siolgico comum maioria das clulas; b) somente ocorre em clulas com transporte de membrana ativo, evitando a penetrao em eritrcitos e plaquetas, onde a infeco seria improdutiva; c) os vrions podem se ligar em qualquer local da superfcie celular para serem internalizados; d) a endocito-
Replicao viral
115
se assegura a internalizao e o transporte dos vrions aos locais de expresso gnica e replicao; e) a penetrao a partir dos endossomos reduz os riscos de deteco pelo sistema imunolgico, pois no deixa protenas virais expostas na superfcie celular; e f) o ambiente endossomal se acidica gradativamente, o que auxilia na ativao dos mecanismos de fuso e penetrao.
3.2.2.1 Endocitose mediada por clatrina

Os endossomos recobertos por clatrina so vesculas de aproximadamente 100 nm de dimetro e se formam pela invaginao de pequenas regies da membrana plasmtica revestidas internamente por molculas de clatrina (clatrin-coated pits). Quando examinadas sob ME, essas regies
Microtbulos
H+
H+ H+
H+
H+
H+
Retculo endo
plasmtico
Ncleo
? ?
E
Meio extracelular
Citoplasma
Figura 5.3. Principais mecanismos de penetrao dos vrus nas clulas hospedeiras. A) Penetrao na superfcie celular, por fuso com a membrana plasmtica; B) Penetrao por fuso aps endocitose mediada por clatrina; C) Penetrao por fuso aps endocitose mediada por caveolina; D-E) Penetrao aps endocitose mediada por agrupamentos de lipdios.
116
Captulo 5
aparecem como espessamentos da membrana, adjacentes aos locais de ligao dos vrions. Aps a invaginao, o revestimento de clatrina removido e as vesculas trafegam em direo ao interior da clula. Nesse trajeto, o ambiente endossomal gradativamente acidicado por meio de ATPases associadas membrana, que bombeiam prtons H+ para o seu interior. Nos endossomos tardios e lisossomos, o pH pode atingir 5,0 a 5,5. Dessa forma, os vrions internalizados por essa via so submetidos reduo gradativa do pH. Essa forma de penetrao a mais estudada e, provavelmente, a mais importante entre os vrus animais, sendo tratada com mais detalhes a seguir (Figura 5.3B). Ao contrrio da fuso e penetrao dos vrus pH independentes, a fuso do envelope de muitos vrus com a membrana celular s ocorre sob pH baixo (5,5-6,5). Esses vrus so denominados pH-dependentes e no conseguem fusionar e penetrar na superfcie celular sob pH neutro. A acidicao progressiva dos endossomos proporciona condies para a fuso do envelope com a membrana endossomal, resultando na liberao do nucleocapsdeo no citoplasma. Embora vrios vrus penetrem dessa forma, esse um mecanismo particularmente bem caracterizado nos vrus da inuenza. A protena de fuso desses vrus (hemaglutinina, HA) tambm a protena responsvel pela ligao aos receptores (cido silico). Aps a ligao nos receptores, os vrions so internalizados por endocitose. A acidicao dos endossomos induz alteraes conformacionais na HA que resultam na fuso do envelope com a membrana do endossomo. O pH baixo nos endossomos tambm facilita a dissociao dos nucleocapsdeos do restante do envelope, resultando na sua liberao no citoplasma. Nos vrus pH-dependentes, a penetrao deve ocorrer no momento apropriado, pois a acidicao excessiva que ocorre aps a fuso dos endossomos com os lisossomos pode inativar o vrus. Drogas que inibem a endocitose (xido de fenilarsina) ou impedem a acidicao dos endossomos (monensina, cloroquina e cloreto de amnia) previnem a penetrao de vrus pH-dependentes. Os vrus sem envelope transpem a membrana pela formao de canais proteinceos na
membrana endossomal (picornavrus) ou por lise/perturbao da integridade dessa membrana (adenovrus e reovrus). A acidicao progressiva dos endossomos e as interaes com a membrana provocam alteraes estruturais e desorganizao do capsdeo, podendo ocorrer a dissociao de algumas protenas. Nos picornavrus, o rearranjamento das protenas do capsdeo induzido pelo pH baixo, leva formao de aberturas atravs das quais o genoma translocado para o interior do citoplasma. As partculas vricas do reovrus, internalizados por endocitose, sofrem alteraes estruturais e algumas protenas do capsdeo so ativadas, tornando-se capazes de lisar ou permeabilizar a membrana do endossomo. Dessa forma, permitem a penetrao dos capsdeos semidesintegrados. Nos adenovrus, o capsdeo sofre alteraes estruturais pela exposio ao pH progressivamente baixo, resultando na desorganizao da partcula e na ativao das protenas bra e penton. Essas protenas participam da lise ou da permeabilizao da membrana endossomal, permitindo a penetrao do complexo nucleoprotena no compartimento intracelular.
3.2.2.2 Endocitose mediada por caveolina

As caveolas so pequenas invaginaes em forma de cantil, que so formadas na membrana plasmtica de diversos tipos de clulas. As caveolas podem ser internalizadas com auxlio da actina e, at o presente momento, no h evidncias de que o seu contedo seja entregue via endoctica, ou seja, constituem um mecanismo independente de internalizao. As caveolas internalizadas so transportadas at a regio perinuclear, prximaao retculo endoplasmtico (RE). Recentemente, evidenciou-se que o vrus smio 40 (SV-40) utiliza essa via para a internalizao e penetrao (Figura 5.3C). Aps a ligao aos receptores, os vrions se deslocam lateralmente na superfcie celular at serem capturados por caveolas. As caveolas so, ento, circundadas parcialmente por bras de actina, conferindo vescula uma aparncia de cantil. Posteriormente, a vescula caveolar, contendo os vrions, entregue aos caveossomos,
Replicao viral
117
que so organelas de pH neutro preexistentes no citoplasma, ricas em caveolina e colesterol. Aps algumas horas da infeco, os caveossomos liberam tbulos membranosos repletos de vrions, que trafegam ao longo dos microtbulos at o RE. Posteriormente, as partculas virais deixam essa organela, entram no citosol e penetram no ncleo atravs dos poros nucleares. Essa via de penetrao parece no ser exclusiva do SV-40. Estudos recentes com o vrus ebola (lovrus), poliomavrus e echovrus (picornavrus) tm sugerido um mecanismo semelhante de penetrao.
acidicados, potencializando a capacidade de fuso e penetrao dos vrions pH-dependentes.
3.3.3.2 Macropinocitose
A macropinocitose um processo celular no especco (pode ocorrer na ausncia de ligantes aos receptores) de internalizao de volumes grandes de uidos e de regies de membrana. Substncias internalizadas por essa via tambm so direcionadas aos endossomos e lisossomos. O vrus da vaccinia (poxvrus) pode penetrar por essa via, uma vez que os seus vrions so muito grandes para serem internalizados por endocitose mediada por clatrina. O vrus HIV tambm parece utilizar essa via para infectar macrfagos.
3.2.2.3 Endocitose mediada por agrupamento de lipdeos

Esngolipdeos e/ou glicoesngolipdeos e molculas de colesterol podem se associar lateralmente e formar microdomnios na membrana celular, denominados de lipid rafts (o termo raft denota as toras de madeira utilizadas na construo de jangadas). Esses microdomnios contm protenas especcas e participam de funes celulares, como o transporte de membrana, morfognese e sinalizao celular. A internalizao dessas estruturas independente do revestimento por clatrina e caveolina. Os vrions internalizados por essa via so direcionados aos endossomos, a partir dos quais ocorre penetrao no compartimento citoplasmtico. Essa via de penetrao tem sido sugerida para o SV-40, em clulas que no contm caveolina, e tambm para alguns picornavrus, papilomavrus e retrovrus (Figuras 5.3D e 5.3E).
3.2.3.3 Translocao atravs da membrana plasmtica

Esse um mecanismo pouco conhecido, provavelmente raro entre os vrus animais e parece ocorrer somente com os vrus sem envelope.
3.2.3.4 Transferncia direta entre clulas

Alm dos mecanismos especcos de penetrao, alguns vrus podem ser transmitidos diretamente entre clulas, sem a necessidade de egresso e infeco de uma nova clula. Essa transmisso possvel pela insero de protenas virais na membrana lateral da clula. As protenas virais produzem fuso entre as clulas vizinhas e transferncia do material gentico do vrus para a nova clula. Esse mecanismo de transferncia direta (observada nos paramixovrus e poxvrus, entre outros) permite ao vrus infectar novas clulas sem se expor ao sistema imunolgico. Como j mencionado, a simples internalizao da partcula vrica no assegura que a replicao ir ocorrer. O desnudamento e a entrega do material gentico aos locais apropriados so necessrios para o prosseguimento do ciclo. Alm disso, a clula deve apresentar as condies intracelulares necessrias para a expresso gnica e replicao do genoma. Sob ME, freqente a
3.2.3. Outros mecanismos de penetrao 3.3.3.1 Fagocitose

O papel da fagocitose na penetrao dos vrus nas clulas hospedeiras ainda no est esclarecido. No entanto, partculas do vrus da inuenza j foram observadas em vesculas fagocticas, e os poxvrus possivelmente utilizam essa via para a internalizao e posterior penetrao celular. Aps a sua formao, os fagossomos se fusionam com os endossomos e lisossomos e so
118
Captulo 5
visualizao de vrions internalizados em clulas, porm localizados em stios inapropriados para o prosseguimento da replicao. Alguns desses vrions podem ser eventualmente reciclados e liberados na superfcie celular, podendo infectar produtivamente outras clulas. A maioria, porm, parece estar destinada inativao por processos catablicos celulares.
3.3 Etapas aps a penetrao 3.3.1 Desnudamento

O termo desnudamento (do ingls uncoating) refere-se serie de eventos que ocorrem imediatamente aps a penetrao, em que os componentes do nucleocapsdeo so parcial ou totalmente removidos, resultando na exposio parcial ou completa do genoma viral. A remoo das protenas do nucleocapsdeo necessria para a exposio do genoma s enzimas e fatores responsveis pela transcrio (vrus DNA e RNA de cadeia negativa) ou traduo (vrus RNA de cadeia positiva). No ciclo replicativo de alguns vrus, a replicao do genoma ocorre aps o desnudamento completo do genoma (poliovrus e avivrus). Em outros vrus, a remoo parcial das protenas do nucleocapsdeo j suciente para a ocorrncia das etapas seguintes do ciclo (paramixovrus, rabdovrus, ortomixovrus e reovrus). Portanto, o desnudamento parece ter uma denio mais funcional do que estrutural. A estrutura e complexidade de cada nucleocapsdeo que determina os passos subseqentes na replicao. O produto do desnudamento depende da estrutura do nucleocapsdeo. Nos picornavrus, o resultado a liberao do RNA genmico totalmente desnudo, com uma protena de 23 aminocidos (VPg) ligada covalentemente sua extremidade 5. Em alguns vrus (paramixovrus, rabdovrus, arenavrus e ortomixovrus), o genoma nunca totalmente desnudo. Os processos de transcrio e replicao ocorrem com o genoma recoberto por protenas (ribonucleoprotena). Nos reovrus e poxvrus, a transcrio e a replicao do genoma ocorrem no interior de capsdeos parcialmente desintegrados.
Nos vrus que penetram por fuso com a membrana plasmtica, a remoo do envelope, que ocorre pela fuso faz parte do desnudamento. Em alguns vrus RNA de cadeia positiva (togavrus), a remoo das protenas do nucleocapsdeo ocorre logo aps a penetrao, pela sua interao com o RNA dos ribossomos. Nos vrus pH dependentes, a acidicao dos endossomos desencadeia a fuso e tambm pode facilitar a dissociao das protenas do genoma. Isso resulta na liberao do nucleocapsdeo ou do genoma desprovido de protenas diretamente no citoplasma. Nos herpesvrus, adenovrus e papovavrus, o capsdeo permanece parcialmente ntegro aps a penetrao, sendo transportado at as proximidades do ncleo associado aos tbulos do citoesqueleto. O desnudamento e a penetrao do nucleocapsdeo no ncleo ocorre prximo aos poros nucleares. Nos picornavrus, a acidicao dos endossomos provoca alteraes conformacionais no capsdeo que proporcionam interaes de suas protenas com a membrana, resultando na formao de aberturas atravs das quais o genoma liberado no citoplasma. O desnudamento torna o genoma acessvel s enzimas e a outros fatores celulares responsveis pelas etapas subseqentes da replicao. Dependendo do tipo de genoma, as etapas que se seguem ao desnudamento diferem entre os vrus.
3.3.2 Movimentao intracelular

Aps a penetrao, o genoma viral precisa ser transportado at o local onde ocorrero a expresso gnica e a replicao. A movimentao dos vrions no citoplasma ocorre inicialmente de forma passiva, no interior de vesculas endocticas. Aps a penetrao, os nucleocapsdeos podem interagir com os componentes do citoesqueleto ou com protenas transportadoras. Os paramixovrus (que penetram na clula por fuso direta do envelope com a membrana celular) e os picornavrus (que penetram atravs de poros na membrana endossomal) no necessitam de transporte intracelular antes de iniciar a sntese de protenas, pois os ribossomos podem estar
Replicao viral
119
prximos ao local de penetrao. Outros vrus penetram na clula em vesculas endocticas, que se movimentam entre a densa cadeia de microlamentos e entregam a sua carga aos locais apropriados. Os herpesvrus e retrovrus penetram na clula por fuso do envelope com a membrana plasmtica, e o genoma viral deve ser transportado at o ncleo para a replicao. Para iniciar a transcrio reversa de seu material gentico, os retrovrus interagem com lamentos de actina, necessitam funes relacionadas miosina e dos microtbulos. O HSV ultrapassa o crtex celular (composto basicamente de actina) por mecanismos ainda desconhecidos, e os nucleocapsdeos so transportados at o ncleo associados com os microtbulos. Os adenovrus e parvovrus tambm so transportados por microtbulos at o ncleo da clula hospedeira.
DNA viral atravs do poro nuclear. O adenovrus tipo 2 transportado ao longo dos microtbulos at as proximidades do ncleo e liga-se a lamentos dos poros nucleares. Aps, com o auxlio das importinas, e pela ligao com histonas, ocorre a desmontagem do vrion e o DNA viral translocado para o interior do ncleo.
3.4 Expresso gnica

A sntese de protenas virais pela maquinaria celular o evento central da multiplicao dos vrus. O genoma viral codica diferentes protenas que devem desempenhar pelo menos trs funes bsicas: a) assegurar a replicao do genoma; b) subverter funes celulares em seu benefcio e c) empacotar os genomas recmreplicados em novas partculas vricas. Os vrus no possuem metabolismo prprio e so inteiramente dependentes da maquinaria celular para a produo de suas protenas. Ou seja, as informaes genticas contidas no genoma dos vrus so decodicadas em protenas virais pelo aparato de sntese protica da clula hospedeira. Para utilizar esse aparato para a produo de suas protenas, os vrus tiveram que evoluir de forma a satisfazer algumas restries impostas pelas clulas hospedeiras. O ponto-chave desse processo a sntese (ou apresentao) de mRNAs que sejam adequadamente reconhecidos e traduzidos pelos ribossomos. Dependendo da estrutura e organizao genmica, os vrus de diferentes famlias convergem para a produo de mRNA por diferentes vias (Figura 5.4). O aparato celular de transcrio (RNA polimerase II e fatores de transcrio) e de processamento dos transcritos se localiza no ncleo das clulas hospedeiras. A maioria dos vrus DNA replica no ncleo e, assim, pode utilizar esses mecanismos. Os genes desses vrus contm regies regulatrias (promotores, enhancers) que so reconhecidas pela RNA polimerase II (RNApolII) e pelos fatores de transcrio celulares. Os transcritos (mRNA) produzidos contm a estrutura cap, so poliadenilados e alguns so submetidos a splicing antes de serem exportados para o citoplasma. Embora sejam vrus DNA, os poxvrus e asfarvrus replicam no citoplasma e so independentes da maquinaria nuclear de sntese
3.3.3 Penetrao nuclear

O ncleo o local de replicao da maioria dos vrus DNA e tambm dos ortomixovrus. No entanto, a presena da membrana nuclear representa uma barreira adicional progresso dos vrions ou dos nucleocapsdeos, pois os poros nucleares permitem a passagem somente de partculas com at 39 nm de dimetro. Conseqentemente, o transporte dos nucleocapsdeos ou do genoma at o interior do ncleo depende de interaes especcas com componentes celulares. Vrions pequenos, como os parvovrus (18-24 nm) e os capsdeos do vrus da hepatite B (36 nm), podem ser transportados intactos (ou semi-ntegros), por meio de mecanismos citoplasmticos especializados (microtbulos, microlamentos e protenas motoras), e, posteriormente, translocados atravs dos poros nucleares por protenas especializadas. Os vrions ou capsdeos maiores necessitam ser previamente desintegrados ou deformados para permitirem a introduo do genoma viral pelos poros nucleares. O nucleocapsdeo do HSV, por exemplo, transportado do crtex celular at o ncleo ao longo dos microtbulos e liga-se, na face citoplasmtica da membrana nuclear, por meio de uma molcula denominada de importina. Posteriormente ocorre uma abertura parcial de um dos vrtices do capsdeo e a liberao do
120
Captulo 5
Vrus DNA
Poxviridae Adenoviridae Herpesviridae Polyomaviridae Papillomaviridae (Classe I) Circoviridae Parvoviridae (Classe II) Vrus que realizam transcrio reversa Hepadnaviridae (Classe VII) Retroviridae (Classe VI)
Vrus RNA
Reoviridae Birnaviridae (Classe III) Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Arenaviridae Rabdoviridae Bunyaviridae Filoviridae (Classe V) Picornaviridae Flaviviridae Caliciviridae Astroviridae Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae (Classe IV)
dsDNA
ssDNA
pdsDNA
ssRNA (+)
dsRNA (+ / -)
ssRNA (-)
ssRNA (+)
ssDNA
.dsDNA
.dsDNA
4
dsDNA
mRNA
Traduo
Protena
Fonte: adaptado de Baltimore (1971).
Figura 5.4. Estratgias de produo de RNA mensageiros (mRNA) e expresso gnica das diferentes classes de vrus. Nos vrus da classe I, os promotores virais so reconhecidos por fatores celulares, e os genes so transcritos pela RNApolII celular, resultando em mRNAs traduzveis pelos ribossomos (1). Nos vrus da classe II, o genoma DNA de fita simples linear (parvovrus) ou circular (circovrus) , inicialmente, convertido em fita dupla e transcrito pela RNApolII (2). Apenas as cadeias negativas dos vrus da classe III (genoma RNA de fita dupla) so transcritas pela polimerase viral, originando os mRNA (5). O genoma dos vrus da classe IV (RNA fita simples de polaridade positiva) pode ser diretamente traduzido, em toda a sua extenso (flavivrus, picornavrus) ou parcialmente (outros) (7). Nestes, o restante dos mRNA so produzidos pela transcrio do RNA intermedirio pela polimerase viral. Nos vrus da classe V, o genoma RNA de polaridade negativa transcrito pela polimerase presente nos vrions (6). Nos hepadnavrus (classe VII), os mRNA so produzidos pela transcrio do DNA viral pela RNApolII e fatores celulares (3). Nos retrovrus (classe VI), os mRNA so produzidos pela transcrio do provrus DNA (uma cpia do RNA genmico) pela RNApolII e fatores celulares, aps a integrao do provrus ao genoma celular (4).
e processamento de DNA e RNA. Isso s possvel porque esses vrus trazem, nos vrions, as enzimas e fatores auxiliares para a transcrio e processamento dos seus mRNA. Os vrus RNA, com exceo dos retrovrus, no dependem da maquinaria celular de transcri-
o e convergem para a produo de mRNA por vias diferentes. Os retrovrus utilizam a maquinaria celular para a transcrio dos seus genes, aps a integrao de uma cpia DNA do genoma (provrus) nos cromossomos celulares. A transcrio resulta na produo de mRNA para a sntese
Replicao viral
121
protica e tambm de cpias de RNA genmico que sero encapsidadas. Os vrus RNA convergem para a apresentao de mRNA traduzveis de duas formas: a) o prprio genoma dos vrus RNA de sentido positivo serve de mRNA e parcial ou integralmente traduzido pelos ribossomos. Nos vrus cujo genoma parcialmente traduzido, os mRNAs, para a sntese das protenas estruturais, so produzidos pela transcrio do RNA de sentido antigenmico, que produzido pela replicao do genoma; b) os vrus RNA de sentido negativo trazem a sua prpria RNA polimerase nos vrions. Assim, no incio da infeco, essa enzima se encarrega de transcrever o genoma viral, produzindo os mRNA para a sntese protica. Nos vrus RNA de cadeia dupla, a RNA polimerase trazida nos vrions transcreve as cadeias genmicas negativas em mRNA. A maquinaria de sntese protica das clulas eucariotas (ribossomos e fatores auxiliares) se localiza no citoplasma; somente traduz mRNA monocistrnicos e que possuam a estrutura cap na extremidade 5. Os mRNA dos vrus DNA que replicam no ncleo so produzidos, processados e exportados para o citoplasma pela maquinaria da clula e, como tal, assemelham-se aos mRNA celulares. Os mRNA do vrus DNA que replicam no citoplasma (poxvrus, asfarvrus) so produzidos e modicados no prprio citoplasma por enzimas virais, tambm semelhana dos mRNA celulares. Para serem traduzidos diretamente, os genomas dos vrus RNA de sentido positivo possuem cap 5 (alguns avivrus, coronavrus, arterivrus e togavrus) ou uma estrutura secundria que permite o reconhecimento pelos ribossomos e o incio da traduo. Essa estrutura denominada IRES (internal ribosomal entry site) e est presente prxima extremidade 5 do genoma dos picornavrus e de alguns membros da famlia Flaviviridae (pestivrus). Nos vrus RNA de sentido negativo e RNA de cadeia dupla, a RNA polimerase viral produz mRNAs com cap e cauda poliA. A maquinaria de traduo das clulas eucariotas no capaz de traduzir mRNAs policistrnicos, ou seja, mRNAs que contenham mais de uma ORF. A traduo de ORFs internas no
mRNA exige o reconhecimento de seqncias especcas localizadas prximas ao cdon de iniciao, mecanismo ainda no identicado em eucariotas. Por isso, os vrus desenvolveram diferentes estratgias de codicao de suas protenas: produo de mRNA monocistrnicos (contendo uma ORF = um gene) ou produo de mRNA policistrnicos. Os mRNAs policistrnicos contm uma nica e longa ORF que codica uma longa poliprotena. medida que vai sendo traduzida, essa poliprotena clivada por proteases celulares e/ou virais, dando origem s protenas virais individuais. Do ponto de vista da traduo, os mRNA que contm uma nica ORF, que traduzida em poliprotena, comportam-se como mRNAs monocistrnicos, pois a traduo se inicia no primeiro cdon de iniciao e termina no cdon de terminao. As protenas individuais so geradas aps este processo, pela clivagem enzimtica. Alm de superar essas restries, os vrus tiveram que desenvolver estratgias que os permitam utilizar a maquinaria celular de traduo em seu benefcio. Isso porque os mRNA celulares esto presentes em muito maior quantidade e competem com grande vantagem em relao aos mRNA virais. Dentre as estratgias virais utilizadas pelos vrus para competir pelo aparato celular de traduo destacam-se: a) inibio da transcrio celular (vrus da estomatite vesicular, VSV); b) inibio do processamento e/ou maturao e exportao de mRNA celulares do ncleo (adenovrus, HIV); c) degradao de mRNA celulares no ncleo (ortomixovrus, HSV) ou no citoplasma (buniavrus); d) inibio seletiva da traduo de mRNA celulares (poliovrus, FMDV); e) facilitao do processamento, transporte e traduo de mRNA virais (HIV); g) alterao da especicidade de reconhecimento de mRNA para a traduo: a traduo de mRNA que possuem cap inibida e as clulas infectadas passam a traduzir mRNA virais, que so reconhecidos pelos ribossomos atravs da estrutura IRES (picornavrus).
3.5 Replicao do genoma

Dependendo do tipo e organizao genmica, os vrus podem utilizar diferentes estratgias
122
Captulo 5
para cumprir as etapas de expresso gnica e replicao do seu genoma. Baltimore (1971) props a classicao dos vrus em seis grupos, de acordo com o tipo de genoma, local e estratgia de replicao. Essa classicao foi posteriormente ampliada para contemplar novos vrus e estratgias identicadas, resultando em sete grupos ou classes (Tabela 5.2). A seguir sero abordados os principais aspectos da replicao de cada um desses grupos. Os detalhes da replicao dos vrus de cada famlia sero abordados nos captulos especcos.
3.5.1 Replicao dos vrus DNA

A replicao dos vrus DNA realizada pela ao orquestrada da maquinaria da clula hospedeira associada com fatores codicados pelo v-
rus. A contribuio dos fatores virais na replicao desses vrus, no entanto, varia muito entre as diferentes famlias. Em geral, os vrus DNA mais simples (circovrus, parvovrus e poliomavrus) utilizam extensivamente a maquinaria celular, pois os seus genomas codicam poucos produtos associados com funes replicativas. Por outro lado, os vrus DNA complexos (herpesvrus e poxvrus) codicam muitas enzimas e fatores envolvidos na replicao. Esses ltimos seriam, teoricamente, menos dependentes da maquinaria celular para a replicao de seus genomas e a conseqente produo da prognie viral. A replicao da maioria dos vrus DNA ocorre no ncleo da clula hospedeira. O genoma desses vrus contm regies regulatrias que so reconhecidas pela maquinaria celular de transcrio e, assim, podem utiliz-la para a produo
Tabela 5.2 Classificao dos vrus de acordo com o tipo de genoma, local de replicao e estratgia utilizada para produzir os mRNAs.
Classe Genoma Local de replicao Famlias Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae Asfarviridae Parvoviridae Circoviridae Reoviridae Birnaviridae IVa.Traduo integral do genoma IV RNA de cadeia simples, sentido positivo Citoplasma IVb.Traduo parcial do genoma; mRNAs subgenmicos Astroviridae Caliciviridae Togaviridae Coronaviridae Arteriviridae Orthomyxoviridae Bornaviridae Bunyaviridae Arenaviridae Rabdoviridae Paramyxoviridae Filoviridae Retroviridae Hepadnaviridae Flaviviridae Picornaviridae
Ia. Ncleo I DNA de cadeia dupla Ib. Citoplasma DNA cadeia simples
II III
Ncleo Citoplasma
RNA de cadeia dupla
Va. Ncleo V RNA de cadeia simples, sentido negativo Vb. Citoplasma
VI
RNA de cadeia simples e intermedirio DNA DNA de cadeia parcialmente dupla e intermedirio RNA
Citoplasma/ncleo
VII
Ncleo/citoplasma
Fonte: adaptado de Baltimore (1971).
Replicao viral
123
dos mRNA necessrios sntese de suas protenas. Em diferentes graus, esses vrus tambm utilizam enzimas e fatores celulares para o metabolismo de nucleotdeos, para a sntese de DNA e replicao do genoma. Os poxvrus e asfarvrus se constituem em excees, pois trazem, nos vrions, as enzimas e fatores necessrios para a transcrio e modicao dos mRNA e codicam as enzimas e fatores requeridos para a replicao do genoma. Mesmo assim, so dependentes da maquinaria celular de sntese protica. A replicao desses vrus ocorre inteiramente no citoplasma. O mecanismo de replicao do genoma tambm apresenta diferenas entre as famlias, devido a peculiaridades de estrutura, topologia e organizao genmica. A replicao do genoma circular de ta dupla dos poliomavrus, por exemplo, realizada quase que exclusivamente por enzimas e fatores celulares. A sntese das novas cadeias utiliza um primer de RNA e ocorre de forma bidirecional e semidescontnua, a exemplo da replicao do DNA celular. A replicao dos genomas DNA de ta simples (circovrus e parvovrus) tambm envolve a participao predomi-
nante de fatores celulares e se inicia com a sntese da ta complementar. Nos parvovrus, a prpria extremidade 3 do genoma serve de primer para o incio da replicao. A replicao do genoma linear de ta dupla dos adenovrus se inicia com um primer de protena, ocorre de forma contnua e em duas etapas. Apenas uma das cadeias replicada em cada etapa. A replicao do genoma dos herpesvrus e poxvrus mais complexa e envolve a participao de vrios fatores codicados pelo genoma viral. Os herpesvrus parecem replicar o seu genoma por um mecanismo de crculo rolante, no qual a replicao inicia-se aps a circularizao do genoma e resulta na produo de multmeros, que so posteriormente clivados em unidades genmicas. A replicao do genoma dos hepadnavrus inclui uma etapa de transcrio reversa, na qual um RNA produzido a partir do DNA genmico convertido em DNA de ta simples e, posteriormente, em DNA de ta dupla. As etapas do ciclo replicativo dos diferentes grupos de vrus DNA esto ilustradas esquematicamente nas Figuras 5.5 a 5.8 (a forma de apresentao das etapas de replicao foi adaptada de ROIZMAN e PALESE, 1996).
Genoma dsDNA
3 Replicao
DNA Prognie
Transcrio genes iniciais
Transcrio genes tardios
Morfognese
mRNA
mRNA
Vrions
Egresso
Traduo
Traduo 6 Morfognese
Protenas iniciais (NS)
Protenas tardias (estruturais)
Figura 5.5. Ciclo replicativo dos vrus da classe Ia (Adenoviridae, Herpesviridae, Polyomaviridae e Papillomaviridae). Os genes iniciais so transcritos antes da replicao do genoma (1) e geralmente codificam protenas no-estruturais (NS) envolvidas nas etapas seguintes da replicao (2). Essas protenas, isoladamente ou em conjunto com fatores celulares, atuam na replicao do genoma (3). Os genes tardios so transcritos aps a replicao do genoma (4) e codificam protenas estruturais em sua maioria (5). As protenas estruturais so importadas para o ncleo, onde ocorre a morfognese (6).
124
Captulo 5
3.5.1.1 Vrus da classe Ia

Os genes desses vrus so transcritos pela maquinaria celular de transcrio, pois possuem as regies regulatrias (promotores, enhancers), que so reconhecidas pela RNApolII e pelos fatores de transcrio da clula hospedeira. Os genes so classicados em duas ou mais classes e so transcritos seqencialmente sob regulao temporal restrita. Os genes iniciais (immediate-early e early nos herpesvrus; early nas demais famlias) so transcritos logo aps a penetrao na clula e, geralmente, codicam protenas no-estruturais que possuem funes regulatrias sobre outros genes e tambm enzimas e fatores envolvidos na replicao do genoma. A replicao do genoma dos poliomavrus e papilomavrus realizada quase que exclusivamente por fatores e enzimas celulares; j os herpesvrus e adenovrus codicam vrias protenas com funes replicativas (DNA polimerase, protena de ligao no DNA, helicase e quinases de nucleotdeos). Os genes tardios so transcritos aps a replicao do genoma e codicam principalmente protenas estruturais e/ou protenas envolvidas na morfognese. Algumas protenas no-estruturais (NS), que so necessrias nos estgios iniciais do prximo ciclo
de infeco, tambm so produzidas nessa etapa e incorporadas na prognie viral (Figura 5.5).
3.5.1.2 Vrus da classe Ib

Os poxvrus e asfarvrus realizam o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma. Para isso, trazem, nos vrions, as enzimas e fatores necessrios para a transcrio dos seus genes e processamento dos transcritos. O genoma desses vrus codica vrios produtos que atuam no metabolismo de nucleotdeos e na replicao do genoma (DNA polimerase, helicase, protena de ligao no DNA e quinase de timidina), que, portanto, realizada predominantemente por enzimas e fatores virais. A expresso gnica ocorre em trs etapas principais: inicial, intermediria e tardia. Os genes iniciais so os primeiros a ser expressos, e os seus produtos possuem funes diversas, incluindo a concluso do desnudamento, a replicao do genoma e ativao da transcrio dos genes intermedirios. As protenas intermedirias atuam principalmente na ativao da transcrio dos genes tardios, cujos produtos so predominantemente protenas estruturais e/ou que participam da morfognese da prognie viral (Figura 5.6). Esses vrus codicam vrios produ-
Genoma DNA (encapsidado)
DNA livre
4 Replicao 5
DNA prognie
Transcrio inicial
Transcrio 7
Transcrio
Morfognese
mRNA iniciais
mRNA intermedirios
mRNA tardios
Vrions
Egresso
Traduo
6 Traduo
Traduo 9 Morfognese
Protenas iniciais (NS)
Protenas intermedirias
Protenas tardias
Figura 5.6. Ciclo replicativo dos vrus da classe Ib (Poxviridae e Asfarviridae). Os genes iniciais so transcritos pela RNA polimerase viral ainda com o DNA parcialmente encapsidado, resultando nos mRNAs (1) que so traduzidos nas protenas iniciais (2). Essas protenas participam do desnudamento completo do genoma (3), na sua replicao (4) e na transcrio (5) dos genes que codificam as protenas intermedirias (6). Estas protenas esto envolvidas na transcrio dos genes tardios (7), que codificam principalmente protenas estruturais (8). Estas protenas participam da morfognese dos vrions, juntamente com o DNA recm-replicado (9).
Replicao viral
125
tos que interferem com a resposta do hospedeiro infeco, dicultando o reconhecimento das clulas infectadas pelo sistema imunolgico do hospedeiro.
Os parvovrus encapsidam predominantemente cpias de DNA de sentido negativo (aquelas que sero transcritas), mas algumas espcies podem encapsidar tambm cpias positivas e, ocasionalmente, uma mistura das duas (Figura 5.7).
3.5.1.3 Vrus da classe II 3.5.1.4 Vrus da classe VII

A replicao do genoma dos parvovrus e circovrus realizada predominantemente por enzimas e fatores da clula hospedeira. A primeira etapa da replicao a sntese da cadeia complementar de DNA. O DNA de ta dupla (linear nos parvovrus, circular nos circovrus) , ento, transcrito pela RNA polII celular, originando os mRNAs para a sntese de protenas virais. A replicao dos parvovrus est intimamente associada com a fase S do ciclo celular, demonstrando a dependncia de fatores celulares presentes nesta fase. O genoma dos parvovrus replicado de forma contnua, a partir de uma 3-OH localizada na extremidade do hairpin, formado pelo pareamento das regies complementares terminais. A sntese da nova cadeia seguida pelo deslocamento da cadeia original, originando concatmeros, que sero posteriormente clivados para originar os monmeros de extenso genmica. A replicao do genoma dos hepadnavrus envolve uma etapa de transcrio reversa e ocorre parte no ncleo e parte no citoplasma. No ncleo, o genoma de cadeia dupla parcial convertido em um crculo covalentemente fechado (ccc) por fatores celulares e virais e, subseqentemente, transcrito pela RNApolII celular. Alm dos mRNA para a produo das protenas virais, a transcrio produz RNAs com a extenso do genoma (pgRNA). Esses pgRNAs serviro de molde para a transcrio reversa, que realizada pela polimerase viral, e ocorre no interior de capsdeos pr-formados no citoplasma. A sntese da cadeia complementar de DNA inicia em seguida, mas interrompida por ocasio do egresso dos vrions. Com isso, as partculas vricas contm uma molcula de DNA de ta parcialmente dupla (Figura 5.8).
1 Genoma DNA (cadeia simples) DNA fita dupla DNA ss (-)
Transcrio 4
Morfognese 5
mRNA
DNA ss (+)
Vrions
Egresso
Traduo Morfognese 5
Protenas estruturais e No-estruturais (NS)
Figura 5.7. Ciclo replicativo dos vrus da classe II (Parvoviridae e Circoviridae). O genoma DNA de cadeia simples , inicialmente, convertido em DNA de cadeia dupla por polimerases e fatores auxiliares da clula hospedeira (1). Apenas uma das cadeias (DNA de sentido negativo) transcrita pela RNA polimerase II celular, originando os mRNAs (2), que so processados e exportados para o citoplasma, onde so traduzidos (3). A replicao do genoma depende da interao entre fatores celulares e virais e resulta na sntese de cpias de DNA de cadeia simples de sentido positivo (4) e negativo (5). As molculas de DNA recm-replicadas so ento includas nos vrions, atravs de interaes especficas com as protenas do capsdeo (6).
126
Captulo 5
Genoma DNA (Parcialmente ds) 1 A cadeia dupla completada Egresso 7
2 DNAccc Transcrio parcial mRNA
3
Traduo
Protenas estruturais e polimerase
8 Vrions DNApds
Sntese da cadeia complementar
4 Transcrio completa
PgRNA
5 Transcrio reversa
CDNA
Figura 5.8. Ciclo replicativo dos vrus da classe VII (Hepadnaviridae). O DNA genmico , inicialmente, convertido em uma molcula circular de cadeia dupla completa ccc (1). Essa molcula transcrita pela RNA pol II celular, originando inicialmente mRNAs (2), que so processados e exportados para o citoplasma, onde sero traduzidos em protenas estruturais e no-estruturais (3). RNAs com a extenso integral do genoma (pgRNA) so, ento, produzidos (4) e exportados para o citoplasma. A polimerase viral recm-produzida realiza a transcrio reversa do pgRNAs, resultando em cDNA (5), que convertido em DNA de cadeia dupla (6). Capsdeos contendo o DNA de cadeia parcialmente dupla podem voltar ao ncleo e reiniciar o ciclo (7) ou participar da morfognese das partculas vricas (8).
3.5.2 Replicao dos vrus RNA

A replicao dos vrus RNA enfrenta algumas diculdades adicionais, impostas por peculiaridades dos processos biossintticos das clulas hospedeiras. A replicao do genoma desses vrus envolve a sntese de molculas de RNA de sentido antigenmico, que servem de molde para a subseqente sntese de RNAs de sentido genmico. Essas reaes so realizadas por polimerases especcas, que produzem molculas de RNA a partir de moldes RNA (polimerases de RNA dependentes de RNA). No entanto, as clulas eucariotas no possuem tais enzimas e, por isso, no so capazes de replicar o genoma desses vrus. Assim, para replicar o genoma, os vrus RNA devem codicar as suas prprias enzimas replicativas. As polimerases de RNA virais, cuja funo produzir cpias do genoma, so denominadas genericamente transcriptases ou replicases. Os vrus RNA de polaridade positiva solucionaram esse problema pela prpria natureza do genoma: a enzima replicase codicada pelo genoma e produzida pela traduo direta do
genoma logo no incio da infeco. Uma vez produzida, essa enzima se encarrega de replicar o genoma, produzindo cpias de RNA de sentido antigenmico, que servem de molde para a sntese de mais cpias de sentido genmico. Por isso, o genoma desses vrus dito infeccioso, ou seja, a sua introduo por mtodos articiais em clulas permissivas (transfeco) resulta na ocorrncia de todas as etapas do ciclo replicativo e na produo de prognie viral. Por outro lado, o genoma dos vrus RNA de polaridade negativa no pode ser traduzido, pois possui o sentido complementar ao mRNA. Esses vrus solucionaram esse problema de forma diferente: trazem associado ao material gentico algumas molculas da polimerase de RNA (replicase). Uma vez no interior da clula, a replicase sintetiza cpias de RNA de sentido antigenmico que servem de mRNA para a sntese das protenas virais. Esses RNAs tambm servem de molde para a sntese de mais cpias de RNA de sentido genmico. O genoma dos vrus RNA de polaridade negativa no infeccioso, ou seja, a sua introduo (desprovido de protenas) em clulas permissivas no resulta na ocorrncia das etapas
Replicao viral
127
seguintes da replicao. Em resumo, a necessidade da polimerase de RNA para replicar o genoma foi suprida, de formas diferentes, tanto pelos vrus RNA de sentido positivo como pelos vrus RNA de sentido negativo. A replicao do genoma dos vrus RNA ocorre em duas etapas. A primeira etapa envolve a sntese de um RNA de sentido antigenmico, tambm denominado replicativo intermedirio (RI). Nos vrus RNA de polaridade positiva, o RI possui polaridade negativa; nos vrus RNA de polaridade negativa, o RI possui polaridade positiva. A segunda etapa envolve a sntese de RNA de sentido genmico, utilizando o RI como molde. Em alguns vrus RNA de sentido positivo (Classe IVb), o RI tambm serve de molde para a sntese de mRNAs. Embora essas duas etapas faam parte do processo replicativo, s vezes, recebem denominaes diferentes: a sntese de RNAs de polaridade positiva denominada transcrio; a sntese da cpia negativa de RNA denominada replicao. Essas duas etapas so realizadas pelas replicases virais, pois as clulas eucariotas no possuem enzimas e funes para replicar o RNA. Alm das replicases, esses vrus codicam outras protenas no-estruturais (NS) com funes diversas e que auxiliam, de algum modo, na replicao do genoma. Atividades de helicase, protease, ligao no RNA, ATPase, ribonuclease,
4 RNA anti-genmico (-) Replicao 3
entre outras, j foram identicadas entre as protenas NS dos vrus RNA. Como os vrus RNA independem da maquinaria nuclear para a sntese e modicao de cidos nuclicos, o seu ciclo replicativo pode ocorrer inteiramente no citoplasma. Os ortomixovrus constituem as excees, pois dependem de segmentos dos mRNA celulares para a produo e funcionalidade de seus mRNAs e, por isso, replicam no ncleo da clula hospedeira. Os retrovrus apresentam um mecanismo de replicao que difere dos demais vrus RNA. Embora possua polaridade positiva, o RNA genmico no traduzido pelos ribossomos, e sim convertido em uma molcula de DNA de ta dupla pela enzima transcriptase reversa (RT) presente nos vrions. Essa molcula de DNA, denominada provrus, integrada ao genoma da clula hospedeira e, posteriormente, transcrita pela RNApolII. A transcrio resulta em mRNAs para a sntese de protenas estruturais e da enzima RT, e em cpias do RNA genmico, que ento includo nas novas partculas vricas. As etapas do ciclo replicativo dos diferentes grupos de vrus RNA esto ilustradas esquematicamente nas Figuras 5.9 a 5.13 (a forma de apresentao das etapas de replicao foi adaptada de ROIZMAN E PALESE, 1996).
Genoma RNA (+)
7 1,6 Traduo
Morfognese
Poliprotena
Vrions
Egresso
Clivagem 7 Morfognese
Protenas no-estruturais Protenas estruturais
Figura 5.9. Ciclo replicativo dos vrus da classe IVa (Picornaviridae e Flaviviridae). A ORF nica do genoma traduzida em toda a sua extenso logo aps o desnudamento, resultando da produo de uma longa poliprotena (1). medida que vai sendo produzida, essa poliprotena vai sendo clivada por proteases celulares e/ou virais dando origem s protenas individuais, entre as quais a RNA polimerase viral (2). A RNA polimerase responsvel pela replicao do genoma, que ocorre via produo de um intermedirio RNA de sentido negativo (3, 4). As novas cpias de RNA de sentido positivo so, ento, utilizadas em novos ciclos de traduo (6), replicao (3,4) e/ou participam da morfognese da prognie viral (7).
128
Captulo 5
3.5.2.1 Vrus da classe IVa

O genoma desses vrus contm uma ORF nica e longa, anqueada por duas regies no traduzidas (5UTR; 3UTR). Os genes das protenas estruturais ocupam o tero 5 do genoma; o restante da ORF contm os genes das protenas no-estruturais (NS). Essa ORF traduzida em toda a sua extenso logo aps o desnudamento, originando uma poliprotena longa, que clivada em protenas individuais medida que vai sendo produzida (Figura 5.9). As protenas NS recm-produzidas incluindo a replicase viral realizam a replicao do genoma, que envolve a sntese de um RNA de sentido antigenmico (de polaridade negativa); que serve, ento, de molde para a sntese de cpias de RNA de sentido genmico. As regies 5UTR e 3UTR do genoma contm seqncias importantes para a transcrio e replicao. O genoma dos vrus do gnero Flavivirus possui a estrutura cap na extremidade 3; os demais membros da famlia Flaviviridae e os picornavrus possuem estruturas secundrias (internal ribosomal entry site, IRES) na regio 5UTR, que so reconhecidas pelos ribossomos para o incio da traduo.
3.5.2.2 Vrus da classe IVb

O genoma desses vrus constitudo por uma molcula de RNA de polaridade positiva,
6 Genoma RNA (+) Replicao 3 Traduo parcial 1 4
mas a organizao genmica e a estratgia de expresso gnica diferem do grupo anterior. Os genes que codicam as protenas NS ocupam os dois teros iniciais do genoma; o tero restante contm os genes das protenas estruturais. No incio da infeco, o RNA genmico traduzido parcialmente, resultando na produo de uma poliprotena que abrange a regio das protenas NS. A clivagem dessa poliprotena resulta nas protenas NS, incluindo a replicase viral. Utilizando o RNA genmico como molde, a replicase sintetiza uma cpia de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa) com a extenso completa do genoma. Esse RNA antigenmico serve de molde para a sntese de vrios mRNAs de extenses variveis (denominados mRNAs subgenmicos), que sero traduzidos nas protenas estruturais. O RNA antigenmico tambm serve de molde para a transcrio completa e produo de RNAs de sentido e extenso genmica. Resumindo, embora o genoma desses vrus possua polaridade positiva, apenas a regio da ORF, que corresponde s protenas NS, traduzida pelos ribossomos. As protenas estruturais so produzidas pela traduo de mRNAs subgenmicos, que, por sua vez, so produzidos pela transcrio do RNA antigenmico. Uma caracterstica marcante dessas famlias e que difere do grupo anterior a produo de mRNAs subgenmicos (Figura 5.10).
6 Replicao 7 Morfognese
RNA anti-genmico (-)
Genoma RNA (+)
Transcrio
Poliprotena regio 5 Clivagem
mRNA subgenmicos
Vrions
Egresso
Traduo 7 Morfognese
Protenas no-estruturais
Protenas estruturais
Figura 5.10. Ciclo replicativo dos vrus da classe IVb (Coronaviridae, Togaviridae, Arteriviridae, Caliciviridae e Astroviridae). O RNA genmico de sentido positivo traduzido parcialmente, resultando em uma poliprotena (1) que clivada em protenas no-estruturais, incluindo a replicase (2). A replicase recm-produzida replica o genoma em toda a sua extenso, produzindo uma molcula de RNA de sentido antigenmico (3). O RNA anti-genmico serve de molde para a transcrio e produo de vrios RNAm subgenmicos de extenses variveis (4), cuja traduo resulta nas protenas estruturais (5). Posteriormente tambm so produzidas cpias inteiras do genoma RNA de sentido positivo (6), que serviro de molde para ciclos adicionais de replicao (3) e sero oportunamente encapsidadas (7).
Replicao viral
129
3.5.2.3 Vrus da classe V

Esses vrus possuem um genoma RNA de sentido negativo, no-segmentado (paramixovrus, rabdovrus e lovrus) ou segmentado (ortomixovrus, buniavrus e arenavrus) e trazem a replicase viral nos vrions. Nos vrus com o genoma no-segmentado, os genes so transcritos individualmente, originando mRNAs que so traduzidos nas protenas estruturais e NS (Figura 5.11). Nos vrus com o genoma segmentado, cada segmento contm um (ou dois) gene(s), que tambm so transcritos individualmente. Nas etapas iniciais da infeco, a transcrio direcionada para a sntese de mRNAs para a produo de protenas virais. Em fases tardias do ciclo, o modo de transcrio deve ser alterado, de modo a produzir os RNAs intermedirios de replicao (RI) de sentido antigenmico. Nos vrus com o genoma no-segmentado, esses RI possuem a extenso inteira do genoma e servem de molde para a sntese de molculas de RNA de sentido genmico. Dois tipos de RNAs de sentido positivo so, ento, produzidos: os mRNA com a extenso dos genes individuais (para a traduo); e o RNA RI, com a extenso inteira do genoma (para a replicao).
4 RNA antigenmico (-) Replicao 3 1, 5
Nos vrus com o genoma segmentado, a transcrio dos segmentos genmicos de RNA tambm resulta em dois tipos de RNAs, com funes diferentes (mRNAs para a traduo; RI RNAs para a replicao). Os mRNAs e RIs, derivados de cada segmento, no entanto, possuem tamanhos aproximados. Os mRNAs possuem alguns nucleotdeos a mais e a estrutura cap na extremidade 5 e uma cauda poliA na extremidade 3. Os RNAs RI, sem cap ou poliA so produzidos tardiamente na infeco e servem exclusivamente de molde para a replicao e produo de segmentos de RNA genmicos. Todas as etapas de transcrio e replicao desses vrus ocorrem com o genoma intimamente associado com protenas, principalmente a nucleoprotena (NP), formando o complexo ribonucleoprotena (RNP). Os arenavrus e os vrus do gnero Phlebovirus (Bunyaviridae) apresentam uma estratgia peculiar de expresso de alguns de seus genes. Os RNA genmicos possuem polaridade negativa e a maioria dos genes expressa pela estratgia descrita acima. No entanto, um dos segmentos genmicos contm seqncias codicantes de protena tanto no sentido do genoma (sentido negativo) como no sentido antigenmico. Essa es-
Genoma RNA (-)
Transcrio
Morfognese
mRNA 2 Traduo
Vrions
Egresso
6 Protenas estruturais No-estruturais + NP
Morfognese
Figura 5.11. Ciclo replicativo dos vrus da classe V (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridade, Orthomyxoviridae e Bunyaviridade). Os genes individuais so transcritos pela RNA polimerase presente nos vrions, produzindo mRNAs correspondentes a cada gene (1). A traduo desses mRNA resulta em protenas estruturais e NS (2). As protenas NS, incluindo a replicase, participam da replicao do genoma. A replicao ocorre via sntese de RNAs de sentido antigenmico (3), que servem de molde para a sntese de RNAs de sentido genmico (4). As molculas de RNA de sentido genmico servem de molde para novos ciclos de transcrio (5), replicao (3, 4) e sero posteriormente encapsidadas (6).
130
Captulo 5
tratgia denominada ambissense e nica dessas famlias.
3.5.2.4 Vrus da classe III

O genoma desses vrus composto por 10 a 12 segmentos (reovrus) ou dois segmentos (birnavrus de animais) de RNA de ta dupla. Nos reovrus, a maioria dos segmentos codica apenas uma protena; poucos segmentos contm dois genes. Logo aps a penetrao e ainda em capsdeos semi-ntegros, a polimerase viral presente nos vrions realiza a transcrio primria de cada segmento. Os mRNA resultantes possuem duas funes: so traduzidos em protenas e, j associados com as protenas estruturais recmproduzidas, servem de molde para a replicao (sntese de RNAs de sentido negativo). Dentro de capsdeos pr-formados, os segmentos de RNA de polaridade negativa recm-produzidos so transcritos (transcrio secundria). Os transcritos resultantes so utilizados predominantemente para a produo de protenas nas fases tardias do ciclo. Os eventos que ocorrem nas fases nais do ciclo no esto esclarecidos, mas parecem envolver a associao das protenas externas do capsReplicao 4
deo com os complexos pr-formados entre o genoma e outras protenas estruturais. A liberao dos vrions maduros ocorre de forma ineciente aps a lise celular. As molculas de RNA genmico possuem funes distintas: as molculas de RNA de polaridade negativa servem apenas de molde para a transcrio. A funo aparente das molculas genmicas de RNA positivo apenas parear com as cadeias negativas. J as molculas de RNAs de sentido positivo, produzidas durante a infeco, possuem duas funes: podem ser traduzidas em protenas (mRNAs) e/ou servem de molde para a sntese das cadeias negativas (Figura 5.12).
3.5.2.5 Vrus da classe VI

A replicao do genoma dos retrovrus inclui etapas que ocorrem no citoplasma (logo aps a penetrao do nucleocapsdeo na clula hospedeira) e no ncleo (aps a integrao do material gentico viral no genoma da clula). O genoma desses vrus composto por duas molculas idnticas de RNA de sentido positivo que, no entanto, no so traduzidas pelos ribossomos. No inico da infeco, a molcula de RNA genmico con-
Pr-capsdeos + mRNA
Genoma RNA (cadeia dupla)
1,6
Transcrio primria e secundria
Morfognese
3 mRNA Vrions
Egresso
Morfognese inicial
Traduo 6 Morfognese
Protena no-estruturais Protenas estruturais
Figura 5.12. Ciclo replicativo dos vrus da classe III (Reoviridae e Birnaviridae). A replicase viral trazida nos vrions realiza a transcrio primria, produzindo mRNAs (1), que so traduzidos em protenas estruturais e no-estruturais (2). Esses mRNAs formam complexos com as protenas estruturais recm-produzidas (3) e, no interior desses complexos, servem de molde para a sntese de RNAs de sentido negativo, com a participao das protenas NS (4). As molculas de RNA de cadeia dupla, resultantes da replicao (4), servem de molde para a transcrio secundria (5) e para etapas adicionais de replicao (4). Essas molculas, j conjugadas com algumas protenas estruturais, eventualmente participam da morfognese pela associao com as demais protenas do capsdeo (6).
Replicao viral
131
vertida em uma molcula de cDNA pela enzima viral transcriptase reversa (RT, DNA polimerase dependente de RNA), que, em seguida, convertida em uma molcula de DNA de ta dupla. Essa molcula, denominada provrus, ingressa no ncleo e integrada no genoma da clula hospedeira, pela atividade integrase da polimerase viral. A integrao do provrus no genoma celular assegura a perpetuao das informaes genticas do vrus no hospedeiro, e absolutamente necessria para a continuao do ciclo replicativo. A prxima etapa a transcrio dos genes virais pela RNApolII e fatores de transcrio celulares. A transcrio parcial do genoma produz mRNAs que sero processados por splicing e sero traduzidos nas glicoprotenas do envelope. A transcrio completa do genoma origina mRNAs com duas nalidades: servirem de molde para a traduo em protenas (RT, protena da matriz, do capsdeo) ou constiturem o RNA genmico para a morfognese da prognie viral. Considerandose que a transcrio do provrus que produz o RNA genmico realizada pela maquinaria celular de transcrio, sem a participao de nenhum
fator viral, o genoma dos retrovrus o nico genoma viral a ser sintetizado exclusivamente por enzimas e fatores celulares (Figura 5.13).
3.6 Morfognese, maturao e egresso

Os vrus das diversas famlias apresentam uma ampla diversidade estrutural, que vai desde partculas formadas pelo genoma e uma camada simples de protenas at vrions altamente complexos. No entanto, independente da sua complexidade estrutural, uma srie de interaes entre os seus constituintes so necessrias para a montagem das partculas vricas e a concluso do processo de replicao. Essas interaes incluem: a) formao das unidades estruturais do capsdeo pela interao entre as respectivas protenas; b) incorporao do genoma ao capsdeo pr-formado ou em formao; e c) liberao da prognie viral da clula infectada. No caso dos vrus envelopados, a formao no nucleocapsdeo seguida pela aquisio do envelope a partir de membranas celulares, nas quais as protenas virais foram previamente inseridas.
ssDNA
Transcrio reversa 1 Genoma RNA (+)
Sntese da cpia complementar 7
Morfognese
dsDNA (provrus) 3 Integrao
Traduo 5
Pol+In Protenas do capsdeo
Vrions
Egresso
Morfognese
Provrus DNA Integrado
Transcrio RNAs de extenso genmica 4
Splicing +Traduo 6
Glicoprotenas do envelope
Figura 5.13. Ciclo replicativo dos vrus da classe V (Retroviridae). Logo aps o desnudamento, a enzima viral transcriptase reversa (RT) sintetiza uma molcula de DNA complementar ao RNA genmico (1) que, em seguida, convertida em DNA de cadeia dupla (dsDNA), tambm pela ao da RT (2). Esta molcula de dsDNA, denominada provrus, penetra no ncleo e integrada no genoma da clula hospedeira pela atividade viral integrase (3). Os genes presentes no provrus so, ento, transcritos pela RNA polII celular, originando mRNAs de extenso subgenmica (4) para a traduo nas protenas do envelope (5). A transcrio do provrus em toda a sua extenso resulta em mRNAs de extenso genmica (6), que podem ser traduzidos nas outras protenas estruturais e polimerase viral (7) ou participam da morfognese das partculas virais (8).
132
Captulo 5
Diferentemente de clulas eucariotas e procariotas, que se multiplicam por sso binria, os vrions so formados pela associao de componentes pr-formados (genoma + protenas). O processo de montagem das partculas vricas, que ocorre ao nal do ciclo replicativo, denominado genericamente de morfognese ou reunio. A aquisio da capacidade infectiva pelas partculas vricas recm-formadas que ocorre prvia ou concomitantemente com o seu egresso da clula denomina-se maturao. Como, para muitos vrus, esses processos ocorrem simultaneamente, sero aqui abordados conjuntamente. As diferentes etapas da formao da partcula vrica no ocorrem ao acaso. As associaes entre os componentes so direcionadas e favorecidas por interaes qumicas especcas entre as unidades proticas estruturais e entre estas e o cido nuclico. Dependendo da estrutura e complexidade da partcula vrica, da estratgia e local de replicao, os vrus desenvolvem diferentes estratgias de morfognese e maturao/egresso de sua prognie.
fognese das partculas (e a conseqente maturao) integralmente no citoplasma (vrus RNA) ou no ncleo (vrus DNA). Dessa forma, a prognie viral infecciosa pode ser encontrada nesses compartimentos, mesmo com a clula ainda ntegra, ou seja, a maturao ocorre previamente ao egresso. Esses vrus geralmente so liberados quando ocorre a destruio das clulas infectadas (Figura 5.14). Os vrus no-envelopados das famlias Polyomaviridae, Papillomaviridae, Adenoviridae e Picornaviridae e tambm os membros da Poxviridae e Asfarviridae (com envelope), enquadram-se nessa categoria.
3.6.2 Maturao por brotamento em membranas celulares

No ciclo replicativo dos vrus envelopados, as glicoprotenas do envelope recm-sintetizadas so inseridas em membranas celulares, isto , na membrana do retculo endoplasmtico rugoso (RER), no aparelho de Golgi ou na membrana plasmtica. Os nucleocapsdeos recm-formados interagem com a protena da matriz e/ou com extremidades citoplasmticas dessas glicoprotenas e inserem-se (ou projetam-se) atravs da membrana, incorporando o envoltrio. Esse envoltrio (envelope) composto pela membrana lipdica dupla, contendo as glicoprotenas virais
3.6.1 Maturao intracelular

(citoplasmtica ou nuclear)
Alguns vrus (principalmente os desprovidos de envelope) completam o processo de mor-
Meio extracelular
Membrana plasmtica
2 Citoplasma
Figura 5.14. Maturao intracelular e egresso dos vrus sem envelope. Os componentes do capsdeo interagem entre si e com o genoma (1), resultando na formao de partculas vricas infecciosas (2), que so liberadas por lise celular (3).
Replicao viral
133
inseridas. O processo de aquisio do envelope denominado brotamento, pois o nucleocapsdeo literalmente brota para o interior do RER (Figura 5.15), do Golgi ou para o exterior da clula (Figura 5.16). Os vrus que realizam brotamento em membranas celulares, como forma de adquirir o
envelope e completar a sua morfognese/maturao, podem ser liberados por exocitose sem induzir necessariamente lise da clula. Os vrus RNA de sentido negativo, alguns vrus RNA de sentido positivo (togavrus) e os retrovrus completam a morfognese e a maturao
Meio extracelular
Membrana plasmtica
Citoplasma
Figura 5.15. Maturao intracitoplasmtica de vrus envelopados por brotamento em membranas celulares internas. Interao dos nucleocapsdeos com as caudas das glicoprotenas do envelope (1), brotamento e transporte no interior de vesculas (2), liberao por exocitose (3).
Meio extracelular
4
Membrana plasmtica
2 1 Citoplasma
Figura 5.16. Brotamento e maturao de vrus envelopados na membrana plasmtica. Interao do nucleocapsdeo com a protena matriz e/ou caudas citoplasmticas das glicoprotenas do envelope (1), brotamento atravs da membrana plasmtica e aquisio do envelope (2, 3), egresso de partculas infecciosas (4).
134
Captulo 5
somente no momento da liberao dos vrions na superfcie da clula. Nesses casos, no possvel detectar prognie viral infecciosa no interior das clulas. Os vrions de outras famlias (Flaviviridae, Coronaviridae, Arteriviridae, Bunyaviridae, Poxviridae) realizam o brotamento no RER e/ou no aparelho de Golgi. Vrions infecciosos podem ser encontrados em vesculas citoplasmticas derivadas desses compartimentos, nas quais so transportados at a membrana plasmtica, onde so liberados por exocitose. Os herpesvrus apresentam uma estratgia particular de morfognese, maturao e egresso. A replicao do genoma e a montagem dos nucleocapsdeos ocorrem no ncleo, para onde as protenas estruturais so importadas aps a sua sntese no citoplasma. Os nucleocapsdeos podem adquirir o envelope pelo brotamento na membrana nuclear interna vrions completos envelopados podem ser observados no espao entre as membranas nucleares . Esses nucleocapsdeos podem perder o envelope ao sair desse compartimento e readquir o envelope pelo brotamento na membrana do RER. Nesses casos, so transportados em vesculas e liberados ao exterior por exocitose. Outros nucleocapsdeos podem ser transportados atravs do citoplasma at a membrana plasmtica, onde adquirem o envelope por brotamento. Ao contrrio de alguns vrus envelopados, que no so lticos, a replicao dos herpesvrus inevitavelmente leva lise e destruio celular. Os efeitos da replicao viral na clula hospedeira so muito variveis e vo desde infeces que no provocam alteraes detectveis at a morte e lise celular. As conseqncias da replicao viral em nvel celular possuem importncia na patogenia das doenas vricas. Esses temas sero abordados no Captulo 8.
BROWN, P. O. 1997. Integration. In: COFFIN, J. M.; HUGHES, S. H.; VARMUS, H. E. (eds). Retroviruses. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, p.161-204. CANN, A.J. Principles of Molecular Virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1997. 310p. CARRASCO, L. Entry of animal viruses and macromolecules into cells. FEBS Letters, v.350, p.151-154, 1994. FLINT, S.J. et al. Principles of Virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. HAY, R.T. et al. Molecular interactions during adenovirus DNA replication. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.199, p.31-48, 1995. HISCOX, J.A. et al. The coronavirus infections bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus. Journal of Virology, v.75, p.506-512, 2001. HISCOX, J.A. The interaction of animal cytoplasmic RNA viruses with the nucleus to facilitate replication. Virus Research, v.95, p.13-22, 2003. HUNTER, E. Virus assembly. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.8, p.171-197. JOKLIK, W.K. The viral multiplication cycle. In: JOKLIK, W.K.; WILLETT, H.P.; AMOS, D.B. (Eds). Zinssers microbiology. 20.ed. Norwalk, CT: Appleton & Lange, 1992. p.789-835. KLASSE, P.J.; BRON, R.; MARSH, M. Mechanisms of enveloped virus entry into animal cells. Advanced Drug Delivery Reviews, v.34, p.65-91, 1998. KLUMPP, K.; RUIGROK, R.W.; BAUDIN, F. Roles of the inuenza virus polymerase and nucleoprotein in forming a functional RNP structure. The EMBO Journal, v.16, p.1248-1257, 1997. MARSH, M.; BOLZAU, E.; HELENIUS, A. Penetration of semliki forest virus from acidic prelysosomal vacuoles. Cell, v.32, p.931940, 1983. MARSH, M.; HELENIUS, A. Virus entry into animal cells. Advances in Virus Research, v.36, p.107-151, 1989. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. PELKMANS, L.; HELENIUS. A. Insider information: what viruses tell us about endocytosis? Current Opinion in Cell Biology, v.15, p.414-422, 2003. PENNINGTON, T.H. The replication of viruses. In: MAHY, B.W.J.; COLLIER, L.H. (Eds.). Topley and Wilsons microbiology and microbial infections. 9.ed. London: Edward Arnold, 1998. v.1. p.23-32.
BEAUD, G. Vaccinia virus DNA replication: a short review. Biochimie, v.77, p.774-779, 1995. BOEHMER, P. E.; LEHMAN, I.R. Herpes simplex virus DNA replication. Annual Review of Biochemistry, v.66, p.347-384, 1997.
Replicao viral
135
SODEIK, B. Mechanisms of viral transport in the cytoplasm. Trends in Microbiology, v.8, p.465-472, 2000. TAVIS, J.E. The replication strategy of the hepadnaviruses. Viral Hepatitis Review, v.2, p.205-218, 1996. WHITE, D.O.; FENNER, F. Medical Virology. 4.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1994. 610p. WHITTAKER, G.R.; KANN, M.; HELENIUS, A. Viral entry into the nucleus. Annual Review of Cell and Developmental Biology, v.16:627-651, 2000. WIMMER, E. Cellular Receptors for Animal Viruses. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. 526p.
PEREZ, L.; CARRASCO, L. Entry of poliovirus into cells does not require a low-pH step. Journal of Virology, v.67, p.4543-4548, 1993. PLOUBIDOU, A.; WAY, M. Viral transport and the cytoskeleton. Current Opinion in Cell Biology, v.13, P.97-105, 2001. ROIZMAN, B.; PALESE, P. Multiplication of Viruses: an overview. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.4, p.101-111. SIECZKARSKI, S.B.; WHITTAKER, G.R. Dissecting virus entry via endocytosis. The Journal of General Virology, v.83, p.15351545, 2002. SMITH, A.E.; HELENIUS, A. How viruses enter animal cells. Science, v.304, p.237-242, 2004.
REPLICAO DOS VRUS DNA

Gustavo Delhon1
6
139 140
140 142 142 144 145 146 146
1 Introduo 2 Poliomavrus
2.1 O ciclo replicativo 2.2 O genoma dos PoVs 2.3 Expresso dos genes iniciais 2.4 Replicao do DNA 2.5 Expresso dos genes tardios 2.6 Morfognese e egresso 2.7 Concluses
3 Papilomavrus
3.1 O ciclo replicativo 3.2 O genoma dos PpVs 3.3 Expresso dos genes iniciais 3.4 Replicao do DNA e interferncia com o ciclo celular 3.5 Expresso dos genes tardios 3.6 Concluses
147
147 147 148 148 150 151
4 Adenovrus
4.1 O ciclo replicativo 4.2 O genoma dos AdVs 4.3.Expresso dos genes iniciais 4.4 Replicao do DNA viral 4.5 Expresso dos genes tardios 4.6 Concluses
151
151 151 153 154 154 156
5 Herpesvrus
5.1 O ciclo replicativo 5.2 O genoma dos HVs 5.3 Os genes virais 5.4 Expresso gnica 5.5 Replicao do DNA viral 5.6 Expresso gnica durante a infeco latente
1
156
156 156 157 158 159 160
Traduzido por Fernanda S.F.Vogel.
5.7 Concluses
160
6 Poxvrus
6.1 O ciclo replicativo 6.2 O genoma dos PoxVs 6.3 Expresso gnica 6.4 Replicao do DNA 6.5 Concluses
160
160 160 161 162 163
163
1 Introduo
A replicao dos vrus DNA realizada pela ao orquestrada da maquinaria da clula hospedeira, associada com fatores codicados pelo vrus. A contribuio relativa dos fatores virais na replicao desses vrus, no entanto, varia muito entre as diferentes famlias. Em geral, os vrus DNA pequenos (parvovrus e poliomavrus) utilizam extensivamente a maquinaria celular, ou seja, os seus genomas codicam poucos produtos associados com funes replicativas. Por outro lado, os vrus DNA grandes (herpesvrus e poxvrus) codicam muitas enzimas e fatores envolvidos na replicao. Esses ltimos seriam, teoricamente, menos dependentes da maquinaria celular para a replicao de seus genomas e a conseqente produo da prognie viral. Dessa forma, qual seria a estratgia mais eciente para a manuteno desses vrus na natureza? Na verdade, ambas, pois tanto os vrus DNA pequenos como os grandes tm conseguido se perpetuar, sugerindo que uma perfeita adaptao a um nicho tecidual mais importante do que a complexidade do genoma e a estratgia de replicao.
Os mecanismos de replicao do genoma tambm variam entre os vrus DNA, de acordo com a estrutura e topologia do genoma e tambm com a participao relativa de fatores celulares e/ou virais (Figura 6.1). O genoma circular de cadeia dupla dos poliomavrus (e provavelmente dos papilomavrus), por exemplo, replicado de forma bidirecional e semidescontnua, a partir de uma origem nica. O complexo replicativo utiliza um primer de RNA para iniciar a sntese, e o mecanismo de replicao semelhante ao utilizado pelas clulas eucariotas para replicar o DNA cromossmico. O genoma linear de ta dupla dos adenovrus possui uma origem em cada extremidade. A replicao ocorre em duas etapas, e cada cadeia parental replicada em uma dessas etapas. O complexo replicativo utiliza uma oxidrila (OH) ligada a uma protena viral (pTP), que est ligada em cada extremidade do genoma como iniciador da sntese de DNA (protein priming). A replicao dos genomas dos herpesvrus e poxvrus mais complexa. O genoma dos herpesvrus possui trs origens e parece ser replicado por um mecanismo de crculo rolante, no qual multmeros lineares so produzidos e, posteriormente, clivados
Ou
Poliomavrus Papilomavrus
Adenovrus
Parvovrus
Herpesvrus
Poxvrus
Fonte: adaptada de Dulbecco e Ginsberg (1980).
Figura 6.1. Ilustrao da replicao do genoma dos principais vrus DNA. Os estgios intermedirios foram propostos a partir de estudos fsico-qumicos e, microscopia eletrnica, realizados a diferentes intervalos aps a infeco.
140
Captulo 6
em unidades genmicas. A replicao do genoma DNA linear de ta dupla dos poxvrus parece se iniciar com a clivagem de uma das cadeias prxima a ala terminal do genoma, seguida de elongao a partir da extremidade 3, gerada pela clivagem. A replicao do genoma DNA linear de ta simples dos parvovrus no abordada neste captulo inicia-se com a elongao da extremidade 3 livre, que se encontra exionada, e prossegue continuamente. Uma ilustrao esquemtica da replicao do genoma de diferentes vrus DNA est apresentada na Figura 6.1. O objetivo fundamental da replicao viral produzir prognie viral vivel e abundante, que assegure a propagao do vrus e a conseqente transmisso a novos hospedeiros. A produo de prognie depende da sntese de milhares de cpias do genoma viral e das protenas componentes do vrion, associado com a montagem correta e liberao eciente das partculas vricas. Esse processo envolve uma srie de etapas reguladas temporal e espacialmente, que incluem a expresso de genes virais e a induo e/ou represso de alguns genes do hospedeiro. Muitas vezes, a replicao viral est associada com alterao da siologia celular, o que pode determinar diferentes graus de patologia e at a morte da clula hospedeira. Embora a grande maioria dos vrus DNA replique no ncleo, alguns deles desenvolveram estratgias especiais que permitem a sua replicao no citoplasma da clula hospedeira. No decorrer deste captulo, sero abordados os aspectos replicativos das principais famlias de vrus DNA e a estratgia de replicao dos prottipos de cada famlia, enfatizando-se os aspectos moleculares e biolgicos da expresso gnica, a interferncia com funes celulares, para assegurar a replicao (entre elas a induo do ciclo celular), e a replicao do genoma propriamente dita. A replicao dos circovrus e parvovrus ser abordada nos Captulos 13 e 14, respectivamente. A replicao dos hepadnavrus ser tratada, resumidamente, no captulo destinado s famlias de interesse limitado em medicina veterinria. Inicialmente, ser descrita a replicao dos vrus da famlia Polyomaviridae, vrus relativamente simples, cuja estratgia de replicao tem
sido amplamente estudada. De fato, a replicao dos vrus DNA grandes pode ser considerada como uma evoluo progressiva de complexidade quando comparada com os esquemas relativamente simples de replicao dos poliomavrus. A seguir, sero apresentados os principais aspectos da expresso gnica, replicao do genoma e interao com funes celulares dos papilomavrus, adenovrus, herpesvrus e poxvrus, respectivamente.
2 Poliomavrus
A famlia Polyomaviridae contm um nico gnero, Polyomavirus, que inclui o prottipo da famlia, o vrus smio 40 (SV-40), e os vrus JC e BK, que tm sido, esporadicamente, associados com tumores em humanos. Os poliomavrus (PoVs) so vrus DNA pequenos, sem envelope, de simetria icosadrica, que infectam um amplo espectro de hospedeiros desde pssaros at humanos . As infeces pelos PoVs so geralmente subclnicas. No entanto, a infeco de clulas que no suportam uma replicao produtiva freqentemente resulta em transformao neoplsica. Por isso, os PoVs so tambm conhecidos como os pequenos vrus DNA tumorais. Apesar de sua pequena importncia clnica, os PoVs foram alvo de intensivos estudos biolgicos e moleculares, principalmente devido s suas propriedades tumorignicas. As pesquisas com os PoVs elucidaram importantes aspectos da biologia celular. Dentre as maiores descobertas resultantes do estudo dos poliomavrus destacam-se: a) estrutura do DNA superenrolado, b) estrutura e funo da origem da replicao do DNA, c) estrutura e funo dos promotores, d) descoberta dos enhancers e o seu papel na expresso gnica, e) descoberta do mecanismo de splicing alternativo dos transcritos (RNA mensageiros, mRNA) e f) replicao do DNA cromossmico.
2.1 O ciclo replicativo

O mecanismo de penetrao dos PoVs nas clulas hospedeiras ainda no est completamente esclarecido. Embora estudos recentes tenham demonstrado o envolvimento de molculas do
Replicao dos vrus DNA
141
complexo maior de histocompatibilidade do tipo I (MHC-I) como receptores para o SV-40, ainda no h evidncias conclusivas nesse sentido. Aps a ligao aos receptores, os vrions so internalizados por endocitose caveolar e transportados ao longo dos microtbulos at o retculo endoplasmtico. O mecanismo de transporte para o citoplasma e da para o ncleo no est esclarecido, porm, sabe-se que o desnudamento do genoma ocorre no interior do ncleo. Aps a sua liberao no nucleoplasma, o genoma transcrito pela RNA polimerase II celular e, subseqentemente, repli-
cado. Os mRNA virais produzidos so processados por splicing e exportados para o citoplasma, onde so traduzidos. As protenas virais recmproduzidas so transportadas de volta ao ncleo, onde participam da replicao do genoma e, posteriormente, da montagem das partculas vricas. Durante esse processo, os mRNA e as protenas virais necessitam interagir com componentes da maquinaria celular responsvel pela exportao e importao nuclear de macromolculas. A morfognese das partculas virais ocorre no ncleo. As partculas recm-formadas so transportadas
A
1 4 7
B
1 4
3 2 5
x
8 5a
Ncleo
Transformao celular
Citoplasma 9
Clula permissiva
Clula no-permissiva
Fonte: adaptado de Cole e Conzen (2001).
Figura 6.2. Ciclo replicativo dos poliomavrus em clulas permissivas (A) e no-permissivas (B). A) Aps a penetrao do vrion (1), o genoma desnudo no interior do ncleo (2), onde os genes iniciais so transcritos pela maquinaria celular de transcrio (3). Os mRNAs so traduzidos nas protenas iniciais, ou seja, os antgenos T (4). Os antgenos T ingressam no ncleo e interagem com o DNA viral e com fatores da clula hospedeira, resultando na replicao do genoma (5). Aps a replicao, os genes tardios so transcritos (6) e a traduo dos mRNAs origina as protenas estruturais (7) que ingressam no ncleo e interagem com o genoma para formar as novas partculas vricas (8). Os vrions se acumulam no ncleo, so exportados em vesculas para o citoplasma e liberados por lise celular ou por exocitose (9). Em clulas no-permissivas (B), as etapas 1 a 4 ocorrem normalmente. No entanto, o antgeno T falha em interagir com os fatores celulares, no ocorrendo a replicao do DNA viral, nem a transcrio e expresso dos genes tardios. O DNA viral persiste no ncleo da clula (5a) e os genes dos antgenos T continuam sendo expressos (3, 4), podendo levar imortalizao e transformao celular. No h replicao do genoma e nem produo de prognie viral.
142
Captulo 6
at a superfcie celular, no interior de vesculas, e liberadas por exocitose ou por lise celular, dependendo do tipo de clula. A infeco de clulas permissivas resulta na ocorrncia de todas essas etapas e na conseqente produo de prognie viral infecciosa. Por outro lado, a infeco de clulas semipermissivas (geralmente de espcies heterlogas) resulta em replicao abortiva, na qual ocorre apenas a expresso dos genes iniciais, sem a replicao do genoma ou produo das protenas tardias (protenas estruturais). A persistncia do genoma viral nessas clulas, associada com a expresso contnua dos antgenos T, pode levar imortalizao e transformao celular. As etapas do ciclo replicativo dos PoVs em clulas permissivas e no-permissivas esto representadas esquematicamente na Figura 6.2.
dos vrions, pois interage com a VP1. Os PoVs de roedores codicam uma terceira protena T, o antgeno T mdio (mT), e no codicam a protena agno. Em vez de possurem regies codicantes com seqncias regulatrias individuais, os PoVs solucionaram o problema do genoma pequeno realizando splicing alternativo em alguns transcritos, resultando, assim, na traduo em protenas diferentes parcialmente homlogas. Alm disso, o genoma apresenta uma concentrao das seqncias regulatrias para a transcrio e replicao do DNA em uma pequena regio, o que contribui para a compactao gentica (Figura 6.3).
2.3 Expresso dos genes iniciais

Aps o desnudamento do genoma no interior do ncleo, o minicromossoma do SV-40 transcrito pelos complexos de transcrio da clula hospedeira (RNA pol II e fatores de transcrio). O primeiro gene a ser transcrito o do antgeno T, e a sua transcrio contnua resulta em um acmulo gradual do mRNA especco durante as primeiras 10 a 12 horas de infeco. Como os mRNA do antgeno T so os primeiros a serem transcritos e detectados, so denominados transcritos iniciais (E = early). Os transcritos primrios do gene do antgeno T sofrem splicing alternativo para originar mRNAs, que sero traduzidos em duas protenas: o antgeno T grande (lT) e pequeno (sT). Com isso, as protenas lT e sT possuem parte de sua seqncia de aminocidos em comum; sendo que o lT possui uma regio adicional no presente no sT. A transcrio dos genes iniciais controlada por uma regio regulatria de 250 pb, localizada imediatamente na direo 5 do stio inicial de transcrio do gene do antgeno T (Figura 6.3). Essa regio regulatria apresenta pequenas seqncias de nucleotdeos, dispostas em la, ou motivos (motifs) que, juntos, constituem o promotor inicial do SV-40. Esses motivos atuam como stios de ancoragem e ligao de componentes do aparato de transcrio celular, incluindo a RNA pol II e os fatores de transcrio. Logo acima do promotor (na direo 5), existem duas cpias re-
2.2 O genoma dos PoVs

O genoma dos PoVs constitudo por uma molcula de DNA de ta dupla circular, com aproximadamente 5.000 pares de bases (bp), que, na maioria dos PoVs, est associado com protenas. O genoma desses vrus encontra-se associado com histonas celulares, formando estruturas semelhantes aos nucleossomas e assumindo uma congurao helicoidal semelhante cromatina celular. Por essas razes, os seus genomas so geralmente denominados minicromossomos virais. A replicao do genoma do SV-40 realizada basicamente por fatores e enzimas da clula hospedeira, com a participao de apenas uma protena viral, o antgeno T. Por isso, a replicao do DNA do SV-40 tem sido utilizada como modelo para se estudar a replicao bidirecional semidescontnua do DNA cromossmico celular. A organizao do genoma do SV-40 est representada na Figura 6.3. Cerca de 90% da extenso do genoma codicante, e os 10% restantes representam regies no-traduzidas que possuem funes regulatrias. O genoma do SV-40 codica seis protenas, sendo trs delas componentes da estrutura do capsdeo (VP1, VP2 e VP3) e trs protenas no-estruturais, denominadas antgeno T pequeno (sT) e grande (lT), e a protena agno. A protena agno parece participar na morfognese
143
m RNA tardios
m RNA iniciais
Enhancer
72
72
21 21 22
TATA
Promoter inicial
III ORI Origem da replicao bidirecional Aux-2
II Core
I
Aux-1
320
240
160
80
0/5243
5163 bp
PL Ori PE VP2
Organizao genmica do SV-40
ST
VP3 LT 17kT VP1
Figura 6.3. Estrutura e organizao do genoma do SV-40 (inferior) e organizao das regies regulatrias da transcrio e replicao (superior). ORI: origem de replicao; PE: promotor dos genes iniciais; PL: promotor dos genes tardios; lT: mRNA do gene do antgeno T grande; sT: mRNA do gene do antgeno T pequeno; VP1, VP2 e VP3: mRNA das protenas estruturais. >>: stios de ligao do antgeno; I: stio de regulao negativa da transcrio dos mRNA iniciais; II: stios de ligao e separao do DNA para o incio da replicao; III: stios de regulao positiva da transcrio dos genes tardios.
petidas de 72 pb que atuam como enhancers do promotor. Essas seqncias de 72 pb so responsveis pela ligao especca de fatores de transcrio, ou transativadores, cuja funo se ligar ao DNA e aumentar a ecincia da transcrio a partir do complexo basal de transcrio. Alguns motivos presentes nos promotores e enhancers virais so encontrados tambm nas regies regulatrias de certos genes das clulas
hospedeiras. Esse aspecto molecular crucial para o parasitismo do vrus. Possuindo regies regulatrias semelhantes s da clula hospedeira, o vrus pode seqestrar os componentes da maquinaria celular de transcrio para sintetizar os seus mRNA. Alm disso, a regio regulatria do SV-40 contm vrias seqncias repetidas que servem de stios de ligao para o antgeno lT, o que in-
144
Captulo 6
dica que esta protena regula a sua prpria expresso. Quando a quantidade de antgeno lT, na clula infectada, atinge nveis altos, a ocupao desses stios pelo prprio antgeno lT regula negativamente a transcrio do seu gene. A prxima etapa do ciclo replicativo a replicao do genoma viral. Como o genoma dos PoVs no codica os produtos necessrios sua prpria replicao, esses vrus dependem integralmente de enzimas e fatores celulares para replicar o seu DNA. No entanto, apenas um pequeno nmero de clulas no organismo encontra-se na fase S do ciclo celular, fase em que a clula expressa os fatores necessrios para a replicao do DNA nuclear. A maioria das clulas do organismo j so diferenciadas ou so clulas que necessitam estmulos externos (fatores de crescimento, hormnios ou outros estmulos mitognicos) para iniciar o ciclo celular. Os PoVs, assim como outros vrus DNA, solucionaram esse problema ao desenvolverem mecanismos para estimular as clulas a entrarem em fase S e, assim, produzirem os fatores necessrios replicao do seu genoma. Dessa maneira, o SV-40 capaz de infectar de forma persistente clulas renais diferenciadas e que no esto em diviso de seu hospedeiro natural. A replicao do DNA cromossmico das clulas ocorre durante a fase S do ciclo celular, mas a sntese e o acmulo dos fatores necessrios replicao do DNA iniciam na fase anterior (G1). A transio entre as fases G1 e S controlada parcialmente pela protena do retinoblastoma (pRb) e pelas protenas relacionadas p107 e p130. Em clulas que no esto em diviso, as protenas da famlia Rb impedem o incio da fase S pelo seqestro de fatores de transcrio que ativam os genes das enzimas relacionadas com a replicao do DNA, incluindo a DNA polimerase . Aps o estmulo mitognico, a ciclina D liga-se nas cdk 4 e cdk 6, ativando-as, o que leva hiperfosforilao da protenas Rb e resulta na liberao dos fatores de transcrio (E2F) e incio da fase S. Outros fatores tambm esto envolvidos no controle da transio entre as fases G1 e S. O fator de transcrio p53 pode prevenir a sntese noprogramada de DNA e bloquear o incio da fase S quando so detectadas leses no DNA celular.
Dependendo do estgio siolgico da clula, a p53 pode retardar o progresso do ciclo celular ou induzir apoptose. Pelo seu papel na transio G-S1, tanto a pRb como a p53 podem ser consideradas guardis que evitam a diviso celular extempornea e a transformao maligna das clulas. Por isso, so conhecidas como protenas antioncognicas. Apesar desses mecanismos de controle do ciclo celular, os PoVs conseguem induzir o incio da fase S em clulas quiescentes porque o antgeno lT dos PoVs exerce um importante papel, alterando o controle do ciclo celular por interagir diretamente com a protena Rb e, em alguns PoVs, tambm com a p53. Um pequeno domnio prximo a regio N-terminal do antgeno lT se liga especicamente s protenas da famlia Rb, enquanto seqncias prximas regio C-terminal so requeridas para a associao com a p53 (Figura 6.4). As conseqncias dessas interaes so a inibio da funo da pRb e p53 e a conseqente expresso dos produtos necessrios replicao do DNA viral e tambm celular. Alm do efeito da ligao nas pRbs, o antgeno lT capaz de estimular diretamente os promotores dos genes envolvidos no controle do ciclo celular, incluindo os genes que codicam as ciclinas. Dessa forma, o antgeno lT utiliza dois mecanismos para assegurar que a clula infectada entre em fase S e, assim, propicie um ambiente favorvel replicao viral. A funo exata do antgeno T pequeno (sT) durante a infeco produtiva ainda no est completamente esclarecida, porm sabe-se que esta protena capaz de interagir com a fosfatase 2, uma enzima reguladora do ciclo celular. Assim, o sT poderia colaborar com o lT na induo da fase S em clulas infectadas.
2.4 Replicao do DNA

A replicao do DNA circular dos PoVs envolve o relaxamento e a separao das cadeias do DNA, a sntese da cadeias lhas de DNA e a resoluo e a separao das molculas replicadas. O multifuncional antgeno lT exerce um papel fundamental no incio da replicao do DNA viral ao se ligar em seqncias regulatrias, localiza-
145
Antgeno T
L X C X E
Domnio J
N L Liga na ORI S
ATPase Zn Liga na p53 Liga na p53 HR
Hsc70
pRB
p53 p300
p107 p130
Figura 6.4. Estrutura funcional do antgeno T do SV-40. Nessa representao, esto indicados os motivos funcionais do lT. Domnio J: stio de ligao da protena Hsc70; LXCXE: stio de ligao das protenas da famlia pRb; NLS: sinal para localizao nuclear; stio de ligao na ORI; stio de ligao de Zn+; stio com atividade ATPase; stios de ligao nas protenas p53; HR: stio envolvido na determinao do host range.
das nas proximidades do promotor/enhancer do genoma do SV-40. Essa regio, conhecida por origem da replicao (ori), consiste de uma seqncia central de 64 nucleotdeos, anqueada por seqncias auxiliares (Figura 6.3). Como outras protenas que se ligam ao DNA, o antgeno lT oligomeriza ao interagir com os stios especcos na ori. Hexmeros do lT formam um anel duplo ao redor da ori e promovem a separao das cadeias do DNA viral nesse local. Esse processo dependente de energia, que fornecida pela hidrlise de ATP catalisada por uma atividade ATPase do prprio antgeno T (Figura 6.4). As regies de ta simples do DNA associamse, ento, com a protena replicativa A (RPA), que uma protena celular que se liga e mantm as regies de ta simples separadas. Isso permite a separao bidirecional das cadeias mediada pelo antgeno lT, expondo regies de cadeia simples para a processividade da replicao. O recrutamento da DNA polimerase (primase) e da topoisomerase I resulta na formao do complexo de iniciao. A etapa de elongao envolve a sntese bidirecional do DNA, que precedida pela atividade helicase do antgeno lT, que se move frente do complexo replicativo (Figura 6.1A). Os fatores do hospedeiro (PCNA e a DNA polimerase ) participam da sntese das cadeias leading
(contnua) e lagging (descontnua). A exonuclease e ligase I da clula hospedeira so necessrias para a remoo dos primers e ligao dos fragmentos de Okazaki, produzidos pela replicao descontnua de uma das cadeias. Como as cadeias parental e recm-replicada de DNA, so circulares e permanecem entrelaadas. A prxima etapa envolve a separao dessas molculas pela ao da enzima celular topoisomerase II (Figura 6.1). As histonas acumuladas no ncleo celular durante a fase S se associam com os genomas virais recm-replicados, formando, assim, uma prognie de minicromossomos. As clulas infectadas contm mais de 200.000 cpias de DNA viral e, aproximadamente, 50% destes so encapsidados para formar a prognie viral. Em resumo, a replicao do DNA do SV-40 compartilha vrias etapas e componentes essenciais envolvidos na replicao do DNA da clula hospedeira.
2.5 Expresso dos genes tardios

A replicao do DNA viral provoca uma alterao no padro de expresso gnica, favorecendo a transcrio e expresso dos genes tardios (L = late), que codicam as protenas do capsdeo. O mecanismo de transio, passando da expresso dos genes iniciais para a expresso
146
Captulo 6
dos tardios no bem conhecido. A redistribuio dos nucleossomos nas regies regulatrias do genoma possivelmente desempenhe alguma funo nesse processo, pois resulta na exposio dos stios regulatrios dos genes tardios para o reconhecimento pelo aparato celular de transcrio. O promotor que direciona a expresso dos mRNA tardios possui alguns motivos presentes tambm nos stios regulatrios dos genes iniciais, incluindo as seqncias para a ligao do antgeno lT. Dois mRNA tardios principais so transcritos na direo oposta aos mRNA iniciais e sofrem splicing alternativo. Os mRNA pequenos so traduzidos na protena VP1 do capsdeo, e os transcritos grandes originam a VP2 e VP3. Como a seqncia que codica a VP3 est contida na seqncia da VP2, a VP3 poderia ser produzida pela clivagem da protena VP2. No entanto, tem sido demonstrado que a traduo e sntese da VP3 e VP2 so independentes. A quantidade de mRNA tardios nas clulas infectadas muito superior a dos mRNA iniciais. Isso se explica pelo fato de que uma nica partcula vrica contm 360 molculas de VP1. Portanto, para uma prognie viral de 105 vrions por clula, so necessrias 3.6 x 107-8 molculas de VP1. Assumindo que cada molcula de mRNA pode originar de 5.000 a 10.000 molculas de VP1, mais de 30.000 molculas de mRNA da VP1 seriam necessrias para a produo de protena suciente para encapsidar a prognie viral. O acmulo da prognie de minicromossomos durante a replicao do DNA viral, com a conseqente amplicao dos moldes DNA e a ativao da transcrio pelo antgeno lT, so os responsveis pelos nveis altos de mRNA tardios nas clulas infectadas. Recentemente, foi relatado que microRNAs (miRNAs) so transcritos do genoma do SV-40 em fases tardias da infeco. Os miRNAs so pequenos (aproximadamente 20 nt) e desempenham funes regulatrias na expresso gnica de eucariotas. A hibridizao desses miRNAs com determinados mRNA-alvos resulta no silenciamento dos genes correspondentes. Esse silenciamento pode ocorrer por interferncia com a traduo ou pela degradao dos mRNA. Assim,
dois mecanismos atuam para reduzir a expresso do antgeno lT em fases tardias da infeco: a represso da transcrio pelo prprio antgeno lT e a interferncia pelos miRNAs. Surpreendentemente, clulas infectadas com isolados de campo do SV-40 so menos susceptveis lise por linfcitos T citotxicos do que clulas infectadas com cepas mutantes que no induzem a sntese de miRNAs. Provavelmente, a capacidade de sntese de miRNA se constitua em um mecanismo de evoluo viral, permitindo a esses vrus escaparem da vigilncia do sistema imunolgico.
2.6 Morfognese e egresso

Aps a sntese no citoplasma, as protenas virais VP1, VP2 e VP3 so transportadas para o interior do ncleo para a montagem dos vrions. Esse transporte mediado por sinais de localizao nuclear (NLS, seqncias especcas de aminocidos) presentes nessas protenas. Essas seqncias so responsveis pela interao das protenas virais com o aparato de importao nuclear. O mecanismo de montagem das partculas virais (morfognese) dos poliomavrus no conhecido. Capsdeos vazios podem ser inicialmente pr-formados, seguidos da incorporao dos genomas (como minicromossomos). Alternativamente, os capsmeros individuais formados pelos pentmeros da VP1, associados com a VP2 e com a VP3, podem interagir como o minicromossomo para a montagem dos capsdeos. A protena agno, uma protena altamente bsica, codicada pela regio lder dos mRNA tardios de alguns PoVs, facilita a morfognese por interagir com a VP1. Nos PoVs de humanos, a agnoprotena atua tambm na transcrio e replicao do DNA.
2.7 Concluses
A importncia crtica de uma nica protena o antgeno lT em vrias etapas do ciclo replicativo, como a transcrio, induo da fase S e replicao do DNA, constitui-se em um aspecto nico da famlia Polyomaviridae. O antgeno lT o protagonista principal e possui vrias atividades
147
biolgicas. Atua como regulador da transcrio viral, como protena ligante de DNA, possui atividade helicase e ATPase e de chaperone, alm de interagir com vrias protenas da clula hospedeira. A atividade do antgeno lT regulada por vrias modicaes ps-traduo, como fosforilao, glicosilao, acetilao e adenilao. Os PoVs so tambm conhecidos como pequenos vrus DNA tumorais, por causa de sua capacidade de induzir a formao de tumores. A infeco de clulas no-permissivas pode resultar em replicao abortiva. No entanto, a integrao freqente do genoma viral nos cromossomos da clula hospedeira pode resultar em expresso contnua das protenas iniciais. O antgeno T possui um papel decisivo nos processos de imortalizao, transformao celular e oncognese, provavelmente por suas interaes com mltiplos fatores celulares e pela interferncia com a regulao do ciclo celular.
3 Papilomavrus
A famlia Papillomaviridae possui apenas o gnero Papillomavirus, que inclui vrios vrus de mamferos e de aves. Esses vrus esto freqentemente associados com leses proliferativas na epiderme e nas mucosas (papilomas ou verrugas). Alm de clulas epiteliais, alguns papilomavrus (PpVs) tambm infectam clulas do tecido conjuntivo, causando bropapilomas (p. ex.: papilomavrus bovino-1, BPV-1). As leses causadas pelos PpVs so geralmente benignas, mas alguns desses vrus esto associados com a produo de neoplasias malignas. Os vrions dos PpVs so icosadricos, sem envelope e possuem aproximadamente 55 nm de dimetro. O genoma consiste de uma molcula de DNA de ta dupla circular, com 6.800 a 8.400 pb que, a exemplo dos poliomavrus, est associada com histonas da clula hospedeira, formando um complexo semelhante cromatina celular (minicromossomo).
dos queratincitos (ou das clulas equivalentes em superfcies no-cutneas). Na epiderme, os queratincitos representam cerca de 90% das clulas e encontram-se em diferentes fases de diferenciao. As clulas menos diferenciadas esto localizadas no compartimento basal (estrato germinativo), e as mais diferenciadas localizam-se no compartimento apical (estrato crneo). As clulas em estgios intermedirios de diferenciao esto localizadas nos estratos granuloso e espinhoso. As clulas-tronco do compartimento basal se multiplicam de forma assimtrica, originando outras clulas-tronco e tambm clulas de transio para a posterior diferenciao. Essas ltimas deixam o estrato basal e penetram no estrato espinhoso, onde iniciam o processo de diferenciao celular. O ritmo de multiplicao das clulas basais assegura uma substituio contnua das clulas escamosas da superfcie apical que vo sendo desfoliadas. A infeco de animais e pessoas pelos PpVs provavelmente ocorre por meio de microleses, que expem o compartimento basal, permitindo a penetrao e incio da replicao viral. A ligao dos vrus s clulas mediada pelo sulfato de heparina. No entanto, no se conhecem os receptores especcos que mediam a ligao e penetrao do vrus nas clulas e tampouco o mecanismo de desnudamento. A infeco das clulas basais no produtiva, ou seja, no resulta na produo de prognie viral. O ciclo replicativo inicia nessas clulas com a expresso limitada de genes virais (genes iniciais) e replicao do DNA. No entanto, a replicao s completada nas clulas diferenciadas, onde ocorre a amplicao do DNA viral, a expresso dos genes tardios, a morfognese e egresso da prognie viral. Embora as clulas basais representem a fonte de fatores de replicao, a infeco viral necessita de fatores que somente esto presentes em clulas que esto na fase S, para assegurar a expresso temporal dos genes e a replicao do genoma.

O ciclo replicativo dos PpVs est estreitamente associado com o processo de diferenciao
3.2 O genoma dos PpVs

A Figura 6.5 apresenta a organizao do genoma do papilomavrus bovino tipo 1 (BPV-1).
148
Captulo 6
Os genes do PpVs so classicados em iniciais (E) ou tardios (T) e, ao contrrio dos PoVs, so codicados em apenas uma das tas do DNA genmico. Assim, a transcrio do DNA viral realizada em apenas uma direo. Uma regio no-traduzida, conhecida como regio longa de controle (LCR), contm as seqncias regulatrias, incluindo a origem da replicao do DNA e enhancers para a transcrio. Seis diferentes promotores foram identicados no genoma do BPV-1. Entre os diferentes PpVs, existe uma variabilidade muito grande dos promotores, provavelmente reetindo os aspectos peculiares de regulao em diferentes espcies ou em diferentes stios de replicao.
E6 LCR
P7185 PL
CE
E7
P7940 P89
E8
7946/1 1000
AL
P890
L1
7000
E1
6000
BPV-1
2000
P2443
5000 3000
L2
4000
P3080
AE
E3 E5 E4 E2
Fonte: adaptado de Fowley e Lowy (2001).
Figura 6.5. Estrutura e organizao do genoma do papilomavrus bovino tipo 1 (BPV-1). LCR: regio longa de controle (contm a origem de replicao); CE: enhancer constitutivo; P: promoters (os nmeros indicam a posio no genoma); AE: stio de poliadenilao dos transcritos iniciais; AL: stio de poliadenilao dos transcritos tardios; E1 a E8: mRNAs dos genes iniciais; L1 e L2: mRNAs dos genes tardios.
o diferencial de mRNAs em diferentes clulas. Os mRNA dos PpVs so policistrnicos, ou seja, contm mais de uma seqncia codicante (open reading frame, ORF). No entanto, apenas uma dessas ORFs traduzida de cada mRNA. Nos PpVs de humanos e de bovinos, os primeiros genes a serem expressos so o E1 e E2, pela RNA pol II, com o auxlio de fatores de transcrio especcos de queratincitos. A protena E2 desempenha um papel fundamental na transcrio e na replicao do DNA. Essa protena contm uma regio para a ligao no DNA e outra com funo de ativao da transcrio. A E2 se liga especicamente em determinados promotores no LCR e controla positiva e negativamente a expresso dos genes iniciais, dependendo da sua concentrao e das interaes de suas regies regulatrias com o DNA. Essa regulao ainda mais complexa devido presena de diferentes isoformas da E2, que, provavelmente, possuam diferentes propriedades regulatrias. Por outro lado, a nica e importante funo da E2 na replicao do genoma estimular a ligao da E1 ao DNA, principalmente no incio da infeco, quando a concentrao da E1 ainda baixa. A E1 a maior e mais conservada protena dos PpV. a nica protena viral diretamente envolvida na replicao do DNA viral. Essa protena apresenta atividade ATPase/helicase e forma hexmeros simples e duplos ao redor do DNA viral. Alm disso, a E1 forma complexos com protenas do hospedeiro que esto envolvidas com a replicao do DNA, incluindo as subunidades da DNA polimerase , a RPA e chaperone Hsp40. Portanto, a E1 dos PpV semelhante ao antgeno lT dos poliomavrus com relao atividade enzimtica, capacidade de recrutar fatores celulares e no papel fundamental na iniciao da replicao do genoma viral.
3.4 Replicao do DNA e interferncia com o ciclo celular

O resultado da atividade conjunta da E1 e E2 a formao do complexo de iniciao que se liga na origem de replicao do DNA. Esse evento precede e permite a elongao da cadeia, resul-

A expresso dos genes dos PpVs complexa, em razo da presena de mltiplos promotores, de stios de splicing alternativo e pela produ-
149
tando na produo das cpias de DNA a serem encapsidadas na prognie viral. importante salientar que todas as fases da replicao do DNA viral ocorrem em sincronia com a replicao dos cromossomos da clula hospedeira. A replicao do DNA viral no compartimento basal produz entre 20 e 100 cpias do genoma, que so mantidos como DNAs extracromossmicos no ncleo da clula hospedeira. Os genomas virais so elmente distribudos entre as clulaslhas, e o processo de replicao s reiniciado nos queratincitos em estgios avanados de diferenciao (Figura 6.6). A amplicao dos genomas virais que ocorre em queratincitos diferenciados, denomi-
nada replicao vegetativa do DNA, representa um desao para o vrus, pois essas clulas encontram-se na fase G0 do ciclo celular. Acredita-se que duas pequenas protenas virais, a E6 e a E7, sejam responsveis pela criao de um ambiente favorvel para a replicao vegetativa. Essas protenas tambm desempenham um papel central na transformao celular e na induo de neoplasias, especialmente nos PpVs humanos de alto risco. De fato, sabe-se muito mais sobre o papel dessas protenas na transformao celular do que em infeces produtivas. Por isso, deve-se analisar com cautela as informaes a respeito do provvel papel da E6 e da E7 na infeco produtiva no contexto da replicao vegetativa do DNA.
Vrus introduzido por microleses
Diferenciao dos queratincitos

Estrato crneo Camadas granulares
Replicao dos papilomavrus

Liberao de vrions maduros Vrions maduros
Camadas espinhosas superiores
Morfognese dos vrions Produo das protenas tardias Amplificao vegetativa do DNA Nveis altos de protenas iniciais (E4)
Camadas espinhosas inferiores Clulas amplificadores em trnsito (mitticas) Clulas basais e de reserva
(substituem as amplificadoras)
Protenas dependentes da diferenciao E6 e E7 Protenas iniciais E1, E2, E3 e E4 Possvel stio alternativo de infeco Protenas iniciais E1 e E2 Infeco primria Estabelecimento da replicao Protenas iniciais E1 e E2
Membrana basal Derme (tecido conjuntivo, fibroblastos, endotlio vascular)
Fonte: daptado de Chow e Broker (1997).
Figura 6.6. Diferenciao do epitlio cutneo e etapas da replicao dos papilomavrus em infeces benignas (notumorais). As fases de diferenciao celular esto apresentadas esquerda da figura; e as etapas do ciclo replicativo esto apresentadas direita.
150
Captulo 6
De forma semelhante ao antgeno lT dos PoVs, as E6 e E7 dos PpVs interagem com as protenas celulares pRb e p53, que so protenas antioncognicas envolvidas no controle do ciclo celular. Quando a E6 expressa em camundongos transgnicos, ocorre a hiperproliferao do epitlio e o desenvolvimento de tumores epiteliais. Esses efeitos dependem parcialmente da habilidade da E6 de se ligar p53 e recrutar uma ligase celular, que adiciona uma ubiquitina, a p53, direcionando-a a degradao. A E6, ento, ao remover a p53, que envolvida no controle do ciclo celular, estimularia a clula a entrar em fase S e retardaria a apoptose. Estudos recentes sugerem que, alm dos efeitos mediados pela interao com a p53, a E6 pode interferir com o ciclo e na sobrevivncia celular por outros mecanismos. A E6 induz a hiperfosforilao e inativao da pRb, o que importante para entrada da clula na fase S. Tambm induz a expresso da telomerase, uma enzima que replica as extremidades do DNA e impede o encurtamento dos cromossomos aps a diviso celular. A inativao da pRb e a expresso da telomerase so importantes no processo de imortalizao de clulas pelos PpVs. Alm disso, a E6 pode interagir com a BAK, que uma protena pr-apoptose, que expressa em altos nveis na camada apical do epitlio estraticado. Assim como a p53, a interao da E6 com a BAK resulta na ubiquitinao e posterior degradao da BAK. Por induzir a degradao da p53 e BAK, a E6 impede ou reduz a probabilidade da clula infectada sofrer apoptose em resposta infeco, aumentando o tempo para o vrus completar o seu ciclo replicativo. A E7 interage com vrias protenas celulares envolvidas no controle do ciclo e na diferenciao celular, incluindo os membros da famlia das protenas pRb, as deacetilases de histonas, as ciclinas, cdks e fatores de transcrio da famlia dos AP-1. Embora o signicado de vrias dessas interaes permanea incerto, sabe-se que a ligao da E7 com a pRb resulta na degradao da pRb e na conseqente liberao do fator de transcrio E2F. A interao da E7 com fatores de transcrio AP-1 est associada com a modulao da transcrio de genes envolvidos com resposta inicial a sinais mitognicos.
Em resumo, a E6 e a E7 atuam sobre reguladores importantes do ciclo celular e da sobrevivncia das clulas infectadas, com o objetivo de proporcionar tempo suciente para assegurar a replicao e produo de prognie viral em clulas diferenciadas. A progresso do ciclo e a diferenciao celular so eventos mutuamente excludentes. De fato, a progresso no-programada do ciclo celular em clulas diferenciadas geralmente leva morte celular. Assim, a E6 e a E7, ao inuenciarem simultaneamente o ciclo celular e o mecanismo de sobrevivncia, so capazes de resolver o impasse que levaria morte celular. Alm do papel da E6 e E7, experimentos in vitro tm demonstrado que a E5 do BPV-1 ativa o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), uma protena que se liga ao PDGF e proporciona o sinal mitognico. Assim, por mimetizar o PDGF, a E5 capaz de criar sinais adicionais para criar um ambiente de fase S propcio replicao viral.

A transcrio dos genes tardios controlada por um promotor, que estimulado por fatores de transcrio presentes somente em queratincitos em fase nal de diferenciao. Isso pode explicar porque a sntese das protenas estruturais e a morfognese das partculas virais ocorrem apenas em clulas diferenciadas. No entanto, evidncias indicam que a expresso dos genes tardios em queratincitos menos diferenciados reprimida por fatores do hospedeiro. Isso indica que a regulao dos genes tardios e a conseqente continuao do ciclo podem estar sujeitas tanto a regulao positiva como negativa, ambas dependentes de condies e fatores associados com o estgio de diferenciao celular. O mesmo promotor tardio direciona a sntese de mRNAs que codicam a E4, uma das protenas menos conservadas dos PpV. Dessa forma, embora o gene da E4 esteja localizado na regio dos genes iniciais, expresso em fases tardias. O gene da E4 completamente sobreposto ao gene da E2. No entanto, a sua seqncia de aminocidos codicada por uma ORF diferente, fazendo com que as seqncias de aminocidos da E2 e
151
da E4 sejam completamente diferentes. A E4 se associa com a queratina e, quando expressa em altos nveis, pode induzir o colapso da cadeia de queratina. Com base nessas observaes, provvel que a E4 participe da replicao, facilitando o egresso das partculas vricas.
3.6 Concluses
Os PpVs dependem da diferenciao do epitlio para completar o seu ciclo de replicao, e a expresso dos seus genes regulada medida que as clulas basais migram em direo superfcie do epitlio. Os produtos virais no apenas controlam a expresso gnica dos genes virais e a replicao do DNA viral como tambm modulam o ciclo celular e os programas de apoptose para assegurar a produo de prognie viral. Em algumas circunstncias, infeces abortivas, sem a realizao completa do ciclo replicativo viral, podem ocorrer. A exemplo de outros vrus DNA pequenos, essas infeces abortivas podem resultar em transformaes neoplsicas.
4 Adenovrus
A Adenoviridae uma famlia de vrus DNA grandes, no-envelopados, que infectam vertebrados e produzem enfermidade leve no trato respiratrio, gastrintestinal e genitourinrio. Os adenovrus (AdVs) possuem a capacidade de infectar uma grande variedade de clulas que no esto em diviso. Por isso, tm sido muito utilizados como vetores para a transferncia de genes e tambm para vacinas vetoriais. Por essas razes, a biologia molecular dos AdVs conhecida com detalhes.
de mediar a importao do genoma viral para o ncleo da clula hospedeira. A expresso gnica do AdVs divide-se em fases inicial e tardia. As protenas iniciais so necessrias para a transcrio dos genes virais e para a replicao do DNA. Tambm esto envolvidas com a interferncia com os mecanismos inamatrios e de apoptose desencadeados pelo hospedeiro. Aps a replicao do DNA, ocorre a expresso dos genes tardios, cujos produtos so, em sua maioria, componentes estruturais das partculas vricas. O ciclo replicativo se completa em 20 a 24 horas e resulta na produo de aproximadamente 104 partculas vricas por clula infectada. Embora a diviso da expresso gnica em fases inicial e tardia seja conveniente do ponto de vista didtico, o limite exato entre essas fases no claro. Por exemplo, alguns genes iniciais continuam a ser expressos em fases tardias da infeco; e baixos nveis de expresso de genes tardios podem ser detectados j no incio da infeco. Essa sobreposio da expresso gnica inicial/ tardia tambm observada durante a replicao de outros vrus DNA.
4.2 O genoma dos AdVs

Os genomas dos AdVs de mamferos so constitudos por molculas lineares de DNA de ta dupla, com aproximadamente 35 kb. Seqncias repetidas invertidas (ITRs) com 36 a 200 pb so encontradas nas regies terminais do genoma. O genoma encontra-se associado com quatro protenas virais (V, VII, X and TP) para formar o ncleo (ou core) da partcula viral. A protena V provavelmente medeia as interaes entre o ncleo e o capsdeo. Maiores detalhes da estrutura das partculas vricas dos adenovrus esto apresentados no Captulo 16. Embora a organizao genmica seja conservada dentro dos gneros, diferenas importantes podem ser observadas entre vrus de gneros diferentes. A maioria dos genes gnero-especcos se localiza prxima s extremidades do genoma, enquanto os genes conservados na famlia tendem a se concentrar na regio central. Essa caracterstica tambm observada em outros vrus

Aproximadamente aps 40 minutos da penetrao na clula, os vrions podem ser observados prximos ao ncleo. A internalizao parece ativar a protease viral L3, que inicia o desmonte da partcula vrica. A protena terminal (TP), que uma protena que est associada de forma covalente na extremidade 5 do genoma, contm sinais de localizao nuclear, que so encarregados
152
Captulo 6
DNA de ta dupla lineares, como os poxvrus e herpesvrus. Nessas famlias, vrios genes gnero-especcos esto envolvidos nas interaes do vrus com o hospedeiro, provavelmente para favorecer a sua sobrevivncia em determinados nichos biolgicos. Alguns desses genes parecem ter sido capturados do hospedeiro em um passado remoto. O genoma dos AdVs codica aproximadamente 45 protenas, das quais apenas 12 so encontradas nos vrions. Os genes virais so organizados em unidades de transcrio, cuja expresso regulada temporalmente. Cinco unidades E1A, E1B, E2, E3 e E4 so expressas em fases iniciais e uma (L) expressa tardiamente na
infeco. Duas pequenas unidades (IX e Iva2) so expressas em fases intermedirias. O genoma do AdV humano pode ser descrito como um bloco central de genes com orientao para a direita, interrompidos por genes iniciais da regio E3 na mesma cadeia, e por genes E2 na cadeia oposta. A regio terminal direita ocupada pelos genes E4, e, esquerda, pelos genes E1A and E1B e dois genes intermedirios (Figura 6.7). Vrios mRNA so produzidos a partir de cada unidade transcripcional. Com poucas excees, os transcritos primrios das vrias unidades so processados por splicing. De fato, uma das mais importantes contribuies dos AdVs para a
Leader:
2 i
3 x y z
L5
L4 ML L3
L2 E3 (tardio)
L1 IX E1B VA E1A
E3 L1 (iniciais)
10
20
30
40
50
60
70
80 E2A
90
100
E2B IV a2 E4
Fonte: adaptado de Shenk (2001).
Figura 6.7 Estrutura do genoma e mapa de transcrio dos adenovrus. A linha dupla representa o genoma. Os nmeros abaixo representam as unidades genmicas. Os transcritos iniciais (E: early) so representados por setas finas; os transcritos tardios (L: late) so representados por setas espessas. A extenso das setas corresponde regio codificante dos mRNAs. A maioria dos transcritos tardios inicia na regio prxima unidade 16 do mapa e contm uma regio lder composta por trs seqncias (1, 2 e 3). As regies entre as seqncias lder e as respectivas setas so removidas por splicing (representam os ntrons).
153
Biologia foi a descoberta do splicing de RNA realizada durante estudos de expresso gnica. A maioria das unidades de transcrio codica uma srie de polipeptdeos com funes relacionadas. Por exemplo, a unidade E1A codica duas protenas que ativam a transcrio e induzem a clula hospedeira a entrar na fase S, enquanto a E2 codica trs protenas que atuam na replicao do DNA viral.

A regio da E1A, a primeira unidade transcripcional a ser expressa, resulta em um transcrito primrio nico, que processado por splicing diferencial em dois mRNAs. Os seus produtos, as protenas 12S e 13S (em razo de diferenas no coeciente de sedimentao dos mRNA), so idnticas, com exceo de 46 aminocidos adicionais presentes na E1A 13S. Uma funo importante das protenas E1A estimular a transcrio generalizada de genes virais. Essa funo depende da habilidade das protenas E1A de se ligarem em uma variedade de fatores regulatrios da transcrio celular, como as protenas CREB, AP1 e fatores basais de transcrio como a protena ligante do TATA (TBP). A ligao da E1A nesses fatores mediada pelos domnios conservados CR1 e CR2 (12S e 13S) e CR3 (somente na 13S). Uma interao crtica ocorre entre o CR3 e a subunidade mediadora MED23, que estimula a montagem do complexo de pr-iniciao nos promotores dos genes iniciais e, provavelmente, tambm aumente a taxa de incio da transcrio desses genes. As protenas E1A tambm desempenham um papel importante de induo do ciclo celular. A exemplo dos poliomavrus, as protenas iniciais dos AdVs focalizam a sua ao nos reguladores principais do ciclo celular, a pRb e p53. A interao entre as E1A e a pRb resulta na dissociao dos complexos E2F-pRb e ativao da transcrio de genes cujos produtos promovem a entrada na fase S. Interessantemente, a E2F tambm se liga e ativa os promotores da E1 e E2. Isso provavelmente represente um mecanismo para coordenar a progresso do ciclo celular com a expresso gnica e replicao do DNA viral.
As protenas E1A inibem a p300/CBP, uma protena que modica a estrutura da cromatina para facilitar a atividade de fatores de transcrio, como a p53. Ao se ligar na p300/CBP, as protenas E1A antagonizam a ao da p53, liberando o bloqueio para a progresso do ciclo celular. Alm disso, a E1B de certos AdVs pode se ligar diretamente e bloquear a p53. A razo por que os AdVs (e tambm os polioma e papilomavrus) utilizam dois mecanismos para estimular o ciclo celular desconhecida. Uma possibilidade que, in vivo, podem existir clulas nas quais um dos mecanismos mais eciente do que o outro. Uma anlise mutacional demonstrou que, embora a ligao da E1A nas protenas pRb ou p300/CBP possa induzir a sntese de DNA em clulas quiescentes, ambas as regies so necessrias para induzir a fase M, sugerindo que eventos tardios do ciclo celular so, provavelmente, requeridos para assegurar uma replicao viral eciente. Funes virais que induzem a progresso do ciclo celular esto envolvidas na transformao de clulas de cultivo por alguns sorotipos dos AdVs. No entanto, nenhum AdV tem sido associado com tumores em seu hospedeiro natural. Os AdVs induzem apoptose na clula hospedeira em fases iniciais da infeco, principalmente atravs de efeitos indiretos da E1A. Por outro lado, vrias protenas virais, incluindo as E1B/55 kDa, E1B/19 kDa e E4orf6, atuam bloqueando a apoptose por vrios mecanismos. A E1B e E4orf6 bloqueiam o mecanismo pr-apopttico dependente da p53, ligando-se e inativando essa protena. A E1B/19 kDa semelhante protena celular antiapopttica Bcl-2, que se localiza na membrana mitocondrial e impede a ativao da caspase9, uma efetora da apoptose. Mutantes do AdVs defectivos na E1B/19 kDa induzem morte celular rpida, resultando em produo de prognie viral em quantidade reduzida quando comparada com o vrus de campo. A sobrevivncia das clulas infectadas tambm depende da interferncia com sinais de morte celular induzidos pela resposta imune. A E3 19 kDa uma glicoprotena transmembrana que ca retida no retculo endoplasmtico (RE) e cujo domnio luminal se liga em molculas do MHCI, provocando a sua reteno no RE. A E3 19 kDa
154
Captulo 6
tambm se liga no complexo TAP e o impede de transferir peptdeos ao MHC-I. O efeito dessas atividades a proteo das clulas infectadas do reconhecimento e lise mediada por linfcitos T citotxicos (CTLs). Os CTLs tambm podem induzir lise celular, desencadeando sinais atravs do receptor de Fas expresso nas clulas-alvo. O complexo viral E3 14.4-kDa/E3 10.4-kDa interfere com a apoptose mediada pelo Fas, induzindo a degradao do seu receptor. Alm disso, esse complexo tambm inibe a lise celular pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF), uma citoquina antiviral potente. Provavelmente, as atividades imunomodulatrias das protenas E3 dos AdVs desempenhem importantes funes durante e replicao viral in vivo. Uma das respostas mais precoces contra infeces vricas aquela mediada pelos interferons (IFNs) e , que agem de forma autcrina e parcrina, induzindo um estado de resistncia antiviral nas clulas. Os IFNs atuam por meio de seu receptor, provocando a ativao da transcrio de genes cujos produtos possuem aes antivirais. Elementos-chave nesse mecanismo so as quinases citoplasmticas denominadas STATs, que, uma vez ativadas, so translocadas para o ncleo, onde se ligam e ativam os promotores responsivos ao IFN. As protenas E1A dos AdVs atuam diretamente nos mecanismos mediados pelos IFNs, ligando-se e inativando a STAT1 e, assim, bloqueando a ativao dos genes responsivos aos IFNs. Em resumo, as protenas iniciais dos AdVs atuam para assegurar uma expresso gnica adequada, progresso do ciclo celular e modulao das respostas do hospedeiro, at que o ciclo replicativo seja concludo. Indiretamente, essas atividades contribuem para a disseminao do vrus no organismo do hospedeiro. Estudos de infeces pelos AdVs in vivo tm demonstrado que esses vrus no so inerentemente inamatrios, indicando que conseguem moderar a resposta inamatria do hospedeiro.
51 bp, localizadas nas regies terminais repetidas, servem de origem de replicao (ori). Duas protenas virais codicadas pela regio E2, a protena pr-terminal (pTP) e a polimerase de DNA, se ligam nas primeiras 20 bases da ori. Uma terceira protena da E2, a protena ligante do DNA (DBP), juntamente com fatores celulares, ligamse um pouco abaixo (na direo 3) e interagem com o complexo pTP/polimerase. A principal funo da pTP servir de primer para a iniciao da replicao do DNA viral. Essa protena , posteriormente, clivada para originar a TP, que permanece ligada s extremidades 5 do genoma. A DBP forma multmeros em uma das cadeias do DNA, provocando a separao das cadeias, evento que necessrio para a elongao das cadeias-lhas. A sntese de DNA se inicia na extremidade de uma das cadeias e se prolonga at a outra extremidade, resultando em uma molcula de cadeia dupla recm-replicada e uma molcula parental de cadeia simples. No segundo estgio, a cadeia simples deslocada na reao inicial serve de molde para a sntese da cadeia complementar. Em clulas de cultivo, a replicao do DNA viral se inicia 5 a 10 horas aps a infeco e continua at a morte celular. Uma ilustrao simplicada da replicao do genoma dos AdVs est apresentada na Figura 6.8. Maiores detalhes sobre este mecanismo esto apresentados no Captulo 16.

O promotor principal tardio exibe um nvel baixo de atividade durante as fases iniciais da infeco e direciona a expresso da protena L1 52/55-kDa. Esta protena se associa com o genoma e o empacota em etapas avanadas do ciclo. medida que a replicao do DNA progride, a atividade do promotor tardio aumenta e se torna centenas de vezes mais ativo em fases tardias da infeco. Esse promotor fortemente ativado pelas protenas E1A, mas as razes de sua ativao tardia so desconhecidas. A transcrio da regio tardia do genoma resulta em um transcrito primrio longo, que processado por poliadenilao em diferentes stios,
4.4 Replicao do DNA viral

A maioria das funes necessrias para a replicao do DNA dos AdVs so codicadas pela regio E2 do genoma. Seqncias especcas de
155
Primeira etapa
3 5 Tp .pTp
-OH
Segunda etapa
Tp 5 3
OH
.pTp 3
OH
5
-OH
Lineariza
3 5
3 5
5 3
+
5 3
Circulariza
5 3 3 5
3 5
Fonte: adaptada de Flint et al. (2000).
Figura 6.8. Ilustrao esquemtica da replicao do genoma dos adenovrus. Na primeira etapa, apenas uma das cadeias replicada de maneira contnua, a partir de uma das extremidades. A cadeia no-replicada circulariza ento para a formao de uma nova origem de replicao. A replicao desta cadeia inicia na extremidade e prossegue ao longo da cadeia, que, em seguida, assume a topologia linear. Ao final das duas etapas, as duas cadeias de DNA esto replicadas.
e por splicing para gerar vrios mRNA tardios. O acmulo citoplasmtico dos mRNA tardios favorecido por duas protenas virais, a E1B 55 kDa e E4 34 kDa, que facilitam o movimento desses transcritos do ncleo para o citoplasma. Concomitantemente, o transporte de mRNA celulares para o citoplasma inibido. A natureza dessa discriminao (mRNA virais versus mRNA celulares) no completamente conhecida, mas pode envolver a relocalizao de fatores celulares requeridos para o transporte de mRNA nos centros de transcrio virais. Alm disso, os mRNA virais so preferencialmente traduzidos em etapas tardias da infeco, por causa de vrios mecanismos regulatrios
virais. Um desses mecanismos a inativao do fator de iniciao da traduo eIF-4F, que, normalmente, se liga aos mRNA para facilitar a traduo. As extremidades 5 dos mRNA virais tardios contm uma regio no-codicante de 200 nt, que permite a esses mRNA serem traduzidos na ausncia de eIF-4F ativo. Em contraste, os mRNA celulares no so mais traduzidos na ausncia do eIF-4F. A maioria das protenas tardias dos AdVs so componentes estruturais dos vrions e fatores envolvidos na morfognese que, juntamente com a replicao do DNA, produzem o cenrio para a morfognese e egresso da prognie viral.
156
Captulo 6
4.6 Concluses
Os adenovrus codicam uma srie de produtos envolvidos na interferncia com os mecanismos de regulao do ciclo celular. As protenas E1A so ativadores promscuos de vrios genes virais e tambm induzem a clula a entrar em fase S. Por outro lado, os efeitos indiretos dessa ativao podem levar a clula infectada apoptose. Por isso, os AdV codicam tambm produtos com atividade antiapopttica. Com isso, o vrus tem tempo suciente para completar o seu ciclo replicativo. No hospedeiro, os AdVs interferem com o reconhecimento de clulas infectadas pelo sistema imunolgico, tambm com o objetivo de preservar a integridade das clulas infectadas pelo tempo necessrio para a concluso do ciclo. Os AdVs tm sido intensivamente estudados como potenciais vetores para terapia gentica e vacinas contra vrus.
5 Herpesvrus
Os herpesvrus (HVs) so vrus grandes (120-200 nm de dimetro), com envelope, que possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla linear como genoma. A famlia Herpesviridae dividida em trs subfamlias, de acordo com aspectos biolgicos e moleculares em comum: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Todos os herpesvrus possuem a capacidade de estabelecer infeces latentes em seus hospedeiros. Os herpesvrus so encontrados em praticamente todas as espcies de vertebrados.
gnie viral infecciosa. A infeco produtiva com produo de prognie incompatvel com a sobrevivncia das clulas e resulta inevitavelmente em lise. Esse ciclo ltico pode ser facilmente reproduzido in vitro pela inoculao de HVs em clulas de cultivo. Aps a replicao ltica inicial, os HVs podem permanecer em determinadas clulas do hospedeiro em um estado no-replicativo durante um longo perodo, provavelmente por toda a vida do indivduo, sem que este apresente sinais da infeco. Essa forma no-produtiva de infeco, que ocorre sem a expresso de genes virais ou produo de prognie viral, denominada infeco latente. No entanto, estmulos especcos muitos deles relacionados ao estresse podem induzir o vrus em latncia a retomar a replicao ativa e, assim, iniciar um novo ciclo de infeco produtiva que culmina com a produo da prognie viral. Essa retomada da replicao ativa denominada reativao. Grande parte dos conhecimentos sobre a replicao produtiva dos HVs foram obtidos a partir de estudos da replicao in vitro pelo herpesvrus humano tipo 1 (vrus do herpes simplex, HSV-1), que o prottipo da famlia Herpesviridae. Em contraste, muito menos se conhece sobre a infeco latente pelos HVs pela diculdade de sua reproduo in vitro.
5.2 O genoma dos HVs

O genoma dos herpesvrus consiste de uma ta dupla linear de DNA com 125 a 240 kb. Os genomas dos HVs so classicados em seis classes (A-F), com base na organizao do genoma presena, nmero e localizao de regies repetidas e terminais (Figura 6.9). Por exemplo, nos genomas da classe E (p. ex.: HSV-1), as seqncias terminais so repetidas em uma orientao invertida e justapostas internamente, dividindo o genoma em uma regio curta (S) e outra longa (L), onde cada regio anqueada por regies repetidas e invertidas. O genoma do herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) um genoma do tipo D, no qual apenas a regio curta (US) anqueada pelas regies repetidas invertidas (Figura 6.9). Em ambos os casos, os componentes nicos podem estar na mesma orientao ou invertidos em relao ao

Os HVs replicam o seu genoma no ncleo da clula hospedeira e utilizam fatores virais e celulares no processo de replicao. Dependendo da expresso de determinados genes e das interaes com a clula hospedeira, os HVs podem apresentar dois tipos distintos de ciclo replicativo. O primeiro ocorre nas clulas epiteliais ou do tegumento durante a infeco aguda inicial, logo aps a penetrao no hospedeiro. A infeco dessas clulas resulta na expresso do conjunto completo de genes virais e na produo de pro-
157
outro. O DNA extrado dos vrions consiste em populaes equimolares que diferem apenas na orientao relativa dos dois componentes. Os genes presentes nas regies repetidas obviamente se encontram em mais de uma cpia no genoma.
Epstein-Barr (EBV), so sintetizados microRNAs que apresentam potencial para silenciar a expresso de genes celulares e/ou virais.
5.3 Os genes virais

Aproximadamente 30 genes dos HV (denominados centrais ou core genes) so conservados entre os membros da famlia Herpesviridae, ou seja, esto presentes nos genomas de todos os HV examinados at o momento. Os produtos desses genes so responsveis pelo metabolismo dos nucleotdeos, pela replicao do DNA e pela morfognese e estrutura dos vrions. Outros genes so conservados apenas entre membros de uma determinada subfamlia. Por exemplo, os alfaherpesvrus codicam transcritos associados latncia, uma protena do tegumento que ativa a transcrio dos genes iniciais e um regulador da transcrio relacionado ao ICP4 dos HSV-1. Alm desses, vrios outros genes so peculiares a algumas espcies de vrus. Os HVs da subfamlia Gammaherpervirinae, principalmente, codicam genes de origem do hospedeiro, provavelmente adquiridos por retrotransposio de cDNAs. Em alguns casos, os genes virais codicam funes similares as dos correspondentes celulares. Em outros casos, esses genes foram alterados para modicar a sua funo. Por exemplo, o homlogo da ciclina tipo D (no herpesvrus humano tipo 8 [HHV-8]) no responde a sinais que atuariam sobre a verso celular do gene, fazendo com que a ciclina tipo D viral permanea constantemente ativada e capaz de promover transformao celular. Na seo 5.4, ser visto que a aquisio de genes do hospedeiro uma caracterstica marcante dos poxvrus. Cerca de 50% dos genes do HSV-1 no so necessrios para a replicao viral em cultivo celulares, por isso so ditos no-essenciais (NE). No entanto, esses genes so importantes para a replicao e patogenia durante a infeco natural. Vrios genes NE atuam antagonizando os mecanismos de defesa antiviral do hospedeiro e, assim, favorecendo a replicao do vrus. Os HVs so capazes de alterar o ambiente celular para favorecer a sua replicao, provocando a inibio ou induo da sntese de macromo-
A B
R4 R3 UL UL Us Us R2 R1
C D E F
Fonte: adaptado de Roizman e Pellet (2001).
Figura 6.9. Estrutura e organizao dos genomas dos herpesvrus. As linhas representam seqncias nicas; os blocos representam seqncias repetidas. Representantes de cada grupo: A) Herpesvrus do catfish de canal; B) Herpesvrus Saimiri; C) Vrus Epstein-Barr; D) Vrus da varicella-zoster; E) Vrus do herpes simplex; F) Herpesvrus Tupaia. Note que somente os genomas do tipo F no apresentam seqncias repetidas. Os alfaherpesvrus de maior importncia veterinria (herpesvrus bovino tipo 1 [BoHV-1] e vrus da doena de Aujeszky [PRV]) possuem genomas do tipo D.
O genoma dos HVs contm entre 70 e 200 genes, e a maioria destes so monocistrnicos, portanto, codicam apenas uma protena. Os genes esto presentes e so transcritos a partir de ambas as cadeias de DNA. A expresso gnica controlada por promotores com TATA box e a transcrio realizada pela RNA polimerase II celular. Quando os genes so sobrepostos, as suas regies regulatrias esto localizadas na regio codicante do gene adjacente. Uma caracterstica comum dos genomas dos HV a existncia de grupos de transcritos co-terminais da extremidade 3, cada um expressando uma ORF diferente. Ao contrrio dos adenovrus, a grande maioria dos transcritos dos HVs no sofrem splicing. Alguns transcritos de genes dos HV parecem no conter ORFs traduzveis. Um exemplo clssico o transcrito associado com a latncia (LAT) do HSV-1, que o nico RNA viral transcrito durante a latncia desse vrus. No caso do vrus
158
Captulo 6
lculas, induo ou inibio da sntese de DNA celular e, ainda, podem induzir a imortalizao da clula hospedeira. Os HVs podem bloquear a induo de apoptose, ativar os mecanismos mediados pelo interferon e a apresentao de antgenos e mimetizar determinadas funes imunomodulatrias. Uma conseqncia geral dessas atividades o retardamento na erradicao da infeco das clulas hospedeiras, por um perodo suciente para permitir a replicao viral completa ou o estabelecimento da infeco latente.
tras classes de genes virais. Alm do stio para a ligao do complexo VP16/HCF/Oct-1, esses promotores contm stios especcos para a ligao de uma variedade de fatores de transcrio do hospedeiro (Figura 6.10).
Classe do gene IE (ICP4)

- 300
Promotor
TATAA TIF SP1 SP1 SP1 ICP4 SP1 TIF SP1 ICP4
5.4 Expresso gnica

E (TK)
+1
A cintica da expresso dos genes dos HVss durante a infeco aguda produtiva tem sido estudada detalhadamente em cultivo celular, mas acredita-se que variaes possam ocorrer in vivo e tambm entre tipos celulares diferentes. Como na maioria dos vrus DNA, os genes dos HV so expressos sob regulao temporal estrita. Os genes alfa ou de transcrio imediata (IE) so os primeiros a serem expressos, seguidos pelos genes beta ou iniciais (E), gama 1 (parcialmente tardios) e pelos genes gama 2 ou tardios (L). Embora os genes virais sejam transcritos pela RNA polII celular com o auxlio de fatores celulares de transcrio, protenas virais so necessrias e auxiliam em cada etapa de transcrio. Aps a penetrao do vrus, o nucleocapsdeo envolto pelo tegumento transportado para as proximidades dos poros nucleares, de onde o DNA viral translocado para o interior do ncleo e rapidamente circularizado. No HSV-1, a protena VP16 do tegumento liga-se a duas protenas celulares, HGF e oct-1, formando um complexo que se liga especicamente aos promotores dos genes IE, ativando a sua transcrio. A ativao da transcrio dependente da regio C-terminal da VP16, que atua facilitando a reunio dos fatores de transcrio celulares responsveis pela maquinaria de transcrio basal. A dependncia da VP16 parece ser maior em clulas quiescentes e diferenciadas encontradas in vivo. Seis produtos IE so codicados pelo HSV1: os polipeptdeos ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e 47 e a protena Us1.5. Os promotores desses genes geralmente so mais complexos do que os de ou-
CCATT, SP1 SP1
TATA +1
TATAA Inr
DAS +20
L (UL38)
-30
+1
Fonte: adaptado de Roizman e Knipe (2001).
Figura 6.10. Organizao dos promoters dos genes de transcrio imediata (IE), iniciais (early) e tardios (late) do vrus do herpes simplex (HSV-1). Cada classe representada pelo promotor de um determinado gene. Os retngulos indicam os stios de ligao dos fatores de transcrio/ transativadores. As setas indicam o incio e direo da transcrio. IE: stios para a ligao do complexo VP16/HCF/oct-1 (TIF), do fator de transcrio celular SP1 e do produto do gene ICP4; TATAA (TATA box). Inr: iniciador; DAS.
As protenas IE ICP4, ICP27 e ICP22 regulam a expresso dos outros genes virais e, portanto, so indispensveis para a continuao do ciclo replicativo. A deleo experimental do gene do ICP4, o mais importante transativador viral, resulta em um vrus incapaz de replicar. Outras funes dos genes IE incluem a inibio de splicing de mRNA (ICP27), a modulao do sistema de degradao das protenas celulares (ICP0) e a reduo da expresso das ciclinas indutoras da fase S (ICP22/Us1.5). A expresso das protenas IE alcana o pico mximo em 2 a 4 horas aps a infeco. Como o ICP4 capaz de reprimir a sua prpria expresso, acredita-se que contribua para a supresso dos genes IE, que observada nas fases tardias da infeco.
159
As protenas codicadas pelos genes E (beta) atingem o pico mximo de sntese cerca de 5 a 7 horas aps a infeco, embora alguns produtos (p. ex.: a subunidade maior da ribonucleotdeo redutase, RR) sejam sintetizados com cintica semelhante aos genes IE. As protenas E apresentam diferentes funes, relacionadas com o metabolismo de nucleotdeos e com a replicao do DNA viral. O seu acmulo nas clulas infectadas prenuncia o incio da replicao do DNA. Os produtos dos genes E envolvidos no metabolismo de nucleotdeos (timidina quinase TK, dUTPase, RR) e aqueles envolvidos na modicao e reparo do DNA (uracil-N-glicosilase e nuclease alcalina) no so essenciais para a replicao viral em clulas de cultivo. Isto se deve ao fato de as clulas em multiplicao expressarem enzimas prprias com atividades semelhantes. No entanto, as protenas E so importantes in vivo e mutaes nos seus genes resultam em vrus que apresentam replicao deciente. Isso faz sentido principalmente nos alfaherpervrus HSV-1 e BoHV-1, que so capazes de infectar diferentes tipos celulares, inclusive neurnios. Os neurnios so clulas diferenciadas que no se dividem e no expressam protenas envolvidas no ciclo celular, incluindo vrias protenas envolvidas no metabolismo de nucleotdeos e na replicao do DNA. Por isso, essas e outras protenas virais podem ser cruciais para possibilitar a infeco de determinados tipos celulares. A expresso dos genes gama 1 inicia em nveis baixos aps o incio da replicao do DNA, mas o seu nvel de expresso aumenta com o avano do processo replicativo. Os genes gama 2 (L) comeam a ser expressos aps a sntese e replicao do DNA viral. A transcrio dos genes tardios ocorre a partir de genomas recm-replicados, localizados em compartimentos de replicao nuclear, nos quais a ICP4 e a RNA polimerase II se localizam. Os promotores dos genes tardios consistem de seqncias regulatrias localizadas a certa distncia dos genes, como tambm de seqncias localizadas na regio 5no-traduzida (Figura 6.10). Alm da ICP4, a transcrio dos genes tardios exige a presena da ICP27, uma protena multifuncional que estimula a transcrio das prote-
nas virais envolvidas na replicao do DNA viral. A ICP27 movimenta-se entre o ncleo e o citoplasma das clulas infectadas, com funes nos dois compartimentos. Evidncias indicam que a ICP27 participa no recrutamento da enzima RNA polimerase II celular para a transcrio dos genes tardios; auxilia na exportao dos transcritos tardios para o citoplasma e estimula a traduo desses mRNA nos poliribossomos.

No incio da expresso dos genes iniciais, as protenas UL9 (protena viral que se liga na origem de replicao), UL29 (protena que se liga em DNA de ta simples) e UL5, UL8 e UL52 (complexo helicase-primase) se dirigem ao ncleo e se associam ao DNA viral, formando estruturas focais chamadas de stios pr-replicativos. Aps o recrutamento do complexo viral de replicao de DNA (UL30/UL42), uma frao dos stios prreplicativos maturam para formar os compartimentos virais de replicao. As funes mais importantes da protena UL9 so a de ligao especca na origem de replicao (ori) e a separao das cadeias de DNA neste stio. Acredita-se que isso favorea a montagem do complexo de iniciao, incluindo a associao da DNA polimerase viral. A sntese da cadeia contnua envolve a separao das cadeias do DNA e a sntese de um primer pelo complexo helicase-primase, a partir do qual a cadeia nascente pode ser sintetizada de forma contnua pela DNA polimerase. A sntese da cadeia descontnua mais complexa e envolve mltiplos ciclos de sntese do primer, extenso, remoo dos primers e ligao dos fragmentos de Okazaki adjacentes. A sntese de DNA viral ocorre pelo mecanismo de crculo rolante (rolling circle), que resulta em molculas longas, contendo vrias unidades do genoma unidas linearmente entre si. Essas molculas contm as quatro possveis formas isomricas do genoma (no caso do HSV-1), que so, ento, clivadas em unidades genmicas, que so encapsidadas nos nucleocapsdeos (Figura 6.1). Os fatores celulares induzidos na fase inicial da infeco, incluindo vrios componentes da maquinaria de reparo do DNA, acumulam-se nos
160
Captulo 6
centros de replicao viral. Esses fatores parecem ser importantes para os centros de replicao do HSV-1 se tornarem funcionais, sugerindo que um estresse celular pode ser necessrio para a replicao eciente dos HVs.
permitir a permanncia do vrus no hospedeiro. A reativao ocasional dessas infeces permite ao vrus ser transmitido e infectar novos hospedeiros, perpetuando-se, assim, na natureza.
5.6 Expresso gnica durante a infeco latente

A expresso de genes virais durante a infeco latente muito restrita e apenas um ou poucos genes virais so transcritos. Por exemplo, durante a latncia em neurnios de gnglios sensoriais, o HSV-1 e o BoHV-1 sintetizam uma srie de transcritos a partir de uma regio bem determinada do genoma (regio associada latncia, LRT; transcrito associado latncia, LAT). As demais regies do genoma permanecem inativas em relao transcrio. A razo dessa restrio da transcrio desconhecida, mas o ambiente neuronal e sinais derivados de clulas do sistema imunolgico tm sido implicados. Vrus recombinantes que possuem mutaes na regio do LAT/LRT so capazes de estabelecerem infeces latentes, mas so defectivos na reativao, o que sugere um papel para esses transcritos na reativao da infeco.
6 Poxvrus
Os poxvrus (PoxV) so vrus DNA que realizam o seu ciclo replicativo incluindo a replicao do genoma integralmente no citoplasma, uma propriedade que comum tambm ao vrus da peste suna africana (ASFV), nico membro da famlia Asfarviridae. Como as enzimas celulares que participam da sntese de RNA e DNA esto localizadas no ncleo, os PoxV devem trazer nos vrions as suas prprias enzimas e fatores auxiliares. Esse cenrio ilustra o nvel de independncia relativa que esses vrus conseguiram atingir em relao clula hospedeira. No entanto, embora codiquem grande parte das enzimas e fatores de transcrio, os PoxV ainda so dependentes de vrios fatores auxiliares da clula hospedeira. O ciclo replicativo dos PoxV foi estudado in vitro, utilizando-se o vrus da vaccinia (VV) como modelo. Apesar da sua complexidade, o ciclo replicativo do VV relativamente rpido, e a prognie viral pode ser detectada j oito horas ps-infeco (pi).
5.7 Concluses
Os herpesvrus possuem um genoma mais complexo e codicam vrias protenas envolvidas nos processos replicativos. Com isso, esses vrus so capazes de replicar em uma variedade de clulas, independente do seu estado de diviso ou diferenciao. Ao contrrio do que ocorre com os vrus DNA pequenos (polioma, papiloma e adeno), os HV no necessitam induzir as clulas a entrarem na fase S, pois codicam e/ou trazem nos vrions grande parte dos fatores necessrios replicao de seu genoma. No entanto, dependem da maquinaria celular de transcrio e processamento dos mRNAs. A replicao dos HVs geralmente induz uma supresso da sntese de macromolculas das clulas, geralmente levando a alteraes metablicas incompatveis com a vida celular. O estabelecimento de infeco latente se constitui em uma estratgia muito eciente para
6.2 O genoma dos PoxVs

Mais de 50 seqncias genmicas completas, representando vrios gneros, espcies e isolados de campo dos PoxV j foram obtidas, permitindo uma descrio detalhada da estrutura, organizao genmica e dos genes individuais. O genoma dos PoxV consiste de uma molcula de DNA linear de ta dupla com 130-390 kbp, contendo seqncias repetidas invertidas do tipo hairpin (ITRs) de 0.1 a 12.4 kb nas extremidades (Figura 6.11). Nos Chordopoxvirus (ChPVs), o nmero de genes de aproximadamente 150, embora mais de 300 genes j tenham sido deduzidos no genoma do PoxV do canrio (canaripox). A densidade gnica alta, com uma mdia de um gene por kb.
161
Repetio invertida
10 kbp
Seqncias nicas
160 kbp
Repetio invertida
10 kbp
Seqncias repetidas 0,9 kbp 1,3 kbp
Seqncias repetidas 1,3 kbp 0,9 kbp
Fonte: adaptado de Murphy et al. (1999).
Figura 6.11. Estrutura do genoma dos poxvrus. O genoma consiste de uma molcula contnua de DNA de fita dupla, sem extremidades livres. Nas duas extremidades, situam-se regies repetidas invertidas de aproximadamente 10 kb cada. As seqncias nicas abrangem o restante do genoma.
Aproximadamente 90 dos 150 genes so conservados no genoma de todos os ChPVs seqenciados at o presente, e codicam produtos que participam da replicao do DNA, da transcrio, da morfognese e da estrutura das partculas virais. Nesses genes, tanto as regies codicantes quanto os promotores so altamente conservados. Em geral, grande parte dos genes conservados esto localizados na regio central do genoma. Os genes localizados entre a regio central e as extremidades do genoma tendem a ser espcie-especcos e codicam protenas cujas funes antagonizam a resposta imune do hospedeiro. Esses genes so chamados coletivamente de genes de virulncia. Esto includos nesse grupo os genes que codicam produtos homlogos s citocinas e quimioquinas do hospedeiro, e genes de receptores de citocinas e quimioquinas que foram adquiridos do hospedeiro e modicados durante a evoluo. Ao contrrio dos genes centrais conservados, vrios genes de virulncia so dispensveis para a replicao viral em cultivo celular.
6.3 Expresso gnica

Como os outros vrus DNA, os PoxVs coordenam os processos de replicao genmica e morfognese por meio de uma regulao temporal da expresso de grupos de genes. A transcri-
o dos genes do VV pode ser dividida em trs etapas: inicial, intermediria e tardia. A transcrio de vrios genes, no entanto, parece no obedecer a essa regulao estrita, ocorrendo continuamente ao longo do ciclo replicativo. Os fatores de transcrio e enzimas necessrias para a transcrio dos genes iniciais esto presentes nas partculas vricas infectantes. Assim, a transcrio desses genes inicia poucos minutos aps a penetrao viral, ainda no interior de partculas parcialmente ntegras e, portanto, antes do desnudamento ser completado. A transcrio inicial resulta na produo de aproximadamente 100 mRNA diferentes, que so exportados do interior dos vrions para o citoplasma para serem traduzidos. Entre as protenas dos genes iniciais esto aquelas envolvidas nos mecanismos de evaso do sistema imunolgico, no desnudamento completo do genoma, na sntese de DNA viral e na regulao da expresso dos genes intermedirios. Os produtos dos genes intermedirios so principalmente fatores de transcrio utilizados para a expresso dos genes tardios. As protenas tardias, por sua vez, esto envolvidas na morfognese, fazem parte da estrutura das partculas vricas e tambm incluem as enzimas e fatores de transcrio que sero includos na prognie viral para o prximo ciclo de replicao. Os genes dos PoxVs so transcritos pela RNA polimerase viral, que composta por nove
162
Captulo 6
subunidades. As duas subunidades maiores apresentam um alto grau de similaridade nos aminocidos, com as subunidades maiores das RNA polimerases de eucariotas e procariotas, mas as duas subunidades menores no apresentam similaridade signicativa com as suas correspondentes. Aproximadamente a metade dos genes do VV pertence ao grupo dos genes iniciais. Os promotores desses genes possuem um resduo de guanina (G) extremamente conservado na posio 21, anqueado por uma regio varivel rica em A-T. A transcrio dos genes iniciais requer a RNA polimerase viral, o fator de transcrio inicial (ou ETF, a nica protena de ligao ao DNA codicada pelos PoxV) e ATP. No modelo atual, o ETF se liga nos promotores iniciais e recruta o complexo da RNA polimerase. A hidrlise de ATP pelo ETF e a sua subseqente liberao do complexo permite a RNA polimerase iniciar a transcrio. Estudos recentes sugerem que vrios fatores de transcrio dos genes iniciais formam complexos que se ligam aos promotores durante a morfognese das partculas virais. Com isso, parte dos fatores necessrios para a transcrio inicial j estaria posicionada nos promotores, permitindo o rpido incio da transcrio, logo aps a penetrao na clula hospedeira. As enzimas virais guanilyl-transferase (capping enzyme), polimerase poly-A e um fator de terminao da transcrio tambm so importantes para a transcrio inicial. A transcrio desses genes termina logo aps o nal das ORFs, em resposta a uma seqncia TTTTTNT (onde N qualquer nucleotdeo), localizada na cadeia de DNA oposta (codicante). At o presente, nenhuma funo da clula hospedeira foi identicada como necessria para a iniciao e terminao da transcrio inicial. Aps o desnudamento completo do genoma, seguem-se as etapas de transcrio dos genes intermedirios, a replicao do DNA e a transcrio dos genes tardios. Os promotores dos genes intermedirios so bipartidos, possuindo um elemento iniciador no stio de iniciao da transcrio e uma seqncia rica em A-T, localizada prxima (na direo 5). A transcrio desses genes requer fatores virais recm-sintetizados, como a
RNA polimerase, fatores ITF-A (helicase), ITF-B (enzima que coloca o cap), VITF-2 (fator derivado do hospedeiro) e B1R (protena quinase viral). Os promotores dos genes tardios tambm so bipartidos e contm um elemento iniciador e uma regio rica em A-T logo acima. Alm da RNA polimerase, trs produtos de genes intermedirios e um produto inicial so necessrios para a transcrio dos genes tardios, embora as funes desses produtos sejam desconhecidas. Um fator de transcrio do hospedeiro tambm parece estar envolvido na transcrio dos genes tardios. A terminao da transcrio dos genes tardios diferente daquela dos genes iniciais, mas tambm requer a participao de produtos virais.
6.4 Replicao do DNA

A replicao citoplasmtica do genoma se constitui em um aspecto nico do ciclo replicativo dos PoxV e ASFV. A replicao do DNA do VV ocorre em fbricas virais, que so reas citoplasmticas totalmente envolvidas por membranas derivadas do retculo endoplasmtico rugoso (RER). O envolvimento dessas reas pelas membranas do RER um processo que se completa em, aproximadamente, 45 minutos a partir do incio da infeco e parece ser inuenciado por protenas virais de membrana. Em etapas tardias da infeco, quando se inicia a morfognese, esses envelopes membranosos do RER no so mais visveis na estrutura celular. Alguns PoxVs codicam enzimas envolvidas na sntese de deoxiribonucleotdeos (dNTPs), para favorecer a sntese e replicao do DNA em clulas que na esto em diviso. No caso do VV, a replicao do DNA ocorre entre 3 e 12 horas psinfeco e resulta na produo de aproximadamente 10.000 cpias por clula, metade das quais sero includas nos vrions. Acredita-se que a replicao do DNA dos PoxV se inicie com uma clivagem em uma das cadeias nas proximidades dos hairpins, seguida de polimerizao seqencial a partir da extremidade 3, deslocamento da cadeia complementar e resoluo por concatmeros (Figura 6.1). A regio terminal de 200 pb do genoma provavelmente serve
163
CAMPO, M.S. Cell transformation by animal papillomaviruses. The Journal of General Virology, v.73, p.217-222, 1992. CAMPO, M.S. Review: bovine papillomavirus and cancer. The Veterinary Journal, v.154, p.175-188, 1997. CANN, A.J. Principles of Molecular Virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1997. 310p. CHOW, L.T.; BROKER, T.R. Small DNA tumor viruses. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.12, p.267-301. COLE, C.N.; CONZEN, S.D. Polyomaviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.63, p.2141-2174. DiMAIO, D.; COEN, D.M. Replication strategies of DNA viruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.6, p.119-132. DULBECCO, R.; GINSBERG, H.S. Multiplication and genetics of animal viruses. In: DAVIS, B.D. et al. (Eds). Microbiology. 3.ed. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1980. 967p. FAUQUET, C.M. et al. (Eds). Virus taxonomy, REPORT OF THE INTERNATIONAL COMMITTEE OF TAXONOMY OF VIRUSES, 8. 2.ed. San Diego, CA: Elsevier Academic Press, 2005. 1162p. FLINT, S.J. et al. Principles of Virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. GAUKROGER, J.M. et al. Interaction between bovine papillomavirus type 4 and cocarcinogens in the production of malignant tumours. The Journal of General Virology, v.74, p.2275-2280, 1993. HAY, R.T. et al. Molecular interactions during adenovirus DNA replication. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.199, p.31-48, 1995. HOWLEY, P.M.; LOWY, D.R. Papillomaviruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.65, p.2197-2229. HUNTER, E. Virus assembly. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.8, p.171-197. MANKERTS, A. et al. Molecular biology of porcine circovirus: analysis of gene expression and viral replication. Veterinary Microbiology, v.98, p.81-84, 2004. MOSS, B. Poxviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.84, p.2849-2883.
de origem de replicao. A resoluo/separao dos genomas individuais requer uma protena viral tardia, a resolvase. Partculas vricas imaturas, em associao com estruturas membranosas, acabam envolvendo o DNA e amadurecem na forma de vrions de formato retangular. Vrios produtos virais desempenham funes importantes da replicao do genoma do VV, incluindo a polimerase de DNA e um fator de processividade associado; a trifosfatase de nucleosdeos, a protena de ligao em DNA de ta simples, a topoisomerase I, protena quinase e glicosilase de uracil. Mutaes em qualquer desses genes so deletrias para a capacidade dos vrus replicar o seu genoma.
6.5 Concluses
Os PoxVs esto entre os vrus mais complexos de animais e trazem nos vrions e/ou codicam um nmero grande de enzimas e fatores necessrios transcrio, processamento de seus mRNAs e replicao do genoma. Por isso, independem da maquinaria celular de sntese de RNA e DNA e realizam o ciclo replicativo inteiramente no citoplasma da clula hospedeira. Os PoxVs tambm codicam uma srie de produtos que antagonizam a resposta imunolgica do hospedeiro, permitindo, assim, que o ciclo replicativo seja completado com a mnima interferncia dos mecanismos anti-virais. A facilidade da manipulao do genoma, assim como a sua extenso e capacidade de suportar a insero de grandes segmentos de DNA, tm feito dos PoxV vrus adequados para a construo de vetores vacinais.
ACKERMANN, H.-W.; BERTHIAUME, L.; TREMBLAY, M. Virus Life in Diagrams. Boca Raton, FL: CRC Press, 1998. 221p. BEAUD, G. Vaccinia virus DNA replication: a short review. Biochimie, v.77, p.774-779, 1995. BLASCO, R. et al. Variable and constant regions in african swine fever virus DNA. Virology, v.168, p.330-338, 1989. BOEHMER, P.E.; LEHMAN, I.R. Herpes simplex virus DNA eplication. Annual Review of Biochemistry, v.66, p.347-384, 1997.
164
MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. PLOUBIDOU, A.; WAY, M. Viral transport and the cytoskeleton. Current Opinion in Cell Biology, v.13, p.97-105, 2001. ROIZMAN, B.; KNIPE, D.M. Herpes simplex viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.72, p.2399-2459. ROIZMAN, B.; PALESE, P. Multiplication of viruses: an overview. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.4, p.101-111.
Captulo 6
ROIZMAN, B.; PELLETT, P.E. The family Herpesviridae: a brief introduction. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.71, p.2381-2397. SHENK, T.E. Adenoviridae: the viruses and their replication.. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.67, p.2265-2300. TAVIS, J.E. The replication strategy of the hepadnaviruses. Viral Hepatitis Review, v.2, p.205-218, 1996. WHITE, D.O.; FENNER, F. Medical virology. 4.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1994. 610p.
REPLICAO DOS VRUS RNA

Maria Elisa Piccone1 & Eduardo Furtado Flores
7
167
167 169 169 169
1 Introduo 1.1 Diversidade de estrutura, organizao e funcionalidade dos genomas

1.2 Stios de replicao 1.3 Indelidade das replicases e diversidade gentica 1.4 Outras protenas virais envolvidas na replicao
2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo

2.1 Genomas com uma nica ORF, sem produo de mRNA subgenmicos 2.1.1 Estrutura e organizao do genoma 2.1.2 Traduo e replicao do genoma 2.2 Genomas com mais de uma ORF e produo de mRNAs subgenmicos 2.2.1 Estrutura e organizao genmica 2.2.2 Expresso gnica e replicao do genoma
169
171 171 172 174 174 174
3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo

3.1 Vrus com o genoma no-segmentado 3.1.1 Estrutura e organizao do genoma 3.1.2 Transcrio 3.1.3 Replicao do genoma 3.2 Vrus com o genoma segmentado 3.3 Vrus com o genoma ambissense
176
176 177 178 179 180 181
4 Vrus com RNA de ta dupla

4.1 Estrutura e organizao do genoma 4.2 Transcrio 4.3 Replicao do genoma
182
182 183 184
5 Retrovrus 6 Bibliograa consultada
184 185
Responsvel pela seo de vrus RNA de sentido positivo.
1 Introduo
Os vrus RNA compem um grupo amplo e diverso de vrus que infectam desde insetos e plantas at vertebrados superiores. So os nicos organismos que possuem RNA como genoma, e, por isso, precisaram se adaptar a certas condies impostas pelas clulas hospedeiras para poder se multiplicar. As clulas eucariotas no possuem enzimas e reaes para a sntese de RNA a partir de moldes RNA, etapa necessria para a replicao do genoma desses vrus. No entanto, a evoluo viral solucionou este impasse, pois o genoma de um vrus RNA codica a sua prpria enzima replicativa (RNA polimerase dependente de RNA ou replicase). Em alguns vrus RNA, a replicase e os fatores auxiliares para a replicao do genoma so produzidos pela traduo direta do genoma, logo no incio do ciclo replicativo. Em outros vrus RNA, o genoma no traduzido diretamente e os vrions carreiam a enzima replicase e os fatores necessrios para a replicao do genoma. A replicao do genoma dos vrus RNA (com exceo dos retrovrus) ocorre em duas etapas e envolve a sntese de molculas intermedirias (RNA complementar ou antigenmico). O RNA antigenmico serve, ento, de molde para a sntese de RNA de sentido genmico. A sntese de RNA com sentido de mensageiro (mRNA ou sentido positivo) denomina-se transcrio, e a sntese de RNA genmico denomina-se replicao. Na verdade, transcrio e replicao so termos equivalentes utilizados para designar a sntese de molculas de RNA a partir de moldes. A mesma enzima replicase, possivelmente assistida por uma combinao diferente de fatores auxiliares ou submetida a modicaes qumicas, responsvel tanto pela transcrio como pela replicao. O complexo enzimtico envolvido na transcrio geralmente chamado de transcriptase; e o complexo responsvel pela replicao denominado replicase. Os retrovrus apresentam uma estratgia de replicao nica, que difere dos demais vrus RNA. Esses vrus possuem um genoma RNA com sentido positivo, mas que no traduzido diretamente. A replicao do genoma ocorre pela
produo de uma molcula de DNA complementar (provrus) que integrada aos cromossomos celulares. A transcrio desse provrus pela RNA polimerase II celular (RNApol II) resulta na produo do RNA para ser includo como genoma nas partculas vricas. A natureza do seu genoma resultou em algumas conseqncias biolgicas e evolutivas para os vrus RNA: a) a maioria deles realiza o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma das clulas hospedeiras, b) poucos deles utilizam o processamento de RNA (splicing) para a gerao de diversidade de protenas; c) a alta taxa de erro das replicases virais, associada com a ausncia de autocorreo, resulta em uma alta freqncia de mutaes, o que contribui para a grande variabilidade gentica e antignica desses vrus.
1.1 Diversidade de estrutura, organizao e funcionalidade dos genomas

Os genomas dos vrus RNA de animais so todos compostos por molculas lineares, porm, apresentam diferenas quanto funcionalidade, estrutura e organizao (Tabela 7.1). A distino inicial se refere funcionalidade do genoma, ou seja, existem vrus com genoma RNA de sentido (ou polaridade) positivo e negativo. Os vrus RNA de sentido positivo possuem as seqncias codicantes de protenas (open reading frames, ORFs) no mesmo sentido do genoma, ou seja, o seu genoma pode ser diretamente traduzido em protenas pelos ribossomos. Dentre estes, duas propriedades principais so reconhecidas: alguns vrus possuem uma nica ORF no genoma e outros genomas possuem mais de uma ORF e produzem RNAs mensageiros subgenmicos (mRNAsg). Os RNAs genmicos dos vrus RNA de sentido negativo no apresentam as ORFs na mesma orientao do genoma, assim, no podem ser diretamente traduzidos em protenas. As ORFs esto presentes no RNA complementar, de sentido antigenmico. Ento, a produo de suas protenas depende inicialmente da sntese de mRNAs pela polimerase viral trazida nos vrions. Dentre esses vrus, existem alguns cujo genoma composto por uma molcula contnua de RNA
168
Captulo 7
e outros cujo genoma dividido em dois ou mais segmentos. Dentre os vrus com o genoma segmentado, existem alguns que possuem o genoma ambissense, ou seja, codicam as suas protenas por ORFs existentes tanto no RNA de sentido genmico quanto no RNA complementar. Todos os genomas dos vrus RNA (sentido positivo e negativo, segmentados ou no) so compostos por molculas de RNA de ta simples (ssRNA). Um terceiro grupo formado por vrus que possuem ta de RNA de cadeia dupla (dsRNA) segmentada como genoma. Estes vrus tambm trazem a enzima polimerase nos vrions, que necessria para a transcrio e replicao dos segmentos genmicos.
Os retrovrus representam uma exceo entre os vrus RNA. O seu genoma possui polaridade positiva, porm no traduzido diretamente pelos ribossomos. A replicao dos retrovrus envolve a transcrio reversa (sntese de DNA a partir de RNA), integrao do DNA proviral nos cromossomos da clula hospedeira e transcrio do provrus pelo aparato celular de transcrio. Apesar dessa diversidade, praticamente todos esses vrus convergem para um evento central comum: a produo de mRNA reconhecveis e traduzveis pela maquinaria celular de traduo. A nica exceo composta pelos genes que codicam protenas no-estruturais (e estruturais em alguns casos) entre os vrus RNA de sentido positivo, que podem ser traduzidos diretamente do genoma.
Tabela 7.1. Classificao dos vrus RNA de acordo com a estrutura, organizao e polaridade do genoma e local intracelular de replicao
RNA genmico
Famlia
Picornaviridae Flaviviridae Caliciviridae Astroviridae Togaviridae Coronaviridae Arteriviridae Retroviridae Birnaviridae Reoviridae Rhabdoviridae Filoviridae Bornaviridae Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae
Replicao
Segmentos
1 1 1 1 1 1 1 2 (idnticos) 2 10-12 1 1 1 1 7-8 3 2
ss/ds
ss ss ss ss ss ss ss ss ds ds ss ss ss ss ss ss ss
Polaridade
Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Ambas Ambas Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa ou ambissense Ambissense
Topologia
Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear
Local intracelular
Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo/citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo Citoplasma Ncleo Citoplasma Citoplasma
Replicao dos vrus RNA
169
1.2 Stios de replicao

Com exceo dos vrus das famlias Orthomyxoviridae e Bornaviridae, cuja replicao do genoma ocorre no ncleo; e dos retrovrus, em que o ciclo replicativo ocorre parte no citoplasma e parte no ncleo, os demais vrus RNA realizam o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma da clula hospedeira. Esses vrus so, portanto, independentes da maquinaria nuclear de sntese e processamento de RNAs. Os ortomixovrus replicam o genoma no ncleo e so dependentes de oligonucleotdeos com cap, que so subtrados dos mRNA celulares. Estes vrus, alm dos retrovrus, dependem ainda da maquinaria de processamento de mRNAs celulares (splicing) para o processamento de alguns de seus transcritos. Alguns vrus RNA que replicam no citoplasma (paramixovrus) utilizam mecanismos alternativos para modicar os seus transcritos e produzir diferentes protenas a partir de um mesmo gene.
rus possui implicaes importantes na epidemiologia, patogenia, diagnstico e para a produo de vacinas.
1.4 Outras protenas virais envolvidas na replicao

Alm das replicases, outras protenas que participam da sntese de RNA so codicadas por esses vrus. As funes exercidas por essas protenas so diversas e incluem: a) direcionamento da polimerase e/ou do genoma aos locais da clula onde ocorre a replicao; b) facilitao do reconhecimento do stio de iniciao da sntese de RNA pela polimerase; c) encapsidao do genoma RNA para a transcrio e replicao; d) aumento da anidade da polimerase pelo RNA; e) aumento da atividade da polimerase; f) separao das cadeias de RNA para a polimerizao (atividade de helicase); g) alterao da especicidade da polimerase pelo molde RNA (troca de transcrio para replicao). Ou seja, esses vrus codicam uma srie de protenas, algumas com atividades enzimticas, que atuam como co-fatores no processo de sntese de RNA e replicao do genoma. Alm de protenas, a sntese de RNAs virais envolve a participao de componentes celulares, denominados genericamente fatores do hospedeiro. A especicidade, as etapas de participao e a dependncia relativa de fatores do hospedeiro para a sntese de RNA viral variam entre os vrus.
1.3 Indelidade das replicases e diversidade gentica

As replicases dos vrus RNA (RNAs polimerases dependentes de RNA) apresentam uma taxa de erro aproximadamente 1.000 a 10.000 vezes superior s polimerases de DNA. Alm disso, essas enzimas no possuem a atividade de proofreading (correo de nucleotdeos incorretos adicionados durante a sntese). O resultado disso que pelo menos uma mutao em ponto pode ser introduzida a cada replicao do genoma, o que tem uma grande implicao para a diversidade e evoluo desses vrus. Como conseqncia, uma populao de vrus RNA no constituda por uma prognie clonal homognea, e sim por uma mistura de variantes agrupados em torno de uma seqncia predominante e mais abundante. Essa populao heterognea de vrus que compe uma espcie viral denominada quasi-species. A gerao contnua dessa populao heterognea se constitui em uma grande vantagem evolutiva para os vrus RNA, pois permite que variantes geradas ao acaso possam apresentar vantagem evolutiva e rapidamente se sobressair na populao quando submetidos determinada presso de seleo. A rpida taxa de evoluo desses v-
2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo

Por denio, esses vrus codicam as suas protenas no sentido do RNA genmico, ou seja, as seqncias abertas de leitura (ORFs) que codicam as protenas virais esto presentes na mesma orientao do genoma. Por isso, o RNA genmico pode ser usado como mRNA e ser diretamente traduzido pelos ribossomos. Os vrus desse grupo possuem algumas caractersticas em comum: a) replicam no citoplasma da clula hospedeira; b) o RNA genmico serve de mRNA e pode ser traduzido; c) o RNA genmico desprovido de protenas infeccioso quando introduzido
170
Captulo 7
nas clulas; d) as protenas virais so sintetizadas como poliprotenas precursoras. Essas poliprotenas so imediatamente clivadas em protenas individuais por proteases virais e/ou celulares; e) os vrions no contm enzimas. As infeces por vrus RNA de sentido positivo no so exclusivas dos animais, e um grande nmero desses agentes pode infectar tambm bactrias ou plantas, constituindo gneros que so classicados dentro dessas famlias de vrus. Sete famlias de vrus animais possuem genoma RNA de sentido positivo, e todos possuem
o genoma no-segmentado: 1) Picornaviridae, 2) Flaviviridae, 3) Caliciviridae, 4) Astroviridae, 5) Togaviridae, 6) Arteriviridae e 7) Coronaviridae. A replicao do genoma desses vrus envolve a ao conjunta de vrios componentes, que incluem protenas virais, seqncias especcas no RNA viral e, provavelmente, vrios componentes celulares, como protenas e membranas. Uma diferena fundamental entre grupos de vrus RNA de sentido positivo se refere existncia de uma ou mais ORFs no genoma e a produo ou no de mRNAs subgenmicos (Figura 7.1; Tabela 7.2).
Picornaviridae (FMDV)
5' VPg
7 - 8.5kb ORF nica
VP4
VP2
VP3
VP1
2A
2B
2C
3A 3B
3C
3D
polyA 3'
Flaviviridae (gnero Pestivirus, BVDV) 12,3kb

ORF nica
5'
N
pro
ms
E1
E2
NS2-3
NS4-A
NS4-B
NS5A
NS5B
poliC3'
Caliciviridae 7.3 - 8.3kb

5' VPg
ORF1
p32
NTPase
P30
VpG
P76 (Pro - pol)
ORF2 capsdeo
ORF3
poliA3
mRNA subgenmico
Astroviridae
5' VPg
6.8kb ORF1a
Pro
ORF1b
Pol
ORF2
Capsdeo
poliA3'
mRNA subgenmico
Togaviridae 9.7 - 11.8kb

ORF1
Cap 5'
ORF2
NsP4 C E3 E2 E1
poliA3'
NsP1
NsP2
NsP3
mRNA subgenmico
Arteriviridae 13 - 15kb
5 Cap
L L L
ORFs2-7 ORF 1a ORF 1b

a 2b 3 4 5 6 7
3 poliA
mRNA subgenmicos
Coronaviridae
5' Cap
L
27 - 32kb ORF1a
Pol
ORF1b
2 HE
5-7 ORFs
3
poliA
mRNA subgenmicos
Figura 7.1. Estrutura e organizao do genoma dos vrus RNA de sentido positivo. As linhas contnuas representam o RNA genmico; os retngulos representam os genes. A localizao das ORFs e dos mRNA subgenmicos tambm est indicada.
171
Tabela 7.2. Principais caractersticas do genoma dos vrus RNA de polaridade positiva Genoma (kb) Famlia Extenso (kb) 7,2 - 8,5 9,6 - 12,3 6,8 7,3 - 8,3 13 - 15 9,7 - 11,8 27 - 32 5' Extremidades 3' RNA subgenmicos no no sim (1) sim (1) sim (6) sim (1) sim (5-7)
Picornaviridae Flaviviridae Astroviridae Caliciviridae Arteriviridae Togaviridae Coronaviridae

** Apenas os vrus do gnero Flavivirus. *** Pestivrus, hepacivrus. **** Pestivrus (BVDV).
VPG*, IRES cap**,IRES*** VPG VPG cap cap cap
poliA poliC**** poliA poliA poliA poliA poliA
* Protena terminal associada extremidade 5' do genoma.
Nos vrus que possuem uma nica ORF no genoma, todas as protenas so produzidas pela traduo direta do RNA genmico, originando uma longa poliprotena. Esta poliprotena clivada por proteases celulares e/ou virais, originando as protenas individuais. A clivagem ocorre medida que a traduo vai se desenvolvendo, de modo que a poliprotena inteira nunca detectada nas clulas infectadas. Nesses vrus, os genes que codicam as protenas estruturais esto localizados no tero 5 do genoma; enquanto as protenas no-estruturais inclusive a polimerase viral so codicadas pelo restante do genoma (Figura 7.1). Entre os vrus em que o genoma possui mais de uma ORF, as protenas no-estruturais (e a polimerase) so codicadas na regio prxima extremidade 5 do genoma (dois teros do genoma). Apenas a ORF localizada na regio prxima extremidade 5 traduzida diretamente do RNA genmico, resultando na sntese das protenas no-estruturais, inclusive a polimerase viral. A(s) outra(s) ORF(s) embora estejam presentes no sentido do RNA genmico so expressas a partir de RNAs subgenmicos (mRNAsg), que so produzidos a partir da transcrio das molculas de RNA complementar (antigenmicos), ou seja, esses vrus produzem uma parte de suas protenas (no-estruturais) pela traduo direta
do genoma e outra parte pela traduo de mRNAs subgenmicos (Figura 7.1). Nesta seo, sero apresentados alguns aspectos das principais estratgias utilizadas pelos vrus RNA de sentido positivo para expressar os seus genes e replicar o seu genoma, utilizando exemplos de diferentes famlias.
2.1 Genomas com uma nica ORF, sem produo de mRNA subgenmicos
Importantes vrus animais e de humanos esto includos neste grupo, que composto por membros das famlias Picornaviridae e Flaviviridae. Dentre os patgenos humanos, esto o poliovrus, os rinovrus, os vrus da dengue e febre amarela, e o vrus da hepatite C. Os principais vrus animais deste grupo so: o vrus da febre aftosa (FMDV, um picornavrus), que possui um impacto sanitrio e econmico notvel na bovinocultura e na economia de vrios pases; e os pestivrus (famlia Flaviviridae) vrus da diarria viral bovina (BVDV) e vrus da peste suna clssica (CSFV).
2.1.1 Estrutura e organizao do genoma

O genoma desses vrus contm uma ORF nica e longa, que abrange quase toda a extenso
172
Captulo 7
do genoma (Figura 7.1). Essa ORF anqueada por duas regies no-traduzidas (5UTR, 3UTR), que possuem extenses variveis, de acordo com o vrus (podem atingir at 1.100 nt em alguns picornavrus). A extremidade 5 do genoma possui estruturas especializadas que so importantes para o direcionamento do genoma para o local da replicao (5VPg), para o incio da traduo (cap ou IRES) e replicao. A extremidade 3 poliadenilada ou possui uma seqncia de citosinas, como no caso dos pestivrus (Figura 7.1; Tabela 7.2). A regio 3 UTR geralmente menor e possui seqncias importantes para a replicao do genoma.
2.1.2 Traduo e replicao do genoma

A primeira etapa na replicao desses vrus a traduo do genoma em uma nica poliprotena, que a precursora de todas as protenas virais
(Figura 7.2). Essa poliprotena clivada seqencialmente, medida que produzida, originando os precursores intermedirios e, nalmente, as protenas virais maduras. Nos picornavrus, as clivagens so realizadas essencialmente por proteases virais; nos membros da famlia Flaviviridae, essas clivagens so realizadas por proteases virais e celulares. Uma das protenas maduras produzidas pela traduo do genoma a replicase viral (polimerase de RNA dependente de RNA), que se encarrega de replicar o genoma. A replicao ocorre em duas etapas: a) sntese de uma molcula de RNA complementar (com a extenso do genoma) e b) sntese de cpias de RNA de sentido genmico a partir do RNA complementar. As molculas de RNA de sentido genmico possuem trs funes: a) servem de mRNA para a produo da poliprotena; b) servem de molde para a sntese de RNA complementar; e c) so encapsidadas
ORF nica
5'
VPg
VP4
VP2
VP3
VP1
2A
2B
2C
3A 3B
3C
3D
3'
IRES 5'-3'
Poliprotena
Clivagem
P1
P2
P3
Clivagem Protenas estruturais

L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C
3A 3B
3C
3D
Figura 7.2. Organizao do genoma e expresso gnica de um picornavrus (vrus da febre aftosa, FMDV). A estrutura IRES, reconhecida pelos ribossomos, est demonstrada na regio 5' no-traduzida. A ORF nica e longa traduzida pelos ribossomos em uma longa poliprotena, que vai sendo clivada por proteases celulares medida que produzida. As clivagens seqenciais originam precursores intermedirios e, finalmente, as protenas virais maduras.
173
como genoma nas novas partculas virais (Figura 7.3). Aps a morfognese dos vrions, ocorre lise celular e a prognie viral liberada. A cintica de replicao dos picornavrus rpida e o ciclo completado em cinco a dez horas. O RNA viral (vRNA) traduzido diretamente pelos polirribossomos, mas, aproximadamente 30 minutos aps a infeco, a sntese de protenas celulares reduzida drasticamente. Essa supresso da sntese protica a causa primria das alteraes morfolgicas celulares que acompanham a infeco, genericamente denominadas como efeito citoptico (ECP). A supresso parece ocorrer pela clivagem de fatores de traduo celulares envolvidos no reconhecimento e ligao s estruturas cap dos mRNAs celulares, evento necessrio para o incio da traduo. Essa clivagem atribuda protease 2A dos rinovrus e enterovrus, e protease L do FMDV. Alguns vrus deste grupo (a maioria dos isolados dos pestivrus) so excees e no so citolticos. Embora o genoma desses vrus se comporte como mRNA e possa ser traduzido em protenas, a sua estrutura diferente dos mRNA celulares. Alm de codicar as protenas virais, esta molcula possui importantes seqncias conservadas e estruturas secundrias na regio 5 no-traduzida (UTR). Entre as estruturas funcionais mais im-
portantes desta regio, destaca-se uma estrutura secundria altamente complexa denominada Internal Ribosomal Entry Site (IRES). Esta estrutura direciona os ribossomos ao cdon de iniciao da traduo, sobrepondo-se ao mecanismo usual de iniciao da traduo dos mRNAs celulares. Estruturas IRES j foram identicadas nos genomas dos poliovrus, vrus da encefalomiocardite (EMCV), FMDV, vrus da hepatite A e em alguns membros da famlia Flaviviridae (vrus da hepatite C [HCV] e BVDV). O mecanismo pelo qual o aparato de traduo celular reconhece o IRES permanece desconhecido, mas a participao de vrios fatores de iniciao, alm de outros fatores celulares, tem sido proposta. Ao contrrio dos poliovrus e dos pestivrus, o genoma dos vrus do gnero Flavivirus possui uma estrutura cap na extremidade 5, mas parece ser traduzido por um novo mecanismo que no depende do cap. A regio 5 UTR do genoma dos vrus RNA de sentido positivo tambm contm sinais para a replicao do genoma. O balano entre traduo e replicao parece ser mediado pela interao dessa regio com protenas virais e celulares. Outra estrutura essencial para a replicao, conhecida como sinal cis-acting de replicao (cre), tem sido identicado no genoma de vrios vrus. Essas
RNA genmico (+)
5'-
-3'
Traduo (1)
Encapsidamento (4)
2
Replicao Protenas
3'-
-5'
RNA antigenmico (-)
Figura 7.3. Ilustrao simplificada das etapas de replicao dos vrus das famlias Picornaviridae e Flaviviridae. O genoma RNA , inicialmente, traduzido em protenas (1). A RNA polimerase produzida nesta etapa sintetiza o RNA complementar (2) e, a seguir, cpias de sentido genmico (3). Alm de ser traduzido em protenas, o RNA de sentido genmico serve de molde para a sntese do RNA complementar e, posteriormente, encapsidado nas novas partculas vricas (4).
174
Captulo 7
estruturas, embora aparentemente responsveis pela mesma funo, esto localizadas em regies diferentes dos genomas. A regio 3 UTR do genoma contm estruturas secundrias e tercirias que so importantes durante a replicao do genoma. Acredita-se que ocorre uma interao direta entre as duas UTRs (5 e 3) durante a traduo e replicao, mediada por complexos do RNA com protenas. Existem ainda evidncias de circularizao do genoma do vrus da dengue (um avivrus) atravs de interao fsica entre as UTRs 5 e 3. Durante a sua replicao, os picornavrus induzem a proliferao de estruturas membranosas envolvidas na replicao viral. Essas membranas podem fornecer fatores celulares necessrios para a replicao do RNA. Vrias protenas celulares que interagem com o RNA genmico tm sido identicadas e, em alguns casos, tm sido associadas funcionalmente com a replicao.
poliadenilada. Os genes que codicam as protenas no-estruturais esto localizadas nos dois teros prximos extremidade 5, e os genes das protenas estruturais ocupam o tero restante do genoma. Uma caracterstica comum a todos esses vrus a produo de mRNA subgenmicos (mRNAsg), em nmero e extenso variveis, que so traduzidos nas protenas estruturais.
2.2.2 Expresso gnica e replicao do genoma

A expresso gnica e a replicao do genoma desses vrus apresentam algumas semelhanas com o grupo anterior: a) o genoma serve de mRNA e traduzido diretamente pelos ribossomos; b) a traduo resulta na produo de poliprotenas, que so posteriormente clivadas nas protenas individuais; e c) a replicao do genoma ocorre via produo de um RNA de sentido antigenmico. As principais diferenas se referem organizao do genoma (posio dos genes das protenas estruturais versus no-estruturais), nmero de ORFs e produo de mRNAsg. Dentre esses vrus, os mais estudados so os coronavrus e os togavrus. A seguir, ser descrita a expresso gnica e replicao do vrus Sindbis, um togavrus responsvel por encefalomielite aguda em camundongos e extensivamente estudado como modelo para diversos aspectos da Virologia. O genoma desse vrus contm duas ORFs, cada uma codicando quatro protenas (Figura 7.4). Inicialmente, a ORF situada prxima extremidade 5 do genoma traduzida, resultando na produo de uma poliprotena. Esta poliprotena clivada medida que vai sendo produzida, originando as protenas no-estruturais, incluindo a replicase viral. Esta polimerase sintetiza, ento, uma cpia de RNA de sentido negativo (complementar ou antigenmica) com a extenso completa do genoma. A molcula de RNA complementar serve para dois propsitos: a) molde para a sntese de RNAs de sentido e extenso genmicos que so encapsidados na prognie viral e b) molde para a sntese de mRNAs subgenmicos. Esses mRNAsg so traduzidos em uma poliprotena que origina, por clivagem, as protenas
2.2 Genomas com mais de uma ORF e produo de mRNAs subgenmicos

Vrios patgenos animais e humanos utilizam esta estratgia de expresso gnica e replicao do genoma. Incluem-se entre eles os togavrus Sindbis e vrus das encefalites eqinas (EEEV, VEEV e WEEV), os calicivrus (calicivrus felino, FCV), os coronavrus (vrios patgenos animais e humanos), os arterivrus (PRRSV, vrus da arterite eqina) e os astrovrus. Pela sua organizao genmica e estratgia de expresso similares, os membros das famlias Coronaviridae e Arteriviridae so agrupados na ordem Nidovirales. Os vrus deste grupo de famlias apresentam vrias similaridades de estrutura, organizao genmica e expresso gnica com o grupo anterior, porm tambm apresentam importantes diferenas.
2.2.1 Estrutura e organizao genmica

Os vrus deste grupo possuem molculas de RNA de polaridade positiva como genoma, com extenso entre 6.8 kb (astrovrus) a 32 kb (coronavrus). Dependendo da famlia, a extremidade 5 possui uma protena ligada (VPg) ou uma estrutura cap, enquanto a extremidade 3
175
Cap
5'
NsP1
NsP2
NsP3 Traduo
NsP4
E3
E2
E1
3'
A(n)
Poliprotena Clivagem
NSP1 NSP2 NSP3
NSP4
Replicao
Protenas noestruturais 3
Transcrio 5
RNA antigenmico (negativo)
Transcrio
Cap
m RNA subgenmico
A (n)
Traduo
Poliprotena
Clivagem
C E3 E2 E1
Figura 7.4. Ilustrao esquemtica da expresso gnica e replicao dos togavrus (vrus Sindbis).
do capsdeo e envelope. Os nucleocapsdeos se formam no citosol, pela associao de mltiplas cpias da protena do capsdeo com o genoma RNA. As glicoprotenas do envelope so inseridas em membranas de organelas celulares, e os vrions maturam por brotamento na membrana plasmtica. A transcrio dos mRNAs (uma nica espcie, no caso dos togavrus) ocorre por iniciao em um stio ou promotor interno. Uma vez sintetizados, esses mRNAsg no so reconhecidos como molde pela polimerase viral e apenas servem para a traduo nas protenas estruturais. Essa estratgia permite a separao temporal da sntese de protenas regulatrias (iniciais) e estruturais (tardias). A replicao desses vrus um pouco mais complexa do que a dos picornavrus, e a clula deve manter a sua integridade para permitir o brotamento contnuo das novas partculas vricas. De fato, a reduo da sntese protica celular muito menos dramtica at mesmo em fases tardias da infeco. A replicao dos calicivrus e astrovrus no tem sido to caracterizada como os togavrus, pois alguns desses vrus no replicam com eci-
ncia em cultivo celular. No entanto, os vrus de ambas as famlias tambm produzem mRNAsg durante a sua replicao. Os coronavrus e arterivrus replicam fazendo uso de um mecanismo similar. Nos coronavrus, uma srie de 5 a 7 mRNAsg sobrepostos so produzidos pela transcrio do RNA antigenmico (Figura 7.1). Cada mRNAsg inicia com uma regio lder 5 idntica (com cap), o que indica um mecanismo mais complexo de iniciao do que o simples reconhecimento de um promotor interno. Todos os mRNAsg possuem a mesma extremidade 3 e so traduzidos em vrias protenas estruturais. A exemplo dos outros vrus RNA de sentido positivo, a replicao desse grupo de vrus ocorre em complexos replicativos associados com membranas intracelulares. As estruturas formadas e a origem das membranas envolvidas, no entanto, variam entre os vrus. Por exemplo, os complexos replicativos de vrios picornavrus e avivrus so associados com o retculo endoplasmtico, enquanto os togavrus utilizam tambm as membranas dos endossomos e lisossomos como stios de replicao.
176
Captulo 7
3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo

Os vrus com genoma RNA de sentido negativo apresentam uma maior diversidade do que o grupo anterior. Esses vrus possuem o genoma geralmente mais extenso e codicam um nmero maior de protenas. Essa complexidade pode dever-se s diculdades adicionais da sua expresso gnica e replicao, o que faz com que necessitem codicar mais protenas e com funes diversas. Os genomas dos vrus RNA de sentido negativo no so traduzidos diretamente em protenas, pois no possuem as ORFs no sentido genmico. Ao contrrio, as ORFs esto presentes na ta de RNA complementar (RNA antigenmico). A sntese das protenas virais, portanto, requer a prvia produo de mRNAs. Estes mRNAs so transcritos pela transcriptase/replicase viral, usando o RNA genmico como molde. Como o RNA genmico no traduzido diretamente e assim a polimerase no produzida no incio do ciclo, como no grupo anterior esses vrus necessitam trazer, nos vrions, as enzimas necessrias para a sntese de RNA antigenmico e mRNA. Os vrus RNA de sentido negativo compartilham algumas caractersticas, tais como: a) os vrions contm cpias da enzima replicase; b) o RNA genmico desprovido de protenas no infeccioso; c) so produzidos mRNAs individuais para cada gene, ou seja, so RNAs monocistrnicos; d) os mRNAs possuem 5cap e so poliadenilados (existem excees); e) o genoma permanece associado com protenas durante a transcrio e replicao; f) o RNA genmico de vrios desses vrus forma estruturas semelhantes a cabos de panela (panhandles), pela associao de seqncias complementares presentes nas extremidades. Neste grupo so encontrados vrus com dois tipos de organizao genmica: os vrus com o genoma no-segmentado, ou seja, uma molcula nica de RNA; e os vrus com o genoma dividido em vrios segmentos. A estratgia de expresso gnica e replicao do genoma dos vrus RNA de sentido negativo muito similar. Cada gene origina um mRNA que codica uma protena, ou seja, so mRNAs monocistrnicos. A replicao do genoma ocorre
por meio da produo de uma molcula de RNA complementar (antigenmico), que serve de molde para a sntese de RNA genmico. Nos vrus com o genoma no-segmentado, so produzidos vrios mRNAs de extenso curta, cada um correspondendo a um nico gene. medida que os mRNAs so transcritos, ocorre a atenuao da transcrio, sendo produzida uma quantidade maior de mensageiros dos genes localizados na extremidade 3 do genoma. Esses mRNAs sero traduzidos em protenas. A produo do RNA complementar (intermedirio na replicao do genoma) envolve a transcrio completa do genoma. Para isso, a replicase ignora os sinais de terminao de cada gene e prossegue transcrevendo at a extremidade 5 da molcula molde. Nos vrus com o genoma segmentado, cada segmento genmico codica um ou ocasionalmente dois produtos. Cada mRNA corresponde aproximadamente extenso completa do respectivo segmento genmico. Esses mRNAs possuem 5 cap e so poliadenilados na extremidade 3. Os RNAs antigenmicos que serviro de molde para a sntese de cpias de RNA genmico possuem uma extenso semelhante, mas no possuem cap na extremidade 5 e nem poliA na extremidade 3.
3.1 Vrus com o genoma no-segmentado

Os membros de quatro famlias de vrus possuem genoma RNA negativo no-segmentado (Tabela 7.1). As famlias Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae e Rhabdoviridae compem a ordem Mononegavirales, pelas semelhanas na estrutura e organizao genmica, estratgia de expresso gnica e replicao do genoma e por semelhanas estruturais e funcionais das protenas. Uma caracterstica marcante da replicao desses vrus a grande estabilidade do complexo ribonucleoprotena (genoma + nucleoprotena, RNP). Esse complexo nunca desfeito durante as diferentes etapas do ciclo replicativo, ou seja, a transcrio e a replicao ocorrem utilizando, como substrato (ou molde), um RNA fortemente recoberto por mltiplas cpias da nucleoprotena (N ou NP). Esses vrus apresentam tambm um mecanismo interessante de regulao na trans-
177
crio dos diferentes genes, chamado de atenuao da transcrio, o que resulta na produo de quantidades de protenas de acordo com a necessidade do vrus. Os bornavrus apresentam alguns aspectos nicos, como a transcrio e replicao nuclear, splicing alternativo dos transcritos primrios policistrnicos, uso diferencial de sinais de incio e trmino de transcrio. Esses aspectos os distinguem dos paramixovrus, lovrus e rabdovrus. As seguir, sero abordados os principais aspectos da expresso gnica e replicao do vrus da estomatite vesicular (VSV), um membro da famlia Rhabdoviridae. Grande parte das informaes se aplica tambm aos outros membros da ordem Mononegavirales.
3.1.1 Estrutura e organizao do genoma

A estrutura e organizao do genoma de vrus representativos das trs famlias que compem a ordem Mononegavirales esto apresenta-
dos na Figura 7.5. Variaes na extenso do genoma, no nmero de genes e na extenso das regies intergnicas (IR) so encontradas nos vrus das diferentes famlias. Porm, todos eles possuem um grupo principal de genes em comum e a organizao genmica muito semelhante. O genoma do VSV formado por uma molcula de RNA linear de ta simples, com aproximadamente 11 kb. Os rabdovrus, em geral, codicam um mnimo de cinco genes, na ordem 3 N P M G L 5, e o VSV codica outras duas pequenas protenas (C e C) em outra fase de leitura do gene P. Nos paramixovrus, vrias protenas so produzidas a partir do gene P, pela utilizao de diferentes cdons de iniciao, traduo de diferentes ORFs e por um mecanismo de edio. Neste mecanismo, so adicionadas uma, duas ou trs guaninas (G) em um determinado ponto do mRNA, resultando em mudana de fase de leitura a partir deste local. Prximo extremidade 3, existe uma regio no-codicante, que transcrita em um polinucleotdeo denominado lder. A seqncia lder possui 47 nt (no
A
Rhabdoviridae (VSV)
(11-15kb) N 3 P M G L 5
B
Paramyxoviridae
(15-16kb) N 3 P/C/V M F H L 5'
C
Filoviridae
(19kb)
NP VP35 VP40 GP VP30 VP24 L
Figura 7.5. Estrutura e organizao do genoma de trs vrus representativos das famlias que compem a ordem Mononegavirales. A) Rhabdoviridae (vrus da estomatite vesicular, VSV); B) Paramyxoviridae (vrus da cinomose, CDV); C) Filoviridae (vrus Ebola). O genoma consiste de uma molcula linear de RNA de polaridade negativa, representada pelo trao contnuo. Os blocos representam os genes, com regies intergnicas (IRs) entre eles. N ou NP): nucleoprotena; P: fosfoprotena (C e V, produtos secundrios do gene P); M (VP40): protena da matriz; G: glicoprotena do envelope; F: protena de fuso; H: protena de ligao aos receptores, hemaglutinina; L: polimerase viral. VP35: cofator para a transcrio e replicao; VP35: cofator para a transcrio e replicao; VP30: nucleoprotena menor; VP24: protena do envelope. O nmero de genes pode variar entre os vrus de cada famlia.
178
Captulo 7
VSV), no possui cap, no poliadenilado e no traduzido em protena. Logo aps, existe um sinal para o incio da transcrio do primeiro gene, que seguida da adio de 5 cap no mRNA resultante. Entre os genes, existem as regies intergnicas (IR), sendo que cada uma possui um sinal para a terminao da transcrio do gene anterior, uma pequena regio interveniente e um sinal para a iniciao da transcrio do gene subseqente (Figura 7.6). Prximo extremidade 5, existe uma regio no-traduzida, denominada trailer. Em todas as etapas da replicao, o genoma permanece fortemente associado com mltiplas cpias da nucleoprotena N, formando o complexo ribonucleoprotena (RNP).
3.1.2 Transcrio
Aps a penetrao e perda do envelope, o nucleocapsdeo (RNA + protena) serve de molde
para a transcrio, que realizada pela replicase viral. O complexo replicase formado pelas protenas L e P. A transcrio se inicia na extremidade 3, a partir de onde a transcriptase sintetiza a seqncia lder de 47 nt. Segue-se, ento, a transcrio individual e seqencial de cada gene, resultando em mRNAs individuais que possuem a estrutura cap na extremidade 5 e so poliadenilados na extremidade 3. A cada regio intergnica, a transcriptase faz uma pausa de aproximadamente 1 a 2 minutos e prossegue transcrevendo o gene seguinte. No entanto, apenas 70 a 80% das replicases prosseguem transcrevendo o prximo gene. As demais se dissociam do genoma e cessam a transcrio. Esse mecanismo de transcrio seqencial, acompanhado de reduo do nmero de transcriptases que prosseguem a sntese de RNA aps cada IR, gera um gradiente de transcrio que importante para a regulao da quantidade de mRNA produzido de cada gene. Assim,
Regio intergnica IR
Terminao
Iniciao
AUACUUUUUUUGAUUGUC UAUG AA
AA
m7
AACAG G
Lder = 47nt
IR
IR
IR
IR
N = 1333
3
AA AA
P = 821
M = 838
G = 1672
L = 6380
5
AA
A
AA
AA A
AA
AA A
AA
AA A
AA
AA
AA
AA
AA A
AA
AA A
AA
AA
AA
AA
AA A
AA
AA
AA
N mRNA
AA
P AA mRNA
AA
M mRNA
AA
G mRNA
AA
L mRNA
AA
Figura 7.6. Organizao do genoma e estratgia de transcrio do vrus da estomatite vesicular (VSV) da famlia Rhabdoviridae. O genoma representado pela linha contnua (as extremidades 3' e 5' e a seqncia lder esto indicados). Os blocos representam os genes, com o nmero respectivo de nucleotdeos. Acima do genoma est apresentada a seqncia comum das regies intergnicas (IR), com os sinais para a terminao e incio da transcrio dos genes subseqentes. Abaixo do genoma, esto representados os mRNAs produzidos pela transcrio seqencial dos genes. O nmero relativo de mRNAs decresce medida que a transcrio se distancia do seu incio. N) nucleoprotena; P) fosfoprotena; M) protena da matriz; G) glicoprotena do envelope; L) polimerase.
179
cada gene localizado na direo 5 do genoma transcrito por um nmero progressivamente menor de transcriptases, resultando em quantidades decrescentes de mRNAs. Esse mecanismo denominado atenuao da transcrio (transcription attenuation). (Figura 7.6).
3.1.3 Replicao do genoma

A replicao do genoma inicia em um determinado momento do ciclo, aps a sntese de quantidade suciente de protenas virais, principalmente de nucleoprotena. A replicao do genoma desses vrus ocorre em duas etapas e envolve a sntese de uma molcula de RNA complementar com a extenso total do genoma. A replicase no interrompe a transcrio a cada IR, ignorando os sinais de terminao da transcrio at a extremidade 5. Os mecanismos responsveis pela transio entre transcrio descontnua (sntese de mRNAs) e transcrio contnua (sntese de RNA complementar) no so completamente conhecidos, mas parecem ser dependentes do acmulo da protena N (e provavelmente a P) nas
N
mRNA
AA AA A
etapas iniciais do ciclo. Mltiplas cpias da protena N se conjugariam fortemente com o transcrito lder, provocando um sinal de antiterminao, que interferiria com a capacidade da replicase de reconhecer os sinais de terminao presentes no nal de cada gene, resultando na sntese de uma molcula de RNA complementar com a extenso do genoma (Figura 7.7). Outro modelo para a troca do modo de transcrio descontnua para a replicao sugere que dois complexos enzimticos diferentes seriam responsveis por cada um desses mecanismos. A fosforilao da protena P, que faz parte do complexo, converteria o complexo transcriptase (que realiza a transcrio descontnua) em complexo replicase (que realiza a transcrio contnua). O RNA antigenmico serve de molde para a sntese das cpias genmicas. Esse processo facilitado pela inexistncia de sinais de terminao da transcrio neste sentido do RNA. Tanto a sntese de RNA antigenmico como a de RNA genmico so seguidas pela imediata encapsidao dos RNAs recm-produzidos pela protena N. As etapas de transcrio e replicao do genoma do VSV esto ilustradas na Figura 7.7.
L
mRNA
AA AA AA A AA A
P
mRNA
AA AA A
M
mRNA
AA AA A
G
mRNA
RNA pol
Transcrio (1)
RNA genmico (-) 5 RNA pol RNA antigenmico (+)
5 5
Replicao (2)
Replicao (3)
RNA genmico (-) 3
Figura 7.7. Etapas da transcrio e replicao do genoma do vrus da estomatite vesicular (VSV). A linha contnua representa a molcula de RNA genmico, recoberta por mltiplas cpias da nucleoprotena. No incio do ciclo replicativo, a transcrio descontnua resulta em mRNAs individuais de cada gene (1). Em uma determinada etapa, com o acmulo da nucleoprotena (N), o complexo replicase realiza a sntese da molcula de RNA complementar (2), que serve de molde para a sntese de molculas de RNA genmico (3). Note que tanto o RNA genmico (-) quanto o RNA antigenmico ou complementar (+) permanecem recobertos por molculas da protena N (ou NP) durante os processos de transcrio e replicao. As etapas ilustradas acima so comuns aos vrus da ordem Mononegavirales.
180
Captulo 7
3.2 Vrus com o genoma segmentado

Vrus de trs famlias possuem este tipo de genoma: Orthomyxoviridae (7 ou 8 segmentos); Bunyaviridae (trs segmentos) e Arenaviridae (dois segmentos). Os ortomixovrus e a maioria dos buniavrus possuem o genoma inteiramente de sentido negativo, ou seja, as ORFs esto presentes no RNA complementar. O genoma dos arenavrus e de alguns buniavrus possui sentido ambissense, ou seja, contm algumas ORFs no sentido do RNA genmico e outras no sentido do RNA complementar. O genoma no traduzido diretamente, e esses vrus necessitam trazer a sua replicase nos vrions. Por isso so classicados como vrus RNA de sentido negativo. Os ortomixovrus possuem o genoma segmentado (inuenza A e B = oito segmentos; inuenza C = 7 segmentos) e replicam o genoma no ncleo da clula hospedeira. A replicao no ncleo faz desses vrus excees entre os vrus
RNA, juntamente com os bornavrus. A descrio a seguir abordar o vrus da inuenza A. O genoma do vrus da inuenza A constitui-se por oito segmentos de RNA de polaridade negativa, numerados de 1 a 8. Os segmentos 1 a 6 codicam uma protena cada; os segmentos 7 e 8 codicam duas protenas cada. Todos os segmentos genmicos apresentam a mesma organizao geral: possuem um gene (ou mais) na regio central, anqueada por seqncias altamente conservadas nas extremidades 3 (12 nt) e 5 (13 nt) (Figura 7.8). As regies terminais possuem sinais para o incio da transcrio e replicao. Cada segmento genmico encontra-se recoberto (encapsidado) por mltiplas cpias da protena NP e est associado com algumas protenas que formam o complexo polimerase-replicase. Esse complexo formado por trs protenas principais: PB1 (polimerase bsica 1); PB2 (polimerase bsica 2) e PA (polimerase cida). O complexo RNA + protenas associadas se denomina ribonucleoprotena (RNP) e permanece estvel durante a replicao.
Traduo
B. mRNA Cap-5---------GAGCGAAAGCAGG
8-13nt
AAA(n)-3
15-22nt Transcrio (1)
Cap-5---------GA 3-UCGCUUUCGUCC A. RNA genmico (-)
8-13nt
GGAACAAAGAUGA-5
Replicao
5-AGCGAAAGCAGG C. RNA antigenmico (+)
CCUUGUUUCUACU-3
Figura 7.8. Estrutura dos RNAs produzidos durante a replicao do vrus da influenza. A) RNA genmico (vRNA); B) mRNA; C) RNA antigenmico. A transcrio para a sntese de mRNA utiliza nucleotdeos com cap subtrados dos mRNA celulares (1). Os mRNA apresentam uma extenso de 8-13 nt (com cap) em relao ao vRNA e os 15-22 nucleotdeos terminais so substitudos por uma cauda poliA. A primeira etapa da replicao do genoma envolve a sntese do RNA de sentido antigenmico que exatamente complementar ao vRNA (2). A segunda etapa da replicao envolve a sntese do vRNA ou genmico a partir do RNA antigenmico (3). Note que os mRNAs diferem dos RNA antigenmicos, pela presena de 8-13 nt adicionais com cap e cauda poliA.
181
Cada segmento genmico transcrito individualmente pelo complexo transcriptase. O processo se inicia pela subtrao de seqncias de 8 a 13 nt, com cap na extremidade 5, de mRNAs celulares. Essa atividade atribuda PB1, ou seja, essa enzima literalmente furta os segmentos iniciais de mRNAs celulares. Esses nucleotdeos servem de primer para o incio da transcrio, alm de possurem a estrutura cap, que necessria para a traduo dos mRNA virais. A transcrio termina 15 a 22 nt antes da extremidade 5 de cada segmento, e seguida pela adio de uma cauda de poliA. Os mRNAs virais no so, portanto, exatamente complementares aos RNAs genmicos: possuem uma extenso de 8 a 13 nt em sua regio 5 e no possuem os 15-22 nt terminais, sendo substitudos por uma cauda poliA. A replicao dos RNA genmicos (vRNA) ocorre em duas etapas: sntese do RNA antigenmico (complementar) e sntese de RNA genmico (vRNA), utilizando o RNA antigenmico como molde. A sntese do RNA antigenmico no envolve a subtrao de nucleotdeos com cap de mRNA celulares; inicia-se exatamente na extremidade 3 do genoma e termina exatamente na extremidade 5. Dessa forma, o RNA antigenmico exatamente complementar ao RNA genmico. A transio entre a transcrio iniciada por primer + cap para a transcrio independente de primer + cap parece envolver complexos transcriptase/replicase diferentes. O acmulo da protena NP e alteraes especcas na composio do complexo polimerase seriam responsveis pela transio entre transcrio e replicao. A Figura 7.8 apresenta a estrutura dos vRNA, mRNA e RNAs antigenmicos produzidos durante a replicao dos vrus da inuenza A.
3.3 Vrus com o genoma ambissense

Os arenavrus e alguns buniavrus possuem genoma ambissense, ou seja, alguns genes so codicados no sentido do RNA complementar, enquanto outros so codicados no sentido do genoma, aps a sntese de mRNA, a partir da cpia complementar de RNA. Em outras palavras, as ORFs de alguns genes esto presentes no RNA
genmico (sentido positivo) e outras esto presentes no RNA complementar (sentido negativo). As ORFs que esto no sentido do genoma ocupam a metade 3 do genoma e no so traduzidas diretamente. Como o genoma no traduzido diretamente pelos ribossomos, esses vrus necessitam trazer, nos vrions, a sua enzima transcriptase/replicase e, por isso, so classicados juntamente com os vrus RNA de sentido negativo. Os arenavrus possuem dois segmentos de RNA como genoma: um segmento grande (large = L) e outro segmento pequeno (small = S). Cada um desses segmentos contm dois genes (Figura 7.9A). No segmento grande, o gene L possui polaridade negativa, ou seja, a sua ORF est presente no RNA complementar. Para que a protena seja expressa, esse gene transcrito pela polimerase viral, originando um mRNA, que , ento, traduzido (Figura 7.9B). Por outro lado, o gene Z possui polaridade positiva (a ORF est presente no RNA genmico do segmento L). No entanto, este gene no expresso pela traduo direta do genoma. A sua expresso somente ocorre aps a sntese do RNA complementar, a partir do qual o mRNA , ento, produzido (Figura 7.9B). A expresso deste gene segue o mesmo padro dos genes expressos atravs de mRNA subgenmicos, caractersticos de algumas famlias de vrus RNA. No segmento S, o gene NP possui polaridade negativa e a sua expresso depende da sntese de mRNA. O gene GP possui polaridade positiva e a sua expresso segue o mesmo padro do gene Z do segmento L: sntese do RNA complementar e transcrio do seu mRNA. A estratgia ambissense de codicao de protenas encontrada ainda em vrus de alguns gneros da famlia Bunyaviridae (Tospovrus e Phlebovrus). A replicao do genoma segue o padro dos outros vrus RNA e ocorre por intermdio de um RNA complementar de sentido antigenmico. A diferena que o RNA complementar serve de molde para a sntese do RNA genmico e tambm para a sntese do mRNA de um dos genes. Em resumo, os genomas ambissense possuem genes que so expressos de maneira semelhante aos genomas RNA de sentido negativo (as ORFs esto presentes no RNA complementar); e genes
182
Captulo 7
que so expressos como nos vrus RNA de sentido positivo (as ORFs esto presentes no sentido genmico, embora no sejam traduzidas diretamente).
4 Vrus com RNA de ta dupla

So conhecidas atualmente seis famlias de vrus que possuem RNA de ta dupla (ds RNA) como genoma, e apenas duas abrigam vrus que infectam vertebrados (Reoviridae e Birnaviridae); destas, apenas a primeira possui patgenos de mamferos. A famlia Reoviridae a maior e mais diversa dessas famlias, contendo importantes patgenos animais. O genoma desses vrus composto por 10, 11 ou 12 segmentos de dsRNA, dependendo do gnero. A maioria dos segmentos codica apenas uma protena, mas alguns podem codicar duas. Nos segmentos duplos de RNA, apenas uma das tas contm as ORFs codicantes de protenas. O complexo replicase trazido nos vrions, associado aos segmentos, e a sntese dos mRNA virais ocorre no interior dos capsdeos semi-ntegros.
A
L
3' -
Z
- 5'
Segmento grande (L) NP

3' -
GP
- 5'
Segmento pequeno (S) Protena Z
Traduo
3'Transcrio (3)
mRNA -5'
L
5' - 3'
4.1 Estrutura e organizao do genoma

Z
RNA complementar
Replicao (2) L
3' -
Z
- 5'
RNA genmico Transcrio (1) mRNA

5' - 3'
Traduo Protena L
Figura 7.9. Estrutura e expresso do genoma ambissense dos arenavrus. A) Organizao dos segmentos genmicos L (grande) e S (pequeno) com os respectivos genes; B) Estratgia de expresso gnica do segmento grande. O gene L possui sentido negativo e a sua expresso depende inicialmente da transcrio e sntese de mRNA (1). O gene Z possui sentido positivo, mas no expresso pela traduo direta do genoma. A sua expresso ocorre somente aps a sntese do RNA complementar (2). Este serve de molde para a transcrio e produo do mRNA correspondente (3). Os genes NP e GP do segmento S seguem os mesmos padres de expresso dos genes L e Z, respectivamente.
Os vrus do gnero Orthoreovirus possuem os prottipos da famlia Reoviridae, os reovrus no-fusognicos de mamferos. O genoma desses vrus composto por dez segmentos de dsRNA. Os segmentos genmicos so denominados de acordo com a sua migrao em gis de poliacrilamida (SDS-PAGE): L = grandes (L1, L2, L3); M = mdios (M1, M2 e M3) e S = pequenos (S1, S2, S3 e S4). Somente os segmentos S1 e M3 originam duas protenas, o restante codica apenas uma. Os dez segmentos dos orthoreovrus so lineares e possuem as extremidades livres. Embora se constituam em segmentos separados, algumas evidncias indicam que os segmentos genmicos encontram-se associados atravs de suas extremidades nas partculas vricas. Cada segmento de polaridade positiva possui uma estrutura cap (7-M-guanina) na extremidade 5, que provavelmente adicionado por enzimas virais no interior dos capsdeos. As extremidades 5 dos segmentos de polaridade negativa possuem um nucleotdeo difosfato. A cadeia codicante (e os mRNAs) possuem uma regio no-traduzida de
183
Gene (nt)
Cadeia (+) 5' 3'
L1=3854
Protena (aa)
3' 3 (1267) 5' pp Cadeia (-)
L2=3916 2 (1269) L3=3901 1 (1275) M1=2304 2 (736) M2=2203 1 (708) M3=2241 NS (721) + NSC (681) S1=1416 1 (455) + 1s (120) S2=1331 2 (418) S3=1198 NS (366) S4=1196 3 (365)
Figura 7.10. Organizao do genoma dos vrus do gnero Orthoreovirus da famlia Reoviridae. O genoma composto por 10 segmentos de RNA de fita dupla, sendo que apenas uma das cadeias codificante (sentido positivo). No segmento L1, so mostradas as duas cadeias, os demais mostram apenas a cadeia codificante. Os diferentes segmentos apresentam uma organizao semelhante, possuindo uma ORF central flanqueada por pequenas regies notraduzidas nas extremidades 5' e 3'. A nomenclatura e nmero de aminocidos de cada protena esto apresentados direita. Note que oito segmentos codificam apenas uma protena cada; os segmentos M3 e S1 codificam dois produtos cada.
12 a 32 nt prxima extremidade 5 e outra regio no-traduzida de 35 a 73 nt na extremidade 3, intercaladas por ORFs que possuem entre 365 e 1.289 nt (Figura 7.10). Essas regies no-codicantes possuem stios regulatrios da transcrio e traduo.
4.2 Transcrio
A transcrio inicial ocorre ainda no interior dos capsdeos, logo aps a penetrao dos vrions no citoplasma da clula hospedeira, e apenas as cadeias negativas so transcritas. Os mRNAs in-
dividuais so exatamente complementares aos RNA moldes: possuem 5 cap e no so poliadenilados. Por isso servem tanto para a traduo como de molde para a sntese do RNA complementar (Figura 7.11). Os mRNAs tardios, produzidos aps a replicao do genoma, constituem uma exceo por no receberem cap na extremidade 5. Os mRNAs so rapidamente exportados dos capsdeos e ganham acesso ao citoplasma para serem traduzidos. Em fases adiantadas do ciclo, j no interior de capsdeos recm-formados, ocorre um novo ciclo de transcrio com a produo de mais mRNA.
184
Captulo 7

A segunda etapa da replicao, a sntese das cadeias negativas, ocorre j em capsdeos pr-formados no citoplasma da clula hospedeira, em um local chamado de viroplasma, que constitui uma fbrica de vrus dentro da clula hospedeira. Para que isso ocorra, as protenas que formam os capsdeos j so produzidas em etapas iniciais do ciclo replicativo. Cada segmento de RNA (+) serve de molde para a sntese da cadeia complementar (-), que permanece pareada com o molde, restabelecendo, assim, a molcula genmica dsRNA. A sntese da cadeia negativa se inicia na extremidade 3 da molcula molde e prossegue at a extremidade 5. Por isso, as cadeias positivas e negativas so exatamente complementares (Figura 7.11).
diretamente. A replicao tambm no ocorre por meio de um intermedirio RNA, como nos outros vrus RNA. Ao contrrio, a replicao do genoma ocorre por meio de um intermedirio DNA. Parte das etapas de replicao do genoma ocorre no citoplasma e parte ocorre no ncleo da clula hospedeira. Resumindo, as principais peculiaridades do genoma e da replicao desses vrus so: a) o seu genoma diplide, ou seja, composto por duas molculas idnticas de RNA; b) o RNA genmico possui polaridade positiva, porm no traduzido em protenas; c) a replicao do genoma ocorre por meio da sntese de um intermedirio DNA (provrus), que incor-
Genoma
Cap
U5
.gag
pol
env
U3
AAAA
RNA
Transcrio reversa (1)
Genoma (ds)
RNA (+)
5' 3' 3' 5'
Provrus
.gag pol env
U3
U5
U3
U5 DNA
RNA (-)
Transcrio (1)
mRNA (+)
5' 3'
Integrao (2) Provrus Integrado

DNA celular
DNA
.gag pol env
U3
U5
U3
U5
DNA celular
Traduo (2)
RNA (+)
5' 3'
Replicao (3)
Transcrio (3)
3' 5'
Genoma
Cap
Protena
Genoma (ds)
RNA (-)
U5
.gag
pol
env
U3
AAAA
RNA
Figura 7.11. Etapas da expresso gnica e replicao dos vrus RNA de fita dupla. A fita negativa do genoma transcrita, originando RNAs de sentido positivo exatamente complementares (1). Estes RNAs podem ser traduzidos em protenas (2) e tambm servem de molde para a sntese da molcula de sentido negativo (3), restabelecendo a molcula genmica de dsRNA.
5 Retrovrus
Os retrovrus apresentam uma estratgia peculiar de replicao do genoma que difere dos demais vrus RNA (Figura 7.12). Embora esses vrus codiquem as suas protenas no sentido do genoma (por isso so considerados vrus RNA de sentido positivo), o genoma no traduzido
Figura 7.12. Ilustrao da estrutura e etapas da replicao do genoma dos retrovrus. O genoma constitudo por uma molcula de RNA de fita simples de 7 a 10 kb com 5'cap e poliA. Prximo s extremidades, o genoma possui duas regies repetidas R (5' e 3') e duas regies nicas (U5 e U3). Entre essas regies, localizam-se as seqncias codificantes: genes gag, pol e env. A primeira etapa da replicao sntese do provrus DNA (molcula de DNA de fita dupla correspondente ao genoma) pela enzima viral transcriptase reversa (1). O provrus contm as regies U3 e U5 duplicadas nas extremidades opostas e integrado aos cromossomos celulares pela ao da enzima viral integrase (2). Aps a integrao, o provrus transcrito pela RNA polimerase II celular (3) originando mRNAs idnticos ao genoma. Estes mRNAs servem para a traduo em protenas e tambm constituem o RNA genmico para serem encapsidados na prognie viral.
185
CAI, Z. et al. Robust production of infectious hepatitis C virus (HCV) from stably HCV cDNA-transfected human hepatoma cells. Journal of Virology, v.79, p.13963-13973, 2005. CHANDRAN, K. et al. Complete in vitro assembly of the reovirus outer capsid produces highly infectious particles suitable for genetic studies of the receptor-binding protein. Journal of Virology, v.75, p.5335-5342, 2001. CHANOCK, R.M.; MURPHY, B.R.; COLLINS, P.L. Parainuenza viruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.42, p.1341-1379. CLYDE, K.; HARRIS, E. RNA secondary structure in the coding region of dengue virus type 2 directs translation start codon selection and is required for viral replication. Journal of Virology, v.80, p.2170-2182, 2006. CORVER, J. et al. Fine mapping of a cis-acting sequence element in yellow fever virus RNA that is required for RNA replication and cyclization. Journal of Virology, v.77, p.2265-2270, 2003. DEVANEY, M.A. et al. Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the capbinding protein complex. Journal of Virology, v.62, p.4407-4409, 1988. DORNER, A.J. et al. In vitro translation of poliovirus RNA: utilization of internal initiation sites in reticulocyte lysate. Journal of Virology, v.50, p.507-514, 1984. EDGIL, D.; POLACEK, C.; HARRIS, E. Dengue virus utilizes a novel strategy for translation initiation when cap-dependent translation is inhibited. Journal of Virology, v.80, p.2976-2986, 2006. ELTON, D. et al. Interaction of the inuenza virus nucleoprotein with the cellular CRM1-mediated nuclear export pathway. Journal of Virology, v.75, p.408-419, 2001. ETCHISON, D. et al. Inhibition of HeLa cell protein synthesis following poliovirus infection correlates with the proteolysis of a 220,000-dalton polypeptide associated with eucaryotic initiation factor 3 and a cap binding protein complex. The Journal of Biological Chemistry, v.257, p.14806-14810, 1982. ETCHISON, D.; FOUT, S. Human rhinovirus 14 infection of HeLa cells results in the proteolytic cleavage of the p220 cap-binding complex subunit and inactivates globin mRNA translation in vitro. Journal of Virology, v.54, p.634-638, 1985. FIELDS, B.N.; GREEN, M.I. Genetic and molecular mechanisms of viral pathogenesis: implications for prevention and treatment. Nature, v.300, p.19-23 (1982). FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. Cap.6, p.162-196. FREED, E.O. HIV-1 replication. Somatic cells and molecular genetics, v.26, p.13-33, 2001.
porado aos cromossomos celulares; d) o provrus integrado transcrito, originando mRNAs para a sntese protica e para serem incorporados como genoma na prognie viral; e) as etapas iniciais da replicao do genoma ocorrem no citoplasma e so mediadas por enzimas virais (transcritase reversa); f) as etapas seguintes ocorrem no ncleo e so mediadas por enzimas virais (integrao = integrase, IN) e celulares (transcrio = RNA pol II celular); g) o genoma dos retrovrus o nico genoma viral sintetizado exclusivamente por enzimas e fatores celulares. Por isso, a sua estrutura idntica aos mRNA celulares: possui cap na extremidade 5 e poliadenilado na extremidade 3. As principais etapas da replicao do genoma dos retrovrus e a estrutura das molculas intermedirias esto ilustradas na Figura 7.12. Maiores detalhes sobre a expresso gnica e replicao do genoma podem ser encontrados no Captulo 31.
ALVAREZ, D.E. et al. Long-range RNA-RNA interactions circularize the dengue virus genome. Journal of Virology, v.79, p.6631-6643, 2005. BALL, L.A. Replication strategies of RNA viruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.5, p.105-118. BALVAY, L. et al. Translational control of retroviruses. Nature Reviews. Microbiology, v.5, p.128-140, 2007. BELSHAM, G.J.; BRAGWYN, J.K. A region of the 5 noncoding region of foot-and-mouth disease virus RNA directs efcient internal initiation of protein synthesis within cells: involvement with the role of L protease in translational control. Journal of Virology, v.64, p.5389-5395, 1990. BISHOP, D.H.L. Arenaviruses have ambisense S RNA. Medical Microbiology and Immunology, v.175, p.61-62, 1986. BLYN, L.B. et al. Host cell proteins binding to domain IV of the 5 noncoding region of poliovirus RNA. Journal of Virology, v.69, p.4381-4389, 1995. BRIAN, D.A. et al. Role of subgenomic minus-strand RNA in coronavirus replication (1994). Archives of Virology, v.9, p.173180, 1994. BROWN, E.A. et al. The 5 nontranslated region of hepatitis A virus RNA: secondary structure and elements required for translation in vitro. Journal of Virology, v.65, p.5828-5838, 1991.
186
GAMARNIK, A.V.; ANDINO, R. Switch from translation to RNA replication in a positive stranded RNA virus. Genes and Development, v.12, p.2293-2304, 1998. GERBER, K.; WIMMER, E.; PAUL, A.V. Biochemical and genetic studies of the initiation of human rhinovirus 2 RNA replication: identication of a cis-replicating element in the coding sequence of 2A pro. Journal of Virology, v.75, p.10979-10990, 2001. GOFF, S.P. Retroviridae: the retroviruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.57, p.1871-1939. GONZALEZ-SCARANO, F.; NATHANSON, N. Bunyaviridae. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.48, p.1473-1504. GOOGFELLOW, I. et al. Identication of a cis-acting replication element within the poliovirus coding region. Journal of Virology, v.74, p.4590-4600, 2000. HELLEN, C.U.; PESTOVA, T.V.; WIMMER, E. Effect of mutations downstream of the internal ribosome entry site on initiation of poliovirus protein synthesis. Journal of Virology, v.68, p.63126322, 1994. HEROLD, J.; ANDINO, R. Functional circularization of a positive stranded RNA virus: a new model for the initiation of negative strand RNA synthesis. In: MEETING OF THE EUROPEAN STUDY GROUP ON THE MOLECULAR BIOLOGY OF PICORNAVIRUSES, 11. Gargano, Italy, May 2000. Proceedings... [S.I.]: Europic 2000. Abstract G09. JANG, S.K. et al. A segment of the 5 nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. Journal of Virology, v.62, p.2636-2643, 1988. JAY, M.T.; GLASER, C.; FULHORST, C.F. The arenaviruses. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.227, p.904-915, 2005. JURGENS, C.K. et al. 2Apro is a multifunctional protein that regulates the stability, translation and replication of poliovirus RNA. Virology, v.345, p.346-357, 2006. KOBAYASHI, T. et al. Gene-specic inhibition of reovirus replication by RNA interference. Journal of Virology, v.80, p.9053-9063, 2006. LAMB, R.A.; KOLAKOFSKY, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.41, p.1305-1340. LAMB, R.A.; KRUG, R.M. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.46, p.1487-1531.
Captulo 7
LOPEZ DE QUINTO, S.; LAFUENTE, E.; MARTNEZ-SALAS, E. IRES interaction with translation initiation factors: functional characterization of novel RNA contacts with eIF3, eIF4B, and eIF4GII. RNA, v.7, p.1213-1226, 2001. MARTIN, A.; STAEHELI, P.; SCHNEIDER, U. RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efcacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication. Journal of Virology, v.80, p.5708-5715, 2006. MASON, P.W.; BEZBOROVA, S.V.; HENRY, T.M. Identication and characterization of a cis-acting replication element (cre) adjacent to the internal ribosome entry site of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, v.76, p.9686-9694, 2002. MIR, M.A.; PANGANIBAN, A.T. Characterization of the RNA chaperone activity of hantavirus nucleocapsid protein. Journal of Virology, v.80, p.6276-6285, 2006. MOLLA, A.; PAUL, A.V.; WIMMER, E. Cell-free, de novo synthesis of poliovirus. Science, v.254, p.1647-1651, 1991. MURPHY, F.A. et al. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. Cap.31, p.469-483. NAYAK, D.P.; HUI, E.K.; BARMAN, S. Assembly and budding of inuenza virus. Virus Research, v.106, p.147-165, 2004. NIBERT, M.L.; SCHIFF, L.A. Reoviruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.52, p.1679-1728. PAUL, A.V. Possible unifying mechanism of picornavirus genome replication. In: SEMLER, B.L.; WIMMER, E. (Ed). Molecular biology of picornaviruses. Washington, D.C.: ASM Press, 2002. p.227-246. PELLETIER, J.; SONENBERG, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, v.334, p.320-325, 1988. PESTOVA, T.V.; HELLEN, C.U.T.; SHATSKY, I.N. Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Molecular and Cellular Biology, v.16, p.6859-6869, 1996. PICCONE, M.E. et al. Expression in Escherichia coli and purication of biologically active L proteinase of foot-and-mouth disease virus. Virus Research, v.35, p.263-275, 1995. PLYUSNIN, A.; VAPALAHTI, O.; VAHERI, A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution. The Journal of General Virology, v.77, p.2677-2687, 1996. RONG, S. Characterization of a highly virulent feline calicivirus and attenuation of this virus. Virus Research, v.122, p.95-108, 2006. ROSE, J.K.; WHITT, M.A. Rhabdoviridae: The viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields
187
SVITKIN, Y.V.; SONENBERG, N. Cell-free synthesis of encephalomyocarditis virus. Journal of Virology, v.77, p.65516555, 2003. SVITTKIN, Y.V. et al. Eukaryotic translation initiation factor 4E availability controls the switch between cap-dependent and internal ribosomal entry site-mediated translation. Molecular and Cellular Biology, v.25, p.10556-10565, 2005. THIEL, V. et al. Mechanisms and enzymes involved in SARS coronavirus genome expression. The Journal of General Virology, v.84, p.2305-2315, 2003. TILGNER, M.; DEAS, T.S.; SHI, P.Y. The avivirus-conserved penta-nucleotide in the 3 stem-loop of the West Nile virus genome requires a specic sequence and structure for RNA synthesis, but not for viral translation. Virology, v.331, p.375386, 2005. TODD, S.; TOWNER, J.S.; SEMLER, B.L. Translation and replication properties of the human rhinovirus genome in vivo and in vitro. Virology, v.229, p.90-97, 1997. TSUKIYAMA-KOHARA, K. et al. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA. Journal of Virology, v.66, p.14761483, 1992. VAN OOIJ, M.J.M. et al. Structural and functional characterization of the coxsackievirus B3 CRE(2C): role of CRE(2C) in negativeand positive-strand RNA synthesis. The Journal of General Virology, v.87, p.103-113, 2006. YE, J. et al. Molecular pathology in the lungs of severe acute respiratory syndrome patients. The American Journal of Pathology, v.170, p.538-545, 2007. YU, H.; GRASSMANN, C.W.; BEHRENS, E. Sequence and structural elements at the 3 terminus of bovine viral diarrhea virus genomic RNA: functional role during RNA replication. Journal of Virology, v.73, p.3638-3648, 1999.
virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.38, p.1221-1244. RUST, R.C. et al. Cellular COPII proteins are involved in production of the vesicles that form the poliovirus replication complex. Journal of Virology, v.75, p.9808-9818, 2001. SANCHEZ, A. et al. Filoviridae: marburg and ebola viruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.40, p.1279-1304. SCHMALJOHN, C.S.; HOOPER, J.W. Bunyaviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.48, p.1581-1602. SCHNEIDER, U. Novel insights into the regulation of the viral polymerase complex of neurotropic Borna disease virus. Virus Research, v.111, p.148-160, 2005. SCHROEDER, R.; BARTA, A.; SEMRAD, K. Strategies for RNA folding and assembly. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, v.5, p. 908-919, 2004. SOUTHERN, P.J. Arenaviridae: the viruses and their replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.49, p.1505-1519. STASSINOPOULOS, I.A.; BELSHAM, G.J. A novel protein RNA binding assay: functional interactions of the foot-and-mouth disease virus internal ribosome entry site with cellular proteins. RNA, v.7, p.114-122, 2001. SVITKIN, Y.V. et al. Complete translation of the hepatitis C virus genome in vitro: membranes play a critical role in the maturation of all virus proteins except for NS3. Journal of Virology, v.79, p.6868-6881, 2005.
PATOGENIA DAS INFECES VRICAS

Eduardo Furtado Flores1
8
191 191 193
193 196 196
1 Introduo
1.1 Conceitos bsicos
2 Patologia em nvel celular

2.1 Interaes dos vrus com as clulas 2.2 Efeitos da replicao viral nas clulas hospedeiras 2.3 Apoptose por vrus
3 Patogenia em nvel de hospedeiro

3.1 Penetrao e replicao primria 3.1.1 Pele e mucosas superciais 3.1.2 Trato respiratrio 3.1.3 Orofaringe e trato digestivo 3.1.4 Mucosa urogenital 3.2 Infeces localizadas versus infeces disseminadas (ou sistmicas) 3.2.1 Disseminao local 3.2.2 Disseminao hematgena 3.2.3.Disseminao nervosa 3.3 Localizao das infeces 3.3.1 Infeces em rgos e sistemas especcos 3.3.2 Infeces da pele e tegumento 3.3.3 Infeces do trato respiratrio 3.3.4 Infeces do trato digestivo 3.3.5 Infeces do sistema nervoso central 3.3.6 Infeces do sistema linforreticular e hematopoitico 3.3.7 Infeco fetal
197
197 197 199 200 201 202 202 202 207 209 209 211 212 213 215 217 218
4 Padres principais de infeco

4.1 Infeces agudas
220
221
Colaboraram em sees especcas: Janice Ciacci Zanella (Apoptose por vrus); Luiz Carlos Kreutz (Padres principais de infeco) e Mariana S e Silva (Imunopatologia em infeces vricas).
1
4.2 Infeces persistentes (ou crnicas) 4.2.1 Infeces latentes 4.2.2 Infeces persistentes ou crnicas 4.2.3 Infeces persistentes temporrias 4.3 Mecanismos envolvidos na manuteno das infeces persistentes 4.3.1 Restrio do efeito citopatognico 4.3.2 Infeco de clulas semipermissivas 4.3.3 Infeco de um pequeno nmero de clulas 4.3.4 Manuteno do genoma viral nas clulas hospedeiras 4.3.5 Evaso da resposta imune do hospedeiro
212 222 222 223 225 225 225 226 226 226
5 Oncognese por vrus

5.1 Oncognese por retrovrus 5.2 Pequenos vrus DNA tumorignicos
226
226 227
6 Imunopatologia em infeces vricas

6.1 Imunopatologia mediada por imunocomplexos 6.2 Imunopatologia mediada por linfcitos T citotxicos 6.3 Imunopatologia por induo de auto-imunidade
228
229 230 230
7 Imunossupresso por vrus

7.1 Replicao viral em clulas envolvidas na resposta imunolgica 7.2 Imunossupresso associada com a ativao do sistema imune 7.3 Produtos de moncitos e linfcitos ativados 7.4 Protenas virais
230
231 232 232 232
234
1 Introduo
O termo patogenia ou patognese , aplicado s infeces vricas, refere-se ao conjunto de mecanismos pelos quais os vrus produzem doena em seus hospedeiros (pato = doena, gnese = origem, produo). A denio de doena como sendo qualquer manifestao resultante de alteraes da siologia do organismo abrange um leque muito amplo de condies. Manifestaes patolgicas incluem desde aumentos leves da temperatura corporal, alteraes de nimo e apetite, at condies severas que, eventualmente, resultam na morte do hospedeiro. Na maioria das doenas, a patogenia multifatorial, resultante da alterao de fatores endgenos ou exgenos, raramente determinadas por um fator nico. Com as infeces vricas no diferente, pois as conseqncias dependem das interaes entre inmeros fatores do agente e do hospedeiro. Grande parte dos sinais clnicos observados nas doenas vricas conseqncia da resposta do hospedeiro injria celular e tecidual. Por sua vez, essa injria pode resultar de efeitos diretos ou indiretos da replicao viral ou pode, ainda, ser conseqncia da resposta imune do hospedeiro contra as clulas infectadas. De fato, a patogenia de vrias doenas vricas est mais intimamente ligada aos mecanismos imunolgicos do hospedeiro do que s conseqncias diretas da replicao viral nos tecidos. Em resumo, a patogenia das infeces vricas determinada pela combinao entre os efeitos diretos e indiretos da replicao viral e as respostas do hospedeiro infeco. Os mecanismos pelos quais os vrus produzem doenas em seus hospedeiros podem ser examinados em diferentes nveis. As clulas so as unidades fundamentais do organismo, nas quais os vrus se multiplicam. Por isso, as clulas se constituem nos locais de origem dos eventos ligados infeco vrica que podem resultar em doena. A replicao dos vrus, muitas vezes, interfere com mecanismos siolgicos essenciais da clula hospedeira, alterando as suas funes em benefcio da replicao viral. A alterao de processos celulares envolvidos na biossntese de macromolculas e na manuteno da homeostase celular, por exemplo, podem resultar em disfun-
o e at morte celular. Outras vezes, produtos da replicao viral podem ser txicos para a clula hospedeira. Essas alteraes esto freqentemente envolvidas na origem de processos patolgicos observados no organismo. Uma infeco pode resultar em absoluta ausncia de efeitos deletrios sobre as clulas e, conseqentemente, na ausncia de manifestaes clnicas; ou pode resultar em efeitos celulares graves, acompanhados de sinais clnicos severos e morte do hospedeiro. No hospedeiro, a complexidade de interaes que pode ou no resultar em doena muito maior, e ainda acrescida da participao dos componentes celulares e humorais da resposta imunolgica e de outros sistemas encarregados de manter a homeostasia e integridade do organismo. Ao contrrio do que se imagina, a ocorrncia de doena clnica em infeces vricas um evento pouco freqente, considerando-se a totalidade das infeces. Ou seja, a maioria das infeces por vrus no resulta em alteraes orgnicas que se manifestem com sinais perceptveis clinicamente. A ocorrncia ou no de doena em uma determinada infeco vrica depende da interao entre inmeros fatores do agente e do hospedeiro, na qual os mecanismos imunolgicos, destinados a manter a integridade e funcionalidade do organismo, desempenham um papel fundamental. A Figura 8.1 ilustra esquematicamente a relao entre infeco e doena em nvel celular e de hospedeiro, com as conseqncias derivadas da replicao nos diferentes nveis.
1.1 Conceitos bsicos

O termo patogenicidade se refere capacidade de um determinado agente produzir doena no hospedeiro. Vrus altamente patognicos so aqueles capazes de produzir doena em uma grande parcela dos hospedeiros infectados. Como a patogenia das infeces depende tambm das reaes do organismo, a patogenicidade de um vrus modulada por suas interaes com o hospedeiro. O termo virulncia, muitas vezes utilizado como sinnimo de patogenicidade, se refere ao nvel de severidade da doena causada por um agente. Os vrus altamente virulentos causam doena grave; enquanto vrus avirulentos ou pouco virulentos (atenuados) no causam
192
Captulo 8
PERCEPTVEIS VISUALMENTE
Efeito em nvel celular
Efeito no hospedeiro
Lise celular
Morte do hospedeiro
Disfuno celular, efeito citoptico ou transformao celular
Doena clssica e severa
Doena leve ou moderada
Replicao viral sem alteraes celulares visveis, ou danos teciduais restritos Exposio sem infeco
Infeco sem sinais clnicos (assintomtica)
Exposio sem infeco
Conceito iceberg das infeces
Figura 8.1. O conceito iceberg das infeces vricas. Note que a maioria das infeces vricas no resulta em efeitos perceptveis em nvel de hospedeiro. As manifestaes clnicas, quando ocorrem, constituem-se em reflexos da disfuno e patologia em nvel celular e tecidual.
doena, ou causam doena leve, respectivamente. A virulncia de um vrus pode ser medida de vrias formas, incluindo o percentual de animais que adoece ou morre aps inoculao experimental, grau de severidade dos sinais clnicos, nvel e intensidade de alteraes histolgicas, entre outras. A virulncia dos vrus determinada geneticamente e pode variar entre isolados de uma mesma espcie viral. No entanto, fatores do hospedeiro podem interferir com e modular a virulncia desses agentes. Embora em alguns vrus a virulncia possa ser mapeada em um ou poucos genes, para a maioria dos vrus essa uma caracterstica multifatorial. Em geral, os genes virais envolvidos na virulncia podem ser divididos em quatro classes: a) genes cujos produtos afetam a capacidade replicativa do vrus; b) produtos gnicos que inuenciam a capacidade do vrus se disseminar no hospedeiro; c) produtos virais que se contrapem resposta imunolgica do hospedeiro e d) produtos virais txicos para a clula
e/ou hospedeiro. Muitos genes virais podem se enquadrar em mais de uma classe, afetando a virulncia de mais de uma forma. A identicao dos genes envolvidos na determinao da virulncia dos vrus de importncia em sade humana e animal um dos maiores desaos da Virologia, pois pode permitir a manipulao gentica desses agentes com ns vacinais e/ou teraputicos. No entanto, essa nem sempre uma tarefa fcil, pela complexidade das interaes vrus-clula, falta de sistemas apropriados ou modelos animais adequados e pela diculdade de se estudar virulncia em cultivos celulares. O termo susceptibilidade se refere s condies oferecidas pelo hospedeiro para a ocorrncia da infeco e doena. Por outro lado, resistncia a oposio oferecida pelo hospedeiro instalao da infeco. A susceptibilidade e resistncia de um hospedeiro a um vrus so determinadas geneticamente e podem variar entre indivduos de uma mesma espcie, de acordo com fatores como: raa, idade, sexo, condio corporal, estado sio-
INFECO SUBCLNICA
VISUALMENTE IMPERCEPTVEIS
DOENA CLNICA
Patogenia das infeces vricas
193
lgico etc. A resistncia infeco pode ser devida a mecanismos naturais (resistncia natural ou inata) ou adquiridos (resistncia adquirida). O termo imunidade muito utilizado para designar a resistncia, principalmente a resistncia adquirida. O termo refratariedade se refere a um grau de resistncia absoluta a um determinado agente, e uma caracterstica da espcie animal, e no do indivduo. O tropismo a predileo de um vrus por determinadas clulas ou tecidos e pode ser determinado por uma variedade de fatores celulares que so necessrios para a replicao viral. O principal fator determinante do tropismo e que possui inuncia direta no padro de distribuio e localizao das infeces a presena de receptores especcos para o vrus. Maiores detalhes sobre os mecanismos envolvidos com o tropismo celular dos vrus sero abordados ao longo do texto.
nes virais na clula hospedeira ou por alteraes nas funes de genes celulares encarregados do controle do ciclo celular.
2.1 Interaes dos vrus com as clulas

A maioria das alteraes da siologia celular resultantes da replicao viral se deve a efeitos secundrios das interaes entre os produtos virais e componentes celulares; interaes estas que so necessrias para a multiplicao dos vrus. Os efeitos txicos especcos de alguns produtos virais e o acmulo excessivo de protenas e cidos nuclicos virais tambm podem levar injria celular. As interaes que resultam em alterao na siologia celular podem ocorrer em qualquer etapa do ciclo replicativo. A penetrao dos adenovrus em clulas de cultivo acompanhada por despreendimento das clulas da superfcie de contato. Esse evento deve-se ligao da protena penton dos vrions s molculas de integrinas da membrana das clulas. Essa ligao altera as interaes das integrinas com outras protenas da membrana celular, necessrias para a aderncia das clulas superfcie do frasco. A protena M2 dos vrus da inuenza produz canais inicos na membrana dos endossomos durante o processo de internalizao do vrus, atravs dos quais prtons H+ penetram para o interior das vesculas endossmicas, acidicando o pH e facilitando o processo de fuso/penetrao e desnudamento do nucleocapsdeo. No entanto, as possveis conseqncias desse evento, para a siologia celular, so desconhecidas. Alguns vrus interferem com os mecanismos de transcrio, processamento (splicing) e transporte de RNA mensageiros (mRNA) celulares, estratgias que visam a favorecer a traduo dos mRNA virais. Os adenovrus e herpesvrus inibem a maturao e a exportao de mRNA celulares para o citoplasma; os vrus da inuenza provocam a clivagem de mRNA celulares para utilizar a extremidade 5 com cap para os seus mRNA. Produtos dos vrus da inuenza, herpesvrus e poxvrus promovem a degradao de mRNA celulares (Tabela 8.1). Outros vrus alteram a especicidade ou subvertem a maquinaria celular de traduo
2 Patologia em nvel celular

A compreenso da patogenia das doenas vricas depende do conhecimento dos mecanismos envolvidos em diferentes nveis. Os vrus necessitam das macromolculas e de processos biossintticos da clula hospedeira para se multiplicar. As interaes entre o vrus e os componentes celulares so complexas e, muitas vezes, resultam em alteraes da siologia celular, podendo levar injria e at mesmo morte da clula. As patologias celulares associadas com a replicao viral se constituem em um dos principais mecanismos de produo das doenas. Em nvel celular, as infeces vricas podem resultar em uma variedade de condies, a saber: a) infeco no-produtiva, com bloqueio em uma das etapas intracelulares da replicao, seguida ou no de injria e morte celular; b) estabelecimento de infeco latente, com limitada expresso gnica viral e persistncia do genoma viral na clula hospedeira; c) infeco produtiva, com produo de prognie viral infecciosa, acompanhada de patologia ou morte celular; d) infeco produtiva persistente, em que a clula sobrevive e segue produzindo vrus em nveis baixos por longos perodos e, at mesmo, indenidamente; f) oncognese, seja pela incorporao de oncoge-
194
Captulo 8
Tabela 8.1. Protenas virais responsveis por efeitos especficos sobre mecanismos e estruturas das clulas hospedeiras Vrus Protena(s)
2A
pro
Efeito
Inibio da traduo cap-dependente Inibio do trfego protico RER-Golgi Proliferao de vesculas membranosas Alterao do mecanismo da MAP4 Inibio da transcrio Aumento da permeabilidade da membrana plasmtica Fuso entre clulas formao de sinccios Bloqueio na acumulao de mRNAs celulares no citoplasma Inibio da traduo cap-dependente Desmontagem dos polissomas Inibio do transporte e processamento de mRNA celular Despolimerizao do citoesqueleto
Alvo
elF-4G Desconhecido Desconhecido MAP4 Tbp, Complexo Tfflc Na, K-ATPase? Membrana plasmtica Protena celular envolvida no transporte de mRNA elF-4E mRNA celular
2A, 3A Poliovrus 2B, 2C Desconhecida 3C Vrus Sindbis Paramixovrus Desconhecida F E1B-55K, E4-34K Adenovrus Desconhecida Herpesvrus Vrus do herpes simplex Vrios vrus Produto do gene vhs (ribonuclease)
ICP 27 Desconhecida
Desconhecido Filamentos de actina.
para a produo de suas protenas, em detrimento das protenas celulares. A inibio da traduo de mRNA celulares, e no de mRNA virais, uma forma de subverso utilizada pelos vrus para favorecer a sntese de suas protenas. Esses mecanismos so utilizados por vrios vrus, incluindo o vrus da estomatite vesicular (VSV), o poliovrus, o vrus da febre aftosa (FMDV), os adenovrus, entre outros. Essa interferncia pode ter efeitos deletrios para a clula hospedeira, que tem a sua sntese protica reduzida ou mesmo suprimida. A inibio da sntese de DNA celular outro mecanismo utilizado por vrus RNA e DNA durante a sua replicao. Essa inibio pode proporcionar uma disponibilidade maior de precursores (nucleotdeos), protenas e estruturas celulares para a sntese dos cidos nuclicos virais e replicao do genoma. possvel tambm que a inibio da sntese de DNA celular, em alguns casos, seja uma mera conseqncia da inibio da sntese protica da clula hospedeira pelo vrus.
Por outro lado, alguns vrus (poliomavrus, papilomavrus e adenovrus) estimulam as clulas a entrar em fase S, com ativao da sntese de DNA e subseqente diviso celular. Essa estratgia tem por m estimular a clula a fornecer condies e componentes (nucleotdeos, enzimas replicativas e fatores de replicao) necessrios replicao do genoma viral. Como conseqncia, a clula hospedeira passa a oferecer as condies necessrias replicao viral. Essa interferncia com a regulao do ciclo celular, algumas vezes, pode levar transformao tumoral dessas clulas. A apoptose ou morte celular programada um mecanismo de morte celular em resposta a vrios estmulos, inclusive infeces vricas. Tem sido demonstrado que vrios vrus so capazes de desencadear a cascata de reaes que leva apoptose da clula hospedeira. Por outro lado, vrios vrus possuem produtos que inibem ou retardam a apoptose, prolongando, assim, a vida da clula e permitindo a concluso do seu ciclo replicativo.
195
Protenas virais podem tambm interferir com mecanismos celulares de modicao, localizao e maturao de protenas, podendo resultar em citopatologia. As glicoprotenas do envelope, em especial, so alvos de extensivas modicaes ps-traduo, maturao e transporte por mecanismos celulares, e a sua abundncia pode interferir com os processos celulares de processamento de protenas endgenas. A alterao da estrutura de membranas celulares, resultando em fuso e/ou alterao da permeabilidade, tambm so efeitos da replicao de vrios vrus. Diversos vrus com envelope possuem glicoprotenas que so necessrias para promover a fuso do envelope com a membrana celular, permitindo a sua penetrao na clula hospedeira. A expresso dessas protenas em clulas infectadas pode resultar em fuso entre clulas vizinhas, resultando na formao de massas citoplasmticas multinucleadas denominadas sinccios. A fuso entre clulas vizinhas tambm possvel pela ao direta das glicoprotenas virais no processo de penetrao. A fuso celular uma forma de citopatologia produzida por vrus, mas tambm pode ser considerada uma forma de disseminao do vrus entre clulas. Os produtos de alguns vrus produzem um aumento na permeabilidade da membrana plasmtica da clula infectada. Em decorrncia disso, o aumento da concentrao de ons sdio na clula pode favorecer a traduo de mRNA virais. Ento, para alguns vrus, o aumento da permeabilidade da membrana pode favorecer a sntese preferencial de protenas virais. A infeco por diversos vrus pode provocar a desorganizao ou mesmo a ruptura do citoesqueleto da clula hospedeira. Uma reduo na quantidade de lamentos de actina tem sido observada na infeco por vrios vrus, incluindo o vrus do herpes simplex humano (HSV), vrus da cinomose (CDV) e VSV, entre outros. As conseqncias da desorganizao do citoesqueleto no so bem claras, mas provavelmente possuem relao com algumas alteraes morfolgicas observadas em clulas infectadas. provvel que as alteraes na estrutura e funo do citoesqueleto sejam efeitos secundrios da replicao viral e da interferncia do vrus com outras funes celulares.
A replicao de alguns vrus resulta na formao de estruturas com morfologia mais ou menos denidas no citoplasma ou no ncleo da clula infectada. Essas estruturas so denominadas genericamente corpsculos de incluso e so formadas pelo acmulo de complexos de transcrio e replicao, produtos intermedirios da replicao, protenas estruturais e no-estruturais, capsdeos, nucleocapsdeos e vrions em determinados locais da clula. A localizao dos corpsculos de incluso reete o local de replicao do respectivo vrus. Os corpsculos de Negri so formados no citoplasma de neurnios infectados pelo vrus da raiva; os corpsculos citoplasmticos de Lenz so caractersticos da infeco pelo CDV. A replicao dos reovrus acompanhada da formao de grandes estruturas citoplasmticas denominadas virossomos, que podem ocupar grande parte do citoplasma. Os virossomos so os locais de acmulo de cidos nuclicos e protenas virais e onde ocorrem os mecanismos de replicao do genoma e montagem das partculas vricas. A replicao dos herpesvrus neuropatognicos (herpesvrus bovino tipo 5 [BoHV-5], vrus da doena de Aujeszky [PRV]) resulta na formao de corpsculos nucleares em neurnios do sistema nervoso central (SNC). A presena de corpsculos de incluso tem sido utilizada no diagnstico histopatolgico de algumas viroses, pela facilidade de observao e pelas suas caractersticas tintoriais (podem ser basoflicos ou acidoflicos). Pelo exposto, ca evidente que as interaes entre os produtos virais e os componentes celulares, durante o ciclo replicativo dos vrus, so extremamente complexas e podem resultar em uma variedade de alteraes da siologia celular. Grande parte dessas alteraes foi investigada e caracterizada em clulas de cultivo. Conseqentemente as informaes provenientes desses estudos devem ser analisadas com cautela. No obstante, possvel que grande parte das alteraes observadas in vitro ocorra tambm in vivo. provvel tambm que as interaes entre os vrus e as clulas hospedeiras sejam ainda mais complexas no animal, pela participao de componentes orgnicos ausentes nos frascos de cultivo. Nesse sentido, os componentes celulares e humorais do sistema imunolgico (citocinas e anticorpos) de
196
Captulo 8
outros sistemas de defesa e tambm do sistema endcrino do hospedeiro certamente possuem participao importante nas interaes dos hospedeiros com esses agentes invasores. Exemplos de protenas virais que interferem com mecanismos especcos das clulas hospedeiras esto apresentados na Tabela 8.1.
2.2 Efeitos da replicao viral nas clulas hospedeiras

A replicao dos vrus nas clulas hospedeiras freqentemente resulta em alteraes na siologia celular, tanto pela interferncia com processos metablicos e estruturas celulares quanto pela ao txica de produtos da replicao viral. Em particular, a interferncia com a sntese de macromolculas pode afetar negativamente a siologia celular e, freqentemente, resulta em patologia. Essas alteraes podem ser detectadas visual ou bioquimicamente e tem sido mais caracterizadas em clulas de cultivo. As alteraes morfolgicas, associadas com a replicao de vrus em clulas de cultivo, so denominadas coletivamente de efeito citoptico ou citopatognico (ECP). Como cada grupo de vrus pode afetar funes e mecanismos celulares diferentes, o tipo de ECP produzido tambm caracterstico de cada espcie ou grupo de vrus. A patologia mais extrema a lise ou destruio celular, e os vrus que a induzem so denominados citolticos. A lise celular caracterizada pela morte e desintegrao celular, freqentemente devida absoro excessiva de lquido extracelular. Alguns vrus produzem alteraes morfolgicas, como citomegalia ou arredondamento celular. A citomegalia pode ser devida absoro de lquido, enquanto o arredondamento geralmente conseqncia de alteraes na estrutura e funo das bras do citoesqueleto. Alteraes no citoesqueleto tambm resultam em desprendimento das clulas do substrato, efeito que pode ocorrer em estgios avanados de patologia celular, por mecanismos diversos. Os vrus que possuem glicoprotenas fusognicas no envelope promovem fuso celular, com a formao de clulas gigantes multinuleadas, denominadas sinccios. Clulas fusiona-
das possuem vida curta e eventualmente sofrem lise. A formao de vacolos outro tipo de ECP produzido por vrus que replicam no citoplasma. Corpsculos de incluso citoplasmticos ou nucleares tambm so formados como resultado da replicao de alguns vrus e podem ser observados sob microscopia tica. Embora a lise celular seja o mecanismo mais atraente e fcil para explicar as patologias induzidas pelos vrus nos seus hospedeiros, certamente no se constitui no nico mecanismo responsvel pela produo das doenas. Vrus no citolticos tambm podem causar patologias severas e at a morte do hospedeiro. Nesse sentido, provvel que outras formas de citopatologia que no necessariamente a lise celular tambm possam ser responsveis por patologias observadas em animais doentes. Acredita-se que grande parte das patologias observadas em doenas causadas por vrus no-citopticos sejam conseqncias da resposta imune do hospedeiro.
2.3 Apoptose por vrus

Apoptose ou morte celular programada um processo bioqumico que funciona como uma cascata que leva a morte ou suicdio celular. Esse mecanismo ocorre naturalmente durante o desenvolvimento embrionrio e fetal, manuteno da imunidade e da homeostase em organismos multinucleados. Muitos vrus interferem no processo de apoptose da clula hospedeira, alterando reaes e componentes-chave desse processo. Produtos de diferentes vrus promovem ou inibem a apoptose atravs de diversos mecanismos de ao. bvio que os vrus se beneciam ao evitar a apoptose, pois isso permite a sobrevivncia da clula at que o ciclo replicativo seja concludo. Porm, em alguns casos, a ocorrncia de apoptose vantajosa para o vrus. Em tais casos, a formao de corpos apoptticos, contendo vrus, resulta em fagocitose dessas estruturas e liberao do vrus no uido extracelular, o que favorece a sua disseminao. Os adenovrus, vrus da peste suna africana (ASFV), vrus da anemia infecciosa das galinhas (CAV) e os vrus da peste suna clssica (CSFV)
197
so exemplos de vrus que produzem protenas indutoras da apoptose. Protenas que inibem a apoptose tambm so produzidas pelos adenovrus e ASFV e pelos vrus da vaccinia, herpesvrus bovino tipo-4 (BoHV-4), herpesvrus eqino (EHV), vrus da doena de Marek, dentre outros.
3.1 Penetrao e replicao primria

O estabelecimento da infeco no hospedeiro depende da penetrao e replicao do vrus em clulas prximas aos locais de entrada. Essa replicao denominada primria necessria para a amplicao do agente, de modo a superar as barreiras impostas pela resposta inata do hospedeiro. A replicao primria geralmente ocorre no prprio local de penetrao, em tecidos prximos ou nos linfonodos regionais. Em geral, os vrus podem utilizar mais de uma via para penetrar nos seus hospedeiros. As principais vias de penetrao de vrus nos animais sero apresentadas a seguir e esto ilustradas na Figura 8.2.
3 Patogenia em nvel de hospedeiro

O resultado de uma infeco vrica de hospedeiro depende de vrios fatores, a saber: a) capacidade de o vrus penetrar em um hospedeiro susceptvel pela via adequada; b) realizar uma replicao primria em tecidos prximos ao local de entrada; c) escapar dos mecanismos naturais de defesa do organismo; d) disseminar-se para os tecidos e rgos-alvo; e) replicar ecientemente nesses tecidos e f) produzir ou no injria tecidual (provocar patologia). Embora os vrus apresentem uma diversidade muito grande e participem de interaes de especicidade e complexidade diferentes com os seus hospedeiros, algumas etapas da patogenia parecem ser comuns maioria das infeces vricas. A seguir, sero abordadas essas etapas.
3.1.1 Pele e mucosas superciais

A pele se constitui em uma importante barreira para a penetrao de vrus, pois a sua camada externa formada por clulas mortas e no suporta a replicao viral. Alm disso, a sua superfcie seca, levemente cida e possui uma ora bacteriana permanente/residente que atua como uma barreira natural. No entanto, solu-
Mucosa conjuntival Pele Mucosa respiratria
Mucosa urogenital Mucosa intestinal
Mucosa orofarngea
Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.
Figura 8.2. Vias de penetrao de vrus em seus hospedeiros.
198
Captulo 8
es de continuidade mesmo imperceptveis provocadas por abrases, pequenas incises ou puncturas podem permitir a penetrao e instalao de vrios vrus. Dentre os vrus que podem penetrar atravs da pele semi-ntegra incluem-se os papilomavrus, alguns poxvrus e herpesvrus (Tabela 8.2). Esses vrus so geralmente transmitidos por contato direto ou indireto, ou tambm mecanicamente atravs de insetos. Se a penetrao for supercial, a replicao geralmente limitada ao stio de penetrao, pois a epiderme desprovida de vasos sangneos e linfticos que poderiam servir para disseminar a infeco. No entanto, a infeco de camadas mais profundas da derme pode levar disseminao sangnea, pois essa camada altamente vascularizada (Figura 8.3A). Em especial, os vrus que so transmitidos por insetos hematfagos (alfavrus, avi-
vrus, buniavrus, alguns rabdovrus e orbivrus) ou por procedimentos iatrognicos (retrovrus e hepadnavrus) podem alcanar as camadas mais internas e encontrar condies propcias para a sua replicao primria. A abundncia de vasos sangneos e linfticos na derme e em camadas mais internas oferece condies para a disseminao desses agentes a partir do stio primrio de replicao. Aps a replicao primria no tecido drmico ou subdrmico, os vrions podem se disseminar para os linfonodos regionais no interior de clulas fagocticas ou livres na linfa e/ou sangue. Os herpesvrus invadem terminaes nervosas localizadas nesses locais e so transportados ao longo dos axnios ou dentritos at o corpo dos neurnios. O transporte dos herpesvrus por bras nervosas ser abordado na seo 3.2.3.
Tabela 8.2. Vrus animais que penetram no hospedeiro atravs da pele ou de superfcies mucosas Via de penetrao Vrus
Papilomavrus de vrias espcies; Herpesvrus de vrias espcies; Poxvrus de bovinos, sunos e ovinos; vrus da estomatite papular bovina; poxvrus avirios; Vrus da doena vesicular de sunos; Vrus da estomatite vesicular (VSV). Vrios poxvrus (mixomavrus, poxvrus suno, poxvrus avirios); Alguns retrovrus (vrus da anemia infecciosa eqina [EIAV], vrus da leucose bovina [BLV]); VSV. Vrus da peste suna africana (ASFV); Vrus da lngua azul (BTV); VSV, outros rabdovrus; Vrus da febre do vale Rift (RVFV), outros buniavrus; Todos os alfavrus; Vrus do gnero flavivrus. Vrus da imunodeficincia felina (FIV); Vrus da raiva (RabV); Arenavrus (entre roedores); Herpesvrus smio B. Papilomavrus de vrias espcies animais; Retrovrus (BLV, EIAV); Vrus da diarria viral bovina (BVDV), vrus da peste suna clssica (CSFV). Herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1), herpesvrus eqino 1(EHV-1); Adenovrus canino tipos 1 e 2 (CAdV-1, CAdV-2).
Pequenas leses (puncturas, abrases)
Picada de insetos (transmisso mecnica)
Picada de insetos (transmisso biolgica)
Mordeduras de vertebrados
Transmisso iatrognica
Contato com a conjuntiva
Fonte: adaptada de Murphy et al. (1999).
199
Aparentemente, as membranas mucosas superciais poderiam se constituir em uma barreira menos eciente para impedir a penetrao viral. Ainda assim, so recobertas por uma camada de muco que, pela sua natureza viscosa e pela presena de IgA, pode dicultar a penetrao dos vrus. Os herpesvrus parecem ser capazes de penetrar em mucosas intactas para iniciar a infeco, embora a ocorrncia de leses certamente favorea a instalao da infeco. Determinados vrus so introduzidos atravs da pele diretamente no tecido subcutneo ou mesmo no tecido muscular. O vrus da raiva inoculado profundamente pela mordedura de animais infectados; os arenavrus tambm so transmitidos entre os roedores silvestres atravs de mordidas; o herpesvrus smio B e o vrus da imunodecincia felina (FIV) tambm podem ser transmitidos por mordeduras. Essa inoculao profunda facilita ainda mais a replicao primria e o estabelecimento da infeco.
Alguns vrus penetram no organismo pela mucosa conjuntival e podem estar associados com conjuntivite ou com infeces sistmicas. Os adenovrus caninos tipos 1 e 2 (CAdV-1; CAdV2) podem penetrar por essa via; o herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) pode causar conjuntivite pela infeco direta da conjuntiva ou por contaminao a partir da cavidade nasal. Os principais vrus de animais que penetram nos seus hospedeiros atravs da pele e mucosas superciais esto apresentados na Tabela 8.2.
3.1.2 Trato respiratrio

A mucosa do trato respiratrio provavelmente se constitui na principal via de penetrao de vrus, por causa de sua grande superfcie e grande quantidade de patgenos potencialmente presentes no ar inspirado. No obstante, o sistema respiratrio apresenta barreiras que limitam ou reduzem as chances dos vrus que penetram
Tabela 8.3. Principais vrus que penetram pelo trato respiratrio para iniciar a infeco do hospedeiro Famlia
Herpesviridae
Vrus
Herpesvrus de vrias espcies. Adenovrus de vrias espcies. Vrus da parainfluenza (PIVs) e vrus respiratrios sinciciais (RSVs). Vrus da influenza suna e eqina. Vrus da bronquite infecciosa das galinhas (IBDV). Vrus da febre aftosa (FMDV); rinovrus de vrias espcies. Calicivrus felino (FCV). Vrus da doena de Aujeszky (PRV), vrus da doena de Marek, vrus da febre catarral maligna (MCFV). Vrus da cinomose (CDV), vrus da peste bovina (rinderpest). Vrus da influenza aviria (AIV). Vrus da diarria viral bovina (BVDV)*; vrus da peste suna clssica (CSFV).
Produzem doena respiratria ou localizada
Adenoviridae Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Coronaviridae Picornaviridae Caliciviridae
Produzem doena sistmica
Herpesviridae
Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Flaviviridae
* O BVDV pode tambm causar doena respiratria. Fonte: adaptada de Murphy et al. (1999).
200
Captulo 8
pelo ar inspirado conseguirem atingir e penetrar nas clulas epiteliais. As vias areas superiores e inferiores contm um epitlio ciliado recoberto com muco, cuja funo reter e, eventualmente, expulsar as partculas inaladas. Alm de reter as partculas vricas, o muco pode conter IgA especca, que pode neutralizar a infectividade dos vrus. Os alvolos so desprovidos dessas defesas, porm possuem macrfagos residentes encarregados de fagocitar e digerir partculas exgenas. Alm disso, a temperatura nas vias areas superiores aproximadamente 3 a 5C inferior temperatura corporal, o que pode restringir a replicao de alguns vrus. Por isso, os vrus incapazes de replicar temperatura corporal (rinovrus), replicam somente no trato respiratrio superior. J os vrus capazes de replicar sob temperatura corporal, podem causar infeco no trato respiratrio inferior. Os vrus geralmente penetram no trato respiratrio atravs de aerossis produzidos por expectoraes (tosse e espirro) ou pelo contato nasal com fmites contaminados. O hbito investigativo olfatrio de vrias espcies animais se constitui em um fator de risco que favorece as infeces da mucosa nasal e do focinho. A maioria dos vrus que penetra por essa via realiza a replicao primria em clulas epiteliais das vias respiratrias; alguns podem replicar em macrfagos livres no lmen respiratrio ou em espaos subepiteliais. A replicao dos vrus que penetram pelas vias areas pode car restrita ao epitlio respiratrio
ou se disseminar para outros tecidos e rgos. Ou seja, os vrus que penetram pelo trato respiratrio podem produzir infeces localizadas ou disseminadas (Tabela 8.3). Os tecidos subjacentes ao epitlio respiratrio possuem vasos linfticos e sangneos que facilitam a disseminao dos vrus at os rgos linfides secundrios e da para o sangue (Figura 8.3B).
3.1.3 Orofaringe e trato digestivo

A mucosa do trato digestivo, desde a orofaringe at os segmentos nais do intestino, pode se constituir em local de penetrao para vrios vrus, que produzem tanto infeces localizadas como sistmicas. Os vrus adquiridos pela ingesto de alimentos ou gua contaminada, ou pelo contato oral com fmites, podem ser deglutidos e alcanar o estmago e intestinos; ou podem infectar as clulas superciais da orofaringe. Os vrus que replicam na orofaringe podem ser, posteriormente, deglutidos ou podem se disseminar sistemicamente pela via hematgena. Os rotavrus, coronavrus, calicivrus e muitos enterovrus produzem infeces localizadas no intestino delgado; o parvovrus canino penetra na mucosa da orofaringe e, por via hematgena, atinge o epitlio intestinal, onde replica e provoca distrbios celulares que resultam em doena; o vrus da diarria viral bovina (BVDV) pode penetrar na mucosa da orofaringe e se disseminar sistemicamente. Alguns vrus podem penetrar atravs
201
da mucosa intestinal e causar doena sistmica, como alguns adenovrus de aves e de mamferos e alguns enterovrus. O trato digestivo apresenta vrias barreiras que restringem ou dicultam a infeco por determinados vrus. O pH cido do estmago, a alcalinidade do intestino delgado, as enzimas digestivas presentes na saliva e no suco pancretico, e as enzimas lipolticas presentes na bile restringem o nmero de vrus que capaz de infectar o hospedeiro por essa via. Como regra, os vrus no-envelopados so mais resistentes ao pH cido do estmago. Excees incluem os rinovrus e o FMDV (picornavrus), que so lbeis pH cido e no resistem ao pH do estmago. Para estabelecer a infeco, portanto, esses vrus devem penetrar na mucosa orofarngea ou nasal. Embora sejam sensveis ao pH baixo e ao da bile, os coronavrus de vrias espcies animais resistem s condies do estmago e intestino e podem estabelecer infeces intestinais. Em geral, os vrus que causam infeces intestinais, como os rotavrus, calicivrus e enterovrus, so resistentes ao pH baixo e ao da bile e, por isso, podem penetrar a partir do lmen intestinal. As enzimas proteolticas presentes no lmen intestinal podem tambm favorecer a infeco por alguns vrus, pela clivagem e ativao de protenas da superfcie dos vrions que so envolvidas na penetrao do vrus na clula hospedeira. Como exemplos, citam-se: a tripsina, pancreatina e elastina que aumentam a infectividade dos rotavrus; e outras enzimas que ativam os processos de penetrao dos reovrus e de alguns coronavrus. Enzimas presentes em secrees respiratrias tambm tm sido envolvidas na ativao de protenas de fuso dos paramixovrus. Os vrus associados com gastrenterite podem infectar uma variedade de clulas do trato gastrintestinal. Os adenovrus, rotavrus, calicivrus e coronavrus infectam predominantemente entercitos maduros quiescentes. Outros vrus possuem tropismo por clulas das criptas que esto em diviso (parvovrus) ou por clulas epiteliais especializadas, como as clulas M (poliovrus e reovrus). As clulas M podem tambm capturar vrions no lmen intestinal e transport-
los para clulas mononucleares adjacentes, onde ocorrer a replicao primria (Figura 8.3C). Dentre os vrus animais que penetram pelo trato digestivo e esto associados com diarria esto os parvovrus (canino e felino), os rotavrus de vrias espcies, os coronavrus entricos, os astrovrus e calicivrus. Outros vrus penetram pelo trato digestivo e esto associados com doena disseminada, geralmente sem diarria, como os adenovrus de vrias espcies, os enterovrus, o vrus do exantema vesicular de sunos, entre outros. Estes vrus utilizam o epitlio intestinal para a replicao primria e amplicao, de onde ganham acesso ao sistema linftico e sangneo (Figura 8.3C).
3.1.4 Mucosa urogenital

A mucosa do trato genital da fmea pode servir de local de penetrao tanto para vrus sistmicos, que so excretados no smen, como para vrus que produzem infeces localizadas no trato genital masculino. No primeiro caso, a transmisso pode ser pela monta natural ou pela inseminao articial, j que os vrus encontram condies ideais de sobrevivncia em smen industrializado. Os herpesvrus de vrias espcies animais podem ser transmitidos pelo smen e/ou pela cpula; o vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) foi amplamente disseminado pela inseminao articial; a monta natural uma importante forma de transmisso do vrus da arterite viral eqina (EAV). Os papilomavrus que causam leses genitais tambm podem ser transmitidos pela cpula, por causa do contato entre as mucosas. Embora o BoHV-1 possa ser excretado pelo smen durante a infeco aguda respiratria, a transmisso venrea desse vrus est mais freqentemente associada com a infeco genital (balanopostite). Os tecidos submucosos so altamente irrigados e fornecem condies propcias para a disseminao dos vrus pela linfa ou pelo sangue para os linfonodos regionais ou para tecidos mais distantes. As terminaes nervosas, localizadas na submucosa, constituem-se em alvos para a pe-
202
Captulo 8
netrao pelos herpesvrus, que so, ento, transportados at gnglios nervosos regionais. Embora com menor freqncia, fmeas que desenvolvem infeces genitais tambm podem transmitir o vrus para o macho durante a cpula, o que favorece a disseminao do agente, pois o macho infectado pode transmitir o agente para outras fmeas.
3.2 Infeces localizadas versus infeces disseminadas (ou sistmicas)

Os padres de distribuio e envolvimento de diferentes rgos e tecidos variam amplamente com os vrus e esto intimamente associados com a biologia do agente, sendo dependentes de suas interaes com o hospedeiro. Alguns vrus produzem infeces localizadas, geralmente limitadas s proximidades dos stios de penetrao e replicao primria. Esse padro de infeco caracterstico dos vrus respiratrios (rinovrus, vrus da inuenza e parainuenza), gastrintestinais (coronavrus e rotavrus) e de alguns vrus que infectam a derme e epiderme (papilomavrus, alguns poxvrus, vrus da mamilite herptica [BoHV-2]). Essas infeces esto geralmente limitadas ao epitlio, mas a penetrao e envolvimento de tecidos subjacentes e disseminao sistmica podem ocasionalmente ocorrer. As infeces que se restringem aos stios de replicao primria e suas proximidades so ditas localizadas. Outros vrus so capazes de se disseminar a longas distncias pelo sangue ou pela linfa e produzir infeces em rgos especcos ou infeces generalizadas. Exemplos incluem o CDV, os parvovrus canino (CPV) e felino (FPLV), o BVDV, os retrovrus, entre outros. As infeces que se estendem alm dos stios de replicao primria so chamadas de disseminadas; e as que atingem vrios rgos ou sistemas so denominadas sistmicas ou generalizadas.
entanto, no permite uma disseminao a longas distncias e essas infeces so geralmente controladas pela resposta imune do hospedeiro. Os vrus que penetram na mucosa respiratria ou digestiva e que so liberados pela superfcie apical de clulas epiteliais podem ser transportados por uidos ou pelo muco e se disseminar rapidamente pelo lmen do rgo. A replicao de muitos desses vrus ca restrita ao epitlio, com nenhuma ou pouca invaso dos tecidos subjacentes. Paralelamente, os vrions podem ser transportados at os linfonodos regionais, livres na linfa ou no interior de clulas fagocticas. Esta geralmente a primeira etapa na disseminao das infeces sistmicas. Em geral, os vrus que so liberados apenas na superfcie apical das clulas epiteliais tendem a car restritos localmente, enquanto aqueles que so liberados tambm pela superfcie basolateral so mais provveis de produzirem infeces sistmicas.
3.2.2 Disseminao hematgena

O transporte pelo sangue oferece aos vrus a oportunidade de atingir virtualmente todos os rgos e tecidos em poucos minutos a partir dos stios de replicao primria. Os vrions podem penetrar no sangue diretamente atravs da parede capilar, aps a infeco de clulas endoteliais ou pela inoculao direta por insetos ou por instrumentos contaminados. A disseminao hematgena se inicia quando os vrions produzidos nos stios primrios de replicao so liberados no lquido extracelular e drenados pelo sistema linftico, cujos capilares so mais permeveis do que os capilares sangneos. Os vrions veiculados pela linfa eventualmente ganham acesso corrente sangnea, seja como partculas livres no plasma, seja no interior de linfcitos ou moncitos/macrfagos infectados durante a sua passagem pelos linfonodos regionais. De fato, a patogenia de vrias infeces vricas est intimamente associada com a infeco de clulas do sistema imunolgico, que ocorre devido ao seu contato com os vrions nos rgos linfides perifricos. Uma vez no sangue, os vrions se disseminam rapidamente pelo organismo. O trajeto
3.2.1 Disseminao local

Aps a replicao primria, muitos vrus se disseminam localmente pela transmisso entre clulas vizinhas. Essa forma de transmisso, no
203
Superfcie corporal
Seios linfticos revestidos por macrfagos Capilar linftico Tecido linfide Veia
Capilar sangneo
Histicito
Tecido conjuntivo
Vaso linftico aferente
Vaso linftico eferente Linfonodo
Ducto torcico
Fonte: adaptada de Mims e White (1984).
Figura 8.4. Trajeto dos vrus que penetram pela pele ou mucosas superficiais para atingir o sangue e se distribuir sistemicamente.
utilizado pelos vrus que penetram no organismo atravs de superfcies cutneas ou mucosas para atingir a corrente sangnea est ilustrado na Figura 8.4. A presena de vrus no sangue denominada viremia e, dependendo da origem do vrus, pode ser classicada em passiva ou ativa. A viremia passiva resulta da introduo do vrus diretamente no sangue, sem a prvia replicao em tecidos. Esta introduo pode resultar de inoculao direta por insetos hematfagos, por transfuso sangnea ou por outras formas de inoculao de sangue. Essas viremias so geralmente transitrias e no duram mais de 12-24 h, mas podem ser de tal magnitude a ponto de provocar a infeco macia de alguns rgos. As viremias ativas resultam da replicao viral em tecidos e rgos do hospedeiro e geralmente atingem uma maior magnitude e durao. Os vrus presentes no sangue podem ter vrias origens, tais como: a) partculas vricas presentes nos tecidos prximos aos locais de penetrao podem ser capturadas pelo sistema linftico e ter acesso ao sangue; b) vrios vrus replicam em clulas localizadas nos linfonodos, podendo ser liberados e ter acesso ao sangue; c) alguns vrus so capazes de replicar
em clulas endoteliais e so liberados diretamente na circulao; d) vrios vrus replicam em clulas mononucleares do sistema linforreticular (moncitos/macrfagos; linfcitos) e podem ser liberados no sangue. Em vrias infeces vricas, duas etapas de viremia ativa podem ser detectadas. A viremia primria resulta da replicao viral nos stios iniciais, geralmente atinge baixa magnitude, mas permite a disseminao do vrus aos rgos secundrios de replicao, denominados rgos-alvo. A replicao viral nesses tecidos produz uma viremia secundria, caracterizada por uma presena macia de vrus no sangue e disseminao ainda maior da infeco. Os resultados da viremia so variveis e, freqentemente, resultam em infeco de vrios tecidos perifricos, com resultados que dependem do tropismo, da patogenicidade e virulncia do vrus. Uma conseqncia freqente de viremia em animais a transmisso transplacentria do vrus ao feto, podendo resultar em uma variedade de condies que vo desde uma infeco transitria at a morte fetal, seguida de abortamento. As etapas da patogenia das infeces vricas localizadas e disseminadas esto ilustradas na Figura 8.5.
204
Captulo 8
Superfcie corporal
Infeco
Excreo Herpesvrus Influenza Paramixovrus Rotavrus Papilomavrus Coronavrus
Replicao primria
Pele Mucosas Trato respiratrio Trato digestivo
Linfonodos
Sangue
Viremia primria
Replicao secundria
rgos/tecidos
Medula ssea
Msculo
Fgado
Bao
Endotlio vascular
Sangue
Viremia secundria
Transmisso iatrognica ou por vetores
Epitlio respiratrio
Pele
Encfalo
rgos/tecidos
Glndula salivar ou rins
Trato respiratrio (pulmes)
Replicao secundria
CDV Rinderpest
Lumpy skin
CDV, Togavrus Flavivrus
Raiva (g.salivar) Arenavrus
Arenavrus hantavrus
Excreo
Fonte: adaptada de Mims e White (1984).
Figura 8.5. Etapas da patogenia das infeces vricas localizadas e sistmicas: papel da viremia na disseminao das infeces.
205
No sangue, os vrions podem ser transportados livres no plasma, no interior de leuccitos ou aderidos membrana de leuccitos, eritrcitos ou plaquetas. Os avivrus, togavrus, enterovrus e parvovrus circulam livres no plasma e produzem a chamada viremia plasmtica. A concentrao de partculas vricas no sangue depende de um equilbrio entre a sua produo nos tecidos infectados e a taxa de remoo ou inativao no sangue. A tarefa de remover vrions circulantes cabe s clulas fagocticas do sistema retculo-endotelial, principalmente s clulas de Kpfer no fgado e, em menor proporo, aos macrfagos dos pulmes, bao e linfonodos. Os vrus que circulam livres no plasma podem entrar em contato e infectar uma grande variedade de clulas, mas dois tipos celulares desempenham um papel importante para a continuidade da infeco: as clulas endoteliais e os macrfagos adjacentes aos vasos. As interaes entre os vrions circulantes e as clulas de Kpfer no fgado podem resultar em: a) internalizao e inativao dos vrions; b) internalizao, transporte transcitoplasmtico e liberao dos vrions na bile; c) infeco dessas clulas e liberao da prognie viral de volta ao sangue, incrementando a viremia; d) infeco celular e liberao dos vrions recm-produzidos pela superfcie basal, resultando na infeco macia de hepatcitos. A infeco das clulas endoteliais pode favorecer a invaso viral nos tecidos a partir do sangue. Em etapas mais avanadas da infeco, os anticorpos produzidos so capazes de se ligar e neutralizar as partculas vricas livres no plasma sangneo. A ligao dos anticorpos aos vrions tambm facilita a fagocitose dos complexos anticorpo-vrions por macrfagos adjacentes aos vasos sangneos teciduais. Esses macrfagos se ligam aos complexos imunes por meio de receptores para a poro Fc das imunoglobulinas. A maioria das viremias plasmticas possui durao limitada e o seu trmino coincide com o aparecimento de anticorpos neutralizantes no soro. Vrios vrus replicam em clulas sangneas, particularmente moncitos e linfcitos B e T, e a sua presena no sangue est predominantemente associada com essas clulas. As viremias associadas a clulas apresentam algumas caractersticas
que as distinguem das viremias plasmticas, tais como: a) no interior das clulas os vrus esto protegidos dos anticorpos neutralizantes e podem se propagar a grandes distncias; b) os ttulos virais so geralmente baixos; c) o isolamento do vrus do sangue geralmente difcil e pode requerer o co-cultivo de leuccitos com clulas de cultivo. Essa diculdade de isolamento pode ser devida aos baixos nveis de replicao do vrus e/ou presena de anticorpos neutralizantes; d) em algumas infeces, a viremia persiste por toda a vida do animal e no termina com o aparecimento dos anticorpos neutralizantes. Exemplos desse tipo de viremia so encontrados nas infeces por retrovrus animais, como o FIV, o vrus maedi-visna (MVV), o vrus da leucose bovina (BLV) e o vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV). Em algumas dessas infeces, a contnua evoluo gentica da populao viral produz variantes que escapam da neutralizao por anticorpos e que podem ser isolados do plasma. Esses vrus, no entanto, parecem representar uma pequena parcela do total de vrus que produzido e que neutralizado e capturado nos complexos imunes. O vrus da lngua azul (BTV) produz viremia persistente e os vrions encontram-se aderidos membrana dos eritrcitos. Embora mais estudada em infeces persistentes, a viremia associada a clulas tambm observada em infeces agudas, como a infeco de ces pelo CDV, entre outras. O BVDV pode ser encontrado em linfcitos e moncitos, mas viremia plasmtica tambm pode ser detectada em animais persistentemente infectados. Esses animais so imunotolerantes a antgenos virais e, por isso, no produzem anticorpos contra o vrus. Com isso, o vrus infeccioso pode ser continuamente isolado do plasma desses animais.
3.2.1.1 Penetrao dos vrus nos tecidos

Os vrus que se disseminam pela via hematgena devem ultrapassar a parede vascular para invadir e replicar nos tecidos e rgos-alvo. Embora seja uma etapa fundamental na patogenia das infeces por virtualmente todos os vrus patognicos que produzem viremia, poucos detalhes so conhecidos sobre a penetrao dos vrus
206
Captulo 8
nos tecidos. O mecanismo de penetrao utilizado pelos vrus depende da sua biologia e tambm da estrutura e relaes do endotlio vascular, que varia muito entre os diferentes tecidos. Os possveis mecanismos utilizados, j demonstrados para alguns vrus, esto ilustrados na Figura 8.6 e descritos a seguir: 1) Penetrao passiva pelo espao entre as clulas endoteliais. Esse mecanismo possvel em alguns endotlios que apresentam fenestras entre as clulas endoteliais, como o plexo coride no SNC. Aps atravessar esta barreira, os vrus podem infectar as clulas epiteliais do plexo coride e ganhar acesso ao uido crebro-espinhal e, assim, disseminar-se pelos espaos ocupados por esse uido. Exemplos de vrus que provavelmente utilizam essa via de invaso incluem o vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV) e o retrovrus (MVV). Os vasos dos tbulos renais, pncreas, clon e leo tambm apresentam fenestras que podem servir para a penetrao dos vrus nos tecidos a partir do sangue; 2) Os vrions podem ser transportados atravs do endotlio vascular por endocitose, seguida de transporte vesicular intracitoplasmtico e exocitose na face oposta da clula endotelial. Para que essas duas formas de invaso possam ocorrer, a concentrao de vrions no sangue deve ser alta e contnua, e o uxo sangneo no local deve ser lento, para permitir o contato e aderncia das partculas vricas ao endotlio e/ou penetrao pelos espaos interendoteliais; 3) Alguns vrus podem infectar as clulas endoteliais e/ou clulas adjacentes e completar o seu ciclo replicativo nessas clulas. Assim, a sua prognie pode ser liberada atravs da superfcie basal ou basolateral dessas clulas e infectar clulas teciduais subjacentes. Essa forma de invaso tecidual j foi demonstrada para os picornavrus, retrovrus, alfavrus e parvovrus. As clulas de Kpfer, que esto localizadas entre as clulas endoteliais dos sinusides hepticos, servem de porta de entrada para vrus que so veiculados no sangue. Os vrus podem ser transportados passivamente ou replicarem ativamente nessas clulas; 4) Os vrus que produzem viremia associada a clulas, em moncitos ou linfcitos, podem ser transportados atravs da parede vascular no in-
terior das clulas infectadas. As clulas mononucleares do sangue esto freqentemente atravessando a parede vascular e penetrando nos tecidos em resposta a estmulos inamatrios e podem funcionar como verdadeiros cavalos de Tria, transportando os vrus para os tecidos. O movimento de clulas atravs do endotlio em direo aos tecidos denominado diapedese. Essa forma de invaso tem sido demonstrada para o CDV, vrus da febre amarela (YFV) e tambm para explicar a penetrao do vrus da imunodecincia humana adquirida (HIV) no encfalo.
2 1 3
Lmen do vaso
Tecido
Figura 8.6. Mecanismos de penetrao de vrus nos tecidos a partir do sangue. 1) Penetrao pelos espaos existentes entre as clulas endoteliais; 2) Transporte ativo atravs das clulas endoteliais; 3) Infeco das clulas endoteliais com posterior egresso da prognie viral na face oposta do endotlio; 4) Transporte atravs do endotlio no interior de moncitos/linfcitos.
3.2.1.2 Infeco celular mediada por anticorpos (antibody-dependent enhancement

of viral infection, ADE)
A ADE um mecanismo utilizado por alguns vrus para penetrar produtivamente e replicar em clulas que expressam receptores para a
207
poro Fc das imunoglobulinas, principalmente os moncitos e macrfagos. Nessas clulas, os receptores de Fc so importantes para a captura e inativao de complexos imunes formados nos uidos e tecidos corporais. O fenmeno de ADE ocorre quando os vrions so recobertos por anticorpos sem atividade neutralizante ou quando os nveis de anticorpos especcos so baixos. Assim, a ligao dos anticorpos no neutraliza a infectividade dos vrions. No entanto, as clulas que expressam receptores para a regio Fc se ligam aos complexos anticorpos-vrions atravs da regio Fc. Essa ligao seguida pela internalizao dos complexos nas clulas, aps a qual os vrions podem ser liberados no citoplasma e iniciar a replicao. Ou seja, alm de no neutralizar a infectividade dos vrions, os anticorpos auxiliam a sua penetrao nas clulas que possuem receptores de Fc. Esse mecanismo somente ocorre para vrus que infectam naturalmente clulas que expressam esses receptores. Embora a ADE j tenha sido demonstrada para vrios vrus in vitro, o seu papel na patogenia das infeces vricas in vivo ainda controverso e parece se restringir a poucos vrus, como o vrus da dengue em humanos e o vrus da peritonite infecciosa felina (FIPV, um coronavrus). Nesses casos, a presena de anticorpos em nveis baixos contra um determinado sorotipo do vrus resulta em um aumento da severidade da doena por ocasio de uma reinfeco com um sorotipo heterlogo. De fato, tem sido demonstrado que a peritonite infecciosa dos gatos mais severa em animais previamente vacinados, reforando a possibilidade de que a ADE contribua na patogenia da doena.
3.2.3 Disseminao nervosa

Vrios vrus se disseminam a partir dos stios de replicao primria no interior de bras nervosas cujas terminaes se distribuem nesses locais. Essa forma de transporte utilizada por vrus essencialmente neuropatognicos (vrus da raiva e vrios alfaherpesvrus) e tambm por vrus cuja invaso do sistema nervoso representa uma circunstncia da sua replicao e disseminao hematgena (reovrus e poliovrus). Alguns vrus, como o CDV e o vrus da artrite e encefa-
lite caprina (CAEV), replicam no SNC e produzem doena neurolgica, porm parecem atingir o encfalo pela via hematgena. Dentre os vrus animais que utilizam a via nervosa para invadir o encfalo e causar doena neurolgica se incluem o BoHV-5, o PRV, o EHV, o vrus da raiva, o vrus da encefalite eqina venezuelana (VEEV) e o vrus da doena de Borna (BDV). Em modelos animais, o VEEV parece tambm utilizar a via hematgena para invadir o encfalo e produzir encefalite. Embora os vrus que se disseminam pela via nervosa e replicam no sistema nervoso sejam denominados classicamente vrus neurotrpicos, esses agentes so capazes de infectar uma variedade de clulas. De fato, a replicao inicial desses vrus ocorre geralmente no epitlio e em tecidos adjacentes aos locais de penetrao, aps a qual os vrions penetram nas terminaes nervosas. O mecanismo de penetrao dos vrus em neurnios parece ser similar ao utilizado para iniciar a infeco de outras clulas. Aps a penetrao e desnudamento, o nucleocapsdeo transportado passivamente ao longo dos processos neuronais (dentritos e axnios) por transporte axoplsmico rpido. O vrus pode ocasionalmente replicar nos axnios ou dendritos, mas este um processo lento e no requerido para a disseminao. Drogas que inibem o transporte axonal (p. ex.: colchicina) tambm bloqueiam a progresso dos vrus o longo dos axnios. Essa forma de disseminao tem sido estudada com detalhes nos alfaherpesvrus, em que o transporte neural at os gnglios sensoriais e autonmicos essencial para o estabelecimento de infeco latente, que, por sua vez, crtica para a manuteno desses vrus na natureza (Figura 8.7). Aps a replicao na mucosa nasal ou genital, os vrions penetram em terminaes dos nervos que se distribuem nas camadas subjacentes. Os vrions ntegros ou partculas subvirais so transportados em vesculas ao longo dos microtbulos dos axnios ou dendritos at os corpos neuronais que se localizam nos gnglios nervosos regionais (gnglio trigmeo, no caso de infeco oronasal; gnglios sacrais, no caso de infeco genital). O transporte axonal de substncias das terminaes nervosas em direo ao corpo neuronal deno-
208
Captulo 8
Transporte retrgrado Latncia
Crebro
Reativao Transporte antergrado
Mucosa nasal
Gnglio trigmeo
Figura 8.7. Disseminao neural dos alfaherpesvrus animais do epitlio respiratrio para os gnglios sensoriais durante a infeco aguda (transporte retrgrado) e do corpo dos neurnios para o epitlio nasal durante a reativao da infeco latente (transporte antergrado). Durante a infeco aguda (e menos freqentemente durante a reativao), pode ocorrer transporte antergrado em direo ao SNC, com invaso e replicao viral no encfalo.
minado retrgrado. Ao alcanar os corpos neuronais, os alfaherpesvrus replicam ativamente de forma ltica ou estabelecem infeco latente. A infeco latente caracterizada pela presena do genoma viral inativo no ncleo dos neurnios, sem expresso gnica ou produo de prognie viral. Em determinadas circunstncias, geralmente associadas com estresse, ocorre a reativao da infeco, a retomada da expresso gnica e a produo de partculas vricas infecciosas. Essas partculas so transportadas de volta aos locais de replicao primria pelas mesmas vias nervosas que haviam servido de acesso para os vrons aos corpos neuronais. O transporte de vesculas e substncias do corpo neuronal em direo s terminaes nervosas denomina-se antergrado e permite a prognie viral alcanar os tecidos perifricos, replicar e ser excretada. Em alguns vrus (BoHV-5 e PRV), a replicao nos corpos neuronais durante a infeco aguda (e provavelmente tambm durante a reativao da infeco latente) tambm pode ser seguida pelo transporte antergrado da prognie viral ao longo das bras nervosas em direo ao encfalo. Esses vrus so capazes de se transmitir atravs de sinapses nervosas e se disseminar ao longo de circuitos neuronais sinapticamente
ligados, resultando em invaso e replicao no encfalo. As infeces neurolgicas acompanhadas de meningoencefalite severa so freqentes em bovinos infectados pelo BoHV-5 e em sunos jovens infectados pelo PRV. Alguns alfaherpesvrus que causam meningoencencefalite (BoHV-5, por exemplo), parecem invadir o encfalo principalmente pela via olfatria que, provavelmente, se constitui em uma via mais eciente e rpida de transporte do que a via trigeminal. Outros (PRV e BoHV-1) parecem atingir o sistema nervoso, principalmente pelos ramos sensoriais do nervo trigmeo. O transporte neural permite a propagao do vrus aos rgos-alvo sem exposio ao sistema imunolgico. Embora as vias hematgena e neural sejam freqentemente consideradas como vias excludentes (alternativas) de disseminao viral, a patogenia de alguns vrus parece envolver a participao de ambas. A invaso dos vrus das encefalites eqinas do leste (EEEV), oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV) no encfalo de animais infectados experimentalmente, por exemplo, j foi demonstrado que pode ocorrer por ambas as vias, embora uma delas provavelmente desempenhe um papel preponderante em infeces naturais.
209
3.3 Localizao das infeces 3.3.1 Infeces em rgos e sistemas especcos

O padro de doena sistmica produzida durante uma infeco depende dos rgos e tecidos-alvo do vrus, das populaes de clulas desses rgos que so infectadas e tambm do tipo de alteraes produzidas pela replicao viral nessas clulas. Felizmente, nenhum vrus capaz de infectar todos os tecidos e clulas do hospedeiro. Na verdade, devido a sua dependncia de processos bioqumicos e moleculares especcos, a maioria dos vrus infecta um nmero limitado de tipos celulares no hospedeiro. As Figuras 8.8 a 8.12 apresentam alguns padres peculiares de disseminao, distribuio e localizao de infeces vricas em ces. O termo tropismo utilizado para designar a predileo dos vrus por determinadas clulas, tecidos ou rgos. Assim, o tropismo um dos principais determinantes da patogenia das infeces vricas. O tropismo celular ou tecidual de um vrus determinado pela interao entre mltiplos fatores virais e celulares, e pode ser inuenciado em diferentes nveis. A constituio e siologia da membrana plasmtica (presena de receptores, co-receptores, atividade endoctica, espessura do citoesqueleto cortical etc.) podem afetar as etapas iniciais da infeco (adsoro, penetrao, desnudamento e transporte intracelular dos vrions). A presena de fatores de transcrio, de transativadores ou inibidores e de enzimas polimerases pode afetar a expresso dos genes virais. Proteases e nucleases celulares podem ativar ou inativar fatores virais. Os mecanismos celulares de transporte e distribuio de macromolculas podem afetar a replicao, distribuio, morfognese e liberao da prognie viral, ou seja, o tropismo de um vrus pode ser determinado por fatores que atuam em qualquer etapa do ciclo replicativo, desde o seu incio at a etapa de egresso das partculas vricas. A presena de receptores especcos na membrana da clula hospedeira o principal fator determinante do tropismo para a maioria dos vrus. Em geral, os receptores virais so restritos
a determinados tipos celulares ou tecidos, e apenas estes podem ser infectados naturalmente. Por isso, a distribuio de receptores nos tecidos e rgos um determinante importante da patogenia dos vrus. Existem vrios exemplos de mutaes naturais ou induzidas nas protenas virais de ligao nos receptores que resultam em alterao no tropismo e/ou na virulncia do vrus mutante. Esses exemplos ilustram a importncia das interaes vrion-receptores como determinantes do tropismo e da patogenia das infeces vricas.
Figura 8.8. Patogenia da parvovirose canina. O CPV penetra pela via oronasal e replica inicialmente na orofaringe e nas tonsilas. Aps a replicao primria, o vrus atinge a corrente sangnea e transportado sistemicamente pelo sangue. Os stios de predileo para a replicao secundria so as clulas das criptas do intestino delgado, que expressam o receptor para o vrus e esto em multiplicao ativa. A replicao viral acompanhada de destruio dessas clulas e reposio deficiente das clulas absortivas das vilosidades intestinais. Os ces com gastrenterite pelo CPV apresentam dificuldade de absoro de nutrientes, diarria hemorrgica e desidratao. A infeco pelo CPV em filhotes caninos com menos de seis semanas de idade pode ser caracterizada por miocardite, pois nessa fase as clulas do miocrdio esto em constante mitose.
Embora aparentemente seja o principal determinante do tropismo, a presena dos receptores no o nico fator que determina a capacidade do vrus infectar um determinado tipo celular. Para alguns vrus DNA e retrovrus, a transcrio dos genes virais pode ser inuenciada pela presena de fatores de transcrio e/ou inibidores celulares. A penetrao em clulas que no
210
Captulo 8
apresentem tais fatores pode resultar em infeco abortiva, pois os genes virais no so expressos ou so expressos em quantidades insucientes
vrions, que ocorre com ecincia diferente conforme o tipo celular. Assim, o tropismo desses vrus parcialmente determinado pela capacidade de determinadas clulas de clivar a protena viral de fuso. Esses exemplos ilustram a variedade de fatores celulares que podem ser determinantes do tropismo dos vrus por determinados tipos celulares.
Figura 8.9. Patogenia da coronavirose canina. O coronavrus canino (CCoV) penetra pela via oral pela ingesto de gua ou alimentos contaminados. O vrus atinge o intestino pela passagem direta pelo trato digestivo, pois resiste ao pH cido do estmago. No intestino, o vrus infecta inicialmente as clulas das vilosidades do duodeno e posteriormente se dissemina at o leo. A replicao nas clulas absortivas das vilosidades provoca uma enterite, que resulta em reduo da absoro de nutrientes, diarria e desidratao. O vrus excretado nas fezes um a dois dias aps a infeco. O CCoV pode, ainda, disseminar-se aos linfonodos mesentricos e, ocasionalmente, replicar no bao e fgado.
Os parvovrus dependem da atividade da DNA polimerase celular e fatores associados para a replicao do seu genoma; por isso esses vrus apresentam tropismo marcante por clulas em diviso. Os papilomavrus dependem de clulas cuja sntese e transporte de nucleotdeos para o ncleo estejam ativos, alm da atividade da DNA polimerase celular. O transporte de nucleocapsdeos at as proximidades dos poros nucleares uma atividade requerida para a replicao dos adenovrus. A integrao do provrus DNA de alguns retrovrus somente ocorre em clulas em atividade mittica. A replicao dos papilomavrus est estritamente associada com o estgio de diferenciao dos queratincitos e dos fatores celulares expressos por essas clulas. A capacidade infectiva dos coronavrus e paramixovrus inuenciada pela clivagem e maturao da protena envolvida na fuso e penetrao dos
Figura 8.10. Patogenia da hepatite infecciosa canina. A infeco pelo adenovrus canino tipo 1 (CAdV-1) pode ocorrer pela via oral, nasofaringeal e/ou conjuntival, seguida de replicao primria nas tonsilas e placas de Peyer. Durante a viremia primria, o vrus se dissemina no organismo e infecta as clulas endoteliais dos vasos e as clulas parenquimais de vrios tecidos. A replicao no parnquima heptico resulta em hepatite, com a ocorrncia de hemorragia e necrose no rgo. Tambm so encontradas leses na crnea e glomerulonefrite, resultantes da deposio de imunocomplexos. O epitlio tubular renal um stio de acesso limitado do sistema imune, permitindo a persistncia do CAdV-1 nesse local por vrios meses.
A distribuio dos vrus nos tecidos e rgos do organismo depende de um balano entre o padro de disseminao e o seu tropismo celular e tecidual. Os vrus que se disseminam pela via hematgena podem ter acesso a virtualmente todos os tecidos do organismo. No entanto, a maioria desses vrus infecta apenas alguns tecidos ou rgos ou podem ainda infectar apenas algumas clulas especcas nesses rgos. Em resumo, a disseminao hematgena permite ao vrus atingir virtualmente todos os tecidos, mas no assegura que a replicao ir ocorrer em todos os tecidos potencialmente atingidos. Por outro lado, a disseminao neural predominantemente dire-
211
cional, pois o vrus se dissemina ao longo de circuitos neuronais sinapticamente ligados e infecta as populaes de neurnios que recebem bras dos neurnios previamente infectados. Durante a transmisso transinptica, alguns vrions podem se disseminar localmente e infectar clulas vizinhas, mas esta infeco ca geralmente limitada. O egresso de vrions dos corpos neuronais no SNC, por outro lado, pode resultar em disseminao local e infeco de outros neurnios e tambm de clulas da glia.
ciam a sua disseminao e localizao no organismo. Cada vrus, em particular, produz um ou mais padres caractersticos de disseminao e localizao de suas infeces. importante ressaltar que cepas ou isolados de um mesmo vrus podem apresentar padres diferentes de disseminao e distribuio, podendo resultar em manifestaes clnico-patolgicas distintas. A seguir sero abordadas sucintamente as caractersticas das infeces nos principais rgos ou sistemas do organismo. Detalhes da patogenia de cada infeco vrica sero abordados nos captulos especcos.
Figura 8.11. Patogenia da traqueobronquite infecciosa canina. Essa enfermidade pode ser causada por vrios agentes virais e bacterianos, incluindo o vrus da parainfluenza canina (CPIV-2) e o adenovrus canino tipo 2 (CAdV-2). Os agentes penetram pela via respiratria e replicam inicialmente no epitlio da nasofaringe. Posteriormente a infeco se dissemina para o epitlio pseudo-estratificado ciliado da traquia. A injria epitelial pela replicao viral e o processo inflamatrio resultam em perda da funo ciliar, aumento da produo de muco, com a ocorrncia de tosse seca, engasgos e aumento da secreo nasal. A progresso da infeco para o trato respiratrio inferior depende da infeco concomitante com bactrias e o quadro clnico-patolgico pode evoluir para pneumonia, com tosse produtiva e febre. As infeces pelo CPIV-2 e pelo CAdV-2 so geralmente restritas ao sistema respiratrio, no causando viremia ou disseminao sistmica.
A localizao especca das infeces, isto , a distribuio do vrus em rgos, tecidos e em grupos de clulas especcas determinada por vrios fatores, que incluem a via de penetrao e replicao primria, a via de disseminao, o tropismo tecidual e celular do vrus. Alm desses fatores, as interaes do vrus com os mecanismos imunolgicos do hospedeiro tambm inuen-
Figura 8.12. Patogenia da cinomose canina. O CDV penetra geralmente pela via oronasal e replica inicialmente nos epitlios e em macrfagos das vias areas superiores, faringe e tonsilas. A replicao primria seguida de viremia que permite a disseminao sistmica do vrus e infeco de uma variedade de linfonodos e acmulos linfides, levando a um quadro de imunossupresso. Em ces que no conseguem montar uma resposta imune eficiente, o vrus produz uma viremia secundria, dissemina-se e replica em uma variedade de tecidos, incluindo clulas epiteliais da pele, dos tratos digestivo, respiratrio e urinrio, no sistema nervoso central e no sistema retculo-endotelial. Esses animais podem apresentar uma variedade de manifestaes clnicas, que possuem correlao com os rgos/ tecidos afetados. A incapacidade de erradicar o vrus pode resultar em persistncia viral no SNC.
3.3.2 Infeces da pele e tegumento

As clulas da epiderme e derme se constituem em alvos de replicao de vrios vrus. Esses tecidos podem se constituir nos stios de replicao primria aps transmisso por contato,
212
Captulo 8
abrases, vetores mecnicos (alguns poxvrus e herpesvrus, papilomavrus) ou se constituir em stios de replicao secundria aps uma disseminao hematgena (alguns poxvrus, CDV). Por outro lado, os vrus que replicam na pele ou na transio muco-cutnea oronasal e genital podem produzir infeces localizadas (papilomavrus) ou se disseminar para outros rgos a distncia pela via sangnea (vrios poxvrus e alguns herpesvrus) ou neural (vrios herpesvrus). O tecido drmico e subdrmico so ricos em clulas e capilares sangneos e linfticos, a partir dos quais os vrus podem se disseminar pelo organismo (ver Figuras 8.3A e 8.4). Os efeitos da replicao viral nesses locais so mais pronunciados e visveis em reas desprovidas de plos, como as extremidades das orelhas, a transio muco-cutnea do focinho, da vulva, bere e tetas, prepcio e escroto. As infeces por contato freqentemente resultam em leses delimitadas, com o desenvolvimento de eritema e edema localizados, mculas, ppulas, formao e ruptura de vesculas, pstulas e eroses. As eroses e a contnua exsudao podem levar ao acmulo de brina, formando membranas nas que recobrem as leses e, posteriormente, dessecam e formam crostas. A contaminao bacteriana das vesculas pode levar formao de pstulas. Na infeco por alguns vrus (p. ex.: vrus do ectima contagioso dos ovinos), as crostas que se desprendem das leses contm o vrus e podem mant-lo vivel durante meses no meio ambiente, servindo de fonte de infeco para outros animais. Algumas infeces sistmicas podem resultar na formao de eritema, petquias e sufuses na pele e/ou mucosas, sem estarem necessariamente associadas com a replicao viral nesses locais. Nesses casos, essas patologias esto associadas com alteraes/leses no endotlio vasculares e/ou com decincias sistmicas na coagulao sangnea (p. ex.: trombocitopenia). Embora vrios vrus produzam infeces cutneas e, assim, esto presentes nas leses, nem todos utilizam esta via de excreo para serem transmitidos. Excees so os herpesvrus, alguns poxvrus e os papilomavrus, que podem ser transmitidos de forma mecnica por vetores
ou por contato a partir das leses superciais (ver Figura 8.5).
3.3.3 Infeces do trato respiratrio

Estima-se que aproximadamente 90% das infeces respiratrias de animais possuam etiologia viral, isoladamente ou em infeces mistas. A anatomia e siologia do trato respiratrio favorecem o estabelecimento de infeces veiculadas por aerossis, poeiras ou transmitidas por contato direto ou indireto. Dentre os fatores que favorecem as infeces respiratrias podese mencionar: a) a inalao contnua de grande quantidade de ar potencialmente contaminado; b) o hbito investigativo olfatrio de vrias espcies animais; c) a grande superfcie das vias respiratrias, que se estendem desde as fossas nasais at os alvolos pulmonares; d) a diversidade do epitlio que reveste os diferentes segmentos do trato respiratrio; e) o gradiente de temperatura entre as fossas nasais (33C) e os alvolos (temperatura corporal), que favorece a replicao de alguns vrus; f) alm dos aspectos que favorecem a replicao viral no epitlio respiratrio ou em tecidos anexos, a abundncia e acessibilidade do tecido linfide e a irrigao presente nos tecidos subjacentes facilita a disseminao sistmica desses vrus (ver Figura 8.3B). Da mesma forma, a anatomia especca do epitlio olfatrio fornece uma conexo direta com o SNC, o que favorece a invaso do encfalo por vrios vrus (ex. BoHV5). Por isso, apesar dos mecanismos naturais de defesa (muco e epitlio ciliar), o epitlio do trato respiratrio um importante local de replicao para vrios vrus. Os vrus que replicam no trato respiratrio podem produzir infeces localizadas (p. ex.: vrus da inuenza, vrus da parainuenza, vrus sinciciais respiratrios) ou se disseminar a partir desse local e infectar outros rgos e sistemas (CDV, BoHV-1 e 5 e BVDV) (ver Tabela 8.3). Alguns vrus tendem a replicar nas vias areas superiores, causando rinite ou rinotraquete (rinovrus e BoHV-1), outros replicam em segmentos intermedirios, provocando traquete ou bronquite (vrus da inuenza), enquanto outros atingem regies mais internas e podem estar as-
213
sociados com bronquiolite e pneumonia (vrus sincicial respiratrio bovino, BRSV). A replicao viral no epitlio respiratrio acompanhada de edema e inamao, resultando em interrupo da atividade ciliar, perda da integridade da camada de muco e destruio focal ou multifocal de clulas epiteliais. A destruio do epitlio e a perda da atividade ciliar contribuem para a colonizao bacteriana secundria. O auxo de clulas inamatrias e acmulo de transudato resultam no aumento da rea desprovida de muco e na exposio da superfcie celular. A infeco pode induzir a produo local de citocinas, que exacerbam o processo inamatrio e contribuem para a manifestao de sinais clnicos. Em estgios avanados, o edema da mucosa associado com o acmulo de transudato, inltrado inamatrio e restos celulares necrticos podem levar reduo importante do lmen e conseqente diculdade respiratria. Contaminaes bacterianas secundrias so freqentes em vrias infeces vricas e, muitas vezes, so as responsveis pela severidade do quadro clnico. Alm dos vrus que produzem infeces localizadas pela sua replicao no epitlio respiratrio, outros vrus utilizam esse epitlio como porta de entrada para a replicao primria e infeco de outros rgos (ver Tabela 8.3). O BoHV-1 replica no trato respiratrio e produz rinotraquete, mas tambm pode se disseminar sistemicamente e infectar o feto. O BoHV-5 e o PRV replicam no epitlio nasal e invadem o SNC, onde replicam maciamente e provocam meningoencefalite. O BVDV pode penetrar e replicar na mucosa nasofarngea, a partir da qual se dissemina sistemicamente e pode infectar o feto, podendo causar aborto ou malformaes. O CDV tambm pode utilizar a replicao respiratria como etapa inicial de uma disseminao sistmica. Os parvovrus podem atingir o epitlio intestinal ou o feto aps replicao primria e disseminao a partir da mucosa orofarngea. Nos vrus que atingem os rgos-alvo por viremia, a replicao secundria ocorre no tecido linfide adjacente mucosa respiratria e tambm nos linfonodos regionais. Os vrus que replicam no trato respiratrio, produzindo infeces respiratrias ou sistmicas, so excretados no muco nasal e/ou na saliva e
podem ser expelidos pela tosse, espirro, expectoraes ou durante a ingesto de gua e alimentos. Esses agentes so transmitidos por contato direto ou indireto e alguns podem ser veiculados por aerossis a distncias relativamente grandes.
3.3.4 Infeces do trato digestivo

As infeces vricas do trato gastrintestinal (TGI) so muito comuns, sendo superadas em freqncia somente pelas infeces respiratrias. A anatomia e siologia dos rgos que compem o TGI tambm oferecem condies favorveis para a instalao de infeces virais. Dentre estas se destacam a exposio a uma grande quantidade de agentes ingeridos com a gua e alimentos, a grande rea de superfcie e a existncia de diferentes tipos de epitlio nos vrios segmentos do TGI. As infeces intestinais ocorrem de forma direta, pela ingesto de partculas vricas (coronavrus, rotavrus e calicivrus), ou de forma indireta, por via hematgena aps a replicao viral na orofaringe (parvovrus). Os vrus que atingem o intestino aps a ingesto devem ser capazes de resistir ao pH cido do estmago e aos sais biliares do intestino delgado para estabelecer a infeco. Aps resistir a essas adversidades, o vrus deve ultrapassar a camada de muco e penetrar nas clulas epiteliais para iniciar a infeco. De acordo com a sua biologia, os vrus associados com infeco do TGI podem ser divididos em trs grupos principais: a) os vrus associados primariamente com replicao no TGI e que causam gastrenterite (parvovrus, calicivrus, astrovrus, coronavrus e rotavrus); b) os vrus excretados nas fezes, mas que no so enteropatognicos (vrios enterovrus, picornavrus, alguns adenovrus; vrus que causam hepatites); e c) vrus sistmicos que replicam no TGI e em outros rgos, podendo estar associados com gastrenterite (exemplo: BVDV). Infelizmente, a biologia de muitos vrus associados primariamente com gastrenterite muito pouco conhecida, pois muitos deles no replicam bem em cultivo celular, o que diculta o seu estudo e a produo de reagentes para o diagnstico.
214
Captulo 8
Vrus de vrias famlias replicam no TGI e esto primariamente associados com doena entrica e diarria. Embora esses agentes estejam freqentemente associados com enterite com caractersticas clnicas semelhantes, a sua patogenia apresenta algumas diferenas importantes. A maioria desses vrus atinge o intestino pela via oral e replica nos entercitos maduros das regies mais altas das vilosidades do intestino delgado (ID) (Figura 8.13). Os vrus que replicam e destroem essas clulas provocam a reduo da capacidade digestiva e absortiva do rgo, resultando em reteno de material parcialmente ou no-digerido no lmen intestinal. Isso leva reteno de gua, aumento de volume e fermentao excessiva nos segmentos terminais do ID e no intestino grosso, exacerbando o efeito osmtico que atrai gua para o lmen intestinal. Essa condio conhecida como sndrome da m-absoro primria. Os parvovrus atingem o intestino delgado pela via sangnea, aps a replicao na orofaringe. Esses vrus infectam as clulas das criptas intestinais, que so imaturas e se constituem nas clulas progenitoras dos entercitos das vilosidades (Figura 8.13). As clulas das criptas so os alvos principais de replicao do CPV e FPLV, pelo fato de apresentarem uma taxa acelerada de diviso, o que favorece a replicao viral. Essas
clulas esto em diviso ativa, pois so encarregadas de substituir gradativamente as clulas das vilosidades que vo sendo esfoliadas. Com a destruio das clulas das criptas pela replicao viral, a substituio das clulas das vilosidades se torna deciente. Isso leva tambm decincia dos processos absortivos do ID, o que caracteriza a sndrome de m-absoro secundria. A destruio das clulas das criptas pela replicao viral resulta em achatamento das vilosidades e reao inamatria severa. A destruio de entercitos maduros leva exposio das camadas adjacentes, hemorragia e desidratao. A presena de sangue nas fezes se constitui em um achado freqente em vrias infeces vricas intestinais, podendo estar associada com nveis importantes de mortalidade. Em ambos os casos, as vilosidades se tornam atroadas e achatadas, podendo ocorrer necrose progressiva e descamao. Embora a maioria desses vrus replique preferencialmente no epitlio do ID, alguns deles podem infectar as clulas epiteliais das vilosidades do intestino grosso. Em geral, a replicao desses vrus ca restrita ao epitlio do intestino, com pouca ou nenhuma replicao em clulas da lmina prpria e tecidos subjacentes. Outros vrus infectam populaes especcas de clulas, alm das clulas epiteliais, como os astrovrus (clulas M e das placas de Peyer do ID).
A
movimento dos entercitos em maturao
B
Rotavrus Astrovrus Calicivrus Coronavrus Adenovrus Torovrus Torovrus Astrovrus
Vilosidade
Entercitos maduros (no-mitticos, absortivos) Epitlio do Dome (clulas M)
Clulas das criptas (mitticas, secretrias)
Placas de Peyer Linfonodo
Parvovrus Torovrus
Fonte: adaptada de Conner e Ramig (1997).
Figura 8.13. Ilustrao simplificada da estrutura do epitlio do intestino delgado (A) e local de replicao de alguns vrus entricos (B).
215
O BVDV est freqentemente associado com quadros de enterite, nos quais a replicao viral nos epitlios e/ou no tecido linfide adjacente resulta em leses erosivas e ulcerativas disseminadas pelo trato GI. Com certa freqncia, essas leses podem ser observadas ao longo do TGI, incluindo a lngua, mucosa oral, esfago, rmen, abomaso e intestino delgado. Alm da replicao nas clulas epiteliais, o carter sistmico do agente e a sua capacidade de replicar em clulas do sistema linforreticular provavelmente contribuem para a patogenia dessas leses. Os vrus que replicam no epitlio intestinal ou em rgos anexos (fgado) geralmente so excretados em altos ttulos nas fezes e so transmitidos principalmente pela via fecal-oral. Esses vrus so geralmente resistentes s condies ambientais, o que favorece a sua sobrevivncia no ambiente e transmisso. Os vrus hepatotrpicos (p. ex.: CAdV-1 e hepadnavrus) tambm so excretados nas fezes. Alguns vrus replicam em rgos anexos ao trato digestivo e so excretados pela saliva, podendo ser transmitidos por mordeduras (vrus da raiva em ces, gatos e morcegos; arenavrus entre roedores; herpesvrus B em macacos) ou pelo contato direto ou indireto com as secrees contaminadas (CDV, CAdV-1 e FMDV).
3.3.5 Infeces do sistema nervoso central

O SNC se constitui em rgo-alvo para a replicao de diversos vrus, cuja infeco geralmente revestida de signicado especial pela sua importncia. Os vrus que produzem infeces neurolgicas e encefalite geralmente invadem o encfalo atravs dos nervos, mas vrios deles podem atingir esse rgo pela via hematgena. Os vrus que replicam em clulas do sistema nervoso so ditos neurotrpicos, mas a maioria deles tambm capaz de replicar em outras clulas. Duas propriedades devem ser denidas com relao a infeco neurolgica por vrus. O termo neuroinvasividade se refere capacidade dos vrus atingir o SNC aps a replicao em stios perifricos. Os vrus que produzem infeces neurolgicas sob condies naturais so neuroinvasivos, pois do
contrrio no seriam capazes de alcanar o encfalo aps a sua penetrao no hospedeiro. O termo neurovirulncia se refere capacidade dos vrus de replicar, disseminar-se no SNC e produzir doena neurolgica. Para a maioria dos vrus que produzem infeces neurolgicas, estas duas propriedades esto presentes simultaneamente. No entanto, tem sido demonstrado que alguns vrus podem ser neurovirulentos se inoculados diretamente no SNC, mas no so capazes de atingir o encfalo aps replicao em stios perifricos. Ou seja, so potencialmente neurovirulentos, mas no neuroinvasivos. Alguns isolados do BoHV-1, por exemplo, s produzem infeces neurolgicas em coelhos aps a inoculao intratecal ou intracerebral, no sendo capazes de invadir o encfalo aps a inoculao intranasal ou intraconjuntival. A via nervosa fornece um acesso direto ao encfalo, pois os vrus so transportados ao longo de bras conectadas sinapticamente. O transporte ao longo de axnios e dentritos e a transmisso atravs das sinapses permite aos vrions percorrer longas distncias e atingir o encfalo a partir dos stios perifricos de replicao. A penetrao de vrus no SNC a partir do sangue oferece obstculos adicionais, representados pela barreira hematoenceflica. Essa barreira formada pela estrutura especializada da parede de certos capilares, que apresentam clulas endoteliais justapostas; pela lmina basal espessa; pelo plexo coride; e pelo epitlio ependimal, que no apresenta espao entre as clulas. Embora estas barreiras sejam ecientes para evitar a penetrao de alguns vrus no SNC, parecem no serem capazes de impedir a penetrao de outros. provvel que alguns vrus consigam ultrapassar essas barreiras; outros podem infectar as clulas endoteliais e serem liberados na face oposta; uma minoria parece ser transportada do sangue para o tecido nervoso no interior de clulas sangneas. Aps a penetrao no tecido nervoso, o vrus pode se disseminar localmente pela infeco de neurnios e clulas da glia localizadas nas proximidades; pode se disseminar pelos espaos intercelulares; e pode tambm atingir regies mais profundas dos SNC por transpor-
216
Captulo 8
te transinptico. Embora as manifestaes clnico-patolgicas mais importantes das infeces neurolgicas devam-se a distrbios funcionais e morte dos neurnios, uma variedade de clulas pode ser infectada e contribuir para as patologias observadas. Ou seja, as patologias neurolgicas nem sempre so derivadas exclusivamente da infeco viral dos neurnios. Para vrios vrus que produzem infeces neurolgicas, as clulas-alvo da replicao no SNC ainda no so perfeitamente denidas. A identicao das clulas-alvo da replicao se constitui em um ponto-chave para o entendimento da patogenia de muitas infeces vricas neurolgicas. Os efeitos mais deletrios e mais estudados das infeces neurolgicas por vrus se devem destruio dos neurnios infectados. Dependendo do nmero de neurnios infectados e destrudos, esses eventos podem resultar em doena severa e na morte do hospedeiro, como ocorre em animais de laboratrio infectados experimentalmente com alguns buniavrus, vrus da raiva, herpesvrus e alfavrus. A morte celular pode dever-se a uma variedade de mecanismos, muitos j descritos na seco referente s interaes do vrus com as clulas hospedeiras (seo 2.1). A induo de apoptose em neurnios tambm tem sido implicada na patogenia de alguns vrus neurovirulentos. O tropismo especco do vrus por determinadas subpopulaes de neurnios pode inuenciar o padro de neurovirulncia e as conseqncias clnico-patolgicas da infeco. O poliovrus, por exemplo, infecta preferencialmente neurnios do corno anterior da medula espinhal, resultando em sintomatologia caracterstica. O buniavrus La Crosse infecta as clulas de Purkinge do cerebelo de camundongos infectados experimentalmente. A via de inoculao e penetrao no SNC tambm pode determinar as caractersticas clnico-patolgicas da infeco. O curso clnico e os sinais clnicos apresentados por coelhos inoculados com o BoHV-5 variam de acordo com a via de inoculao (intranasal e conjuntival), provavelmente reetindo diferentes padres temporais e espaciais de replicao viral no encfalo. Embora a infeco e destruio de neurnios seja o mecanismo mais atraente e talvez
aquele de ocorrncia mais freqente para explicar os distrbios neurolgicos associados com as infeces vricas do SNC, a ocorrncia de doena neurolgica grave sem infeco neuronal macia tambm tem sido descrita em infeces vricas. Isso demonstra que alguns vrus podem causar disfuno neuronal grave sem infeco ou morte de um nmero signicativo dessas clulas, o que poderia explicar, em parte, os casos de recuperao clnica que eventualmente ocorram aps infeces neurolgicas. Em muitos casos, ocorre a infeco de um nmero varivel de clulas da micrglia, de astrcitos e de oligodendrcitos, com um envolvimento pouco signicativo de neurnios. possvel que produtos virais txicos para os neurnios sejam liberados por essas clulas no meio extracelular. A liberao de citocinas e outros mediadores qumicos inamatrios tambm tm sido implicados na disfuno neuronal observada nessas infeces. Em particular, o xido ntrico que produzido por clulas da glia em resposta infeco vrica pode ser deletrio para os neurnios. De fato, tem sido demonstrado que as interaes entre clulas inamatrias e neurnios podem resultar em toxicidade e disfuno neuronal, sem necessariamente induzir a morte de neurnios. Os mecanismos efetores celulares e humorais da resposta inamatria tambm podem potencialmente contribuir para a injria e disfuno neuronal. Esses mecanismos podem explicar, em parte, a ocorrncia de doena neurolgica severa e at mesmo fatal, desacompanhada de infeco neuronal signicativa, como ocorre em algumas situaes. Alm das infeces neurolgicas agudas com conseqncias clnico-patolgicas variveis e freqentemente fatais alguns vrus estabelecem infeces persistentes no sistema nervoso. Uma parte das infeces agudas resulta em morte do hospedeiro dentro de poucos dias, tendo, assim, importncia epidemiolgica limitada (p. ex.: encefalites eqinas por alfavrus e avivrus, raiva e cinomose). Por outro lado, as infeces persistentes podem ter conseqncias epidemiolgicas mais importantes, pela perpetuao da infeco nos hospedeiros. Para estabelecer uma infeco persistente, o vrus no pode matar as clulas infectadas; ele deve manter a sua replica-
217
o em nveis baixos e possuir estratgias para escapar da vigilncia do sistema imunolgico. De fato, nessas infeces, a extenso da injria e leses geralmente muito pequena ou mesmo ausente. Por outro lado, a persistncia viral em clulas nervosas freqentemente associada com imunopatologia em neurnios e clulas da glia. O SNC apresenta caractersticas que podem favorecer a persistncia de infeces vricas, entre elas: possui uma populao estvel e heterognea de clulas susceptveis a vrios vrus; uma rede intrincada de processos (axnios e dendritos) que permite a disseminao do vrus a longas distncias; uma barreira hemato-enceflica que restringe o acesso de linfcitos T e anticorpos. No entanto, alguns vrus infectam concomitantemente clulas extraneurais e produzem viremia crnica, indicando que o SNC pode no oferecer todas as condies para a persistncia viral. As infeces persistentes do SNC podem ser classicadas em trs tipos principais, com conseqncias clnico-patolgicas e epidemiolgicas diferentes: infeces latentes, infeces crnicas defectivas e infeces crnicas produtivas. Os alfaherpesvrus (PRV, BoHV-1, BoHV-5 etc.) estabelecem infeces latentes em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos prximos ao stio de infeco primria. Durante a infeco latente, o genoma do vrus permanece inativo no ncleo dos neurnios, sem expresso gnica ou produo de prognie viral. Ocasionalmente, em situaes de estresse, o vrus retoma a replicao ativa e transportado de volta aos stios de penetrao, onde replica e excretado. A reativao da infeco importante na epidemiologia desses vrus, pois permite a excreo e transmisso a outros animais. Algumas vezes a reativao acompanhada de recrudescncia clnica, com o desenvolvimento de leses no stio de penetrao, e tambm com o desenvolvimento espordico de infeco neurolgica e meningo-encefalite (BoHV-5). Ces que se recuperam da infeco aguda pelo CDV acompanhada ou no de sinais clnicos podem car portadores do vrus, que segue replicando em nveis muito baixos no SNC, geralmente desacompanhado de excreo viral. Eventualmente esses animais desenvolvem um quadro de encefalite viral e vo a bito, mas
essa ocorrncia pode demorar anos. A persistncia do vrus no SNC, aps a infeco aguda, pode ser favorecida por mutaes que resultem na produo de vrus defectivos. Outra forma de infeco persistente no SNC a estabelecida pelo retrovrus MVV, nos quais o vrus estabelece infeco crnica em clulas da linhagem macrofgica com produo de vrus ausente ou espordica. O vrus da doena de Borna (BDV) de eqinos tambm estabelece infeco persistente no sistema nervoso, porm a produo de vrus parece ser contnua, apesar de ocorrer em nveis baixos.
3.3.6 Infeces do sistema linforreticular e hematopoitico

Vrios vrus utilizam clulas linforreticulares e/ou da linhagem hematopoitica como alvos de replicao em infeces naturais. A variedade de tipos celulares e a multiplicao contnua de algumas dessas clulas favorecem a replicao desses vrus. Da mesma forma, a contnua recirculao dessas clulas especialmente os linfcitos favorece o carter sistmico dessas infeces. Em geral, a infeco se inicia nos rgos linfides secundrios, aps a drenagem da linfa dos tecidos ou com a passagem do sangue pelo bao. Os vrus presentes na linfa e/ou sangue so capturados por ou infectam clulas da linhagem monoctica/macrofgica, clulas dentrticas ou linfcitos dos linfonodos, bao, placas de Peyer e outros acmulos linfides. A replicao viral nessas clulas seguida da produo de prognie viral que infecta um nmero adicional de clulas prximas, alm de permitir a sua disseminao sistmica atravs de clulas circulantes. Assim o vrus pode se distribuir por outros rgos linforreticulares e se disseminar nesses tecidos. Infeces de clulas progenitoras hematopoiticas da medula ssea podem ocorrer nesses estgios da infeco. Os macrfagos, clulas dendrticas, linfcitos T e B so alvos de replicao de uma variedade de vrus que causam doenas em animais. Alm dessas, clulas progenitoras da linhagem linfide, mielide ou hematopoitica da medula ssea podem ser infectadas por alguns vrus e comprometer a reposio das clulas sangneas (alguns vrus induzem trombocitopenia).
218
Captulo 8
A infeco macia do sistema linforreticular freqentemente leva depleo linfide e disfuno da resposta imunolgica. A disfuno do sistema imunolgico pode resultar em decincias na resposta a outros patgenos, com predisposio a infeces secundrias. Vrios vrus animais tm sido associados com infeco do sistema linfide e induo de imunossupresso, incluindo o vrus da doena de Gumboro em aves (IBDV), o FIV e o vrus da imunodecincia bovina (BIV). Outros vrus, como o BVDV, CSFV, CDV e CPV podem estar associados com quadros transitrios de supresso imunolgica. A imunossupresso produzida por esses vrus pode dar-se em razo de vrios mecanismos e ser abordada em seo especca. Alguns dos vrus mais virulentos para humanos e animais esto associados com infeces do tecido linforreticular e hematopoitico, incluindo o vrus ebola (lovrus), arenavrus, hantavrus, o vrus da febre do vale Rift (um buniavrus), o VEEV, CSFV e ASFV. Esses vrus esto associados com doena severa, caracterizada pelo curso agudo e pela ocorrncia de leses vasculares, disfunes hemodinmicas, de coagulao sangnea e ocorrncia de eventos hemorrgicos. Alguns isolados do BVDV tambm tm sido associados com doena aguda severa acompanhada de componentes hemorrgicos. Essas enfermidades possuem algumas caractersticas em comum, como o curso agudo, a ocorrncia de alteraes vasculares, leses endoteliais com perda de lquido vascular, proteinria e edemas. As manifestaes mais comuns da injria nos endotlios vasculares incluem hiperemia acentuada, petquias e sufuses nas mucosas e serosas, equimoses e hemorragias pontuais disseminadas em quadros severos. Quadros de choque hipovolmico so freqentes em estgios avanados da doena. As hemorragias e extravasamento de plasma podem ser por causa da injria nos endotlios vasculares pela replicao viral nas clulas endoteliais, por alteraes na coagulao sangnea (coagulao intravascular disseminada com consumo de plaquetas) ou ainda por trombocitopenia primria.
3.3.7 Infeco fetal

Os tecidos embrionrios e fetais apresentam uma alta taxa de multiplicao celular e, por isso, constituem-se em stios de predileo para a replicao de vrios vrus. Os vrus que infectam o feto se disseminam pela via hematgena e vrios deles produzem infeces inaparentes ou leves nas fmeas prenhes. Nesses casos, as conseqncias maiores da infeco so devidas s perdas reprodutivas. As conseqncias da infeco fetal variam com a espcie e cepa do vrus, com o status imunolgico da fmea e com a fase de gestao em que ocorre a infeco. As infeces que ocorrem em fases precoces da gestao so geralmente acompanhadas de morte embrionria ou fetal. Infeco fetal em estgios intermedirios pode produzir teratogenia ou abortos e infeco em fases avanadas pode induzir abortos, natimortos ou resultar em resposta imunolgica e erradicao da infeco pelo feto. A infeco fetal tambm pode representar um meio para o vrus persistir na populao, pela gerao de animais imunotolerantes e persistentemente infectados, capazes de disseminar o vrus por longos perodos. A produo de neonatos persistentemente infectados caracterstica da infeco fetal por cepas no-citopticas do BVDV entre os 40 e 120 dias de gestao, e pode ocorrer tambm com os pestivrus suno e ovino. Os efeitos da infeco fetal pelo BVDV esto ilustrados na Figura 8.14. Os efeitos observados no feto podem deverse replicao viral nos tecidos fetais e/ou replicao na placenta e interferncia com as funes placentrias. A mortalidade fetal pode ser seguida de reabsoro, mumicao fetal ou abortamento. Os abortos associados com infeces vricas geralmente ocorrem dias ou semanas aps a infeco, o que diculta a deteco de vrus e/ou produtos virais nos tecidos fetais e conseqentemente o diagnstico. Dentre os vrus animais que produzem infeces embrionrias e fetais destacam-se:
219
herpesvrus de vrias espcies: mortalidade fetal, abortos, doena ou mortalidade neonatal; pestivrus de bovinos (BVDV), sunos (CSFV) e ovinos (border disease virus BDV): mortalidade fetal, abortos, malformaes, natimortalidade, nascimento de animais persistentemente infectados; vrus da lngua azul (BTV, um orbivrus) em ovinos e bovinos: mortalidade fetal, abortos, malformaes congnitas; parvovrus suno (PPV): reabsoro embrionria, mortalidade fetal, abortos, mumicao, natimortalidade; vrus da panleucopenia felina (FPLV): hipoplasia cerebelar;
vrus da leucemia felina (FeLV): leucemia, mortalidade fetal; vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) e vrus da arterite viral eqina (EAV): mortalidade fetal, abortos; vrus Akabane (ovinos e bovinos): morte fetal, abortos, malformaes, natimortalidade; vrus da febre do vale Rift (RVFV) em ovinos: mortalidade fetal e abortos. Perdas reprodutivas por alguns desses agentes tambm tm sido relatadas aps o uso de vacinas atenuadas contendo os respectivos agentes. Por outro lado, para os vrus que causam perdas reprodutivas importantes, a vacinao deve ser realizada antes da cobertura ou inseminao para prevenir a infeco fetal e, assim, minimizar as perdas.
BVDV ncp ou cp Soropositivo, sem o vrus ncp Bezerro PI Natimortos Malformaes Bezerros PI Infertilidade Abortos
ncp ou cp
Atrofia da retina Cegueira

Embrio muito susceptvel Efeitos na fertilizao, implantao Leses no SNC Bezerros saudveis soropositivos
Imunotolerncia (PI) Abortos
40
80
120
160
200
240
280
D I A S D E G E S TA O
Figura 8.14. Efeitos da infeco de fmeas bovinas prenhes pelo vrus da diarria viral bovina (BVDV). As conseqncias da infeco dependem do status imunolgico da fmea, da cepa do vrus (biotipo e virulncia) e do estgio de desenvolvimento do embrio/feto.
220
Captulo 8
4 Padres principais de infeco

A sobrevivncia dos vrus como espcie depende de infeces sucessivas e contnuas de diferentes indivduos e/ou de infeces prolongadas no mesmo indivduo. Por outro lado, o resultado da infeco viral em um animal depende de interaes mltiplas entre componentes virais e do hospedeiro. Objetivamente, depende do balano entre as estratgias virais para se perpetuar no organismo e dos mecanismos de defesa do hospedeiro para erradicar o agente. Apesar da diversidade dos vrus e da complexidade de suas interaes com os hospedeiros, dois padres
principais de infeco podem ser reconhecidos: as infeces agudas e as infeces crnicas (ou persistentes). No entanto, variaes e combinaes desses tipos tambm ocorrem com freqncia (Figura 8.15). Alguns vrus produzem infeces agudas, que se caracterizam pela curta durao e rpida erradicao do agente pela resposta imunolgica do hospedeiro. Outros vrus produzem infeces persistentes ou crnicas, caracterizadas pela permanncia do agente no hospedeiro por longos perodos, muitas vezes pelo resto da vida. A natureza autolimitante das infeces agudas se deve principalmente ecincia do sistema imunol-
Infeco Aguda
Infeco Latente
Infeco Persistente
Infeco Persistente temporria
Replicao viral Manifestaes clnicas
Figura 8.15. Principais padres de infeco.
221
gico do animal em combater e erradicar a infeco. Visto por outro ngulo, o carter transitrio dessas infeces se deve incapacidade dos vrus persistir no animal na presena da resposta imunolgica. As infeces persistentes ou crnicas tambm podem ser vistas sob duas ticas: a) do ponto de vista do hospedeiro, a persistncia do agente em seus tecidos reete a incapacidade do sistema imunolgico de erradic-lo; e b) do ponto de vista do agente, a persistncia o resultado de estratgias evolutivas, que foram desenvolvidas para se adaptar ao hospedeiro e escapar da vigilncia do sistema imunolgico, garantindo, assim, a sua permanncia no animal.
es entricas por rotavrus em vrias espcies, vrus da inuenza em sunos e eqinos, vrus da raiva em vrias espcies, CPV, entre outras.
4.2 Infeces persistentes ou crnicas

As infeces crnicas ou persistentes se caracterizam pela persistncia do vrus ou do genoma viral no hospedeiro por longos perodos. A maioria dessas infeces se inicia como uma infeco aguda, caracterizada por uma rpida replicao viral, acompanhada ou no de sinais clnicos. No entanto, ao contrrio das infeces agudas, a resposta imunolgica montada pelo hospedeiro no capaz de erradicar o agente, resultando na sua permanncia nos tecidos por perodos variveis. Diferentes tipos de infeces crnicas podem ser reconhecidos de acordo com a biologia do agente, com a dinmica de replicao viral (ausncia ou presena de replicao ativa) e com a durao. Em geral, os nveis de replicao e excreo viral nas infeces crnicas so muito mais baixos do que nas infeces agudas e, algumas vezes, podem ser dicilmente detectveis. De acordo com a ocorrncia ou no de replicao viral durante a persistncia, dois tipos principais de infeces crnicas so reconhecidos: as infeces latentes e as infeces persistentes. As infeces latentes so caracterizadas pela permanncia do genoma viral nas clulas do hospedeiro, na maior parte do tempo sem replicao e produo de vrus. A replicao e produo de prognie viral somente ocorrem em situaes espordicas e duram horas ou poucos dias. J nas infeces persistentes, a replicao viral ocorre de forma contnua, em nveis variveis, e freqentemente acompanhada de excreo do agente. Em algumas infeces persistentes, no entanto, os nveis de replicao so to baixos e em determinados tecidos do organismo que no so acompanhados de excreo viral detectvel (p. ex.: persistncia do CDV no encfalo de ces adultos e persistncia do FMDV na faringe). Em outras, a replicao e excreo viral ocorrem de forma contnua e em nveis signicativos. As infeces persistentes aquelas que cursam com replicao viral contnua podem ser agrupadas em duas classes, que so determinadas pela biologia dos vrus e por suas interaes
4.1 Infeces agudas

A principal caracterstica das infeces agudas o curto perodo de tempo em que o vrus replica no organismo do hospedeiro. o padro de infeco mais estudado e conhecido e caracterstico de vrios vrus que replicam com ecincia em animais e em cultivos celulares. O termo aguda se refere rapidez de replicao e produo de prognie viral, que seguida tambm por uma rpida resoluo e erradicao da infeco. Os nveis de replicao viral no organismo aumentam rapidamente, atingem um pico aps alguns dias e decrescem tambm com certa rapidez (Figura 8.15). A reduo dos nveis de vrus no organismo coincide com o desenvolvimento de resposta imunolgica humoral (anticorpos) e celular (linfcitos T citotxicos). Em geral, a resposta imunolgica capaz de erradicar o agente dos tecidos aps alguns dias. Se, por um lado, o curto perodo de replicao e excreo pode ser detrimental para a sobrevivncia do vrus na populao, os altos ttulos de vrus que so excretados favorecem a transmisso do agente. importante ressaltar que o termo aguda se refere cintica de replicao viral (nveis e tempo) e no s manifestaes clnicas. De fato, muitas infeces agudas so absolutamente subclnicas, ou seja, so desacompanhadas de manifestaes clnico-patolgicas. No obstante, muitas vezes as infeces agudas no podem ser controladas pelo sistema imunolgico e resultam em doena de severidade varivel, algumas vezes fatais. Exemplos de infeces agudas incluem as infec-
222
Captulo 8
com o hospedeiro. Para alguns vrus, o estabelecimento de infeco persistente uma regra e ocorre em, virtualmente, todos os indivduos infectados. Em outras palavras, a persistncia uma caracterstica biolgica inerente s relaes daquele vrus com os seus hospedeiros. Esse tipo de infeco persistente se prolonga por tempo indeterminado, provavelmente por toda a vida do animal. Essas so as infeces persistentes clssicas e so caractersticas das infeces pelos retrovrus animais, alm de outros vrus. Em outros grupos de vrus, infeces persistentes podem ser estabelecidas aps a infeco aguda, em um nmero varivel de indivduos, e a persistncia geralmente possui durao varivel, no necessariamente indenida. Nesses casos, a persistncia uma conseqncia provvel e muitas vezes freqente da infeco, mas no se constitui em regra ou padro biolgico da infeco por esses vrus. Alm disso, grande parte dos animais que se tornam portadores consegue erradicar a infeco aps algum tempo, determinando o m da persistncia, ou seja, so infeces persistentes temporrias (Figura 8.15). Algumas infeces persistentes so acompanhadas de sinais clnicos crnicos, que podem ser brandos ou graves; outras vezes a infeco absolutamente inaparente. Vrias infeces crnicas resultam em patologias progressivas de desenvolvimento lento (MVV, CAEV, vrus da pneumonia progressiva dos ovinos [OPPV] e FeLV), em imunopatologia ou imunodecincia (EIAV, FIV e LCMV) ou no desenvolvimento de neoplasias malignas (vrus da leucose aviria [ALV] e BLV). Essas patologias so mais comumente observadas nas infeces persistentes clssicas. Os locais de persistncia do vrus no so necessariamente os mesmos em que o vrus replicou e produziu patologias na fase aguda e, freqentemente, incluem stios de acesso restrito do sistema imunolgico. Os padres de replicao e excreo viral durante as infeces crnicas tambm so muito variveis. Em algumas infeces, a replicao viral contnua e ocorre em nveis moderados a altos; em outras, os nveis de replicao so muito baixos, com pouca ou nenhuma excreo viral. J as infeces latentes so caracterizadas por longos perodos de absoluta ausncia de replicao viral intercaladas com episdios espordicos de reativao, replicao e excreo viral.
4.2.1 Infeces latentes

Esse tipo de infeco tpico dos alfaherpesvrus animais (BoHV-1, BoHV-5, PRV, EHV1, herpesvrus canino, herpesvrus felino, entre outros) e se caracteriza pela permanncia do genoma viral inativo em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos aps o trmino da replicao na fase aguda. Durante a infeco latente no ocorre produo de protenas virais, replicao do genoma ou produo de partculas vricas. Com isso, os neurnios que abrigam o genoma viral no so reconhecidos como infectados pelo sistema imunolgico, o que permite ao vrus escapar da vigilncia imunolgica. O genoma viral no integrado aos cromossomos celulares e permanece como um epissomo, fortemente associado com protenas celulares no ncleo dos neurnios. Esporadicamente, geralmente associado com situaes de estresse e produo de glicocorticides endgenos, a infeco reativada e o vrus replica de forma aguda e excretado. O perodo e a magnitude de excreo viral durante a reativao so geralmente bem inferiores queles observados durante a infeco aguda. A reativao da infeco ocasionalmente acompanhada de manifestaes clnicas, geralmente mais brandas do que aquelas observadas durante a infeco aguda. As reativaes ocorrem a intervalos variveis (semanas, meses, anos) em uma parcela dos indivduos e possvel que alguns hospedeiros no apresentem episdios de reativao. A infeco latente representa um meio do vrus se perpetuar no hospedeiro, e a sua reativao peridica permite a sua excreo e transmisso.
4.2.2 Infeces persistentes ou crnicas

Essas infeces se caracterizam pela contnua replicao e produo de partculas vricas nos tecidos do hospedeiro por tempo ilimitado, provavelmente por toda a vida do animal. possvel se detectar o agente infeccioso em qualquer momento aps a infeco aguda, desde que se examinem os tecidos certos com tcnicas apropriadas. As infeces persistentes se estabelecem porque o sistema imunolgico do hospedeiro no consegue erradicar o vrus durante a infeco
223
aguda. Subseqentemente, por diferentes mecanismos, o agente consegue coexistir com uma resposta imune que mantm um controle parcial da infeco, sem conseguir elimin-la totalmente. Os nveis de replicao nesse tipo de infeco variam de acordo com o vrus. Alguns vrus mantm nveis considerveis de replicao de forma contnua; outros apresentam uma replicao mnima, s vezes, de difcil deteco. As infeces pelos retrovrus animais (EIAV, BLV, FeLV, CAEV, entre outras), BTV e infeco persistente pelo BVDV so exemplos clssicos de infeces vricas persistentes. No caso dos retrovrus, a manuteno da infeco se deve integrao denitiva de cpias DNA do genoma viral nos cromossomos das clulas hospedeiras, ou seja, as clulas infectadas cam persistentemente infectadas e, caso se multipliquem, transmitem o genoma viral para a sua prognie. Assim, geraes sucessivas de clulas produzem vrus infecciosos ao longo da vida do animal. No caso do BLV, a manuteno da infeco persistente deve-se principalmente a divises celulares contnuas e transmisso do genoma viral para a prognie, do que produo de vrus infecciosos. interessante observar que os retrovrus, alm de inserir o seu material gentico nos cromossomos do hospedeiro, tambm sofrem contnuas mutaes que contribuem para a sua perpetuao no animal infectado. As infeces persistentes pelo BVDV somente ocorrem em animais que tenham sido infectados intra-uterinamente, entre os 40 e 120 dias de gestao. Esses animais se tornam imunotolerantes e so incapazes de montar uma resposta imunolgica contra o vrus infectante. Assim, o vrus pode replicar continuamente em altos ttulos no tecido linforreticular e epitlios dos animais, sem a interferncia do sistema imunolgico.
4.2.3 Infeces persistentes temporrias

Em alguns vrus, a infeco aguda pode ser seguida de persistncia do agente nos tecidos do hospedeiro por perodos variveis. Em algumas delas, a persistncia ocorre apenas em alguns animais, no se constituindo em uma regra. Em
outros casos, as infeces crnicas que se seguem s infeces agudas parecem ocorrer na maioria, seno em todos os animais. Os nveis de replicao e excreo viral variam de acordo com o agente e com a resposta do hospedeiro. A durao da persistncia tambm varivel, podendo ser de meses e at anos (ou at mesmo por toda a vida do animal). Naqueles casos em que a erradicao do agente ocorre aps algum tempo, provvel que o vrus tenha esgotado o seu arsenal de estratgias para persistir no animal, sendo eventualmente combatido pelo sistema imune. Vrios vrus produzem este tipo de infeco. O PRRSV permanece replicando nos testculos de reprodutores sunos por at seis meses aps a infeco aguda. O CAdV-1 tambm pode permanecer durante meses replicando no epitlio dos tbulos renais, que so locais de acesso restrito do sistema imunolgico. A infeco pelo CDV um exemplo de infeco que geralmente aguda na maioria dos animais mas pode se tornar crnica em uma parcela dos ces que no conseguem erradicar o vrus na fase aguda. Nesses animais, o vrus persiste replicando em nveis baixos no SNC. Essa replicao no acompanhada de excreo viral em secrees ou excrees. A maioria desses animais eventualmente desenvolve doena neurolgica de curso fatal, em um prazo que varia de meses a anos. No caso do calicivrus felino (FCV), a persistncia do vrus no hospedeiro parece ser favorecida pela ocorrncia contnua de mutaes genticas que resultam em variantes virais que escapam da resposta imune do animal. O FMDV produz uma infeco clnica aguda (febre aftosa) que se resolve em poucos dias. No entanto, uma parcela dos animais permanece abrigando o vrus na faringe por um determinado tempo. Os nveis de replicao so geralmente muito baixos e parecem no ser acompanhados de excreo viral. Alguns arenavrus e hantavrus produzem infeces crnicas em roedores silvestres. Essas infeces so acompanhadas por viremia prolongada muitas vezes por toda a vida e de transmisso vertical do vrus para a prognie. J as infeces crnicas por hantavrus so caracterizadas por viremia transitria seguida de excreo prolongada de vrus pela saliva, secrees nasais, fezes e urina. Esses vrus podem ser ocasional-
224
Captulo 8
mente transmitidos para humanos e so importantes causas de febres hemorrgicas. A Tabela
8.4 apresenta as principais caractersticas das infeces virais persistentes.
Tabela 8.4 Stios de persistncia de vrus que estabelecem infeces latentes ou persistentes nos hospedeiros Tipo Famlia/subfamlia Vrus
BoHV-1 BoHV-5 BoHV-2 CaHV-1 Herpesviridae/ Alphaherpesvirinae FHV-1 CpHV PRV
Espcie
bovina bovina bovina canina felina caprina suna eqina aves suna ruminantes eqina aves bovina ovina caprina felina eqina aves ovina felina canina felina bovina, ovina e suna aves eqina suna bovina e ovina patos, gansos, marmotas, esquilos ovinos
Local de persistncia
Gnglios sensoriais e autonmicos, tonsilas e linfcitos T (BoHV-1.1), linfonodos da regio sacral (BoHV-1.2). Gnglio trigmeo e stios do SNC. Gnglio trigmeo, pele e linfonodos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglio trigmeo, bulbo olfatrio, tronco cerebral, medula espinhal, tonsilas. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Glndula salivar, epitlio vesical e clulas mononucleares. Clulas linfoblastides. Clulas linfoblastides. Clulas da glndula da casca e do oviduto. Linfcitos B. Moncitos e macrfagos. Linfcitos, SNC, epitlio alveolar, moncitos e macrfagos. Clulas mielides, linfcitos T e B. Macrfagos e linfcitos. Clulas linfides, mielides, renais, sseas, endoteliais e mesenquimais. Clulas epiteliais do sistema respiratrio. Macrfagos. SNC (oligodendrcitos). Epitlio respiratrio e anexos. Clulas do sistema imune, SNC, medula ssea, clulas endoteliais e clulas epiteliais dos sistemas respiratrio e digestrio. Linfcitos T. Mucosa respiratria, adenides. Tecido linfide, rins e testculos. Clulas hematopoiticas.
Latente
EHV-1, 3 e 4 GaHV-1 Herpesviridae/ Betaherpesvirinae Herpesviridae/ Gammaherpesvirinae Adenoviridae PCMV (SHV-2) MCFV (AHV-1) EHV-2 e 5 DAdV-A BLV Maedi/ Visna CAEV FIV/FeLV Retroviridae EIAV ALV Vrus Jaagsiekte OPAV
Persistente
Coronaviridae Paramyxoviridae Caliciviridae
FIPV CDV* FCV BVDV, BDV e CSFV** MDV (GaHV-2) EAdV-2 PPV*** BTV DHBV, WHBV, GSHBV
Flaviviridae
Alphaherpesvirinae Adenoviridae Parvoviridae Reoviridae Hepadnaviridae
Hepatcitos.
225
Tabela 8.4 Continuao

Tipo Famlia/subfamlia Vrus
BPV-1 a 7 Papillomaviridae CaPV EPV-1 e 2 Adenoviridae CAdV-1 ASFV PCV-1 e 2 FMDV PRRSV Arteriviridae EAV TGEV Coronaviridae IBV Bornaviridae BDV aves eqina Clulas do epitlio renal. Neurnios, astrcitos e oligodendrcitos. eqina suna
Espcie
bovina canina eqina canina suna e bubalina suna bovina, suna e ovina suna
Local de persistncia
Clulas epiteliais. Clulas epiteliais. Clulas epiteliais. Epitlio dos tbulos renais. Clulas mononucleares e fagocticas, tonsilas e linfonodos. Clulas mononucleares sangneas, macrfagos e linfcitos. Mucosa da orofaringe. Macrfagos, clulas germinativas dos testculos. Macrfagos, clulas endoteliais e mesoteliais. Mucosas respiratria e intestinal.
Persistente temporria
Asfarviridae Circoviridae Picornaviridae
* Alguns animais que se recuperam da doena ficam portadores,mas no excretam o vrus, que replica em nveis baixos no SNC. **Fetos infectados em determinada fase de gestao ficam imunotolerantes e nascem persistentemente infectados. ***Alguns fetos infectados no tero se tornam imunotolerantes e ficam portadores, excretando o vrus por longos perodos.
4.3 Mecanismos envolvidos na manuteno das infeces persistentes

Os mecanismos envolvidos no estabelecimento e manuteno das infeces persistentes so muito complexos e pouco esclarecidos at o presente. No entanto, independentemente dos mecanismos responsveis, a manuteno de uma infeco vrica no organismo deve preencher trs condies essenciais: a) a infeco celular deve ser no-citoltica (ou de citopatogenicidade limitada); b) manuteno do genoma viral nas clulas do hospedeiro, e c) evaso da resposta imune do hospedeiro. Vrios mecanismos adicionais ou complementares tm sido sugeridos para explicar a persistncia desses agentes em tecidos do hospedeiro, por longos perodos, a despeito da resposta imunolgica desencadeada contra eles. provvel que nenhuma infeco persistente seja mantida por causa de apenas um desses mecanismos; ao contrrio, provavelmente so mantidas pela combinao de vrios deles.
4.3.1 Restrio do efeito citopatognico

Os vrus que produzem infeces no-citolticas so mais propensos a estabelecerem infeces persistentes, pois a sua replicao no resulta na destruio das clulas infectadas (ou resulta em destruio limitada). Exemplos de vrus nocitolticos que causam infeces persistentes so alguns arenavrus (infeco renal persistente em roedores), o BVDV (infeco de clulas do sistema linforreticular) e o vrus da hepatite B (infeco no-citoltica de hepatcitos).
4.3.2 Infeco de clulas semipermissivas

A replicao dos alfaherpesvrus em clulas epiteliais e do tegumento altamente citoltica, o que tambm observado em uma variedade de clulas in vivo e in vitro. A infeco tambm citoltica em vrios tipos de neurnios. No entanto, alguns neurnios sensoriais e autonmicos no so permissivos replicao ltica aguda. Como
226
Captulo 8
conseqncia, aps penetrar e ter o seu ciclo replicativo interrompido, o vrus estabelece infeces latentes nesses neurnios, ou seja, a infeco de clulas semi-permissivas infeco ltica o mecanismo responsvel pela persistncia dos alfaherpesvrus nos seus hospedeiros. Sob determinadas condies, esses neurnios que abrigam o genoma viral se tornam permissivos, o que desencadeia a reativao e replicao viral.
4.3.3 Infeco de um pequeno nmero de clulas

Essa forma de infeco tem sido observada por alguns vrus in vitro e possvel que tambm ocorra in vivo. Candidatos para esse tipo de modulao so os adenovrus e os arterivrus (EAV em eqinos e PRRSV em sunos). A infeco persistente no hospedeiro seria mantida atravs de infeces sucessivas citolticas ou no de um nmero pequeno de clulas a cada ciclo. Os vrus produzidos por essas clulas infectariam outra pequena populao de clulas e, assim, a infeco se prolongaria sucessivamente. Provavelmente algum mecanismo concomitante de evaso do sistema imune seja necessrio para permitir a ocorrncia dessas infeces continuadas, mesmo em baixos nveis.
sistncia no hospedeiro. Em muitos vrus, essas estratgias provavelmente complementam os outros mecanismos envolvidos na permanncia do agente no organismo. Os mecanismos mais utilizados pelos vrus para evaso da resposta imune so: a) restrio de produo das protenas virais (como no caso da latncia dos herpesvrus); b) infeco de locais imunologicamente privilegiados (p. ex.: infeco das clulas do SNC pelo CDV e e de clulas do epitlio seminfero dos testculos pelo PRRSV); c) variao antignica (EIAV, FCV e FMDV); d) tolerncia imunolgica (bovinos persistentemente infectados pelo BVDV); f) interferncia com clulas e molculas do sistema imunolgico (adenovrus e poxvrus).
5 Oncognese por vrus

A transformao celular e produo de tumores esto entre as conseqncias da replicao de alguns grupos de vrus nos seus hospedeiros. De fato, acredita-se que uma parte considervel dos tumores de humanos e animais possua a participao direta ou indireta de agentes virais. De acordo com o vrus, diferentes tipos celulares e rgos podem ser afetados, com conseqncias diversas. Alguns tumores induzidos por vrus so benignos, mas uma parcela importante constituda por neoplasias malignas que resultam em doena progressiva e morte do animal. Para alguns vrus indutores de tumores, os mecanismos moleculares de oncognese j foram razoavelmente esclarecidos. Para outros vrus, no entanto, esses mecanismos permanecem obscuros e se constituem em temas de contnuas investigaes. Dentre os vrus animais associados com neoplasias, encontram-se famlias de vrus RNA (retrovrus) e DNA (poliomavrus, papilomavrus, adenovrus e hepadnavrus).
4.3.4 Manuteno do genoma viral nas clulas hospedeiras

A manuteno do genoma viral nas clulas do hospedeiro pode ocorrer por dois mecanismos distintos: pela integrao do genoma viral nos cromossomos da clula do hospedeiro, como ocorre com as infeces pelos retrovrus, ou pela manuteno do genoma como elemento extracromossomal no ncleo da clula, como ocorre nas infeces latentes pelos alfaherpesvrus e papilomavrus.
5.1 Oncognese por retrovrus

Os retrovrus envolvidos com a produo de tumores tambm chamados de oncornavrus so amplamente distribudos na natureza e tm sido isolados de virtualmente todas as espcies animais. Esses vrus diferem entre si em relao ao tropismo celular, potencial oncognico, per-
4.3.5 Evaso da resposta imune do hospedeiro

As estratgias de evaso do sistema imunolgico esto entre os mecanismos mais importantes utilizados pelos vrus para assegurar a sua per-
227
odo de incubao e mecanismo de oncognese. Com base no tempo necessrio para a produo dos tumores, os oncornavrus podem ser divididos em vrus transformantes no-agudos, agudos e transindutores. Os retrovrus transformantes no-agudos induzem a formao de neoplasias aps um longo perodo de incubao (meses at dcadas), assim como os transindutores. Os retrovrus transformantes agudos induzem tumores em um intervalo menor de tempo (semanas). Os mecanismos de oncognese tambm variam entre os grupos. Os retrovrus transformantes no-agudos esto envolvidos em vrios tipos de neoplasias, incluindo linfomas e leucemias. Esses vrus no possuem genes especcos com atividade oncognica no seu genoma. Ao contrrio, induzem oncognese pela integrao do seu genoma (provrus DNA) nas proximidades de proto-oncogenes celulares ou de genes envolvidos no controle do ciclo e diferenciao celular. Com isso, a expresso desses genes alterada e pode levar transformao tumoral. Este processo denominado de oncognese insercional. Os retrovrus transformantes agudos podem induzir a formao de tumores dentro de poucos dias. Ao contrrio do grupo anterior, esses vrus possuem oncogenes (genes oncognicos) no seu genoma. Mais de 30 diferentes oncogenes j foram identicados no genoma de retrovrus animais e todos eles parecem ter sido adquiridos integralmente ou por rearranjos do genoma dos hospedeiros em infeces passadas. As funes dos produtos desses oncogenes so variveis e incluem desde quinases at fatores de transcrio. Uma caracterstica comum a quase todos os oncogenes retrovirais identicados at o presente que os seus produtos esto envolvidos em mecanismos de sinalizao intracelular (signal transduction). Retrovrus com essas caractersticas j foram identicados em vrias espcies animais e tm sido associados com uma grande variedade de tumores, incluindo sarcomas, carcinomas e linfomas em aves; sarcomas e linfomas em roedores; brossarcomas e linfossarcomas em felinos; e sarcoma em primatas. Os retrovrus transformantes transindutores produzem leucemias monoclonais de linfcitos T
e B aps um longo perodo de incubao. Entre esses vrus se destacam o vrus da leucemia de linfcitos T humano (HTLV) e o BLV. O genoma desses vrus no possui oncogenes e o mecanismo de induo da oncognese difere daqueles dos dois grupos anteriores. A transformao tumoral induzida por esses vrus parece estar ligada funo dos produtos de dois genes acessrios, tax e rex, que tambm possuem papel importante no ciclo replicativo do vrus. A protena Rex essencial para o ciclo replicativo ltico do HTLV, mas a sua participao na oncognese permanece desconhecida. J a protena Tax necessria para o ciclo ltico e tambm para a transformao tumoral das clulas hospedeiras. Esta protena um potente transativador de transcrio do provrus viral e tambm de vrios genes celulares. J foi demonstrado que vrios genes celulares que possuem um papel potencial na regulao do ciclo celular podem ser ativados pela protena Tax. Por isso a ativao de genes envolvidos no controle do ciclo celular um dos provveis mecanismos de oncognese pelos retrovrus transindutores.
5.2 Pequenos vrus DNA tumorignicos

Algumas famlias de vrus DNA possuem membros que tm sido associados com tumores, seja em infeces naturais ou aps inoculao experimental. Alguns deles produzem tumores em animais e, por isso, possuem importncia em medicina veterinria. Em particular, alguns vrus das famlias Polyomaviridae e Papillomaviridae tm sido associados com tumores em seus hospedeiros naturais e tm comprovado o seu potencial oncognico aps inoculao em hospedeiros heterlogos. O primeiro vrus DNA tumorignico identicado foi o CRPV (papilomavrus dos coelhos cauda-de-algodo) que causa papilomas cutneos benignos nos hospedeiros naturais. Quando inoculado em coelhos domsticos, no entanto, o CRPV induz papilomas que tendem a progredir e se tornar carcinomas. Vrios aspectos da tumorignese associada com infeces virais foram estudados nesse modelo animal. O papilomavrus de camundongos tambm tem sido associado com tumores mltiplos, sobretudo aps inoculao experimental em neonatos. O vrus
228
Captulo 8
smio 40 (SV-40), tambm um membro da famlia Polyomaviridae, capaz de produzir tumores em hamsters recm-nascidos. O SV-40 tambm tem sido associado com alguns tumores raros em pessoas que foram vacinadas h aproximadamente 50 anos com uma vacina antipoliomielite contaminada com o vrus. Os papilomavrus bovinos (BPVs) tambm tm sido associados com a induo de tumores nos seus hospedeiros. O BPV-1 est associado com papilomas e bropapilomas, tumores cutneos de carter benigno e com freqncia muito menor, a tumores cutneos malignos. O BPV-4 est associado com a produo de carcinomas de laringe e esfago em bovinos, cuja etiologia parece estar combinada com a intoxicao por samambaia. Os papilomavrus humanos 16 e 18 (HPV-16; HPV-18) esto envolvidos na produo de um dos tumores mais freqentes em humanos, o carcinoma de colo de tero de mulheres. Os mecanismos pelos quais esses vrus induzem transformao neoplsica nas clulas hospedeiras tm sido intensivamente estudados nas ltimas dcadas. A capacidade oncognica desses vrus tem sido atribuda a uma ou mais protenas virais que se ligam e inativam protenas celulares envolvidas na regulao do ciclo celular. Em particular, as protenas celulares pRb e p53 so os alvos para o antgeno T, dos poliomavrus, e para as protenas E6 e E7 dos papilomavrus. As protenas da famlia da pRb e p53 exercem um papel regulatrio-chave no controle da estabilidade do genoma, na proliferao, diferenciao e apoptose em clulas de mamferos. A sua inativao pelas protenas virais citadas resulta no descontrole do ciclo celular e eventualmente pode resultar em transformao neoplsica. Os vrus da famlia Hepadnaviridae, tambm conhecidos como vrus das hepatites B, tambm tm sido associados com a produo de tumores em seus hospedeiros naturais. Alm do vrus da hepatite B humana (HBV), os hepadnavrus de esquilos (GSHV) e de marmotas (WHV) esto associados com o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, que ocorre ocasionalmente em hospedeiros com hepatite crnica. Os mecanismos responsveis pela transformao neoplsica que ocorre nas infeces crnicas pelos hepadnavrus no esto completamente esclarecidos. V-
rios mecanismos tm sido propostos e acredita-se que a oncognese pode resultar da combinao de mais de um deles. Os mecanismos propostos incluem: a) ativao de proto-oncogenes celulares pela insero do genoma viral nos cromossomos; b) ativao de proto-oncogenes celulares pela protena X; c) injria e inamao heptica crnica, com produo de substncias potencialmente mutagnicas. Em geral, o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular precedido por uma infeco heptica crnica de longa durao.
6 Imunopatologia em infeces vricas

O sistema imunolgico o responsvel pela proteo do organismo contra agentes agressores, porm a ativao da resposta imune nem sempre capaz de controlar a infeco. Alm disso, em determinadas situaes, a resposta produzida pode induzir leses imunomediadas, determinando a ocorrncia da doena. Vrias doenas vricas, como a AIDS, a dengue, a anemia infecciosa eqina e a artrite-encefalite caprina, entre outras, apresentam as leses resultantes da resposta imunolgica como componentes de sua patogenia. A resposta imune em infeces vricas tem como objetivo a eliminao e/ou neutralizao das partculas virais livres, pela ao de anticorpos e do complemento; alm da destruio das clulas infectadas, pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), linfcitos T citotxicos (CD8+) e lise por clulas natural killer (NK). Em algumas situaes, essa resposta suciente para eliminar o vrus do organismo. No entanto, em outras situaes, essa resposta pode causar injria tecidual, doena e at matar o hospedeiro. Em alguns casos, comum a coexistncia do hospedeiro com o vrus, com a ocorrncia de injrias celulares e teciduais mnimas, muitas vezes sem o comprometimento da sade geral do animal. O grau de leso que a resposta imunolgica pode produzir no hospedeiro depende, em parte, dos rgos envolvidos. Se a infeco ocorre no SNC ou no corao, as leses so geralmente graves, enquanto uma resposta localizada na pele, por exemplo, possui conseqncias limitadas.
229
Os vrus podem induzir imunopatologias por diferentes mecanismos, como a induo de auto-imunidade, imunossupresso e pela deposio de imunocomplexos, que caracteriza a reao de hipersensibilidade do tipo III. As leses imunomediadas ocorrem com maior freqncia em infeces persistentes ou crnicas, e principalmente em infeces por vrus no-citolticos.
6.1 Imunopatologia mediada por imunocomplexos

A conseqncia imunopatolgica mais freqente em infeces vricas agudas ou persistentes a formao de imunocomplexos. Esses complexos so formados por anticorpos ligados a partculas vricas ou a antgenos virais solveis. Quando esses imunocomplexos so produzidos em excesso, podem resultar em imunopatologia. Isso ocorre quando os antgenos virais no so eliminados ecientemente ou quando a replicao do vrus no controlada de forma eciente pelo sistema imunolgico. Dependendo do tipo de anticorpo e da sua capacidade neutralizante, os complexos podem carrear vrus viveis que podem penetrar produtivamente em clulas que possuam receptores para anticorpos (receptores para a poro Fc), como macrfagos e linfcitos ativados. Leses de glomerulonefrite imunomediada so freqentemente observadas em infeces vricas como a hepatite infecciosa canina, peritonite infecciosa felina, imunodecincia felina, peste suna clssica, peste suna africana, entre outras. Doenas mediadas por imunocomplexos somente ocorrem quando a sua produo excede a capacidade do organismo de remov-los dos tecidos e uidos corporais. Em condies normais, os imunocomplexos produzidos so removidos atravs de fagocitose por macrfagos e clulas mesangiais antes que eles se depositem e causem algum tipo de leso. Quando em excesso, a deposio dos imunocomplexos ocorre geralmente em locais com funo de ltragem de lquidos orgnicos, como os glomrulos renais, a parede dos vasos sangneos, as membranas sinoviais e o plexo coride. As leses causadas pela deposio dos imunocomplexos no so resultantes da
sua ao fsica e sim da ativao local do complemento e dos eventos inamatrios resultantes dessa ativao. A deposio de imunocomplexos na parede dos vasos e nos tecidos seguida do aumento da permeabilidade vascular local, mediada por aminas vasoativas como a histamina e serotonina. A ligao da regio Fc dos anticorpos dos imunocomplexos a receptores Fc das membranas provoca a liberao das aminas vasoativas provenientes de baslos, plaquetas e mastcitos que circulam no local da deposio. A poro Fc se liga ao componente C1 e ativa a via clssica do complemento. Ocorre a atrao de neutrlos para o local de deposio, e a formao do complexo de ataque membrana (MAC), o que contribui para a injria local. Os receptores para a poro Fc das imunoglobulinas G esto presentes no plexo coride, onde possuem distribuio periventricular. A localizao desses receptores parece ter relevncia na distribuio das leses por deposio de imunocomplexos observadas na infeco pelo MVV e CAEV em pequenos ruminantes (ovinos e caprinos). Na anemia infecciosa eqina, os anticorpos se ligam a vrions livres no plasma, e os imunocomplexos so depositados principalmente nos glomrulos renais, levando glomerulonefrite imunomediada. A circulao desses imunocomplexos tambm pode levar hemlise, resultando em anemia. O FeLV pode induzir deposio de imunocomplexos e imunodecincia. Algumas vezes ocorrem altos nveis de antgenos virais e a formao e deposio de imunocomplexos leva glomerulonefrite imunomediada. Em outros casos, ocorre depleo linfide, em parte pela ADCC. Essa depleo leva a uma maior susceptibilidade a infeces secundrias, como estomatites crnicas, gengivites, leses de pele e abscessos subcutneos. As leses imunomediadas podem ocorrer tambm como seqelas de infeces virais, sem envolvimento direto na patogenia da infeco, como a sndrome oftlmica que ocorre em ces convalescentes da infeco pelo CAdV-1. A leso caracterizada pela deposio de imunocomple-
230
Captulo 8
xos na crnea, resultando em opacidade, conhecida como olho azul.
6.2 Imunopatologia mediada por linfcitos T citotxicos

Os linfcitos T citotxicos (CTLs, CD8+) possuem um papel relevante na erradicao de infeces vricas dos hospedeiros, pela sua capacidade de identicar e lisar clulas infectadas por vrus. Os CTLs reconhecem peptdeos virais conjugados com molculas do MHC-I na superfcie das clulas infectadas, atravs das molculas TCR + CD8. Alm de lisar clulas infectadas, os CTLs parecem ser capazes de erradicar certos vrus (p. ex.: vrus da hepatite B humana), sem a necessidade de lisar as clulas infectadas, provavelmente interferindo (atravs de citocinas) com alguma etapa da replicao viral. Dessa forma, a infeco aguda pelo HBV geralmente erradicada por uma resposta vigorosa mediada principalmente por CTLs especcos para antgenos do vrus. Por outro lado, a resposta imunolgica de alguns pacientes no consegue erradicar a infeco e esses indivduos se tornam portadores de infeco heptica crnica. Nesses indivduos, a resposta mediada por CTLs fraca ou indetectvel, provavelmente devido a uma expanso clonal deciente. Essa resposta fraca e contnua tem sido implicada na patogenia da infeco crnica, levando a leses necro-inamatrias crnicas no fgado, ou seja, a injria celular de intensidade fraca, porm contnua, resultaria em um processo inamatrio persistente que resulta em hepatite crnica. Eventos semelhantes ocorrem em camundongos inoculados com o LCMV.
zir anticorpos contra protenas prprias. Assim, os linfcitos T que possuem papel essencial na resposta imune contra vrus so responsveis pela modulao da intensidade da resposta, limitando os danos causados por uma resposta agressiva. A expanso clonal dessas clulas em resposta a epitopos de protenas do hospedeiro, evento que pode ocorrer em determinadas infeces vricas, est envolvido na induo de autoimunidade. Esse processo ocorre, por exemplo, na encefalomielite murina de Theiler, em que a resposta especca de clulas T ao vrus ocorre junto com uma resposta imune contra a protena bsica da mielina, induzindo desmielinizao auto-imune.
7 Imunossupresso por vrus

Grande parte das infeces vricas acompanhada por disfunes no sistema imunolgico, muitas das quais podem ser detectadas in vivo e demonstradas experimentalmente in vitro. Freqentemente, essas alteraes ocorrem concomitantemente com uma resposta imunolgica efetiva contra o vrus que as induziu. Por outro lado, alguns vrus suprimem a resposta imunolgica contra os seus antgenos, proporcionando condies para o estabelecimento de infeces prolongadas ou persistentes. As alteraes imunolgicas causadas por infeces vricas podem aumentar a susceptibilidade do hospedeiro a infeces secundrias, dicultar ou retardar a resposta contra a prpria infeco, ou levar a um desequilbrio amplo e duradouro na resposta imunolgica contra vrios agentes. Falha em responder a outros antgenos, tanto por vacinao como infeco natural, resposta deciente em provas de hipersensibilidade retardada e resposta proliferativa e citotxica decientes, tm sido associadas com diversas infeces vricas em humanos e animais. Ativao policlonal de linfcitos B, que pode resultar em um aumento inespecco do nvel de imunoglobulinas plasmticas e dicultar o diagnstico sorolgico da infeco, alm de reduzir a resposta a antgenos recm-introduzidos, tambm tem sido identicada em algumas infeces.
6.3 Imunopatologia por induo de auto-imunidade

A induo de auto-imunidade outro mecanismo de imunopatologia que pode ocorrer em algumas infeces virais. Nesse mecanismo, pode ocorrer estimulao antignica por determinantes antignicos de protenas virais que sejam semelhantes a protenas do hospedeiro ou por distrbios na ativao de linfcitos, que podem produ-
231
Os mecanismos envolvidos nesses eventos, no entanto, nem sempre so facilmente elucidveis, sobretudo pela diculdade de se mimetizar experimentalmente in vitro a complexidade das interaes imunolgicas que ocorrem in vivo. Em geral, os mecanismos envolvidos com imunossupresso por vrus podem ser devidos replicao viral em clulas que participam da resposta imunolgica, alterao da resposta imunolgica normal pela resposta especca contra o vrus ou a efeitos indiretos da replicao e/ou de produtos virais. A Tabela 8.5 apresenta um resumo das alteraes imunolgicas j identicadas em infeces vricas e os mecanismos potencialmente envolvidos.
7.1 Replicao viral em clulas envolvidas na resposta imunolgica

Diversos vrus replicam em clulas da linhagem mielide e/ou linfide, cujas clulas diferenciadas esto envolvidas com a resposta imunolgica natural e adquirida. Para alguns vrus, essas clulas se constituem nos principais alvos da replicao, enquanto, para outros, elas representam apenas uma parcela das populaes celulares infectadas. A infeco e destruio de clulas imunolgicas o mecanismo mais atraente e lgico na tentativa de explicar a imunossupresso causada por vrus. No entanto, este no o ni-
Tabela 8.5. Principais alteraes imunolgicas e seus mecanismos de induo, por diferentes grupos de vrus
Alteraes imunolgicas Famlia/ Famlia grupo

Susceptibilidade Proliferao Aumento nas Replicao em Vrus clulas imunoglobulinfide a infeces imunolgicas linas reduzida
Mecanismos
Ativao do Produtos de sistema moncitos e imune linfcitos Th Protenas virais
Picornaviridae Flaviviridae Arteriviridae Coronaviridae
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Rhabdoviridae Arenaviridae
Reoviridae Retroviridae Parvoviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae
Fonte: adaptada de Griffin (1997).
232
Captulo 8
co e talvez nem seja o mecanismo mais relevante envolvido na supresso da resposta imunolgica por vrus. Na verdade, na grande maioria das infeces vricas imunossupressivas estudadas, o percentual de clulas de determinada populao que infectada raramente atinge 1%. Essa pequena proporo infectada dicilmente seria suciente para explicar a decincia imunolgica associada com essas infeces. O HIV, por exemplo, infecta linfcitos TCD4+. Em clulas quiescentes, o vrus se encontra em um estado de latncia, sem o genoma integrado nos cromossomos celulares. Por ocasio da ativao dessas clulas, que seguida da integrao do provrus DNA, a replicao viral iniciada. A frao de linfcitos TCD4+ circulantes que infectada situa-se em torno de 0,01 a 1%, sendo que menos de 10% destas produzem prognie viral. Essa proporo de clulas infectadas no justica as severas alteraes imunolgicas observadas nos pacientes soropositivos, indicando a participao de outros mecanismos na imunossupresso. J o IBDV, um birnavrus de galinhas, infecta liticamente populaes de linfcitos B que esto em diviso, resultando em imunossupresso profunda pela extensiva perda dessas clulas. Nos animais afetados, ocorre uma disfuno na resposta humoral, mediada por linfcitos B. Dentre os vrus animais que infectam clulas do sistema imunolgico se incluem: a) vrus que infectam linfcitos T: vrios retrovrus animais (p. ex.: FeLV e FIV) e GHV-2 (vrus da doena de Marek); b) vrus que infectam linfcitos B: birnavrus (IPNV e IBDV), vrus da leucemia murina (MuLV), retrovrus smio, BVDV e BLV; c) vrus que infectam clulas da linhagem monocticamacrofgica: VEEV, LCMV, vrus da inuenza, vrus Maedi-Visna, CAEV, vrus da parainuenza, vrus da peste suna africana (ASFV). ASFV, vrios coronavrus, circovrus, arterivrus (PRRSV, EAV, LDEV), EIAV e ALV.
contra o vrus infectante. Seriam, portanto, conseqncias inevitveis da resposta necessria para combater este agente e montar uma resposta duradoura que proteja contra reinfeces. Nesse sentido, decincias imunolgicas podem ser resultantes de: a) ativao generalizada de linfcitos T sem os sinais apropriados (muitos dos quais morrem por apoptose); b) produo anormal (quantitativa e qualitativamente) de citocinas; c) depleo de linfcitos T vrus-especcos pela sua ativao em resposta ao agente. A participao desses mecanismos na imunossupresso evidenciada pelo fato de que os nveis mximos de supresso coincidem com o aparecimento da resposta imunolgica especca e erradicao do agente. Esse tipo de imunossupresso tem sido detectado em infeces pelo vrus da inuenza, vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV), entre outros.
7.3 Produtos de moncitos e linfcitos ativados

Vrias interleucinas so produzidas por clulas especializadas em resposta a infeces vricas, incluindo os interferons do tipoI (IFN alfa e beta), IL-2 e receptor de IL-2, entre outras. A maioria dessas interleucinas atua modulando e estimulando a resposta celular e/ou humoral contra o agente infeccioso. No entanto, j foram identicados vrios fatores produzidos por moncitos e linfcitos ativados que inibem a resposta imunolgica. A resposta contra o vrus de Newcastle, por exemplo, caracterizada pela reduo da atividade dos linfcitos T citotxicos contra um segundo vrus, associada com supresso dos nveis de IFN. As interleucinas 4 e 10 (IL-4, IL-10) produzidas por linfcitos ativados suprimem a funo de moncitos/macrfagos.
7.4 Protenas virais

Diversas protenas codicadas por vrus interferem com a resposta imunolgica do hospedeiro, retardando ou suprimindo esta resposta, permitindo, assim, a replicao e disseminao do vrus no hospedeiro (Tabela 8.6). Algumas dessas protenas podem ser secretadas pelas clulas infectadas e interferir com a funo de clulas
7.2 Imunossupresso associada com a ativao do sistema imune

Muitas alteraes da resposta imunolgica ocorrem no contexto da resposta desencadeada
233
Tabela 8.6. Protenas virais que interferem com a resposta imunolgica do hospedeiro
Mecanismo efetor Famlia

Lise celular mediada por anticorpos e complemento
Vrus
Protena viral Vrus

gE+gI gC VCP E3/19K ICP47 UL-18 ? ? ? crmA orfB8R 38kDa 37kDa
Protena-alvo
Poro Fc das Igs C3b C3b+C4b Cadeia pesada MHC-I TAP Beta 2-microglobulina TNF TNF IL-1 beta TNF IL-1 beta IFN gama IFN gama, IL-2, IL-5 IFN gama
Vrus do herpes simplex Vrus vaccinia Adenovrus Vrus do herpes simplex Citomegalovrus Vrus do mixoma (Pox)
Apresentao de antgenos peloMHC-I a linfcitos citotxicos
Produo de citocinas por macrfagos
Vrus vaccina Cowpox Orthopox
Produo de citocinas por linfcitos Th
Tanapox Vrus do mixoma
Fonte: adaptada de Griffin (1997).
no-infectadas. J foi demonstrado, por exemplo, que a hemaglutinina do vrus da inuenza afeta diretamente a funo de neutrlos. Outras protenas virais podem se ligar a receptores de superfcie celular e interferir com a sua funo. Por exemplo, as glicoprotenas gE e gI do HSV (e provavelmente de outros alfaherpesvrus) se ligam na poro Fc das imunoglobulinas, impedindo que ocorra a ativao do complemento na superfcie de clulas infectadas e prevenindo, assim, a destruio dessas clulas. Protenas virais podem tambm atuar como superantgenos, ligando-se a receptores de linfcitos T e estimulando-os at a exausto e depleo. A protena E3/19 K dos adenovrus se liga com a cadeia pesada da molcula de MHC-I, retendo-a no retculo endoplasmtico. Assim, as clulas infectadas pelos adenovrus no apresentam peptdeos virais associados com o MHC-I e no so reconhecidas pelos linfcitos Tc. Alguns poxvrus e herpesvrus tambm suprimem a expresso de MHC-I na superfcie das
clulas infectadas. Os poxvrus codicam protenas que so secretadas pelas clulas infectadas e interferem com a ao de interleucinas produzidas em resposta infeco. Alguns desses vrus codicam uma protena que se liga ao fator de necrose tumoral (TNF) e o impede de se ligar superfcie das clulas infectadas. O vrus do mixoma codica uma protena homloga ao receptor do interferon gama (IFN ). Os vrus da vaccinia e cowpox codicam protenas que se ligam e inibem a funo da IL-1, IFN- e TNF. Em resumo, a infeco e alterao da funo de clulas envolvidas na resposta imunolgica no o nico mecanismo de imunossupresso causado por vrus. provvel que a imunossupresso observada nas infeces vricas, em sua maioria, deva-se interao de mltiplos fatores, que incluem citocinas/interleucinas, infeco e disfuno de clulas imunolgicas e efeitos de protenas virais especcas.
234
Captulo 8
ADDIE, D.D. et al. Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. The Journal of General Virology, v.84, p.2735-2744, 2003. AHMED, R.; MORRISON, L.A.; KNIPE, D. Persistence of viruses. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.8, p.219-249. AHMED, R.; MORRISON, L.A.; KNIPE, D. Viral persistence. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.9, p.181-205. BAKER, J.C. Clinical aspects of bovine virus diarrhea infection. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.9, p.25-41, 1990. BENEDICT, C.A.; NORRIS, P.S.; WARE, C.F. To kill or to be killed: viral evasion of apoptosis. Nature Immunology, v.3, p.1013-1018, 2002. BOLIN, S.R. The pathogenesis of mucosal disease. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.489-500, 1995. BROWNLIE, J. The pathogenesis of bovine virus diarrhea virus infection. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.9, p.43-59, 1990. BROWN JR, T. et al. Immunopathology. In: SLAUSON, D.O.; COOPER, B.J. Mechanism of Disease. 3.ed. St. Louis, MO: Mosby, 2002. Cap.5, p.247-297. CHOW, L.T.; BROKER, T.R. Small DNA tumor viruses. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.12, p.267-301. CONNER, M.E.; RAMIG, R.F. Viral enteric diseases. In: NATHANSON, N. (ed). Viral Pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.30, p.713-743 . DARWICH, L.; SEGALS, J.; MATEU, E. Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome caused by porcine circovirus 2: an immune riddle. Archives of Virology, v.149, p.857-874, 2004. DAWE, P.S. et al. Natural transmission of foot-and-mouth disease virus from African buffalo (Syncerus caffer) to cattle in a wildlife area of Zimbabwe. The Veterinary Record, v.134, p.230232, 1994. EVANS, A.S.; BRACHMAN, P.S. Bacterial infections of humans: epidemiology and control. 2.ed. New York: Plenum Press, 1991. 908p. FLINT, S.J. et al. Principles of Virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p.
GAMOH, K. et al. The pathogenicity of canine parvovirus type2b, FP84 strain isolated from a domestic cat, in domestic cats. The Journal of Veterinary Medical Science, v.65, p.1027-1029, 2003. GASKELL, R.M; BENNETT, M. Doenas infecciosas felinas. In: DUNN, J.K. Tratado de Medicina de Pequenos Animais. So Paulo: Roca, 2001. p.953-978. GOCKE, D.J; MORRIS, T.Q; BRADLEY, S.E. Chronic hepatitis in a dog: the role of immune factors. Journal of American Veterinary Medicine Association, v.156, p.1700-1705, 1970. GRIFFIN, D.E. Virus-induced immune suppression. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.10, p.207-233. HARDWICK, J.M.; GRIFFIN, D.E. Viral effects on cellular functions. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.4, p.55-83 . HAY, S.; KANNOURAKIS, G. A time to kill: viral manipulation of cell death program. The Journal of General Virology, v.83, p.1547-1564, 2002. HOLMES, K.V. Localization of viral infectious. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.3, p.35-53 . HOSKINS, J.D. Canine viral enteritis. In: GREENE, C.E. Infectious Diseases of the Dog and Cat. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 1998. p.40-49. IGNJATOVIC, J.; SAPATS, S. Avian infectious bronchitis virus. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.19, p.493-508, 2000. JABRANE, A.; GIRARD, C.; ELAZHARY, Y. Pathogenicity of porcine respiratory coronavirus isolated in Quebec. The Canadian Veterinary Journal, v.35, p.86-92, 1994. KNIPE, D.M. Virus-host cell interactions. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.10, p.273-299. LAPPIN, M.R. Viral diseases. In: LEIB, M.S.; MONROE, W.E. Practical small animal internal medicine. Philadelphia: Saunders, 1997. p.873-902. LIPTON, H.L.; GILDEN, D.H. Viral diseases of the nervous system: persistent infections. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.36, p.855-869. MIMS, C.A.; WHITE, D.O. Viral pathogenesis and immunology. Oxford: Blackwell Science Inc., 1984. 394p. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. NATHANSON, N.; TYLER, K.L. Entry, dissemination, shedding, and transmission of viruses. In: NATHANSON, N. (ed). Viral
235
TYLER, K.L.; GONZALEZ-SCARANO, F. Viral diseases of the nervous system: acute infectious. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.35, p.837-853. WEAVER, S.C. et al. Venezuelan equine encephalitis. Annual Review of Entomology, v.49, p.141-174, 2004. WHITMORE, H.L.; ZEMJANIS, R.; OLSON, J. Effects of bovine viral diarrhea virus on conception in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.178, p.1065-1067, 1981. WIMMER, E. Cellular receptors for animal viruses. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994. 526p. WRIGHT, P.F. Respiratory diseases. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.29, p.703-711. ZINKERNAGEL, R.M. Virus-induced immunopathology. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.8, p.163-179.
pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.2, p.1333. PETERS, C.J. Viral hemorrhagic fevers. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.32, p.779-799 . RIEDER, E.; WIMMER, E. Cellular receptors of picornaviruses: an overview. In: SEMLER, B.L.; WIMMER, E. (eds). Molecular Biology of Picornaviruses. Washington, DC: ASM Press, 2002. p.61-70. SAIF, L.J.; WESLEY, R.D. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory coronavirus. In: STRAW, B.E. et al. Diseases of Swine. Ames, IA: Iowa State University, 1999. Cap.24, p.295325. SUMMERS, B.A.; CUMMINGS, J.F.; LAHUNTA, A. Veterinary neuropathology. In: ___. Immunobiology and immmunopathology of the central nervous system. St. Louis, MO: Mosby, 1995. p.23-26. THOMSON, B.J. Viruses and apoptosis. International Journal of Experimental Pathology, v.82, p.65-76, 2001. TYLER, K.L.; FIELDS, B.N. Pathogenesis of viral infections. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.7, p.173-218.
RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA VRUS

Luiz Carlos Kreutz
9
239 239
240 242 242 243 243 243
1 Introduo 2 Resposta imune inata

2.1 Interferon tipo I 2.2 Sistema complemento 2.3 Clulas natural killer 2.4 Clulas dendrticas 2.4.1 Interao entre as DCs e clulas NK 2.4.2 O papel das DCs na resposta imune adquirida
3 Resposta imune adquirida

3.1 Reconhecimento de antgenos pelo sistema imunolgico 3.1.1 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B 3.1.2 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T 3.2 Resposta imune celular 3.2.1 Importncia dos linfcitos Tc na imunidade antiviral 3.3 Resposta imune humoral 3.4 Respostas primria e secundria/memria imunolgica 3.5 As imunoglobulinas na defesa antiviral 3.5.1 Mecanismos de ao das imunoglobulinas 3.6 O papel da resposta humoral e celular na imunidade antiviral
244
244 244 245 249 250 250 252 253 254 255
4 Mecanismos virais de evaso da resposta imune

4.1 Infeces latentes no sistema nervoso central 4.2 Variaes antignicas 4.3 Induo de tolerncia 4.4 Integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro 4.5 Infeco de stios imunologicamente privilegiados 4.6 Interferncia com funes do sistema imunolgico
256
256 256 257 257 257 258
5 Consideraes nais 6 Bibliograa consultada
258 258
1 Introduo
A imunidade ou resistncia do hospedeiro contra infeces vricas depende da atuao integrada da resposta imune inata e da resposta imune adquirida. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente aps o contato do hospedeiro com os antgenos virais, no possuem capacidade de discriminao entre os vrus e no necessitam de exposio prvia para serem desencadeados. Os mecanismos envolvidos na resposta imune adquirida, por sua vez, desenvolvem-se seqencialmente e de forma mais lenta e sincronizada, resultando na induo de clulas efetoras, que iro combater o agente, e de clulas de memria, que possuem vida longa e que sero efetivamente reestimuladas em exposies posteriores ao mesmo agente. A diviso entre a resposta imune inata e adquirida no absoluta, e essas duas formas de resposta esto interligadas, atuando conjuntamente no combate aos agentes agressores. Os principais protagonistas da conexo entre essas respostas so as clulas dendrticas (dendritic cells, DCs). Essas clulas circulam pelos tecidos perifricos, onde capturam antgenos, e se dirigem aos rgos linfides secundrios, onde estimulam as clulas linfides. Alm disso, as infeces vricas so acompanhadas de estmulos qumicos e celulares que formam uma intrincada rede de informaes, que visam maximizar o mecanismo imunolgico mais efetivo contra a maioria dos vrus: os linfcitos T citotxicos (Tc). Os componentes da imunidade inata so ativados precocemente aps a infeco e se encarregam de limitar e restringir a replicao viral at que os mecanismos da resposta imune adquirida tenham sido desencadeados. Na resposta inata contra vrus, atuam principalmente o interferon do tipo I (IFN-I), clulas natural killer (NK) e os componentes ativos do complemento. A resposta imune adquirida mediada por clulas (linfcitos T) e por molculas circulantes (anticorpos), produzidas por clulas derivadas dos linfcitos B. As citocinas (ou interleucinas [ILs]) so peptdeos produzidos por uma variedade de clulas que moderam e inuenciam a funo de outras clulas do sistema imunolgico.
2 Resposta imune inata

A resposta imune inata (tambm denominada natural ou inespecca) mediada por clulas e molculas. Previamente estimulao dessa resposta, mecanismos naturais de proteo contra a penetrao de patgenos, como a pele, os plos, o muco, enzimas, peptdeos antivirais e anti-bacterianos representam as barreiras iniciais contra os agentes infecciosos. A ausncia ou disfuno desses mecanismos provavelmente resultaria em um aumento da freqncia e da severidade das infeces. Embora sejam considerados componentes da imunidade inata, essas barreiras no sero abordadas nessa reviso. Aqui, ser dado enfoque aos mecanismos imunolgicos naturais que efetivamente participam da imunidade antiviral e, principalmente, que cooperam com a ativao da resposta imune especca. A resposta imune inata assim denominada em razo de algumas caractersticas peculiares, tais como: a) atua imediatamente aps o contato com o agente; b) no discrimina diferentes tipos de antgenos; c) atua com intensidade relativamente constante e d) no possui memria. questionvel se, agindo isoladamente, a resposta inata seria capaz de erradicar uma infeco vri-
240
Captulo 9
ca estabelecida. No entanto, os seus mecanismos efetores se constituem em obstculos importantes, que retardam a progresso do processo infeccioso, controlando-o temporariamente e, assim, permitindo o desenvolvimento da imunidade especca. Os principais componentes da resposta inata contra vrus so representados pelo IFN-I, sistema complemento, clulas NK e DCs. Esses mecanismos so desencadeados seqencialmente aps a infeco vrica e antecedem o desenvolvimento dos mecanismos especcos (Figura 9.1).
2.1 Interferon
O primeiro obstculo infeco viral representado pelos IFN-I, que foram justamente identicados pela sua capacidade de interferir com a replicao viral. O IFN-I compreende dois tipos principais: interferon alfa (IFN-) e interferon beta (IFN-), que so produzidos por vrios tipos de clulas em resposta s infeces vricas. Vrios vrus so potentes indutores de IFN-I, e a sua induo est associada com a produo de RNA de ta dupla no interior da clula durante a replicao viral. A interao de alguns vrus com
os receptores celulares tambm parece estimular a produo de IFN-I. Qualquer clula nucleada capaz de produzir IFN-I em resposta a uma infeco por vrus, mas evidncias recentes indicam que as DCs plasmacitides (pDCs) representam a principal fonte dessa citocina. O IFN-I produzido por clulas infectadas secretado no meio extracelular e se distribui localmente, interagindo com as clulas vizinhas e induzindo um estado de resistncia antiviral (Figura 9.2). Essa interao mediada por receptores especcos na superfcie celular, que esto amplamente distribudos nos tecidos. A ligao do IFN-I aos receptores desencadeia uma srie de sinais intracelulares que induzem a transcrio de genes cujos produtos esto envolvidos na resposta mediada pelos IFNs. Os principais efeitos antivirais do IFN-I so devidos degradao de RNAs mensageiros (mRNA) e inibio da traduo. Dessa forma, esta citocina inibe a sntese de protenas na clula-alvo, tornando-a um meio imprprio para a replicao viral, uma vez que os vrus dependem integralmente da maquinaria celular de sntese protica para a sua replicao.
4 1
Aumento da expresso do MHC-I
Ativao de: Clulas NK; Linfcitos Tc; Macrfagos.
Estado de resistncia antiviral (inibio da sntese protica, degradao de mRNA)
Figura 9.2. Induo e principais funes do IFN-I na resposta imune inata. A presena de RNA de fita dupla em clulas infectadas por vrus induz a produo de IFN-I (1), que secretado no meio extracelular (2). O IFN-I interage com receptores nas clulas vizinhas (3) e desencadeia uma srie de reaes que resultam na induo de um estado de resistncia antiviral (4). O IFN-I tambm promove um aumento na expresso do MHC-I (5), alm de ativar clulas NK, linfcitos Tc e macrfagos (6).
Resposta imunolgica contra vrus
241
O IFN-I desencadeia uma srie de reaes intracelulares que levam expresso da enzima 2-5-adenilato sintetase. Essa enzima sintetiza oligmeros de adenina (oligo-A), que, por sua vez, ativam a endorribonuclease RNAse L. A ativao da RNAse L resulta na degradao de mRNA celulares e virais. Alm disso, o IFN-I promove a ativao da enzima protena kinase R (PKR), que fosforila e inativa o fator de iniciao da traduo (elongation initiation factor 2 - eIF-2). Com isso, a traduo de mRNAs celulares e virais tambm ca inibida. Outro grupo de IFN-I induz um estado antiviral pela induo das protenas Mx, que tambm contribuem para a inibio da sntese protica celular.
O IFN-I atua tambm como fator de sobrevivncia para as pDCs, promove o desenvolvimento, maturao e atividade microbiocida dos macrfagos e ativa as clulas NK, que, por sua vez, interagem sinergisticamente com as DCs. Alm de seu papel na imunidade inata, o IFN-I possui um papel importante no desenvolvimento da imunidade especca, por meio de diferentes mecanismos, tais como: a) induo da expresso de molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo I (MHC-I), o que favorece o processamento e a apresentao de antgenos endgenos; b) ativao das DCs, produzindo um aumento da expresso de receptores e produo de citocinas; c) estimulao da
8
Fagcito
10 9 12 11
7
NK
Clula infectada
2 5
6
Linfcitos Tc
Dcs Clulas vizinhas
Figura 9.3. Mecanismos efetores associados com a resposta imune inata. A infeco viral (1) resulta na produo e secreo de IFN-I pelas clulas infectadas (2). O IFN-I secretado induz um estado de resistncia antiviral nas clulas vizinhas (3); ativa clulas NK (4), DCs (5), linfcitos Tc (6) e estimula a atividade fagoctica dos macrfagos (7). Simultaneamente, a presena de vrions pode levar ativao do complemento (8); cujos componentes ativados atraem e ativam fagcitos (9, 10), opsonizam vrions, facilitando a fagocitose (11) ou promovem a lise de vrus envelopados (12).
242
Captulo 9
sobrevivncia e proliferao de linfcitos T de memria; d) estimulao da produo de interferon gama (IFN-) pelas DCs e linfcitos T; e) participao direta e indireta na diferenciao e atividade dos linfcitos B. Os mecanismos de ativao e as atividades desempenhadas pelo IFN-I na resposta imune infeces vricas esto ilustrados nas Figura 9.2 e 9.3.
e fungos) torna-as resistentes ao complemento, pois inibe a ligao de alguns componentes que do continuidade cascata e posterior formao do MAC.
2.3 Clulas natural killer

As clulas natural killer (NK) so derivadas de progenitores linfides da medula ssea e foram assim denominadas em razo de sua capacidade de destruir clulas tumorais e clulas infectadas por vrus na ausncia de um reconhecimento antgeno-especco. Constituem o que se convencionou chamar de terceira populao de linfcitos (linfcitos B, T e clulas NK). Por no possurem marcadores especcos de linfcitos B ou de linfcitos T, foram inicialmente chamadas de clulas nulas (null cells). As clulas NK esto presentes principalmente nos tecidos linfides perifricos e atuam direta, pela capacidade de destruir clulas infectadas, e indiretamente mediante a secreo de citocinas. A atividade das clulas NK precede a ativao da resposta imune especca. A destruio de clulas infectadas por vrus realizada inicialmente pelas clulas NK e, posteriormente, pelos linfcitos Tc. A capacidade das clulas NK em distinguir clulas infectadas de clulas no-infectadas est relacionada com a presena de receptores inibidores da destruio (killing inhibitory receptors = KIR) na sua superfcie. Esses receptores reconhecem as molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo I (MHC-I), que esto presentes na superfcie de virtualmente todas as clulas do organismo. A expresso do MHC-I est geralmente reduzida em clulas infectadas por vrus e em clulas tumorais. Dessa forma, utilizando os receptores KIR, as clulas NK podem detectar se uma clula est expressando molculas do MHCI em nveis normais. A ligao dos KIR em molculas do MHC-I inibe a ao das clulas NK. No caso da expresso das molculas de MHC-I estar reduzida, essa clula torna-se alvo de destruio pelas clulas NK. O mecanismo utilizado pelas clulas NK para destruir as clulas-alvo semelhante ao utilizado pelos linfcitos Tc. O contato com a clula infectada estimula as NK a liberarem perforinas
2.2 Sistema complemento

O sistema complemento composto por um conjunto de protenas presentes no plasma sangneo na forma inativa. Essas protenas podem ser ativadas pela presena de complexos imunes, formados pela ligao de imunoglobulinas com antgenos (via clssica de ativao), pela deposio espontnea do componente C3b do complemento na superfcie de microorganismos (via alternativa) ou devido ligao com protenas que se ligam manose (via da lecitina). A ativao do complemento por qualquer uma dessas vias resulta em uma cascata de ativao seqencial, com a formao de molculas intermedirias que possuem diversas atividades biolgicas, principalmente ligadas ativao do processo inamatrio. Dentre as funes dos componentes ativados do complemento destacam-se: opsonizao; quimiotaxia e ativao de neutrlos e outras clulas inamatrias; degranulao de mastcitos com conseqente vasodilatao e aumento da permeabilidade capilar e formao do complexo de ataque membrana (membrane attack complex, MAC), formado pela associao dos componentes C5-9 e que se inserem na membrana de clulas infectadas ou no envelope de vrions, resultando na sua destruio. O componente mais importante do complemento denominado C3, que, a partir da ativao da cascata, clivado de forma contnua e espontnea, gerando os produtos C3a e C3b. Uma vez produzido, o C3b se deposita em superfcies que no possuam cido silico, como o envelope de diversos vrus, e, assim, desencadeia a cascata de ativao do complemento, que culmina com a formao do MAC e com a destruio do vrion. A presena de cido silico na superfcie das clulas animais (e eventualmente em algumas bactrias
243
no meio extracelular. As perforinas so protenas semelhantes aos componentes C5-C9 do complemento e produzem pequenos poros na membrana plasmtica da clula-alvo. As clulas NK liberam ento as granzimas, que penetram por estes poros e induzem morte celular por apoptose. Durante a resposta inata, as clulas NK destroem clulas infectadas independentemente do reconhecimento de antgenos especcos. No curso da resposta imune especca e aps a produo de anticorpos antivirais, as clulas NK tambm podem participar da destruio de clulas infectadas. Nesse caso, anticorpos produzidos contra antgenos virais se ligam em antgenos virais presentes na superfcie das clulas infectadas. Essa ligao facilita o seu reconhecimento pelas clulas NK, pois estas possuem receptores para a poro Fc das imunoglobulinas. Essa atividade denominada citotoxicidade celular dependente de anticorpos (antibody dependent cellular citotoxicity, ADCC) e tambm pode ser mediada por outras clulas que possuem receptores para a poro Fc (macrfagos, neutrlos e eosinlos). Alm de destruir clulas infectadas por vrus, as clulas NK contribuem para a defesa antiviral pela secreo de vrias citocinas, incluindo o IFN- e fator de necrose tumoral alfa (TNF-). Essas clulas tambm possuem receptores para vrias citocinas (IL-2, IL-12 e TNF-) que podem inuenciar na sua atividade.
freqentes de penetrao de agentes virais. As clulas de Langerhans (LC), por exemplo, esto localizadas na epiderme; DCs intersticiais esto localizadas na derme, nas mucosas e em tecidos perifricos. Por outro lado, as pDCs encontramse principalmente nos rgos linfides, como a medula ssea, timo, bao, tonsilas e linfonodos. As mDCs desempenham a importante funo de apresentar antgenos aos linfcitos T e transferir antgenos aos linfcitos B, eventos que se constituem no principal elo entre a imunidade inata e a imunidade adquirida. Alm disso, as pDCs so as principais clulas produtoras de IFN-I durante as infeces virais e participam ativamente da estimulao das clulas NK.
2.4.1 Interao entre as DCs e clulas NK

As DCs estimulam as clulas NK por meio de mediadores solveis e tambm por contato direto. A interao entre as DCs e as clulas NK importante para a ativao das prprias DCs. A ativao das DCs pelas clulas NK depende de contato direto, da proporo NK:DCs e de citocinas como o TNF-. Clulas NK pr-ativadas por IL-2 so potentes estimuladoras das DCs, agindo tanto de forma isolada como em sinergismo com estmulos inamatrios, como os lipopolissacardeos (LPS). A interao entre as clulas NK e DCs parece ocorrer nos locais da infeco, onde existem DCs imaturas residentes e para onde migram as clulas NK em resposta a estmulos inamatrios. Essa interao pode ocorrer tambm nos linfonodos e em outros rgos linfides secundrios, para onde as DCs migram aps capturar antgenos nos tecidos perifricos.
2.4 Clulas dendrticas

As clulas dendticas (DCs) constituem uma populao heterognea de clulas que diferem entre si em relao origem, fentipo, localizao, funo e necessidades para o desenvolvimento. As DCs que se originam de progenitores mielides da medula ssea so semelhantes aos moncitos e so denominadas de DCs mielides (mDCs). Por outro lado, as DCs que se originam dos progenitores linfides so denominadas de DCs plasmacitides (pDCs) e se assemelham aos plasmcitos. As mDCs so encontradas em quase todos os tecidos e rgos, com exceo do crebro, dos olhos e dos testculos. So especialmente abundantes nos linfonodos, na pele e em tecidos subjacentes a superfcies mucosas, locais
2.4.2 O papel das DCs na resposta imune adquirida

As DCs constituem o principal elo entre a imunidade inata e a imunidade adquirida. As DCs so especializadas na captura e apresentao de antgenos aos linfcitos T, evento essencial para a estimulao dessas clulas em resposta a antgenos. Por sua vez, a estimulao de linfcitos Th resulta na produo de citocinas que ativam tanto a resposta mediada por clulas (Tc) como a resposta humoral (linfcitos B plasmcitos). Os
244
Captulo 9
estmulos para a proliferao dessas clulas so fornecidos por mediadores solveis (citocinas ou interleucinas) produzidos pelas prprias DCs, ou no microambiente dos linfonodos, onde os linfcitos so ativados. As DCs encontram-se nos principais locais de penetrao dos vrus e tambm nos linfonodos e em outros tecidos linfides secundrios. Conseqentemente, o contato dos vrus ou de suas protenas com as DCs praticamente inevitvel e fundamental para que as DCs processem adequadamente os antgenos virais e os apresentem s diferentes populaes de linfcitos. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata contra vrus esto ilustrados na Figura 9.3.
3 Resposta imune adquirida

Os mecanismos imunolgicos especcos contra as infeces vricas so desencadeados aps a estimulao direta ou indireta dos linfcitos T e B pelos antgenos virais e possuem como caractersticas principais: especicidade (cada clula reconhece apenas um determinante antignico); diversidade (capacidade de reconhecer uma grande variedade de antgenos) e memria imunolgica (capacidade de produzir uma resposta qualitativa e quantitativamente diferente em exposies subseqentes a um determinado antgeno). Alm disso, a resposta imune especca se caracteriza pela tolerncia a antgenos do prprio organismo. De acordo com os mecanismos efetores, a resposta imune especca pode ser dividida em celular e humoral. A resposta celular mediada pelos linfcitos T auxiliares (T helper ou Th) e linfcitos Tc. A resposta humoral mediada pelos anticorpos produzidos pelos plasmcitos, clulas derivadas dos linfcitos B. Embora sejam tratados separadamente com ns didticos, os mecanismos envolvidos nessas duas respostas so complementares e atuam conjuntamente no combate s infeces vricas. A importncia relativa desses mecanismos, no entanto, varia entre os diferentes vrus, de acordo com a sua biologia. Para alguns vrus, a resposta mediada por linfci-
tos Tc fundamental na erradicao da infeco; para outros, a resposta humoral desempenha um papel mais importante na proteo. O conhecimento dos mecanismos especcos envolvidos na resposta imunolgica contra cada vrus fundamental para a elaborao de vacinas. A etapa inicial da resposta imunolgica especca o reconhecimento de antgenos pelos linfcitos Th, Tc e B. Em resposta ao contato com o antgeno, os linfcitos Th secretam vrias citocinas, que estimulam a atividade de outras clulas envolvidas na resposta imunolgica. Os linfcitos Tc reconhecem e destroem clulas infectadas por vrus e tambm secretam algumas citocinas. Estimulados pelo contato com o antgeno, os linfcitos B proliferam e se diferenciam em plasmcitos. Os anticorpos, produzidos pelos plasmcitos so protenas solveis que possuem diversas funes no combate aos agentes invasores.
3.1 Reconhecimento de antgenos pelo sistema imunolgico

A capacidade de distinguir antgenos prprios de antgenos no-prprios (neste caso, os antgenos virais) se constitui no evento central da resposta imune adquirida. Antgenos noprprios devem ser reconhecidos como tal, e o seu reconhecimento deve induzir uma resposta que resulte na sua eliminao e/ou inativao. Por outro lado, os antgenos prprios devem ser igualmente reconhecidos, porm devem ser tolerados. Ou seja, antgenos do prprio organismo no devem estimular uma resposta imunolgica. A resposta imunolgica especca contra vrus mediada por diferentes subpopulaes de linfcitos: os linfcitos Th, Tc e B. Essas trs populaes de linfcitos apresentam mecanismos efetores distintos e reconhecem os antgenos de formas diferentes. A seguir sero apresentados os mecanismos de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B e T.
3.1.1 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B

Os linfcitos B reconhecem os antgenos virais atravs de receptores de membrana denomi-
245
nados BCRs (B cell receptors). Os BCRs so molculas de imunoglobulinas das classes IgD e IgM, que possuem uma regio altamente varivel, capaz de se ligar a uma variedade muito grande de determinantes antignicos. Os BCRs podem se ligar a antgenos de qualquer natureza qumica, sejam protenas, carboidratos, lipdios ou outras macromolculas, ou seja, os linfcitos B podem reconhecer e responder a antgenos proticos e no-proticos, desde que esses possuam regies complementares s regies variveis dos seus BCRs. Isso faz com que os linfcitos B reconheam antgenos na sua forma nativa, solvel ou no, sem a necessidade de processamento prvio. No caso dos vrus, os principais antgenos reconhecidos pelos linfcitos B so as protenas de superfcie dos vrions, devido a sua localizao e acessibilidade aos BCRs. Protenas virais inseridas em membranas celulares, alm de protenas secretadas pelas clulas infectadas, tambm podem estimular os linfcitos B. Os linfcitos B tambm podem reconhecer antgenos virais capturados e armazenados na superfcie das DCs, sob a forma de pequenas esferas (icossomos). Do ponto de vista de proteo, os anticorpos induzidos contra protenas de superfcie (do capsdeo ou envelope) possuem importncia especial, pois podem se ligar e neutralizar a infectividade dos vrus. Os locais de contato entre os antgenos e os linfcitos B locais de reconhecimento do antgeno so principalmente os rgos linfides perifricos, dentre estes, os linfonodos.
por ambos. A forma de reconhecimento de antgenos por esses dois tipos de linfcitos, no entanto, diferente:
3.1.2.1 Reconhecimento de antgeno pelos linfcitos Th

Os linfcitos Th reconhecem antgenos virais atravs de seus receptores de membrana, denominados TCRs (T cell receptors), juntamente com a molcula acessria CD4. Por isso, so tambm chamados de linfcitos T CD4+. Para que um antgeno protico seja reconhecido pelo complexo TCR+CD4 e estimule o linfcito Th, ele deve ser previamente processado e apresentado de forma adequada por clulas especializadas. O processamento do antgeno protico envolve a sua internalizao por endocitose ou fagocitose, clivagem enzimtica em peptdeos de 12 a 16 aminocidos e conjugao dos peptdeos com molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo II (MHC-II). Esses processos ocorrem em compartimentos citoplasmticos especializados (endossomos, fagossomos e retculo endoplasmtico). Os complexos MHC-II + peptdeo so, ento, transportados at a superfcie celular, onde cam expostos espera do reconhecimento pelos linfcitos Th. O reconhecimento dos complexos MHC-II + peptdeos realizado pelos receptores TCR+CD4 existentes na membrana dos linfcitos Th e resulta na ativao desses linfcitos. Essa via de apresentao denominada exgena, pois ocorre com protenas extracelulares que so previamente internalizadas e processadas. Protenas estruturais dos vrions, protenas virais secretadas pelas clulas infectadas ou extravasadas no meio extracelular aps a lise celular podem ser processadas desta maneira e ser apresentadas aos linfcitos Th. Em resumo, os linfcitos Th reconhecem antgenos virais proticos, desde que devidamente processados e apresentados em associao com molculas do MHC-II por clulas especializadas (Figura 9.4). Embora um nmero grande de clulas do organismo seja capaz de capturar protenas e outras macromolculas no meio externo e process-las, somente um grupo restrito de clulas expressa molculas do MHC-II. Dentre estas, incluem-se
3.1.2 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T

O reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T mais complexo e requer que o antgeno seja previamente processado e apresentado por clulas e molculas especializadas. Os linfcitos T no so capazes de responder a antgenos em sua forma nativa, solvel ou no, e somente so estimulados por antgenos proticos, ou seja, apenas as protenas virais estimulam a resposta celular. Dependendo da sua origem e da forma como so processadas, as protenas virais podem ser reconhecidas pelos linfcitos Th, pelos Tc ou
246
Captulo 9
Linfcito Th
1 4
2 3
ncleo Clula apresentadora de antgeno (APC)
Figura 9.4. Apresentao de antgenos virais extracelulares e resposta por linfcitos Th. Antgenos virais extracelulares so internalizados por endocitose e/ou fagocitose (1) e processados proteoliticamente no interior de vesculas (2), gerando peptdeos que so conjugados com molculas do MHC-II no retculo endoplasmtico (3). Os complexos peptdeo-MHC-II so transportados at a superfcie celular (4), onde so reconhecidos pelos linfcitos Th (5). Os linfcitos Th, estimulados por esse contato, secretam interleucinas (6) que possuem diversas aes modulatrias sobre as clulas envolvidas na resposta imunolgica.
as clulas da linhagem monoctica/macrofgica (moncitos, macrfagos, CDs, clulas interdigitantes e LC), algumas clulas endoteliais e os linfcitos B. Ou seja, somente essas clulas so capazes de apresentar antgenos virais presentes no meio extracelular (exgenos) aos linfcitos Th. As clulas que possuem como funo precpua a captura, processamento e apresentao de antgenos aos linfcitos Th so denominadas genericamente clulas apresentadoras de antgenos (APCs) prossionais e, dentre estas, destacam-se as DCs e os macrfagos. Embora no se constituam em APCs prossionais, os linfcitos B tambm apresentam antgenos virais de forma eciente aos linfcitos Th. A via exgena de apresentao de antgenos
aos linfcitos Th est representada esquematicamente na Figura 9.4.
3.1.2.2 Reconhecimento de antgeno pelos linfcitos Tc

Os linfcitos Tc reconhecem protenas virais atravs dos TCRs, juntamente com a molcula acessria CD8. Por isso, essas clulas tambm so chamadas de linfcitos T CD8+. Para que as protenas virais sejam reconhecidas pelos receptores TCR+CD8 e estimulem os linfcitos Tc, tambm devem ser adequadamente processadas e apresentadas. No entanto, essa forma de processamento e apresentao somente ocorre com as
247
protenas sintetizadas no interior das clulas durante a infeco, e no com protenas extracelulares que so internalizadas. Por isso, essa via de apresentao denominada endgena. Protenas virais produzidas no interior das clulas durante o ciclo replicativo so clivadas enzimaticamente em peptdeos de 8 a 12 aminocidos, que so conjugados com molculas do MHC-I. Os complexos MHC-I+peptdeos virais so transportados at a superfcie celular, onde cam expostos (Figura 9.5). Esse um processo siolgico e resulta tambm na apresentao de fragmentos de protenas celulares. No entanto, apenas os peptdeos resultantes da clivagem das protenas virais so capazes de estimular os linfcitos Tc. O reconhe-
cimento dos complexos MHC-I+peptdeo realizado pelos complexos TCR+CD8 existentes na membrana dos linfcitos Tc. Essa interao gera estmulos que, em conjunto com citocinas produzidas pelos Th e DCs, levam ativao dos linfcitos Tc. Resumindo, os linfcitos Tc reconhecem protenas virais endgenas, aps o seu processamento e conjugao com molculas do MHC-I. Como, virtualmente, todas as clulas do organismo com exceo dos neurnios expressam o MHC-I, a infeco de quaisquer dessas clulas por vrus ir resultar no reconhecimento e resposta mediada por linfcitos Tc. Acredita-se, no entanto, que as DCs sejam mais efetivas na induo dos linfcitos Tc, pois, alm da apresentao
Linfcito Tc
7 6
1 5
Replicao viral ... prossegue...
2 4 3
ncleo
Qualquer clula nucleada
Figura 9.5. Apresentao de antgenos virais endgenos e resposta por linfcitos Tc. Aps a penetrao do vrus (1), as protenas virais so produzidas pelo aparato celular de traduo (2). Parte dessas protenas so processadas pelos proteassomos (3), resultando em peptdeos que so conjugados com molculas do MHC-I no RE (4). Esses complexos so transportados at a superfcie celular (5), onde sero reconhecidos pelos linfcitos Tc (6). Ativados pelo contato com o antgeno e por citocinas, os linfcitos Tc liberam o contedo citotxico de seus grnulos (7), destruindo a clula infectada.
248
Captulo 9
do MHC-I+ peptdeos, so capazes de fornecer os sinais adicionais para a ativao integral dos Tc. Essa via de apresentao e reconhecimento de antgenos muito importante na resposta a infeces vricas, pois permite ao sistema imunolgico reconhecer clulas infectadas por vrus e ativar o mecanismo mais efetivo para a sua destruio, os linfcitos Tc. Tanto as protenas estruturais como as no-estruturais produzidas durante a replicao viral podem ser processadas e apresentadas aos linfcitos Tc. A via endgena de apresentao de antgenos aos linfcitos Tc est representada esquematicamente na Figura 9.5.
As DCs desempenham um papel muito importante no processo de apresentao de antgenos a outras clulas do sistema imunolgico. As DCs podem ser infectadas por uma variedade de vrus e, assim, apresentar fragmentos de protenas virais conjugadas com o MHC-I aos linfcitos Tc. Alm de apresentar esses antgenos, as DCs fornecem estmulos qumicos (citocinas) para a ativao integral desses linfcitos (Figura 9.6). As DCs podem detectar vrions ou protenas virais atravs de receptores do tipo TLR 7 e 9, resultando em uma cascata de eventos intracelulares que as induzem a produzir citocinas e acelerar o seu
Linfcito Th
2a
2b
3 1 3 6
Linfcito Tc
Clula dendrtica
Linfcito B
8
CTL
5 9
Clula infectada Plasmcito
Figura 9.6. Interaes entre as DCs e os linfcitos e estimulao da resposta adquirida. As DCs so capazes de apresentar peptdeos exgenos aos linfcitos Th (1), estimulando-os a produzir citocinas do tipo Th1 (2a) ou Th2 (2b). O reconhecimento de antgenos em soluo ou nos icossomos da superfcie das DCs (3), juntamente com as citocinas do tipo Th2, estimula os linfcitos B a proliferar (4) e se diferenciar em plasmcitos, que so clulas secretoras de anticorpos (5). Os linfcitos Tc podem reconhecer antgenos endgenos na superfcie de clulas infectadas ou nas DCs (6). Este reconhecimento, juntamente com as citocinas do tipo Th1 (2a), ativa os linfcitos Tc que se tornam CTLs (7). Ao reconhecerem o mesmo padro antignico (MHC-I+ peptdeo viral) na membrana de clulas infectadas (8), os CTLs descarregam o seu arsenal citotxico que resulta em apoptose e morte celular (9).
249
processo de maturao. As DCs possuem prolongamentos citoplasmticos denominados dendritos, que aumentam a sua superfcie, facilitando, com isso, a interao com as demais clulas do sistema imunolgico. As DCs so capazes de capturar e armazenar antgenos em pequenas esferas na sua superfcie, denominadas icossomos. Dessa forma, as DCs podem oferecer e transferir antgenos para outras DCs, para macrfagos e mesmo para os linfcitos B. As interaes entre as DCs e as clulas envolvidas na resposta imune adquirida esto ilustradas na Figura 9.6 O contato entre os antgenos e as clulas do sistema imunolgico apresentao e reconhecimento de antgenos ocorre principalmente nos linfonodos e outros tecidos linfides secundrios. Nesses tecidos, o microambiente existente favorece as interaes entre o antgeno, as DCs e outras APCs, linfcitos T e B e clulas acessrias, resultando na estimulao eciente de uma gama de clulas envolvidas com a resposta imunolgica especca. Alm de se constituir no evento central da imunidade adquirida, o reconhecimento de antgeno e a conseqente estimulao de populaes de linfcitos T e B representa a etapa inicial da resposta imunolgica especca.
3.2 Resposta imune celular

A resposta imune especca mediada por clulas representada pela atividade dos linfcitos T, pois a participao das demais clulas (macrfagos, DCs e clulas NK) faz parte da resposta inata e ocorre de forma inespecca. Os mecanismos efetores dos linfcitos Th e Tc so distintos. Os linfcitos Th modulam a resposta imunolgica atravs das citocinas, que agem estimulando e modulando a atividade de uma variedade de clulas do sistema imune. Os linfcitos Tc possuem a funo precpua de identicar e destruir clulas infectadas por vrus. De acordo com as citocinas produzidas, dois tipos de respostas mediadas por linfcitos Th podem ser identicadas: as respostas do tipo Th1 e Th2. A resposta do tipo Th1 caracterizada pela secreo de IFN-I, IL-2, IL-12 e TNF-. Essas citocinas atuam principalmente na estimulao da imunidade celular (linfcitos Tc, DCs, clulas
NK e macrfagos). A resposta do tipo Th2 caracteriza-se pela secreo de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, citocinas que atuam principalmente na ativao da imunidade humoral. Essas citocinas possuem papel importante na ativao, proliferao e diferenciao de linfcitos B e secreo de anticorpos, ou seja, as citocinas produzidas pelos Th em resposta ao antgeno estimulam tanto a resposta celular como a resposta humoral. O balano entre as respostas do tipo Th1 e Th2 depende da biologia de cada vrus e de suas interaes com o sistema imunolgico. A funo principal dos Tc na resposta antiviral a destruio de clulas infectadas por vrus. Para muitas infeces vricas, a resposta celular, mediada pelos Tc, representa a forma mais eciente de combate e erradicao da infeco. A ativao dos linfcitos Tc ocorre aps o reconhecimento de antgenos apresentados por clulas infectadas. Esta ativao depende de dois estmulos bsicos: a estimulao resultante do reconhecimento dos complexos peptdeo-MHC-I na superfcie das clulas clulas infectadas e as citocinas produzidas pelas DCs ou pelos linfcitos Th ativados (Figura 9.6). Os complexos peptdeo-MHC-I so reconhecidos exclusivamente pelo TCR e CD8 dos linfcitos Tc. Aps a sua ativao, esses linfcitos tornam-se competentes para destruir as clulas que apresentem o mesmo complexo peptdeo-MHC-I que induziu a sua estimulao. Esses complexos sero encontrados nas clulas que albergam o vrus infectante. Os linfcitos Tc ativados e capazes de destruir clulas infectadas so denominados CTLs (citotoxic T lymphocytes). Ao entrar em contato com a clula infectada, os linfcitos Tc aderem a ela por meio do complexo TCR/CD8 e de outras molculas de superfcie. Essas interaes resultam na reorganizao do citoesqueleto, polarizando o linfcito Tc com o objetivo de descarregar o seu arsenal citotxico sobre a clula infectada. Entre os componentes citotxicos dos linfcitos Tc encontramse as perforinas, que possuem a capacidade de induzir a formao de poros na clula-alvo. Os linfcitos Tc tambm secretam as granzimas, que penetram nas clulas atravs dos poros e ativam mecanismos intracelulares que culminam com a morte programada da clula (apoptose). Poste-
250
Captulo 9
riormente, o linfcito Tc desprende-se da clula e parte em busca de novas clulas-alvo, caracterstica que lhe confere o codinome de serial killer entre as clulas do sistema imunolgico. O mecanismo de destruio celular pelos linfcitos Tc similar ao desencadeado pelas clulas NK.
3.2.1 Importncia dos linfcitos Tc na imunidade antiviral

Clulas infectadas por vrus podem produzir milhes de novas partculas virais em um perodo de poucas horas. A disseminao dos vrions entre as clulas ocorre pela liberao de partculas virais no meio extracelular ou pela transmisso direta dos vrions entre clulas. A transmisso direta entre clulas minimiza a possibilidade de um encontro indesejado dos vrions com as clulas e molculas do sistema imunolgico. Nesse caso, as nicas defesas das clulas infectadas so a produo de IFN-I e a apresentao dos antgenos virais associados ao MHC-I. Dessa forma, a presena do vrus no interior das clulas pode ser detectada pelas clulas vizinhas (via IFN-I) e pelos linfcitos Tc. A estratgia do organismo em utilizar os linfcitos Tc para destruir precocemente clulas infectadas muito apropriada, pois prefervel destruir pequenas fbricas de vrions a tentar inativar milhes de partculas vricas disseminadas no organismo e com o potencial de infectar novas clulas. O processamento e apresentao de protenas virais aos linfcitos Tc em fases iniciais da infeco permite ao hospedeiro identicar e destruir as clulas infectadas antes do incio da produo da prognie viral. No obstante, alguns vrus desenvolveram estratgias para evitar ou retardar o reconhecimento de clulas infectadas, a m de assegurar a concluso do ciclo replicativo e a liberao de prognie viral.
3.3 Resposta imune humoral

A resposta especca humoral mediada pelas imunoglobulinas (Igs), popularmente conhecidas como anticorpos. As Igs so produzidas e secretadas pelos plasmcitos, que so clulas originadas da proliferao e diferenciao dos
linfcitos B em resposta a antgenos (Figura 9.7). As Igs apresentam cinco classes principais, com estrutura e funes diferentes: IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Imunoglobulinas das classes IgM e IgD so tambm encontradas na superfcie dos linfcitos B, onde servem de receptores (BCRs) para o reconhecimento de antgenos por essas clulas. Devido aos mecanismos de diversidade e especicidade, cada linfcito B e a sua prognie possuem BCRs idnticos entre si e com a capacidade para reconhecer um nico determinante antignico. Felizmente, o organismo possui bilhes de linfcitos B com BCRs diferentes e, por isso, capazes de reconhecerem e responderem a uma variedade virtualmente innita de antgenos. A capacidade de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B depende exclusivamente do BCR e, conseqentemente, os linfcitos B podem reconhecer antgenos solveis e tambm antgenos no-proticos. Ou seja, os linfcitos B reconhecem os antgenos em sua forma nativa, sem a necessidade de processamento e apresentao prvios, como ocorre com os linfcitos T. A ativao dos linfcitos B depende da sua interao com os antgenos virais (via BCR) e da ao de citocinas secretadas pelos linfcitos Th, tambm em resposta ao reconhecimento do antgeno. As DCs desempenham um papel fundamental nesse processo, pois podem transferir antgenos aos linfcitos B por meio dos icossomos e, simultaneamente, apresentar antgenos ao linfcitos Th (Figuras 9.6 e 9.7). Por outro lado, os linfcitos B, aps reconhecerem um antgeno, podem interagir diretamente com os linfcitos Th, em um processo de estimulao recproca. importante ressaltar que os linfcitos B, alm de secretarem imunoglobulinas, tambm so excelentes APCs, ou seja, podem apresentar antgenos associados ao MHC-II aos linfcitos Th. As citocinas produzidas pelos Th, juntamente com o reconhecimento do antgeno pelo BCR, resultam em estimulao, proliferao e diferenciao dos linfcitos B em plasmcitos, clulas secretoras de anticorpos. As DCs tambm podem fornecer citocinas importantes para uma adequada estimulao dos linfcitos B. O contato com o antgeno e as citocinas produzidas pelos Th estimulam os linfcitos B a se
251
multiplicarem de forma rpida e abundante. As clulas resultantes dessa proliferao podem ter dois destinos: a grande maioria se diferencia em plasmcitos e uma minoria se diferencia em clulas de memria. Os plasmcitos possuem vida
relativamente curta; as clulas de memria possuem vida longa. Tanto os BCRs presentes na membrana dos linfcitos B de memria como as imunoglobulinas secretadas pelos plasmcitos possuem a mesma especicidade dos BCRs do
Vaso aferente
Clulas dendrticas 4
Crtex
2
B
5 7
Th
Centros germinativos
Clula de memria 10 Plasmcitos
Linfonodo
11
Vaso eferente
Figura 9.7. Mecanismos envolvidos na estimulao dos linfcitos B e produo de anticorpos. Partculas vricas ou antgenos virais drenados pela linfa nos tecidos perifricos penetram nos linfonodos pelos vasos aferentes (1). Esses antgenos podem ser reconhecidos diretamente pelos linfcitos B (2) ou em icossomos na superfcie das DCs (3). Tanto as DCs como os linfcitos B podem processar e apresentar antgenos virais aos linfcitos Th (4, 5), que secretam citocinas em resposta (6). Estas citocinas atuam nos linfcitos B, estimulando a sua proliferao (7) e diferenciao em plasmcitos (8) ou em clulas de memria (9). Os plasmcitos secretam grande quantidade de anticorpos (10) que tm acesso aos lquidos corporais (11). Clulas fagocticas e/ou DCs podem tambm penetrar nos linfonodos j com antgenos virais capturados nos tecidos perifricos e os apresentar aos linfcitos Th e B.
Diferenciao
Proliferao
Ativao
252
Captulo 9
linfcito B que os deu origem. A estimulao e proliferao dos linfcitos B ocorrem nos rgos linfides secundrios, sobretudo nos linfonodos. Os anticorpos produzidos so secretados no meio extracelular e atravs dos vasos eferentes podem ter acesso corrente sangnea e, posteriormente, aos tecidos. Os processos de reconhecimento do antgeno, proliferao e diferenciao dos linfcitos B esto ilustrados esquematicamente na Figura 9.7.
3.4 Respostas primria e secundria/memria imunolgica

Os linfcitos possuem um perodo de vida relativamente curto aps a sua produo a partir dos progenitores linfides na medula ssea. No entanto, a sua sobrevivncia pode ser prolongada desde que encontrem o antgeno que os estimule a proliferar e se diferenciar, ou seja, os linfcitos que no encontram o antgeno que os estimule possuem vida curta; aqueles que encontram o antgeno complementar ao seu BCR tm a sua vida prolongada. Dessa forma, a presena de antgenos especcos no organismo literalmente resgata os linfcitos da morte, estimulando-os a proliferar e se diferenciar, gerando uma resposta imune, denominada resposta primria. O principal evento da resposta primria a expanso dos clones de linfcitos que possuem receptores para os antgenos introduzidos pela primeira vez no organismo. Porm, a maioria das clulas originadas pela expanso clonal se diferenciar em clulas de vida curta, os plasmcitos. Os plasmcitos exercem a sua funo de secreo de Igs e sobrevivem por algumas semanas ou meses. Felizmente, aps a expanso clonal, uma frao pequena dos linfcitos estimulados no se diferencia em plasmcitos, e sim em clulas de memria. Estas mantm a capacidade de reconhecimento do mesmo antgeno que as estimulou (pois possuem os BCRs com especicidade idntica aos da clula original) e sobrevivem no organismo por um longo tempo. As clulas de memria habitam a medula ssea e circulam pelo organismo. Ao encontrarem o mesmo antgeno que as estimulou previamente (vrions ou protenas virais), essas clulas respondem rapidamente, produzindo
uma resposta proliferativa e de diferenciao rpida e intensa. Essa resposta denominada resposta imune secundria. Embora mais estudados em linfcitos B, pela facilidade de quanticao dos anticorpos, os eventos envolvidos na resposta primria e secundria provavelmente ocorram de forma semelhante aos linfcitos T. A resposta primria a um determinado vrus pode resultar de infeco natural ou de vacinao e prepara o sistema imunolgico para responder e montar uma resposta secundria caso ocorra uma reexposio posterior ao agente. A memria imunolgica de linfcitos B e T diferente. A produo contnua de anticorpos especcos tem sido detectada vrias dcadas aps a infeco por alguns vrus. Como a vida mdia dos anticorpos no organismo de poucas semanas, isto indica que ocorre uma produo contnua de anticorpos para que os nveis sejam mantidos. Uma possvel explicao para esse fato de que linfcitos B de memria seriam constantemente reestimulados a se diferenciarem em plasmcitos secretores de Igs, pois os plasmcitos possuem vida curta. O contato freqente com o antgeno e as conseqentes reestimulaes podem decorrer da reexposio ao prprio microorganismo ou resultar de reatividade cruzada com antgenos semelhantes, prprios ou heterlogos. Alm disso, recentemente foi observado que as DCs possuem a capacidade de armazenar antgenos em seus dendritos por perodos prolongados e liber-los lentamente para os linfcitos de memria, provocando a sua reestimulao contnua. Isso poderia proporcionar uma estimulao prolongada no somente dos linfcitos de memria, mas tambm de linfcitos que ainda no haviam sido estimulados (naive ou virgens). Estes, ao chegarem aos rgos linfides, encontrariam com o antgeno pela primeira vez, gerando novamente uma resposta imune primria e, conseqentemente, a produo de mais linfcitos de memria. Ao contrrio da fase efetora da resposta humoral cuja produo de anticorpos pode persistir por longos perodos a fase efetora da resposta celular de curta durao. A presena prolongada de linfcitos Th e Tc efetores seria deletria para o organismo, pois a secreo persistente de
253
citocinas e a atividade citoltica continuada poderiam resultar em imunopatologia. Aps a fase efetora, as clulas T de memria so encontradas com freqncia mais alta e podem responder com mais rapidez e ecincia a estmulos antignicos secundrios. A rapidez e ecincia com que as clulas T de memria se deslocam para os stios de infeco e respondem a estmulos secundrios faz com que no seja necessria a preexistncia de clulas efetoras para gerar uma resposta protetora. Uma das questes fundamentais na resposta imune est relacionada com os mecanismos que garantem a sobrevivncia e manuteno das clulas T e B de memria. A estabilidade da memria dos linfcitos Tc, por exemplo, mantida por divises celulares lentas e continuadas. As clulas B de memria podem ser mantidas por estimulaes paralelas, ou seja, por citocinas produzidas pelas clulas Th e DCs em resposta a outros antgenos. No entanto, embora a medula ssea apresente o ambiente ideal para a manuteno, replicao e sobrevivncia dessas clulas, acredita-se que a reexposio e contato com o antgeno sejam importantes para a manuteno das clulas B de memria. Com isso, as reestimulaes contribuiriam para a reposio das clulas secretoras de Igs e a conseqente manuteno dos nveis de anticorpos circulantes. O conhecimento dos eventos que ocorrem durante a resposta primria e secundria fundamental para o entendimento das bases imunolgicas da proteo induzida por vacinas. A vacinao induz uma resposta primria, com a conseqente expanso de clones de linfcitos B e T especcos para os antgenos vacinais. Com isso, so produzidos plasmcitos e linfcitos T efetores, que possuem vida curta; e, principalmente, clulas B e T de memria, que possuem vida longa e so capazes de responder ao mesmo padro antignico que induziu a sua proliferao. A infeco subseqente de um animal vacinado ir induzir uma resposta secundria, com estimulao e proliferao muito mais rpida e intensa de linfcitos T e B, pois o nmero dessas clulas especcas para o antgeno agora muito maior, resultado da expanso clonal da resposta primria. Esta infeco resulta em estimulao
dos linfcitos de memria, que proliferam e se diferenciam em clulas efetoras, a exemplo do que ocorreu na resposta primria, porm com muito maior ecincia e rapidez. O resultado a produo de linfcitos Th e Tc efetores e de plasmcitos secretores de anticorpos, que se encarregam de combater o vrus invasor.
3.5 As imunoglobulinas na defesa antiviral

A importncia dos anticorpos na imunidade antiviral tem sido muito discutida e parece variar de acordo com a biologia do vrus e tambm com o estgio da infeco (infeco primria versus reinfeco). Como os anticorpos aparecem apenas tardiamente durante a infeco primria, acredita-se que desempenhem um papel secundrio na erradicao dessa infeco. O papel principal nesses casos seria assumido pelos linfcitos Tc. Os anticorpos teriam participao mais efetiva na proteo em casos de reinfeco, quando atuariam limitando e restringindo a penetrao e disseminao do vrus no organismo. Alm dessa diferena, a importncia relativa dos anticorpos e da imunidade celular variam de acordo com a biologia e interaes de cada vrus com o hospedeiro. Os principais locais de produo de anticorpos pelos plasmcitos so os centros germinativos dos linfonodos e as regies equivalentes dos outros rgos linfides secundrios. As Igs esto presentes nos uidos do organismo (plasma sangneo, saliva, lgrima, urina, colostro/ leite, muco, secrees, lquido cfalo-raquidiano e lquido sinovial) e so capazes de se ligar especicamente no determinante antignico que induziu a sua formao. Para vrias infeces virais, a quantidade de Igs especcas presentes no soro sangneo pode ser correlacionada com proteo. Por isso, esse parmetro utilizado para o monitoramento dos provveis nveis de proteo e da necessidade de novas imunizaes. Considerando-se que a resistncia antiviral devese, em grande parte, atividade dos linfcitos Tc (que efetivamente destroem clulas infectadas), a quanticao dos anticorpos no pode ser considerada o indicador nico de proteo. No obs-
254
Captulo 9
tante, a sorologia muito utilizada para se avaliar os nveis de imunidade como um todo, visto que os mtodos para detectar e quanticar a funo de linfcitos T so de difcil aplicao.
3.5.1 Mecanismos de ao das imunoglobulinas

As Igs possuem vrias atividades biolgicas que potencialmente podem estar envolvidas na resposta antiviral. Algumas dessas atividades j foram demonstradas in vivo e a sua participao na resposta antiviral parece ser inquestionvel; outras somente foram demonstradas inequivocadamente in vitro e/ou possuem um papel controverso na resposta imunolgica contra os vrus. A seguir so listadas as principais atividades antivirais dos anticorpos (essas atividades na defesa contra vrus esto ilustradas na Figura 9.8): Neutralizao: a interao dos vrions com os receptores celulares para o incio da infeco mediada por regies especcas das protenas de superfcie dos vrions (anti-receptores). Anticorpos produzidos contra essas regies possuem a capacidade de se ligar aos vrions e impedir a interao com os receptores celulares, neutralizando a sua infectividade. Esses anticorpos so denominados genericamente neutralizantes e constituem uma parcela do total de anticorpos produzidos contra os vrus. Anticorpos com atividade neutralizante so direcionados contra protenas de superfcie dos vrions. A neutralizao de partculas virais pode ocorrer por Igs da classe IgA, presente nas mucosas e em secrees; ou por IgM e IgG, presentes no plasma sangneo. Um dos desaos da vacinologia a induo de proteo slida nas mucosas, pela estimulao de IgA com capacidade de neutralizar as partculas vricas nos locais mais freqentes de penetrao viral (sistema respiratrio, digestrio e reprodutivo) e, assim, impedir a instalao da infeco. A neutralizao da infectividade o mecanismo mais direto de ao dos anticorpos contra vrus e, talvez, o mais importante; Aglutinao: as IgM e IgG possuem a capacidade de aglutinar partculas virais e, com isso, facilitar a sua remoo mediada pelo sistema complemento e por clulas fagocticas;
Opsonizao: o revestimento de partculas vricas por molculas de imunoglobulinas (IgM e IgG) facilita a ligao e remoo dessas partculas pelas clulas fagocticas, via receptores para a poro Fc das Igs. A ativao do sistema do complemento tambm gera fragmentos capazes de opsonizao viral (C3b); Ativao do complemento: a ligao das Igs aos antgenos resulta em alteraes tridimensionais na sua regio Fc, expondo stios de ligao para o componente C1 do complemento, iniciando a sua ativao em cascata. O resultado a estimulao de vrios mecanismos da imunidade inata (vasodilatao, aumento da permeabilidade capilar, quimiotaxia para fagcitos, entre outros) e a formao do MAC sobre a superfcie dos vrions, o que pode resultar na inativao da infectividade dos vrus envelopados. A ligao de anticorpos em protenas virais inseridas na membrana de clulas infectadas pode ativar o complemento e levar formao do MAC. Com isso, a clula infectada pode sofrer lise osmtica. Esse mecanismo pode tambm ocorrer com bactrias; Citotoxicidade mediada por clulas dependente de anticorpos (ADCC): durante a replicao de alguns vrus, certas protenas virais podem ser inseridas na membrana plasmtica da clula infectada. Anticorpos especcos so produzidos contra essas protenas e se ligam a elas na superfcie celular. Com isso, a clula infectada se torna alvo para algumas clulas do sistema imunolgico que possuem receptores para a poro Fc das Igs (clulas NK e neutrlos) e destroem a clula. Embora a ADCC tenha sido amplamente demonstrada in vitro, a sua importncia in vivo ainda desconhecida; Outras atividades dos anticorpos: embora as Igs desempenhem funes bencas para a manuteno da integridade e funcionalidade do organismo, pelo combate a agentes infecciosos potencialmente nocivos, eventualmente podem participar de processos que so prejudiciais ao hospedeiro. A presena de grande quantidade de antgenos no plasma sangneo pode levar formao disseminada de complexos antgenoanticorpo. Esses complexos geralmente so removidos pelas clulas fagocticas. No entanto, quando esto em excesso, depositam-se em locais
255
1 2
Tc
6
Figura 9.8. Atividades dos anticorpos na resposta contra vrus. Neutralizao da infectividade (1), aglutinao (2), opsonizao e fagocitose (3), ativao do complemento (4), lise de vrus envelopados mediada por complemento (5), ADCC (6) e lise celular mediada por complemento dependente de anticorpos (7).
como as superfcies articulares e tbulos renais e, freqentemente, causam imunopatologia. O revestimento de vrions com anticorpos sem atividade neutralizante pode, ao invs de neutraliz-lo, potencializar a sua infectividade. Essas Igs so reconhecidas por clulas que possuem receptores para a poro Fc (moncitos e macrfagos), resultando na internalizao eciente de vrions recobertos com anticorpos, facilitando a infeco dessas clulas, ou seja, os anticorpos aumentam a ecincia de penetrao desses vrions. Esse mecanismo denominado Antibody Dependent Enhancement (ADE) e tem sido descrito para v-
rios vrus, dentre os quais o vrus da dengue, o coronavrus felino e o vrus da imunodecincia humana (HIV). O papel da ADE na patogenia dessas doenas, no entanto, ainda tema de debates.
3.6 O papel das respostas celular e humoral na imunidade antiviral

Os avanos no estudo da imunologia antiviral tm resultado na emergncia de importantes componentes e mecanismos anteriormente relegados a papis secundrios na resposta imune,
256
Captulo 9
como as DCs. No entanto, o papel exato de cada componente na intrincada cadeia de relaes celulares e moleculares que resultam na eliminao de uma determinada infeco vrica ainda no est satisfatoriamente esclarecido. O esclarecimento desses mecanismos depende do entendimento detalhado da biologia e da patogenia de cada infeco e das interaes peculiares de cada vrus com o sistema imunolgico. No obstante, pode-se armar que os linfcitos Tc so fundamentais na erradicao da infeco primria, pela destruio das clulas infectadas. Os anticorpos no teriam grande participao no combate infeco primria, pois aparecem tardiamente no curso da infeco. Seriam de fundamental importncia por ocasio de uma reexposio ao agente, prevenindo e/ou limitando a infeco atravs de neutralizao viral e de outros mecanismos que restringiriam a disseminao do vrus no organismo. Caberia aos linfcitos Th o papel de coordenar e moderar as duas respostas (humoral, mediada por linfcitos B; e celular, mediada por linfcitos Tc) pela secreo de citocinas.
tolerncia, integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro, infeco de stios imunologicamente privilegiados e interferncia com funes do sistema imunolgico.
4.1 Infeces latentes no sistema nervoso central

O estabelecimento de infeces latentes um eciente mecanismo de perpetuao no hospedeiro utilizado pelos vrus da famlia Herpesviridae. A fase de latncia, que se segue infeco aguda, caracterizada pela presena do genoma viral inativo em neurnios, sem sntese protica ou produo de prognie viral. Como conseqncia, a infeco desses neurnios no detectada pelo sistema imunolgico e essas clulas podem manter o material gentico viral indenidamente. No entanto, sob determinadas circunstncias, geralmente associadas com estresse, ocorre a reativao e a retomada da replicao viral nos neurnios infectados. Os vrions produzidos migram pelos axnios de volta aos locais de replicao primria, de onde so excretados, podendo infectar outros hospedeiros. O estabelecimento e reativao de infeces latentes, portanto, constituem-se em estratgias dos herpesvrus para escapar do sistema imunolgico e garantir a sua perpetuao no hospedeiro e na populao. Infeces latentes ocorrem com os herpesvrus bovino tipo 1 e 5 (BoHV-1 e 5), herpesvrus suno (doena de Aujeszky), herpesvrus felino tipo 1 (FHV-1), herpesvrus eqinos tipo 1 e 4 (EHV-1 e 4), entre outros.
4 Mecanismos virais de evaso da resposta imune

A ocorrncia contnua de doenas virais somente possvel devido ao sucesso desses microorganismos em produzir infeces, resistir ou escapar dos mecanismos antivirais do hospedeiro e se disseminar para outros hospedeiros susceptveis. Hospedeiros imunes impedem a progresso da infeco, o que reduz drasticamente a possibilidade de transmisso do vrus para outros animais. Dezenas ou centenas de milhares de anos de coexistncia, alm da rapidez com que os vrus se multiplicam e evoluem geneticamente, permitiram o desenvolvimento de estratgias que lhes permitem evitar ou resistir s defesas do hospedeiro, causando infeces produtivas, agudas ou crnicas, e garantindo a sua manuteno e perpetuao na natureza. Dentre os mecanismos utilizados pelos vrus para compatibilizar a sua existncia e perpetuao, apesar dos mecanismos imunolgicos do hospedeiro, destacam-se os seguintes: infeces latentes no sistema nervoso central, variaes antignicas, induo de
4.2 Variaes antignicas

Alteraes na seqncia de aminocidos de determinantes antignicos em protenas de superfcie dos vrions permite o escape da neutralizao por anticorpos e uma estratgia muito utilizada pelos vrus, principalmente os vrus RNA. Essas alteraes surgem como resultado dos erros cometidos pela enzima RNA polimerase viral durante a replicao do genoma. Como conseqncia, aminocidos diferentes so freqentemente incorporados durante a sntese das protenas virais, alterando a sua seqncia e es-
257
trutura, podendo resultar no no-reconhecimento pelos anticorpos produzidos contra os epitopos originais. Vrions com alteraes antignicas podem, assim, escapar da resposta imune existente naquele momento no hospedeiro, principalmente da imunidade humoral, e infectar novas clulas. A presena desses novos determinantes antignicos elicitar a sntese de anticorpos com uma nova especicidade. Porm, novas variaes podero ser posteriormente produzidas e novamente alguns variantes podem escapar da neutralizao. Essas variaes antignicas discretas, geralmente associadas com a acumulao de mutaes em ponto, so denominadas genericamente de antigenic drift e tm sido bem caracterizadas nos vrus da inuenza, embora ocorram tambm em outros vrus. Alteraes antignicas mais drsticas ocorrem quando os vrus da inuenza trocam entre si os genes que codicam as protenas do envelope (HA e NA), resultando em vrus antigenicamente muito diferentes dos parentais. Esse mecanismo denominado antigenic shift e tem sido implicado no surgimento de vrus de maior patogenicidade, responsveis por epidemias de grandes propores.
mais. Essa condio s possvel pela tolerncia do sistema imunolgico aos antgenos virais.
4.4 Integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro

Os vrus da famlia Retroviridae podem persistir no hospedeiro durante toda a sua vida, mesmo na presena da resposta imune. O mecanismo de persistncia resulta de dois aspectos da biologia desses vrus: a) possuem a capacidade de inserir cpias do seu genoma nos cromossomos das clulas hospedeiras e b) possuem a enzima denominada transcriptase reversa, responsvel pela transcrio reversa do genoma (RNA para DNA), mas que no corrige os seus prprios erros. Com isso, a cada ciclo so produzidas populaes de vrus compostas por indivduos com pequenas diferenas genticas entre si (quasiespecies). A insero do material gentico viral garante que a infeco seja permanente, e as alteraes antignicas que resultam de cada ciclo de replicao viral asseguram que alguns vrions produzidos possam escapar da resposta imune para infectar novas clulas. Dentre as infeces por retrovrus animais destacam-se a anemia infecciosa eqina e a imunodecincia felina.
4.3 Induo de tolerncia

Em condies normais, o sistema imunolgico possui tolerncia, ou seja, no reage contra os antgenos do prprio organismo. Ocasionalmente o sistema imunolgico pode se tornar tolerante tambm a antgenos estranhos, contra os quais deveria produzir uma resposta. Um exemplo o que ocorre quando fetos bovinos so infectados por cepas no-citopticas do vrus da diarria viral bovina (BVDV) entre os 40 e 120 dias de gestao. Nessa fase, o sistema imunolgico do feto ainda est imaturo e no reconhece os antgenos virais como estranhos. Com isso, no ocorre a estimulao e proliferao de linfcitos B e T e, como conseqncia, o feto ca incapaz de montar uma resposta contra o vrus. Os fetos imunotolerantes nascem persistentemente infectados (PI) pelo BVDV e excretam o vrus continuamente em secrees e excrees. Os animais PI se constituem no ponto-chave da epidemiologia do BVDV, pois so fontes contnuas de vrus para os outros ani-
4.5 Infeco de stios imunologicamente privilegiados

Os tecidos e rgos aos quais os componentes do sistema imunolgico no possuem acesso imediato e irrestrito so denominados genericamente stios de privilgio. Os neurnios do SNC, por exemplo, no expressam de forma constitutiva as molculas do MHC-I, o que diculta o reconhecimento da infeco celular e a ao dos linfcitos Tc. Conseqentemente, os vrus que infectam neurnios so privilegiados, pois as clulas hospedeiras no denunciam a sua presena. Por outro lado, a falta de expresso de molculas do MHC-I pode ser considerada um mecanismo de proteo, evitando a destruio de clulas to importantes. Da mesma forma, a barreira hematoenceflica restringe o acesso de algumas clulas imunolgicas ao SNC. So tambm considerados stios de privilgio as clulas da epiderme (onde
258
Captulo 9
ocorrem infeces pelos vrus da papilomatose), as clulas germinativas das gnadas (onde pode ocorrer a infeco pelo vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos, PRRSV), retina, clulas dos tbulos renais (utilizadas pelos hantavrus e arenavrus) e tecidos fetais (diversos vrus).
4.6 Interferncia com funes do sistema imunolgico

Os estudos sobre as relaes vrus-clula e sobre a biologia dos vrus permitiram elucidar vrios mecanismos utilizados pelos vrus para subverter o sistema imunolgico, por meio da interferncia com a funo das clulas e molculas imunolgicas. Essa interferncia freqentemente leva a decincias na resposta imunolgica, conseqncias denominadas genericamente de imunossupresso. Cada vrus utiliza uma estratgia especca, dependendo da sua biologia, o que torna impraticvel enumer-las aqui. No entanto, como mecanismos gerais, citam-se: a) destruio, inibio ou induo da maturao das DCs, o que altera o padro de secreo de citocinas e de expresso de receptores nas DCs, resultando em prejuzo nas suas relaes com as demais clulas do sistema imunolgico, principalmente os linfcitos T; b) destruio ou alterao das funes dos linfcitos T; c) interferncia com a apresentao de antgenos, inibindo a ao das protenas TAP-1 e TAP-2 e inibio da formao do complexo peptdeo-MHC-I no retculo endoplasmtico (RE); d) produo de protenas que inibem a funo das citocinas; e) produo de protenas que protegem a clula infectada da ao do IFN-I e do TNF- e f) infeco dos linfcitos B, induzindo alterao na secreo de imunoglobulinas.
espcies animais. Observando a trajetria desses fascinantes microorganismos e de suas complexas interaes celulares e moleculares, percebese o quanto ainda h para descobrir em relao aos mecanismos imunolgicos protetores. Tanto verdade que o surgimento do HIV renovou o interesse dos pesquisadores pela imunologia. A partir de ento, o descobrimento de novas infeces e o desao de vencer velhos conhecidos fez da imunologia uma das reas do conhecimento que mais rapidamente acumula informaes. Paralelamente aos avanos no conhecimento das interaes dos vrus com o sistema imunolgico e dos mecanismos utilizados por esses agentes para se perpetuarem no hospedeiro surgem importantes linhas de pesquisa na rea de desenvolvimento de vacinas. Um dos maiores avanos dos ltimos anos foi a elucidao do papel central das DCs na resposta s infeces virais. Essas clulas se constituem no elo de ligao entre mecanismos imunolgicos naturais e especcos. Juntamente com a descoberta da importncia das DCs, novos questionamentos direcionam as investigaes futuras que, necessariamente, devero considerar a manipulao de vetores virais para maximizar a resposta imune com vistas produo de vacinas.
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Cellular and molecular immunology. 4.ed. Philadelphia: Saunders, 2000. 553p. AHMED, R.; BIRON, C.A. Immunity to viruses. In: PAUL, W.E. (ed). Fundamental immunology. 4.ed. New York: LippincottRaven, 1998. Cap.39, p.1295-1334. BERTRAM, E.M.; DAWICKI, W.; WATTS, T. Role of T cell costimulation in antiviral immunity. Seminars in Immunology, v.16, p.185-196, 2004. BERZOFSKY, J.A.; BERKOWER, I.J. Immunogenicity and antigen structure. In: PAUL, W.E. (ed). Fundamental immunology. 4.ed. New York: Lippincott-Raven, 1998. Cap.19, p.651-699. BROWN, D.M.; ROMN, E.; SWAIN, S.L. CD4 T cells responses to inuenza infection. Seminars in Immunology, v.16, p.171177, 2004. CROTTY, S.; AHMED, R. Immunological memory in humans. Seminars in Immunology, v.16, p.197-203, 2004.
5 Consideraes nais
inquestionvel o avano no entendimento dos mecanismos imunolgicos estimulados durante as infeces vricas. Os imunologistas aprendem imunologia com os vrus, cujas interaes com o sistema imunolgico so repletas de estratgias para driblar ou conviver com os mecanismos imunolgicos e, assim, perpetuar-se nas
259
McHEYZER-WILLIAMS, L.J.; McHEYZER-WILLIAMS, M.G. Antigen-specic memory B cell development. Annual Review of Immunology, v.23, p.487-513, 2005. NOSSAL, G.J.V. Vaccines. In: PAUL, W.E. (ed). Fundamental Immunology. 4.ed. New York: Lippincott-Raven, 1998. Cap.42, p.1387-1425. STEINMAN, R.M. Dendritic cells. In: PAUL, W.E. (ed). Fundamental immunology. 4.ed. New York: Lippincott-Raven, 1998. Cap.16, p.547-573. TORTORELLA, D. et al. Viral subversion of the immune system. Annual Review of Immunology, v.18, p.861-926, 2000. WELSH, R.M.; SELIN, L.K.; SZOMOLANYI-TSUDA, E. Immunological memory to viral infections. Annual Review of Immunology, v.22, p.711-743, 2004. WHITTON, J.L.; OLDSTONE, M.B.A. Immune response to viruses. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.12, p.345-374. WODARZ, D.; CHRISTENSEN, J.P.; THOMSEN, A.R. The importance of lytic and nonlytic immune responses in viral infections. Trends in Immunology, v.23, p.194-200, 2002. WOODLAND, D.L.; RANDALL, T.R. Anatomical features of antiviral immunity in the respiratory tract. Seminars in Immunology, v.16, p.163-170, 2004. YEWDELL, J.W.; HAERYFAR, S.M. Understanding presentation of viral antigens to CD8+ T cells in vivo: the key to rational vaccine design. Annual Review of Immunology, v.23, p.651682, 2005. YOKOYAMA, W.M.; KIM, S.; FRENCH, A.R. The dynamic life of natural killer cells. Annual Review of Immunology, v.22, p.405-429, 2004. ZINKERNAGEL, R.M. Virus-induced immunopathology. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.8, p.163-179.
DOHERTY, P.C.; AHMED, R. Immune responses to viral infection. In: NATHANSON, N. (ed). Viral Pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.7, p.143-161. FENNER, F.J. et al. Immune response to viral infections. In: ___. Veterinary virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1993. Cap.8, p.137-158. FLINT, S.J. et al. Prevention and control of viral diseases. In: __ _. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. Cap.19, p.662-714. FLINT, S.J. et al. Viruses offense meets host defense. In: _____ _. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. Cap.14, p.478-516. GORDON, S. Macrophages and the immune response. In: PAUL, W.E. (ed). Fundamental immunology. 4.ed. New York: Lippincott-Raven, 1998. Cap.15, p.533-545. HAERYFAR, S.M. The importance of being a pDC in antiviral immunity: the IFN mission versus Ag presentation? Trends in Immunology, v.26, p.311-317, 2005. HAMERMAN, J.; OGASAWARA, K.; LANIER, L.L. NK cells in innate immunity. Current Opinion in Immunology, v.17, p.2935, 2005. JANEWAY Jr, C.A.; MEDZHITOV, R. Innate immune recognition. Annual Review of Immunology, v.20, p.197-216, 2002. KLEIN, J.; HOREJSI, V. Defence against invaders. In: ______. Immunology. 2.ed. Malden, MA: Backwell Science, 1997. Cap.21, p.532-595. KLEIN, J.; HOREJSI, V. T-Lymphocyte and natural killer cell responses. In: ___. Immunology. 2.ed. Malden, MA: Backwell Science, 1997. Cap.16, p.465-482. LARSSON, M.; BEIGNON, A.S.; BHARDWAJ, N. DC-virus interplay: a double edged sword. Seminars in immunology, v.16, p.147-161, 2004. LEE, S.H.; JUNG, J.U.; MEANS, R.E. Complementing viral infection: mechanisms for evading innate immunity. Trends in Microbiology, v.11, p.449-452, 2003.
EPIDEMIOLOGIA DAS INFECES VRICAS

10
263 263
265 269 270 273 274 274
1 Introduo 2 A cadeia do processo infeccioso

2.1 Fontes de infeco 2.2 Vias de excreo 2.3 Mecanismos de transmisso 2.4 Vias de penetrao 2.5 O novo hospedeiro 2.5.1 Patogenia e resposta imunolgica
3 Mecanismos de perpetuao dos vrus na natureza

3.1 Infeces persistentes 3.2 Infeces latentes 3.3 Infeco de vrias espcies animais 3.4 Infeco de vetores 3.5 Sobrevivncia no ambiente 3.6 Transmisso vertical 3.7 Ciclos contnuos de transmisso
275
276 276 277 279 279 280 281
4 Doenas em populaes
4.1 Denio de populao 4.2 Populao de risco 4.3 Populaes abertas e fechadas 4.4 Quanticao de doena: incidncia e prevalncia
281
281 282 282 283
5 Padres temporais de ocorrncia das doenas vricas

5.1 Doenas espordicas 5.2 Doenas endmicas 5.3 Doenas epidmicas 5.4 Fatores determinantes das epidemias 5.5 Outros padres de ocorrncia
284
284 285 285 287 287
6 Distribuio espacial das doenas vricas

6.1 Doenas de distribuio mundial 6.2 Doenas com certa limitao geogrca 6.3 Doenas restritas geogracamente 6.4 reas livres naturais 6.5 reas livres articiais
288
288 289 289 289 290
7 Doenas vricas emergentes 8 Bibliograa consultada
290 293
1 Introduo
A epidemiologia estuda as doenas em populaes, investigando os seus determinantes, a sua dinmica e distribuio. Os fatores envolvidos na manuteno e transmisso das infeces vricas nas populaes so mltiplos e participam de interaes complexas, s vezes, de difcil compreenso. A complexidade dessas interaes muito varivel entre as viroses. Existem infeces vricas que so mantidas na populao por uma cadeia sucessiva de infeces agudas entre hospedeiros de uma nica espcie animal. Essas infeces apresentam, portanto, uma epidemiologia relativamente simples. Outras viroses conseguem persistir na populao graas a infeces persistentes ou latentes. Por outro lado, alguns vrus desenvolveram a capacidade de infectar vrias espcies de hospedeiros e a sua manuteno, na natureza, possvel pela ocorrncia de ciclos alternados de infeco nessas espcies. Infeco de espcies silvestres, transmisso por artrpodes, longos perodos de incubao ou de sobrevivncia no meio ambiente, transmisso vertical, variabilidade gentica e antignica, entre outras, fazem parte do arsenal de estratgias utilizadas pelos vrus para assegurar a sua sobrevivncia como espcie. Alguns vrus fazem uso concomitante de vrias dessas estratgias, o que torna a sua epidemiologia extremamente complexa, favorecendo a sua manuteno no ambiente e dicultando o seu controle.
Os principais objetivos das investigaes epidemiolgicas so o conhecimento dessas cadeias de interaes e a identicao de pontos frgeis que sejam passveis de interveno, visando ao controle das doenas. A nfase maior da epidemiologia a populao a sua sade e bem-estar. A importncia do indivduo limitase sua condio de componente da populao, pois, como tal, pode originar informaes teis para a preservao da sade coletiva. Este captulo aborda, de forma genrica, os principais aspectos da epidemiologia das infeces vricas de animais. Os aspectos epidemiolgicos mais relevantes de cada virose sero abordados oportunamente nos captulos especifcos. A epidemiologia aplicada s doenas animais possui uma terminologia prpria (epizootiologia, epizootia, enzootia etc.). Este texto, no entanto, utilizar a terminologia clssica (epidemia, endemia etc.), consagrada ao longo de dcadas na descrio de doenas humanas, mas que tambm tem sido utilizada em epidemiologia veterinria.
2 A cadeia do processo infeccioso

A sobrevivncia de um vrus como espcie depende de sua capacidade de cumprir uma seqncia de etapas que se convencionou chamar de cadeia do processo infeccioso. Para facilitar o seu entendimento, a cadeia do processo infeccioso pode ser dividida nas seguintes etapas: fontes de infeco, vias de excreo, mecanismos de transmisso, vias de penetrao e o novo hospedeiro (Figura 10.1).
Excreo
Penetrao
Fonte de infeco Transmisso
Novo hospedeiro
Figura 10.1. A cadeia do processo infeccioso.
264
Captulo 10
Inicialmente, o agente deve penetrar e se multiplicar no hospedeiro e, mesmo na presena da resposta imunolgica, produzir prognie vivel. Essa prognie deve ser excretada do hospedeiro a tempo, pela via adequada e em quantidade suciente para permitir a sua transmisso a outros indivduos (Figura 10.2). Aps a excreo, o agente deve ser capaz de resistir no meio ambiente o tempo necessrio para encontrar outro hospedeiro susceptvel. A transmisso dos vrus entre hospedeiros pode ocorrer por diferentes meios. Alguns vrus so transmitidos por contato direto entre hospedeiros. Nesses casos, a capacidade do vrus resistir em condies ambientais irrelevante, pois o tempo e espao entre os hospedeiros so virtuais. J outros agentes no so transferidos imediatamente, e a sua transferncia entre hospedeiros ocorre com o auxlio de objetos inanimados ou de artrpodes (insetos). Nesses casos, o agente necessita obrigatoriamente resistir no meio ambiente e/ou replicar ou persistir vivel nos vetores pelo tempo necessrio, a m de assegurar a sua transmisso ao prximo hospedeiro.
Ao contrrio de outros microorganismos (bactrias e fungos) a maioria dos vrus no capaz de manter a viabilidade por longos perodos no meio externo. Isso crtico para muitos desses agentes, uma vez que a viabilidade e a perspectiva de transmisso so freqentemente perdidas pela inativao no meio ambiente. Aps encontrar um hospedeiro susceptvel, o agente deve penetrar pela via adequada (Figura 10.3) e multiplicar nos tecidos e rgos-alvo para produzir prognie e ser novamente excretado. O cumprimento dessas etapas fundamental para a perpetuao dos vrus assim como de outros agentes infecciosos na natureza. Na realidade, o processo evolutivo fez com que os agentes virais que existem atualmente tenham desenvolvido meios para cumprir essas etapas e, assim, sobreviver como espcie. No obstante, as estratgias utilizadas para realizar essa tarefa so variadas e peculiares de cada vrus ou grupo de vrus. tambm provvel que, ao longo dos tempos, tenham surgido vrus que no foram capazes de cumprir alguma dessas etapas. Tais agentes certamente no tiveram sucesso em sua histria natural e, conseqentemente, desapareceram.
Descamaes cutneas Tecidos
Secrees urogenitais, smen
Secrees oronasais
Urina, fezes
Sangue, linfa Colostro e leite
Fetos, fluidos e membranas fetais
Figura 10.2. Vias de excreo de vrus que infectam animais.
Epidemiologia das infeces vricas
265
Mucosa conjuntival Pele Mucosa urogenital Mucosa respiratria
Mucosa orofarngea Mucosa intestinal
Figura 10.3. Vias de penetrao de vrus que infectam animais.
2.1 Fontes de infeco

Dene-se como fonte de infeco qualquer animal vertebrado que esteja infectado e seja capaz de transmitir o agente para outros animais susceptveis. Excluem-se dessa denio os artrpodes, que, na maioria das infeces vricas animais, parecem desempenhar um papel predominantemente de transmisso e no de manuteno do agente. Dependendo do resultado das interaes agente-hospedeiro, que podem ou no resultar em manifestaes clnicas, as fontes de infeco (tambm chamados de hospedeiros) podem ser classicadas em doentes e portadores. Os doentes so os animais infectados que manifestam sinais clnicos de doena. Do ponto de vista estritamente epidemiolgico, essas fontes de infeco possuem uma importncia relativamente menor, pois so facilmente reconhecidas como tal, o que permite o diagnstico e a adoo das medidas de controle pertinentes. Alguns exemplos so os ces, com sinais clnicos de raiva, e os bovinos, com sinais caractersticos de febre aftosa. No obstante, em infeces vricas, nas quais o desenvolvimento de doena freqente, os animais doentes se constituem nas fontes de infeco mais comuns e epidemiologicamente importantes.
Os portadores so os animais que abrigam e excretam o agente sem estar manifestando alteraes clnicas indicativas de doena. Por isso no so facilmente reconhecveis, o que os torna muito importantes na epidemiologia de cada infeco. Os animais portadores podem ser tambm denominados de hospedeiros assintomticos. Dependendo da sua participao na disseminao viral, dois tipos de portadores podem ser reconhecidos: ativos e passivos. Os portadores ativos so aqueles que excretam o vrus; os portadores passivos apenas abrigam e replicam o agente sem excret-lo ou transmiti-lo. A grande maioria dos portadores de agentes virais enquadra-se na primeira categoria. Entretanto, ces adultos podem abrigar o vrus da cinomose (CDV) no sistema nervoso central (SNC) de forma persistente sem excret-lo. Aparentemente, bfalos infectados pelo vrus da febre aftosa (FMDV) tornam-se portadores aps a infeco aguda, mas parecem ser incapazes de transmiti-lo. Nesses casos, esses animais se constituem em portadores passivos. Dependendo do perodo em que excretam o agente, os portadores ativos podem ser classicados em permanentes ou temporrios. Os portadores ativos permanentes so aqueles que excretam o vrus continuamente. Alguns exemplos so os animais infectados por retrovrus e aqueles persis-
266
Captulo 10
tentemente infectados pelo vrus da diarria viral bovina (BVDV). Os portadores ativos temporrios excretam o agente sem manifestar sinais clnicos concomitantes por determinados perodos. Quando a excreo viral inicia-se no perodo de incubao ou na fase prodrmica e os animais ainda no apresentam sinais clnicos, eles so chamados de portadores em perodo de incubao e portadores prodrmicos, respectivamente. Exemplos incluem os bovinos infectados com vrus respiratrios, que podem iniciar a excretar o vrus de um a trs dias antes do incio dos sinais clnicos. Em outras infeces, os animais podem seguir excretando o vrus aps a resoluo da doena clnica, sendo, ento, denominados portadores em fase de convalescena. Sunos infectados pelo vrus da sndrome respiratria e reprodutiva (PRRSV) e ces infectados pelo adenovrus canino (CAV) enquadram-se nessa categoria, pois podem permanecer excretando o vrus por semanas ou at meses aps o trmino dos sinais clnicos. Nesses casos, a excreo viral pode ocorrer durante perodos em que o animal no exibe sinais clnicos, o que caracteriza a condio de portador. Portadores ativos temporrios intermitentes (ou espordicos) excretam o vrus apenas esporadicamente, por poucas horas ou dias, a intervalos variveis. So caractersticos das infeces latentes por alfaherpesvrus, cujas reativaes peridicas resultam em excreo viral transitria, geralmente desacompanhada de manifestaes clnicas. Animais portadores podem permanecer por longo tempo na populao excretando o vrus e contribuindo para a perpetuao do agente no rebanho. Vrias infeces vricas somente conseguem se manter na natureza graas existncia de portadores, nos quais o agente encontra condies de se multiplicar continuamente. O reconhecimento e isolamento e/ou eliminao desses portadores constituem-se nos pontos-chave do combate a essas infeces. Outro conceito importante em epidemiologia o de reservatrio. Denomina-se reservatrio a espcie animal que abriga e mantm agentes infecciosos em um ecossistema, podendo transmiti-los para outras espcies. Embora utilizada, na
maioria das vezes, para designar espcies silvestres, essa denominao pode tambm ser utilizada para designar animais domsticos que sirvam de fontes de infeco e, como tal, mantenham e transmitam agentes infecciosos. Geralmente, as principais espcies que servem de reservatrios de agentes virais na natureza so as espcies de origem desses agentes, tambm chamadas de hospedeiros ou reservatrios naturais. No entanto, mesmo espcies que no se constituam nos hospedeiros naturais de determinados vrus podem, ocasionalmente, servir de reservatrios. Deve ser enfatizado que algumas espcies que abrigam agentes virais na natureza e que se constituem, portanto, em reservatrios desenvolvem a enfermidade devido infeco. Nesse sentido, os agentes que conseguem infectar e se manter em espcies animais sem causar doena apresentam uma grande vantagem, pois possuem uma maior probabilidade de perpetuao e transmisso. Exemplos de espcies reservatrios so as aves aquticas e migratrias, para os vrus da inuenza A; pssaros e outras aves, para os alfavrus; roedores silvestres, para os arenavrus e hantavrus; morcegos de vrias espcies, para diversos vrus (Nipah, Hendra, vrus da raiva). Os morcegos hematfagos e carnvoros silvestres (raposas, ces silvestres, raccons) so reservatrios do vrus da raiva e podem transmitilo a vrias espcies silvestres e domsticas (Figura 10.4). Os pssaros e outras aves silvestres so reservatrios do vrus do Nilo Ocidental (WNV) e dos vrus das encefalites do leste (EEEV) e oeste (WEEV) e podem transmiti-los para eqinos, aves domsticas (faises, emas) e, ocasionalmente, para humanos (Figura 10.5). Sudeos silvestres (warthogs) so reservatrios do vrus da peste suna africana (ASFV) e podem transmiti-lo para sunos domsticos. Nesses exemplos, independentemente se as espcies mencionadas constituem-se nos hospedeiros naturais do agente e em alguns casos parecem s-lo , na prtica, desempenham o papel de reservatrios, pois abrigam e transmitem o agente para outras espcies de interesse. O termo reservatrio, portanto, teria uma denio mais funcional do que ecolgica.
267
Hospedeiros terminais
Hospedeiros terminais
Figura 10.4. Ciclo natural da raiva de herbvoros.
Ciclo natural
Hospedeiros acidentais
Figura 10.5. Ciclo natural dos vrus da encefalites eqina do leste (EEEV), oeste (WEEV) e vrus do Nilo Ocidental (WNV) e infeco de hospedeiros acidentais.
268
Captulo 10
Espcies domsticas que mantenham um agente e o transmitam a outras espcies tambm podem ser consideradas reservatrios. A raiva pode ser mantida na populao de ces urbanos e, ocasionalmente, ser transmitida para pessoas. Nesse caso, os ces seriam os reservatrios para a populao humana. Espcies domsticas tambm podem servir de reservatrios de agentes virais e transmiti-los a animais silvestres. Surtos com alta mortalidade de mamferos marinhos (focas, lees marinhos e cetceos) associados a um morbilivrus (provavelmente o vrus da cinomose CDV) foram relatados nos mares Mediterrneo e Cspio. O CDV, provavelmente transmitido por ces domsticos, tambm foi associado com doena e mortalidade de lees e hienas em uma reserva na Tanznia e com doena em mos-pelada (racoons) e gatos nos Estados Unidos (Figura 10.6). Na frica do Sul, a raiva mantida principalmente em ces domsticos urbanos ou rurais e, ocasionalmente, transmitida a carnvoros selvagens (chacais), nos quais pode se manter por algum tempo. O termo hospedeiro terminal (dead end host) utilizado para designar indivduos de uma espcie que so infectados esporadicamente (ou acidentalmente) por um agente, mas no possuem participao relevante no seu ciclo de transmisso
e manuteno na natureza. Por isso, obviamente, no podem se constituir em seus hospedeiros naturais. As razes pelas quais essas espcies no participam da cadeia de transmisso podem ser vrias, incluindo o desenvolvimento de enfermidade rpida e fatal (no haveria tempo para uma excreo e transmisso signicativa), a produo de nveis baixos de viremia (insucientes para assegurar a transmisso) e incapacidade de transmitir o agente (pela razo anterior ou pela natureza da transmisso). O termo terminal se refere ao nal da cadeia de transmisso e no necessariamente ao curso da enfermidade. Os bovinos, gatos e ces podem ser ocasionalmente infectados pelo vrus da doena de Aujeszky (PRV), mas no possuem papel importante na transmisso, devido ao curso rpido e fatal da doena. Situao semelhante ocorre com a raiva nessas espcies e tambm em humanos. Mesmo na hiptese de a raiva bovina no possuir curso rpido e fatal, dicilmente seria transmitida por essas espcies, devido forma de transmisso (bovinos no possuem o hbito de morder outros animais). Os humanos, eqinos e outras espcies domsticas so freqentemente infectados pelo WNV, EEEV e WEEV, mas no possuem papel importante na transmisso. Nesses casos, os nveis e durao da viremia so geralmente incompatveis com a
Ciclo natural
Figura 10.6. Ciclo natural do vrus da cinomose e transmisso acidental para espcies de vida livre.
269
transmisso por mosquitos. Em alguns desses casos, a infeco tambm rpida e fatal, o que diculta a transmisso do agente a partir do animal infectado. Casos de transmisso do WNV entre pessoas, por transfuso sangnea, via placenta e pela amamentao j foram relatados, mas representam excees e possuem importncia epidemiolgica restrita. Pessoas infectadas pelos hantavrus tambm no participam ativamente na transmisso do agente. Acredita-se que as espcies em que um determinado vrus cause doena severa e mortalidade considervel no se constituam em seus hospedeiros naturais, e sim acidentais. A tendncia que os vrus no causem doena severa em seus hospedeiros naturais devido a um processo evolutivo que, eventualmente, tenha resultado em um equilbrio na interao
agente-hospedeiro, ou seja, o desenvolvimento de doena severa nos hospedeiros desfavoreceria a manuteno desses agentes na natureza.
2.2 Vias de excreo

Para que ocorra a transmisso entre indivduos, o vrus deve ser inicialmente excretado do hospedeiro infectado pela via adequada em quantidade suciente. As vias pela qual o agente excretado do organismo animal so denominadas vias de excreo (vias de eliminao) ou portas de sada. A via de excreo de um vrus determinada primariamente pelo seu tropismo, ou seja, pelo tecido ou rgo-alvo onde ocorre a sua replicao. Por exemplo, os vrus que replicam na mucosa das vias respiratrias so excretados pe-
Tabela 10.1. Vias de excreo dos principais vrus de animais
Vias de excreo
Tipos de vrus/infeco
vrus respiratrios
Exemplos
vrus da influenza, parainfluenza, rinovrus, herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) CDV, vrus da febre aftosa (FMDV), vrus da raiva enterovrus, coronavrus, parvovrus canino (CPV) vrus das hepatites arenavrus, hantavrus
Secrees oronasais e expectoraes
vrus que replicam na cavidade oral e anexos vrus entricos
Fezes vrus hepticos vrus que replicam nos epitlios dos tbulos renais Urina vrus que replicam no epitlio vesical outros vrus sistmicos vrus que replicam nas gnadas Smen e/ou secrees genitais vrus que replicam no trato genital externo vrus sistmicos vrus que infectam o feto vrus sistmicos vrus sistmicos ou vrus que produzem viremia permanente ou transitria vrus que replicam em camadas superficiais da pele ou na transio pele-mucosa retrovrus, BVDV, flavivrus, vrus da lngua azul (BTV), etc. PRRSV PRRSV, BoHV-1, vrus do exantema coital eqino (EHV-3) vrus da leucose bovina (BLV), outros retrovrus BVDV, BoHV-1, parvovrus suno (PPV), PRRSV
CDV
Fetos/membranas e fluidos fetais
Sangue e linfa
Pele, descamaes e exsudaes cutneas
poxvrus, vrus do ectima contagioso, papilomavrus, FMDV, BoHV-2
270
Captulo 10
las secrees oro-nasais e expectoraes; os vrus que replicam no fgado e no trato intestinal so excretados pelas fezes. As principais vias de excreo de agentes virais esto ilustradas na Figura 10.2, e os agentes que as utilizam esto apresentados na Tabela 10.1. A grande maioria dos vrus pode ser excretada por mais de uma via, embora geralmente uma delas apresente maior importncia em determinadas situaes. A via de excreo tambm determina a forma de transmisso. Os vrus que so excretados no smen sero transmitidos pela cpula ou pela inseminao articial; os vrus que so excretados nas fezes provavelmente sero transmitidos pela via fecal-oral, pela contaminao de gua e alimentos. Os vrus presentes no sangue e/ou na linfa provavelmente sero transmitidos por vetores ou por procedimentos iatrognicos (agulhas e material cirrgico contaminado).
2.3 Mecanismos de transmisso

A transferncia ou transmisso do agente entre indivduos representa o ponto-chave na cadeia do processo infeccioso. O agente excretado deve ser capaz de resistir no meio ambiente o tempo necessrio para encontrar e penetrar
em outro hospedeiro susceptvel. No entanto, ao contrrio de outros microorganismos que conseguem sobreviver no meio ambiente por longos perodos, a viabilidade da maioria dos vrus fora do organismo do hospedeiro muito limitada. Por isso, certamente, grande parte das partculas virais produzidas pelas infeces virais inativada no meio ambiente antes de ter conseguido alcancar um novo hospedeiro. As principais formas de transmisso dos agentes virais esto apresentadas na Figura 10.7 e Tabela 10.2. Em termos gerais, a transmisso dos vrus entre indivduos pode ser horizontal ou vertical. Transmisso horizontal se refere transmisso entre indivduos de uma mesma gerao, pela coabitao de um mesmo habitat. Transmisso vertical refere-se transmisso do agente de um hospedeiro para os seus descendentes. A transmisso horizontal pode ser direta ou indireta. A transmisso horizontal direta pode ocorrer por contato direto ou indireto. A transmisso indireta pode ocorrer com a participao de veculos, por vetores ou pelo ar. A transmisso direta por contato direto ocorre pelo contato fsico entre o hospedeiro infectado e o novo hospedeiro. O contato entre mucosas, entre pele e mucosa ou entre pele e pele permite ao agente passar diretamente ao animal susceptvel
Contato direto Direta Contato indireto Veculos Horizontal Indireta Vetores Mecnicos Area Transmisso Biolgicos
Transovariana Transplacentria Vertical Perinatal Colostro/leite
Figura 10.7. Formas de transmisso dos vrus de animais.
271
e pode ocorrer por mordedura (transmisso do vrus da raiva, arenavrus entre roedores), lambedura (vrus entricos), contato focinho-focinho (viroses respiratrias, FMDV, CDV), focinhogenitlia (herpesvrus bovino tipo 1 [BoHV-1],
BVDV), focinho-pele (vrus da mamilite herptica [BoHV-2]), contato pele-pele (poxvrus, papilomavrus) e pela cpula (BoHV-1, vrus do exantema coital dos eqinos [EHV-3], PRRSV). Nessas formas de transmisso, o agente trans-
Tabela 10.2. Principais mecanismos de transmisso dos vrus de animais
Famlia
Mecanismo de transmisso
Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria), transplacentria (vrus da panleucopenia felina, parvovrus suno). Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto e indireto (cutnea, leses de pele). Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto ou indireto (cutnea [orf, cowpox], respiratria [sheep pox]), vetores artrpodes (vrus do mixoma). Contato direto ou indireto (sexual [exantema coital eqino [EHV-3], balanopostite e vulvovaginite pelo BoHV-1], respiratria (BoHV-1), transplacentria (PRV, BoHV-1). Contato direto ou indireto (respiratria), indireto por vetores (carrapatos), oral (alimento contaminado). Contato direto ou indireto (fecal-oral [enterovrus, FMDV], respiratria [rinovirus, FMDV]), transmisso indireta por veculos (alimentos contaminados, fmites [FMDV]). Contato direto ou indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto ou indireto (respiratria, sexual), indireto (fmites, smen contaminado [PRRSV, EAV]). Indireta por vetores. Indireta por vetores (WNV), contato direto e indireto (fecaloral, respiratria [BVDV, vrus da peste suna clssica [CSFV]), transplacentria (BVDV). Contato direto ou indireto (fecal-oral, respiratria) Contato direto ou indireto (urina contaminada, mordeduras, respiratria) Indireta por vetores (vrus da febre do Vale Rift) Contato direto ou indireto (respiratria) Contato direto (mordedura [vrus da raiva]), direto ou indireto (vrus da estomatite vesicular [VSV]), indireta por vetores (VSV). Contato direto ou indireto (respiratria). Contato direto ou indireto (fecal-oral [rotavrus, vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos [TGEV]), indireta por vetores (BTV). Contato direto ou indireto, vertical (in ovo [leucose aviria] ou transplacentria [BLV]), ingesto, indireta por vetores (EIAV).
Parvoviridae
Circoviridae Papillomaviridae Adenoviridae Poxviridae
Herpesviridae
Asfarviridae Picornaviridae
Caliciviridae Arteriviridae Togaviridae
Flaviviridae
Coronaviridae Arenaviridae Bunyaviridae Orthomyxoviridae
Rhabdoviridae Paramyxoviridae Reoviridae
Retroviridae
272
Captulo 10
ferido imediatamente a outro hospedeiro, assim, a sua capacidade de resistncia no meio ambiente pouco relevante para o sucesso da transmisso. Na transmisso direta por contato indireto no ocorre contato fsico entre o corpo do animal infectado e o novo hospedeiro. Nesses casos, ocorre o contato imediato entre o material contaminado recm-excretado (secrees, excrees, lquido ou membranas fetais) e uma superfcie mucosa (focinho, mucosa nasal, oral e genitlia) ou pele do novo hospedeiro. A diferena entre essa forma de transmisso e a transmisso indireta por veculos, descrita a seguir, muito tnue e de difcil percepo em alguns casos. A transmisso indireta envolve a transmisso do agente por meio de objetos inanimados (denominados veculos ou fmites) ou por vetores invertebrados (insetos). Veculos ou fmites, freqentemente envolvidos na transmisso de vrus animais, incluem agulhas hipodrmicas, material cirrgico, luvas de palpao retal, espculos, formigas, focinheira, tatuadores, aplicadores de brinco, roupas e utenslios, instalaes, equipamentos (ordenhadeiras), cochos, solo e outros. A gua, leite, smen, subprodutos crneos e outros alimentos contaminados com o agente tambm podem servir de veculos para a transmisso de agentes virais. No caso de transmisso por veculos, o sucesso da transmisso depende da capacidade de o agente preservar a sua viabilidade no meio ambiente o tempo suciente para alcancar o novo hospedeiro. A transmisso de vrus por luvas de palpao, espculos contaminados ou equipamento de inseminao articial tambm pode ocorrer (vrus da leucose bovina [BLV], BVDV, PRRSV). Viroses respiratrias (BoHV-1, BVDV, vrus respiratrio sincicial bovino [BRSV], vrus da parainuenza tipo 3 [bPI3v]) ou cutneas (FMDV, poxvrus, BoHV-2) podem ser transmitidas pelo contato de mucosas com cochos contaminados; viroses entricas e hepticas podem ser transmitidas pela via oro-fecal atravs da contaminao de cochos, gua e alimentos. O smen utilizado em inseminao articial pode servir de veculo para vrios vrus (BoHV-1, PRRSV, vrus da lngua azul [BTV], BVDV, PRV). O sangue contaminado, utilizado em transfuses e/ou outros
procedimentos, pode transmitir agentes como o VLB, vrus da leucemia felina (FeLV) e vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), entre outros. A possibilidade de transmisso por veculos maior para os vrus que possuem grande capacidade de resistncia no meio ambiente. O FMDV um exemplo de agente que possui grande capacidade de disseminao por meio de veculos (sapatos, roupas, utenslios, alimentos etc.). A transmisso por aerossis a curtas distncias pode ocorrer para os vrus que replicam na cavidade oronasal e anexos (vrus da inuenza, vrus da bronquite infecciosa das aves [IBV], vrus da laringotraquete infecciosa [ILTV], BoHV-1, CDV, vrus da Doena de Newcastle [NDV]). O termo iatrognico se refere transmisso de agentes por procedimentos mdicos e/ou relacionados com a sade animal. Os retrovrus animais (BLV, EIAV, vrus da imunodecincia felina [FIV]), alm de outros vrus que produzem viremia (BVDV, BTV) podem ser transmitidos por agulhas, material cirrgico ou outros equipamentos contaminados (p. ex.: tatuadores, aplicadores de brinco). Vrios vrus sistmicos podem ser transmitidos por transfuso de sangue ou derivados e tambm por transplante de rgos. Vrios vrus animais so transmitidos pela picada de artrpodes (insetos), denominados genericamente vetores. Dependendo de sua participao na transmisso, os vetores artrpodes podem ser classicados em vetores biolgicos e mecnicos. Na maioria dos casos, os insetos possuem um papel mais amplo do que simplesmente transferir o agente entre hospedeiros, ou seja, so susceptveis replicao e amplicao do vrus em seus tecidos, eventos que ocorrem aps a sua contaminao e que so necessrios para que ocorra a subseqente transmisso a outro hospedeiro. Por isso so chamados de vetores biolgicos. Exemplos de vrus transmitidos primariamente por mosquitos so os vrus das encefalites eqinas (EEEV, WEEV e vrus da encefalite venezuelana [VEEV]), o WNV, o vrus da dengue e febre amarela (YFV), alm de vrios buniavrus. Os culicides transmitem o BTV, carrapatos transmitem o ASFV, entre outros. Os vrus transmitidos primariamente por insetos so chamados genericamente de arbovrus (arthropod-borne viruses).
273
Alm dos arbovrus, outros agentes virais podem ocasionalmente ser transmitidos por essa via. Nesses casos, a transmisso por insetos apenas uma das formas de transmisso geralmente no a principal e, por isso, possui importncia epidemiolgica limitada (p. ex.: BLV). Alguns vrus podem ser transmitidos por insetos, de forma mecnica, pela simples contaminao de partes de seu corpo (probscide, asas) (p. ex.: vrus da mixomatose, poxvrus, BLV, BoHV-2). Por outro lado, os tabandeos e as moscas do estbulo transmitem mecanicamente o EIAV, e esta a principal forma de transmisso do vrus. Transmisso mecnica por alguns insetos tambm pode ocorrer no ciclo natural do VEEV. Nesta infeco, no entanto, os insetos desempenham preponderantemente o papel de vetores biolgicos. No caso de transmisso mecnica, os vetores no so susceptveis replicao do agente, desempenhando apenas um papel mecnico na transferncia do agente entre hospedeiros. Por isso so denominados vetores mecnicos. Pela analogia de funo, os vetores mecnicos so ocasionalmente referidos como agulhas voadoras. A transmisso area pelo transporte de gotculas e/ou partculas contaminadas a longas distncias tem sido demonstrada em algumas viroses. Gotculas em aerossis (ou partculas dessecadas) podem ser resultado de espirro e/ou tosse em viroses respiratrias (inuenza) ou de aerossolizao/dessecao de urina (hantavrus) ou fezes (enterovrus). Essa forma de transmisso somente possvel para os agentes que apresentam grande resistncia no meio ambiente. J foi demonstrado que o FMDV pode se disseminar por vrios quilmetros, dependendo das condices de umidade do ar e ventos. No entanto, sabe-se que a maioria dos vrus, principalmente os respiratrios, s se dissemina pelo ar a pequenas distncias. A infeco por hantavrus em humanos ocorre freqentemente pela inalao e/ou deposio conjuntival de partculas de poeira oriundas de solo contaminado pela urina de roedores portadores. Os poxvrus, por causa de sua grande resistncia ambiental, tambm podem ser transmitidos por via area. A transmisso vertical de um vrus pode ocorrer de vrias formas (Figura 10.7). Certos retrov-
rus avirios e murinos so capazes de integrar o seu genoma no cromossomos dos gametas (vrus da leucose aviria [ALV], retrovrus murinos). Esse tipo de transmisso denominada transovariana. Essa forma de transmisso tambm ocorre com alguns vrus nos vetores artrpodes (p. ex.: a fmea do mosquito Aedes aegypty transmite o vrus da dengue aos ovos e larvas; esse tipo de transmisso tambm ocorre com o ASFV em carrapatos). Outros vrus so transmitidos atravs da placenta (transmisso transplacentria), resultando em infeco fetal com conseqncias diversas (BVDV, BLV, PRRSV, parvovrus suno [PPV], entre outros). A transmisso que ocorre nas proximidades e/ou durante o parto denominada de perinatal (herpesvrus canino [CHV], PRV, FIV). A transmisso pelo colostro e/ou leite contaminado (vrus da artrite-encefalite caprina [CAEV], maedi-visna, VLB) tambm considerada uma forma de transmisso vertical se envolver me e lho. A maioria dos vrus pode ser transmitida por mais de uma forma, embora geralmente uma delas desempenhe um papel epidemiolgico mais importante em cada situao.
2.4 Vias de penetrao

Aps ser excretado e transportado (se for o caso), o vrus deve penetrar no novo hospedeiro pela via adequada para que possa estabelecer a infeco. Os stios por onde os vrus penetram no hospedeiro so denominados vias de penetrao (ou portas de entrada) (Figura 10.3). A via de penetrao de um agente determinada primariamente pelo mecanismo de transmisso. Assim, os vrus transmitidos por gua e alimentos contaminados provavelmente iro penetrar pela via oral; os vrus transmitidos por vetores artrpodes iro penetrar atravs de orifcios (picadas) na pele; os vrus transmitidos pelo smen iro penetrar na mucosa genital feminina. A maioria dos vrus pode utilizar mais de uma via de penetrao, dependendo da via de excreo e do mecanismo de transmisso; poucos vrus utilizam uma nica via de penetrao. As principais vias de penetrao de agentes virais nos seus hospedeiros so:
274
Captulo 10
mucosa respiratria: vrus respiratrios (vrus da inuenza, rinovrus, BoHV-1, NDV); mucosa conjuntival: adenovrus, hantavrus, alguns herpesvrus; mucosa orofarngea: CDV, FMDV, vrus sistmicos; mucosa intestinal: enterovrus, coronavrus, rotavrus; pele: BoHV-2, poxvrus, papilomavrus, arbovrus (pela picada de insetos); mucosa genital: BoHV-1, PRRSV, EHV-3, alm de agentes virais veiculados pelo smen.
2.5 O novo hospedeiro

A simples penetrao do agente no organismo de um animal no assegura o desenvolvimento da infeco. Para que isso ocorra, o hospedeiro deve ser susceptvel ao agente. O termo susceptibilidade refere-se ao conjunto de condies apresentadas pelo hospedeiro para permitir a multiplicao do vrus. O termo resistncia refere-se ao conjunto de barreiras que o organismo oferece para impedir ou limitar a infeco. A susceptibilidade e resistncia so caractersticas individuais e podem variar com vrios fatores, tais como: espcie, raca, sexo, idade, exposio prvia ao agente, estado nutricional e siolgico, entre outros. O termo refratariedade, por outro lado, refere-se a um grau absoluto de resistncia, que caracterstico da espcie animal. Por exemplo, a espcie canina naturalmente refratria ao vrus da imunodecincia humana (HIV); assim como os eqinos so refratrios ao FMDV. Os fatores que determinam a susceptibilidade (e resistncia) de uma espcie animal a um determinado vrus so mltiplos e, em muitos casos, no so completamente conhecidos. Nesse sentido, deve-se fazer uma distino entre susceptibilidade natural e susceptibilidade experimental. Algumas espcies no so naturalmente infectadas por um determinado agente, mas podem ser infectadas experimentalmente. Como exemplo, citam-se: a) os coelhos, que no so infectados naturalmente pelo BoHV-1 e BoHV-5, mas podem ser infectados experimentalmente, desenvolvendo a enfermidade; b) animais de laboratrio (cobaias, coelhos, camundongos e ratos), que podem ser
infectados experimentalmente por uma variedade de vrus humanos e animais, embora a infeco natural por esses agentes nessas espcies no tenha sido descrita. Essa caracterstica tem sido explorada para estudos de patogenia e outros aspectos da biologia desses agentes. provvel que a resistncia infeco natural (ou a ausncia de casos de infeco natural) de algumas dessas espcies deva-se falta de oportunidade de infeco mais do que resistncia propriamente dita, ou seja, possvel que algumas dessas espcies poderiam ser infectadas tambm in vivo, desde que providas as condies necessrias para tal (p. ex.: contato apropriado com animais que estejam excretando o vrus e penetrao do agente pela via adequada).
2.5.1 Patogenia e resposta imunolgica

Aps a penetrao no hospedeiro susceptvel, o vrus deve replicar prximo ao local de entrada (geralmente nas clulas epiteliais e/ou no tecido linforreticular adjacente) para produzir prognie suciente para ultrapassar as defesas do hospedeiro. Dependendo das interaes entre o agente e o hospedeiro, a infeco pode ou no resultar em manifestaes clnicas. Os mecanismos pelos quais os agentes infecciosos produzem doena em seus hospedeiros so considerados sob a denominao de patogenia ou patognese (pato = doena, genesis = origem, formao). O conjunto de respostas do hospedeiro infeco vrica (resistncia natural e adquirida) denominado genericamente de resposta imunolgica. Os mecanismos gerais da patogenia e da resposta imunolgica s infeces vricas foram tratados de forma geral nos Captulos 8 e 9, respectivamente, e, especicamente, nos captulos de cada famlia. Abaixo so relacionados alguns termos relacionados com a patogenia. O perodo de incubao de uma infeco o intervalo de tempo entre a penetrao do agente e o incio dos sinais clnicos. A sua durao varia de acordo com fatores do vrus (espcie, cepa, dose, virulncia etc.) e do hospedeiro (espcie animal, condio nutricional e imunolgica, via de inoculao etc.) e pode variar entre poucos dias (febre aftosa, inuenza), meses, at anos (leucose bovi-
275
na). Quando a infeco for subclnica, o perodo de incubao pode ser innito. O periodo pr-patente o intervalo de tempo entre a penetrao do agente e o incio da excreo viral pelo hospedeiro. Depende principalmente da durao do ciclo replicativo do vrus e pode ser de horas, poucos dias (vrus respiratrios, FMDV) at semanas ou meses (alguns gamaherpesvrus). O perodo patente, tambm chamado de perodo de transmissibilidade ou comunicabilidade a fase da infeco em que o agente excretado e, portanto, pode ser transmitido. Em infeces agudas clnicas, a durao da excreo do vrus coincide razoavelmente com o perodo clnico, podendo iniciar horas ou poucos dias antes e estender-se por algumas horas ou alguns dias
aps. Em infeces persistentes por retrovrus, o agente pode ser excretado por um longo perodo (at anos) antes do aparecimento de sinais clnicos. Em outras infeces (PRRSV, ILTV, vrus da arterite eqina [EVAV], CAV, alguns coronavrus), os hospedeiros podem continuar excretando o vrus por longo perodos aps o trmino das manifestaes clnicas (Figura 10.8).
3 Mecanismos de manuteno dos vrus na natureza

A sobrevivncia dos vrus na natureza depende da sua capacidade de cumprir seqencialmente as etapas da cadeia do processo infeccioso. A incapacidade da maioria dos vrus de resistir
Infeco aguda
Infeco latente
Infeco persistente
Infeco persistente temporria
Replicao viral Manifestaes clnicas
Fonte: adaptado de Flint et al. (2000).
Figura 10.8. Padres de ocorrncia das infeces e perodo de transmissibilidade em diferentes tipos de infeces virais.
276
Captulo 10
por longo tempo no meio ambiente os obriga a utilizar diferentes estratgias para prolongar e perpetuar a sua existncia. Infeces persistentes ou latentes, longos perodos de replicao e excreo, longos perodos de incubao, infeco de vrias espcies animais e/ou de insetos, e transmisso aos descendentes (transmisso vertical) esto entre as estratgias utilizadas pelos vrus para se perpetuar na natureza. No obstante, as partculas vricas de diversos vrus so relativamente estveis, podendo persistir viveis por perodos considerveis no meio ambiente. Muitos vrus utilizam uma combinao de mais de uma dessas estratgias para conseguir se perpetuar na populao. Outros vrus no utilizam nenhuma dessas estratgias e s conseguem se manter na natureza por meio de infeces agudas sucessivas.
3.1 Infeces persistentes

As infeces persistentes, acompanhadas ou no de manifestaes clnicas, constituem-se em importantes meios de manuteno de vrios agentes virais na natureza. Durante o perodo de infeco que pode durar toda a vida do animal o vrus ca disponvel no organismo do animal e pode ser excretado de forma contnua ou intermitente, podendo infectar outros animais e, assim, alimentar a cadeia do processo infeccioso (Figuras 10.8 e 10.9). Alguns vrus so excretados
ou cam disponveis no organismo para serem transmitidos continuamente a partir do nal do perodo pr-patente. Exemplos so as infeces pelos retrovrus animais, pelo BTV, papilomavrus (persistem nas leses) e calicivrus felino (FeCV). Bezerros infectados intra-uterinamente pelo BVDV podem nascer portadores e excretar o vrus por toda a vida. Outros vrus podem ser excretados por longos perodos aps a infeco aguda (PRRSV, EVAV, CAV, alguns coronavrus). Por outro lado, alguns tipos de persistncia apresentam um papel pouco relevante do ponto de vista epidemiolgico, pois o vrus no excretado. Por exemplo, a infeco persistente pelo CDV no SNC de ces adultos geralmente no acompanhada de excreo viral. Da mesma forma, alguns bovinos previamente imunizados contra o FMDV e posteriormente infectados, assim como bubalinos infectados pelo FMDV, podem car portadores do vrus aps a infeco primria, embora a sua capacidade de transmitir o agente para outros hospedeiros ainda seja questionvel.
3.2 Infeces latentes

Animais infectados pelos alfaherpesvrus (BoHV-1, BoHV-5, PRV, EHV-1), entre outros, excretam o agente por alguns dias durante a infeco aguda, mas a replicao viral eventualmente cessa devido resposta imunolgica
Excreo viral
Infeco aguda
Dias
Infeco persistente
Meses, anos
Figura 10.9. Infeces persistentes de vrus de animais: vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV).
277
Reativao da infeco Situaes de estresse etc.
Excreo viral
Infeco aguda
Infeco latente
Estabelecimento da latncia
Figura 10.10. Infeces latentes de vrus animais: vrus da doena de Aujeszky (PRV).
do hospedeiro. Esses animais, no entanto, cam portadores do agente na forma latente para o resto da vida. A infeco latente se caracteriza pela presena do genoma viral inativo, principalmente em neurnios de gnglios nervosos, sem a expresso de protenas e/ou produo de partculas virais. Esporadicamente, a infeco latente pode ser reativada por situaes de estresse, resultando em replicao e excreo viral (Figura10.10). O vrus excretado durante os eventos de reativao pode, ento, ser transmitido a outros animais. Os episdios de reativao e excreo podem se repetir peridica e indenidamente durante a vida do animal, proporcionando inmeras ocasies para a transmisso do agente. Assim, as infeces latentes e suas reativaes peridicas se constituem em meios ecientes de perpetuao e disseminao desses vrus na natureza e representam o principal obstculo para o estabelecimento de medidas de combate contra essas infeces. Por isso, a capacidade de estabelecer infeces latentes possui um papel central e fundamental na epidemiologia das infeces pelos alfaherpesvrus.
3.3 Infeco de vrias espcies animais

Ao contrrio de alguns vrus que possuem um espectro de hospedeiros restrito (infectam uma nica espcie animal), vrios outros agentes virais podem infectar mais de uma espcie, o
que representa uma vantagem em sua estratgia de sobrevivncia. Alguns exemplos clssicos so a maioria dos alfavrus (Togaviridae), alguns rabdovrus (vrus da estomatite vesicular, VSV) e avivrus, que podem infectar uma variedade de espcies de aves e mamferos (Figura 10.11). O vrus da inuenza A, por meio de mutaes/adaptaes, tambm pode infectar vrias espcies de aves domsticas e silvestres, alm de mamferos (Figura 10.12); o VSV pode infectar vrias espcies de mamferos. O WNV capaz de infectar naturalmente mais de 180 espcies de vertebrados, incluindo pssaros e outras aves silvestres e domsticas (mais de 150 espcies) e mamferos. A infeco alternada dessas espcies pode favorecer a permanncia do agente no ecossistema. Alm dos vrus que usualmente infectam mais de um hospedeiro como parte de seu ciclo natural, outros podem, ocasional ou acidentalmente, infectar outras espcies. Nesses casos, o hospedeiro acidental no participa da cadeia de transmisso do agente. A transmisso de vrus entre os reservatrios silvestres e destes para a espcie hospedeira principal pode ocorrer por vrios mecanismos e, freqentemente, envolve a participao de vetores artrpodes. Em geral, considera-se que quanto maior o espectro de hospedeiros susceptveis, mais favorecida ser a sobrevivncia do agente na natureza. No entanto, isso no impede que vrus que infectem naturalmente apenas uma espcie e os exemplos so numerosos consi-
278
Captulo 10
Ciclo natural
Figura 10.11. Ciclo natural dos alfavrus e WNV em animais silvestres e infeco acidental de humanos e espcies domsticas.
Fonte: adaptado de Webster et al. (2006).
Figura 10.12. Evoluo do vrus da influenza A H5N1 por meio de infeces em vrias espcies.
279
gam se manter indenidamente nas respectivas populaes.
3.4 Infeco de vetores

A infeco de vetores artrpodes (mosquitos, carrapatos) uma importante forma de transmisso de alguns vrus, denominados genericamente arbovrus. Aps a ingesto de sangue do hospedeiro infectado, o vrus replica no intestino e/ou nas glndulas salivares do inseto, podendo ser transmitido aps um perodo de incubao de alguns dias (chamado de perodo extrnseco de incubao). A transmisso consumada pela picada e inoculao de saliva contaminada em outro hospedeiro. Embora os insetos hematfagos tenham preferncia por determinada espcie para se alimentar, podem ocasionalmente transmitir o agente a animais de outra espcie. De fato, a transmisso por vetores hematfagos oferece uma oportunidade mpar para a transmisso interespcie de vrios vrus. Mosquitos podem transmitir o WNV e os alfavrus das encefalites eqinas entre aves, de aves para mamferos (eqinos, mamferos silvestres) e de aves para humanos. Os vrus da WNV e VEEV j foram identicados em mais de uma dezena de espcies de mosquitos, embora se acredite que, em cada ecossistema, apenas uma ou poucas espcies desses insetos tenham papel preponderante na transmisso desses agentes. O vrus da febre amarela pode ser transmitido pela picada de mosquitos entre primatas, entre primatas e o homem e entre pessoas. O ASFV transmitido por carrapatos entre sudeos silvestres e entre estes e sunos domsticos. Em geral, acredita-se que a manuteno dos arbovrus na natureza depende da transmisso peridica a um hospedeiro vertebrado, ou seja, a infeco seria mantida pela replicao seqencial e alternada em hospedeiros vertebrados e invertebrados (os vetores). A manuteno dos arbovrus em pocas de pouca ou nenhuma atividade dos vetores, devido a temperaturas baixas, pode ser explicada em parte pela transmisso transovariana do agente e tambm pela infeco ocasional de hospedeiros vertebrados com hbitos de hibernao. Embora a capacidade de manuteno de vrus por longos perodos exclusivamente
nos hospedeiros invertebrados seja questionvel, considera-se que esta seja uma das formas possveis de sobrevivncia desses microorganismos na natureza. Para o VEEV e WNV, j foi demonstrada a sobrevivncia do vrus em larvas de mosquitos ao longo de perodos prolongados (meses) de clima frio.
3.5 Sobrevivncia no ambiente

Os vrus necessitam clulas vivas para se multiplicar e a maioria deles no capaz de resistir por muito tempo no meio ambiente. A sua resistncia no ambiente depende da estabilidade fsica da partcula viral e das condices ambientais (temperatura, umidade, radiao solar). Os vrus sem envelope geralmente so capazes de resistir por mais tempo fora do hospedeiro (parvovrus, FMDV, enterovrus, adenovrus), embora alguns vrus envelopados (poxvrus, mixomavrus) tambm possam resistir por perodos considerveis. J foi demonstrado que o parvovrus canino (CPV) pode permanecer vivel no ambiente, desde que protegido por material orgnico, por perodos de at seis meses. O parvovrus suno (PPV) tambm pode resistir durante dias ou semanas em fezes e/ou em membranas e restos fetais. O parapoxvrus, agente do ectima contagioso de ovinos, pode permanecer vivel durante meses nas crostas que se desprendem das leses labiais dos animais afetados. O circovrus suno (PCV) tambm pode permanecer vivel por dias ou at semanas no ambiente. A contaminao de gua, alimentos, solo, pastagens e mesmo de insetos pode servir de meio para transmisso desses agentes. Os vrus com envelope especialmente aqueles que causam infeces respiratrias so geralmente mais instveis e, por isso, so mais rapidamente inativados por fatores sicos e/ou qumicos ambientais. Os poxvrus esto entre os vrus envelopados com maior resistncia ambiental. Embora possam resistir no ambiente por perodos considerveis e, assim, ser transmitidos de forma indireta, esses vrus so freqentemente transmitidos por contato direto ou indireto (Figura 10.13), ou seja, a transmisso indireta aps um perodo de sobrevivncia no ambiente representa uma estratgia adicional para assegurar a sua transmisso ao novo hospedeiro e perpetuao na populao.
280
Captulo 10
Ambientes, solo, instalaes etc.
Meses
Figura 10.13. Sobrevivncia ambiental dos vrus animais: parvovrus canino (CPV).
3.6 Transmisso vertical

A transmisso ao feto e/ou ao recm-nascido constitui-se em um importante mecanismo de prolongamento da existncia de vrios vrus
animais. Os retrovrus, arenavrus, alguns herpesvrus, parvovrus e alguns togavrus so freqentemente transmitidos aos fetos/neonatos. Em alguns desses vrus (retrovrus e arenavrus), os fetos ou recm-nascidos infectados tornam-se portadores e servem de fontes contnuas e permanentes de infeco. Uma forma especial de perpetuao por esse mecanismo descrita para o BVDV, um pestivrus (famlia Flaviviridae) de ruminantes (Figura 10.14). A infeco de fetos bovinos entre os 40 e 120 dias de gestao freqentemente resulta na produo e nascimento de bezerros imunotolerantes, persistentemente infectados (PI). Os bezerros PI podem ser clinicamente saudveis (embora freqentemente apresentem crescimento retardado e susceptibilidade aumentada a outras doenas) e excretam o vrus em secrees e excrees em grandes quantidades durante toda a vida. Os animais PI representam o principal meio de perpetuao do BVDV na natureza, servindo de fonte de vrus para as infeces agudas e outras infeces fetais persistentes. As infeces fetais que resultam em morte fetal e abortamento possuem um menor impacto epidemiolgico, ainda assim os restos fetais (feto, uidos, membranas) ou objetos inanimados con-
Bezerro saudvel, soropositivo, no-infectado.
aborto; mumificao; natimorto.
Infeco fetal
Anos Excreo viral Bezerro persistentemente infectado
Figura 10.14. Transmisso vertical e infeco persistente pelo vrus da diarria bovina (BVDV).
281
taminados podem servir de veculos para a transmisso do agente e facilitar a sua diseminao.
3.7 Ciclos contnuos de transmisso

As estratgias mencionadas acima so caractersticas de famlias ou de grupos de vrus e representam vantagens evolutivas que favorecem a perpetuao desses agentes na natureza. No entanto, alguns vrus que no utilizam essas estratgias tambm so capazes de se manter indenidamente nas populaes. Como no so capazes de persistir por longos perodos no hospedeiro (infeco latente ou persistente) ou de infectar vetores ou outras espcies animais, e no resistem por muito tempo no ambiente, a sobrevivncia desses vrus depende da infeco seqencial, imediata e contnua de novos hospedeiros de uma nica espcie (Figura 10.15). Isso requer condies epidemiolgicas especcas, que incluem a presena constante de um percentual alto de hospededeiros susceptveis e condies de convivncia que favoream o contato freqente e, assim, a sua transmisso entre indivduos.
Os vrus que causam infeces agudas so geralmente excretados por secrees oronasais (vrus respiratrios) ou pelas fezes (vrus entricos) em altos ttulos durante um curto espao de tempo. Essas caractersticas, aliadas com a disponibilidade de hospedeiros susceptveis e facilidade de contato, permitem a transmisso contnua e o prosseguimento da cadeia infecciosa. Exemplos de vrus que se mantm dessa forma so: o CDV, os vrus respiratrios (bPI3v, NDV, BRSV), corona e rotavrus bovino, vrus da inuenza (transmisso dentro da espcie). No obstante, vrios vrus que so capazes de utilizar as outras estratgias tambm podem ser mantidos por perodos longos por meio de ciclos contnuos de transmisso.
4 Doenas em populaes
4.1 Denio de populao
Em epidemiologia, dene-se populao como o grupo de indivduos no qual se est estudando aspectos relacionados sade e doena. A partir desse conceito, pode-se derivar duas de-
Figura 10.15. Ciclos contnuos de transmisso do vrus da cinomose (CDV).
282
Captulo 10
nies, dependendo da delimitao geogrca e do nmero de indivduos. Populao local um grupo de indivduos que habita uma determinada rea, sujeito s mesmas condies e cujos indivduos interagem freqentemente entre si. O termo metapopulao mais abrangente e se refere a uma populao maior, geralmente composta por vrias populaes locais, em que a migrao de indivduos entre populaes locais possvel. Para algumas espcies de animais sobretudo aquelas de interesse econmico , os termos rebanho e criao so muito utilizados como sinnimo de populao, principalmente quando se refere a populaes locais. O tamanho e as caractersticas das populaes-alvo de estudos epidemiolgicos so muito variveis. Pode-se estudar os fatores que determinaram a ocorrncia de cinomose em um canil, por exemplo. Nesse caso, a populao-alvo composta apenas pelos ces presentes no canil na poca da ocorrncia da doena. uma populao limitada e sob certo controle, o que caracteriza uma populao local. Em um estudo da infeco pelo parvovrus em ces de uma cidade, a populao-alvo abrange todos os ces da cidade. Essa uma populao com um nmero grande de indivduos, de difcil enumerao e identicao, e, por isso, sobre a qual no se tem controle. Estudos de viroses em animais silvestres (febre amarela em primatas, raiva em morcegos) tratam de uma populao de tamanho desconhecido e sobre a qual no se possui nenhum controle. Evidentemente, os estudos epidemiolgicos em populaes limitadas que habitam uma rea restrita e sobre a qual se tem controle so mais facilmente exequveis e produzem resultados mais objetivos e conveis. No entanto, estudos em populaes numerosas de dimenses desconhecidas so, muitas vezes, necessrios e, dependendo da metodologia empregada, podem tambm produzir resultados conveis e de grande utilidade. Nesses casos, geralmente, estuda-se apenas uma parcela da populao, denominada amostra.
enfermidade em questo. Se todos os indivduos da populao forem susceptveis ao agente, a populao de risco equivale populao total. A populao de risco para a febre aftosa em uma populao bovina no-vacinada, por exemplo, composta por todos os bovinos da populao, pois todos os animais so igualmente susceptveis. Em outras situaes, a populao de risco apenas uma parcela da populao, que susceptvel infeco ou enfermidade. Em estudos de abortos por vrus em bovinos, a populao de risco constituda apenas pelas vacas prenhes. Estudos sobre as causas de mastite em bovinos contemplam apenas as vacas em lactao. A denio da populao de risco importante quando se quantica os eventos de doena e se expressa em ndices ou taxas. Esses clculos devem sempre considerar a populao de risco (e no a populao total) como denominador.
4.3 Populaes abertas e fechadas

Dependendo da possibilidade de contato com o meio exterior (e com outras populaes), as populaes de animais podem ser classicadas em abertas e fechadas. Populaes abertas so aquelas sobre as quais no so impostas restries movimentao (entrada e sada) de animais e de subprodutos, estando, por isso, mais susceptveis introduo e disseminao de agentes infecciosos. As populaes de ces de cidades so exemplos de populaes abertas, pois no existem restries entrada e movimentao de animais oriundos de outras cidades ou regies. Muitos rebanhos bovinos, principalmente aqueles de criao extensiva, tambm se enquadram nessa categoria pela ausncia de medidas de biossegurana para impedir a entrada de agentes infecciosos. Nesses casos, as populaes locais podem, com maior ou menor freqncia, interagir com outras populaes locais dentro de uma mesma metapopulao. As populaes fechadas so grupos de animais mantidos sob certo isolamento do meio exterior. As condies de isolamento em nvel e rigor variveis geralmente so impostas pelo homem com o intuito de evitar a introduo de agentes infecciosos e preservar a condio sanitria da po-
4.2 Populao de risco

O termo populao de risco refere-se parcela da populao que susceptvel infeco ou
283
N de casos novos Incidncia (%) = _______________________ x 100
Populao de risco (mdia) x tempo
pulao. possvel manter populaes fechadas com diferentes abrangncias, desde rebanhos em propriedades, municpios, regies, estados, pases e at mesmo continentes. Rebanhos sunos ou granjas de aves livres de determinados patgenos (PRV, PRRSV, NDV) e que impem restries introduo de quaisquer fatores que possam introduzir o agente so exemplos de populaes pequenas fechadas. Por outro lado, pases como os Estados Unidos impem restries introduo de animais e subprodutos de outros pases, com o objetivo de preservar seus rebanhos suno e bovino livres do vrus da peste suna clssica (CSFV) e FMDV, respectivamente. A tendncia que criaes comerciais de vrias espcies animais se tornem progressivamente fechadas, a m de preservar uma condio sanitria compatvel com sade animal e atividade econmica.
4.4 Quanticao de doena: incidncia e prevalncia

A quanticao dos eventos de doena nas populaes se constitui em um dos instrumentos mais utilizados em epidemiologia. Essa quanticao expressa sob a forma de taxas e coecientes. Dene-se taxa (ou ndice) como uma frao em que o numerador nmero de casos e o denominador a populao de risco, ou seja, a expresso de uma freqncia relativa de casos de uma determinada doena ou indicador de sade. Dois ndices muito utilizados em epidemiologia so a incidncia e a prevalncia. Embora sejam ndices relacionados e, muitas vezes, confundidos, incidncia e prevalncia so ndices que possuem composio, clculo e signicados distintos e, como tal, devem ser considerados e analisados. O ndice de incidncia mais utilizado para descrever a dinmica de infeces agudas, em que o nmero de novos casos aumenta rapidamente com o decorrer do tempo. Dene-se incidncia como a freqncia relativa de novos casos da doena (casos novos em relao a populao de risco) que surgem em relao ao tempo. A incidncia calculada da seguinte forma:
O clculo da incidncia sempre considera o parmetro tempo, que pode ser dias, semanas, meses ou anos, dependendo da dinmica da infeco. A incidncia uma freqncia relativa que d uma idia da dinmica da infeco ou doena. expressa em percentagem (exemplo: 1% de novos casos por ms) ou frao (1/100.000 por ms) x tempo. A incidncia tambm denominada de taxa de ataque ou morbidade incidente. A prevalncia tambm uma freqncia relativa (nmero de casos/populao de risco), porm determinada em certo momento (no considera a varivel tempo). utilizada principalmente para expressar a freqncia de infeces ou doenas crnicas, ou de doenas que ocorram h algum tempo na populao e cujo incio no foi monitorado. Dene-se prevalncia como uma freqncia relativa de casos de uma doena (ou de outro fator relacionado) em um determinado momento. O clculo da prevalncia no considera o parmetro tempo e tambm pode ser expresso em percentual (p. ex.: 1% de infectados) ou frao (1/10.000).
N de casos Prevalncia (%) = ______________________ x 100
Populao de risco
A prevalncia de infeces em rebanhos freqentemente determinada por exames sorolgicos que detectam anticorpos e indicam que houve uma exposio prvia ao agente. A freqncia relativa de animais reagentes chamada de soroprevalncia. Ao contrrio da incidncia, o ndice de prevalncia no fornece informaes acerca da dinmica da infeco, e sim da situao momentnea, ou seja, constitui-se em uma informao esttica, pois no acompanha a evoluo do processo infeccioso. Outras taxas comumente utilizadas em epidemiologia so morbidade, mortalidade e letalidade. Taxa de morbidade o percentual (ou frao) dos
284
Captulo 10
animais expostos a um determinado agente que desenvolvem a doena. O clculo dessa taxa pode considerar, como denominador, a populao potencialmente exposta (abrange todos os animais do rebanho ou populao) ou a populao que realmente entrou em contato com o agente (somente os animais que foram infectados). No segundo caso, a taxa de morbidade seria um reexo direto da patogenicidade do agente; no primeiro caso, seria o produto da patogenicidade e da transmissibilidade. Taxa de mortalidade a frao dos animais (potencial ou realmente expostos) que vai a bito em decorrncia da infeco. Taxa de letalidade o percentual dos animais doentes que vai a bito ( uma medida da severidade da doena).
Doena Espordica
N de novos casos
Tempo B Doena Endmica
5 Padres temporais de ocorrncia das doenas

Os eventos de doena ocorrem continuamente com o decorrer do tempo, com freqncia e distribuio temporal que podem variar de acordo com diversos fatores. Dependendo da distribuio da freqncia ao longo do tempo, trs padres principais de ocorrncia podem ser reconhecidos: doenas de ocorrncia espordica, endmica e epidmica (Figura 10.16). Os termos endemia e epidemia so utilizados para designar doenas de ocorrncia endmica e epidmica, respectivamente. Os termos enzotica e epizotica so utilizados para referir-se a doenas animais. Porm, como mencionado anteriormente, os termos epidemiolgicos clssicos (endemia, epidemia) so tambm utilizados em epidemiologia veterinria.
N de novos casos
Tempo C Doena Epidmica
N de novos casos
Epidemia em ponto
Epidemia de propagao
Tempo
5.1 Doenas espordicas

As doenas espordicas so aquelas que no esto presentes na populao a maior parte do tempo e a sua ocorrncia caracterizada pelo aparecimento de um nmero geralmente pequeno de casos a intervalos variveis, irregulares e imprevisveis (Figura 10.16A). Tratando-se de doenas infecciosas, algumas possveis explicaes para esse comportamento so: a) o agente est sempre presente no ecossistema, porm em
Figura 10.16. Padres temporais de ocorrncia de doenas.
reservatrios (outras espcies animais). Esses reservatrios apenas ocasionalmente entram em contato e transmitem o agente para a espcie em questo, desencadeando o aparecimento da doena (p. ex.: casos de infeco pelo vrus ebola em pessoas na frica, hantavirose em humanos no Brasil); b) o agente est sempre presente na populao, porm causando infeces subclnicas
285
na maioria e doena em uma minoria dos indivduos, ou seja, a infeco raramente causa a doena. Assim, a infeco seria endmica e a doena seria espordica (p. ex.: a infeco pelo BLV em bovinos endmica; a ocorrncia do linfossarcoma causado pelo BLV espordica); c) o agente no est presente na populao na maior parte do tempo, sendo esporadicamente introduzido. Quando introduzido, ocasiona os eventos de doena (p. ex.: casos de febre aftosa nos estados do Rio Grande do Sul e Mato Grosso do Sul nos ltimos anos).
laes. A infeco pelo BoHV-1, por exemplo, endmica na populao bovina do Brasil. Para infeces que ocorram endemicamente em todo o mundo, no necessrio especicar a populao. Por exemplo, a parvovirose uma doena endmica na populao canina (ca implcito que se trata da populao mundial).
5.3 Doenas epidmicas

Doenas de ocorrncia epidmica ou epidemias (epizootias) so aquelas que se caracterizam pela ocorrncia de um nmero excessivo e inesperadamente alto de casos em um determinado perodo em uma populao (Figura 10.16C), ou seja, ocorre com uma freqncia inesperada em certo intervalo de tempo. Os termos epidemia (epizootia) e surto so comuns e indistintamente utilizados para designar esses eventos. Surto um termo popular e tem sido utilizado mais amide para referir-se a eventos restritos geogracamente; enquanto epidemia um termo tcnico, mais comumente (mas no exclusivamente) utilizado para designar eventos mais abrangentes geogracamente. No entanto, deve-se enfatizar que no existe uma distino clara entre esses dois conceitos e ambos so utilizados indistintamente para se referir a esses eventos. A caracterizao de uma epidemia necessariamente requer a considerao dos parmetros freqncia (nmero excessivo de casos), tempo (dia, semana, ms, ano) e espao (populao). Uma epidemia no pode ser denida pelo nmero absoluto de casos, e sim pelo nmero relativo, que deve ser comparado com o nmero de casos esperado para o respectivo perodo naquela populao. Por exemplo, um nico caso de febre aftosa nos Estados Unidos (EUA), em 2006, pode congurar estatisticamente uma epidemia, pois a freqncia esperada era zero. Por outro lado, 1.000 casos de doena causada pelo PRRSV no estado de Nebraska, EUA, em maio de 2006, pode no congurar uma epidemia, pois pode ser semelhante freqncia observada nos meses anteriores. Estatisticamente, considera-se uma epidemia sempre que o nmero de casos exceder 1,96 desvio padro acima da mdia de casos esperados para aquele intervalo de tempo.
5.2 Doenas endmicas

Doenas endmicas ou endemias (enzootias) so aquelas que ocorrem continuamente, com freqncias pouco variveis e, portanto, razoavelmente previsveis na populao ao longo do tempo (Figura 10.16B). Em outras palavras, a infeco dita nativa da populao. Infeces endmicas so geralmente mantidas pela ocorrncia simultnea e contnua de mltiplas cadeias de transmisso do agente entre hospedeiros susceptveis. Trs componentes so absolutamente necessrios para que uma infeco seja endmica em uma populao: a) a presena do agente; b) o nmero/proporo adequado(a) de hospedeiros susceptveis e c) a presena dos mecanismos de transmisso. A ausncia de um desses componentes preclude a ocorrncia endmica da doena. Uma infeco ou doena pode ser endmica em diferentes nveis (hipoendmica [incidncia baixa], mesoendmica [incidncia moderada], hiperendmica [incidncia alta] e holoendmica [incidncia altssima]), dependendo do nmero/proporo de animais que afeta. Exemplos de infeces vricas endmicas em populaes animais so abundantes: cinomose e parvovirose em ces, infeco pelo BVDV e BoHV-1 em bovinos de muitos pases, rotavirose e parvovirose suna, leucose enzotica bovina, entre outras. O termo endmico refere-se ao padro temporal de ocorrncia de uma doena em uma determinada populao. Por isso, quando se refere uma doena endmica, preciso, necessariamente, mencionar a populao em questo, pois essa doena pode no ser endmica em outras popu-
286
Captulo 10
As dimenses de uma epidemia podem variar amplamente de acordo com o nmero de animais afetados e rea ocupada pela populao. A introduo de um animal infectado pelo BVDV em um rebanho de cria, por exemplo, pode resultar em um surto localizado de abortos naquela propriedade. Mordeduras de morcegos em bovinos e eqinos produzem surtos de raiva que, freqentemente, atingem uma ou mais propriedades vizinhas. O surto de febre aftosa no Rio Grande do Sul (RS), em 2000, e no Mato Grosso do Sul (MS), em 2005, envolveu vrios municpios; na Argentina, em 2000, houve o envolvimento de vrias provncias e, na Inglaterra, atingiu praticamente todo o pas. Epidemias pequenas (envolvendo rebanhos ou populaes pequenas) provavelmente ocorram continuamente em populaes animais do mundo inteiro, sem despertar a ateno. No entanto, algumas epidemias atingem grandes propores por envolver pases e at mesmo continentes. A epidemia de SARS (2003-2004) atingiu grande parte da sia, alguns pases europeus e o Canad. Epidemias que atingem populaes de continentes ou eventualmente de todo o mundo so denominadas pandemias, das quais a parvovirose canina (a partir da dcada de 1980) e a infeco pelo HIV constituem-se em exemplos contemporneos. Dois tipos de epidemia podem ser reconhecidos de acordo com a dinmica (taxa de aumento da incidncia de acordo com o tempo) e durao, reetindo doenas com diferentes formas de transmisso e propagao. As epidemias em ponto so caracterizadas por um aumento brusco, de magnitude varivel e curta durao, no nmero de novos casos (Figura 10.16C). Geralmente so resultantes de exposio simultnea de vrios indivduos ao agente, seja diretamente na fonte de infeco (animal infectado), em gua, alimentos, aerossis ou em produtos contaminados. So caractersticas de infeces altamente transmissveis (FMDV, CSFV, inuenza) ou de infeces transmitidas macia e simultaneamente por uma fonte comum de infeco. Ocorrem freqentemente pela ingesto de gua ou alimentos contaminados aos quais os animais tm acesso simultaneamente. Caracterizam-se por uma grande concentrao de novos casos em um curto espaco
de tempo. A introduo de um animal infectado pelo FMDV em um rebanho pequeno susceptvel provavelmente resultar em uma epidemia com essas caractersticas. Essas epidemias geralmente possuem curta durao. Epidemia em torre, macia, de fonte comum ou hdrica so sinnimos utilizados para designar eventos com essas caractersticas. As epidemias de propagao so aquelas em que a incidncia aumenta gradualmente e no de forma explosiva medida que novos animais vo sendo infectados, transmitem o agente a novos hospedeiros e apresentam sinais clnicos (Figura 10.16C). So caractersticas de infeces transmitidas por contato direto ou indireto. A epidemia da AIDS em humanos, a parvovirose em ces e a PRRS em sunos so exemplos recentes de epidemias de propagao. Epidemias de propagao geralmente possuem durao prolongada. Acredita-se que, mesmo em populaes de animais silvestres e sem a interveno humana, as epidemias sejam autolimitantes e no continuem indenidamente. O m das epidemias ocorre eventual e inevitavelmente pelo esgotamento dos susceptveis, tanto pela morte como pelo desenvolvimento de imunidade pelos indivduos. Algumas enfermidades epidmicas em seu incio, principalmente aquelas causadas pela introduo de um agente novo na populao, podem se tornar endmicas com o decorrer do tempo. Exemplos so a parvovirose canina e a PRRS, que, aps um incio explosivo, se tornaram endmicas nas populaes canina e suna de vrios pases, respectivamente. A infeco pelo WNV foi introduzida nos EUA, em 1999, quando resultou em epizootias/epidemias em aves e humanos. Aps esta introduo e incio epidmico, a infeco se estabeleceu no ecossistema e se tornou endmica em vrios estados norte-americanos. Recentemente o WNV foi detectado no noroeste da Amrica do Sul e tambm na Argentina. Outras epidemias se tornam restritas temporalmente (por fatores naturais ou por medidas de controle) e no persistem de forma endmica na populao. Exemplos recentes incluem a SARS e as ocorrncias de febre aftosa no RS, em 2000; no MS, em 2005; e na Inglaterra, em 2001, cujas me-
287
didas de combate resultaram na erradicao do agente e no trmino das respectivas epidemias.
5.4 Fatores determinantes das epidemias

Os surtos de doenas vricas resultam do desequilbrio das interaes agente-hospedeiro-meio ambiente e podem ser potencialmente determinados por inmeros fatores que podem atuar individualmente ou em conjunto. Os surtos de febre aftosa no RS e Gr-Bretanha, em 20002001, por exemplo, foram determinados pela introduo do agente em populaes susceptveis. A pandemia de parvovirose canina, a partir da dcada de 1980, foi determinada pelo surgimento de um novo vrus na espcie canina, a partir da mutao/evoluo do vrus da panleucopenia felina. A pandemia de AIDS provavelmente originou-se h decadas pela transmisso e adaptao de um vrus de primatas (vrus da imunodecincia smia [SIV]) para humanos. Os surtos anuais de gripe em humanos devem-se, entre outros fatores, contnua evoluo e variao antignica do vrus. A inuenza denominada gripe do frango, que acomete pessoas e aves na sia desde 1997, deve-se a um vrus de aves que sofreu mutaes sucessivas e tornou-se mais virulento para aves silvestres e domsticas e capaz de infectar pessoas. O PRRSV de sunos provavelmente se originou de um vrus de roedores (lactate dehidrogenase elevating virus, LDEV) que sofreu mutaes e adaptao em sudeos silvestres, sendo posteriormente transmitido e disseminado entre sunos domsticos. O vrus da SARS que infectou milhares de pessoas na sia, Europa e Canad, em 2003-2004, provavelmente se originou e foi transmitido a humanos a partir de espcies de animais silvestres. Alterao em fatores ambientais, sem modicaes evidentes no agente, tambm podem resultar em um aumento expressivo da freqncia de doenas. A superpopulao de morcegos hematfagos em determinadas reas, devido a alteraes ecolgicas, so acompanhadas de surtos de raiva em herbvoros. Mudanas ecolgicas relacionadas com a agricultura tm causado aumento da populao e mudana de hbitos de
roedores silvestres que servem de reservatrios para os hantavrus e arenavrus. Essas alteraes tm sido implicadas na ocorrncia de hantavirose e doena hemorrgica por arenavrus em humanos. O estresse do transporte e aglomerao ao qual bezerros so submetidos aps o desmame tem sido associado com surtos de viroses respiratrias (BoHV-1, BRSV) e encefalite herptica (BoHV-5). A temperatura e umidade no vero favorecem a proliferao de vetores e a conseqente ocorrncia de arboviroses (WNV, encefalites eqinas, dengue). A aglomerao de ces em canis e pet shops pode favorecer o contato entre os animais e a conseqente transmisso do CDV e vrus respiratrios, entre outros. A falha de cobertura vacinal na populao em um determinado ano pode resultar em surtos de doenas que normalmente so endmicas e cuja freqncia geralmente baixa. A reativao de infeces latentes, geralmente associada com fatores ambientais (estresse, m nutrio, aglomerao, mudana de alimentao) tem sido freqentemente responsabilizada por surtos de doenas associadas ao BoHV-1 e BoHV-5 em bovinos. Esses fatores ambientais podem tambm atuar em conjunto sobre o sistema imunolgico, predispondo os animais a outras enfermidades. Em resumo, virtualmente, qualquer fator do agente, do hospedeiro e do meio ambiente que determine direta ou indiretamente o aumento na freqncia esperada de uma doena pode ser considerado o fator determinante de uma epidemia. A origem e os fatores determinantes de surtos podem ser freqentemente determinados pela realizao de investigaes epidemiolgicas criteriosas e sistemticas. No entanto, em muitas situaes, as interaes que produzem esses eventos so muito complexas e no permitem a identicao da origem e dos fatores responsveis.
5.5 Outros padres de ocorrncia

Alm dos padres clssicos de ocorrncia, algumas infeces vricas agudas apresentam variaes de incidncia diferentes dos descritos acima. Vrias infeces vricas agudas apresentam aumentos de incidncia coincidentes com
288
Captulo 10
determinadas estaes do ano. Viroses respiratrias (BRSV, parainuenza canina) geralmente apresentam picos de incidncia no inverno; em contraste, algumas viroses entricas e arboviroses apresentam picos no vero. Esse tipo de comportamento denominado sazonal ou estacional, e o aumento de incidncia vericado nessas pocas deve-se geralmente ao direta ou indireta de fatores climticos sobre os hospedeiros, vetores e/ou agentes. A maior incidncia de viroses respiratrias no inverno deve-se a fatores como aglomerao de indivduos, ventilao deciente, estresse trmico, umidade, temperatura e facilidade de transmisso dos vrus. A maior incidncia de arboviroses nos meses quentes deve-se ao aumento da populao e atividade dos artrpodes vetores. A causa de sazonalidade de algumas infeces vricas, no entanto, no facilmente explicvel e pode envolver mltiplas interaes de fatores climticos com o hospedeiro e com o agente. Doenas com variaes cclicas apresentam aumentos de incidncia a intervalos maiores do que um ano. Os picos geralmente ocorrem quando a imunidade da populao, que atinge o seu mximo logo aps cada pico, atinge nveis criticamente baixos aps um perodo de reduo gradativa. Esse padro de ocorrncia mais facilmente reconhecido em populaes humanas (o sarampo apresenta picos a cada 2-3 anos; rubola a cada 5-7 anos) e de animais silvestres, pois os animais domsticos de interesse econmico freqentemente tm o seu ciclo de vida interrompido devido nalidade produtiva. Doenas com tendncia secular so aquelas cuja incidncia apresenta uma reduo ou aumento muito lento ao longo de anos e dcadas. Essas variaes devem-se, em geral, a alteraes ecolgicas graduais e progressivas, mudanas de hbitos e de prticas de manejo, e a medidas gerais de prolaxia e controle das doenas animais.
presena e da interao entre vrios fatores. Os requerimentos mais bvios para a ocorrncia de uma infeco e doena em uma determinada populao so a presena do agente e de hospedeiros susceptveis. No entanto, outros fatores epidemiolgicos so determinantes da distribuio geogrca das viroses animais. A existncia e nmero de reservatrios e vetores, condies favorveis para a sobrevivncia e transmisso do agente, barreiras naturais ou articiais, medidas de controle e/ou erradicao (incluindo vacinao), sistemas de produo, entre outros, contribuem para os diferentes padres de distribuio e localizao das infeces vricas.
6.1 Doenas vricas de distribuio mundial

As viroses de animais de companhia, sobre os quais geralmente no se impe restries movimentao e que no se constituem em alvos de programas sanitrios ociais, geralmente possuem uma distribuio ampla, muitas vezes mundial. Enquadram-se nessa categoria as principais infeces vricas de ces e gatos. Embora amplamente difundidas na populao, essas viroses certamente apresentam diferenas de prevalncia e de incidncia entre populaes, reetindo peculiaridades epidemiolgicas locais e medidas voluntrias de controle eventualmente praticadas. Populaes de ces e gatos que vivem em condies isoladas (ilhas, comunidades remotas) podem ocasionalmente ser livres de algumas dessas viroses. Algumas infeces vricas de animais de interesse econmico (BoHV-1, bPI3v, BVDV, rotavirose, coronavirose, parvovirose suna) tambm possuem distribuio mundial, embora algumas delas tenham sido alvos recentes de programas de erradicao e, atualmente, estejam erradicadas de alguns pases. A maioria das viroses humanas tambm possui distribuio mundial, embora possam apresentar nveis variveis de ocorrncia nas diferentes subpopulaes. Algumas viroses humanas j foram erradicadas mundialmente (varola) ou esto em vias de erradicao em vrios pases (poliomielite, sarampo).
6 Distribuio espacial das infeces vricas

As infeces vricas apresentam distribuies geogrcas diversas que dependem da
289
6.2 Doenas vricas com certa limitao geogrca

Algumas infeces vricas sobretudo as arboviroses embora possam apresentar uma distribuio relativamente ampla e possam acometer populaes de vrios continentes, possuem certa limitao geogrca. A delimitao da ocorrncia dessas infeces geralmente determinada pela existncia de condies climticas para a sobrevivncia e atividade dos insetos envolvidos na transmisso do agente. Enquadram-se nessa categoria a dengue, a febre amarela, algumas infeces por alfavrus, avivrus e outras arboviroses (WNV, VEEV). A distribuio dessas infeces coincide com uma faixa territorial de certa amplitude laditudinal, onde as condies climticas so favorveis sobrevivncia e atividade dos vetores. Essas enfermidades podem, ocasionalmente, ser detectadas em reas remotas e que no apresentam condies para a perpetuao dos vetores, mas dicilmente se tornam endmicas nessas regies.
6.3 Doenas vricas restritas geogracamente

Algumas infeces vricas apresentam uma distribuio geogrca restrita, cando limitadas a determinadas regies ou pases. A peste suna africana ocorre endemicamente na frica, provavelmente pelas condies epidemiolgicas favorveis (populao susceptvel, reservatrios, vetores, falta de medidas de biossegurana). Esporadicamente introduzida na Europa e no Brasil no passado, a doena foi rapidamente erradicada e no se tornou endmica. A doena do vale Rift, enfermidade zoontica que afeta vrias espcies de mamferos domsticos e silvestres, tem sido historicamente restrita a uma regio da frica. Ocasionalmente detectada fora do continente africano (Oriente Mdio e sia), aparentemente no encontrou condies para se manter endemicamente. A retrovirose Maedi-Visna foi inicialmente identicada em ovinos/caprinos da Islndia e tem cado praticamente restrita a esse pas insular. O vrus Hendra (um morbilivrus de morcegos) ultrapassou a barreira interespcies e
infectou humanos e eqinos na Austrlia, estando, at ento, limitado quele continente. Evento similar ocorreu na Malsia e Indonsia, onde o vrus Nipah (tambm um morbilivrus de morcegos) infectou e provocou doena em pessoas e grande mortalidade em sunos. Outro exemplo de infeco vrica restrita geogracamente o associado ao vrus ebola, cujos eventos epidmicos concentram-se quase que exclusivamente na frica Central. As infeces pelos vrus das encefalites eqinas do leste e oeste (EEEV, WEEV) tambm possuem certa delimitao geogrca, que determinada pelas interaes do agente com seus vetores e hospedeiros. Esses agentes, no entanto, tm sido tambm detectados fora de seus nichos ecolgicos originais, o que pode, eventualmente, caracterizar uma expanso de sua abrangncia. A restrio geogrca de muitas dessas viroses pode possuir carter apenas circunstancial e pode ser modicada ocasionalmente, acompanhando alteraes ecolgicas ou epidemiolgicas. A doena do Nilo Ocidental (WNV), causada por um avivrus transmitido por insetos e cujos hospedeiros naturais so vrias espcies de pssaros e outras aves silvestres, por exemplo, estava historicamente restrita ao nordeste do continente africano, a alguns pases do Oriente Mdio e europa mediterrnea (casos isolados). Introduzida, em 1999, nos Estados Unidos, a infeco pelo WNV rapidamente se disseminou e se tornou endmica no pas e est avanando na direo sul em pases da Amrica Central e Caribe. Outro exemplo recente de expanso geogrca foi o vrus da lngua azul (BTV), que atingiu rebanhos ovinos da Holanda, Alemanha e Blgica, em 2006, provavelmente a partir da frica, onde a infeco endmica.
6.4 reas livres naturais

Algumas populaes de animais so naturalmente livres de determinadas infeces vricas. Essas populaes (ou as reas que habitam) so ditas indenes sem relao doena e livres em relao ao agente. Essas reas foram mantidas livres do agente ao longo de dcadas, sobretudo, pela existncia de barreiras naturais que dicultavam a sua introduo. A Austrlia naturalmente in-
290
Captulo 10
dene raiva animal (silvestre e urbana) e febre aftosa, condies favorecidas pela sua localizao geogrca. O Chile manteve-se livre de febre aftosa durante dcadas, apesar da situao endmica da infeco na Amrica do Sul, tambm graas cordilheira dos Andes, que serviu de barreira natural contra a introduo do agente. Embora muitas dessas reas tenham se mantido historicamente livres de doenas graas existncia de barreiras naturais, a manuteno dessa condio, nos ltimos anos, tambm deveu-se imposio de barreiras articiais. A condio de rea livre tambm pode ser meramente circunstancial, pois o agente pode ser potencialmente introduzido a partir de reas endmicas.
6.5 reas livres articiais

Vrios pases tm envidado esforos e conseguido erradicar viroses outrora endmicas em seus rebanhos. O BLV, BoHV-1 e PRV foram erradicados de alguns pases europeus; a febre aftosa e a peste suna clssica (PSC) foram erradicadas de grande parte do Brasil. Embora existam apenas alguns relatos remotos de ocorrncia de casos, a PSC e febre aftosa foram erradicadas dos EUA h muitas dcadas. O PRV foi erradicado de vrios pases europeus e recentemente da populao suna comercial dos EUA. Esforos de erradicao de doenas vricas tm sido empreendidos por vrios pases e, se bem-sucedidos, resultaro em novas reas livres. As principais viroses-alvo de programas de erradicao so aquelas sob regulao internacional que restringe a movimentao de animais e subprodutos.
7 Doenas vricas emergentes

As ltimas dcadas tm testemunhado o surgimento e ressurgimento de vrias enfermidades vricas em populaes humanas e animais. As causas da emergncia de algumas dessas enfermidades j foram parcialmente esclarecidas e parecem envolver diversos fatores que atuam individualmente ou em conjunto. Em geral, a emergncia/reemergncia de enfermidades vricas est associada com: a) surgimento de um novo vrus na populao ou espcie; b) muta-
o/variao gentica de um vrus j existente na populao; c) alteraes ecolgicas que afetam as interaes entre os hospedeiros, reservatrios e vetores, ou d) ao do homem atravs dos sistemas de criao, manejo, transporte e comercializao/utilizao de animais. O HIV surgiu na frica, entre 1940 e 1950, provavelmente a partir de um vrus de primatas no-humanos (simian immunodeciency virus, SIV). Acredita-se que o SIV tenha sido transmitido de macacos a pessoas pelo contato com o sangue ou outros uidos corporais, proporcionado por prticas como caa, abate e alimentao. Aps atravessar a barreira interespcies, o novo vrus foi gradativamente se adaptando e disseminando na populao humana. Atualmente o HIV est amplamente difundido na populao humana e representa um dos principais problemas de sade pblica em todo o mundo, ou seja, a epidemia de AIDS deveu-se ao surgimento de um novo vrus na populao humana. Outro exemplo de vrus que atravessou a barreira entre espcies e alterou o seu espectro de hospedeiros foi o parvovrus canino (CPV). O CPV surgiu como patgeno de ces no nal dos anos 1970, a partir de mutaes nas protenas do capsdeo do parvovrus causador da panleucopenia felina (FLPV). Como conseqncia dessas alteraes genticas, o parvovrus teve a sua gama de hospedeiros alterada, adquirindo a habilidade de infectar e causar doena em ces. Nos anos que se seguiram ao surgimento desse novo vrus na espcie canina, as cepas de parvovrus eram altamente virulentas. Ao longo dos anos, no entanto, as cepas de alta virulncia foram sendo gradativamente substitudas na populao por cepas menos virulentas, o que indica uma adaptao gradativa aos novos hospedeiros. O vrus da encefalite eqina venezuelana (VEEV), um alfavrus zoontico transmitido por insetos, tem sido implicado em epidemias e epizootias (em eqdeos) de grandes propores no norte e noroeste da Amrica do Sul nas ltimas dcadas. Esses eventos se repetem a intervalos de aproximadamente 10 anos. No intervalo entre os surtos, no h evidncia de atividade viral nas populaes de eqinos ou de humanos, mas o vrus provavelmente permanea circulando no seu
291
ambiente natural, infectando pequenos mamferos silvestres. Os vrus que circulam nas populaes silvestres nesses perodos denominados enzoticos , embora capazes de infectar eqinos e pessoas, produzem baixos nveis de viremia e so virtualmente apatognicos para essas espcies. Periodicamente esses vrus sofrem mutaes que os tornam patognicos e capazes de produzir altos nveis de viremia em eqinos. Esses vrus denominados epizoticos so, ento, transmitidos aos eqinos, nos quais so amplicados e disseminados nessa espcie e tambm para humanos, causando epidemias/epizootias de grandes propores. Os surtos peridicos de VEE so exemplos da reemergngia de doenas devido a mutaes/alteraes genticas de vrus preexistentes no ecossistema. O PRRSV foi inicialmente identicado como patgeno de sunos no nal dos anos 1980, nos EUA, e no incio dos anos 1990, na Europa. A hiptese mais aceita que o agente tenha se originado de um vrus muito semelhante de roedores (lactate dehidrogenase elevating virus, LDEV). O LDEV teria sido transmitido de roedores para sudeos silvestres na Europa h, aproximadamente, um sculo. Posteriormente, teria sido transmitido a sunos domsticos e introduzido nos EUA no incio de sculo 20 pela importao de animais. A partir da, o vrus teria evoludo na espcie suna paralelamente nos dois continentes. Qual a razo, ento, para o seu surgimento apenas nos anos 1980-1990? A explicao mais plausvel que, embora presente nesses pases h dcadas, a grande disseminao teria apenas ocorrido nas duas ltimas dcadas, por modicaes drsticas nas prticas de manejo, comercializao, intercmbio intensivo de reprodutores e uso indiscriminado da inseminao articial. O coronavrus causador da SARS (SARSCoV) emergiu na sia, em 2003, como um vrus novo na populao humana. O seu surgimento parece ter envolvido a interao de fatores ecolgicos e virais. Estudos epidemiolgicos iniciais indicavam as civetas (civet cats) pequenos carvvoros silvestres domesticveis e utilizados tambm para alimentao humana como provvel origem do agente. Estudos mais recentes, no entanto, indicam uma espcie de morcego
(Rhinonophus sinicus) como provvel hospedeiro natural do vrus. No obstante, a anlise logentica desse vrus sugere que eventos de mutao ou recombinao, envolvendo coronavrus avirios e de mamferos, tenham ocorrido no passado. Aliado a fatores ambientais e culturais, esses eventos genticos podem ter contribudo para a capacidade do agente de infectar diferentes espcies silvestres e, eventualmente, ser transmitido a humanos. A transmisso a humanos foi seguida de uma rpida disseminao no sudeste asitico, extendendo-se para alguns pases europeus e para o Canad pela movimentao de pessoas. Felizmente as medidas prolticas adotadas foram capazes de restringir a disseminao e, eventualmente, resultaram no nal na epidemia. Dois exemplos de doenas que emergiram devido a alteraes ecolgicas foram as causadas pelos vrus Nipah e Hendra. Esses vrus cruzaram a barreira interespcies e causaram doena e mortalidade em animais e pessoas na Malsia e Austrlia, respectivamente. O desmatamento indiscriminado, seguido de queimadas nas orestas da Malsia em 1997-1998, desalojou populaes de morcegos frugvoros da espcie Pteropus (conhecidos como raposas voadoras) de seu habitat natural. Essas populaes foram, ento, procurar abrigo e alimento em pomares domsticos, alguns deles localizados em granjas de sunos. Como conseqncia da proximidade, os sunos se infectaram ao ingerir restos de frutas contaminadas com a saliva dos morcegos infectados. O vrus Nipah se disseminou rapidamente em granjas com alta concentrao de animais, contaminando e causando doena grave em sunos e humanos. Evento similar ocorreu na Austrlia em 1994-1995, quando eqinos foram contaminados com outro morbilivrus, o vrus Hendra, pelo contato com excreta e restos placentrios de morcegos contaminados. Essa enfermidade foi mais restrita, mas atingiu e ocasionou a morte de vrios eqinos e de algumas pessoas que tinham contato com esses animais. O vrus da febre do Vale Rift (RVFV), um vrus buniavrus zoontico transmitido por insetos, tambm tem sido associado com eventos epidmicos de propores considerveis em humanos e animais domsticos em alguns pases da frica. Um des-
292
Captulo 10
ses eventos foi associado com a abertura de uma grande represa no Egito, seguida de enchentes e alagamentos. Essas condies propiciaram uma proliferao rpida e abundante de insetos e a conseqente disponibilidade de vetores para a transmisso do agente. O WNV emergiu na Amrica do Norte no ano de 1999, inicialmente produzindo doena e mortalidade em aves silvestres (corvos, pardais) e de zoolgicos, acompanhada de alguns casos de doena humana. At ento, a infeco pelo WNV estava restrita ao nordeste do continente africano e a alguns pases do Oriente Mdio e Europa mediterrnea. Nesses locais, a infeco ocorria sob a forma de surtos restritos geogracamente e atingindo um nmero limitado de pessoas e/ou de animais. O vrus provavelmente foi introduzido no continente americano pelo movimento migratrio de aves a partir da frica (aves silvestres so os seus hospedeiros naturais), importao ilegal de aves ornamentais contaminadas ou pelo transporte de mosquitos contaminados em navios e/ou avies. Aps a introduo, o WNV encontrou condies ecolgicas e rapidamente se disseminou nos EUA, ocasionando doena em aves (mais de 150 espcies de pssaros e outras aves so naturalmente susceptveis), humanos (aproximadamente 700 mortes at meados de 2007) e em animais domsticos (mais de 25 mil casos em eqinos at julho de 2007). A infeco em humanos tem assumido caractersticas at ento no relatadas, como ocorrncia espordica de transmisso transplacentria e neonatal, alm de transmisso por transfuso sangnea e transplante de rgos. O vrus j foi detectado em alguns pases da Amrica Central e, recentemente, foi detectado na Colmbia (2004-2005) e Argentina (2006). So vrios os exemplos de doenas vricas emergentes de animais domsticos e humanos cujos agentes se originaram de animais silvestres. O caminho inverso, ou seja, transmisso de agentes vricos de animais domsticos para espcies silvestres, embora menos freqente, tambm tem sido bem documentada. O vrus da cinomose (CDV), um morbilivrus canino, tem sido freqentemente associado com eventos de doena em animais silvestres. O vrus foi asso-
ciado com surtos de alta mortalidade em focas (>10.000) e outros mamferos nos mares Mediterrneo e Cspio no incio do sculo 21, e no lago Baikal, Rssia, em 1997/1998. O CDV tambm foi associado com mortalidade de lees e hienas em uma reserva natural da Tanznia, e tem sido esporadicamente isolado de doena em mos-peladas (racoons), feldeos e outros animais silvestres de vida livre ou de zoolgicos. Um estudo retrospectivo demonstrou antgenos do CDV em amostras de, aproximadamente, 50% dos lees e tigres que morreram entre 1972 e 1992 em zoolgicos da Sua. O vrus da inuenza A de aves (H5N1), provavelmente por meio de mutaes sucessivas e adaptao gradativa, tornou-se virulento para aves domsticas e silvestres e infeccioso para humanos, causando centenas de mortes na sia a partir de 1997. Durante esse surto, dois tigres e dois leopardos de zoolgicos da Tailndia foram infectados com o H5N1 e morreram. A reemergncia do H5N1 a partir de 2004 tem resultado em uma disseminao maior, atingindo aves silvestres e domsticas e pessoas de pases da sia, Oriente Mdio e Leste Europeu. Esse vrus est sendo considerado o candidato mais provvel e temido a causar uma pandemia de gripe na populao humana nos prximos anos. provvel que o surgimento e ressurgimento de enfermidades vricas continuem a ocorrer com o decorrer do tempo em razo de alteraes ecolgico-ambientais, modernizao de sistemas de manejo, produo e reproduo e tambm por causa da evoluo natural (mutao + seleo) desses agentes. O exemplo mais recente foi a transmisso de um vrus da inuenza (H3N8) de eqinos para ces nos Estados Unidos em 2004. Relatos iniciais indicaram que o novo vrus est se disseminando ecientemente da populao de ces de carreira naquele pas. A recente transmisso do vrus da inuenza para feldeos domsticos (gatos) e selvagens cativos (tigres e leopardos) tambm se constituiu em um evento inusitado. Para vrios vrus, a linha que delimita o seu espectro de hospedeiros parece ser mais epidemiolgica do que biolgica, ou seja, a restrio de alguns agentes aos seus hospedeiros naturais ocorreria mais por falta de oportunidade de
293
CRUZ, M.H. et al. Caracterizacion de la problacion animal. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa. 1979. p.72. DINTER, Z.; MOREIN, B. Virus infections of ruminants. New York, NY: Elsevier Science, 1990. 386p. DOHOO, I.; MARTIN, W.; STRYHN, H. Veterinary epidemiologic research. Charlottetown, P.E.I.: AVC, 2003. 706p. FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM, 2000. 804p. HALPIN, K. et al. Newly discovered viruses of ying foxes. Veterinary Microbiology, v.68, p.83-87, 1990. HAYES, E.B. et al. Epidemiology and transmission of West Nile virus disease. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1167-1173, 2005. HUI, E. K-W. Reasons for the increase in emerging and reemerging viral infectious diseases. Microbes and Infection, v.8, p.905-916, 2006. JONES, C. Herpes simplex virus type 1 and bovine herpesvirus 1 latency. Clinical Microbiology Reviews, v.16, p.79-95, 2003. KRUSE, H.; KIRKEMO, A-M; HANDELAND, K. Wildlife as source of zoonotic infections. Emerging Infectious Diseases, v.10, p. 2067-2072, 2004. MARTIN, S.W.; MEEK, A.H.; WILLEBERG, P. Veterinary epidemiology: principles and methods. Ames, Iowa: The Iowa State University Press, 1987. 343p. MIMS, C.A. Vertical transmission of viruses. Microbiological reviews, v.45, p. 267-286, 1981. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3. ed. San Diego, CA: Academic, 1999. 629p. OSTLUND, E.N. The equine herpesvirus. Veterinary Clinics of North America: Equine Practice, v.9, p. 283-294, 1993. PARRISH, C.R. Host range relationships and the evolution of canine parvovirus. Veterinary Microbiology, v.69, p.29-40, 1999. PENSAERT, M.B. Virus infections of porcines. Amsterdam: Elsevier, 1989. 283p. PETERSON, A.T.; BAUER, J.T.; MILLS, J.N. Ecologic and geographic distribution of lovirus disease. Emerging Infectious Diseases, v.10, p.40-47, 2004. PLAGEMANN, P.G. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: origin hypothesis. Emerging Infectious Diseases, v.9, p.903-908, 2003. POOM, L.L.M. et al. Isolation and characterization of a novel coronavirus in bats. Journal of Virology, v.79, p. 2001-2009, 2005.
transmisso do que pela sua incapacidade de infectar outras espcies. Nesses casos, a barreira interespcies seria circunstancial e tnue e, por isso, potencialmente temporria. Exemplos de agentes virais que ultrapassam a barreira entre espcies e se tornam capazes de infectar novos hospedeiros tm sido cada vez mais freqentes. Nesse sentido, acredita-se que mais de 70% das viroses emergentes em humanos teve origem zoontica, tendo sido adquirida de animais em um passado mais ou menos recente. De especial interesse para a sade humana e animal a imensurvel gama de agentes infecciosos existentes em animais silvestres. A histria recente tem demonstrado que essa gama freqentemente contempla populaes humanas e de animais domsticos com novos vrus potencialmente patognicos.
ANDERSON, R.M.; MAY, R.M. Vaccination and herd immunity to infectious diseases. Nature, v.318, p.323-325, 1985. ASTUDILLO, V.M. Encuestos por muestreo para estudios epidemiologicos en poblaciones animales. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa. 1979. 60p. ASTUDILLO, V.M. et al. Caracterizacion de los ecosistemas de la ebre aftosa. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa, 1985. 91p. ATWELL, J.K. Veterinary services in emergencies: epizootic and zoonotic diseases. Journal of American Veterinary Medical Association, v.190, p.709-713, 1987. BAKER J.C. Clinical aspects of bovine virus diarrhoea infection. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.9, p.25-41, 1990. BARRET, T. Morbillivirus infections, with special emphasis on morbilliviruses of carnivores. Veterinary Microbiology, v.69, p.3-13, 1999. BINGHAM, J. Canine rabies ecology in Southern Africa. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1337-1341, 2005. CRTEZ, J.A. Epidemiologia: conceitos fundamentais. So Paulo: Varela, 1993. 227p. e princpios
COYNE, M.J.; SMITH, G.; McALLISTER, F.E. Mathematical model for the population biology of rabies in raccon in the midAtlantic states. American Journal of Veterinary Research, v.50, p.2148-2153, 1989. CRAWFORD, P.C. et al. Transmission of equine inuenza virus to dogs. Science, v.310, p. 482-485, 2005.
294
RICO-HESSE, R. et al. Emergence of a new epidemic/epizootic Venezuelan equine encephalitis virus in South America. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.92, p.5278-5281, 1995. RIJKS, J.M. et al. Phocine distemper outbreak, the Netherlands, 2002. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1945-1948, 2005. ROJAS, R.A. Epidemiologia. Buenos Aires: Intermdica, 1974, 190p. SCHUNRRENBERGER, P.R.; HUBBERT, W.T. An outline of the zoonoses. Ames, Iowa: The Iowa Sate University Press, 1981. 158p. SCHWABE, C.W. Veterinary medicine and human health. 3. ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1984. 679p. SCHWABE, C.W.; RIEMANN, H.P.; FRANTI, C.E. Epidemiology in veterinary practice. Philadelphia: Lea & Febiger, 1977. 303p. SMITH, R.D. Veterinary clinical epidemiology: a problemoriented approach. 2. ed. Boca Raton, FL: CRC, 1995. SPICKLER, A.R.; ROTH, J.A. Emerging and exotic diseases of animals. 2. ed. Ames: IA: Institute for International Cooperation in Animal Biologics, Iowa State University College of Veterinary Medicine, 2004. 182p. STETTLER, M. et al. Determinants of persistence in canine distemper viruses. Veterinary Microbiology, v.57, p.83-93, 1997. STUDDERT, M.J. Virus infections of equines (virus infections of vertebrates s.). Amsterdam: Elsevier Science, 1996. 380p. THURSFIELD, M.V. Veterinary Butterworth, 1986. 280p.
Captulo 10
epidemiology.
London:
TIMONEY, P.J. Arteritis viral eqina. International Veterinary Information Service, 2003. Disponvel em: < http://www.ivivs. org/special_book/lekeux/timoney/chapter_frm.asp?LA=1>. Acesso em: 20 mar. 2005. TORRES-VELEZ, F; BROWN, C. Emerging infections in animals: potential new zoonoses? Clinics in Laboratory Medicine, v.24, p.825-838, 2004. TRUYEN, U. et al. There is nothing permanent except change. The emergence of new virus diseases. Veterinary Microbiology, v.43, p.103-122, 1995. VAN DER MEULEN, K.M.; PENSAERT, M.B.; NAUWYNCK, H.J. West Nile virus in the vertebrate world. Archives of Virology, v.150, p.637-657, 2005. WEAVER, S. C. et al. Genetic evidence for the origins of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IAB outbreaks. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.60, p.441-8, 1999. WEBSTER, R.G. et al. H5N1 outbreaks and enzootic inuenza. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.3-8, 2006. WOLFE, N.D. Bushmeat hunting, deforestation and prediction of zoonotic disease emergence. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1822-1827, 2005. WOOLHOUSE, M.E.; GOWTAGE-SEQUERIA, S. Host range and emerging and reemerging pathogens. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1842-1847, 2005.
DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS INFECES VRICAS

11
297 298 299 299
302 302 304 308 309 311 314 316 316 317 318 319 320 320 320
1 Introduo 2 Aplicaes do diagnstico virolgico 3 Propriedades das tcnicas diagnsticas 4 Mtodos de diagnstico
4.1 Mtodos diretos 4.1.1 Microscopia eletrnica 4.1.2 Isolamento e identicao 4.1.3 Hemaglutinao e inibio da hemaglutinao 4.1.4 Deteco de antgenos 4.1.5 Deteco de cidos nuclicos 4.2 Mtodos indiretos diagnstico sorolgico 4.2.1 Imunodifuso em gar 4.2.2 Soro-neutralizao 4.2.3 Inibio da hemaglutinao 4.2.4 ELISA 4.2.5 Imunouorescncia/imunoperoxidase 4.2.6 Imunoblots 4.2.7 Fixao do complemento 4.2.8 Outras tcnicas sorolgicas
5 Coleta e remessa de material

5.1 Eleio do material a ser coletado 5.2 Cuidados na coleta e acondicionamento 5.3 Conservao e remessa 5.4 Histrico 5.5 Fluxograma dos procedimentos de diagnstico 5.6 Processamento das amostras 5.7 Interpretao dos resultados
320
321 321 322 323 323 325 325
326
1 Introduo
A elaborao do diagnstico laboratorial das infeces vricas animais depende de aes coordenadas do veterinrio de campo e dos tcnicos de laboratrio. Os resultados dos testes laboratoriais, isoladamente, possuem pouco signicado se no forem interpretados luz de conhecimentos de epidemiologia, patogenia e imunologia das doenas. Por isso, o diagnstico laboratorial contribui com uma parte das informaes necessrias soluo do problema sanitrio sob investigao. A outra parte, necessariamente, deve ser provida pelos tcnicos encarregados da investigao clnico-patolgica e epidemiolgica; e da coleta e remessa do material. A coleta e acondicionamento adequados do material a ser examinado so crticos para o sucesso do diagnstico laboratorial. Se as tcnicas laboratoriais j apresentam diculdades intrnsecas, a sua realizao com material em condies imprprias diculta a realizao das tcnicas e reduz a probabilidade de obter o diagnstico correto. Por essa razo, amostras cuja coleta e acondicionamento tenham sido inadequados possuem um valor limitado para a realizao do diagnstico. O material para exame deve ser acompanhado de um histrico clnico e epidemiolgico detalhado. O histrico importante para a formulao de hipteses sobre os possveis determinantes da doena e para o planejamento e direcionamento das tcnicas e reagentes a serem empregados. Ou seja, grande parte da estratgia laboratorial de diagnstico depende das informaes que acompanham a amostra. A elaborao do diagnstico pode ser comparada com a montagem de um quebra-cabea. As informaes clnicas, patolgicas e epidemiolgicas colhidas a campo se constituem em parte das peas; e as informaes obtidas com a realizao das tcnicas laboratoriais representam as peas restantes. Essa analogia ilustra bem a importncia dos diferentes componentes do intrincado complexo de informaes necessrias para a elucidao dos fatores que levam ocorrncia das doenas.
O nmero de agentes virais que causam doenas de importncia sanitria e econmica em animais muito grande. Isso torna virtualmente impossvel que um nico laboratrio disponha de tcnicas, reagentes e pessoal capacitado para o diagnstico de todas as viroses. Por isso, existe uma tendncia de laboratrios se especializarem em viroses de determinadas espcies animais. Esse direcionamento , em grande parte, determinado pela demanda de servios na sua regio de abrangncia. Durante a realizao do diagnstico, deve-se considerar que agentes diferentes podem causar doenas semelhantes e que a elaborao do diagnstico deve, necessariamente, considerar outros patgenos, tais como: bactrias, fungos e protozorios. Por isso, o encaminhamento do material para exame deve contemplar tambm as outras reas da microbiologia. Embora as tcnicas clssicas de diagnstico virolgico (isolamento, microscopia eletrnica) continuem sendo utilizadas, a crescente demanda por diagnstico em nvel populacional tem impulsionado o desenvolvimento de tcnicas rpidas, sensveis e automatizveis. O diagnstico de um evento de doena determina, muitas vezes, as medidas de controle a serem adotadas. Nesses casos, a rapidez na obteno dos resultados pode ser crtica para o sucesso da estratgia escolhida. O desenvolvimento de kits diagnsticos para uso em clnicas e consultrios de pequenos animais tem auxiliado a difundir e popularizar o diagnstico virolgico como uma prtica necessria para um adequado direcionamento da conduta do mdico veterinrio. Da mesma forma, tcnicas de baixo custo e que podem ser automatizadas para uso em animais de interesse econmico tm sido incorporadas ao arsenal de tcnicas j disponveis. As tcnicas moleculares tambm tm contribudo para a realizao de diagnsticos mais rpidos, seguros e conveis, embora a utilizao dessas tcnicas ainda no esteja amplamente difundida. A seguir sero abordados os aspectos gerais do diagnstico laboratorial de infeces vricas, com enfoque para a aplicao das tcnicas com
298
Captulo 11
ns diagnsticos. A descrio detalhada das tcnicas aqui abordadas foi apresentada no Captulo 3, e a sua aplicao no diagnstico individual das doenas ser abordada nos captulos especcos.
2 Aplicaes do diagnstico virolgico

O diagnstico laboratorial de infeces vricas possui aplicaes muito mais amplas e abrangentes do que a de suporte investigao clnica. Mesmo em enfermidades que possam ser diagnosticadas clinicamente e/ou com auxlio da histopatologia, a conrmao da etiologia por mtodos virolgicos e/ou sorolgicos recomendvel e, em muitos casos, imprescindvel. A investigao clnica e epidemiolgica de eventos de doena em indivduos ou em populaes freqentemente requer a complementao ou conrmao por tcnicas laboratoriais. As variaes na apresentao clnica das viroses, a ocorrncia de sndromes distintas associadas com o mesmo agente ou, ainda, a ocorrncia de manifestaes clnicas semelhantes produzidas por diferentes vrus, fazem dos testes laboratoriais importantes recursos auxiliares ao diagnstico clnico. Alm disso, as infeces vricas freqentemente cursam sem sinais clnicos perceptveis ou com sinais inespeccos, tornando a conrmao laboratorial um requisito essencial para o seu diagnstico. Criaes em diferentes nveis (propriedades, regies, pases e continentes) tm empregado esforos para erradicar e/ou evitar a introduo de doenas vricas de importncia sanitria estratgica, como a febre aftosa, peste suna clssica e africana, doena de Aujeszky, inuenza aviria, entre outras. Nesses casos, a existncia de um sistema integrado e gil de monitoramento, capaz de detectar e identicar esses agentes rapidamente, constitui-se em uma ferramenta essencial para a manuteno da condio sanitria dessas criaes. As zoonoses vricas, como a raiva, inuenza H5N1, hantavirose, febres hemorrgicas, febre amarela, encefalomielites eqinas, doena do Nilo Ocidental, entre outras, possuem grande importncia em sade pblica, o que justica a manuteno de sistemas integrados e contnuos de vigilncia
e diagnstico nas regies endmicas ou de risco. O monitoramento constante da evoluo gentica dos vrus da inuenza, que infectam aves aquticas e migratrias, tem fornecido informaes importantes sobre o potencial zoontico desses vrus e tambm tem direcionado a elaborao de vacinas e a adoo de medidas preventivas. O acompanhamento da histria natural de outros vrus zoonticos, como o coronavrus causador da SARS, o vrus ebola e os paramixovrus Nipah, Menangle e Hendra tambm se baseia na disponibilidade de mtodos virolgicos de diagnstico. A comercializao, especialmente internacional, de animais de interesse econmico geralmente requer a certicao de que esses animais so livres de infeces persistentes ou latentes, como as infeces pelo vrus da leucose bovina (BLV), herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1), vrus da lngua azul (BTV), vrus da doena de Aujeszky (PRV), vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), entre outras. O mesmo ocorre com animais enviados a feiras, exposies, centrais de coleta de smen e hipdromos. Em reas endmicas, o mais comum que as propriedades que comercializem reprodutores erradiquem essas infeces e obtenham a certicao ocial. Para isso, necessrio um sistema de diagnstico efetivo, capaz de identicar os animais infectados e certicar as propriedades ou reas livres do agente. Da mesma forma, os reprodutores e/ou smen destinados comercializao devem ser testados e certicados livres de determinados agentes. Em infeces por retrovrus (BLV, EIAV, vrus da artrite e encefalite caprina [CAEV]) e por herpesvrus (BoHV-1/5, PRV), entre outras, possvel reduzir gradativamente a prevalncia da infeco e, eventualmente, erradicar o agente atravs de programas de identicao e remoo dos animais soropositivos. Para isso, necessrio um sistema efetivo e sistemtico de diagnstico, aliado a polticas pblicas ou privadas que viabilizem o descarte dos animais e a indenizao dos proprietrios, medidas freqentemente adotadas nesses programas. O estabelecimento de programas de sanidade animal depende do conhecimento das enfermidades prevalentes em uma determinada regio. Portanto, estudos epidemiolgicos para
Diagnstico laboratorial das infeces vricas
299
determinar a ocorrncia, prevalncia e distribuio de enfermidades vricas especcas so freqentemente realizados e utilizam testes diagnsticos, principalmente testes sorolgicos. A deciso de se adotar medidas de controle e/ou erradicao de doenas vricas depende do conhecimento prvio sobre a situao da respectiva infeco na populao. Este conhecimento pode ser obtido por estudos soro-epidemiolgicos que fazem parte de um estudo descritivo inicial, denominado diagnstico de situao. A tomada de decises, a natureza das medidas adotadas e avaliaes peridicas do andamento e sucesso de programas de controle tambm dependem dos resultados obtidos em testes diagnsticos. As aplicaes do diagnstico virolgico laboratorial so amplas e abrangentes e contemplam desde investigaes clnicas em nvel individual at programas de controle e erradicao de doenas em nvel nacional ou continental. Por essa razo, as tcnicas de diagnstico esto sob contnuo aperfeioamento para contemplar os diferentes graus de exigncia. Novas tcnicas e variaes de tcnicas j existentes so relatadas continuamente em publicaes especializadas e muitas delas acabam sendo incorporadas ao arsenal de tcnicas disponveis para o diagnstico de viroses animais.
da tcnica de identicar um determinado vrus e, simultaneamente, distingui-lo de outros agentes, mesmo que sejam muito semelhantes. A rapidez de obteno do diagnstico essencial, pois, muitas vezes, o resultado determina as medidas a serem adotadas. A conabilidade de qualquer teste diagnstico depende tambm da sua repetibilidade (ou reprodutibilidade), ou seja, da consistncia dos resultados obtidos pela repetio de sua execuo. Para possurem utilizao na rotina, as tcnicas devem tambm ser simples e prticas de executar, de preferncia automatizveis para possibilitar o teste simultneo de um grande nmero de amostras. Alm disso, devem apresentar um custo baixo, sobretudo, para o diagnstico de enfermidades de animais de interesse econmico e, quando necessrio, o teste de um nmero grande de amostras.
Praticidade Custo baixo Simplicidade
Sensibilidade
Tcnica diagnstica
Repetibilidade
Especificidade
Rapidez Capacidade de Automatizao
3 Propriedades das tcnicas diagnsticas

A aplicao de uma determinada tcnica laboratorial em diagnstico requer o preenchimento de alguns requisitos bsicos. A tcnica deve possuir predicados como sensibilidade, especicidade, rapidez, simplicidade (ou praticidade), reprodutibilidade, automatizao e custo baixo (Figura 11.1). Sensibilidade refere-se capacidade da tcnica de detectar quantidades mnimas do agente ou de seus produtos. Como freqentemente a quantidade de vrus (ou antgenos) presente nas amostras clnicas muito pequena, as tcnicas devem ser sucientemente sensveis para detect-los. Em nvel populacional, a sensibilidade se refere capacidade de deteco de um nmero maior ou menor dos indivduos que so realmente positivos. Especicidade refere-se capacidade
Figura 11.1. Propriedades desejveis nos testes diagnsticos.
4 Mtodos de diagnstico
Os mtodos de diagnstico virolgico podem ser classicados em diretos e indiretos. Os mtodos diretos so utilizados para detectar o vrus, antgenos ou cidos nuclicos virais. A deteco pode ser realizada diretamente em amostras clnicas ou aps a multiplicao do agente em cultivos celulares, ovos embrionados ou animais susceptveis. Os mtodos indiretos detectam anticorpos especcos contra o vrus, isto , detectam a resposta do hospedeiro infeco e, por isso, a sua denominao.
300
Captulo 11
Dentre as tcnicas diretas, destaca-se a microscopia eletrnica (ME) que permite a visualizao de partculas vricas diretamente no material clnico ou aps a multiplicao do agente em cultivo celular. Esse mtodo rpido e permite a identicao de partculas vricas viveis e tambm inviveis. No entanto, a tcnica exige equipamento caro e pessoal altamente treinado, aplicvel somente a alguns vrus e no possui boa sensibilidade. O isolamento em cultivo celular (ICC) permanece sendo o mtodo mais utilizado para investigar a presena de vrus em material clnico. Aps a multiplicao em clulas de cultivo, o vrus pode ser identicado pela produo de efeito citoptico (ECP) caracterstico ou pela deteco de antgenos ou cidos nuclicos nas clulas infectadas, ou, ainda, por neutralizao com soro imune especco. O ICC um dos mtodos mais sensveis de deteco de vrus, porm a demora na obteno dos resultados se constitui na sua principal restrio em relao a outros mtodos. Uma das vantagens do mtodo a obteno do vrus vivel, o que permite a sua caracterizao e estudos posteriores. A inoculao de ovos embrionados (OE) ou de animais susceptveis j foi amplamente utilizada para o diagnstico e deteco de vrus. No entanto, atualmente esse mtodo possui aplicao restrita a poucos vrus e a algumas situaes especcas. Mtodos que se utilizam da capacidade hemaglutinante (hemaglutinao) ou hemadsorvente (hemadsoro) de alguns vrus tambm tm sido utilizados em diagnstico virolgico, porm so aplicveis somente a um grupo restrito de agentes. A deteco de antgenos virais pelo uso de anticorpos especcos um dos mtodos mais utilizados para a deteco e identicao de vrus. A deteco pode ser realizada em amostras clnicas (secrees, smen, sangue, urina, fezes etc.), tecidos (obtidos por bipsia ou necropsia) ou em clulas de cultivo aps a multiplicao do agente. As tcnicas de imunouorescncia (IFA) e imunoperoxidase (IPX) tm sido amplamente utilizadas em diagnstico, sobretudo, pela boa sensibilidade, especicidade, rapidez, custo baixo e facilidade de execuo. O desenvolvimento de kits
diagnsticos para uso em consultrios, clnicas veterinrias ou mesmo a campo popularizaram essas tcnicas e ampliaram o seu uso. A deteco de antgenos atravs de mtodos imunoenzimticos (ELISA), imunocromatogrcos e imunoblot (Western/dot blot) tambm tem se popularizado ultimamente e somaram-se IFA e IPX como tcnicas importantes de diagnstico. Nas ltimas dcadas, o desenvolvimento de tcnicas moleculares contribuiu de forma notvel para o diagnstico de enfermidades infecciosas. Tcnicas de deteco de cidos nuclicos atravs de hibridizao (Southern, Northern, dot/slot blot) e reao da polimerase em cadeia (PCR) so muito sensveis e especcas, permitindo uma identicao rpida e segura do cido nuclico viral em amostras clnicas. A substituio dos istopos radioativos por substncias no-radioativas para a marcao das sondas moleculares tambm contribuiu para a popularizao e difuso dessas tcnicas. A adaptao da PCR para o diagnstico rpido a campo (PCR em tempo real) ampliou as perspectivas para o diagnstico aplicado investigao de infeces vricas de importncia sanitria estratgica. Os mtodos diretos de diagnstico virolgico esto apresentados na Figura 11.2
Microscopia eletrnica
Tecidos Secrees Excrees
Isolamento e identificao
Pesquisa de antgenos Hemaglutinao
Pesquisa de cidos nuclicos
Figura 11.2. Mtodos de deteco de vrus ou produtos virais em amostras clnicas.
A deteco de anticorpos antivirais no soro ou em secrees (leite, colostro) tambm amplamente utilizada em tcnicas de diagnstico. Esse procedimento se constitui em mtodo indireto, pois detecta os produtos da reao do organismo animal contra o agente. As tcnicas de deteco de anticorpos, tambm chamadas de testes sorolgicos, possuem aplicao ampla em estudos epi-
301
demiolgicos, sobretudo, quando o objetivo a determinao da prevalncia e distribuio de infeces vricas em populaes. Dentre as tcnicas sorolgicas, destacam-se a imunodifuso em gel de gar (IDGA), ELISA, soroneutralizao (SN), xao do complemento (FC) e inibio da hemaglutinao (HI). O signicado da sorologia para o diagnstico varia de acordo com a biologia de cada vrus. Por isso, os resultados dos exames sorolgicos
devem ser interpretados luz dos conhecimentos sobre a biologia e epidemiologia do agente e da resposta imunolgica do hospedeiro. Detalhes sobre a interpretao dos resultados de exames sorolgicos para diferentes vrus sero abordados na seo 4.2. Os principais mtodos diretos e indiretos de diagnstico, com o seu princpio, propriedades, restries e aplicaes esto apresentados nas Tabelas 11.1 e 11.2, respectivamente.
Tabela 11.1. Princpios, propriedades e restries dos principais mtodos diretos de diagnstico virolgico Mtodo
Microscopia eletrnica
Princpio
Visualizao das partculas vricas coradas com metais pesados em um microscpio
Propriedades
Rpida (poucas horas); Detecta vrions viveis e inviveis; til para vrus que no replicam em cultivo; Pode permitir a identificao do agente. Sensvel; O agente fica disponvel para estudos posteriores; Implementao e execuo relativamente simples.
Restries
Equipamento caro; Exige pessoal treinado; Baixa sensibilidade; Aplicao restrita a alguns vrus.
Aplicaes
Infeces entricas (rotavrus, coronavrus, astrovrus); Infeces cutneas (poxvrus, herpesvrus).
Isolamento em cultivo celular
Observao do efeito citoptico e/ou deteco de produtos virais aps a sua multiplicao em clulas de cultivo.
Demorado (at semanas); No aplicvel a alguns vrus; Somente detecta vrus que estejam viveis; Contaminao bacteriana e fngica; Contaminao com vrus adventcios. Aplicvel ao um grupo restrito de vrus; Hemaglutinao inespecfica; Necessidade de espcies doadoras de hemcias; No automatizvel. Equipamento caro (IFA); Reaes inespecficas (uso de anticorpos policlonais); Reagentes para alguns vrus podem no ser disponveis.
Todos os vrus que replicam em cultivos celulares; Qualquer material clnico pode ser submetido ao isolamento.
Hemaglutinao (HA)
Observao da capacidade do vrus de aglutinar eritrcitos.
Rpida; Boa sensibilidade; Boa especificidade; Fcil execuo.
Aplicvel aos vrus hemaglutinantes de aves e mamferos (ver tabela no captulo 3); Fluidos corporais, suspenses de tecidos.
Imunofluorescncia (IFA). Imunoperoxidase (IPX).
Protenas virais so detectadas por anticorpos especficos conjugados com um marcador fluorescente (IFA) ou com uma enzima (IPX).
Rpida (minutos ou poucas horas); Simples, baixo custo; Boa sensibilidade e especificidade; Detecta tambm vrus invivel; Pode informar sobre sorotipos; Disponvel em kits; Aplicvel a virtualmente todos os vrus. Simples e prtica; Disponvel em kits; Rpida; Boa sensibilidade e especificidade.
Aplicvel a qualquer vrus para o qual se disponha de anticorpos especficos; Materiais: tecidos (frescos, congelados, fixados), esfregaos (sangneos, de secrees), clulas de cultivo.
A presena do antgeno Testes imunoenzimticos/cromatogr que reage com o anticorpo especfico ficos imobilizado ou aps migrao, revelada pela mudana de cor.
No automatizvel; Especificidade e sensibilidade podem deixar a desejar; Custo alto por amostra.
Aplicvel a vrios vrus de pequenos animais; Kits disponveis para uso em clnicas; Tambm para alguns vrus de aves, sunos e bovinos.
Deteco de cidos nuclicos (PCR, hibridizao).
cidos nuclicos (RNA, DNA) do vrus so detectados por sondas marcadas (hibridizao) ou aps amplificao por reaes enzimticas (PCR).
Especfica; Sensvel; Necessita quantidades mnimas da amostra; Potencialmente aplicvel a todos os vrus; Rpida (PCR); Automatizvel (PCR).
Custo alto; Requer equipamento e pessoal treinado; Tcnica sofisticada.
Aplicvel a virtualmente todos os vrus conhecidos; Pode ser realizada em qualquer amostra clnica.
302
Captulo 11
Tabela 11.2. Princpios, propriedades e restries dos principais mtodos indiretos de diagnstico virolgico Mtodo
Imunodifuso em gar (IDGA)
Princpio
Observao de linhas de precipitao no gar, produzidas pela formao de complexos antgenoanticorpos.
Propriedades
Simples execuo e implementao; Custo baixo; Sensibilidade razovel; Resultados em 24-72 h.
Restries
Reaes inespecficas freqentes; Sensibilidade limitada; Qualidade do antgeno crtica; Somente qualitativa (no permite a quantificao dos anticorpos). Exige cultivos celulares; Implementao/execuo podem ser problemticas; Contaminao bacteriana; Toxicidade do soro; Detecta somente anticorpos neutralizantes.
Aplicaes
- Anemia infecciosa eqina, lngua azul, leucose enzotica bovina.
Soroneutralizao (SN)
Anticorpos presentes no soro previnem a replicao do vrus e a produo de efeito citoptico nos cultivos.
Sensvel; Especfica; Custo reduzido; Qualitativa (sim/no) e quantitativa (ttulo de anticorpos); Similar neutralizao in vivo. Rpida (2-3 h); Sensvel; Especfica; Automatizvel; Disponvel em kits; Pode detectar classes especficas (IgG, IgM etc.).
Virtualmente todos os vrus que replicam em cultivo celular.
ELISA
Anticorpos presentes no soro ligam-se aos antgenos imobilizados em placas de poliestireno e so detectados por anti-anticorpos conjugados com enzimas.
Requer equipamento; Kits comerciais podem ter custo alto; No disponvel para todos os vrus; Qualidade do antgeno crtica.
Utilizada para inmeros vrus; Pode ser qualitativa e quantitativa; Utilizada para detectar anticorpos totais ou classes especficas no soro ou secrees (leite); Variaes da tcnica so disponveis para a deteco de antgenos. Vrus hemaglutinantes de aves e mamferos (ver tabela captulo 3).
Inibio da hemaglutinao (HI).
Anticorpos antivirais impedem a atividade hemaglutinante do vrus.
Rpida; Sensvel; Especfica; Custo baixo.
Somente aplicvel a vrus hemaglutinantes; Requer animais doadores de eritrcitos; Inibidores inespecficos podem dar falso positivo; No-automatizvel. Demorada; Trabalhosa; No automatizvel; Requer animais doadores de eritrcitos. Reaes inespecficas; Exige microscpio de UV; Pode no detectar nveis baixos de anticorpos; No automatizvel.
Fixao do Complemento.
A presena de anticorpos leva ativao do complemento e lise de eritrcitos.
Boa sensibilidade e especificidade.
J foi muito usada para vrios vrus, atualmente est em desuso.
Imunofluorescncia (IFA) para anticorpos.
Anticorpos presentes no soro se ligam em antgenos especficos imobilizados e so detectados por anticorpos marcados com FITC. A presena do anticorpo que reage com o antgeno revelada pela mudana de cor.
Rpida; Boa sensibilidade; Simples.
J foi usada para vrios vrus; Uso atual restrito a alguns vrus.
Imunocromatografia
Simples e prtica; Disponvel em kits; Rpida; Boa sensibilidade e especificidade.
No automatizvel; Especificidade e sensibilidade podem deixar a desejar; Custo individual alto.
Aplicvel a vrios vrus de pequenos animais; Kits disponveis para uso em clnicas; Tambm para alguns vrus de aves, sunos e bovinos.
4.1 Mtodos diretos 4.1.1 Microscopia eletrnica

A tcnica de microscopia eletrnica (ME) permite a visualizao das partculas vricas em material clnico ou aps a sua amplicao em cultivo celular (Figura 11.3). A simples observao das caractersticas morfolgicas dos vrions
(morfologia, dimetro, estrutura do capsdeo e envelope), aliada com a sua distribuio no material examinado (ncleo ou citoplasma), permite, algumas vezes, a identicao denitiva do agente. Por isso, a ME constitui-se em um dos mtodos mais notveis de diagnstico de infeces vricas. O mtodo particularmente til para infeces entricas (rotavrus, coronavrus,
303
astrovrus), cutneas (poxvrus, herpesvrus) e tambm para a identicao de vrus de difcil multiplicao em cultivo celular (torovrus, hepadnavrus, circovrus, alguns adenovrus, astrovrus, coronavrus e rotavrus).
O dimetro, a morfologia dos vrions e detalhes da sua superfcie so os aspectos principais observados no diagnstico por ME. Essas caractersticas variam muito entre as famlias de vrus, mas so pouco variveis entre vrus de um mes-
Figura 11.3. Fotos de microscopia eletrnica de material enviado para diagnstico virolgico. A) Bipsia de pele de glndula mamria de vacas com mamilite. Partculas tpicas de herpesvrus (setas) (magnificao 60.000x); B) Clulas de cultivo inoculadas com macerado de crebro de bezerros com doena neurolgica. Partculas vricas envelopadas tpicas de herpesvrus (42.000x); C) Crostas na juno mucocutnea oral de ovinos com doena vesicular-crostosa. Partculas tpicas de parapoxvrus (100.000x). D) Fezes de bezerro com diarria. Partcula de 75-80 nm semelhante a rotavrus (75.000x); E) Fezes de bezerro com diarria. Partcula envelopada com aproximadamente 80 nm, sugestiva de coronavrus (120.000x). E) Sobrenadante de cultivo inoculado com secrees nasais de bezerros com doena respiratria. Partcula envelopada semelhante a herpesvrus (260.000x).
304
Captulo 11
mo gnero ou espcie. No entanto, alguns vrus so de difcil visualizao e deteco atravs da ME, devido a sua morfologia pouco denida (podendo ser confundidos com estruturas celulares) ou pela baixa concentrao de partculas vricas no material. Isso faz com que a ME no possua aplicabilidade universal. Dentre as amostras clnicas mais comumente submetidas ME esto o material fecal (fezes ou contedo intestinal), uidos ou escaras de leses cutneas ou mucosas, tecidos coletados na necropsia, clulas ou sobrenadante de cultivos previamente inoculadas com o material suspeito. A realizao de ME em tecidos de animais infectados tambm pode indicar o local da clula onde ocorre a replicao do vrus, podendo fornecer informaes sobre a patogenia dessas infeces. Quando a concentrao mnima requerida para a visualizao das partculas no atingida (aproximadamente 106 partculas virais por mL de uido ou por grama do material), pode-se realizar a ultracentrifugao do material para concentrar os vrions. O uso de anticorpos especcos conjugados com micropartculas de ouro (tcnica de immunogold) aumenta a probabilidade de deteco e visualizao do agente. Como a ME requer grande quantidade de vrus para poder detect-lo, resultados negativos nessa tcnica no indicam necessariamente a ausncia de vrus na amostra. Dentre as propriedades deste mtodo destacam-se a rapidez de execuo, a possibilidade de reconhecimento da morfologia viral (s vezes, a identicao da famlia e espcie do vrus) e a possibilidade de deteco de vrus viveis e tambm aqueles que eventualmente j estejam inviveis no material submetido. A ME tambm muito til para detectar vrus que no replicam ecientemente em cultivo celular. As maiores restries referem-se a sua baixa sensibilidade, aplicabilidade restrita a alguns vrus, equipamento caro e necessidade de pessoal altamente treinado. A Figura 11.3 apresenta fotograas de ME obtidas pelo exame de amostras clnicas e cultivos celulares inoculados com o material suspeito.
o de vrus, aps o seu isolamento em cultivo celular, continua sendo o mtodo direto mais
utilizado em diagnstico virolgico. Tambm o mtodo mais fascinante utilizado em Virologia, pois permite a obteno do agente vivel para estudos posteriores. O isolamento em ovos
embrionados somente aplicvel para alguns vrus; j o isolamento em animais de laboratrio encontra-se atualmente em desuso e possui aplicao muito restrita.
4.1.2.1 Isolamento em cultivo celular

Como os vrions freqentemente esto presentes em pequenas quantidades no material clnico, a inoculao em clulas susceptveis permite a sua multiplicao para posterior identicao. Alm do uso em diagnstico, a multiplicao de vrus em cultivos celulares muito utilizada com diversas nalidades em laboratrios de virologia, ou seja, os cultivos celulares so instrumentos indispensveis prtica virolgica. A maior restrio para a utilizao do isolamento com ns diagnsticos o tempo necessrio para se obter o resultado nal pode levar at semanas. O ICC aplicvel a maioria dos vrus de interesse veterinrio e possui boa sensibilidade. O material suspeito inoculado em clulas animais cultivadas in vitro e a replicao do vrus evidenciada pela produo de efeito citoptico (ECP) ou pela deteco de protenas ou cidos nuclicos virais nas clulas inoculadas. O material enviado ao laboratrio deve ser acompanhado de um histrico clnico que permita a formulao de hipteses sobre os vrus suspeitos. Isto facilita a tomada de deciso com relao ao tipo de clula e da tcnica utilizada para a identicao, por exemplo, em casos de doena respiratria de bovinos, quatro agentes virais esto associados com maior freqncia: BoHV-1, vrus da diarria viral bovina (BVDV), vrus da parainuenza 3 (bPI-3) e vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV). Portanto, o procedimento a ser adotado dever ser direcionado para a deteco desses agentes. O material dever ser inoculado em cultivos celulares que sejam susceptveis aos quatro agentes para que, se algum deles esti-
4.1.2 Isolamento e identicao

Apesar do desenvolvimento de tcnicas modernas e sosticadas de diagnstico, a identica-
305
ver presente no material, possa se multiplicar e ser identicado. A escolha das clulas crtica para o sucesso do procedimento. Em geral, clulas primrias so mais sensveis para o isolamento do que linhagens celulares. Apesar disso, muitos laboratrios utilizam linhagens celulares pela facilidade de manuteno e multiplicao mais eciente. Como regra, deve-se preferir clulas da espcie animal de origem do material. Amostras oriundas de bovinos devem ser inoculadas em clulas de origem bovina, e assim por diante. Alguns vrus so estritamente espcie-especcos e somente se multiplicam em clulas da espcie homloga; outros so capazes de replicar em clulas de diferentes espcies (o BVDV, por exemplo, replica em clulas de bovinos, ovinos, sunos, carnvoros, primatas etc.). Poucos vrus se multiplicam bem somente em clulas de outras espcies. O vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) replica ecientemente em clulas da linhagem MARC-145, de origem primata; os herpesvrus eqinos so amplicados nas linhagens VERO (de primatas) e RK-13 (coelho); os vrus da inuenza de eqinos e humanos se multiplicam bem na linhagem MDCK (canina). Esses exemplos representam excees. As clulas utilizadas para o isolamento e multiplicao dos principais vrus animais e o ECP produzido por esses vrus esto apresentados na Tabela 3.3 (Captulo 3). Os materiais mais freqentemente enviados para a deteco de vrus so fragmentos de tecidos (coletados em necropsias ou de fetos abortados), secrees (leite, secrees nasais, vaginais, prepuciais, smen), fezes, contedo intestinal ou uterino, lquido de vesculas, soro e sangue integral. Previamente inoculao, cada material submetido a um determinado procedimento, que pode incluir macerao e homogeneizao (tecidos); centrifugao para a remoo de sujidades (secrees) ou para a separao dos leuccitos (sangue integral); ou ltrao para a remoo de bactrias e outros contaminantes (fezes, contedo intestinal). Os cultivos celulares so inoculados com o material suspeito e devem ser monitorados diariamente para o aparecimento de alteraes morfolgicas que caracterizam o ECP. O no aparecimento de ECP ao nal de 4 a 5 dias deve
ser seguido da reinoculao do sobrenadante do cultivo em cultivos frescos (subcultivados 18 a 24 h antes). Cada etapa de inoculao e monitoramento, que leva entre 4 e 5 dias, denominada passagem. Para alguns vrus, previamente reinoculao, recomenda-se proceder trs ciclos de congelamento e descongelamento rpido do material, para provocar a ruptura das clulas e a liberao dos vrions intracelulares. O material , ento, centrifugado baixa rotao, o sedimento desprezado e o sobrenadante inoculado em um novo cultivo. A maioria dos protocolos recomenda a realizao de trs passagens antes de considerar o material negativo. A necessidade da realizao dessas passagens explicada pelo fato de que alguns vrus de campo replicam lentamente em cultivo. Alm disso, a quantidade de vrus vivel no material original pode ser muito pequena, sendo necessria uma amplicao substancial que permita a visualizao do ECP. A replicao da maioria dos vrus animais em cultivo celular produz ECP caracterstico do seu gnero ou espcie. Esses vrus so denominados citopticos (ou citopatognicos, CP). Por isso, com freqncia, possvel identicar o agente viral pelo tipo de ECP produzido, aliado com o histrico clnico-patolgico. Os ECPs produzidos pelos principais vrus animais esto apresentados na Tabela 3.3 (Captulo 3). As caractersticas do ECP podem apresentar variaes entre diferentes isolados do vrus e entre diferentes clulas. Alguns vrus apresentam replicao rpida e produzem ECP bem pronunciado e caracterstico. Outros replicam lentamente e produzem um ECP pouco evidente e nem sempre reconhecvel. Quando no h a produo de ECP, ou quando este no caracterstico, necessria a identicao do agente pelo uso de tcnicas de deteco de antgenos (IFA ou IPX). O agente detectado pela produo de ECP pode tambm ser identicado por neutralizao com anti-soro especco. A identicao de alguns vrus, aps a produo de ECP, pode ser realizada tambm por ME. Uma minoria de vrus no produz citopatologia, sendo denominados no-citopticos (ncp, exemplos: circovrus suno, BVDVncp). Nesses casos, a execuo de tcnicas de deteco de antgeno ou de cidos nuclicos indispensvel para a deteco e identicao do agente.
306
Captulo 11
O isolamento de vrus em cultivo a partir de material clnico apresenta algumas diculdades, como a toxicidade do material e contaminao bacteriana ou fngica. A toxicidade de materiais, como o smen, pode ser reduzida pela sua diluio em meio de cultivo ou em soro fetal bovino (smen); a contaminao das fezes pode ser minimizada pela ltrao ou por centrifugao previamente inoculao, alm do uso de antibiticos e antifngicos no meio de cultivo. Outros fatores que inuenciam o sucesso do ICC so: a coleta, conservao e remessa adequadas do material. Como o mtodo detecta apenas partculas vricas viveis, e, portanto, capazes de replicar em cultivo, determinadas temperaturas, pH e exposio a condies ambientais que sejam prejudiciais viabilidade do agente podem afetar negativamente o teste. O material a ser submetido deve ser mantido sob refrigerao (ou congelado) at a submisso ao laboratrio, para preservar a viabilidade do vrus. As recomendaes para a coleta e remessa de material para diagnstico virolgico encontram-se ao nal deste captulo. O protocolo para o isolamento e identicao de vrus em cultivo celular est ilustrado na Figura 11.4.
4.1.2.2 Isolamento em ovos embrionados

Os tecidos de embries de galinha representam sistemas ideais para a multiplicao de vrios vrus. Por isso, ovos embrionados tm sido utilizados para o isolamento e tambm para o cultivo de alguns vrus de aves e de mamferos. Dependendo do vrus suspeito, o material pode ser inoculado por diversas vias e em diferentes estgios de desenvolvimento do embrio. Aps a inoculao, a viabilidade do embrio monitorada diariamente em um ovoscpio. Em caso de morte, realiza-se a necropsia do embrio busca de alteraes macroscpicas. A identicao do agente pode requerer a realizao de outros testes (hemaglutinao, deteco de antgenos e/ou cidos nuclicos virais) em material coletado do embrio. As principais propriedades desse mtodo so: boa sensibilidade, facilidade de manipulao e custo relativamente baixo. As maiores restries se referem diculdade de obteno de ovos embrionados livres de patgenos, contaminao bacteriana e/ou fngica e impossibilidade de automao. Alm disso, a sua aplicao restrita aos vrus que se multiplicam em embries
Tecidos rgos Secrees Smen Sangue 3 - 5 dias Inoculao Soro Cultivo celular Fezes Processamento (ver texto)
Antgenos virais
Efeito citoptico (ECP)
cidos nuclicos
Figura 11.4. Protocolo para isolamento e identificao de vrus pela inoculao em cultivo celular. As amostras so inicialmente processadas e inoculadas em clulas susceptveis aos vrus suspeitos. Os cultivos so monitorados por alguns dias para o aparecimento de efeito citoptico (ECP). Ao final da terceira passagem do material ou quando aparecer ECP os cultivos so submetidos identificao do agente por tcnicas de deteco de antgeno ou de cidos nuclicos. A presena de vrus no-citopticos deve ser monitorada por IFA ou IPX. Deve-se proceder trs passagens do material antes de consider-lo negativo para vrus.
307
de galinha. Na Tabela 3.2 (Captulo 3), esto listados os vrus que replicam em ovos embrionados, as vias de inoculao e as alteraes produzidas nos embries.
4.1.2.3 Isolamento em animais

Com o advento dos cultivos celulares, a inoculao de animais para o diagnstico de infeces por vrus foi sendo gradativamente substituda. Alm das questes operacionais (custo, espao, diculdade de manuteno de animais com este propsito), o uso de animais tem sido restrito por questes ticas. No entanto, esse mtodo ainda possui aplicao em alguns casos especcos, geralmente associados com outras tcnicas de diagnstico. Em casos suspeitos de raiva, pesquisa-se inicialmente a presena de antgenos em fragmentos de crebro por IFA. Este teste seguido pela inoculao de um macerado do crebro suspeito em camundongos lactentes (6-10 dias de idade), o que constitui a prova biolgica,
permitindo o diagnstico denitivo da enfermidade. Os camundongos so inoculados pela via intracerebral com o material suspeito e monitorados por at 28 dias. A presena do vrus rbico no material resulta no desenvolvimento de doena neurolgica severa e morte entre o 8 e 21 dias aps a inoculao. A conrmao da identidade do agente pode ser realizada por imunouorescncia do crebro dos camundongos que morreram. O protocolo padro para o diagnstico da raiva est ilustrado na Figura 11.5. A encefalite eqina venezuelana (VEE), causada por um alfavrus, alm de infeces neurolgicas causadas por alguns avivrus, tambm pode ser diagnosticadas pela inoculao intracerebral do material suspeito em camundongos lactentes. A inoculao de camundongos tambm realizada em algumas situaes para o diagnstico da febre aftosa. A inoculao de leites tambm tem sido ocasionalmente realizada como teste conrmatrio da presena do PRRSV, do vrus da peste suna clssica (CSFV) e da peste
Prova rpida (1 hora)
Positivo IFD Negativo Resultado
Inoculao intracerebral
Camundongos lactentes
Doena neurolgica Morte Sem manifestaes
Prova biolgica (10-20 dias)
Figura 11.5. Protocolo para o diagnstico de raiva animal. Impresses do crebro do animal suspeito so submetidas imunofluorescncia direta (IFD) para a deteco de antgenos virais. Em caso positivo, o diagnstico comunicado imediatamente. Aps, uma suspenso do crebro macerado inoculada pela via intracerebral em camundogos lactentes, que so observados por at 30 dias. Em casos positivos, os animais apresentam sinais neurolgicos severos e morrem geralmente entre os dias 8 e 20. A ausncia de manifestaes clnicas e morte ao final do perodo indicam que o material negativo para vrus. A prova biolgica deve ser realizada nas amostras que foram positivas na IFD e, principalmente, nas amostras que foram negativas.
308
Captulo 11
suna africana (ASFV). Esse mtodo j foi utilizado para a deteco de vrios vrus, incluindo o BTV, vrus da estomatite vesicular (VSV), poxvrus ovino, entre outros. No entanto, este sistema tem sido gradualmente substitudo por mtodos que no utilizam animais e que produzem resultados equivalentes ou superiores.
4.1.3 Hemaglutinaco e inibio da hemaglutinao

Alguns vrus possuem a capacidade de se ligar a molculas da membrana plasmtica de eritrcitos de determinadas espcies animais e provocar a sua aglutinao. Essa atividade, denominada hemaglutinao (HA), pode ser utilizada como indicador da presena desses vrus em amostras clnicas. A hemaglutinao o resultado da ligao de glicoprotenas da superfcie dos vrions, denominadas genericamente hemaglutininas, com receptores da superfcie dos eritrcitos. Os vrus que possuem essa atividade so chamados de hemaglutinantes. A tcnica de HA tem sido muito utilizada para pesquisar e quanticar vrus em diversos materiais, porm aplicvel somente aos vrus que apresentam essa propriedade biolgica. Essa propriedade tambm utilizada para a pesquisa de anticorpos capazes de inibir a hemaglutinao, na tcnica sorolgica denominada inibio da hemaglutinao (HI). Ao contrrio da reao de HA, que somente revela uma atividade biolgica do vrus, a reao de HI uma prova sorolgica e, dessa forma, pode ser empregada tanto para a identicao do agente como para o diagnstico sorolgico de infeces por esses vrus. O princpio da HI baseiase na capacidade de anticorpos se ligarem nas hemaglutininas virais e inibirem a sua atividade hemaglutinante. A HI realizada com um soro-padro conhecido frente a um material positivo recm-detectado na HA possibilita a identicao do agente. Por exemplo, a deteco de atividade hemaglutinante em lquidos provenientes de fetos sunos abortados indica a presena de vrus. A inibio dessa atividade hemaglutinante com um soro-padro para o parvovrus suno (PPV) indica que o agente presente nos uidos o PPV. Por outro lado, a deteco de anticorpos inibido-
res da hemaglutinao contra um determinado vrus no soro de um animal indica que este j foi exposto ao agente. As tcnicas de HA e HI so realizadas em tubos ou em placas de microtitulao, requerem eritrcitos frescos (galinha, cobaias ou coelhos, dependendo do vrus) e permitem a obteno do resultado em uma a duas horas. Tanto a HA como a HI so tcnicas simples, rpidas e de baixo custo, possuindo boa sensibilidade e especicidade. No entanto, so aplicveis somente aos
+
Amostra suspeita Eritrcitos Incubao 1 hora
Amostra positiva
Amostra negativa
Figura 11.6. Teste de hemaglutinao (HA) para demonstrao de vrus hemaglutinantes em amostras clnicas. A amostra suspeita (fluido corporal ou macerado de tecido) misturada e incubada com uma suspenso de eritrcitos. Na presena do vrus hemaglutinante, os eritrcitos aglutinam-se e se depositam como uma fina camada de contorno irregular no fundo da cavidade. Na ausncia do vrus suspeito, os eritrcitos livres rolam para o fundo da cavidade, formando um boto espesso de contorno bem definido.
309
vrus que possuem atividade hemaglutinante, alm de no serem automatizveis. A HI pode ser relativamente trabalhosa se houver a necessidade de pr-tratamento do soro para a remoo de inibidores inespeccos da hemaglutinao. A diculdade de se obter eritrcitos da espcie indicada tambm pode representar uma restrio ao uso dessas tcnicas na rotina diagnstica. A HA e a HI so utilizadas para os vrus da inuenza e parainuenza, para alguns poxvrus e togavrus, picornavrus, parvovrus, reovrus e adenovrus. Os principais vrus que possuem atividade hemaglutinante e as espcies dos eritrcitos que so aglutinados por esses vrus esto apresentados na Tabela 3.1 (Captulo 3). A Figura 11.6 apresenta uma ilustrao da tcnica de HA.
4.1.4 Deteco de antgenos

A multiplicao dos vrus nos tecidos do hospedeiro resulta na produo de grande quantidade de protenas virais. Uma parte dessas protenas as chamadas protenas estruturais incorporada nas partculas vricas produzidas, mas grande parte delas e tambm as protenas no-estruturais permanecem nas clulas infectadas. Como conseqncia, os tecidos infectados geralmente possuem uma quantidade considervel de antgenos virais. Os uidos corporais (sangue, secrees, excrees) tambm podem conter clulas infectadas e/ou protenas virais solveis. A deteco desses antgenos pelo uso de anticorpos especcos um dos mtodos mais utilizados no diagnstico de infeces vricas. A disponibilidade de anticorpos para virtualmente todos os vrus de interesse veterinrio possibilita a aplicao universal desse mtodo. Alm do uso em diagnstico, as tcnicas de deteco de antgeno possuem uma ampla aplicabilidade em diversas reas da Virologia. A complementaridade qumica entre os anticorpos e determinantes antignicos e exclusivos de cada espcie de vrus confere a especicidade do mtodo. Vrias tcnicas que utilizam este princpio foram desenvolvidas e so utilizadas na rotina de laboratrios de virologia. Em geral, so tcnicas simples, rpidas, de custo baixo e
com boa sensibilidade e especicidade. A maior restrio refere-se diculdade de automao, o que torna trabalhosa a sua realizao em um nmero grande de amostras. No obstante, algumas etapas dessas tcnicas podem ser automatizadas, o que reduz a diculdade para se testar vrias amostras simultaneamente. As tcnicas mais utilizadas para a deteco de antgenos virais so a IFA, a IPX, os ELISAs e imunocromatogrcos, alm dos imunoblots (Western blot, dot e slot blot). O princpio de cada uma dessas tcnicas foi descrito no Captulo 3. Em resumo, as protenas virais so detectadas por anticorpos especcos, conjugados com substncias indicadoras que permitam a sua deteco. Na IFA, os anticorpos so conjugados com um marcador uorescente (uorescena), que pode ser visualizado sob UV. No caso da IPX e ELISAs, os anticorpos so marcados com uma enzima, que reage com o substrato e promove a mudana de cor deste ou emite luminosidade. A luminosidade emitida pode ser detectada por aparelhos (luminmetros) ou captada em lmes de raios X. Protenas virais presentes em uma variedade de amostras podem ser detectadas por esses mtodos. O desenvolvimento de kits diagnsticos para a utilizao em consultrios, clnicas ou mesmo a campo popularizou e ampliou o uso dessas tcnicas. Exemplos de aplicao dessas tcnicas na rotina diagnstica incluem a deteco de antgenos virais em impresses de crebro (raiva, BoHV-5, cinomose); em clulas descamativas em secrees nasais (BoHV-1, BoHV-5, BRSV, BVDV, vrus da cinomose [CDV]), em esfregaos sangneos (BVDV); conjuntivais (CDV) e genitais (PRRSV, BoHV-1). Esses testes so realizados em seces ou impresses de tecidos, em clulas imobilizadas em placas de cultivo ou em lminas histolgicas. A deteco de antgenos virais em cortes histolgicos possui uma grande aplicao para estudos retrospectivos, pois as protenas previamente xadas e includas em parana preservam a sua estrutura antignica por longos perodos. Nesses casos, utiliza-se a tcnica de IPX, associada com protocolos para a recuperao/renaturao dos antgenos e com sistemas de amplicao do sinal emitido (sistema avidina-biotina).
310
Captulo 11
Outra importante aplicao desse mtodo a deteco e identicao de antgenos aps a multiplicao do vrus em cultivos celulares. A conrmao da identidade do agente importante para os vrus que produzem citopatologia pouco caracterstica e, principalmente, para aqueles que no produzem ECP. Nesses casos, a deteco das protenas virais nos cultivos se constitui no indicador da presena do agente no material suspeito. Para a pesquisa de antgenos em uidos (sangue, smen, secrees nasais), podem ser utilizadas tcnicas imunoenzimticas (ELISA), imunocromatogrcas e imunoblot. As tcnicas imunoenzimticas do tipo ELISA possuem diversas variaes (deteco de antgenos e anticorpos ver Captulo 3), so geralmente muito sensveis, especcas e automatizveis, permitindo o teste simultneo de um nmero grande de amostras. Possuem especial aplicao para o diagnstico em rebanhos. Um exemplo desse uso a triagem de rebanhos busca de animais persistentemente infectados pelo BVDV. Existem kits comerciais para a deteco de antgenos do BVDV no soro sangneo, no leite ou em bipsias de pele. Os fragmentos de pele, geralmente coletados da orelha, podem ser submetidos IPX ou a ensaios imunoenzimticos em placas, o
que facilita o diagnstico pelo teste simultneo de um nmero grande de amostras. Essa tcnica tem apresentado grande aplicao em programas de controle e erradicao dessa enfermidade na Europa e Amrica do Norte. Tambm tem sido utilizada para identicar rebanhos positivos, atravs do teste de amostras de leite coletadas na indstria. Antgenos do BLV e de outros retrovrus (CAEV, EIAV) tambm podem ser detectados no sangue por tcnicas imunoenzimticas ou por imunoblots. A Figura 11.7 lista os mtodos diretos de deteco de antgenos virais em amostras clnicas. O princpio dos mtodos cromatogrcos e imunoenzimticos foi utilizado para o desenvolvimento de testes aplicveis em clnicas e consultrios. Vrios testes para a deteco de antgenos e tambm de anticorpos, sob a forma de kits, esto disponveis comercialmente. So testes rpidos (15-30 min), de execuo simples e geralmente possuem boa sensibilidade e especicidade. Dentre os testes disponveis em kits para a deteco de antgenos se incluem aqueles para a deteco dos parvovrus canino (CPV) e felino (FLPV) em fezes; rotavrus tipo A em fezes de bovinos, sunos e caninos; vrus da raiva na saliva ou no encfalo de ces, bovinos e de fures; vrus da leucemia
Material
Secrees Sangue Excrees
Tecidos rgos
Fluidos
Clulas
Fresco
Congelado
Parafinizado
ELISA Imunoblot Cromatografia
IFA IPX Imunoblot
IFA IPX Imunoblot Cromatografia
IFA IPX
- IFA - IPX
Figura 11.7. Tcnicas de deteco de antgenos virais em amostras clnicas.
311
felina (FeLV) no sangue, plasma ou soro; vrus da gastrenterite transmissvel (TGEV) em fezes de sunos; vrus da inuenza aviria em fezes de aves; coronavrus em fezes de bovinos e caninos; CDV em secrees nasais, conjuntivais ou urina de ces, entre outros. A grande vantagem desses testes a realizao in loco, como suporte investigao clnica, ou seja, paralelamente ao exame clnico, o veterinrio pode recorrer ao exame laboratorial para dar suporte ao seu diagnstico. O custo individual dos testes relativamente alto, o que restringe o seu uso em nvel populacional. A tcnica de radioimunoensaio (RIA) j teve importante aplicao na deteco e diagnstico de vrus, mas, atualmente, encontra-se em desuso, pela disponibilidade de outras tcnicas equivalentes e que no requerem o uso de marcadores radioativos. Assim, possui aplicao restrita e especca em algumas situaes. A aglutinao em ltex, tcnica de execuo simples que se popularizou no diagnstico de gestao em mulheres, tem sido difundida em kits para uso no diagnstico de viroses de pequenos animais. No entanto, a sua rapidez e simplicidade so contrabalanadas por problemas de sensibilidade e especicidade. Em geral, protocolos que resultem em aumento de sensibilidade, especicidade e permitam maior facilidade de execuo tm sido continuamente desenvolvidos. Com isso, tcnicas modicadas e aperfeioadas a maioria delas baseada em princpios j bem estabelecidos tm sido continuamente incorporadas aos mtodos tradicionais de deteco de antgenos.
4.1.5 Deteco de cidos nuclicos

A multiplicao dos vrus nos tecidos do hospedeiro resulta na produo de grande quantidade de cidos nuclicos virais, incluindo RNA mensageiro (mRNA), RNAs intermedirios (vrus RNA), alm do RNA e DNA genmicos. Portanto, os tecidos infectados e uidos corporais e excrees freqentemente contm quantidades considerveis de cidos nuclicos de origem viral. A deteco desses cidos nuclicos, com base na especicidade das seqncias e na complementaridade de bases, constitui-se no fundamento das tcnicas moleculares de diagnstico.
Essas tcnicas foram desenvolvidas a partir da dcada de 1980 e tiveram um impacto notvel na pesquisa e no diagnstico de inmeras doenas humanas e animais. A sua versatilidade e a aplicabilidade praticamente universal resultaram em rpida difuso e adoo como tcnicas preferenciais de diagnstico em inmeros laboratrios. O princpio das tcnicas de hibridizao (Southern e Northern blot, dot/slot blot) foi utilizado e ampliado para o desenvolvimento da tcnica de PCR, uma tcnica altamente especca que capaz de detectar quantidades mnimas do genoma viral em amostras clnicas. A universalidade de aplicaes do PCR foi ampliada e adaptada para deteco rpida e possibilidade de quanticao do cido nuclico presente na amostra (PCR em tempo real). Por outro lado, as tcnicas de hibridizao in situ (ISH) e PCR in situ, que se constituem em variaes das tcnicas originais, possuem aplicao restrita em diagnstico, sendo mais utilizadas em pesquisa e em estudos de patogenia. Quando a amostra clnica contm uma determinada quantidade do cido nuclico viral, pode-se detect-lo pelas tcnicas de hibridizao, utilizando-se sondas moleculares marcadas com istopos radioativos ou com enzimas. Quando a quantidade de cidos nuclicos muito pequena para ser detectada diretamente, a tcnica de PCR pode ser utilizada para multiplicar/amplicar o nmero de molculas presentes na amostra. As tcnicas de deteco de cidos nuclicos podem ser utilizadas para detectar DNA e RNA e so aplicveis a qualquer vrus, desde que se conheam algumas seqncias do seu genoma. Atualmente, as seqncias genmicas parciais ou totais de virtualmente todos os vrus de interesse veterinrio encontram-se disponveis em bancos genmicos acessveis via Internet. Da mesma forma, existe uma variedade de softwares destinados ao desenho de primers e sondas utilizando essas seqncias. As tcnicas moleculares podem ser utilizadas para detectar cidos nuclicos virais em material clnico de qualquer natureza, incluindo tecidos, sangue (soro/plasma), clulas sangneas, secrees (leite, saliva, secrees nasais, urina, smen), descamaes cutneas, entre outros. Podem tambm ser utilizadas para detectar o geno-
312
Captulo 11
ma viral em cultivos celulares previamente inoculados com o material suspeito. Essas tcnicas possuem especial utilidade para detectar quantidades muito pequenas do material gentico; para vrus que no multiplicam com ecincia em cultivo celular e tambm para detectar o agente j inativado em amostras inadequadamente conservadas. Tambm possuem aplicao especial para a deteco de infeces latentes, nas quais o genoma do vrus permanece inativo nas clulas do hospedeiro. A seguir ser dado enfoque para a utilizao das tcnicas de deteco de cidos nuclicos com ns diagnsticos.
tanto os vrus RNA como os vrus DNA necessitam da produo de RNAs durante a sua replicao. O dot/slot blot so verses simplicadas dessas tcnicas, nas quais o cido nuclico detectado diretamente na membrana, sem a separao prvia por eletroforese.
4.1.5.2 Reao da polimerase em cadeia

A PCR uma tcnica de amplicao de cidos nuclicos que, quando utilizada com ns diagnsticos, permite a deteco e identicao de quantidades mnimas do material gentico do agente suspeito. Pode ser aplicada em qualquer material clnico que, potencialmente, contenha o agente ou o seu cido nuclico. Possui aplicabilidade universal, ou seja, pode ser realizada para qualquer vrus, desde que se disponha de suas seqncias nucleotdicas. As principais vantagens da tcnica so: a) sensibilidade (pode detectar mnimas quantidades do agente); b) especicidade (altamente especca para o agente); c) rapidez (pode ser realizada em poucas horas); d) universalidade (pode ser aplicada para qualquer vrus); e) pode ser realizada em quantidades mnimas da amostra; f) capaz de detectar tambm vrus que j esteja invivel; g) pode ser adaptada para detectar vrios subtipos do mesmo vrus ou vrus diferentes em uma mesma reao (PCR multiplex); h) pode ser padronizada para aumentar a sensiblidade e especicidade (nested PCR); i) pode ser utilizada para detectar cidos nuclicos em tecidos includos em parana (til em estudos retrospectivos) ou j) pode ser realizada em amostras conservadas de forma imprpria para a realizao de outras tcnicas. O custo dos testes tem se reduzido ao longo do tempo e j no representa uma restrio importante para o diagnstico. Dentre as restries se incluem o risco de contaminao e a produo de resultados falso-positivos; a necessidade de se utilizar substncias txicas para extrair os cidos nuclicos, necessidade do aparelho termociclador (pode ser limitante para laboratrios pequenos) e diculdades na padronizao. Pela suas vantagens, essa tcnica tem sido padronizada e utilizada para o diagnstico de
4.1.5.1 Hibridizao (Southern/Northern

blot)
Para a deteco por hibridizao, os cidos nuclicos devem ser inicialmente extrados da amostra clnica e, posteriormente, imobilizados em membranas. A deteco realizada por sondas moleculares especcas que so seqncias de nucleotdeos complementares s do cido nuclico do agente pesquisado. A especicidade da reao deve-se especicidade e complementaridade do pareamento de bases. Para permitir a deteco, as sondas so conjugadas com istopos radioativos ou com enzimas. Esses marcadores so, ento, detectados pela captao da radiao emitida (marcao radioativa) ou pela observao da ao enzimtica em substratos. Dentre as vantagens dessas tcnicas, destacam-se a boa sensibilidade, especicidade e relativa rapidez na obteno dos resultados. So aplicveis a qualquer agente infeccioso desde que se conhea parte da seqncia do genoma; e podem ser executadas em vrios tipos de material clnico. As suas restries referem-se principalmente necessidade de equipamentos e tecnologia, alm de serem tcnicas relativamente recentes e, por isso, ainda no assimiladas por muitos laboratrios. A tcnica de hibridizao para a deteco de DNA, aps a sua separao por eletroforese, denomina-se Southern blot. aplicvel para a deteco de vrus com genoma DNA. A deteco de RNA por um mtodo equivalente denominada Northern blot. aplicvel a qualquer vrus, pois
313
inmeras viroses. Possui especial aplicao para a deteco de quantidades pequenas de cido nuclico, quando outras tcnicas so incapazes de faz-lo. muito til para a deteco de bovinos portadores do BoHV-1 e BoHV-5 e de sunos portadores do PRV em programas de erradicao; e tambm para a deteco de vrios vrus no smen ou em secrees. Pode ser aplicada em fases precoces da infeco, para detectar vrus difceis de se isolar e quando ainda no h indicadores sorolgicos. Ou seja, a PCR encontra aplicao em todas as situaes em que exista a necessidade de se detectar especicamente um agente viral em material suspeito. Tambm possui um amplo espectro de aplicao em vrias reas da Biologia e Medicina, constituindo-se em uma das tcnicas mais teis e de maior impacto nas Cincias Biolgicas.
processadas e rapidamente testadas, fornecendo o resultado ainda na propriedade. Termocicladores portteis, acoplados a microcomputadores, tm sido desenvolvidos com essa nalidade. Essa estratgia pode ser muito til na investigao de surtos de doenas de importncia sanitria estratgica, como a febre aftosa, peste suna clssica, inuenza aviria, entre outras. Nesses casos, a investigao clnica e epidemiolgica no rebanho pode j ser acompanhada do diagnstico denitivo, o que agiliza a tomada de decises e a adoo de medidas para o controle da infeco.
4.1.5.4 Hibridizao in situ/ PCR in situ

A tcnica de hibridizao in situ (ISH) uma tcnica de deteco de cidos nuclicos, a exemplo do Southern e Northern blot. A diferena fundamental que a ISH realizada em cortes histolgicos e os cidos nuclicos so detectados diretamente nos tecidos. Alm da boa sensibilidade e especicidade, essa tcnica permite a identicao das clulas infectadas. Em razo disso, a ISH muito utilizada em estudos de patogenia de infeces vricas. Tambm permite a deteco de vrus em tecidos conservados por longo tempo em blocos de parana ou em lminas histolgicas, possibilitando estudos retrospectivos. As suas aplicaes diagnsticas, no entanto, so restritas, sobretudo, pela sua complexidade, necessidade de pessoal treinado e tempo requerido para a sua execuo. Em geral, as tcnicas de imunoistoqumica (IHC) tm substitudo a ISH com ns diagnsticos. Em alguns casos, especialmente quando a m conservao dos antgenos virais nos tecidos prejudica o reconhecimento das protenas virais pelos anticorpos, a ISH pode substitu-la com vantagens. A tcnica de PCR in situ tambm realizada em cortes de tecidos, e a amplicao dos cidos nuclicos virais pode ser detectada diretamente nas clulas infectadas. A exemplo da ISH, essa tcnica possui aplicao restrita em diagnstico, sobretudo, pela sua complexidade e requerimento de equipamento especco. Possui algumas aplicaes em estudos de patogenia e biologia de determinadas infeces vricas.
4.1.5.3 PCR em tempo real

A tcnica tradicional de PCR envolve as etapas de extrao do cido nuclico, amplicao e deteco do produto amplicado. O procedimento integral pode demandar vrias horas at a obteno do resultado. Da mesma forma, a quantidade de cido nuclico presente na amostra original de difcil quanticao. Nos ltimos anos, foi desenvolvida a tcnica de PCR em tempo real, na qual as etapas de amplicao podem ser monitoradas medida que vo ocorrendo, pela utilizao de sondas marcadas com substncias indicadoras que so liberadas a cada ciclo de amplicao. O sinal emitido a cada ciclo , ento, captado e quanticado por um software acoplado a um microcomputador. Isso permite o acompanhamento da reao e a visualizao do acmulo dos produtos medida que so produzidos, isto , o resultado pode ser obtido bem antes do nal da reao, o que reduz signicativamente o tempo de realizao. Alm de abreviar o tempo da reao, no necessrio analisar os produtos por eletroforese em gis de agarose. Essa tcnica tambm permite a quanticao dos cidos nuclicos presentes na amostra. A tcnica de PCR em tempo real tem sido tambm adaptada para a realizao a campo, na qual as amostras so coletadas,
314
Captulo 11
4.2 Mtodos indiretos diagnstico sorolgico

A deteco de anticorpos no soro muito utilizada com ns diagnsticos em Virologia. As infeces vricas induzem uma resposta imunolgica especca, mediada por anticorpos (alm de clulas), que persiste por um tempo varivel e que pode ser detectada por diversas tcnicas. Os anticorpos produzidos contra um determinado vrus so estritamente especcos para este agente. Por isso, as tcnicas de deteco de anticorpos so tambm especcas, permitindo distinguir a resposta sorolgica produzida contra vrus diferentes. Da mesma forma, as tcnicas sorolgicas podem ser altamente sensveis, capazes de detectar quantidades mnimas de anticorpos e de identicar quase a totalidade dos animais que os possuem. Variaes dessas tcnicas permitem no s a deteco, mas tambm a quanticao dos anticorpos presentes no soro. Os nveis de anticorpos so geralmente expressos como ttulos, que representam a recproca da maior diluio do soro, na qual os anticorpos ou o seu efeito podem ser detectados. Algumas tcnicas so tambm automatizveis, permitindo o teste de um nmero grande de amostras simultaneamente, sendo muito teis para estudos de rebanhos. As tcnicas de deteco de anticorpos so denominadas genericamente tcnicas sorolgicas, e a anlise da resposta sorolgica a antgenos denominada genericamente sorologia. Os testes sorolgicos possuem aplicaes tanto individuais como em rebanhos ou em populaes. O seu uso individual, como mtodo auxiliar investigao clnica, possui repercusso limitada. No entanto, a deteco de anticorpos possui aplicaes importantes na identicao de animais portadores de alguns vrus, na deteco de infeco intra-uterina e na identicao da fase aguda de algumas viroses. Por outro lado, o seu uso populacional pode apresentar uma repercusso sanitria mais importante, por permitir o conhecimento sobre a situao da infeco e, ao mesmo tempo, indicar a necessidade e/ou viabilidade de programas de combate. As tcnicas sorolgicas tm aplicao especialmente relevante em estudos epidemiolgicos, em triagens e
monitoramentos de rebanhos. Testes sorolgicos tambm so utilizados para se vericar a condio imunolgica de rebanhos e para avaliar o potencial imunognico e a cobertura conferida por vacinas. Os resultados dos exames sorolgicos realizados em cada situao devem ser interpretados luz de conhecimentos sobre a biologia e resposta imunolgica a cada vrus. Testes sorolgicos realizados em uma amostra nica podem ter signicados diferentes, dependendo do vrus. Para os vrus que produzem infeces agudas autolimitantes que constituem a maioria , o resultado positivo em um teste isolado indica apenas exposio prvia ao agente (ou vacinao). Em populaes, resultados positivos em uma amostragem nica podem indicar a circulao prvia ou atual do agente na populao. Em alguns casos, a quanticao dos anticorpos pode indicar se a exposio foi recente ou remota. Para infeces cuja resposta humoral de curta durao, a deteco de altos ttulos de anticorpos indica uma exposio recente ao agente. Para os vrus que estabelecem infeces persistentes (todos os retrovrus) e latentes (herpesvrus), um teste sorolgico positivo indica a condio de portador. Em monitoramentos sorolgicos da febre aftosa, a deteco de anticorpos reagentes no teste VIA indica que houve infeco, e no vacinao. Ao se interpretar o resultado de um teste sorolgico deve-se considerar tambm a possibilidade dos anticorpos detectados terem sido adquiridos passivamente (via placenta e/ou colostro) ou terem sido induzidos por vacinas. A sorologia tambm pode ser utilizada como mtodo auxiliar clnica, em investigaes de eventos de doena isolada ou em grupos de animais. Nesses casos, podem-se adotar duas estratgias: a realizao de sorologia pareada ou a deteco de IgM especca para o agente suspeito. A sorologia pareada deve ser realizada com duas amostras coletadas com intervalo de duas a trs semanas (uma durante a fase aguda e a outra na fase de convalescena). Um aumento de quatro vezes ou mais no ttulo de anticorpos entre as coletas denominado soroconverso um indicativo de que a doena foi causada pelo agente sob investigao. A deteco de IgM espe-
315
cca para o vrus suspeito em amostras nicas, coletadas durante a fase aguda, tambm permite o diagnstico da infeco. Nesse caso, um nico teste j suciente para o diagnstico, pois os nveis sricos de IgM s se encontram aumentados durante a infeco aguda. Essa estratgia tem sido utilizada no diagnstico de vrias viroses (hantavirose, infeco pelo vrus Junin, dengue, encefalites eqinas pelos togavrus encefalite eqina venezuelana, VEE, por exemplo e pelo vrus do Nilo Ocidental [WNV]) e encontra aplicabilidade especial para os vrus que produzem viremia transitria e cujo isolamento difcil. No caso da VEE, a deteco de IgM por um teste ELISA o mtodo mais utilizado para o diagnstico da infeco aguda. A realizao de testes sorolgicos em animais recm-nascidos, no soro coletado previamente ingesto de colostro, um indicativo de infeco intra-uterina. Testes sorolgicos tambm so teis para monitorar os nveis de imunidade adquiridos passivamente pela placenta ou pelo colostro. De acordo com o seu princpio, as tcnicas sorolgicas podem ser divididas em trs grupos: a) tcnicas que detectam diretamente a interao entre os anticorpos com os antgenos virais (RIA, ELISA, imunoblots, IFA, IPX); b) tcnicas em que a interao anticorpo-antgeno resulta em efeitos no relacionados com o vrus (xao do complemento, aglutinao em ltex) e c) tcnicas que mensuram diretamente a capacidade dos anticorpos de bloquear ou alterar alguma atividade biolgica do vrus (SN, HI). Algumas dessas tcnicas tambm esto amplamente difundidas e popularizadas, estando disponveis em kits para uso em clnicas e consultrios veterinrios. Ao se padronizar uma tcnica sorolgica para um determinado agente, deve-se considerar e avaliar as seguintes propriedades: sensibilidade, especicidade, valores preditivo positivo e negativo. A sensibilidade se refere ao percentual de animais que possuem anticorpos e que so detectados pelo teste. Individualmente, a sensibilidade depende da capacidade do teste em detectar quantidades mnimas de anticorpos. A sensibilidade de um teste em padronizao ou
implementao pode ser avaliada comparandose os seus resultados com os resultados de um teste padro (gold standard). A especicidade de um teste sorolgico medida pelo percentual de animais negativos (sem anticorpos) que so considerados positivos no teste. Uma tcnica sorolgica para ser utilizada em diagnstico deve resultar em um nmero mnimo de falso-negativos (boa sensibilidade) e mnimo de falso-positivos (boa especicidade). A sensibilidade e especicidade so propriedades intrnsecas de cada teste sorolgico e podem variar entre as diferentes tcnicas. O valor preditivo positivo mede a probabilidade de resultados positivos no teste serem realmente positivos; o valor preditivo negativo um indicador da probabilidade de resultados negativos serem realmente negativos. A Figura 11.8 ilustra a utilizao de tcnicas sorolgicas para o diagnstico de infeces vricas.
Soro Plasma Secrees
Pesquisa de anticorpos
Imunodifuso ELISA Soroneutralizao Inibio da hemaglutinao Fixao do complemento Imunoblots Imunocromatografia Aglutinao em ltex Imunofluorescncia Radioimunoensaio
Figura 11.8. Tcnicas utilizadas para a pesquisa de anticorpos antivirais no soro ou em secrees.
A seguir, esto descritas as principais tcnicas sorolgicas, seus princpios e aplicaes:
316
Captulo 11
4.2.1 Imunodifuso em gar

O princpio da imunodifuso em gel de gar (IDGA) insolubilizao e precipitao de complexos formados pela reao antgeno-anticorpo. Esses complexos podem ser visualizados sob a forma de linhas de precipitao no gel de agarose (Figura 11.9). A IDGA uma tcnica simples, de custo baixo, possui boa sensibilidade e especicidade. Pela sua simplicidade e praticidade, pode ser implementada em qualquer laboratrio. Foi inicialmente desenvolvida para a deteco de antgenos, mas a sua maior aplicao atual como teste sorolgico. particularmente til para inquritos sorolgicos de grandes populaes animais, sobretudo, pela sua praticidade e custo baixo. Essa tcnica tem sido utilizada para o diagnstico sorolgico de vrias viroses, mas possui aplicao particular para o vrus da EIAV (teste de Coggins), BLV, BTV, doena de Gumboro e bronquite infecciosa aviria. A IDGA se constitui no teste ocial de diagnstico da infeco pelo EIAV, BLV e BTV em vrios pases. As suas maiores restries referem-se a problemas de sensibilidade (pode no detectar nveis baixos de anticorpos), especicidade (reaes inespeccas), repetibilidade e tempo para a obteno dos resultados (at 72 horas).
4.2.2 Soro-neutralizao
O teste de soro-neutralizao (SN) utilizado para se detectar anticorpos que possuem capacidade de neutralizar a infectividade do vrus. O teste geralmente utilizado com soro sangneo, mas pode ocasionalmente utilizar outros uidos corporais que possuam anticorpos. Nesse teste, examina-se o soro suspeito frente a um vrus-padro previamente conhecido e quanticado. O teste realizado em microplacas de 96 cavidades, nas quais se incubam diluies crescentes do soro-teste com uma quantidade constante do vrus (geralmente 100-200 DICC50 por cavidade) por um determinado tempo. Aps esse perodo, durante o qual os anticorpos presentes no soro se ligam e neutralizam o vrus, so adicionadas as clulas de cultivo. As placas, contendo a mistura soro-vrus-clulas, so incubadas a 37C em atmosfera com 5% de C02 por 48 a 96 h. A presena de anticorpos neutralizantes na diluio testada previne a produo de ECP pelo vrus nos cultivos (Figura 11.10). O aparecimento de ECP indica a ausncia de anticorpos neutralizantes sucientes para neutralizar o vrus, na respectiva diluio. Os cultivos podem ser corados com cristal violeta para facilitar a leitura dos resultados. Os
Soro-teste
Antgeno-padro
Reao antgeno-anticorpo
Figura 11.9. Tcnica de imunodifuso em gel de gar (IDGA). O antgeno padro depositado no orifcio central e as amostras-teste so colocadas nos orifcios perifricos da roseta perfurada na camada de gar. Durante as 48-72 h de incubao, antgeno e anticorpos se difundem radialmente a partir dos respectivos orifcios. O encontro entre antgenos e anticorpos resulta em precipitao e formao de uma linha opaca no local. A formao desta linha indica que a amostra positiva para anticorpos contra o antgeno especfico.
317
tapetes ntegros (pela presena de anticorpos que preveniram a replicao viral) se coram em azul; a ausncia de colorao indica a destruio do tapete celular pela atividade do vrus (ausncia de anticorpos). Dependendo do objetivo, o teste de SN pode ser realizado para a obteno de resultado qualitativo (positivo/negativo) ou quantitativo (ttulo de anticorpos). No teste qualitativo, testa-se apenas uma diluio do soro; no teste quantitativo, testam-se vrias diluies.
+
Soro-teste Vrus-padro
Incubao (2 - 24 h)
Dentre as tcnicas sorolgicas, o princpio da SN o que mais se assemelha s interaes entre anticorpos e vrus que ocorrem in vivo. A neutralizao viral reete uma atividade dos anticorpos com maior signicado biolgico. Por isso, a SN uma das tcnicas sorolgicas mais utilizadas em Virologia. Como a neutralizao de um determinado vrus s ocorre por anticorpos especcos contra ele, essa tcnica altamente especca. A SN tambm possui boa sensibilidade. As maiores restries referem-se necessidade de cultivos celulares (possibilidade de contaminao bacteriana e fngica, toxicidade do soro), tempo para obteno dos resultados (at uma semana) e a diculdade de automao. A SN possui aplicao potencial para qualquer vrus que replique bem em cultivo celular, mas possui aplicao preferencial para determinados vrus, tais como: o BoHV-1, BVDV, bPI-3, BRSV, vrios adenovrus, CDV, coronavrus canino (CCoV), PRV, adenovrus canino (CAdV), calicivrus felino, herpesvrus eqinos (EHV), entre outros.
4.2.3 Inibio da hemaglutinao

A deteco de anticorpos capazes de inibir a atividade hemaglutinante de alguns vrus tem sido muito utilizada no diagnstico virolgico. A tcnica de deteco denominada HI e foi descrita na seo 4.1.3. Resumidamente, o soro-teste (puro ou em diluies crescentes) incubado com uma quantidade predeterminada do vrus padro em questo (4 ou 8 unidades hemaglutinantes) por uma hora, seguido da adio de uma suspenso de eritrcitos de uma determinada espcie animal, e outra incubao de 1-2 horas. Ao nal procede-se a leitura: a presena de anticorpos contra o vrus padro impede a sua atividade hemaglutinante, e os eritrcitos rolam formando um boto circular de borda bem denida no fundo da cavidade da placa. A ausncia de anticorpos resulta na atividade hemaglutinante do vrus, provocando a aglutinao dos eritrcitos e a sua precipitao, formando uma camada difusa, recobrindo todo o fundo da cavidade da placa. A incubao de diferentes diluies do soro permite a quanticao dos anticorpos inibidores da hemaglutinao. A maior diluio do soro capaz
Inoculao em cultivo
2-4 dias
ECP Soro positivo
ECP + Soro negativo
Figura 11.10. Tcnica qualitativa de soro-neutralizao para a deteco de anticorpos antivirais. Cada soro suspeito geralmente diludo 1:2 ou 1:10 incubado por 2-24 h com uma quantidade constante do vrus em questo. A seguir, so adicionadas clulas em suspenso a cada cavidade que contm a mistura soro + vrus. As placas so incubadas em estufa de CO2 por 72-96 h e, ento, examinadas sob microscopia tica para a presena de efeito citoptico (ECP). A presena do tapete ntegro indica neutralizao viral (amostra positiva para anticorpos). A produo de ECP indica ausncia de anticorpos neutralizantes (amostra negativa para anticorpos).
318
Captulo 11
de prevenir a hemaglutinao denominada ttulo inibidor da HA. A tcnica de HI est representada esquematicamente na Figura 11.11.
4.2.4 ELISA
Os testes do tipo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) so realizados em microplacas de poliestireno de 96 cavidades e utilizam anticorpos marcados com enzimas (peroxidase ou fosfatase alcalina). Embora tenham sido originalmente planejados para a deteco de antgenos (pela ligao especca de anticorpos marcados), a sua maior utilizao atual tem sido para a deteco de anticorpos. Desde a sua descrio inicial, em 1971, essa tcnica tem tido uma aplicao notvel nas diversas reas da pesquisa e diagnstico em Biologia. A sua adaptao para uso como teste sorolgico literalmente revolucionou o campo do diagnstico e controle de infeces humanas e animais. A tcnica possui muitas variaes, cujas aplicaes so indicadas para casos especcos. Como tcnica sorolgica, tem sido utilizada para a deteco de anticorpos contra praticamente todos os vrus de interesse veterinrio, por isso a sua enumerao se faz desnecessria. No entanto, a sua aplicabilidade e utilidade no so as mesmas para todos os vrus, principalmente por questes relacionadas pureza do antgeno e ocorrncia de reaes inespeccas, entre outras. Pode ser utilizada individualmente ou em rebanhos, constituindo-se em uma tcnica de grande aplicao em estudos epidemiolgicos e programas de combate a viroses em grandes populaes. Tambm tem sido usada para a deteco de anticorpos no leite, como forma de identicar rebanhos positivos para determinados vrus. As principais vantagens da tcnica incluem a especicidade, sensibilidade, rapidez (resultados em 2-3 horas), custo relativamente baixo, praticidade e capacidade de automao (em uma placa podem ser testadas 96 amostras). Geralmente produz resultados qualitativos (positivo/negativo), mas pode ser adaptada para uma avaliao semiquantitativa dos anticorpos. A tcnica pode ser adaptada tambm para a deteco de isotipos especcos de imunoglobulinas (IgG, M, E), sendo particularmente til no diagnstico de algumas infeces vricas agudas (p. ex: dengue, hantavirose, infeco pelo vrus Junin, WNV, encefalites eqinas), nos quais os nveis de IgM esto au-
+
Soro-teste Vrus-padro hemaglutinante
Incubao 1 hora
Adio de eritrcitos
Incubao 1 hora
Amostra negativa
Amostra positiva
Figura 11.11. Teste de inibio da hemaglutinao (HI). O soro suspeito incubado com o vrus padro, que possui atividade hemaglutinante. Aps 1-2h, adicionada uma suspenso de eritrcitos, seguida de outra incubao. A ocorrncia de hemaglutinao (camada difusa de eritrcitos no fundo da cavidade) indica a ausncia de anticorpos inibidores da hemaglutinao no soro-teste. A formao de um boto de eritrcitos no fundo do poo indica a inibio da atividade hemaglutinante do vrus por anticorpos presentes no soro.
319
mentados na fase aguda. Possui aplicao especial quando utilizada em conjunto com vacinas com marcadores antignicos, em programas de controle de doenas de importncia sanitria estratgica como a doena de Aujesky. Nesse caso, o vrus vacinal contm deleo em um dos genes que codica as glicoprotenas do envelope. Animais vacinados com essa vacina podem ser diferenciados dos animais infectados pelo vrus de campo pelo uso de um teste ELISA que detecta anticorpos contra a protena deletada. Esse sistema tem sido utilizado nos programas de controle e erradicao da doena de Aujeszky na Europa,
Estados Unidos e Japo. Tambm tem sido utilizado na erradicao dessa doena de granjas de sunos no estado de Santa Catarina. As maiores restries ao uso tecnologia de ELISA para o diagnstico se referem necessidade dos aparelhos para a lavagem das placas e para a leitura da reao (espectofotmetro). Para laboratrios com grande rotina diagnstica, no entanto, esses custos se diluem pelo teste de grande nmero de amostras. Uma ilustrao esquemtica da tcnica de ELISA est apresentada na Figura 11.12.
4.2.5 Imunouorescncia/ imunoperoxidase

Antgeno viral
Incubao soro-tes te
Lavagem
Anticorpos no soro-teste
Anticorpo antiespcie
Lavagem
Anticorpos marcados
Adio do substrato Mudana de cor
Positivo
Negativo
Figura 11.12. Teste imunoenzimtico do tipo ELISA para a deteco de anticorpos. As cavidades das placas esto recobertas com o antgeno viral. O soro suspeito adicionado e incubado por um determinado tempo (1-2 h), seguido de lavagem para a remoo dos anticorpos no-ligados. Adiciona-se um anticorpo antiespcie do primeiro anticorpo, conjugado com a enzima peroxidase. Incuba-se e procede-se uma nova lavagem. A seguir, adiciona-se o substrato. A mudana de cor no substrato indica a presena de anticorpos no soro suspeito.
Embora seja mais utilizada para a deteco de antgenos, a IFA tambm tem sido utilizada com sucesso para a deteco de anticorpos contra vrios vrus. O antgeno (protenas puricadas ou clulas infectadas) , inicialmente, imobilizado sobre um suporte slido (placa de poliestireno ou lminas de microscopia). O soro-teste incubado por um determinado perodo (geralmente 30 min a 1 h), seguido da lavagem para a remoo dos anticorpos no-ligados e pela adio do anticorpo secundrio marcado com uorescena (FITC). O anticorpo secundrio deve ser especco para a espcie animal do soro-teste. A leitura do teste realizada sob microscopia de UV, na qual se observa a emisso de luz uorescente quando h a presena de anticorpos especcos contra o antgeno imobilizado. uma tcnica rpida e de fcil execuo, porm freqentemente resulta em resultados de difcil interpretao, pela ocorrncia de reaes inespeccas. J foi utilizada para a deteco de anticorpos contra vrios vrus, porm, atualmente, tem a sua utilizao restrita, principalmente pelo desenvolvimento de tcnicas mais especcas e objetivas e que no resultam em reaes inespeccas. No entanto, ainda possui aplicao no diagnstico sorolgico de alguns vrus, como o circovrus suno, o PRRSV e o ASFV. A tcnica de IPX tambm pode ser adaptada com essa nalidade. Nesse caso, os anticorpos antiespcie so conjugados com as enzimas peroxidase ou fosfatase alcalina.
320
Captulo 11
4.2.6 Imunoblots
As tcnicas de imunoblot (Western, dot/slot blots) podem ser utilizadas para a deteco de anticorpos. Para tal, os antgenos do vrus suspeito devem ser solubilizados e imobilizados em membranas de nitrocelulose ou nylon. Essa imobilizao pode ser realizada diretamente pela deposio do material em pontos na membrana ou ser precedida pela separao das protenas por eletroforese e posterior transferncia para a membrana. A membrana , ento, incubada com o soro-teste, seguida de lavagem e incubao com um anticorpo espcie-especco marcado com uma enzima (geralmente a peroxidase). A presena do anticorpo especco no soro revelada pela ao da enzima no substrato, que resulta em mudana de cor (substratos cromgenos) ou em emisso de luminosidade (substrato luminescente). Essa tcnica possui aplicaes especcas, como o monitoramento da evoluo dos nveis de anticorpos no curso da infeco, mas possui limitada aplicao no diagnstico sorolgico de rotina.
4.2.8 Outras tcnicas sorolgicas

Vrios testes sorolgicos, baseados em cromatograa e imunoensaio, tambm se encontram disponveis em kits, para a realizao a campo (consultrios, clnicas). Dentre eles incluem-se o teste para a deteco de IgG contra o CDV; anticorpos totais contra o vrus da peritonite infecciosa felina; anticorpos grupo-especcos contra o vrus da imunodecincia felina. Esses testes podem ser realizados com sangue total, plasma ou soro e permitem a obteno do resultado em minutos. Possuem, em geral, boa sensibilidade e especicidade. A sua grande vantagem a possibilidade de uso em clnicas, paralelamente investigao clnica. O custo de cada exame, no entanto, relativamente alto, o que restringe o seu uso populacional. As tcnicas de radioimunoensaio e aglutinao em ltex, desenvolvidas inicialmente para a deteco de antgenos, foram posteriormente adaptadas para a deteco de anticorpos e utilizadas em diagnstico sorolgico. A tcnica de RIA foi sendo gradualmente substituda com vantagem pelas tcnicas imunoenzimticas e atualmente encontra-se em desuso. A aglutinao em ltex tem sido popularizada em kits, principalmente para o diagnstico de viroses de pequenos animais. Esse mtodo tem sido utilizado em clnicas e consultrios, tanto para a deteco de antgenos como de anticorpos. As suas principais vantagens so a simplicidade e a rapidez de execuo. Em geral, possuem sensibilidade e especicidade compatveis com a sua nalidade.
4.2.7 Fixao do complemento

A observao de que os anticorpos ao se ligarem ao antgeno especco so capazes de interagir com componentes do sistema do complemente da espcie homloga e desencadear a cascata de ativao, levou ao desenvolvimento da tcnica de xao do complemento (FC). O efeito dos componentes ativados do complemento (p. ex: lise de eritrcitos) pode ser observado e um indicador da presena de anticorpos na amostrateste. Na ausncia de anticorpos contra o agente, no h ativao do complemento pela ausncia da formao de complexos antgeno-anticorpo. Nesse caso, no ocorre a lise dos eritrcitos. Essa tcnica teve grande aplicao no diagnstico de infeces vricas e bacterianas. Atualmente, porm, possui aplicao bastante restrita e utilizada apenas em situaes especiais. As maiores restries tcnica referem-se ao tempo para obteno dos resultados (24 h) e ao fato de ser uma tcnica muito trabalhosa e no-automatizvel.
5 Coleta e remessa de material

A qualidade do material que ingressa no laboratrio crtica para o sucesso do diagnstico. Por isso, as etapas de coleta, acondicionamento, conservao e remessa so to importantes quanto a realizao e interpretao dos testes laboratoriais. E, assim, o papel dos prossionais de campo e dos tcnicos de laboratrios envolvidos no diagnstico se equivale em importncia. A eleio do material adequado para a coleta depende de conhecimentos sobre a biologia e
321
patogenia do agente. Uma vez eleito, o material deve ser adequadamente coletado, acondicionado e remetido ao laboratrio. O material destinado pesquisa de vrus vivel deve ser enviado com a maior brevidade possvel. Na impossibilidade de faz-lo em um curto espao de tempo, este material deve ser armazenado sob condies adequadas para preservar a viabilidade do agente. Descries detalhadas dos aspectos epidemiolgicos, clnicos e patolgicos observados a campo so muito teis para a elaborao do diagnstico e devem fazer parte do histrico que acompanha as amostras ao laboratrio. A seguir, so apresentadas algumas regras bsicas para orientar a tarefa de coleta e submisso de amostras clnicas para o diagnstico virolgico. A Figura 11.13 ilustra, de maneira simplicada, a seqncia de eventos que acompanham as infeces vricas agudas e que devem ser considerados para se determinar o tipo de material a ser coletado e o momento mais apropriado para faz-lo.
5.1 Eleio do material a ser coletado

A escolha do material a ser enviado para exame depende de conhecimentos bsicos de clnica e de patogenia das enfermidades vricas. Em geral, coleta-se material dos sistemas e rgos afetados pela patologia, nos quais h maior probabilidade de se detectar o agente ou seus produtos. A coleta de material de animais doentes deve ser realizada to logo se observe os sinais clnicos, quando os nveis de replicao viral geralmente atingem os valores mais altos. Na necropsia, deve-se dar preferncia aos rgos e tecidos que apresentam alteraes macroscpicas. A coleta de sangue para a sorologia recomendada para uma variedade de infeces. A seguir, so listados os materiais mais indicados para coleta, de acordo com os sistemas afetados: enfermidades respiratrias: secrees nasais, aspirados nasofarngeos, trato respiratrio superior, pulmes; enfermidades entricas: fezes, contedo intestinal, segmentos intestinais, linfonodos regionais; doena genital: secrees genitais, smen; conjuntivite: raspados conjuntivais, secrees; pele: raspados cutneos, uidos vesiculares, fragmentos de pele; doena neurolgica: secrees nasais, crebro, uido crebro-espinhal; doena sistmica: secrees nasais, fezes, soro, sangue integral, linfonodos, bao; fetos abortados: placenta, lquidos fetais, timo, bao, pulmo, crebro; outras doenas: soro, rgo ou tecido afetado, secrees/excrees do sistema afetado.
Sinais clnicos
Vrus
Resposta imunolgica
10
12
14
16
18
Dias aps a infeco Material para: Isolamento viral Antgenos cidos nuclicos Sorologia Sorologia pareada
5.2 Cuidados na coleta e acondicionamento

Devem-se observar os seguintes cuidados no momento da coleta de material e no seu acondicionamento: secrees nasais, oculares ou genitais devem ser coletadas com o auxlio de suabes. Apesar de existirem suabes para esse uso especco,
Figura 11.13. Cintica da infeco viral e resposta imunolgica, com indicao do momento de coleta de material para diagnstico.
322
Captulo 11
muitas vezes no se encontram disponveis a campo. Nesses casos, pode-se utilizar cotonetes de uso humano, com a ressalva de que no devem conter antisspticos e/ou outras substncias qumicas. Os suabes devem ser coletados agressiva e profundamente na cavidade nasal, para se aumentar a possibilidade de coletar material que contenha o vrus e/ou clulas descamativas. Aps a coleta, os suabes devem ser acondicionados em meio apropriado, soluo siolgica estril ou PBS e mantidos sob refrigerao (ver abaixo); tecidos e fragmentos de rgos devem ser coletados individual e assepticamente, para minimizar a possibilidade de contaminao bacteriana e fngica. Para isso, pode-se utilizar lminas de bisturi, tesouras ou outros tipos de lmina. Quando o rgo for volumoso (fgado, crebro), deve-se coletar fraes representativas de vrias reas. Os fragmentos de diferentes rgos devem ser acondicionados em tubos ou em sacos plsticos individuais e bem fechados; fetos abortados podem ser enviados inteiros ou submetidos necropsia para a coleta de tecidos e rgos; fezes devem ser preferencialmente coletadas da ampola retal. Segmentos de intestino devem ser coletados com o seu contedo. Para isso, as extremidades da seo intestinal devem ser bem amarradas com barbante; sangue integral deve ser coletado com anticoagulante (citrato, heparina ou EDTA). Geralmente, 2 a 3 mL (pequenos animais) e 5 a 10 mL (grandes animais) so sucientes para os propsitos a que se destinam; a coleta de sangue para exames sorolgicos deve ser realizada de modo a minimizar a hemlise. Tubos estreis de plstico ou vidro so recomendveis. Em geral, 1 a 2 mL de soro so sucientes para a maioria dos testes; raspados cutneos ou de mucosas devem ser obtidos pelo uso de lminas estreis. Em algumas situaes, lminas de vidro podem ser adequadas para essa nalidade. A raspagem deve ser capaz de coletar as clulas superciais da pele e/ou das mucosas; as embalagens (tubos e sacos plsticos) em que as amostras sero acondicionadas devem ser
bem fechadas, para evitar o vazamento e mistura do material ou a entrada de gua originada do derretimento do gelo; as embalagens devem ser rotuladas e identicadas individualmente com caneta ou lpis. Deve-se evitar o uso de rtulos de papel que se desprendam pelo umedecimento e de canetas cuja tinta seja removida pelo contato com a gua; tubos de vidro ou de outro material frgil devem ser acondicionados de forma a evitar a sua ruptura durante o transporte.
5.3 Conservao e remessa

Os maiores cuidados com a conservao devem ser dispensados aos materiais destinados ao isolamento viral. Essas amostras devem ser prontamente acondicionadas em recipientes estreis (tubos, sacos plsticos, placas) e conservadas sob temperaturas baixas. A resistncia dos vrus sob temperaturas ambientais varia muito: certos vrus so muito resistentes (pox, polio, entero), enquanto outros so muito sensveis (BRSV, outros paramixovrus). Por isso, o tempo entre a coleta do material e a inoculao deve ser o mais breve possvel. Se o intervalo entre a coleta e entrega ao laboratrio for curto (at 2 a 3 dias), prefervel manter o material refrigerado (a 4C). Se o tempo necessrio para a remessa e entrega do material for superior a trs dias, deve-se optar pelo seu congelamento. O sangue integral destinado ao isolamento viral nunca deve ser congelado. Alguns vrus (p. ex.: BRSV) so extremamente sensveis a temperaturas ambientais altas, alm de no resistirem a congelamentos/descongelamentos sucessivos. Em geral, pode-se adotar a seguinte regra: para horas ou at 2 a 3 dias, conservar o material a 4C; para mais tempo, congelar a -20C ou -70C. Para a remessa, o material deve ser acondicionado em caixas trmicas com gelo reciclvel em abundncia. Tambm como regra: quanto menor o tempo decorrido entre a coleta e a inoculao do material, maior ser a probabilidade de se isolar o vrus. Quando o sangue for destinado a exames sorolgicos, deve-se proceder separao do soro ( temperatura ambiente ou a 4-6C) previamente
323
ao envio. Aps a sua separao, o soro pode ser conservado a 4-6C por vrios meses, sem afetar a viabilidade e atividade biolgica das imunoglobulinas. Quando o tempo at o teste for muito prolongado, pode-se optar pelo congelamento do soro. Nunca se deve congelar o sangue antes da separao do cogulo, pois pode inutilizar a amostra para ns diagnsticos.
Recebimento da amostra e histrico
Registro
5.4 Histrico
Todo o material para exame deve ser acompanhado por um histrico detalhado, no qual devem constar informaes referentes amostra, que podem ser necessrias para a elaborao do diagnstico. Laboratrios de diagnstico geralmente possuem formulrios prprios que especicam as informaes requeridas em cada caso. O histrico deve ser anexado na parte exterior do recipiente, para evitar o seu umedecimento e inutilizao. Se includo no interior do recipiente, deve ser acondicionado em sacos plsticos prova dgua.
Formulao da hiptese etiolgica
Encaminhamento
Virologia Patologia toxicologia Realizao da tcnica Bacteriologia micologia
Leitura do teste
5.5 Fluxograma dos procedimentos de diagnstico

Cada laboratrio possui o seu prprio uxograma de encaminhamento das amostras destinadas ao diagnstico. A seguir sero descritas as etapas de um protocolo-modelo (Figura 11.14): logo aps o recebimento, o material deve ser removido da embalagem de transporte e acondicionado provisoriamente sob temperatura adequada (geralmente em geladeira a 4-6C); a seguir, deve-se registr-lo em um protocolo interno (livro ou arquivo); a prxima etapa o encaminhamento para a realizao do teste pertinente. O encaminhamento do material ao mtodo indicado depende de uma anlise preliminar que objetiva denir o agente (s) suspeito (s) e a metodologia a ser utilizada para diagnostic-lo. Nessa etapa, o histrico que acompanha a amostra fundamental para a tomada de deciso. Ao se encaminhar a amostra para o diagnstico, deve-se considerar outros possveis patgenos e encaminhar parte do material para a bacteriologia, micologia, toxicologia entre outras (Figura 11.14).
Interpretao do resultado
Envio do resultado
Figura 11.14. Fluxograma de procedimentos realizados na rotina diagnstica.
Amostras de soro geralmente so acompanhadas de uma requisio especca (p. ex.: sorologia para BLV). Nesses casos, o encaminhamento simples. Algumas vezes, as amostras so acompanhadas de um histrico clnico, sem a indicao do exame requerido. Nesses casos, o tcnico deve denir, com base no histrico, qual o agente suspeito e encaminhar a amostra para o respectivo exame. Pode-se tambm contatar o veterinrio que submeteu a amostra para inquiri-lo sobre a natureza do exame solicitado. Em labora-
324
Captulo 11
trios que realizam testes sorolgicos como parte de programas de monitoramento de rebanhos, comum a submisso de centenas ou milhares de amostras de soro simultaneamente, as quais so diretamente encaminhadas para a realizao dos testes a que se destinam. Quando a amostra submetida de outra natureza (tecidos, secrees, fetos), pode-se exigir uma anlise mais detalhada do histrico para formular uma hiptese diagnstica e encaminhar o material ao destino apropriado. Amostras desse tipo podem ser acompanhadas pela requisio de um determinado exame, o que simplica a tomada de deciso. Crebros de caninos ou bovinos so freqentemente enviados com a solicitao especca de diagnstico de raiva; fezes bovinas so acompanhadas de uma requisio de diagnstico para rotavrus; smen bovino encaminhado para a pesquisa de herpesvrus, entre outros. Nesses casos, cabe ao tcnico do laboratrio simplesmente encaminhar o material para a realizao do teste solicitado. Os tipos de exames a serem realizados para cada material (e para cada agente suspeito) so geralmente predeterminados pelo laboratrio. Outras vezes, o material enviado sem a indicao de um agente suspeito e sem a requisio especca de um exame. Nesses casos, cabe ao laboratorista analisar o histrico e formular a hiptese etiolgica a ser investigada. Com base nessa hiptese, indicar o exame mais apropriado. A formulao da hiptese e o encaminhamento correto do material exigem conhecimentos de Virologia, clnica, patogenia e epidemiologia das doenas vricas e nem sempre so tarefas fceis. Especialmente nesses casos, um histrico detalhado reveste-se de grande importncia. Em geral, a anlise do histrico, realizada luz dos conhecimentos acima mencionados, permite a formulao de uma hiptese, que pode envolver um ou mais agentes suspeitos. Assim, o encaminhamento dever ser realizado objetivando a pesquisa e comprovao da hiptese. A seguir, sero mencionados alguns exemplos de procedimentos dessa natureza freqentemente adotados, e os direcionamentos indicados:
Caso 1. Material: secrees nasais. Espcie: bovina. Histrico: bezerros com sinais de doena respiratria. Hiptese etiolgica: quatro agentes virais so mais comumente associados com doena respiratria em bezerros: BoHV-1, bPI-3, BVDV e BRSV. Encaminhamento: pesquisa de vrus por isolamento em cultivo celular. Caso 2. Material: crebro. Espcie: bovina. Histrico: doena neurolgica seguida de morte. Hiptese: dois agentes virais so mais freqentemente associados com doena neurolgica em bovinos: o vrus da raiva e o BoHV-5. Encaminhamento: inicialmente investiga-se o vrus da raiva por IFA. Em caso de resultado negativo, investiga-se o BoHV-5, por IFA em impresses de crebro, PCR ou por isolamento viral. Caso 3. Material: secrees nasais e raspados oculares. Espcie: canina. Histrico: lhotes com sinais respiratrios. Hiptese: pode-se suspeitar de cinomose ou de outra virose respiratria (adenovrus, parainuenza canina). Encaminhamento: pode-se inicialmente pesquisar antgenos virais em clulas descamativas nas secrees ou raspados por IFA ou por mtodos cromatogrcos (kits). Posteriormente podese encaminhar para PCR ou isolamento, dependendo do protocolo de cada laboratrio. Caso 4. Material: feto abortado e membranas fetais. Espcie: suna. Histrico: rebanho com problemas de aborto, mumicaes, natimortos. Hiptese: dois agentes so mais comumente associados com perdas reprodutivas em sunos: o parvovrus e o PRRSV. No Brasil, ainda no foi
325
descrita a presena do PRRSV, ento, deve-se, inicialmente, investigar o parvovrus. Encaminhamento: pesquisa de atividade hemaglutinante (HA) nos tecidos, membranas e lquidos fetais. Caso 5. Material: fezes. Espcie: bovina. Histrico: diarria em bezerros com poucos dias de vida. Hiptese: dois vrus so mais freqentemente associados com esses casos: o rotavrus e coronavrus. Encaminhamento: pesquisa de partculas vricas por microscopia eletrnica. Esses exemplos ilustram a importncia do histrico clnico-patolgico junto com a amostra submetida. A anlise do histrico pode ser decisiva para direcionar o procedimento e mesmo para descartar possveis suspeitos. Algumas vezes, amostras so enviadas sem o mnimo de informaes, nem mesmo relativas natureza do material ou espcie animal do qual foram coletadas. Nesses casos, a formulao da hiptese e o encaminhamento do material cam muito prejudicados, tornando muito difcil a obteno do diagnstico correto.
sangue integral deve ser centrifugado baixa rotao, e a capa ogstica deve ser cuidadosamente removida, ressuspendida em meio de cultivo e inoculada nos cultivos. O smen deve ser diludo em soro fetal bovino (1:5 ou 1:10) para reduzir a toxicidade. Materiais destinados a outros mtodos de diagnstico so submetidos a um processamento apropriado a cada tipo de exame.
5.7 Interpretao dos resultados

Os resultados dos testes laboratoriais devem ser analisados conjuntamente com as informaes que acompanham a amostra e interpretados luz de conhecimentos de patogenia, clnica e epidemiologia. Se analisados isoladamente, podem conduzir a interpretaes incompletas e concluses equivocadas. A deteco de cidos nuclicos do BoHV-5 por PCR no crebro de bovinos acometidos de doena neurolgica, por exemplo, no deve ser considerada prova denitiva do envolvimento desse vrus na etiologia deste caso de doena. Bovinos portadores da infeco latente possuem o DNA viral em vrias partes do encfalo, sem que isso tenha signicado patolgico ou que possa estar associado com ocorrncia da doena em questo. Por outro lado, o resultado negativo em um determinado teste laboratorial no signica necessariamente que o material era realmente negativo, pois as tcnicas apresentam certo limite de sensibilidade e podem, ocasionalmente, falhar em detectar o agente ou seus produtos. Da mesma forma, o resultado negativo no isolamento viral no descarta denitivamente o agente suspeito, pois condies inadequadas de coleta e conservao do material podem ter afetado negativamente a viabilidade do agente e prejudicado o teste. Por essas razes, os resultados laboratoriais devem ser considerados como uma parte de um conjunto de informaes necessrias elaborao do diagnstico e no como o diagnstico em si. Em todas as situaes, os resultados e a sua interpretao devem ser transmitidos com a maior brevidade possvel ao pessoal que os requisitou, para que as medidas apropriadas muitas vezes
5.6 Processamento das amostras

Dependendo da natureza das amostras e dos testes a que se destinam, diferentes processamentos so realizados previamente realizao do exame. Para o isolamento de vrus em cultivo celular, fragmentos de tecidos ou rgos devem ser macerados com areia estril, homogeneizados e centrifugados baixa rotao. O sobrenadante deve, ento, ser inoculado. Secrees (nasais, oculares, genitais) devem ser centrifugadas para a remoo de debris celulares e sujidades; o sobrenadante deve ser inoculado. Material contaminado (secrees, contedo intestinal, fezes) deve ser ltrado em ltros acoplveis a seringas para remover bactrias e fungos contaminantes que possam interferir com o isolamento. As fezes devem ser previamente diludas em meio de cultivo ou PBS para reduzir a sua toxicidade. O
326
Captulo 11
dependentes dos resultados e de sua interpretao possam ser adotadas.
HIRSCH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Malden, MA: Blackwell Science, 1999. 480p. INNIS, M.A. et al. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego, CA: Academic Press, 1990. 482p. KIRKBRIDE, C.A. Laboratory diagnosis of livestock abortion. 3.ed. Ames: Iowa State University Press, 1990, 260p. MAHY, B.W.S.; KANGRO, H.O. Virology methods manual. San Diego, CA: Academic Press, 1996. 374p. MAYR, A.; GUERREIRO, M.G. Virologia veterinria. 2.ed. Porto Alegre: Sulina, 1981. 472p. McINTOSH, K. Diagnostic virology. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.14, p.401-430. MULLIS, K.B.; FERR, F.; GIBBS, R.A. PCR: the polimerase chain reaction. New York, NY: The Maple Press Company, 1994. 458 p. QUINN, P.J. et al. Clinical veterinary microbiology. London: Wolfe, 1994. 648 p. THORNBER, P.M.; MURRAY, G. Dealing with unexpected or unknown emergencies: examples of Australian approaches. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.18, p.193-213, 1999. TIMONEY, J.F.; GILLESPIE, J.H.; SCOTT, F.W. Hagan and Bruners microbiology and infectious diseases of domestic animals. 8.ed. New York, NY: Cornell University Press, 1988. 951p. TREMBLAY, R. Transmission of bovine viral diarrhea virus. Veterinary Medicine, v.91, p.858-866, 1996. VERSTEEG, J. A colour atlas of virology. Weert: Wolfe Medical Publications, 1985. 240p. ZHANG, Z. et al. Application of immunohistochemistry and in situ hybridization for detection of bovine coronavirus in parafn-xed intestines. Journal of Clinical Microbiology, v.35, p.2964-2965, 1997.
BAKER, J.C. Bovine respiratory syncytial virus: immunopathogenesis, clinical signs, diagnosis and prevention. Infectious Diseases and Food Animal Practice, v.8, p.62-68, 1993. CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.P. Veterinary diagnostic virology: a practitioners guide. St. Louis, MO: Mosby, 1992. 285p. dOFFAY, J.M. et al. Diagnosis of encephalitic bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) infection in cattle: virus isolation and immunohistochemical detection of antigen in formalinxed bovine brain tissues. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.7, p.247-251, 1995. DUBOVI, E.J. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infection. Veterinary Medicine, v.91, p.867-872, 1996. ELLIS, J.A.; HASSARD, L.E.; MORLEY, P.S. Bovine respiratory syncytial virus-specic immune responses in calves after inoculation with commercially available vaccines. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.206, p.354-361, 1995. ELLIS, J.A. et al. Comparison of detection methods for bovine viral diarrhea virus in bovine abortions and neonatal death. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.7, p.433-436, 1995. FENNER, F.J. et al. Veterinary virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1993. 666p. FRESHNEY, R.J. Culture of animal cells. 2.ed. New York, NY: Wiley-Liss, 1987. 397p. GROOMS, D.L.; WARD, L.A.; BROCK, K.V. Morphologic changes and immunohistochemical detection of viral antigen in ovaries from cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus. American Journal of Veterinary Research, v.57, p.830-833, 1996. HAINES, D.M.; CLARK, E.G.; DUBOVI, E.J. Monoclonal antibody-based immunohistochemical detection of bovine diarrhea virus in formalin-xed, parafn-embedded tissues. Veterinary Pathology, v.29, p.27-32, 1992.
VACINAS VRICAS
Cludio Wageck Canal & Clarissa Silveira Luiz Vaz
12
329 329
329 331
1 Introduo 2 Formas de imunizao

2.1 Imunizao passiva 2.2 Imunizao ativa
3 Objetivos da vacinao 4 Tipos de vacinas

4.1 Vacinas replicativas 4.1.1 Vacinas com vrus patognico 4.1.2 Vacinas com vrus de espcie heterloga 4.1.3 Vacinas com vrus atenuado 4.1.4 Vetores vacinais 4.2 Vacinas no-replicativas 4.2.1 Vacinas com vrus inativado 4.2.2 Vacinas de subunidades virais 4.2.3 Vacinas de protenas recombinantes 4.2.4 Vacinas de peptdeos sintticos 4.3 Vacinas de DNA e RNA 4.4 Vacinas monovalentes e polivalentes
331 332
333 334 334 334 339 342 342 343 344 345 346 347
5 Adjuvantes 6 Controle de qualidade 7 Conservao e administrao de vacinas 8 Falhas vacinais 9 Reaes adversas da vacinao 10 Drogas antivirais
347 350 350 352 353 354
11 Vacinas vricas licenciadas no Brasil 12 Bibliograa consultada
356 358
1 Introduo
No sculo 18, a varola afetava e matava milhes de pessoas em todo o mundo. Naquela poca, a prtica utilizada para evitar a doena era a exposio das pessoas a uma pequena quantidade de material obtido de leses cutneas de varola. Isto tinha como objetivo provocar uma infeco controlada, que seria seguida de resposta imunolgica e proteo frente a uma nova exposio ao agente. A prtica, conhecida como variolao, era originria da China e, embora bastante difundida nas reas endmicas, no era considerada segura, j que uma signicativa parcela dos indivduos que eram submetidos ao procedimento desenvolvia a doena aps a exposio. Em seus estudos sobre a varola humana, o mdico Edward Jenner observou que os ordenhadores de vacas afetadas pela varola bovina no desenvolviam a forma humana da enfermidade, o que sugeria algum tipo de proteo cruzada. Em 1796, para comprovar a sua teoria, Jenner coletou material de leses de varola do bere de uma vaca e o administrou a um menino de oito anos de idade. Alguns meses mais tarde, ele exps esta criana ao vrus da varola humana (smallpox) que, conrmando suas suspeitas, no produziu a doena. Jenner demonstrou, com esta prtica, que a exposio prvia ao vrus da varola bovina, um patgeno de baixa virulncia, conferia proteo frente ao desao com o vrus da varola, antigenicamente relacionado ao vrus bovino, porm mais virulento. Posteriormente, na dcada de 1870, Louis Pasteur utilizou o termo vacina (do Latim, vaccinia; termo derivado de vaca) como forma de homenagem a Jenner, para designar a prtica da administrao de patgenos a indivduos sadios com o objetivo de induzir resposta imunolgica, numa poca em que as bases tericas da imunizao ainda eram pouco conhecidas. As vacinas consistem em microorganismos ou fraes destes que, quando administradas a um indivduo, induzem uma resposta imunolgica capaz de proteger frente ao contato posterior com o agente original. A resposta imunolgica que induzida resulta do desenvolvimento de clulas efetoras e de clulas de memria. A va-
cinao constitui-se na estratgia mais efetiva de preveno e controle de vrias enfermidades humanas e veterinrias causadas por vrus. Diversas viroses animais e humanas j foram ou esto sendo controladas e erradicadas de pases e continentes graas vacinao. A varola foi erradicada do mundo h trs dcadas. Doenas como a poliomielite e sarampo esto em vias de erradicao. Doenas animais como a febre aftosa, peste suna clssica, doena de Aujeszky, entre outras, tambm foram erradicadas de pases e continentes inteiros pelo uso sistemtico da vacinao. A tecnologia empregada para a produo de vacinas contra vrus apresentou um valioso avano com o domnio das tcnicas de cultivo de clulas, a partir das quais foi possvel otimizar a atenuao e a multiplicao de diversos agentes virais. No entanto, apesar dos avanos recentes na vacinologia, muito ainda pode ser obtido atravs da tecnologia de DNA recombinante, que permite a manipulao do genoma viral e a produo de vacinas cada vez mais ecientes e seguras. Entre os desaos para a indstria de imunobiolgicos, est a adequao das tecnologias surgidas nas ltimas dcadas frente demanda cada vez maior por segurana, bem-estar e produtividade.
2 Formas de imunizao
O termo imunizao se refere induo de imunidade frente a um determinado agente ou antgeno. De acordo com a participao do sistema imunolgico na produo dessa imunidade, dois tipos principais de imunizao podem ser reconhecidos: imunizao passiva ou ativa. A imunizao passiva pode ser natural (pela placenta, colostro ou gema) ou articial (administrao de soro hiperimune). A imunizao ativa ocorre pela exposio do animal ao agente infeccioso (infeco) ou por vacinao.
2.1 Imunizao passiva

A imunizao passiva resulta da transferncia de anticorpos especcos pr-formados atravs da placenta ou do colostro materno ao lhote mamfero; da gema do ovo em aves, ou da administrao de soro hiperimune. Nesses casos, no
330
Captulo 12
h a produo de resposta especca pelo sistema imunolgico do hospedeiro. Ao contrrio, o hospedeiro recebe os anticorpos pr-formados. A imunidade passiva de extrema importncia para neonatos e em situaes em que necessria uma rpida resposta frente a um patgeno ou antgeno especco, como nos casos de exposio a toxinas ou doenas de carter letal, como a raiva. A capacidade de transferncia de imunidade humoral atravs da placenta varia de acordo com caractersticas peculiares de cada espcie. A placenta humana, de outros primatas, de roedores e de carnvoros permite a transferncia de anticorpos da classe IgG durante a gestao. A placenta de ruminantes, eqdeos e sudeos, no entanto, virtualmente impermevel passagem de imunoglobulinas. Nessas espcies, a imunizao passiva depende exclusivamente da ingesto do colostro nas primeiras horas de vida, quando o epitlio intestinal permevel absoro dessas molculas. Neste caso, o perodo que os anticorpos sero capazes de proteger depende da quantidade de colostro ingerida pelo lhote em tempo hbil. A durao da imunidade passiva recebida pelo colostro varia entre as espcies e depende de vrios fatores, incluindo o ttulo de anticorpos maternos, concentrao de imunoglobulinas no colostro, quantidade de colostro ingerida, quantidade de imunoglobulinas efetivamente absorvidas e taxa de crescimento corporal. Por outro lado, a imunidade passiva pode interferir na produo de imunidade ativa resultante de uma subseqente vacinao dos animais jovens. Em geral, quanto maior a concentrao plasmtica de anticorpos maternos, menor ser a eccia da vacinao. A imunidade induzida por vacinas com vrus atenuado menos afetada pela imunidade passiva do que a induzida por vacinas inativadas. A imunidade colostral pode ser sistmica, quando mediada por IgG que so absorvidas na mucosa intestinal e ganham acesso ao sangue. Por outro lado, IgAs ingeridas com o colostro podem conferir proteo local pela neutralizao de microorganismos no lmen intestinal. O decrscimo gradual dos nveis de anticorpos adquiridos passivamente seguido pelo surgimento de anticorpos produzidos ativamente, frente infeco natural ou vacinao (Figura 12.1).
Nvel de anticorpos
Imunidade passiva Imunidade ativa
Semanas (meses)
Figura 12.1. Evoluo da imunidade passiva e ativa nas primeiras semanas/meses de vida.
A avicultura industrial um bom exemplo da utilizao em larga escala da imunidade passiva para o controle de doenas virais importantes. As fmeas reprodutoras recebem vrias doses de vacinas que visam proteger passivamente a sua prognie contra a infeco por alguns patgenos aos quais os pintos so expostos nos primeiros dias de vida. Apesar de ser inicialmente dispendioso, o custo-benefcio deste programa de vacinao acaba sendo favorvel, pois cada fmea gera aproximadamente 150 pintos imunizados passivamente. Este tipo de imunidade fundamental para a proteo dos pintos contra o vrus da doena infecciosa da bursa de Fabricius (IBDV), reovrus das aves e vrus da encefalomielite aviria. A vacinao de fmeas, antes ou depois da cobertura, para induzir a produo de anticorpos que sejam posteriormente transferidos aos recm-nascidos pelo colostro, tambm um mtodo muito utilizado para prevenir doenas vricas de neonatos, como a rotavirose e coronavirose suna e bovina. Em tese, fmeas imunes contra qualquer agente viral iro transferir essa imunidade aos fetos ou neonatos, conferindo proteo nas primeiras semanas de vida. A resposta imunolgica conferida pela imunizao passiva tipicamente de curta durao, pois baseada nos anticorpos que so administrados e no na resposta do hospedeiro. Essa imunidade no possui memria e perdura somente o
Vacinas vricas
331
perodo em que os anticorpos transferidos no so degradados pelo organismo do hospedeiro. Apesar dessas caractersticas, a imunidade passiva fundamental no s para a defesa de neonatos, mas tambm em situaes na quais necessria uma resposta imediata. Para combater a infeco pelo vrus da cinomose (CDV), por exemplo, pode-se administrar soro hiperimune especco aos ces doentes, na tentativa de auxiliar o seu organismo a combater a infeco. Tambm os indivduos expostos ao vrus da raiva (RabV) devem receber a aplicao do anti-soro especco, j que uma imunizao ativa provavelmente no teria tempo hbil para proteger antes do nal do perodo de incubao.
2.2 Imunizao ativa

A imunidade ativa pode resultar tanto da exposio ao patgeno por infeco natural quanto da administrao do antgeno em vacinas especcas. Como resultado, o sistema imunolgico do hospedeiro estimulado pelo antgeno ao qual foi exposto. A magnitude e durao da resposta imunolgica dependem de fatores do hospedeiro, como a presena de anticorpos adquiridos passivamente, idade e imunocompetncia do hospedeiro; e de vrios fatores da vacina. Como regra, considera-se que a resposta imunolgica mais efetiva e duradoura aquela induzida pela infeco natural. Portanto, quanto mais as vacinas mimetizarem a infeco natural, melhor ser a resposta imunolgica. Por isso, acredita-se que as vacinas com vrus replicativos (ou vivos) sejam as mais efetivas, pois so as que mais se assemelham infeco natural. Alm da vacinao clssica, outras formas de imunizao ativa tm sido ocasionalmente utilizadas em alguns sistemas. Por exemplo, leitoas susceptveis ao parvovrus suno (PPV) podem ser expostas a fezes ou a ambientes contaminados com o vrus, de modo a adquirirem a infeco (que benigna nesses animais) e se tornarem imunes. Posteriormente, se forem expostas ao agente durante a gestao, estaro imunizadas e os seus fetos estaro protegidos contra a infeco. Da mesma forma, alguns pecuaristas mantm o hbito de expor os cordeiros s crostas de ectima
contagioso obtidas de ovinos adultos, buscando a proteo contra uma subseqente exposio ao vrus. Essas formas empricas de imunizao apresentam alguns riscos, pois podem expor os animais a outros agentes patognicos, alm da incerteza com relao inocuidade do vrus administrado. De acordo com o tipo de antgeno envolvido na exposio inicial, a imunidade resultante pode ser do tipo humoral, celular ou ambas. Na imunizao passiva, a imunidade obtida tipicamente humoral e de curta durao. Na imunizao ativa, a resposta imunolgica geralmente de maior magnitude e durao. A maior durao da imunidade ativa deve-se principalmente produo de linfcitos especcos de vida longa, chamados genericamente de linfcitos de memria.
3 Objetivos da vacinao
As vacinas so utilizadas com o objetivo de induzir a formao de uma resposta imunolgica especca capaz de combater o agente frente a uma nova exposio. Assim, as vacinas devem ser efetivas para induzirem proteo e seguras, para no produzirem doena no hospedeiro. Nesse sentido, as vacinas inativadas so consideradas mais seguras se comparadas com as vacinas vivas atenuadas, uma vez que no ocorre replicao do agente ou risco de reverso virulncia. Por outro lado, os vrus presentes nas vacinas vivas possuem a capacidade de replicao no organismo hospedeiro, estimulando a imunidade humoral e celular. Por isso, as vacinas vivas (ou replicativas) so consideradas mais ecientes na induo de proteo. A efetividade vacinal est relacionada com a capacidade de estimulao de clulas apresentadoras de antgenos, seguida da liberao das citocinas apropriadas. As vacinas devem estimular linfcitos T e B, gerando um nmero adequado de clulas de memria especcas para o antgeno inoculado. Devem ainda estimular a produo de linfcitos T auxiliares (Th) e T citotxicos (Tc) especcos para diferentes epitopos do antgeno vacinal. O antgeno contido na vacina dever persistir, preferivelmente, em locais especcos do tecido linfide, permitindo que continue estimulando as clulas do sistema imunolgico.
332
Captulo 12
A induo de resposta imunolgica mediada por linfcitos T (imunidade celular), que pode ser obtida de acordo com o tipo de vacina utilizada, uma das mais efetivas defesas do organismo contra os vrus. Igualmente importante a capacidade de estimular a produo de anticorpos neutralizantes, capazes de neutralizar os vrions circulantes e, dessa forma, evitar a infeco de novas clulas. De modo ideal, espera-se que uma vacina seja capaz de conferir proteo prolongada do indivduo frente a uma nova exposio ao agente, caracterizando a imunidade de longa durao. Espera-se, portanto, a estimulao de memria imunolgica, que ir permitir uma resposta imunolgica mais intensa frente a uma nova exposio ao vrus. Vacinas contra vrus de animais devem apresentar caractersticas especcas, tais como: facilidade de administrao, custo de aquisio acessvel, estabilidade do produto durante o armazenamento e, aps a inoculao no organismo, adequao para programas de vacinao em massa e capacidade de estimular imunidade forte e duradoura. Devem ainda causar o menor nmero possvel de efeitos colaterais, e no afetar o desempenho produtivo dos animais. Em termos prticos, os objetivos da vacinao incluem: a) prevenir a infeco (imunidade esterilizante), o que virtualmente impossvel com as vacinas atuais. Mesmo em animais adequadamente vacinados, a exposio subseqente seguida de replicao inicial do agente; b) prevenir a doena clnica e suas conseqncias (esse objetivo pode ser alcanado por vrias vacinas animais); c) atenuar a doena clnica e suas conseqncias (para algumas viroses, as vacinas somente conseguem atenuar ou reduzir a intensidade e severidade dos sinais, reduzindo as conseqncias da doena); d) proteger o feto. Para vrias viroses (diarria viral bovina e parvovirose suna, por exemplo), as maiores conseqncias da infeco resultam das perdas fetais. Nesses casos, a vacinao objetiva imunizar as mes para que a sua resposta imunolgica proteja e impea a infeco fetal; e) proteger os neonatos. Para viroses que afetam os animais nas primeiras semanas de vida (rotavirose, coronavirose), a imunizao das fmeas visa conferir proteo
passiva aos recm-nascidos; f) reduzir a excreo viral. Animais vacinados, se posteriormente expostos ao agente, devem excretar o vrus em menores quantidades e por menos tempo, reduzindo, assim, a sua disseminao e transmisso; g) erradicar o agente da populao. A vacinao contra determinados vrus, mais do que prevenir e/ou atenuar a doena clnica, objetiva criar, na populao, uma imunidade protetora que torne invivel a circulao e perpetuao do agente. Esse tipo de cobertura denomina-se imunidade de populao ou de rebanho. Em situaes em que o uso de imungenos pode dicultar o diagnstico sorolgico da doena e, com isso, dicultar programas de controle ou erradicao, a deciso sobre o uso de vacinao deve ser criteriosamente avaliada.
4 Tipos de vacinas
Diferentes tipos de vacina contra vrus esto licenciados para uso veterinrio, sendo a maioria composta por vrus inativados ou por vrus vivos atenuados. A utilizao de novas tecnologias, principalmente envolvendo a manipulao gentica (tecnologia de DNA recombinante), tem originado inmeros estudos e expectativas no surgimento de novas opes de vacinas. Algumas vacinas recombinantes j esto no mercado, enquanto vrias outras esto em fase de desenvolvimento ou de testes. Para algumas dessas vacinas, no entanto, muitos estudos ainda so necessrios para a comprovao de sua segurana e eccia; motivo pelo qual ainda possuem pouca participao no mercado veterinrio. Por outro lado, algumas vacinas produzidas por mtodos clssicos, h dcadas, ainda conservam o seu espao devido sua eccia e segurana. Vacinas autgenas de uso individual, produzidas com material coletado do animal a ser vacinado, so ainda uma das melhores formas de controle da papilomatose bovina e canina, demonstrando maior ecincia se comparadas com outros tipos de vacinas. Os diferentes tipos de vacinas contra vrus, j licenciadas ou ainda em fase de desenvolvimento, esto apresentados na Tabela 12.1.
Vacinas vricas
333
Tabela 12.1. Tipos de vacinas vricas
Tipo
Caractersticas/propriedades Vrus patognicos Vrus heterlogos Vrus naturalmente atenuados;
Gnero
1. Replicativas (vrus vivo) Vrus atenuados
Vrus atenuados por passagens em cultivo celular; Vrus atenuados por passagens em ovos embrionados; Vrus atenuados por passagens em espcie heterloga; Vrus temperatura-sensveis; Vrus modificados pela deleo de genes; Vacinas com marcadores antignicos. Vetores virais Vrus inativado
2. No-replicativas (sem vrus vivo)
Subunidades de vrus; Produtos de vrus Protenas recombinantes; Peptdeos sintticos.
3. DNA/RNA
Contm o gene da protena de interesse.
4.1 Vacinas replicativas

So vacinas que contm o vrus vivel (vivo, replicativo) e, por isso, proporcionam a replicao do agente no organismo hospedeiro, resultando
na amplicao viral e no aumento da quantidade de antgeno que apresentada ao sistema imunolgico. Essas vacinas comportam-se de modo semelhante ao vrus em infeces naturais. Os vrus vivos podem ser utilizados como vacinas em diferentes apresentaes (Figura 12.2).
Vacinas replicativas (vrus vivo)
Vrus patognico
Vrus heterlogo Vrus atenuado
Vetores vacinais
Vetores virais
Vetores bacterianos
Naturalmente atenuado
Atenuao por mtodos clssicos
Atenuao por manipulao gentica
Vrus temperaturasensvel
Passagens em cultivo celular
Passagens Passagens em ovos em animais embrionados
Deleo de genes
Vacinas diferenciais
Figura 12.2. Tipos de vacinas que contm o vrus vivel, replicativo.
334
Captulo 12
4.1.1 Vacinas com vrus patognico

Em casos especcos, os prprios vrus com potencial patognico, sem atenuao ou tratamento prvio, podem ser utilizados como vacina. Ovinos infectados pelo vrus do ectima contagioso apresentam leses na regio oral e focinho, desenvolvendo uma resposta imunolgica protetora aps a primeira exposio ao vrus. Ainda freqente a prtica de expor os cordeiros s leses de ectima contagioso (crostas), buscando induzir o desenvolvimento de imunidade. Este procedimento se assemelha muito prtica realizada na poca da variolao humana. Outra forma de vacinao contra o ectima o uso de uma vacina comercial contendo o vrus patognico, porm inoculado atravs de escaricao na pele da face interior da coxa, onde o vrus no causa os sintomas indesejveis. Para a parvovirose suna, a exposio prvia de leitoas primparas s fezes de sunos adultos (que provavelmente j entraram em contato com o vrus) pode conferir imunidade e prevenir a ocorrncia de perdas reprodutivas, caso sejam infectadas posteriormente, durante a gestao.
a espcie vacinada e induz proteo cruzada contra um vrus antigenicamente semelhante ao da espcie.
4.1.3 Vacinas com vrus atenuado

Vrus que apresentam maior patogenicidade e virulncia precisam ser submetidos a procedimentos especcos para reduzir o seu potencial patognico e viabilizar a sua utilizao como vacinas replicativas. Do contrrio podem produzir doena e, at mesmo, mortalidade nos animais vacinados. Esses procedimentos devem preservar as suas caractersticas antignicas e a capacidade replicativa. A reduo do potencial patognico do agente denomina-se genericamente atenuao, e o agente com a patogenicidade reduzida dito atenuado. As vacinas que contm o vrus replicativo, capaz de se multiplicar no organismo do animal inoculado, so denominadas genericamente de vacinas vivas, vacinas atenuadas ou vacinas com vrus vivo modicado. Em geral, os vrus vacinais atenuados replicam nos tecidos prximos ao local da inoculao, produzem pouca ou nenhuma disseminao sistmica e, por isso, geralmente no produzem doena nos animais vacinados, ou seja, a vacinao com vrus atenuado se constitui em uma infeco controlada ou restrita. A imunidade conferida por vacinas atenuadas , geralmente, de maior magnitude, amplitude (resposta celular e humoral) e durao do que a imunidade induzida pelas vacinas com vrus inativado. Vacinas atenuadas esto disponveis contra a doena de Marek das galinhas, parvovirose e cinomose canina, rinotraquete felina, encefalomielite aviria, rinotraquete infecciosa e diarria viral bovina, entre muitas outras. A imunidade conferida geralmente prolongada e reduz ou mesmo elimina a necessidade de se realizar revacinaes com a mesma vacina. A resposta vacinal ser melhor quando a vacina for capaz de mimetizar a infeco natural e estimular uma resposta imunolgica especca; de magnitude, espectro e durao adequados. As vacinas de vrus atenuados tm a capacidade de induzir uma replicao viral limitada no organismo hospedeiro, que, no entanto, de boa amplitude e
4.1.2 Vacinas com vrus de espcie heterloga

Alguns vrus, que so antigenicamente relacionados com outros vrus, podem ser utilizados para induzir imunidade em determinadas espcies nas quais no causam doena. O poxvrus bovino antigenicamente semelhante ao vrus da varola humana e, como comprovado pelos estudos clssicos de Jenner, pode induzir imunidade em humanos. Os poxvrus de outras espcies de aves tambm tm sido utilizados para induzir proteo de galinhas contra a bouba (varola aviria). Um herpesvrus de perus j foi utilizado para imunizar galinhas contra a doena de Marek, causada por um herpesvrus antigenicamente relacionado. Da mesma forma, o rotavrus bovino j foi utilizado para imunizar sunos contra a rotavirose suna. O vrus da parainuenza 3 de bovinos j foi utilizado para imunizar crianas contra o vrus da parainuenza 3 de humanos. Nesses casos, o vrus vacinal apatognico para
Vacinas vricas
335
capaz de estimular resposta imunolgica sem resultar no desenvolvimento de sinais clnicos importantes. O tipo de imunidade obtido aquele considerado ideal para uma vacina, havendo estimulao dos mecanismos da resposta imunolgica inata e adaptativa. Nesta ltima, so geradas respostas celular (linfcitos Th e Tc) e humoral (linfcitos B, anticorpos), alm de imunidade de mucosas, o que conveniente no caso de se buscar proteo contra uma infeco natural que ocorra em superfcies mucosas. Esse tipo de vacina, entretanto, no considerado totalmente seguro para todos os vrus, em razo da possibilidade, embora rara, de reverso virulncia da cepa viral original. Por esse motivo, a sua administrao no recomendada para indivduos imunodeprimidos, nos quais pode causar a doena. Cabe ressaltar que as mutaes que so induzidas nos processos de atenuao viral so produzidas ao acaso e, na maioria das vezes, so desconhecidas. Isso signica que difcil prever as circunstncias nas quais poderia ocorrer a reverso virulncia. Por exemplo, algumas cepas atenuadas de vrus da laringotraquete infecciosa das galinhas (ILTV) so capazes de reverter-se forma virulenta aps algumas passagens em aves no vacinadas. Dessa forma, a utilizao dessa vacina reservada somente para as regies onde o vrus endmico ou em surtos da doena. Vacinas atenuadas contra o herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) e vrus da diarria viral bovina (BVDV) retm a sua capacidade de infectar o feto e causar perdas reprodutivas, por isso no devem ser administradas a fmeas prenhes. Os vrus atenuados utilizados em vacinas podem ser pouco patognicos naturalmente ou podem ser atenuados por mtodos articiais. A maioria das vacinas atenuadas disponveis atualmente foi obtida pela atenuao proposital do agente, por diferentes mtodos.
Marek, para proteger os pintos contra o sorotipo 1 oncognico. O sorotipo 2 pode ser isolado de galinhas, e o tipo 3 pode ser isolado de perus, sendo ambos apatognicos, mas capazes de proteger as galinhas contra os tumores induzidos pelo vrus patognico. Provavelmente a grande maioria dos vrus animais apresente alguma cepa pouco virulenta circulando na populao ou naturalmente atenuada e que poderia ser utilizada como vacina. No entanto, o procedimento mais utilizado para a produo de vacinas atenuadas a induo de atenuao de cepas originalmente patognicas.
4.1.3.2 Atenuao por passagens em cultivo celular

Em 1974, foi desenvolvida uma vacina atenuada contra a varicela, a partir de uma cepa viral denominada Oka, obtida de um isolado clnico do vrus da varicela-zoster (VZV). Essa cepa foi propagada sucessivamente em cultivos de broblastos de embrio de cobaias e em clulas WI38. O objetivo da propagao em cultivo celular era obter a atenuao do vrus, de modo a adapt-lo a um ambiente diferente daquele encontrado no hospedeiro natural, sem eliminar a capacidade de replicao viral. No caso da cepa Oka, utilizada na prolaxia da varicela, a vacina resultante capaz de induzir uma forte imunidade frente ao vrus sem produzir sinais clnicos nos indivduos vacinados, ou seja, o vrus vacinal desprovido de patogenicidade e virulncia, propriedades que caracterizam a atenuao viral. Seguindo esse mesmo princpio, passagens sucessivas de vrus em cultivos de clulas se constituem, atualmente, na maneira mais comum de se obter atenuao de vrus para uso em vacinas. Essa prtica tem sido adotada para a atenuao da maioria das vacinas vricas vivas disponveis para uso veterinrio. As passagens podem ser realizadas em linhagens celulares de espcies diferentes daquela para a qual a vacina se destina. Alternativamente, pode-se realizar passagens em clulas da mesma espcie, porm de tecido ou rgo diferente daqueles infectados naturalmente pelo vrus. Uma das formas de se obter a atenuao do CDV, que naturalmente infecta clulas
4.1.3.1 Vrus naturalmente atenuado

Determinadas cepas virais so naturalmente pouco virulentas e, assim, podem ser utilizadas em vacinas vivas sem a necessidade de atenuao prvia. Um exemplo est na utilizao de vrus dos sorotipos 2 e 3 do vrus da doena de
336
Captulo 12
linfides, a realizao de passagens sucessivas do vrus em cultivo de clulas renais de origem canina. Aps vrias passagens em cultivo celular, existe uma tendncia ao acmulo de mutaes pontuais no genoma viral, e a freqncia dessas mutaes maior nos vrus RNA. O acmulo de mutaes, algumas provavelmente em genes associados com a virulncia, eventualmente resulta na atenuao do vrus, ou seja, o vrus se adapta aos cultivos e perde algumas funes necessrias para a sua virulncia na espcie hospedeira. Uma vez atenuado, este vrus pode ser utilizado em vacinas. Uma das maiores restries a esse tipo de vacina o desconhecimento da base gentica da atenuao. Se a atenuao for devida a uma ou a poucas mutaes, existe o risco de reverso ao fentipo virulento aps a administrao ao animal. Dentre as vacinas vricas com vrus vivo de uso humano e veterinrio, a grande maioria foi obtida por este mtodo.
minado nmero de passagens, pode ser conrmada por ensaios laboratoriais e pela inoculao do vrus na espcie de interesse. Essa uma etapa indispensvel para a certicao da vacina como atenuada e estvel.
4.1.3.4 Atenuao por passagens em espcie heterloga

Os vrus destinados para uso em vacinas tambm podem ser atenuados por mltiplas passagens em uma espcie heterloga, geralmente animais de laboratrio (coelhos, camundongos, cobaias). Esse mtodo, embora seja pouco prtico e cada vez menos desejvel quando comparado ao uso de cultivo celular, o mais adequado para a atenuao de determinados vrus, como o RabV e alguns arbovrus. A espcie animal utilizada para a atenuao viral pode tambm ser prxima espcie para a qual a vacina destinada. Vacinas contra o CDV podem ser atenuadas por passagens sucessivas do vrus em fures. J a cepa chinesa do vrus da peste suna clssica (CSFV), mundialmente utilizada como vacina viva, foi atenuada por passagens sucessivas em coelhos. H algumas dcadas, vacinas contra a raiva eram produzidas pela inoculao sucessiva em crebro de coelhos.
4.1.3.3 Atenuao por passagens em ovos embrionados

A realizao de mltiplas passagens em embries de galinha tambm tem sido utilizada como forma de se atenuar vrus para uso em vacinas. Esse procedimento pode ser utilizado tanto para vrus de aves como para vrus de mamferos que replicam em embries de galinha. Dentre os vrus avirios que foram atenuados por passagens em ovos embrionados destacam-se o vrus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) e o vrus da inuenza. Vacinas contra a inuenza de mamferos (sunos e eqinos) tambm foram produzidas pela atenuao do vrus em ovos embrionados. A exemplo das vacinas atenuadas por passagens em cultivos celulares, a restrio maior desse tipo de vacina o desconhecimento da base gentica da atenuao, havendo o risco potencial de reverso virulncia. Alm de vrus avirios, diversos outros vrus podem ser atenuados desse modo. Vacinas atenuadas atravs da passagem do vrus em embries de galinha j foram produzidas contra o CDV, vrus da lngua azul (BTV) e da raiva (RabV). A reduo da virulncia, aps um deter-
4.1.3.5 Vrus temperatura-sensveis (TS)

Vrus atenuados para uso em vacinas podem tambm ser obtidos pela seleo de variantes que apresentam capacidade limitada de replicar sob temperatura corporal (37C), mas que replicam com ecincia sob temperaturas mais baixas (3033C). Os vrus que apresentam essas caractersticas so denominados vrus TS. Para a obteno dos variantes TS, o vrus cultivado em clulas sob temperaturas mais baixas que a temperatura do organismo hospedeiro (geralmente 30-33C). Isso resulta na seleo de variantes virais capazes de replicar ecientemente nessa temperatura. Esses vrus, geralmente, no so capazes de replicar temperatura corporal e, por isso, no causam infeco sistmica quando administrados ao hospedeiro. Esse tipo de vacina possui aplicao especial em viroses respiratrias, como a inuenza
Vacinas vricas
337
(gripe) humana e na infeco pelo BoHV-1 em bovinos. As vacinas TS so geralmente indicadas para administrao intranasal. Aps a administrao, o vrus vacinal replica prximo superfcie corporal (na mucosa nasal), onde a temperatura inferior temperatura corporal. Uma vacina TS contra o vrus da inuenza foi licenciada para uso humano nos Estados Unidos, enquanto uma vacina TS contra o BoHV-1 j utilizada em vrios pases, inclusive no Brasil. Uma das principais vantagens das vacinas TS contra o BoHV-1 a segurana, pois o vrus vacinal infecta as clulas do local da inoculao, mas no capaz de replicar temperatura corporal. Com isso, o BoHV-1 TS teoricamente incapaz de se disseminar de forma sistmica e infectar o feto, cuja infeco pode causar aborto.
4.1.3.6 Vrus atenuados por deleo de genes

Quando os genes envolvidos na virulncia de um vrus so conhecidos, possvel introduzir alteraes direcionadas no genoma viral atravs de manipulao gentica. Vacinas deletadas so obtidas pela remoo ou inativao de genes relacionados com a virulncia, utilizando tcnicas de DNA recombinante. Os mutantes virais que so produzidos preservam a capacidade de replicao e, por isso, retm a sua capacidade imunognica. No entanto, so incapazes de causar doena porque apresentam pouca ou nenhuma virulncia. O vrus deve se manter vivel aps a manipulao gentica e a estabilidade desta mutao pode ser evidenciada aps vrias passagens em cultivo celular. Como em qualquer outra metodologia empregada para se obter a atenuao viral, sempre existe a preocupao de evitar a reverso para a forma virulenta. Assim, procura-se fazer a excluso de um gene inteiro ou de mais de um gene de virulncia no mesmo vrus, sempre preservando a capacidade de replicao viral. Essa estratgia reduz a possibilidade de o vrus recuperar a virulncia e torna a vacina deletada mais segura do que as demais vacinas de vrus atenuados.
A atenuao que pode ser obtida nos herpesvrus um bom exemplo da produo de vacinas atenuadas por deleo. Esses vrus possuem um gene que codica a enzima timidina quinase (TK), associada com a capacidade do vrus de replicar em neurnios e ser neurovirulento. J os genes que codicam as glicoprotenas do envelope gE, gI e gC no so essenciais viabilidade e replicao viral. A eliminao do gene da TK produz um vrus mutante atenuado, com capacidade reduzida ou nula de produzir infeces neurolgicas. A deleo simultnea de outro gene resulta em um vrus vacinal ainda mais atenuado e mais seguro e, ao mesmo tempo, capaz de estimular a resposta imunolgica do hospedeiro. No Brasil, uma vacina atenuada obtida por deleo de genes (gE negativa) est licenciada para uso contra a doena de Aujeszky dos sunos. Outras vacinas desse tipo encontram-se em desenvolvimento para o BoHV-1 e BoHV-5. Vacinas contra alguns poxvrus animais tambm foram obtidas pela deleo do gene da TK, enzima que tambm est envolvida na capacidade de replicao e virulncia desses vrus.
4.1.3.7 Vrus com marcadores antignicos

Vacinas com marcadores antignicos tambm denominadas vacinas diferenciais so aquelas que induzem uma resposta sorolgica nos animais vacinados que pode ser distinguida da resposta infeco natural (Figura 12.3). Essas vacinas so muito teis em programas de controle e erradicao de infeces vricas que produzem infeces persistentes ou latentes. Nesses programas, a vacinao utilizada paralelamente a outros procedimentos, como a identicao e eliminao dos animais portadores. Nesses casos, crtico que se diferenciem os animais vacinados daqueles que so portadores do vrus. O carter diferencial em um vrus vacinal geralmente obtido pela deleo do gene que codica uma protena do envelope do vrion. A diferenciao realizada pelo uso de um teste sorolgico geralmente um teste de ELISA que detecta anticorpos contra a protena ausente no vrus vacinal, mas presente no vrus de campo. Ou seja, a deteco de anticorpos especcos contra esta protena
338
Captulo 12
indica que os animais foram infectados com o vrus de campo. Animais somente vacinados no reagem positivamente no teste. As vacinas diferenciais so comercializadas acompanhadas do teste diagnstico especco, que permite diferenciar a resposta vacinal da resposta induzida pelo vrus de campo. Esta estratgia possibilita a implantao de programas
de vacinao em reas de risco, sem prejudicar a perda da condio de rebanho livre ou prejuzo ao trnsito de animais. Como citado anteriormente, na vacina diferencial licenciada contra a doena de Aujeszky, o herpesvrus suno (PRV) sofreu a deleo do gene da glicoprotena E (gE). Esta glicoprotena, alm de no ser essencial replicao do vrus, capaz
Vacinas vricas
339
de induzir a produo de anticorpos no hospedeiro. Portanto, animais vacinados com a cepa gE negativa no formaro anticorpos especcos contra esta glicoprotena, mas os animais que forem infectados com o vrus de campo desenvolvero anticorpos contra a gE. Atravs do teste imunoenzimtico, fornecido com a vacina, podese, subseqentemente, diferenciar os sunos vacinados daqueles infectados pelo vrus de campo. Por suas caractersticas, as vacinas diferenciais so adequadas para programas de controle e erradicao de infeces, j que no impedem o trnsito e comrcio de animais. A erradicao da PRV, na Alemanha e em outros pases europeus, foi obtida com o uso de vacinas diferenciais. O programa de erradicao da PRV, nos Estados Unidos, em fase nal de execuo, tambm se valeu dessa estratgia. No Brasil, o programa de erradicao dessa doena, em Santa Catarina, utilizou uma vacina deletada na gE, associada com um teste imunoenzimtico. Vacinas diferenciais esto sendo utilizadas em vrios pases europeus em programas de controle e erradicao do BoHV-1. A possibilidade de se manipular geneticamente os vrus e modic-los antigenicamente abre a possibilidade da confeco e utilizao deste tipo de vacina contra outros vrus animais. O princpio das vacinas deletadas diferenciais e a sua utilizao para diferenciar animais vacinados daqueles infectados com o vrus de campo est ilustrado na Figura 12.3. Embora as vacinas diferenciais clssicas tenham sido concebidas para utilizao do vrus deletado como vacina viva, o vrus com marcador antignico pode tambm ser utilizado em uma vacina inativada. Da mesma forma, vacinas de subunidades e vacinas de vetores tambm permitem a diferenciao entre animais vacinados e infectados naturalmente. Ou seja, o carter diferencial pode ser obtido tanto por vacinas vivas ou inativadas geneticamente manipuladas como por vacinas de subunidades ou de vetores. Em algumas vacinas tradicionais, possvel se diferenciar a resposta vacinal da resposta infeco. Um exemplo a vacina inativada contra o vrus da febre aftosa (FMDV). Utilizando um teste que detecta anticorpos contra uma protena do vrus produzida durante a sua replicao, possvel reconhecer os animais que foram infectados
e diferenci-los daqueles que foram vacinados, pois a referida protena retirada da formulao vacinal durante o seu processamento.
4.1.4 Vetores vacinais

Vrus natural ou articialmente atenuados podem ser utilizados para carrear um ou mais genes que codicam antgenos virais imunoprotetores de outros vrus. Esses vrus funcionam, assim, como vetores vivos para a imunizao de animais. O gene de interesse pode ser inserido no genoma do vrus vetor por manipulao gentica. O resultado um microorganismo recombinante que expressa as suas prprias protenas e tambm a protena heterloga. Como conseqncia, a vacinao com este vrus induz resposta imunolgica contra as protenas do vetor e tambm contra a protena do vrus heterlogo. Os vetores de eleio devem possuir capacidade replicativa, porm devem ser pouco ou nada patognicos. De preferncia, os vrus vetores devem replicar e estimular a resposta imunolgica em stios equivalentes aos infectados pelo vrus de interesse. Dessa forma, a resposta imunolgica ser produzida nos locais naturais de infeco. Em geral, os vetores virais utilizados so aqueles que j tm o genoma seqenciado e caracterizado, alm de serem capazes de receber a insero do gene heterlogo que ir codicar o antgeno de interesse. Sendo assim, os poxvrus, os herpesvrus e os adenovrus so os vrus mais freqentemente empregados como vetores vacinais. Alm desses, diversos outros vrus vm sendo estudados como vetores para vacinas humanas e animais, como os alfavrus (vrus da encefalite eqina venezuelana [VEEV], vrus Sindbis), avivrus (vrus da febre amarela) e o poliovrus (cepa atenuada Sabin, a mesma que utilizada contra a poliomielite). O vrus da varola das galinhas, pertencente famlia Poxviridae, utilizado como vetor de antgenos do vrus da doena de Newcastle (NDV) das aves, recentemente licenciada nos EUA. Ou seja, a imunizao das aves com o vetor vacinal induz proteo contra o NDV. O vrus vaccinia e o vrus da bouba dos canrios, tambm poxvrus, so exemplos de vetores virais utilizados em vacinas j comercializadas no Brasil e em outros
340
Captulo 12
pases. O vrus da bouba dos canrios apresenta baixo ndice de replicao e incapacidade de disseminao quando inoculado em clulas de mamferos. Esse vrus tambm capaz de expressar antgenos heterlogos de maneira muito eciente e, por este motivo, usado como vetor para vacinas destinadas a outras espcies animais. Um exemplo de uso desse vrus a vacina recombinante contra a cinomose canina, j disponvel no comrcio. Os genes das glicoprotenas hemaglutinina (H ou HA) e de fuso (F) do CDV foram inseridos no genoma do poxvrus do canrio, que multiplicado at atingir altos ttulos. O
vrus recombinante , ento, utilizado para imunizar ces. O resultado a induo de resposta imunolgica contra os antgenos do poxvrus irrelevante neste caso, pois este no um vrus de ces mas principalmente contra as protenas H e F, conferindo proteo aos ces contra o CDV (Figura 12.4). O poxvrus do canrio tambm serve de vetor para vacinas contra o vrus do Nilo Ocidental (WNV) para uso em eqinos. A raiva em carnvoros silvestres da Blgica e Frana tem sido controlada com o emprego de um vetor poxvrus (vaccinia) expressando a glicoprotena G do RabV. Esta vacina de administrao
Vrus da cinomose (CDV)
Poxvrus do canrio
Genes da protenas HeF
Sntese de cDNA
cDNA
Y Y
Y
Y Y Y
|| || || || || || |
Multiplicao
||
||
||
||
||
||
||
Imunizao
Figura 12.4. Princpio das vacinas replicativas baseadas em vetores virais. Os genes de protenas estruturais imunognicas do vrus de interesse so sintetizados como cDNA e inseridos no genoma de um vrus vetor, geralmente de outra espcie animal. Este vrus vetor amplificado em cultivo celular at atingir altos ttulos e, ento, utilizado para imunizar os animais da espcie de interesse. Os animais imunizados desenvolvem resposta imunolgica contra as protenas do vrus vetor e contra a protena heterloga, conferindo proteo contra o vrus de interesse. O exemplo se refere vacina contra a cinomose, em que as glicoprotenas H e F do CDV foram inseridas no genoma do poxvrus do canrio, que , ento, utilizado para imunizar ces.
Vacinas vricas
341
oral fornecida por meio de iscas alimentares distribudas nas orestas. As raposas que receberam a vacina no apresentaram sinais clnicos de raiva ou leses de pox. A raiva silvestre em vrios pases europeus tem sido controlada pelo uso desta vacina. Os adenovrus bovino, ovino e suno so tambm bons vetores vacinais, pois so vrus de manipulao relativamente fcil e de genoma bem caracterizado, que permite a insero de grandes seqncias de genes sem necessitar a remoo de seqncias originais do vrus. Os adenovrus apresentam tropismo para diferentes tipos celulares e facilidade de replicar em altos ttulos em cultivos celulares. Esta estratgia foi utilizada para a produo de uma vacina contra a FMDV, na qual um adenovrus humano no-replicativo expressa protenas do capsdeo do FMDV. Uma vacina contra o papiloma genital humano causador do carcinoma de colo de tero foi produzida pela insero de genes do papilomavrus humano no genoma de um adenovrus. Uma vacina contra a gripe humana foi produzida utilizando um adenovrus no replicativo como vetor para a hemaglutinina do vrus da inuenza. Os herpesvrus tambm tm sido explorados como vetores potenciais para carrear antgenos de outros vrus pela facilidade de atenu-los (por deleo de genes) e pela grande capacidade do genoma (permite a insero de um ou mais genes). Dentre os usos experimentais de herpesvrus como vetores vacinais incluem-se: BoHV-1 expressando antgenos do RabV, do BVDV e do vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV). O resultado uma vacina polivalente para bovinos que estimula o sistema imune no local de entrada desses vrus. Umas das caractersticas desejveis nos vetores virais a ausncia de excreo ou excreo mnima do vrus no ambiente. No caso dos vetores de herpesvrus, existe ainda a preocupao com a possibilidade do vrus vetor estabelecer latncia no animal vacinado. Estudos realizados com o herpesvrus canino (CHV) como vetor vacinal para uso em raposas demonstraram que, embora o vrus tenha sido detectado nos stios de latncia, no foi observada a reativao viral.
O genoma do herpesvrus suno apresenta boas caractersticas para a insero de genes heterlogos e, por isso, vem sendo utilizado experimentalmente como vetor para genes de outros vrus sunos, como o CSFV e o circovrus suno (PCV). O resultado um herpesvrus atenuado que atua como vacina multivalente e apresenta timas perspectivas para vacinao em sunos. O herpesvrus suno tambm pode ser utilizado como vetor para outras espcies animais, havendo estudos que o utilizam como vetor de genes do FMDV. As vacinas que utilizam vetores virais apresentam a vantagem de no sofrerem interferncia da imunidade passiva materna, pois os animais geralmente no possuem imunidade contra antgenos do vrus vetor. Da mesma forma, se o vrus vetor for um vrus no-patognico para a espcie animal vacinada, no existe o risco de tornar-se virulento. Eles tambm so boas alternativas de vacinas contra vrus que replicam de maneira insatisfatria em cultivos celulares. Conforme o local de replicao do vetor utilizado, haver o estmulo de imunidade de mucosas (penetrao em mucosas) ou imunidade mediada por linfcitos T (penetrao intracelular). Certamente, novas vacinas de vetores virais sero incorporadas ao mercado nos prximos anos, pelas vantagens e aplicaes potenciais que apresentam. Algumas bactrias tambm podem ser utilizadas como vetores para a expresso de antgenos virais. Nesse caso, o gene que codica uma protena viral imunoprotetora pode ser inserido no genoma bacteriano, atravs de manipulao gentica. A bactria recombinante , ento, amplicada em cultura e administrada pela via oral ao hospedeiro. Ao atingir o intestino, a bactria se multiplica e produz o antgeno viral, que apresentado ao sistema imunolgico. Enterobactrias, como Escherichia coli (E. coli) e Salmonella, so consideradas boas candidatas a vetores de antgenos de vrus entricos devido perspectiva de apresentao do antgeno viral diretamente no tecido linfide que est associado ao intestino. Vetores bacterianos para antgenos virais apresentam boas perspectivas para uso em humanos, pois alm de induzirem resposta imunolgica lo-
342
Captulo 12
cal (IgA), podem ser administrados pela via oral, o que tambm representa uma vantagem.
4.2 Vacinas no-replicativas

As vacinas no-replicativas no contm o agente vivel e, por isso, so mais seguras do que as vacinas com vrus replicativo. Assim, no oferecem a possibilidade de reverso virulncia e de causar doena. No entanto, por no resultarem em amplicao do antgeno como ocorre com as vacinas vivas e por no induzirem resposta mediada por linfcitos Tc, apresentam efetividade geralmente inferior s vacinas com vrus replicativo. No entanto, essas vacinas possuem inmeras aplicaes e tm contribudo para o controle e erradicao de vrias doenas vricas importantes, como a febre aftosa. Vrias vacinas no-replicativas esto disponveis no mercado e outras tantas esto em fase de desenvolvimento ou testes. As vacinas no-replicativas podem ser compostas por vrions inativados, por fraes ou protenas extradas dos vrions, por protenas virais recombinantes, por peptdeos sintticos correspondentes aos determinantes antignicos imunoprotetores das protenas e, nalmente, por DNA ou RNA que codica a protena de interesse (Figura 12.5). Dentre estas, a maioria contm partculas vricas ntegras, porm desprovidas de infectividade (vacinas inativadas ou mortas).
4.2.1 Vacinas com vrus inativado

Vacinas inativadas, tambm chamadas de vacinas mortas, so obtidas a partir do vrus infectivo original, que passa pela eliminao irre-
versvel da sua infectividade por mtodos fsicos ou qumicos. So, portanto, vacinas compostas de partculas vricas ntegras, porm inertes e sem capacidade replicativa. So consideradas vacinas seguras porque possveis vrus contaminantes, se presentes no estoque original de vrus, so tambm inativados durante o processo de inativao. Alm disso, aps a inativao, no existe possibilidade de retorno do vrus vacinal forma virulenta. Para a produo da vacina, o vrus inicialmente amplicado em um sistema biolgico (cultivo celular, ovos embrionados) at atingir altos ttulos. Esses vrus so, ento, submetidos ao processo de inativao, que objetiva eliminar a sua viabilidade. Durante a eliminao da capacidade infectiva do vrus, procura-se preservar a capacidade antignica, de modo que a resposta imunolgica seja devidamente estimulada. A manuteno da integridade da conformao dos antgenos imunoprotetores um fator que pode inuenciar na resposta imunolgica. Produtos qumicos, como o formaldedo, etilenemina e propiolactona, so utilizados para inativar vrus para uso em vacinas. Esses qumicos, contudo, se empregados em concentraes e tempo excessivos, podem alterar a conformao de epitopos virais e, conseqentemente, resultar em reduo da imunogenicidade do antgeno. Atualmente, a -propiolactona e os derivados da etilenemina so os inativantes mais utilizados pela indstria de vacinas. A imunidade decorrente da aplicao de vacinas inativadas tipicamente humoral, uma vez que as partculas inativadas so incapazes de replicar no organismo hospedeiro e, deste modo, desencadear a resposta celular mediada por lin-
Vacinas no-replicativas (sem vrus vivo)
Vacinas inativadas
Vacinas de subunidades
Protenas recombinantes
Vacinas de peptdeos sintticos
Vacinas de DNA e RNA
Figura 12.5. Tipos de vacinas que no contm o vrus replicativo.
Vacinas vricas
343
fcitos Tc. Aps a administrao de uma vacina inativada, ocorre a estimulao de clones especcos de linfcitos B, parte dos quais se transformam em plasmcitos secretores de anticorpos e parte se transformam em clulas de memria, de longa durao. Clones de linfcitos Th so tambm estimulados e auxiliam a proliferao e diferenciao dos linfcitos B por meio da secreo de citocinas (interleucinas). Em uma exposio posterior ao mesmo agente, as clulas de memria so rapidamente estimuladas e se diferenciam em plasmcitos. Os plasmcitos secretam grandes quantidades de anticorpos, muitos dos quais com atividade neutralizante, que so responsveis pelo combate ao agente e controle da infeco. Atualmente a maioria das vacinas virais utilizadas em medicina veterinria so inativadas. O controle e a erradicao da febre aftosa, no Brasil, so baseados na poltica de vacinao com uma vacina inativada. A vacina contra a raiva, que utilizada em diferentes espcies, tambm obtida pela amplicao do vrus em clulas de cultivo e posterior inativao. Vrias vacinas inativadas esto atualmente em uso para proteger animais de viroses. Ainda que sejam seguras e estveis temperatura ambiente, a magnitude e a durao da imunidade resultante do uso dessas vacinas so relativamente menores do que as produzidas pelas vacinas atenuadas. A incapacidade de replicao do vrus determina a necessidade de realizar reforos vacinais, alm de se incluir grande quantidade de antgeno na vacina, o que pode elevar o seu custo. Apesar dessas estratgias, os resultados so geralmente inferiores aos obtidos com vacinas vivas. Alm disso, as vacinas inativadas requerem o uso de potencializadores da resposta imunolgica denominados adjuvantes que tambm aumentam o seu custo e provocam efeitos colaterais. No obstante, as vacinas inativadas continuam sendo a nica opo contra algumas doenas, seja pela impossibilidade de se obter suciente atenuao do agente ou pela impossibilidade de se usar o vrus replicativo em algumas situaes, como em fmeas prenhes ou em reas livres.
4.2.2 Vacinas de subunidades virais

O sistema imunolgico por meio de suas clulas e molculas no reconhece a estrutura completa do vrus. Ao contrrio, reconhece e interage com pequenas regies das protenas que compem as partculas vricas. Essas regies, que na realidade so determinadas seqncias de aminocidos, so denominadas epitopos ou determinantes antignicos. Dentre os epitopos que um vrion possui, alguns so mais imunognicos do que outros. Alm disso, a maioria dos epitopos virais no gera imunidade protetora, capaz de neutralizar os vrions ou provocar a lise das clulas infectadas. No entanto, existem protenas e epitopos altamente imunognicos, contra os quais a resposta imunolgica altamente efetiva. Dessa forma, possvel produzir vacinas com fraes ou protenas do vrus, selecionadas dentre as mais imunoprotetoras. Para isso, o vrus deve ser inicialmente cultivado e produzido em grande quantidade. A seguir, uma ou mais dessas protenas virais so puricadas por mtodos qumicos e administradas junto com adjuvantes na forma de vacina (Figura 12.6). Por conterem apenas fraes do vrus, essas vacinas so denominadas vacinas de subunidade. Portanto, as vacinas de subunidade contm apenas pores ou protenas do vrus, e no o vrus completo, sendo desprovidas de capacidade replicativa e so muito seguras. Essa metodologia tem sido utilizada para a produo de vacinas contra a inuenza humana. Para tal, diferentes cepas do vrus so cultivadas em ovos embrionados de galinhas seguido de inativao e subseqente puricao das hemaglutininas virais que iro constituir a vacina. Uma outra opo disponvel a vacina contendo as glicoprotenas da superfcie do vrus (hemaglutinina), que so reunidas e administradas na mesma vacina. A vacina clssica contra o vrus da hepatite B humana (HBV) era produzida pela puricao de partculas subvirais inertes, obtidas do plasma de indivduos portadores. Contudo, apesar dos diversos trabalhos de pesquisa descritos, ainda no h opes de vacinas de subunidades disponveis no comrcio para vrus de interesse veterinrio.
344
Captulo 12
Vrus de interesse
NA HA
4.2.3 Vacinas de protenas recombinantes

A base dessas vacinas semelhante s anteriores, com a diferena que a protena viral de interesse no extrada dos vrions, e sim produzida em organismos recombinantes. O gene de interesse removido do vrus e inserido no genoma de bactrias ou leveduras, que passam a produzir a protena em grande quantidade, possibilitando a sua puricao e administrao na forma de vacina (Figura 12.7). Este sistema, alm de produzir uma maior quantidade da protena imunoprotetora, tambm seguro e de baixo custo. A vacina atual contra a HBV, licenciada e disponvel para a imunizao humana, foi produzida a partir da clonagem de genes que codicam o antgeno de superfcie do HBV (HBsAg) em levedura. Os antgenos produzidos pelas leveduras recombinantes so subseqentemente puricados e utilizados como vacina. A administrao dessa protena ao hospedeiro estimula o desenvolvimento de resposta imunolgica especca contra o vrus. Utilizando o sistema de bactrias ou leveduras, genes que codicam capsdeos virais tambm podem ser clonados em plasmdeos e produzidos em grande escala. As protenas produzidas se organizam em uma estrutura semelhante ao vrus original, porm vazio (virus-like particles), e podem ser utilizadas como vacina. Como essas partculas virais no possuem cidos nuclicos e capacidade de replicao, so desprovidas de infectividade e totalmente seguras. Embora essas partculas j tenham sido produzidas experimentalmente para vrias espcies de rotavrus, calicivrus, picornavrus e orbivrus, ainda no esto licenciadas no mercado veterinrio. Alternativamente, vrus de plantas, como o vrus do mosaicotabaco, podem servir como vetores de antgenos vacinais, que so administrados a plantas transgnicas que produzem o antgeno. Vacinas que utilizam esta estratgia de plantas transgnicas j foram desenvolvidas contendo genes do FMDV e do BoHV-1. Recentemente, foi produzida e est disponvel no comrcio uma vacina recombinan-
Purificao das protenas
HA
NA
Administrao ao hospedeiro
|| || ||
Figura 12.6. Princpio das vacinas de subunidades virais. O vrus de interesse amplificado at atingir altos ttulos. As protenas de interesse so, ento, purificadas por mtodos qumicos e utilizadas para imunizar os hospedeiros. O exemplo se refere s vacinas de subunidades contra o vrus da influenza humana, que contm fraes purificadas das glicoprotenas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).
|| || || || || || || || || || |
Vacinas vricas
345
Vrus de interesse
gp70
Clonagem do gene da gp70 em bactria ou levedura
Multiplicao em grande escala
Purificao da protena
te contra o papilomavrus humano (HPV), agente associado com carcinoma de colo uterino em mulheres. A protena do capsdeo do HPV produzida em levedura, e as suas unidades se associam formando estruturas semelhantes aos vrions (virus like particles, VLPs). Essas partculas so, ento, utilizadas como imungeno e induzem boa proteo contra a infeco. Uma vacina contra o vrus da leucemia felina (FeLV) foi produzida pela expresso da glicoprotena viral gp70 em E. coli (Figura 12.7). Vacinas que utilizam protenas puricadas estimulam linfcitos Th CD4+, alm de resposta humoral mediada por linfcitos B e anticorpos, contudo, no geram uma resposta relevante de linfcitos Tc. A ausncia de resposta citotxica deve-se ao fato de essas protenas serem processadas e apresentadas quase exclusivamente associadas ao complexo de maior de histocompatibilidade (MHC) classe II. Como resultado, no h a adequada estimulao e resposta mediada por linfcitos Tc, que dependem de estimulao via MHC-I. Vacinas contendo protenas recombinantes apresentam perspectivas promissoras para uso em vrias doenas vricas animais e humanas.
gp70
4.2.4 Vacinas de peptdeos sintticos

Administrao ao hospedeiro
Figura 12.7. Princpio das vacinas de protenas recombinantes. O gene que codifica uma protena estrutural imunognica do vrus inserido no genoma de bactrias ou leveduras, que passam a expressar a protena. Esses organismos so cultivados em grande escala e a protena de interesse purificada e utilizada para imunizar os animais. O exemplo se refere vacina de protena recombinante contra o FeLV, em que a glicoprotena gp70 produzida em um sistema heterlogo e utilizada como vacina.
Por maior que seja a molcula do antgeno, somente alguns epitopos so importantes para o reconhecimento pelos linfcitos B e induo da resposta imunolgica. Assim, os epitopos virais, que so bem conhecidos e caracterizados por apresentarem maior capacidade imunoprotetora, podem ser sintetizados em laboratrio, resultando em uma vacina de peptdeos sintticos. Ou seja, essas vacinas contm apenas as seqncias de aminocidos correspondentes aos epitopos relevantes, produzidas sinteticamente em laboratrio. Os peptdeos produzidos so quimicamente anlogos aos determinantes antignicos originais e, em geral, contm de 3 a 10 aminocidos. Por meio desta metodologia, foi possvel estimular a produo de anticorpos neutralizantes contra RabV, FMDV e parvovrus canino.
|| || || || || || || || || || || || || |
346
Captulo 12
Os linfcitos B reconhecem antgenos na sua conformao natural. Assim, muitos dos epitopos capazes de estimular resposta humoral necessitam manter esta conformao. No entanto, grande parte dos peptdeos que so sintetizados apresenta-se como cadeias curtas de forma linear, no dispondo de conformao terciria ou quaternria. Como conseqncia, o nvel de induo dos linfcitos B e a atividade dos anticorpos que induzida pelas vacinas de peptdeos sintticos so baixos e insatisfatrios quando comparados com aqueles induzidos pelas vacinas compostas por partculas virais completas ou por protenas puricadas. Uma das estratgias usadas para contornar esta baixa imunogenicidade a ligao dos peptdeos a protenas maiores para induzir uma melhor resposta e produo de anticorpos.
4.3 Vacinas de DNA e RNA

No incio dos anos 1990, foi demonstrado que a administrao intramuscular de um DNA plasmideal contendo um gene sob a regulao de um promotor de eucariotas era capaz de levar expresso da protena codicada pelo gene nas clulas do animal inoculado. Dessa forma, foram criadas as vacinas de DNA, que consistem de DNA exgeno contendo o gene da protena de interesse sob regulao de um promotor. A inoculao desse DNA em animais resulta na produo da protena viral nos tecidos do hospedeiro, o que desencadeia uma resposta imunolgica contra ela. A natureza da resposta desencadeada altamente desejvel: alm de resposta humoral, essa estratgia permite a estimulao de linfcitos Tc, que so importantes na resposta contra vrus. A elaborao de uma vacina de DNA necessita a identicao prvia de um gene que codica uma determinada protena imunodominante e indutora de resposta protetora, o qual inserido em um plasmdeo de expresso. Esse plasmdeo, que serve como vetor vacinal, contm um promotor eucaritico forte e um marcador de seleo para a produo do DNA em grande escala em bactrias. Uma grande quantidade desses plasmdeos produzida em E. coli, sendo, ento, puricada e inoculada no hospedeiro. Uma vez
no organismo hospedeiro, o DNA transportado at o ncleo das clulas locais, onde o gene ser transcrito, a protena produzida e, posteriormente, apresentada ao sistema imunolgico. O resultado a estimulao de resposta imunolgica humoral e celular contra esta protena e, como conseqncia, contra o vrus que a possui em sua estrutura. As vias de administrao mais utilizadas para as vacinas de DNA so a intramuscular e a intradrmica, atravs das quais os plasmdeos podem ser injetados associados a lipdeos catinicos ou atravs da metodologia de balstica (gene-gun). Nos experimentos realizados at o presente, os nveis de anticorpos detectados aps a vacinao ainda so baixos. De fato, para induzir uma resposta imunolgica satisfatria, necessria a inoculao de uma grande quantidade de DNA. Por isso, a administrao das vacinas atravs de gene-gun tem se mostrado mais eciente frente s demais vias, j que possibilita administrar grandes quantidades de DNA, capazes de gerar resposta imune de maior magnitude. Porm, as diculdades prticas da adoo desse mtodo para aplicao da vacina tornam remota a sua adoo na rea veterinria. Embora o mecanismo de ao das vacinas de DNA seja aparentemente simples, pouco ainda conhecido sobre a maneira exata pela qual desencadeiam a resposta imunolgica. Sabe-se que a produo dos antgenos imunognicos ocorre intracelularmente no organismo hospedeiro, portanto, no existem os riscos observados nas vacinas vivas, tais como infeco, produo de latncia e desenvolvimento de imunidade contra o vetor vacinal. Os peptdeos resultantes so reconhecidos como no-prprios, sendo, ento, processados por clulas apresentadoras de antgenos e expostos s clulas do sistema imune, via MHC classe I e II, resultando na induo de resposta de linfcitos Tc e Th, respectivamente. A resposta de linfcitos Tc uma das principais vantagens das vacinas de DNA em relao aos outros tipos de vacinas no-replicativas, que somente estimulam linfcitos Th. Diversos estudos indicam que a resposta humoral e celular resultante bastante satisfatria e, experimentalmente, no foram detec-
Vacinas vricas
347
tadas interferncias com a imunidade passiva. Uma variao das vacinas de DNA so as vacinas de RNA. Nesses casos, o RNA mensageiro (mRNA) que codica protenas virais de interesse produzido in vitro e incorporado em lipossomos ou em micropartculas. A inoculao dessas partculas ou lipossomos no animal resulta em transporte do mRNA para o interior das clulas, onde ocorre a traduo e produo da protena. Esta protena , ento, apresentada ao sistema imunolgico, resultando em estimulao de resposta humoral e celular. Embora as vantagens e aplicaes originalmente vislumbradas, as vacinas de DNA e RNA ainda no encontraram a aplicao inicialmente prevista. Atualmente, apenas uma vacina de DNA encontra-se disponvel para uso veterinrio. Esta vacina disponvel nos EUA direcionada para proteger eqinos contra o vrus do Nilo Ocidental (WNV), infeco emergente nas Amricas.
4.4 Vacinas monovalentes e polivalentes

Vrias vacinas de uso humano e animal contm antgenos de mais de um vrus e tambm de bactrias em sua formulao. O objetivo de se formular vacinas di-, tri-, tetra- ou polivalentes o de facilitar o manejo da vacinao, ou seja, imunizar os animais contra vrios patgenos em apenas uma ocasio. Dentre as vacinas multivalentes, podem-se mencionar dois tipos, de acordo com o objetivo e abrangncia: a) vacinas multivalentes direcionadas contra sndromes clnicas denidas; b) vacinas multivalentes direcionadas contra vrus no-relacionados, mas que so prevalentes na populao. Dentre as primeiras, incluem-se as vacinas contra os vrus que compem o complexo respiratrio bovino (BoHV-1, BVDV, vrus da parainuenza 3 e BRSV), que freqentemente esto associados na etiologia dessa patologia. Nessa categoria tambm se incluem as vacinas contra diarrias neonatais de bovinos e sunos, que possuem rotavrus e coronavrus em sua formulao, alm de antgenos bacterianos. Dentre as vacinas multivalentes contra vrus norelacionados, incluem-se as vacinas contra viro-
ses de ces, que contm antgenos de at cinco vrus diferentes em sua formulao, alm de antgenos bacterianos. Estas apresentam como objetivo imunizar os animais contra os agentes mais prevalentes da espcie, mesmo que alguns no apresentem relao epidemiolgica entre si. So disponveis comercialmente tambm vacinas die trivalentes, contra vrus de maior importncia em determinadas situaes epidemiolgicas. A maior vantagem das vacinas multivalentes a praticidade, pois permitem a imunizao dos animais contra vrios agentes na mesma aplicao. Essas vacinas, no entanto, apresentam algumas restries potenciais do ponto de vista imunolgico: a) exigem a resposta simultnea do sistema imunolgico contra um nmero muito grande de antgenos; b) mesclam antgenos imunodominantes com antgenos menos dominantes; c) incluem agentes imunosupressores em algumas delas; d) unicam a ocasio da aplicao, que pode no ser tima para vrios dos antgenos presentes; e) algumas mesclam vrus vivo com vrus inativado. Mesmo assim, vrias vacinas de uso animal contm antgenos de mais de um vrus em sua formulao e muitas delas tm sido usadas com sucesso para o m a que se destinam. As vacinas replicativas e no-replicativas apresentam propriedades e restries, de acordo com a sua formulao e nalidade a que se destinam. As principais vantagens e desvantagens desses dois tipos de vacina esto apresentadas na Tabela 12.2.
5 Adjuvantes
Os adjuvantes so substncias que tm a funo de potencializar a resposta imunolgica induzida por vacinas no-replicativas, constitudas por vrus inativados, subunidades ou protenas recombinantes. As protenas na forma solvel e os antgenos puricados e de baixo peso molecular que compem essas vacinas podem ser pouco imunognicos, mas apresentam um aumento acentuado na sua imunogenicidade quando so combinadas com adjuvantes. Por isso, com exceo das vacinas atenuadas (compostas de vrus vivo) e das vacinas de DNA e RNA, as outras for-
348
Captulo 12
Tabela 12.2. Propriedades e restries das vacinas vricas replicativas (vivas) e no-replicativas (no-vivas)
Caracterstica
Imunidade mediada por linfcitos TcD8+ Durao da imunidade Necessidade de adjuvante Quantidade de antgeno por dose Nmero de doses Via de administrao Estabilidade trmica Reverso forma virulenta Uso em fmeas em gestao
Replicativas
Sim Longa No Pequena Uma (geralmente) Injetvel ou oral Lbil Raro No recomendado
N-replicativas
No Curta Sim Grande Vrias Injetvel Estvel No Sim
mas de vacinas no-vivas devem, necessariamente, incluir adjuvantes em sua formulao. Alm de aumentar a magnitude da resposta imune, alguns adjuvantes so capazes de promover a induo da imunidade de mucosas e estimular linfcitos Tc, aumentando a ecincia de macrfagos e clulas dendrticas na apresentao de antgenos e prolongando a expresso do complexo peptdeo/MHC-II na superfcie de clulas
apresentadoras de antgenos. Por outro lado, a maioria dos adjuvantes no capaz de formar ligaes estveis com o antgeno. Diversas substncias tm sido utilizadas como adjuvantes, diferindo na sua composio, que geralmente determina o modo de ao (Tabela 12.3). Em geral, existem dois mecanismos principais de atuao: sistemas de entrega do antgeno e adjuvantes imunoestimuladores.
Tabela 12.3. Principais adjuvantes utilizados em vacinas de uso veterinrio e seu mecanismo de ao Tipo de adjuvante Sais inorgnicos Forma de ao Armazenamento e liberao gradual do antgeno. Armazenamento e liberao gradual do antgeno, estimulao de macrfagos Estimulao de macrfagos e induo da liberao de citocinas. Armazenamento e liberao gradual do antgeno. Liberao do antgeno encapsulado no citosol, estimulando linfcitos T citotxicos. Citocinas Estmulo de clulas T citotxicas ou de clulas dendrticas. Exemplos Hidrxido de alumnio, fosfato de alumnio, fosfato de clcio. Adjuvante completo de Freund. LPS, BCG (linhagem atenuada de Micobacterium bovis).
Componentes de bactrias
Partculas lipdicas
Adjuvante incompleto de Freund (emulso de leo em gua). Lipossomos, virossomos, ISCOMs.
Interleucinas 1, 2 e 12; Interferon alfa e gama.
Vacinas vricas
349
Sais inorgnicos, como o hidrxido de alumnio, promovem a precipitao e a deposio do antgeno no local da aplicao da vacina, de onde ser liberado gradualmente. A liberao lenta do antgeno tambm o princpio de ao das emulses de gua em leo, como o adjuvante incompleto de Freund, que forma depsitos no tecido inoculado. Fraes de origem bacteriana podem ser timos adjuvantes. Os lipopolissacardeos (LPS) bacterianos desencadeiam sinais que tornam as clulas apresentadoras de antgeno mais ativas. Esses compostos induzem ainda a produo de citocinas inamatrias e, conseqentemente, a resposta imunolgica local de magnitude superior. O adjuvante completo de Freund contm, alm do leo mineral, micobactrias inativadas, cujos componentes da parede celular so capazes de aumentar a imunoestimulao. Vesculas articialmente produzidas a partir de lipdeos, denominadas lipossomos, podem incorporar antgenos no seu interior ou superfcie. Se os lipossomos forem envoltos por protenas do envelope viral, sero capazes de mimetizar o envelope natural do vrus, sendo chamados de virossomos. Vacinas contra a inuenza e vrus da hepatite A humana, baseadas em virossomos, j foram licenciadas em vrios pases europeus. Complexos imunoestimuladores (ISCOMs) resultam da mistura do antgeno ao colesterol, fosfolipdeos e saponina Quil A, um glicosdeo puricado de plantas. Os ISCOMs apresentam estrutura esfrica, com cerca de 40 nm de dimetro, e j existem algumas vacinas para uso veterinrio que utilizam este complexo como adjuvante. Outra possibilidade que surgiu atravs da tecnologia de DNA recombinante foi a fuso de protenas ou peptdeos imunoprotetores de vrus com diferentes citocinas. Esses complexos agiriam como adjuvantes e direcionariam a resposta imune desejada. As clulas apresentadoras de antgenos, particularmente as clulas dendrticas e os macrfagos, so os principais alvos da ao dos adjuvantes, resultando em efeitos diversos que produzem um aumento na resposta imune (Figura 12.8). Alguns efeitos adversos decorrentes do uso de adjuvantes devem ser considerados. Os sais inorgnicos geralmente desencadeiam reao granulomatosa no local da aplicao. O adjuvante
completo de Freund no utilizado em animais de produo, devido possibilidade de induzir reao cruzada com o teste de tuberculinizao e intensa reao local. As reaes adversas locais, bem como a possibilidade de desenvolver efeitos carcinognicos, fazem com que este tipo de adjuvante tambm no seja utilizado em vacinas humanas.
Emulses gua em leo
Sais de alumnio
LPS, adjuvante de Freund
Persistncia do antgeno
Lipossomos, polmeros de manose
Macrfago, clula dendrtica Sntese de citocinas Processamento e apresentao de antgeno
Estimulao de linfcitos Th, Tc e B
Potencializao da imunidade
Fonte: adaptado de Tizard (2001).
Figura 12.8. Mecanismos de potencializao da resposta imunolgica, desencadeados pelos principais adjuvantes utilizados em vacinas de uso veterinrio.
Somente compostos contendo alumnio, hidrxido de alumnio ou fosfato de alumnio esto atualmente aprovados para uso humano. J na rea veterinria, as substncias mais utilizadas como adjuvantes so o leo mineral e os sais minerais baseados em alumnio, embora outros compostos estejam sendo testados experimentalmente. A principal diculdade em identicar
350
Captulo 12
novos adjuvantes que, embora muitos resultados experimentais em animais demonstrem boa capacidade imunoestimuladora, esses compostos freqentemente so txicos para os animais.
6 Controle de qualidade
Durante o processo de desenvolvimento e produo, as vacinas devem ser submetidas a testes para assegurar a sua inocuidade e capacidade imunognica. Dentre os testes realizados incluem-se os de esterilidade (para assegurar a ausncia de contaminao bacteriana ou fngica), inocuidade (para certicar que no causa efeitos indesejveis), estabilidade (para vericar a estabilidade gentica e fenotpica dos vrus atenuados; ou para atestar a estabilidade do antgeno, no caso de vacinas inativadas) e potncia (capacidade imunognica). Dentre esses testes, os de potncia assumem uma importncia especial, pois avaliam a capacidade da vacina de induzir uma resposta imunolgica adequada. Em geral, esses testes so realizados na espcie animal para qual a vacina destinada. No entanto, animais de laboratrio (cobaias, coelhos) podem tambm ser utilizados, desde que se avalie previamente a resposta imunolgica dessas espcies e se compare esta com a resposta do hospedeiro natural. A capacidade imunognica de uma vacina pode ser avaliada pela deteco e quanticao dos anticorpos produzidos em resposta imunizao ou por testes de desao. A quanticao da resposta sorolgica induzida o mtodo mais utilizado para se avaliar o potencial imunognico de antgenos vacinais. Para isso, um grupo de animais vacinado e anticorpos especcos contra o vrus so pesquisados por tcnicas sorolgicas como soroneutralizao (SN) ou ELISA, a diferentes intervalos aps a vacinao. Alm da quanticao da resposta sorolgica a curto prazo (30, 60 dias), pode-se acompanhar os animais por um perodo mais longo, a m de monitorar-se a durao da resposta induzida. A maior restrio desse mtodo refere-se ao fato de que quantica apenas a resposta humoral. Portanto, mais apropriado para a avaliao de vacinas no-replicativas, que induzem resposta predominantemente humoral. Para alguns vrus,
os ttulos de anticorpos que conferem proteo j foram razoavelmente determinados. Assim, a deteco de anticorpos com ttulos desta magnitude nos animais vacinados pode ser utilizada como indicativo de proteo e da eccia da vacina. Para vacinas replicativas, no entanto, o parmetro sorolgico nem sempre reete a magnitude da resposta imunolgica, pois no avalia a resposta celular. Embora tambm utilizado para avaliar a potncia de vacinas replicativas, a sorologia deve ser considerada um indicador apenas parcial da imunogenicidade, pois essas vacinas induzem tambm resposta mediada por linfcitos Tc. O mtodo mais objetivo de se avaliar a eccia de uma vacina a vacinao seguida de desao. Nesse teste, um grupo de animais vacinado de acordo com as recomendaes do fabricante, e outro grupo permanece no-vacinado (controle). Aps algum tempo (geralmente 30-60 dias), os animais dos dois grupos so inoculados com o vrus patognico pela via natural de infeco. Essa inoculao denominada desao e objetiva mimetizar uma situao de infeco natural que os animais podem, eventualmente, enfrentar a campo. Aps o desao, os animais vacinados e os controles so monitorados quanto excreo viral e, principalmente, quanto manifestao de sinais clnicos de doena. A eccia da vacina medida por sua capacidade de reduzir a excreo viral (magnitude e durao) e, sobretudo, por prevenir a ocorrncia de doena nos animais vacinados. Se a vacina objetiva prevenir a infeco fetal e a ocorrncia de abortos, por exemplo, fmeas prenhes previamente vacinadas devem ser desaadas, e o efeito da infeco nos fetos deve ser monitorado. Embora seja o mtodo mais objetivo de avaliao de eccia vacinal, este mtodo apresenta algumas diculdades, tais como: custo elevado, diculdade crescente do uso de animais para experimentao, incerteza quanto cepa e dose viral a ser utilizada no desao, entre outras.
7 Conservao e administrao de vacinas

As vacinas podem ser administradas por diferentes vias, que so denidas pelas caractersticas do antgeno ou do vrus vacinal, do tipo
Vacinas vricas
351
de imunidade que se deseja estimular, da doena contra a qual se destinam e tambm da espcie animal na qual so aplicadas. As principais vias de administrao de vacinas vricas so: intramuscular, subcutnea, intradrmica, cutnea, ocular, oral e nasal. A maioria das vacinas animais administrada por via parenteral (intramuscular ou subcutnea); algumas so administradas por via oral (na gua de bebida ou rao) ou por meio de aerossis; e poucas so administradas atravs de escaricaes na pele. Vacinas de aplicao intraprepucial e intravaginal tambm j foram desenvolvidas para a doena genital causada pelo BoHV-1. A vacina contra o ectima contagioso de ovinos aplicada em gotas, aps escaricao da pele da face interna da coxa. A vacinao em massa a forma mais adequada para a imunizao de animais de produo, como sunos e aves, e pode ser realizada por meio da gua de beber e por aerossol. A via pela qual a vacina administrada inuencia o tipo de imunoglobulina que produzida, sendo um fator de grande importncia na preveno da infeco, pois o estmulo da imunidade deve ocorrer preferencialmente nos locais de penetrao do vrus no organismo. Como exemplo, as vacinas de vrus atenuados que so administradas pelas vias nasal e oral devem replicar no trato respiratrio e intestinal, respectivamente. Nas infeces de mucosas, como a respiratria, intestinal, genital, urinria e ocular, a IgA secretada nessas mucosas a imunoglobulina mais importante para a preveno da infeco. Portanto, h situaes em que a imunidade local mais importante do que a imunidade sistmica, o que inuencia diretamente na via de administrao da vacina. Vacinas atenuadas, administradas pela via oral contra o NDV das aves, tm a vantagem de favorecer a replicao viral no trato intestinal, promovendo o estmulo e sntese de IgA local por um perodo prolongado. O vrus da poliomielite humana replica no epitlio intestinal, que o mesmo stio de replicao da vacina atenuada de uso oral, conhecida como Sabin. A imunidade resultante , portanto, vantajosa em relao administrao injetvel da vacina. Vacinas inativadas contra a inuenza, que so
administradas na forma parenteral, podem no estimular a resposta de IgA na mucosa respiratria, stio no qual a imunidade mais importante frente a uma subseqente exposio ao vrus. Um importante avano foi obtido na indstria avcola com a demonstrao de que embries de galinha podem ser vacinados ainda dentro do ovo e, assim, desenvolver precocemente uma resposta imunolgica. A vacinao in-ovo estimula a imunidade dos pintos antes dos primeiros dias de vida, momento em que, provavelmente, tero o primeiro contato com o vrus de campo. Nesse caso, os ovos so vacinados entre os 17 e 18 dias de incubao, exatamente no momento em que feita a transferncia para os nascedouros. A vacinao in-ovo realizada de modo automatizado, atravs de um equipamento capaz de imunizar at 50.000 ovos a cada hora. Atualmente, essa via de vacinao est disponvel apenas para a doena de Marek, mas h perspectiva de se estender o mtodo para outros patgenos importantes de aves. A correta conservao desempenha um papel muito importante na eccia das vacinas. As vacinas com vrus replicativo apresentam menor estabilidade, pois o vrus pode perder a sua viabilidade sob condies inadequadas de temperatura e exposio radiao solar. As vacinas no-replicativas so geralmente mais estveis, porm tambm necessitam ser adequadamente conservadas para evitar a degradao dos antgenos e reduo da sua potncia. Como regra, recomenda-se conservar as vacinas no-vivas a 4-6C, evitando-se o congelamento e descongelamento. A maioria das vacinas vricas vivas comercializada de forma liolizada e deve ser conservada sob congelamento (-20C). Estas vacinas devem ser ressuspendidas imediatamente antes do uso, para evitar a perda da viabilidade do vrus vacinal. Recomenda-se a sua aplicao no menor intervalo de tempo possvel aps a ressuspenso. Se necessrio, podem ser mantidas resfriadas por algumas horas, evitando-se o congelamento e descongelamento. Exposio a desinfetantes, gua clorada, irradiao solar e altas temperaturas so altamente prejudiciais viabilidade dos vrus e possuem efeitos altamente deletrios sobre a eccia vacinal.
352
Captulo 12
8 Falhas vacinais
As vacinas vricas so utilizadas para conferir proteo contra exposies posteriores ao agente, impedindo que as infeces resultem em doena clnica. Se a resposta imunolgica decorrente da vacinao for de amplitude e magnitude adequadas, dever minimizar a replicao e a disseminao do vrus no organismo e prevenir a ocorrncia de manifestaes clnicas. No entanto, algumas vezes, no se obtm o efeito protetor esperado, por razes diversas. Em geral, as falhas vacinais podem ser atribudas a problemas intrnsecos da vacina, de sua conservao ou administrao, ou tambm a falhas do animal em responder vacinao (Figura 12.9). Vrias famlias de vrus, principalmente as de genoma RNA, possuem sorotipos ou variantes antignicos que possuem distribuio variada na populao. Dessa forma, pode ser importante tipicar a cepa de campo de algumas espcies de vrus antes de se recomendar a vacina mais apropriada para uma determinada regio. Um exemplo disto tem sido o IBV, contra o qual esto disponveis vrias cepas vacinais diferentes. Os isolados tm sido caracterizados por SN ou PCR, seguido de seqenciamento ou clivagem do genoma com enzimas de restrio. O resultado da caracterizao comparado com a das cepas vacinais e pode-se optar pela cepa que mais se assemelhe ao vrus de campo. Outro exemplo tem sido a vacina autgena utilizada para o controle do PCV, j que isolados de outras regies ou empresas produtoras conferem uma proteo
menos eciente. O mesmo ocorre com o BVDV, cujas vacinas disponveis no comrcio brasileiro contm isolados norte-americanos, que so antigenicamente diferentes dos isolados locais. Infelizmente, para muitas espcies de vrus, ainda existe pouca informao sobre as caractersticas genmicas e antignicas das cepas que circulam na populao animal local. Alguns mtodos utilizados para a produo de vacinas podem resultar em antgenos que so menos ecientes na ativao do sistema imunolgico se comparados com o vrus original. De fato, a destruio parcial ou completa dos epitopos imunoprotetores, que pode ocorrer durante o processamento e inativao do vrus vacinal, capaz de reduzir a sua capacidade imunognica. Ainda que o antgeno inativado permanea estvel, se estiver presente em quantidade insuciente, poder resultar no comprometimento da eccia vacinal. Em grande parte, esses efeitos podem ser minimizados com base nos testes de qualidade a que as vacinas comerciais devem ser submetidas. Esses testes devem incluir necessariamente provas de potncia vacinal, nos quais avaliada a capacidade imunognica da vacina produzida. Muitas vezes, as causas de falhas vacinais esto relacionadas ao animal e decorrem da vacinao em perodo imprprio. Uma das causas mais freqentes da falta de resposta vacinal a vacinao dos animais no perodo de incubao da doena, quando a vacina no ser efetiva. O momento de vacinar tambm deveria ser considerado na deciso de vacinar animais jovens.
Falhas vacinais
Falhas da vacina
cepa incorreta; pouco antgeno; antgeno no-protetor; pouco adjuvante/
Falhas na conservao/ administrao

conservao inadequada; administrao inadequada; animal com imunidade passiva; animal j infectado.
Falhas do animal
imunidade passiva; animal j infectado; animal imunodeprimido; animal doente; variao individual.
adjuvante incorreto.
Figura 12.9. Principais causas de falhas vacinais.
Vacinas vricas
353
Se realizada no momento em que os animais ainda esto protegidos pela imunidade passiva, a vacinao ser parcialmente efetiva devido interferncia dos anticorpos maternos. De fato, a presena de imunidade passiva provavelmente se constitui em uma das causas mais comuns de falhas vacinais. A resposta vacina pode ser prejudicada ainda por condies desfavorveis do animal vacinado, principalmente situaes de estresse, presena de doenas imunodepressoras, subnutrio ou intensa infestao por parasitas. Por todos os aspectos que inuenciam a imunidade que decorre da vacinao, sabe-se que a resposta imunolgica no ser de magnitude igual em todos os indivduos vacinados. Ou seja, cada animal responder de maneira individual. Assim, a maioria dos animais montar uma resposta moderada ou mdia; e alguns animais respondero de forma excelente e outros de forma insatisfatria. Os animais que respondem de maneira insuciente so epidemiologicamente importantes em doenas altamente contagiosas, como a febre aftosa, e representam uma possibilidade de disseminao da doena. J em viroses pouco insidiosas e de evoluo lenta, como a raiva, uma populao vacinada que responde de forma parcial vacina pode ser sucientemente capaz de impedir a disseminao da doena. A eccia das vacinas pode ser prejudicada pelo armazenamento inadequado, principalmente no caso de vacinas contendo vrus vivos mantidas sob temperaturas superiores recomendada. Mesmo que armazenadas de modo correto, o ttulo viral das vacinas vivas tende a reduzir devido inativao de vrus ao longo do prazo de validade do produto. Por exemplo, as vacinas associadas a clulas que so utilizadas contra a doena de Marek sofrem acentuada reduo do ttulo viral durante o perodo de armazenamento a -20C. Dessa forma, devem ser estocadas em nitrognio lquido e, uma vez descongeladas, devem ser aplicadas em um curto perodo de tempo. Por outro lado, a vacinao por mtodos alternativos ao parenteral, como a via nasal, oral ou por aerossis, pode dicultar no s a administrao da dose vacinal correta, como tambm a imunizao uniforme de todos os animais de um
lote. Para espcies criadas em grandes concentraes, como na avicultura industrial, a viabilidade de vacinas orais compostas de vrus sensveis ao cloro pode ser comprometida com a excessiva clorao da gua, que utilizada como veculo vacinal. Finalmente, deve ser considerada a interferncia de desinfetantes empregados excessivamente para a antissepsia que precede a administrao parenteral de vacinas vivas. Cabe ressaltar que a ocorrncia de doena branda em animais vacinados no signica necessariamente uma falha vacinal. As vacinas so produzidas para proteger os animais da doena clnica. No entanto, algumas delas no conseguem cumprir integralmente este objetivo e, mesmo animais vacinados, podem desenvolver um quadro clnico discreto. Se esta vacina for efetiva na reduo signicativa da gravidade da doena, quando comparada com animais no-vacinados, pode-se armar que a mesma cumpriu parcialmente o seu objetivo.
9 Reaes adversas da vacinao

Embora os benefcios obtidos pelo uso da vacinao sejam inquestionveis, como a erradicao de vrias doenas virais, nenhuma vacina totalmente isenta de riscos. Apesar de relativamente raros, efeitos indesejveis e prejudiciais sade do hospedeiro tm sido relatados pelo uso de vacinas. Por isso, a possibilidade de efeitos colaterais no deve ser negligenciada e os benefcios advindos da vacinao devem superar os riscos possveis resultantes de seu uso. Efeitos residuais de virulncia em vacinas vivas devem ser considerados. Um sorotipo avirulento do poliovrus, utilizado na vacina oral infantil, pode sofrer mutaes e tornar-se virulento, causando poliomielite pela administrao da vacina numa taxa de um caso a cada milho. Casos de encefalite ps-vacinal, atribuda ao vrus presente na vacina, j foram relatados em bovinos vacinados contra o BoHV-1 e em ces vacinados contra o CDV. Vacinas vivas devem ser utilizadas com muito critrio em animais imunodeprimidos. Por outro lado, a vacinao contra um agente pode causar imunodepresso, que pode ser de-
354
Captulo 12
terminante na resposta vacinao contra outros microorganismos. Vacinas atenuadas contra a parvovirose canina causam imunodepresso em lhotes, os quais podem adoecer aps a aplicao de vacina viva contra a cinomose. Tambm o estresse causado pelo manejo dos animais durante a vacinao uma causa comprovada de reativao das infeces latentes pelos herpesvrus. A vacinao de fmeas em gestao deve ser precedida de cuidados com relao deciso de vacinar contra determinados vrus, assim como na escolha do tipo de vacina a ser utilizada. Vacinas com vrus atenuados administradas a fmeas gestantes que no foram anteriormente imunizadas podem prejudicar o desenvolvimento fetal e mesmo causar abortos, como no caso do vrus da panleucopenia felina (FPLV), BoHV-1 e BVDV. Sendo assim, vacinas contendo vrus inativados so as mais indicadas para a vacinao das fmeas nesse perodo. Por outro lado, possvel que vacinas inativadas potencializem a doena decorrente de um contato posterior com o vrus de campo por parte do lhote vacinado. Esse fato j foi observado em crianas previamente vacinadas contra o vrus respiratrio sincicial (RSV) e em potros vacinados contra o vrus da encefalite eqina do leste (EEEV). Reaes de hipersensibilidade podem surgir aps a administrao de vrias doses de vacina; principalmente tratando-se de vacinas inativadas ou de anti-soro. Essas reaes podem variar de hipersensibilidade do tipo III, com intensa reao inamatria local, at distrbio vascular generalizado. Pacientes expostos ao RabV passavam pelo tratamento ps-exposio com o soro anti-rbico produzido em coelhos, que exigia mltiplas aplicaes abdominais, as quais, muitas vezes, desencadeavam reaes de hipersensibilidade. Reaes de hipersensibilidade retardada, com formao de granulomas, podem ser ocasionadas pelo uso de determinados tipos de adjuvantes, como os que agem pela formao de depsitos. Por isso, esses tipos de adjuvantes no so utilizados na formulao de vacinas para uso humano e animal. Qualquer componente da vacina pode ser responsvel pelo desencadeamento da reao, j
que a resposta de cada organismo muito peculiar. Contudo, os mais envolvidos so os antgenos derivados dos cultivos de clulas ou de ovos embrionados utilizados para o cultivo do vrus. Pessoas ou animais alrgicos a albumina do ovo podem apresentar hipersensibilidade imediata e desenvolver choque analtico em resposta a vacinas cujo vrus foi amplicado em ovos embrionados. Um efeito adverso menos deletrio a opacidade da crnea em ces decorrente da vacinao contra a hepatite viral canina com o adenovrus canino tipo 1 (CAdV-1). Este problema tem sido evitado pela utilizao do CAdV-2 na formulao vacinal, em vez do CAdV-1. O uso de vacinas pode favorecer a seleo de novas variantes antignicas dos vrus. A imunizao parcial do rebanho apontada como uma das causas de presso seletiva que favorece o surgimento de novas variantes do vrus, as quais podem substituir o vrus de campo. Em galinhas, tem sido bem evidente o surgimento peridico de novas variantes do IBV e do IBDV, apesar da massiva utilizao de vacinas contra esses patgenos.
10 Drogas antivirais
A abordagem convencional para o controle das doenas virais tem sido o desenvolvimento de vacinas efetivas, o que no tem sido possvel para um nmero considervel de agentes. Em virtude disso, uma nfase muito grande tem sido dada para a busca de drogas antivirais, sobretudo em medicina humana. No entanto, o desenvolvimento de drogas antivirais muito mais difcil do que o desenvolvimento de drogas antibacterianas, embora as perspectivas a longo prazo sejam encorajadoras. A diculdade de se obter drogas antivirais aplicveis a humanos e animais se deve principalmente ao fato de a replicao viral utilizar fundamentalmente o metabolismo das clulas hospedeiras para replicar. Desse modo, o equilbrio para evitar a replicao viral e no causar toxicidade para a clula muito sensvel. Apesar disso, o conhecimento sobre a bioqumica da replicao viral tem aumentado sensivelmente e permitido o desenvolvimento de
Vacinas vricas
355
drogas que so fundamentais para o tratamento de algumas viroses humanas (Tabela 12.4). Ainda no existem drogas licenciadas para uso veterinrio, embora existam perspectivas de que isto possa ocorrer em breve. Teoricamente, todas as enzimas e processos essenciais para a replicao viral so alvos potenciais para a terapia antiviral. Uma abordagem que tem sido utilizada para o desenvolvimento
de novas drogas a sntese de substncias que inibam essas etapas, como os inibidores da transcriptase, replicase e protease. Aps, variaes dessas drogas so sintetizadas e testadas para se obter um inibidor mais potente e menos txico. Assim como ocorre nas drogas antibacterianas, a resistncia s drogas antivirais tambm tem sido descrita. Por exemplo, existem dois tipos de drogas contra o vrus da inuenza A: os inibido-
Tabela 12.4. Drogas antivirais disponveis para o tratamento de infeces vricas humanas Droga Vidarabina Aciclovir Vrus herpesvrus herpes simplex (HSV) citomegalovrus Tipo qumico anlogo de nucleosdeo anlogo de nucleosdeo Alvo polimerase viral polimerase viral
Ganciclovir e valganciclovir Anlogos de nucleosdeo inibidores da transcriptase reversa: Zidovudina (AZT), Didanosina (ddI), Zalcitabina (ddC), Stavudina (d4T), Lamivudina (3TC) No nucleosdeos inibidores da transcriptase reversa: Nevirapina, Delavirdina Inibidores da protease: Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir Ribavirina
anlogo de nucleosdeo
polimerase viral
retrovrus (HIV)
transcriptase reversa
retrovrus (HIV)
transcriptase reversa
HIV
anlogo de peptdeo
protease do HIV
amplo espectro: HSV, HCV, rubola, sarampo amplo espectro: HSV, HCV, rubola, sarampo vrus da influenza A vrus da influenza A e B picornavrus vrus da hepatite BeC
triazol carboxamida
mutgeno de RNA
Ribavirina
triazol carboxamida
mutgeno de RNA
Amantadina, Rimantadina Relenza, Tamiflu
amina tricclica mimtico do cido neuramnico cclico pequeno
protena da matriz, hemaglutinina inibidor da neuraminidase vrions (bloqueia a ligao e desnudamento) ativa protenas de defesa
Meconaril
Interferons
protena
356
Captulo 12
res da neuraminidase e os derivados da adamantina (amantadina e rimantadina). Um estudo do Centers for Disease Control (CDC), nos EUA, em 2005, demonstrou que ambos os princpios ativos eram ecazes na reduo da durao da sintomatologia clnica, contudo, no eram ecazes contra todas as cepas circulantes. De fato, algumas cepas possuam resistncia contra mais de uma dessas drogas. Outra desvantagem que as drogas antivirais apresentam a de que so efetivas na fase mais intensa de replicao viral. No entanto, quando os sinais clnicos so mais aparentes e por isto atraem o interesse do mdico ou veterinrio grande parte da replicao viral responsvel pelas patologias observadas j ocorreu. O interesse pelo desenvolvimento de drogas antivirais foi renovado aps o surgimento de vrus para os quais a obteno de vacinas efetivas parece ser muito difcil, como o vrus da imunodecincia humana (HIV) e o vrus da hepatite C (HCV), entre outros. O desenvolvimento de drogas antivirais para vrus de interesse humano certamente trar consigo importantes avanos para a obteno de drogas aplicveis tambm em viroses animais.
11 Vacinas vricas licenciadas no Brasil

O Brasil um dos principais produtores pecurios e est entre os principais pases exporta-
dores de carne bovina, suna e de frango. Paralelamente, no mbito interno, foi possvel observar, nas ltimas dcadas, o aumento expressivo do interesse por animais de companhia, estimulando o desenvolvimento de um mercado bastante especco de produtos alimentares e de medicamentos. Nesse sentido, as vacinas desempenham um papel fundamental no controle e erradicao de vrias doenas virais humanas e animais. No mercado veterinrio de vacinas, os animais de produo apresentam a maior parcela no faturamento (88,1%), enquanto os animais de companhia j respondem por 9,3%. Somados todos os tipos de vacinas contra patgenos de animais, no ano de 2004, esse tipo de produto foi o que apresentou o maior faturamento (31,5%) no mercado de produtos veterinrios no Brasil. Atualmente, so licenciadas 433 diferentes vacinas para a linha veterinria, sendo que nem todas esto no mercado. Na Tabela 12.5, encontram-se listadas as vacinas vricas licenciadas no pas. Diante da perspectiva futura de desenvolvimento e licenciamento de novas vacinas baseadas na metodologia de DNA recombinante, muito provavelmente algumas das vacinas atuais podero ser, gradativamente, substitudas por opes mais seguras e ecientes para proteger os animais de doenas vricas.
Tabela 12.5. Vacinas de uso veterinrio, para as diferentes espcies animais, licenciadas para produo e comercializao no Brasil Espcie Vrus
parvovrus suno
Tipo
inativada atenuada por deleo gnica (TK- e gE-); inativada (inativao de mutante viral gE-) inativada inativada inativada inativada por mtodos qumicos vrus vivo patognico inativada por mtodos qumicos
Sunos
herpesvrus suno (doena de Aujeszky) herpesvrus eqino tipo 1 vrus da influenza eqina
Eqinos
vrus da encefalite Leste e Oeste vrus da raiva vrus do ectima contagioso
Ovinos e Caprinos
vrus da raiva
Vacinas vricas
357
Tabela 12.5. Continuao
Espcie
Vrus
vrus da cinomose
Tipo
atenuada por passagens em clulas; poxvrus como vetor dos antgenos HA e F do vrus da cinomose atenuada por passagens em clulas atenuada por passagens em clulas atenuada por passagens em clulas inativada por mtodos qumicos inativada por mtodos fsicos atenuada por passagens em clulas atenuada por passagens em clulas atenuada por passagens em clulas atenuada por passagens em clulas antgeno recombinante purificado inativada por mtodos qumicos inativada por mtodos qumicos inativada por mtodos qumicos inativada por mtodos qumicos, atenuada por termosensibilidade
adenovrus canino tipo 2 (traqueobronquite) parvovrus canino
Caninos
adenovrus canino tipo 1 (hepatite infecciosa canina) vrus da raiva coronavrus canino vrus da parainfluenza tipo 2 calicivrus felino herpesvrus felino (rinotraquete)
Felinos
vrus da panleucopenia felina vrus da leucemia felina vrus da raiva vrus da febre aftosa vrus da raiva herpesvrus bovino tipo 1 e 5
vrus da diarria viral bovina
inativada por mtodos qumicos atenuada por alteraes qumicas, atenuada por termossensibilidade, inativada
Bovinos
vrus da parainfluenza tipo 3
vrus sincicial respiratrio bovino rotavrus bovino coronavrus bovino vrus da doena infecciosa da bursa vrus da bronquite infecciosa aviria
atenuada (amostra viva modificada) inativada por mtodos qumicos inativada por mtodos qumicos atenuada atenuada, inativada
vrus da doena de Marek
atenuada por passagens em clulas; vrus naturalmente atenuado (HVT) atenuada, inativada
vrus da doena de Newcastle
Aves
adenovrus avirio (sndrome da queda de postura) vrus da encefalomielite aviria
inativada
atenuada por passagens em embries de galinha; cepa naturalmente atenuada inativada, atenuada por termossensibilidade
reovrus avirio
pneumovrus avirio
atenuada, inativada
vrus da laringotraquete vrus da bouba aviria
atenuada por passagens em clulas atenuada
358
Captulo 12
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Cellular and Molecular Immunology. 4.ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 2000. 553p. ANDRE, F.E. Vaccinology: past achievements, present roadblocks and future promises. Vaccine, v.21, p.593-595, 2003. BABIUK, L.A. et al. Nucleic acid vaccines: research tool or commercial reality. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.76, p.1-23, 2000. BRAMWELL, V.W.; Perrie, Y. The rational design of vaccines. Drug Discovery Today, v.10, p.1527-1534, 2005. BREWER, J.M. (How) do aluminium adjuvants works? Immunology Letters, v.102, p.10-15, 2006. DE CLERCQ, E. Advances in antiviral drug design. Amsterdan: Elsevier, v.4, 2003. 230p. DIMMOCK, N.J.; EASTON, A.J.; LEPPARD, K.N. Introducion to modern virology. 5.ed. London: Blackwell, 2001. 464p. FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, v.1, 1996. 1504p. GURUNATHAN, S.; KLINMAN, D.M.; SEDER, K.A. DNA vaccines: immunology, application and optimization. Annual Review of Immunology, v.18, p.927-974, 2000. HENDERSON, L.M. Overview of marker and differential diagnostic test technology. Biologicals, v.33, p.203-209, 2005. KUCERS, A. et al. The use of antibiotics: a clinical review of antibacterial, antifungal and antiviral drugs. 5.ed. Oxford, UK: Butterworth-Heinemann, 1997. 1992p. MKEL, P.H. Vaccines, coming of age after 200 years. FEMS Microbiology Reviews, v.24, p.9-20, 2000. MOYLETT, E.H.; HANSON, I.C. Immunization. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v.111, p.S754-S765, 2003. MURPHY, F.A. et al. Vaccination against viral diseases. In: ___. Veterinary virology. 3.ed. New York: Academic Press, 1999. Cap 13, p.225-244.
OSHOP, G.L.; ELANKUMARAN, S.; HECKERT, R.A. DNA vaccination in the avian. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.89, p.1-12, 2002. PASTORET, P.P. Veterinary vaccinology. Comptes Rendus de l`Acadmie des Sciences. Srie III, Sciences de la Vie, v.322, p.967-972, 1999. PINK, J.R.; KIENY, M.P. 4th Meeting on novel adjuvants currently in/close to human clinical testing World Health Organization -Organisation Mondiale de la Sante Fondation Mrieux, Annecy, France, 23-25 June 2003. Vaccine, v. 22, p.2097-2102, 2004. PLOTKIN, S.A. Six revolutions in vaccinology. The Pediatric Infectious Disease Journal, v.24, p.1-9, 2005. PLOTKIN, S.A. Vaccines: past, present and future. Nature Medicine, v.11, p.S5-S11, 2005. REUBEL, G.H. et al. Suitability os canine herpesvirus as a vector for oral bait vaccination of foxes. Veterinary Microbiology, v.114, p.225-239, 2006. SHAMS, H. Recent developments in veterinary vaccinology. The Veterinary Journal, v.170, p.289-299, 2005. SINGH, M.; OHAGAN, D.T. Recent advances in veterinary vaccine adjuvants. International Journal for Parasitology, v.33, p.469-478, 2003. SOUZA, A.P.D. et al. Recombinant virus as vaccines against viral diseases. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.38, p.509-522, 2005. TATSIS, N.; ERLT, H.C.J. Adenovirus vaccine vectors. Molecular Therapy, v.10, p.616-629, 2004. TIZARD, I. An introduction to veterinary immunology. 2.ed., Philadelphia, W.B. Saunders, 1982, 363p. VAN OIRSCHOT, J.T.; KAASHOEK, M.J.; RIJSEWIJK, F.A.M. Advances in the development and evaluation of bovine herpesvirus 1 vaccines. Veterinary Microbiology, v.53, p.43-54, 1996.
PARTE II VIROLOGIA ESPECIAL
CIRCOVIRIDAE
Janice Reis Ciacci Zanella
13
363 363 364 366 367
368 368 369 371 371 372 372 373 374 374
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 Replicao 5 Circovrus de interesse veterinrio

5.1 Circovrus suno tipo 2 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.1.3 Diagnstico 5.1.4 Controle e prolaxia 5.2 Anemia infecciosa das galinhas 5.2.1 Epidemiologia 5.2.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.2.3 Diagnstico 5.2.4 Preveno e controle
374
1 Introduo
Os membros da famlia Circoviridae possuem vrions icosadricos, sem envelope, com 14 a 26 nm de dimetro. O genoma DNA circular de ta simples (1.7-2.3 kb) um dos menores entre os vrus animais. Os circovrus so encontrados com freqncia em vrias espcies, mas os sunos se constituem nos nicos mamferos nos quais o vrus j foi isolado. A famlia dos circovrus animais composta por trs vrus avirios e dois sunos. Os circovrus avirios so: o vrus da anemia infecciosa das galinhas (CAV), o vrus da doena das penas e bicos dos psitacdeos (BFDV) e o circovrus dos pombos (PiCV). Dois circovrus j foram identicados em sunos: o PCV-1 e o PCV2. O PCV-1 um contaminante comum de clulas de cultivo de rim (PK-15) e no tem sido associado com doena em animais. J o PCV-2 tem sido associado com diferentes sndromes clnicas, denominadas conjuntamente de circovirose suna. Com exceo do PCV-1, as infeces com os circovrus animais so associadas com doenas potencialmente fatais. Nessas doenas, as leses nos tecidos linfides e imunossupresso so freqentes. Na dcada de 1990, houve vrias descries de outros circovrus ou circovirus-like vrus, principalmente em aves (canrios, avestruzes, gansos, dentre outros). O nico circovrus humano at hoje classicado, o torquetenovrus (TTV), foi isolado de casos de hepatite ps-transfuso. Esse vrus foi previamente classicado na fam-
lia Circoviridae e recentemente foi reclassicado em um novo gnero, denominado Anellovirus. A exemplo dos circovrus de animais, os TTV possuem vrions pequenos, no-envelopados, com DNA circular de ta simples. O genoma possui entre 3.3 e 3.9 kb. Os TTV so vrus ubquos e 60 a 100% de pessoas saudveis mundialmente j tiveram contato com o vrus. Semelhanas genmicas tambm existem entre os circovrus animais (PCV-1) e vrus de plantas (Geminiviridae), atualmente reclassicados como nanovrus de plantas.
2 Classicao
Os circovrus foram identicados, pela primeira vez, em 1974, como contaminantes de uma linhagem de clulas renais de sunos (PK-15) e foram inicialmente descritos como partculas semelhantes aos picornavrus. Posteriormente, a caracterizao do cido nuclico extrado de partculas vricas puricadas demonstrou que os vrions continham uma molcula de DNA de ta simples circular. O nome circovrus suno ou circovrus porcino (PCV) foi proposto por Tischer e colegas (1974), em reconhecimento ao primeiro vrus animal a possuir um genoma DNA circular. Essa denominao foi, posteriormente, adotada pelo Comit Internacional de Taxonomia de Vrus (ICTV) quando os membros da Circoviridae foram descritos como uma famlia de vrus (Tabela 13.1). Em seguida, o BFDV e o CAV foram tambm caracterizados e classicados conjunta-
Tabela 13.1. Reconhecimento e classificao de membros da famlia Circoviridae Vrus

PCV1 CAV BFDV
Gnero
Circovirus Gyrovirus Circovirus
Espcie
Sunos Galinha Pssaros psitacdeos
Ano de reconhecimento (caracterizao)

1974 (1982) 1979 (1989) 1984 (1989)
Doena
Nenhuma Anemia infecciosa das galinhas Doena das penas e bicos dos psitacdeos Mortalidade associada com definhamento e anorexia Circovirose suna ou sndrome multissistmica do definhamento dos sunos (SMDS)
PiCV
Circovirus
Pombos
1993 (2000)
PCV2
Circovirus
Sunos
1997 (1998)
Fonte: adaptada de Todd (2000).
364
Captulo 13
mente na famlia Circoviridae. O BFDV e os PCVs so classicados no gnero Circovirus, enquanto o CAV o nico membro do gnero Gyrovirus, com base em diferenas moleculares. Um segundo circovrus suno, o PCV-2, com caractersticas antignicas e genticas diferentes do PCV-1, foi descrito posteriormente e est comprovadamente associado com doena em sunos.
3 Estrutura do vrion e do genoma

Os circovrus possuem vrions pequenos (14-26 nm de dimetro), icosadricos, sem envelope. Pequenas diferenas estruturais podem ser observadas entre os vrions dos dois gneros (Figura 13.1). Em geral, os vrions do CAV so um pouco maiores do que os do PCV-2 e do BFDV (Tabela 13.2). A superfcie do CAV tambm possui um aspecto diferenciado quando analisada em estudos de mapas tridimensionais com amos-
tras crio-preservadas. Os capsdeos desses vrus possuem uma estrutura icosadrica, contendo 60 molculas da protena do capsdeo arranjadas em 12 unidades pentamricas. Porm, enquanto o PCV-2 e o BFDV possuem capsmeros planos bastante similares, os capsmeros do CAV possuem aparncia pontiaguda em forma de trompete. Essas caractersticas morfolgicas distintas demonstram que os vrus dos gneros Gyrovirus e Circovirus no so estruturalmente relacionados. O capsdeo do CAV composto por cpias mltiplas de uma nica protena viral, a VP1. A VP1 possui uma regio N-terminal altamente bsica de 50 aminocidos, que interage com o DNA viral encapsidado. A regio C-terminal da VP1 possui seqncias funcionais associadas com a replicao do DNA pelo mecanismo de crculo rolante (RCR ou rolling circle), o que indica que a VP1 desempenha tanto papis estruturais como funcionais.
Criomicroscopia
Mapa tridimensional
CAV
PCV2
CAV BFDV
Fonte: Crowter et al. (2003).
Figura 13.1. Vrions da famlia Circoviridae. Esquerda: criomicroscopia eletrnica do CAV (A); PCV-2 (B) e CAV/BFDV (C). Direita: mapa tridimensional dos respectivos vrions.
Circoviridae
365
Tabela 13.2. Caractersticas fsicas e bioqumicas dos circovrus Vrus

Dimetro da partcula (nm) Densidade (g/ml em CsCl) Coeficiente de sedimentao Extenso do genoma (nt) Massa da protena do vrion (kDa)
Fonte: adaptada de Todd (2000).
CAV
19.1-26.5 1.33-1.37 91S 2298/2319 50
PCV1
16.8-20.7 1.33-1.37 57S 1759 36
PCV2
15-16 1768 28
BFDV
14-20.7 1.378 1993 27, 23, 17
O capsdeo do PCV-2 consiste de mltiplas cpias de uma protena codicada pela ORF2, a qual encapsida um genoma de 1.7 kb. As protenas codicadas pela ORF2 do PCV-1 e do PCV2 possuem 66% de identidade de aminocidos. Essa protena possui uma regio N-terminal bsica, capaz de interagir com o DNA viral, porm desprovida da regio envolvida na RCR. A replicao do genoma do PCV-2 realizada com auxlio de outra protena (Rep). O BFDV possui uma organizao genmica semelhante aos PCVs, e a protena codicada pela sua ORF2 apresenta uma identidade de aminocidos de 26% com a protena homloga do PCV-2. As partculas dos circovrus podem ser puricadas em gradientes de cloreto de Csio a uma densidade de 1.35 a 138 g/ml e possuem um coeciente de sedimentao de 91S (CAV) e de 57S (PCV-1) em gradiente de sacarose. Os circovrus so extremamente estveis sob condies ambientais. Cultivos celulares, contendo esses vrus, conservam o seu potencial infectivo aps incubao a 56 ou 70C, e tratamentos a pH 3 ou clorofrmio, por 15 minutos. Essa resistncia inativao desempenha um importante papel na epidemiologia do agente e possui implicaes para o controle das infeces por esses vrus. As principais caractersticas fsico-qumicas dos vrions dessa famlia esto apresentadas na Tabela 13.2. O genoma dos circovrus uma molcula de DNA de ta simples circular, com 1.7 kb (circovrus suno), 1.99 kb (PFDV) ou 2.3 kb (CAV). O genoma dos PCVs e do PFDV possui genes que so codicados tanto pela cadeia de sentido ge-
nmico como pela cadeia complementar, estratgia denominada ambissense. No genoma dos PCVs, trs ORFs esto presentes no sentido do DNA complementar ao genoma (C1, 2 e 3) e uma ORF est presente na seqncia correspondente ao DNA genmico (V1) (Figura 13.2A). O genoma do CAV possui polaridade negativa, ou seja, as seqncias codicadoras esto presentes no DNA complementar (e nos mRNAs transcritos a partir da cpia genmica). O DNA complementar apresenta trs ORFs que codicam uma protena estrutural (VP1) e duas noestruturais (VP2 e VP3) (Figura 13.2B). A VP3 est associada com a induo de apoptose em clulas do timo de galinhas infectadas. A VP2 atua auxiliando a VP1 a adotar uma conformao adequada para a construo do capsdeo. Todos os isolados do CAV identicados at o presente pertencem ao mesmo sorotipo, e todos so patognicos quando inoculados experimentalmente em animais. Os genomas do PCV-1 e PCV-2 so semelhantes na sua organizao e apresentam 76% de homologia. Nesses genomas, existem seis ORFs potenciais, mas apenas trs codicam protenas j identicadas: ORF1, ORF2 e ORF3 (Figura 13.2A). A ORF1 codica uma protena, a Rep, essencial para replicao do DNA viral, enquanto a ORF2 codica a protena do capsdeo. A ORF3 codica uma protena viral no essencial para replicao, mas com um papel importante na induo de apoptose. A anlise do genoma de vrios isolados do PCV-2 da Europa, Amrica do Norte, sudeste asitico e do Brasil demonstraram que esses vrus so muito semelhantes entre si,
366
Captulo 13
Stem-loop
Regio do promotor
C2
AA 5'
C3 C1
PCV-2
1.767 nt
V1
CAV
2.298 nt
C3
C1
C2
Fonte: adaptado de Todd et al. ( 2001).
Figura 13.2. Estrutura e organizao do genoma dos circovrus. A) Estrutura e regies codificantes do genoma do PCV2; B) Estrutura e regies codificantes do genoma do CAV; C - ORFs presentes no DNA complementar; V - ORF presente no DNA de sentido genmico. No genoma do CAV, o mRNA correspondente as trs ORFs est representado internamente.
com homologia mdia de 96% entre os isolados. Estudos recentes, realizados na Sucia e Canad, indicam a existncia de dois gentipos diferentes do PCV2 (PCV2a e PCV2b) com uma alta identidade de nucleotdeos. O genoma dos circovrus apresenta algumas caractersticas em comum, como a presena de uma estrutura secundria em forma de grampo (stem-loop) que est associada com a iniciao da replicao do DNA viral.
4 Replicao
Os circovrus so os menores vrus capazes de replicao autnoma em clulas de mamferos. Devido sua simplicidade genmica e estrutural, a replicao requer a participao de vrias protenas das clulas hospedeiras e ocorre durante a fase S do ciclo celular. A replicao do genoma ocorre no ncleo das clulas e envolve a sntese de uma molcula de DNA de ta dupla (replicativo intermedirio). Aps a sntese do replicativo intermedirio, o genoma , provavelmente, replicado pelo mecanismo de crculo rolante.
A replicao do genoma do CAV se inicia logo aps a penetrao do vrus na clula, pela sntese da ta complementar de DNA (Figura 13.3). Essa molcula de DNA de ta dupla possui 2.298 ou 2.319 pares de bases, de acordo com a presena de quatro ou cinco seqncias repetidas de 21 nucleotdeos (nt). Uma seqncia TATA localizada na posio 324 e outros stios de ligao de fatores de transcrio possuem papel importante na regulao da transcrio do genoma (regio do promotor) e constituem a parte no-transcrita do genoma do CAV (Figura 13.2B). Aps a sua sntese, o DNA replicativo intermedirio transcrito em um RNA mensageiro (mRNA) de 2.1 kb. Este mRNA policistrnico e contm trs ORFs sobrepostas entre si, cada uma codicando uma das trs protenas do CAV: VP1 (51.6 kDa), VP2 (24 kDa) e VP3 (13.6 kDa). A partir do DNA replicativo intermedirio, so produzidas molculas de DNA de ta simples circulares, correspondentes ao DNA genmico. Essas molculas so encapsidadas por mltiplas cpias da protena VP1 (Figura 13.3). A morfognese ocorre no ncleo por mecanismos ainda no esclarecidos.
Circoviridae
367
ORF1 ORF2 ORF3 5'

AAAAn
3'
3
Vp2 Vp3
4
VP1
DNA fita dupla (replicativo intermedirio)
5 5
DNA circular fita simples
Prognie viral
Fonte: adaptado de Brentano (2000).
Figura 13.3. Ilustrao esquemtica do ciclo replicativo do CAV. A etapa inicial a sntese da cadeia de DNA complementar ao DNA genmico (1). O DNA de fita dupla (replicativo intermedirio) transcrito pela maquinaria celular, originando um mRNA de 2.1 kb (2). Este mRNA contm trs ORFs e traduzido em trs protenas (3). O DNA de fita dupla serve de molde para a replicao, com a produo de cpias genmicas do DNA (4). Este DNA , ento, encapsidado por mltiplas cpias da VP1 (5).
Os PCVs replicam em uma variedade de clulas primrias e de linhagem suna e, geralmente, no produzem citopatologia evidente. Por isso, tm sido freqentemente detectados como contaminantes de cultivos celulares. Essa propriedade possui implicaes tambm para o diagnstico, pois o isolamento viral em cultivo deve ser necessariamente seguido da deteco de antgenos ou de cidos nuclicos virais nas clulas inoculadas. O CAV replica em clulas MDCC-MSB1 (linhagem linfoblastide derivada de tumores de doena de Marek). Em passagens iniciais, o vrus
no produz efeito citoptico. O CAV pode tambm ser cultivado em pintos de um dia e em ovos embrionados de galinha.
5 Circovrus de interesse veterinrio

As infeces com os quatro membros da famlia Circoviridae so associadas com doenas potencialmente fatais em animais. Este captulo abordar apenas as duas doenas mais importantes para a produo pecuria no Brasil: as infeces pelo PCV-2 e pelo CAV.
368
Captulo 13
5.1 Circovrus suno tipo 2

A sndrome da circovirose suna a denominao dada ao conjunto de manifestaes clnicas causadas pelo PCV-2, um vrus que est disseminado em rebanhos sunos de todo o mundo. Esta doena foi diagnosticada pela primeira vez no Brasil, em 2000, no Laboratrio de Sanidade da Embrapa Sunos e Aves em Concrdia, SC. Atualmente, a circovirose considerada uma doena endmica no pas, e um aumento do nmero de casos clnicos com conrmao laboratorial tem sido observado. Apesar de ter sido reportada pela primeira vez em 2000, a circovirose suna foi diagnosticada em materiais de arquivo de 1988, sugerindo que a infeco j estava presente anteriormente no Brasil. Os fatores que determinaram o surgimento da circovirose como uma doena emergente, nos ltimos anos, permanecem desconhecidos. Seis formas clnicas ou sndromes esto relacionadas com a circovirose suna, sendo a sndrome multissistmica do denhamento (SMDS) a mais freqente e a mais bem caracterizada.
5.1.1 Epidemiologia
A SMDS foi diagnosticada inicialmente em rebanhos de alto padro sanitrio no Canad, porm tambm pode atingir plantis de ciclo completo ou unidades produtoras de leites de tamanhos variados (maiores que 50 matrizes) ou, ainda, unidades de segundo e terceiro stios de produo (crechrios e terminadores). Os sunos so mais freqentemente afetados entre as 5 e 16 semanas de idade, e a morbidade e mortalidade variam de acordo com a fase em que a doena surge e com o manejo da criao. Cerca de 50% dos sunos afetados morrem em menos de oito dias. Os demais animais podem sobreviver, mas a maioria evolui para o denhamento extremo, sem perspectiva de recuperao. Poucos animais sobrevivem e, mesmo assim, apresentam um mau desempenho produtivo. O principal problema da SMDS a sua durao nos rebanhos, podendo persistir por vrios meses se medidas apropriadas de controle no forem adotadas. Na mdia, h um aumento de trs vezes nas taxas de mortalidade na creche e
no crescimento-terminao. Em alguns rebanhos, essas taxas retornam normalidade dentro de alguns meses. Co-fatores infecciosos e no-infecciosos, assim como fatores de risco predisponentes ao estresse, como densidade elevada, variaes trmicas extremas, frio, baixa qualidade do ar, ar seco e misturas de lotes com idades diferentes podem exacerbar os sinais e a severidade da doena. Nos pases onde o vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos (PRRSV) endmica, a co-infeco com o PRRSV foi detectada na maioria dos plantis, exacerbando a SMDS. Outros agentes, como o Haemophilus parasuis, at ento pouco diagnosticados na suinocultura brasileira, passaram a possuir grande importncia aps o surgimento da circovirose. A infeco pelo parvovrus suno (PPV) tambm parece ser um importante co-fator para o agravamento da SMDS. A identicao e classicao de isolados do PCV-2, oriundos de vrios rebanhos do mundo em dois gentipos diferentes (PCV2a e PCV2b), indicam diferenas na virulncia, o que importante na evoluo da infeco e epidemiologia da circovirose suna. O PCV-2 pode ser transmitido de forma horizontal ou vertical, sendo a via oronasal a rota mais freqente de transmisso. O PCV-2 excretado nas fezes por at 13 dias aps a infeco. Os circovrus so muito resistentes s condies ambientais e aos desinfetantes. Portanto, o contato direto ou indireto com sunos infectados, instalaes, equipamentos, pessoal contaminado e fmites tambm podem transmitir o agente. O DNA do PCV-2 pode ser detectado no smen de machos infectados, mas ainda no se detectou a presena de infectividade nessa secreo. Em caso positivo, esses reprodutores poderiam representar uma fonte potencial de disseminao da infeco para matrizes, pela monta natural ou inseminao articial. Estudos de prevalncia, formas de transmisso, excreo e tropismo do vrus ainda esto sendo realizados. Estudos sorolgicos no Brasil e em outros pases indicaram que anticorpos contra o PCV-2 esto presentes na maioria dos rebanhos sunos (rebanhos SPF, unidades de terminao e criaes de fundo de quintal) e a maior parte dos animais se infecta ao redor da terceira e quarta
Circoviridae
369
semanas aps o desmame. Sudeos selvagens, como os javalis, tambm so susceptveis infeco pelo PCV-2 e desenvolvem a SMDS quando submetidos a estresse e a outros fatores de risco.
5.1.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade

O PCV-2 geralmente infecta os sunos com 5 a 16 semanas de idade, freqentemente pela via oronasal. O vrus infecta clulas do sistema imunolgico, como macrfagos, linfcitos e clulas dendrticas, e capaz de replicar em vrios tipos celulares, preferencialmente em clulas com diviso ativa. Aps a infeco e replicao em clulas do sistema imunolgico, o PCV-2 produz viremia e se dissemina sistemicamente no organismo. Devido incapacidade do animal
infectado desenvolver uma resposta imunolgica efetiva, o PCV-2 pode infectar clulas em vrios rgos, produzir leses e, assim, agravar o quadro clnico. Um desequilbrio das substncias mediadoras da imunidade, morte de linfcitos e falhas na reposio de clulas linfides colaboram para esta imunodecincia. Ainda no est claro porque apenas uma parcela dos leites infectados desenvolve a doena. A explicao pode estar relacionada com a presena de co-fatores infecciosos e no-infecciosos, que so responsveis pelo aumento dos nveis de replicao do PCV-2 nos sunos com SMDS (Figura 13.4). Sabe-se que os animais que desenvolvem a infeco subclnica apresentam uma carga viral inferior quela presente nos animais que desenvolvem a SMDS. Estes animais tambm desenvolvem ttulos superiores de anticorpos neutralizantes contra o PCV2.
Transmisso viral: via oro-nasal ou outra
Infeco pelo PCV-2 Suno de 5-16 semanas Infeco de macrfagos, APCs, clulas epiteliais
VIREMIA
Co-fatores no-infecciosos Co-fatores infecciosos
Distribuio sistmica: moncitos do sangue
Infeco subclnica PCV-2 rgos Sem leses Sangue Sangue CD8+ BeT Moncitos
SMDS PCV-2 Tecido no-linfide Tecido Linfide Pneumonia Hepatite Nefrite Enterite Clulas dendrticas B (apoptose) e T Fagcitos
Atrofia do timo Moncitos
Depleo linfocitria Infiltrao histiocitria
Fonte: adaptado de Darwich et al. (2004).
Figura 13.4. Patogenia das infeces pelo circovrus suno -2 (PCV-2).
370
Captulo 13
Do ponto de vista clnico, trs fatores principais so sugeridos para explicar a grande variao no nmero de animais afetados por lote: o efeito individual, o efeito leitegada e o efeito manejo (fatores de risco). O efeito individual decorrente da gentica individual do animal, da herana imunolgica e da sua capacidade de responder adequadamente s infeces. O efeito leitegada sugere um importante papel da matriz como possvel reservatrio do vrus e/ou na transferncia de imunidade passiva aos leites. O efeito manejo ou fatores de risco causadores de estresse, como densidade elevada, ambiente inadequado, baixa qualidade do ar, da gua e da rao, misturas de leites com procedncias e idades diferentes, falhas na limpeza/desinfeco e a no-realizao de vazio sanitrio so muito importantes. A considerao desses fatores indispensvel no planejamento de medidas de controle da SMDS. A SMDS a forma clnica mais importante associada com o PCV-2, mas o vrus tambm est relacionado com outras manifestaes clnicas. Os sinais mais importantes so o emagrecimento progressivo, anorexia, aumento de volume dos linfonodos, diarria crnica e dispnia, que no regridem com tratamentos antimicrobianos. Palidez nas mucosas, ictercia e lcera gstrica tambm podem ocorrer. Outros sinais, alguns deles relacionados com infeces secundrias como a pneumonia enzotica, colibaciloses, doena de Glasser (H. parasuis), salmonelose, infeces de pele por Staphylococcus podem estar presentes. Infeces causadas por outros vrus, como o PPV e o PRRSV, podem exacerbar os sinais clnicos, resultando em doena mais severa e taxa maior de mortalidade. As leses macroscpicas mais importantes incluem a hipertroa de linfonodos (inguinais, submandibulares, mesentricos e mediastnicos), atroa do timo e ausncia de colabamento pulmonar. Entretanto, essas leses nem sempre esto presentes e, portanto, no podem ser utilizadas como um indicador seguro da SMDS. O infartamento dos linfonodos geralmente acompanha os estgios precoces da infeco, e esses rgos podem retornar ao tamanho normal ou mesmo reduzido. Alguns linfonodos podem apresentar
pequenas reas multifocais de necrose (pontos branco-amarelados), provavelmente devido a infeces concomitantes. O fgado de animais ictricos tambm pode apresentar hipotroa e reas de descolorao. Pontos multifocais brancacentos podem ser observados na superfcie e no parnquima dos rins, porm a hipertroa renal pode ser apenas discreta. Leses de pele (manchas avermelhadas) tambm podem ser observadas em alguns casos. Muitos animais com sinais de denhamento apresentam lcera gastresofgica, responsvel por hemorragias internas e pela palidez da pele e das mucosas. Alteraes como poliserosite, hepatizao pulmonar e colite podem ser observadas, dependendo das infeces intercorrentes. O PCV-2 tambm est associado com a forma epidmica da sndrome da dermatite e nefropatia suna (SDNS) e pode ser identicado em tecidos de sunos afetados por essa sndrome. Geralmente, a SDNS a primeira manifestao clnica da infeco pelo PCV-2 observada em um rebanho, que , ento, seguida pela SMDS. A SDNS tambm pode ocorrer isoladamente, acometendo principalmente sunos com idade superior a trs meses. Os sinais da SDNS so: anorexia, edema subcutneo ventro-caudal e reas eritematosas na pele dos membros plvicos e na regio perianal. Ainda no est esclarecida a participao do PCV-2 na patogenia da SDNS. Alm das leses necrticas da pele, ocorrem leses bilaterais nos rins, que aparecem plidos, com severa hipertroa, aderncia difusa da cpsula, superfcie irregular e, s vezes, petquias disseminadas pela cortical. Estrias brancacentas, que se prolongam do crtex at a medula renal, so observadas ao corte. Em alguns casos no so observadas leses macroscpicas, e o diagnstico da doena realizado pela deteco de vasculite necrtica sistmica. O PCV-2 est geralmente associado com outros agentes patognicos em infeces mistas. Isoladamente, o agente pode causar pneumonias, enterites e distrbios reprodutivos. Essas infeces se caracterizam por pneumonia intersticial proliferativa e necrosante; enterite granulomatosa; falhas reprodutivas que resultam em abortos, mumicao fetal, natimortalidade e mortalidade
Circoviridae
371
de leites pr-desmame com miocardite. Tremor congnito em leites e doenas do sistema nervoso central (SNC) que levam leites desmamados morte sbita tambm j foram relatados. A conrmao do PCV-2 como o agente etiolgico da SMDS veio de infeces experimentais que resultaram em: a) leses caractersticas de SMDS em sunos inoculados; b) presena de altas concentraes de antgenos virais em tecidos; c) presena do DNA viral nas leses; d) isolamento do PCV-2 dos animais infectados; e) desenvolvimento de anticorpos especcos contra o agente. Nas infeces experimentais em que o PCV-2 o nico agente, os sinais clnicos e as leses foram brandos. Isso indica que co-fatores infecciosos e no-infecciosos so importantes para a manifestao do quadro clnico observado a campo. Portanto, parece que o PCV-2 necessrio, porm no suciente para reproduzir a doena, o que indica que a circovirose uma doena multifatorial.
5.1.3 Diagnstico
O diagnstico da SMDS deve ser realizado com base na anlise dos sinais clnicos, leses macro e microscpicas e deteco de antgenos ou cidos nuclicos virais nos tecidos. A imunoistoqumica (IHC) e reao em cadeia da polimerase (PCR) so muito utilizadas para demonstrar a presena do agente. Como esta sndrome cursa com sinais variados e produz imunossupresso que predispe a ocorrncia de outras doenas, trs aspectos devem ser considerados para o diagnstico: sinais clnicos: emagrecimento progressivo, problemas respiratrios e/ou diarria; leses macroscpicas: aumento de volume de linfonodos, hipotroa do timo e consolidao pulmonar com pulmes no-colabados. Leses microscpicas: depleo de linfcitos nos linfonodos e bao, inltrao de histicitos, pneumonia intersticial. A presena de corpsculos de incluso basoflicos no citoplasma de macrfagos possui valor diagnstico limitado, pois aparece somente em cerca de 30% dos casos; deteco de antgenos ou de cidos nuclicos do agente associados com as leses, por IHC ou PCR, respectivamente.
O isolamento do vrus pode ser realizado em clulas de linhagem, tais como: PK-15, ST (testculo suno) e SK-6 (rins de suno). Como o vrus replica com mais ecincia em clulas com replicao ativa, o tratamento de clulas de cultivo com substncias indutoras do ciclo celular, como a D-glucosamina, til para induzir nveis de replicao que permitam a multiplicao do agente. O PCV-2 no produz efeito citoptico em clulas de cultivo, sendo necessria a deteco de antgenos virais por imunouorescncia (IFA) ou imunoperoxidase (IPX). Anticorpos monoclonais especcos para o PCV-2 e PCV-1 so utilizados nesses testes. Anticorpos presentes no soro podem ser detectados por imunouorescncia indireta (IFI) ou por imunoperoxidase indireta, podendo ocorrer reaes cruzadas entre o PCV-1 e o PCV-2. Testes de ELISA especcos para o PCV-2 tm sido utilizados em estudos de prevalncia, porm no so recomendados para o diagnstico da doena. Em resumo, o diagnstico denitivo de SMDS deve ser realizado pela identicao de antgenos ou cidos nuclicos virais, associados com o quadro clnico-patolgico compatvel com as descries da enfermidade. O diagnstico diferencial deve ser realizado para alguns patgenos que tambm produzem sinais clnicos semelhantes, principalmente o denhamento. Inclui-se, nesses casos, a diarria causada por Lawsonia e Brachyspira. Devido possvel co-infeco pelo PCV-2 e PRRSV, algumas leses atribudas ao PRRSV podem ter sido causadas pelo PCV-2.
5.1.4 Controle e prolaxia

Vacinas especcas para o PCV-2 esto apresentando resultados promissores em pases da Europa e Amrica do Norte. No entanto, no esto disponveis comercialmente no Brasil, o que diculta o controle da doena. As vacinas, em diferentes preparaes, so disponveis para uso em porcas marrs. A vacinao das fmeas potencialmente confere proteo para a sndrome da circovirose suna atravs da transferncia passiva de anticorpos. As vacinas tambm so indicadas para uso em leites, com aplicao antes da fase de maior exposio ao agente.
372
Captulo 13
O controle da circovirose baseia-se na identicao e eliminao dos fatores de risco e na reduo dos fatores de estresse. Fatores complicadores para o controle da enfermidade incluem a grande resistncia do agente no meio ambiente e a inexistncia de tratamento especco para os sunos afetados. Os melhores resultados para a reduo da mortalidade e das perdas podem ser obtidos atravs de mudanas de manejo baseadas nos 20 pontos de Madec, o que permite redues de taxas de mortalidade abaixo dos 5% em creches. A observncia das recomendaes de Madec melhora a biossegurana da granja e reduz o potencial patognico de outros agentes de doenas que afetam os sunos, especialmente os entricos e os respiratrios. Esses pontos podem ser resumidos em: reduo do estresse: especialmente ambiental (variaes de temperatura, correntes de ar, excesso de gases e excesso de densidade animal); limitao dos contatos entre sunos: evitar enxertias e misturas de leites com idades e/ou origens diferentes, e pronta remoo dos animais doentes para baias-hospital; adoo de medidas de higiene: adotar o sistema todos dentro-todos fora com vazio sanitrio rigoroso entre lotes, utilizando desinfetantes ecazes para o PCV-2, alm de melhorar as medidas de biossegurana; boa nutrio: assegurar-se da ingesto adequada de colostro nas primeiras horas de vida e de nutrio de boa qualidade para auxiliar a siologia do sistema imunolgico (uso de antioxidantes, por exemplo); estabilizao imunitria: auto-reposio, adaptao das marrs por seis semanas antes da cobertura e realizao de um programa de vacinao efetivo das fmeas para as outras enfermidades prevalentes no rebanho. Outra recomendao importante a ampliao da idade de desmame para acima de 25 dias. Medidas bsicas de higiene, como a limpeza e desinfeco de instalaes, seguidas de vazio sanitrio, so prioritrias. Os circovrus so muito resistentes aos desinfetantes de uma maneira geral, principalmente por carem protegidos na matria orgnica. Dessa forma, importante que
se realize uma limpeza geral com o uso de detergentes, antes do uso dos desinfetantes. Estes devem ser utilizados na dosagem recomendada para inativao do vrus. Os desinfetantes mais ecazes para o PCV-2 so aqueles base de uma mistura de peroximonosulfato de potssio e cloreto de sdio, seguidos pelos desinfetantes base de hidrxido de sdio, de amnia quaternria, de hipoclorito de sdio e dos derivados fenlicos. Para prevenir a entrada do PCV-2 em granjas livres, deve-se seguir risca as medidas de biossegurana. Essas medidas devem ser tanto externas (controle de visitantes, veculos, acesso de animais, introduo de sunos e smen), quanto internas (uso de desinfetantes, controle de vetores, manejo das instalaes e reduo de estresse). Estudos recentes demonstraram a presena do PCV-2 no smen de cachaos de algumas centrais de inseminao articial do pas, achado que deve merecer ateno especial.
5.2 Vrus da anemia infecciosa das galinhas

A anemia infecciosa das galinhas (AIG) uma doena de aves jovens, que produz perdas signicativas, principalmente em frangos de corte. Apesar de a infeco ser freqente em galinhas poedeiras, a doena clnica no muito comum nessa categoria. A enfermidade mais freqente em pintinhos jovens, que se infectam de forma vertical (via ovo) a partir de matrizes com a infeco subclnica. O CAV associado AIG foi identicado, pela primeira vez, no Japo e, atualmente, est disseminado mundialmente. No Brasil, o CAV j foi identicado e a doena foi reproduzida em aves SPF (specic pathogen free). Anticorpos especcos contra o CAV foram detectados no soro de matrizes e frangos de corte no incio dos anos 1990 no Sul do Brasil.
5.2.1 Epidemiologia
O CAV est presente em praticamente todos os pases que possuem avicultura comercial, e a infeco mais freqente em lotes de matrizes acima de 20 a 25 semanas de idade. As galinhas se constituem na nica espcie susceptvel in-
Circoviridae
373
feco, e a doena no apresenta riscos sade pblica. No Brasil, estudos realizados em vrios estados demonstraram uma soroprevalncia de aproximadamente 90% nas matrizes de corte. A transmisso do CAV ocorre principalmente de forma vertical, da matriz para o embrio, mas o agente tambm pode ser transmitido horizontalmente pela via fecal-oral. O vrus excretado nas fezes e pode contaminar a cama e instalaes, podendo persistir no ambiente devido sua alta resistncia inativao. A maioria das matrizes se infecta ao redor das cinco semanas de idade, provavelmente pela ingesto de material contaminado. As taxas de morbidade, mortalidade e a severidade da doena variam de acordo com o ttulo do vrus, via de infeco, com a idade das aves, imunidade passiva, presena de co-fatores infecciosos (outros vrus imunossupressores) e noinfecciosos (ambincia, estresse, nutrio). Alm desses fatores, alguns relatos indicam a existncia de amostras do CAV de maior patogenicidade e virulncia que podem produzir quadros clnicos mais severos. As matrizes infectadas, geralmente, no apresentam sinais clnicos, e os primeiros sinais da doena aguda so observados quando os pintinhos esto com 7 a 14 dias de idade. As aves geralmente cam deprimidas, apresentando taxas de morbidade prximas a 100% e de mortalidade entre 5 e 15%, apesar de taxas de at 60% j terem sido relatadas.

O CAV infecta clulas do timo e da medula ssea, mas pode tambm ser detectado em outras clulas linfides. A replicao do CAV ocorre em clulas precursoras dos linfcitos T no crtex do timo, em clulas T maduras no bao, e em hemocitoblastos na medula ssea. A infeco de clulas progenitoras da medula, tais como os eritroblastos, hemocitoblastos e trombocitoblastos, resulta em anemia e hemorragias. O efeito imunossupressor do CAV se deve depleo de linfcitos e a alteraes na produo de mediadores qumicos da resposta imunolgica. Por isso, surtos da
doena podem ser acompanhados por infeces bacterianas secundrias (dermatites e colibaciloses), pelo agravamento de outras doenas imunossupressoras (doena de Gumboro e reoviroses) e por falhas vacinais a outras infeces virais, como as doenas de Marek e Newcastle. Em aves com idade superior a trs semanas, a infeco geralmente subclnica, mas, mesmo assim, pode causar perdas signicativas. A infeco produz alteraes na funo de macrfagos e de outras clulas responsveis pela fagocitose, apresentao de antgenos e produo de citocinas. A forma clnica mais importante associada com a infeco pelo CAV ocorre em pintinhos jovens. Nesses animais, so observados diversos graus de anemia, palidez na musculatura, barbela e crista, depresso e desuniformidade do lote. Esses sinais podem ser confundidos com outras doenas. Hemorragias musculares e dermatites secundrias tambm podem ocorrer. As leses macroscpicas mais importantes incluem hipotroa de timo e alteraes da colorao da medula do fmur. Hemorragias musculares, subcutneas ou no proventrculo podem tambm ser observadas. A co-infeco pelo CAV e o reovrus pode resultar em um quadro denominado doena da asa azul, ilustrando mais uma vez o carter multifatorial das infeces pelos circovrus. Microscopicamente, pode-se observar depleo linfocitria no timo, na bursa de Fabricius e no bao. Uma reduo de clulas hematopoiticas na medula, degenerao de hepatcitos e inltrao de macrfagos no fgado tambm podem ser observados. Estudos recentes avaliaram a persistncia do CAV nas gnadas de matrizes de corte que possuam nveis variveis de anticorpos neutralizantes e tambm a capacidade do vrus ser transmitido para a prognie. Foi observado que a transmisso do vrus ao embrio pode ocorrer independentemente dos altos nveis de anticorpos neutralizantes nas matrizes. Ainda no se tem estabelecido qual o ttulo de anticorpos neutralizantes necessrios para prevenir a transmisso vertical. Tambm desconhecido se a vacinao das matrizes, que vem sendo realizada atualmente, efetiva para proteger a prognie.
374
Captulo 13
5.2.3 Diagnstico
O diagnstico da AIG deve ser realizado com base nas combinaes entre os sinais clnicos, leses macro e microscpicas e na deteco de antgenos ou cidos nuclicos do CAV nos rgos das aves afetadas. As tcnicas de IHC, IFA e PCR so amplamente utilizadas para demonstrar a infeco pelo CAV. O isolamento viral no um mtodo recomendado para o diagnstico, pois demorado e caro. No entanto, o vrus replica em clulas MDCC-MSB1, que so clulas de linhagem de linfoma que se multiplicam em suspenso. O vrus tambm pode ser isolado pela inoculao de ovos embrionados. Anticorpos no soro podem ser detectados por imunouorescncia indireta, soroneutralizao ou ELISA (testes comerciais j esto disponveis).
CHAE, C. A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases. The Veterinary Journal, v.169, p.326-336, 2005. BRENTANO, L. Anemia infecciosa das galinhas. In: BRECHIERI JR.; A. MACARI, M. Doenas das aves. Campinas: FACTA, 2000. Cap.5.9, p. 339-350. CIACCI-ZANELLA, J.,R.; MORES, N. Diagnostic of PostWeaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in Swine in Brazil Caused by Porcine Circovirus Type 2 (PCV-2). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, Belo Horizonte, MG, v. 55, p. 522-527, 2003. CROWTER, R.A. et al. Comparison of the structures of three circoviruses: Chicken Anemia Virus, Porcine Circovirus Type 2, and Beak and Feather Disease Virus. Journal of Virology, v.77, p.13036-13041, 2003. DARWICH, L.; SEGALS, J.; MATEU, E. Pathogenesis of Postweaning Multysistemic Wasting Syndrome caused by Porcine Circovirus 2: an immune riddle. Archives of Virology, v.149, p.857-874, 2004. MADEC F. et al. La maladie de lamaigrissement du porcelet (MAP) en France. 1. Aspects descriptifs, impact en levage. Journes de la Recherche Porcine en France. v.31, p. 347-354, 1999. MANKERTS, A. et al. Molecular biology of Porcine circovirus: analysis of gene expression and viral replication. Veterinary Microbiology, v.98, p.81-84, 2004. ROYER, R.L. Susceptibility of Porcine Circovirus type 2 to commercial and laboratory disinfectants. Journal of Swine Health Production, v.9, n.5, p. 281-284, 2001. LUKERT, P.D.; ALLAN, G.M. In: Straw, B.E. et al. Eds. Diseases of swine. 8.ed. Ames: Iowa State University Press, 2002. p.119124. TISCHER, I. et al. Characterization of papovavirus and picornavirus like particles in permanent pig kidney cell lines. Zentralbl Bakterio. Parasitenkd Infektionskr Hyg Abt 1 Orig, v.26, p.153-167, 1974. TODD, D. Circoviruses: immunosuppressive threats to avian species: a review. Avian Pathol, v.29, p.373-394, 2000. TODD, D. et al. Genome sequence determinations and analysis of novel circoviruses from goose and pigeon. Virology, v.286, p.354-362, 2001.
5.2.4 Preveno e controle

A infeco pelo CAV muito comum em plantis avcolas de todo o mundo. A preveno da doena clnica pode ser obtida pela induo de ttulos altos de anticorpos nas matrizes antes do incio da idade de postura. Dessa forma, evitase a transmisso vertical do CAV. Todavia, ainda no esto claros quais os nveis de anticorpos que so necessrios para prevenir a transmisso vertical do vrus. Vacinas vivas atenuadas esto disponveis no Brasil e so recomendadas em uma ou duas aplicaes, entre as 16 e 20 semanas de idade, desde que os animais recebam a ltima dose pelo menos quatro semanas antes do incio da postura. Medidas como o controle de outros agentes imunossupressores e associados com infeces secundrias, limpeza e desinfeco das instalaes tambm auxiliam a minimizar as perdas e a melhorar a biossegurana da granja.
PARVOVIRIDAE
Mauro Pires Moraes & Paulo Renato dos Santos Costa
14
377 377 378 381
381
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 Replicao

5 Parvovrus de interesse veterinrio

5.1 Vrus da panleucopenia felina 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.1.3 Diagnstico 5.1.4 Controle e prolaxia 5.2 Parvovrus canino 5.2.1 Epidemiologia 5.2.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.2.3 Diagnstico 5.2.4 Controle e prolaxia 5.3 Parvovrus suno 5.3.1 Epidemiologia 5.3.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.3.3 Diagnstico 5.3.4 Controle e prolaxia 5.4 Parvovrus bovino
384
384 384 384 387 388 388 388 389 391 391 392 392 393 394 395 395
395
1 Introduo
Os membros da famlia Parvoviridae so vrus pequenos, esfricos, com capsdeo icosadrico, que possuem uma molcula de DNA linear de ta simples como genoma. O nome da famlia deriva do tamanho dos vrions (parvus = pequeno). Uma caracterstica marcante dos parvovrus a dependncia de clulas na fase S do ciclo celular ou em diviso, para a sua replicao. Essa dependncia se deve ao requerimento da maquinaria celular para a sntese de DNA e replicao do genoma viral, devido ao nmero restrito de genes e funes codicadas pelo genoma do vrus. Os parvovrus possuem somente quatro genes, distribudos em duas regies codicantes (open reading frames ORFs) sobrepostas no genoma DNA de ta simples de 5 quilobases (kb). Alm disso, alguns vrus dessa famlia dependem de infeco conjunta com outros vrus (adenovrus ou herpesvrus) para completarem o seu ciclo replicativo. Esses vrus so agrupados no gnero Dependovirus e no h relatos de enfermidades animais associadas com esses agentes. A dependncia de clulas na fase S do ciclo celular exerce uma grande inuncia sobre a patogenia das infeces pelos parvovrus. As infeces por esses vrus afetam preferencialmente rgos que apresentam clulas em multiplicao, como as clulas da medula ssea, clulas embrionrias e clulas precursoras do epitlio intestinal (clulas das criptas intestinais). Os parvovrus apresentam uma grande estabilidade no ambiente, podendo manter a sua infectividade durante meses, em determinadas condies, e so muito restritos quanto espcie hospedeira. Os primeiros relatos de enfermidades causadas por parvovrus em animais datam de mais de 100 anos e se referiam panleucopenia felina (FPL). Posteriormente, foram descritos o vrus da enterite dos visons (MEV), em 1947, e o parvovrus canino (CPV) em 1978. As enfermidades causadas por esses trs agentes so muito semelhantes e cursam com enterite e leucopenia. A infeco por esses agentes pode, ainda, estar associada com mortalidade e malformaes fetais. O parvovrus suno (PPV) produz infeces subclnicas em animais jovens e adultos, porm
responsvel por perdas reprodutivas importantes quando infecta fmeas prenhes. Outros parvovrus tambm so responsveis por enfermidades em gansos, roedores e humanos. Existem tambm os parvovrus isolados em galinhas, coelhos e eqinos, porm ainda no foram relatadas enfermidades associadas com esses agentes. O parvovrus bovino (BPV) encontra-se amplamente disseminado na populao bovina, no entanto, a sua importncia clnico-patolgica questionvel. Alm de sua importncia como patgenos, vrios parvovrus tm sido utilizados como vetores para a transferncia de DNA em animais. Em geral, esses vetores podem carrear at 5 kb de DNA heterlogo, tendo como vantagem a ausncia ou fraca resposta imune do animal contra o vetor, permitindo a sua ampla utilizao.
2 Classicao
Segundo o Comit Internacional de Taxonomia Viral (ICTV), a famlia Parvoviridae composta por duas subfamlias: Parvovirinae e Densovirinae. A primeira agrupa os parvovrus que infectam vertebrados e, por isso, os seus membros sero discutidos mais detalhadamente neste captulo. A segunda contm vrus que infectam insetos e, aparentemente, no possuem importncia em medicina veterinria. Os principais parvovrus de interesse veterinrio esto listados na Tabela 14.1. A subfamlia Parvovirinae dividida em cinco gneros: Parvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus (ADMV-like viruses) e Bocavirus (BPV-like viruses). O gnero Erythrovirus representado pelo parvovrus humano, o B19, que causa abortos e doena exantematosa em crianas; e por outros vrus de primatas, como o parvovrus do macaco rhesus (RhPV) e o parvovrus smio (SPV). A maioria dos gneros abriga vrus que replicam de forma autnoma. Por outro lado, os Dependovirus so dependentes de adenovrus para replicar e, por isso, so chamados adeno-associated virus (AAV). Os AAV tm sido utilizados como vetores de expresso, por serem apatognicos e por no induzirem resposta imune nos animais inoculados.
378
Captulo 14
Tabela 14.1. Principais parvovrus animais, hospedeiros e manifestaes clnicas Gnero Espcie
Parvovrus de galinha Vrus da panleucopenia felina Parvovrus canino
Abreviatura
ChPV FPLV CPV MEV
Hospedeiros
galinhas gatos ces martas (M. vision)
Manifestaes Clnicas
subclnica panleucopenia, enterite, hipoplasia cerebelar leucopenia, miocardite, enterite panleucopenia, enterite
Parvovirus
Vrus da enterite das martas Parvovrus dos mospeladas Vrus minuto dos camundongos Parvovrus suno
RPV
mo-pelada (racoon) camundongos
panleucopenia, enterite
MMV ou MVM
deformidades congnitas
PPV
sunos
infertilidade, aborto, mumificao fetal hepatite, miocardite hepatite, miocardite
Dependovirus
Parvovrus de gansos Parvovrus de patos Muscovy Vrus adeno-associados Parvovrus bovino Vrus minuto canino
GPV MDPV
gansos patos
AAV-1 a 6 BPV CnMV
vrias espcies bovinos ces
subclnica subclnica diarria
Amdovirus Bocavirus
Aleutian mink disease virus
AMDV
martas (M. Vision)
encefalopatia
No gnero Parvovirus, so classicados os agentes associados com doenas em animais, como o vrus da panleucopenia felina (FPLV), o CPV e o parvovrus suno (PPV). Originalmente, era reconhecido apenas um parvovrus de ces, o canine minute virus (CnMV), que pertence ao gnero Bocavirus e possui ocorrncia espordica. Na dcada de 1970, surgiu outro parvovrus nesta espcie, denominado parvovrus canino tipo 2 (CPV-2). Este vrus, denominado genericamente de CPV, originou-se a partir do FPLV, disseminou-se rapidamente na populao canina e, atualmente, constitui-se em um dos principais patgenos da espcie canina. Tem sido proposto que o grupo do FPLV, que inclui o CPV, o parvovrus das martas (MEV) e da mo-pelada ou racoon (RPV), constitui-se, na verdade, em uma espcie viral, e que os vrus individuais seriam subespcies. Neste caso, o CPV seria, na verdade, uma subespcie do FPLV. De fato, existem evidncias biolgicas (como a repli-
cao em clulas de origem felina), sorolgicas e logenticas de que o CPV realmente deriva do FPLV. A diferena entre os vrus felino e canino parece estar restrita substituio de dois aminocidos em uma protena do capsdeo, responsvel pela interao dos vrions com os receptores das clulas hospedeiras.

Os vrions dos parvovrus so pequenos (18 a 26 nm de dimetro), aproximadamente esfricos, com simetria icosadrica e so desprovidos de envelope (Figura 14.1). As partculas virais possuem uma massa de 5,5 a 6,2 x 106 daltons, distribudas em uma poro protica (80%) e DNA (20%). A densidade situa-se entre 1,39 e 1,42 g/cm3 em gradiente de cloreto de csio, o que permite a separao dos Dependovirus dos vrus associados, como os adenovrus.
Parvoviridae
379
Fonte: A) web.uct.ac.za; B) Muzyczka e Berns (2001).
Figura 14.1 Vrions da famlia Parvoviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de partculas vricas; B) Reconstruo de crio-eletromicroscopia, com indicao das estruturas na superfcie do vrion. Depresses, chamadas de dimples (2); projees ou spikes (3) e cilindros (5). As depresses que circundam os cilindros so conhecidas como canyons.
Os vrions apresentam uma grande resistncia inativao no meio ambiente, que pode ser creditada sua estrutura simples e compacta, desprovida de envelope. A estrutura vrica estvel sob pH entre 3 e 9, e a temperatura de 56C por 60 minutos. Por outro lado, a infectividade pode ser inativada com desinfetantes base de formalina, hipoclorito de sdio e agentes oxidantes. Outra caracterstica dos parvovrus a capacidade de aglutinar eritrcitos de sunos, de cobaias e/ou de macacos rhesus, dependendo da
espcie do vrus. A maioria dos parvovrus possui uma gama de hospedeiros e tropismo muito restritos. No entanto, alguns vrus podem sofrer mutaes e ampliar a sua gama de hospedeiros. Um exemplo foi a substituio de dois aminocidos na protena VP2 do FPLV, que permitiu ao vrus utilizar o receptor da transferrina (TfR) presente em clulas de ces e, assim, estabelecer o CPV como um novo patgeno canino. As partculas virais so formadas por trs classes de protenas: VP1, VP2 e VP3, com exceo do AMDV (vrus da doena das martas Aleutian), que possui apenas as duas primeiras. A massa molecular das protenas varia entre 80 e 86 kDa (VP1), 64-75 kDa (VP2) e 60-62 kDa (VP3). Essas protenas so codicadas a partir de uma nica ORF no genoma viral, sendo a VP1 e VP2 originadas por splicing alternativo do RNA mensageiro (mRNA). A VP3 formada a partir da clivagem de 15 a 20 aminocidos da regio amino-terminal da VP2. A VP3 somente detectada em partculas inteiras, ou seja, em partculas que contm o genoma viral completo, pois h produo de grande quantidade de partculas defectivas que apresentam genomas incompletos ou ausentes. O capsdeo formado por 60 cpias da VP2 e poucas cpias da VP1 e da VP3. Quando observada por cristalograa, a protena VP2 apresenta oito cadeias estruturais em forma de barril-, estrutura que conservada em outros vrus icosadricos. Essas estruturas so ligadas por alas que esto expostas na superfcie do vrion e so responsveis pela estabilidade das partculas no ambiente. A VP2 possui ainda epitopos que induzem a produo de anticorpos neutralizantes juntamente com a VP3, e pequenas diferenas nesta protena podem determinar o tropismo por diferentes tecidos e hospedeiros. Na superfcie dos vrions, podem ser observadas estruturas caractersticas, como protuberncias (spikes), depresses (dimples) e estruturas na forma de cilindros circundados por depresses (canyons) (Figura 14.1). Essas estruturas possuem funes biolgicas importantes, como o reconhecimento e ligao a receptores celulares (depresses) e determinao das caractersticas imunognicas (projees).
380
Captulo 14
O genoma dos parvovrus composto por uma molcula de DNA linear de cadeia simples, com aproximadamente 5 kb. Os Dependovirus apresentam um genoma de 4.5 kb. Em geral, a molcula de DNA que incorporada aos vrions de polaridade negativa (complementar aos mRNAs), mas alguns parvovrus podem encapsidar qualquer uma das cadeias em propores variadas. Os vrions do BPV, por exemplo, apresentam molculas de DNA de polaridade positiva em aproximadamente 20 a 30% das partculas. O genoma dos parvovrus de importncia veterinria possuem apenas duas ORFs, que codicam quatro protenas: duas protenas noestruturais (NS1 e NS2) e duas ou trs protenas estruturais (VP1 e VP2/VP3) (Figura 14.2). As protenas no-estruturais (NS1 e NS2) so produzidas pela traduo de mRNAs que sofrem splicing alternativo. A NS1 essencial para
a replicao do genoma viral, e a NS2 est associada com a formao dos capsdeos, controle da expresso gnica e tambm participa da replicao do genoma. As protenas produzidas a partir da outra ORF (VP1 e VP2) fazem parte da estrutura do capsdeo. As protenas VP1 e VP2 so traduzidas a partir de um mesmo mRNA, aps splicing, e compartilham a maior parte de sua seqncia de aminocidos. A diferena entre a VP1 e VP2 resulta da utilizao de diferentes cdons de iniciao pelos ribossomos. A VP3 composta por uma seqncia de aminocidos da regio amino-terminal da VP2. Os mRNAs, produzidos pela transcrio do genoma, possuem 5 cap e so poliadenilados na extremidade 3. O genoma viral apresenta de 6 a 10 seqncias palindrmicas, que possibilitam a formao de estruturas em forma de grampo nas regies terminais (Figura 14.2). Essas estruturas so es-
3 NS1 e NS2 VP1 e VP2
NS1
NS2
2 3 3
ORF
VP1 VP2
5kb
Figura 14.2 Ilustrao esquemtica da estrutura e organizao do genoma e dos transcritos do parvovrus canino (CPV). A figura superior representa o DNA genmico com as extremidades 5' e 3' flexionadas sobre si; a localizao das duas ORFs e os stios de iniciao da transcrio (setas). A figura inferior mostra os trs transcritos (1, 2 e 3), com as respectivas ORFs e locais de processamento. As linhas contnuas representam a cadeia de RNA, e os retngulos representam as ORFs codificantes das respectivas protenas. NS1 e NS2: protenas no-estruturais; VP1 e VP2: protenas do capsdeo.
Parvoviridae
381
senciais para a replicao do genoma viral e para a encapsidao do genoma na prognie viral.

O ciclo replicativo dos parvovrus iniciase pelo reconhecimento e ligao dos vrions a receptores celulares. O receptor utilizado pelo FPLV e CPV provavelmente seja o TfR, que expresso preferencialmente em clulas em diviso, que so dependentes de transferrina para realizarem a sua multiplicao. O BPV e alguns AAVs utilizam sialoglicoprotenas como receptores, ligando-se ao componente cido silico. O parvovrus humano B19 liga-se a carboidratos; e o AAV-2 utiliza o sulfato de heparina ou uma integrina como receptor. A penetrao ocorre pela via endoctica, e os vrions so transportados rapidamente at as proximidades do ncleo da clula. Durante esse trajeto, as partculas virais so expostas a pH progressivamente mais baixo no interior dos endossomos, o que induz alteraes na conformao das protenas do capsdeo. No interior dos endossomos, as partculas virais sofrem trs alteraes importantes: exposio da regio amino-terminal da VP1, clivagem da regio amino-terminal da VP2 e, nalmente, o desnudamento do genoma. Essas alteraes ocorrem simultaneamente e podem ser detectadas aos 30 minutos aps a internalizao dos vrions. As partculas que permanecem nessas vesculas at a fuso com os lisossomos so degradadas. A regio amino-terminal da VP1 possui sinais de localizao nuclear, promovendo a sinalizao para o transporte do complexo nucleoprotena (DNA + protenas) para o ncleo da clula. No ncleo, a primeira etapa da replicao a sntese da ta de DNA complementar ao genoma viral, resultando em uma molcula de DNA de ta dupla (Figura 14.3). Essa sntese realizada por DNA polimerases celulares e fatores auxiliares, tambm de origem celular. A abundncia da DNA polimerase e de nucleotdeos a principal razo da dependncia dos parvovrus por clulas em multiplicao. A molcula de DNA de ta dupla produzida pode, ento, ser utilizada como molde pela RNA polimerase II celular para a transcrio e conseqente produo dos mRNAs.
4 Replicao
A replicao dos parvovrus autnomos ocorre no ncleo das clulas hospedeiras e depende de fatores celulares que esto presentes somente quando a clula est em fase S ou G2. Algumas caractersticas da patogenia das infeces por parvovrus dependem das clulas em mitose. Por exemplo, a infeco de fetos (parvovrus suno e felino) ou de animais recm-nascidos (CPV) favorecida pela presena de um grande nmero de clulas em diviso. A infeco pode ser sistmica em fetos e em animais recm-nascidos, mas geralmente restrita a tecidos com clulas em mitose, como o epitlio intestinal, em animais com mais idade. Em fetos felinos ou em gatos recm-nascidos, a infeco afeta o cerebelo; enquanto em ces com at seis semanas de idade, o miocrdio o stio preferencial de infeco pelos parvovrus. Em animais mais velhos, as clulas que se encontram em diviso so, principalmente, as clulas linfides e as clulas das criptas do intestino. A replicao do parvovrus nessas clulas pode produzir linfopenia ou enterite, respectivamente. Usualmente, a replicao dos parvovrus in vitro restrita a clulas da espcie hospedeira, como as PK-15 (rim de suno) para o PPV; CRFK (rim de gato) para o FPLV. O CPV constitui-se em exceo, pois replica em clulas MDCK (rim de co o hospedeiro) e pode multiplicar-se tambm em clulas da linhagem CRFK. A determinao do tropismo celular ou tecidual do vrus depende de seqncias especcas de aminocidos na superfcie dos vrions, importantes para o reconhecimento e ligao aos receptores celulares. No CPV, o tropismo determinado por trs aminocidos da VP2 (posies 93, 300 e 323). O tropismo de cepas no-patognicas do PPV, como a NADL-2, e patognicas, como a Kresse, determinado por diferenas em um aminocido na projeo da VP2 (posio 436), e em dois aminocidos que circundam a depresso.
382
Captulo 14
3 NS1 e NS2 VP1 e VP2
+
3
5 4
2 1
NS1 NS2
+ 6
VP1, VP2/3
Vrion
Figura 14.3. Etapas da expresso gnica e replicao dos parvovrus autnomos. O genoma DNA de fita simples (ssDNA) , inicialmente, convertido em DNA de fita dupla (dsDNA) por enzimas celulares (1), seguido da expresso (transcrio, traduo) das protenas NS1 e NS2 (2). A protena NS1 essencial nas etapas seguintes da replicao do genoma (3), para a expresso das protenas estruturais (4) e tambm na fase final da replicao do DNA (5). Os genomas recm-replicados so encapsidados pelas protenas estruturais VP1 e VP2/3, originando as novas partculas vricas (6,7).
Apesar da variao entre a posio especca de cada elemento, trs transcritos so produzidos durante a replicao dos parvovrus autnomos. A sua produo dependente de promotores distribudos ao longo do genoma viral. Em contraste, existe apenas um sinal para a poliadenilao desses transcritos, que est localizado na regio terminal do genoma. Os mRNAs originados por splicing dos transcritos R1 e R2 sero traduzidos nas protenas no-estruturais NS1 e NS2, respectivamente. O outro transcrito primrio (R3) o responsvel pela codicao das protenas VP1 e VP2/VP3. Estes transcritos tambm so submetidos a processamento por splicing. A utilizao de um determinado cdon para incio da traduo resulta na produo da VP1; a utilizao de um cdon mais adiante resulta na sntese da
VP2. Alm desses, j foram detectados outros seis transcritos, que so produzidos de forma estvel em clulas infectadas, mas a sua funo ainda no foi estabelecida. A expresso gnica dos parvovrus regulada de forma que a produo da protena NS1 ocorra somente na fase S do ciclo celular. Na regio anterior ao sinal de transcrio deste gene, existe uma seqncia especca de nucleotdeos que reconhecida pelo fator de transcrio celular Sp1. No entanto, somente a presena deste elemento no explica a regulao da expresso gnica. Essa regulao fundamental para o sucesso da infeco pelos parvovrus, pois a produo da NS1 de forma contnua txica para a clula. No entanto, o acmulo da protena NS1 durante a fase S necessrio para a ativao dos genes que
Parvoviridae
383
Figura 14.4 Ilustrao simplificada da replicao do genoma dos parvovrus. A replicao se inicia na extremidade 3' livre e prossegue ao longo do genoma (1), resultando inicialmente na formao de um monmero de DNA de fita dupla (dsDNA) (2). O prosseguimento da polimerizao (3) leva formao de uma molcula dimrica de dsDNA, que contm quatro molculas com a extenso genmica (4). A clivagem deste multmero resulta em quatro molculas genmicas de ssDNA, sendo duas de sentido positivo e duas de sentido negativo (5). Acredita-se que multmeros contendo um nmero maior de unidades genmicas possam ser formados durante a replicao do genoma dos parvovrus.
codicam as protenas estruturais. Essa funo realizada pela ligao da NS1 a fatores de transcrio celulares, alguns deles j descritos (TBP e TFIIA). A protena NS1 tambm essencial para a replicao do genoma viral, atuando em diferentes etapas do processo. Entre outras funes, a NS1 participa da replicao atravs de suas funes helicase e endonuclease. Esta ltima funo est relacionada com a maturao do DNA viral e com a interferncia com a replicao do DNA celular. A fosforilao da NS1 necessria para que suas funes sejam exercidas de forma plena. As etapas seguintes do ciclo envolvem a expresso das protenas estruturais (VP1, VP2/3), a complementao da replicao do genoma e, nalmente, a morfognese das partculas vricas, pela interao das protenas do capsdeo com monmeros de DNA (Figura 14.3). Vrios grupos tm estudado com detalhes os mecanismos de replicao do genoma dos parvovrus. O conhecimento adquirido importante para o desenvolvimento de vetores baseados em parvovrus dependentes (principalmente os AVV) e tambm para a produo de vacinas. O modelo de replicao mais aceito o de produo de cpias genmicas por um mecanismo de crculo rolante modicado. Neste modelo, as seqncias palindrmicas repetidas da regio terminal 3 do genoma serviriam como iniciadores para a sntese da cadeia complementar, ao formar estruturas terminais semelhantes a grampos de cabelo (hairpins). Esse processo ocorreria no incio do ciclo replicativo, logo aps o ingresso do DNA no ncleo celular, resultando na sntese de cadeias de DNA complementares, que seriam utilizadas como molde para a transcrio (Figura 14.4). Com a produo das protenas no-estruturais NS1 e NS2 e uma vez completada a primeira cadeia de DNA ta dupla, a polimerizao continuaria, produzindo uma cpia linear dupla que corresponderia a quatro cpias do genoma viral (duas de polaridade positiva, duas negativas). Essa estrutura tetrmera pode no ser a nica produzida, e alguns pesquisadores acreditam que estruturas maiores, contendo um nmero maior de cpias do genoma, podem ser tambm produzidas. Essa macromolcula composta por mltiplas cpias do genoma seria, ento, resol-
vida pela atividade endonuclease da NS1, que clivaria o multmero em unidades genmicas de polaridade positiva e negativa (Figura 14.4). Em geral, as molculas de DNA de polaridade negativa so preferencialmente encapsidadas. No entanto, algumas espcies virais podem encapsidar uma mistura das duas ou tambm uma proporo varivel de DNAs de polaridade positiva/ negativa. A maturao dos vrions ocorre no ncleo e leva aproximadamente 60 minutos para ser com-
Monmero ssDNA
Monmero dsDNA
1 2
Dmero dsDNA
+ Clivagem enzimtica
384
Captulo 14
pletada, no entanto, a produo de capsdeos vazios pode ocorrer em menos tempo. Os capsdeos vazios apresentam uma conformao diferente das partculas virais completas. O processo de replicao dos parvovrus produz corpsculos de incluso intranucleares grandes. A liberao dos vrions ocorre por lise das clulas infectadas.
ambiente. O vrus resiste a vrios desinfetantes, porm inativado pelo hipoclorito de sdio a 6%, formol a 4% e glutaraldedo a 1% quando exposto por 10 minutos.
5.1.1 Epidemiologia
O FPLV pode causar doena em todos os membros da famlia dos feldeos. O vrus possui distribuio mundial pela sua natureza altamente contagiosa e pela alta capacidade de persistir no meio ambiente. Cerca de 75% dos gatos com um ano de idade, no-vacinados e clinicamente saudveis, apresentam anticorpos contra o FPLV. Portanto, a maioria dos gatos susceptveis exposta e infectada pelo vrus durante seu primeiro ano de vida. Nesses animais, a infeco geralmente subclnica. A doena com sinais clnicos tpicos ocorre mais freqentemente nos animais jovens no vacinados, embora os lhotes vacinados tambm possam desenvolver a enfermidade. Isso ocorre pela interferncia da imunidade materna com a resposta vacinal. Na verdade, existe uma relao inversa entre a incidncia da doena e a idade dos animais, ou seja, a incidncia da enfermidade diminui medida que a faixa etria aumenta. A transmisso do vrus ocorre pelo contato direto ou indireto dos animais susceptveis com os animais infectados ou com as suas secrees. O vrus pode estar presente em todas as secrees corpreas de gatos infectados, porm mais consistentemente encontrado nas fezes diarricas. A rota fecal-oral considerada a principal forma de transmisso. Pela alta resistncia do FPLV no ambiente, a transmisso por fmites contaminados pode desempenhar um importante papel na propagao da infeco.
5 Parvovrus de interesse veterinrio

Os parvovrus que possuem importncia como patgenos de animais de produo e companhia pertencem subfamlia Parvovirinae. Neste captulo, sero abordados o vrus da panleucopenia felina (FPLV), o parvovrus canino (CPV), o parvovrus suno (PPV) e o parvovrus bovino (BPV), pela sua importncia clnico-patolgica e sanitria nas respectivas espcies.
5.1 Vrus da panleucopenia felina

A panleucopenia felina (FPL) uma doena infecciosa de distribuio mundial, que afeta os feldeos domsticos e selvagens, e tambm outras espcies (visons e guaxinins). A FPL uma das principais doenas virais de felinos e encontra-se controlada nas comunidades onde a vacinao realizada de forma rotineira. Entretanto, a doena clnica em sua forma mais grave ainda freqentemente observada em gatos no-vacinados, geralmente provenientes de gatis. Nesses animais, as taxas de morbidade e mortalidade so elevadas. A panleucopenia felina causada pelo FPLV, um vrus muito semelhante ao CPV. Nos ltimos anos, foram isoladas as cepas a e b do CPV de gatos sadios e tambm de gatos com sinais clnicos de FPL. Da mesma forma, diferentes cepas de CPV foram capazes de reproduzir uma doena compatvel com a FPL em gatos inoculados experimentalmente. possvel que o FPLV e o CPV apresentem transmisso mtua entre as espcies felina e canina e, eventualmente, alguns desses animais desenvolvam a doena clnica. Os vrions do FPLV so muito resistentes sob condies ambientais, sendo capazes de manter a viabilidade por at um ano sob temperatura
5.1.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia

Aps a exposio oronasal, o vrus se multiplica inicialmente nos linfonodos regionais. Aps a replicao primria, o vrus atinge a corrente sangnea e dissemina-se para os tecidos que possuem clulas em diviso, como a medula ssea, epitlio das criptas intestinais e rgos linfides
Parvoviridae
385
(Figura 14.5). O tropismo do vrus pelas clulas hematopoiticas explica um dos eventos caractersticos da doena, a panleucopenia. Da mesma forma, a replicao viral no epitlio intestinal responsvel pelo quadro de enterite. Quando a infeco ocorre no tero nal da gestao ou no neonato, alm do tecido linfide e medula ssea, o sistema nervoso, incluindo o crebro, cerebelo, nervo ptico e tambm a retina, podem ser infectados. As infeces experimentais de gatos SPF (livres de patgenos especcos) tm demonstrado quadros mais brandos do que aqueles observados em infeces naturais. Isso sugere que outros fatores podem participar no agravamento da doena. Acredita-se que os animais SPF apresentem uma
taxa menor de renovao das clulas linfides e intestinais do que os animais com microora intestinal preservada. Na ausncia de patgenos, a renovao celular seria menor, com isso, a replicao viral e a destruio celular seriam reduzidas, resultando em doena de severidade moderada. As infeces bacterianas secundrias pela microora intestinal parecem contribuir para o agravamento da doena. A endotoxemia resultante da absoro de toxinas das bactrias gram-negativas intestinais, acompanhada ou no de bacteremia, e o desenvolvimento da coagulao intravascular disseminada (CID) so complicaes comuns da FPL e, provavelmente, responsveis pela evoluo fatal da doena (Figura 14.5).
Gatos SPF (> 3 semanas de idade)
Exposio ao vrus
Replicao nos linfonodos oronasais (18-24 h)
Anticorpos insuficientes
Anticorpos suficientes
Viremia (2 a 7 dias)
Medula ssea
Infeco subclnica
Necrose do tecido linfide
Jejuno e leo
Leucopenia Infeces bacterianas secundrias
Atrofia linfide
Necrose das criptas
Septicemia, CID
Recuperao
bito
Fonte: adaptado de Greene (1998).
Figura 14.5 Patogenia da panleucopenia felina. CID: coagulao intravascular disseminada.
386
Captulo 14
Durante a infeco intestinal, a replicao do FPLV destri as clulas das criptas do epitlio. Essas clulas normalmente se diferenciam em clulas de absoro medida que migram para o pice das vilosidades. A conseqncia imediata desta destruio celular atroa das vilosidades, pela perda e no reposio das clulas epiteliais, e o conseqente colapso dos vilos com exposio da lmina prpria da mucosa. A diarria resultante devida decincia de absoro e aumento da permeabilidade. A diarria freqentemente hemorrgica pelo sangramento de capilares a partir da destruio do revestimento epitelial da mucosa. Esse sangramento tambm resulta em perda de protenas para a luz intestinal. A conseqncia nal das leses provocadas pelo vrus a quebra da barreira de proteo intestinal e a translocao de bactrias, que atingem a circulao sangnea e stios extra-intestinais, podendo ocorrer septicemia e CID. A isquemia intestinal ocorre devido hipovolemia, pelas perdas lquidas por vmito e diarria; e pode ser agravada pela septicemia, causando o choque sptico. Pode tambm ocorrer uma resposta inamatria sistmica e falncia mltipla de rgos. A replicao viral provoca tambm lise de linfcitos, resultando em depleo marcante dos folculos linfides dos linfonodos, bao, tecido linfide intestinal e timo. A atroa dos tecidos
linfides foi associada capacidade do FPLV de induzir apoptose em clulas linfides felinas. Foi demonstrado in vitro que o FPLV pode provocar lise de clulas das linhagens eritride e mielide. possvel que essa lise ocorra tambm in vivo e seja responsvel pela leucopenia intensa. A infeco intra-uterina pelo FPLV, no incio da gestao, pode resultar em morte e reabsoro dos embries ou fetos, infertilidade, abortos ou no nascimento de fetos mumicados (Figura 14.6). A infeco no tero nal da gestao ir resultar no nascimento de lhotes vivos com graus variveis de decincias neurolgicas. Em uma mesma ninhada, podem estar presentes animais com diferentes graus de decincia e mesmo animais sem alteraes aparentes, devido aquisio de imunidade. O cerebelo a rea mais afetada, pois parte do desenvolvimento deste rgo em gatos ocorre na fase nal da gestao e no perodo neonatal. Os lhotes infectados nessa fase apresentam hipoplasia cerebelar e aqueles que sobrevivem apresentam sinais permanentes de doena cerebelar. Uma grande parcela dos gatos infectados parece no manifestar sinais clnicos da infeco. A doena, com os sinais clssicos, observada, principalmente, em animais jovens e sem histrico de vacinao, embora animais mais velhos e mesmo vacinados possam desenvolver a en-
Exposio ao vrus
Feto (estgio de gestao) Filhotes (2-3 semanas)
Incio
Tero mdio
Tero final
Infertilidade Morte fetal Reabsoro
Abortos Mumificao fetal
Crebro Nervo tico Retina
Tecido linfide/medula ssea (panleucopenia) Cerebelo (hipoplasia)
Figura 14.6 Patogenia da panleucopenia felina aps infeco fetal e neonatal.
Parvoviridae
387
fermidade. A faixa etria de maior incidncia da doena situa-se entre os trs e cinco meses. A taxa de letalidade em animais com menos de um ano de idade varia de 50 a 90%. Os sinais clnicos iniciais da doena, com evoluo de trs a quatro dias, incluem depresso profunda, anorexia, hipertermia (40C), vmito e desidratao. A diarria, com ou sem hemorragia, pode ocorrer em uma fase mais tardia. Muitas vezes os gatinhos podem morrer antes de apresentarem diarria hemorrgica. Quando submetidos palpao abdominal, os animais podem demonstrar dor abdominal, alas intestinais espessadas e rudos intestinais. Petquias e equimoses podem ser observadas em animais que desenvolvem CID. Em estgios terminais, podem ser observadas hipotermia, estupor e coma. Animais que sobrevivem por mais de cinco dias geralmente evoluem para a recuperao clnica. Os gatinhos que adquirem a infeco no nal da gestao ou logo aps o nascimento podem apresentar apenas o quadro neurolgico. Os sinais tpicos de leso cerebelar, como ataxia, hipermetria, tremor, estao em base larga (membros afastados) e quedas pela incoordenao dos membros e tronco, so observados aps trs ou quatro semanas de vida. A intensidade dos sinais pode variar entre lhotes da mesma ninhada. As anormalidades neurolgicas no so progressivas, porm so permanentes. Os animais com sinais brandos podem se adaptar sua decincia e viver normalmente, apesar dos seus decits neurolgicos. O exame de fundo de olho pode revelar reas de degenerao da retina, que aparecem como pequenos focos acinzentados com bordas escurecidas. O principal achado laboratorial a panleucopenia, observada em 100% dos casos de doena sistmica. A panleucopenia pode ser detectada a partir do segundo dia da infeco, podendo atingir nmeros extremamente baixos (200 leuccitos/dl) entre o quarto e o sexto dia. Quanto mais intensa for a leucopenia, mais desfavorvel ser o prognstico. Anemia e trombocitopenia tambm ocorrem. Outros achados laboratoriais, como hiperbilirrubinemia e aumento das enzimas hepticas, podem eventualmente ser detectados.
Os achados patolgicos incluem congesto e reduo da espessura do intestino delgado, reas de necrose, vilosidades atroadas, muco e debris celulares. Incluses intranucleares podem ser encontradas nas clulas das criptas intestinais. Os linfonodos podem estar aumentados de volume, edematosos, com destruio de linfcitos e inltrao massiva de neutrlos. Nos fetos e lhotes com sinais neurolgicos, so observadas leses na lmina granular externa do cerebelo, alm de hipoplasia cerebelar.
5.1.3 Diagnstico
O achado de intensa leucopenia em gatos com histrico e sinais clnicos compatveis com a FPL suciente para se estabelecer um diagnstico presuntivo. Entretanto, o diagnstico denitivo depende da realizao de outros testes, como a microscopia eletrnica (ME) das fezes, isolamento viral, sorologia e imunouorescncia (IFA). Nos casos fatais, as alteraes histopatolgicas intestinais so consideradas patognomnicas. Podem ser realizados testes de hemaglutinao (HA) a partir de amostras fecais, uma vez que o FPLV aglutina eritrcitos de sunos. O isolamento viral em cultivo celular tambm pode ser utilizado para a conrmao da etiologia. Nesse caso, clulas primrias felinas ou clulas de linhagem de origem felina, como a CRFK, podem ser utilizadas. Testes comerciais de ELISA para a deteco de antgenos virais nas fezes esto disponveis no comrcio. Pode-se tambm realizar a tcnica de IFA em tecidos para a deteco de antgenos virais. Outro recurso diagnstico a tcnica de PCR, para a identicao de DNA viral em tecidos, fezes ou em clulas infectadas. A pesquisa de anticorpos pode ser realizada por soroneutralizao (SN), imunouorescncia indireta (IFI) e ELISA, porm os resultados devem ser interpretados com cautela, em razo da grande disseminao da infeco. Nesse sentido, somente a sorologia pareada ou a deteco de IgM so indicativos de infeco recente. A tcnica de inibio da hemaglutinao (HI) tambm
388
Captulo 14
pode ser utilizada para titular amostras nicas ou pareadas.

O tratamento da FPL tipicamente de suporte, pois no existem drogas antivirais especcas. Aps aproximadamente cinco dias da infeco, os animais desenvolvem mecanismos imunolgicos adequados para controlar a infeco. Os objetivos principais da terapia incluem a manuteno do equilbrio hdrico e eletroltico, a reduo das perdas lquidas por vmito e diarria e o combate s infeces bacterianas secundrias. A vacinao se constitui em um mtodo eciente para proteger os animais e reduzir a incidncia da FPL. Para isso, existem vacinas inativadas e com vrus vivo modicado. Estas ltimas produzem imunidade mais rpida e efetiva do que as vacinas inativadas. A primeira vacinao deve ser realizada com seis a oito semanas de idade e repetida com intervalos de quatro semanas. Recomenda-se a revacinao anual, porm acredita-se que as vacinas atenuadas possam produzir imunidade duradoura, e as possveis exposies naturais permitiriam a manuteno de ttulos adequados de anticorpos por toda a vida do animal. Em animais vacinados adequadamente quando jovens, uma revacinao a cada trs anos pode oferecer uma segurana adicional.
Aps o seu surgimento a partir do FPLV, o CPV continuou sofrendo alteraes genticas, dando origem a novas cepas, designadas como subtipos CPV-2a e CPV-2b. Felizmente, as diferenas antignicas entre essas cepas so mnimas e as vacinas protegem contra ambas. Um terceiro subtipo tem sido proposto, o CPV-2c. O CPV-2b amplamente difundido nos Estados Unidos, enquanto na Europa encontram-se tanto o CPV2b como o CPV-2a. No Brasil, existem relatos da circulao de ambos os subtipos. O CPV-2a predominou na dcada de 1980, porm entre 1990 e 1995 a infeco pelo CPV-2b ocorreu com maior freqncia. Assim como os demais parvovrus, o CPV muito resistente no ambiente e maioria dos desinfetantes. Uma das excees o hipoclorito de sdio, comercializado como gua sanitria, em concentraes que variam de 2 a 3%. O hipoclorito de sdio a 0,175% efetivo para a inativao do CPV. Para assegurar a ao do produto, a soluo deve permanecer em contato com o agente por tempo prolongado (horas).
5.2.1 Epidemiologia
A parvovirose canina surgiu no nal dos anos 1970, apresentando altas taxas de morbidade e mortalidade. A gravidade da doena observada nessa poca foi atribuda falta de imunidade natural da populao canina contra o novo vrus. Atualmente, os ces so mais resistentes ao CPV, provavelmente pelas vacinaes e pela resistncia natural contra a doena. Entretanto, a incidncia da infeco se mantm alta em animais com idade entre seis semanas e seis meses. Os lhotes dessa faixa etria, quando novacinados, so altamente susceptveis ao desenvolvimento da doena. Os anticorpos maternos so protetores contra a infeco nas primeiras semanas de vida. No entanto, em um determinado momento, os nveis de anticorpos so insucientes para proteger da doena e, em contrapartida, bloqueiam o desenvolvimento de uma resposta imune efetiva pelas vacinas. Esse perodo conhecido como janela de susceptibilidade e pode explicar porque alguns animais, mesmo
5.2 Parvovrus canino

A parvovirose canina considerada uma das principais causas de diarria de origem infecciosa em ces com idade inferior a seis meses. A doena causada pelo parvovrus canino (canine parvovirus, CPV) que surgiu no nal dos anos 1970 e disseminou-se rapidamente por todos os continentes. A incidncia da infeco elevada em todo o mundo. A parvovirose canina caracteriza-se por enterite grave, com anorexia, vmitos, diarria hemorrgica e choque. O CPV deve ser diferenciado do outro parvovrus que infecta ces, o canine minute virus (CnMV), que foi descrito em 1970, possui ocorrncia pouco freqente e considerado pouco patognico.
Parvoviridae
389
adequadamente vacinados, desenvolvem a infeco e a doena. Os lhotes so mais propensos ao desenvolvimento da gastrenterite hemorrgica (GEH) pelo CPV, porm ces de qualquer idade, sexo ou raa podem ser acometidos. Animais de algumas raas de porte mdio e grande, como dobermann, rottweiler, labrador, pastor alemo e pitbull, parecem apresentar a doena mais severa quando infectados. A incidncia maior em animais sem raa denida provavelmente est ligada vacinao inadequada, associada com o acesso livre rua, o que aumenta o risco desses animais adquirirem a infeco. O CPV altamente contagioso, e a infeco geralmente ocorre por exposio oro-nasal a fezes, fmites ou ambientes contaminados. O vrus pode permanecer por longos perodos (mais de seis meses) no ambiente e nos plos dos animais que tiveram contato com fezes contaminadas. As pessoas, equipamentos veterinrios, insetos e roedores podem atuar como veculos para a propagao do vrus. Estudos sorolgicos realizados em vrios pases indicam uma grande disseminao do agente, com ndices variveis de soropositividade em ces urbanos, geralmente entre 60 e 95%.

Aps a exposio oronasal, o vrus replica nos tecidos linfides prximos ao local de entrada (geralmente na orofaringe) e atinge a corrente sangnea. Durante a disseminao virmica, o vrus se localiza preferencialmente em tecidos com rpida diviso celular, como a medula ssea, rgos linfopoiticos e criptas do jejuno e leo (Figura 14.7). O perodo de incubao varia de 2 a 14 dias, mas, na maioria dos casos, de 4 a 7 dias. A viremia intensa do primeiro ao quinto dia da infeco e cessa por volta do quinto ou sexto dia, quando anticorpos neutralizantes j podem estar presentes no soro. Os animais com imunidade parcial apresentam infeco subclnica ou formas clnicas mais brandas.
Durante a infeco intestinal, o parvovrus replica nas clulas epiteliais das criptas da mucosa intestinal. Essas clulas esto em constante mitose e so responsveis pela reposio do epitlio absortivo das vilosidades. As clulas das criptas se diferenciam em clulas de absoro medida que migram para superfcie das vilosidades. A conseqncia imediata da infeco pelo CPV o achatamento das vilosidades, o colapso e a necrose epitelial, com exposio da lmina prpria da mucosa (Figuras 14.7 e 14.8). A diarria, resultante da m absoro intestinal, costuma ser hemorrgica, pelo sangramento de capilares subjacentes ao revestimento epitelial da mucosa. A perda do epitlio intestinal permite a penetrao de bactrias na circulao sangnea, que facilitada pela leucopenia. A replicao do vrus nas clulas linfides e na medula ssea resulta em linfopenia e neutropenia. A imunossupresso decorrente permite o estabelecimento de infeces secundrias por outros vrus, bactrias, fungos ou parasitas. Essas infeces podem contribuir para o agravamento dos sinais clnicos. A excreo do vrus nas fezes inicia no terceiro ou quarto dia aps a infeco e se intensica com o surgimento da doena. O CPV excretado em grandes quantidades por at 20 dias. O trmino da excreo viral fecal est provavelmente relacionado com o desenvolvimento de imunidade. Duas sndromes clnicas so descritas em ces infectados com o CPV: a miocardite e a gastrenterite hemorrgica (GEH). A miocardite pode ocorrer em neonatos, aps a infeco intra-uterina ou nas primeiras seis semanas de vida. Esses animais apresentam morte sbita ou sinais inespeccos e, posteriormente, desenvolvem sinais de insucincia cardaca. Essa forma clnica da doena ocorreu com freqncia quando foram relatados os primeiros surtos de parvovirose no nal dos anos 1970. Atualmente essa manifestao considerada muito rara, provavelmente pela alta prevalncia de anticorpos contra o CPV na populao canina. A imunidade passiva protege os lhotes na fase de ocorrncia dessa forma clnica. A principal manifestao da parvovirose canina a gastrenterite.
390
Captulo 14
Exposio ao vrus
Viremia
Medula ssea
Tecido linfide
Criptas intestinais
Outros tecidos (miocrdio, esfago, rins, fgado, pulmes)
Neutropenia
Linfopenia
Necrose epitelial
Imunossupresso
Quebra da barreira intestinal
Diarria hemorrgica
Bacteremia, endotoxemia, septicemia, SIRS, CID, FMO
Recuperao
bito
Figura 14.7 Patogenia da parvovirose canina. SIRS= sndrome da resposta inflamatria sistmica, CID= Coagulao intravascular disseminada, FMO= Falncia mltipla de rgos.
movimento dos entercitos em maturao
B
Entercitos maduros (no-mitticos, absortivos)
Vilosidade
Cripta
Clulas das criptas (mitticas, secretrias)
Fonte: adaptado de Conner & Ramig (1997).
Figura 14.8 Ilustrao da patogenia das leses provocadas pelo parvovrus canino (CPV) no epitlio intestinal. A) Vilosidade intestinal com estrutura normal; B) Vilosidade afetada. A destruio das clulas das criptas pela replicao viral resulta em reposio deficiente das clulas absortivas das vilosidades. Com isso, ocorrem necrose e descamao epitelial, achatamento das vilosidades e exposio da lmina prpria.
Parvoviridae
391
A apresentao tpica da GEH geralmente ocorre em ces jovens no-vacinados, e caracterizada pelo surgimento brusco de prostrao, anorexia, vmitos freqentes, sialorria, febre, dor abdominal e diarria hemorrgica. Os sinais de prostrao, anorexia e vmitos precedem o quadro de diarria, geralmente em 12 a 24 horas. Ces com diarria podem apresentar desidratao, hipovolemia e choque. Os sinais clnicos iniciais de choque incluem taquicardia, pulso normal ou fraco, palidez das mucosas, tempo de preenchimento capilar aumentado, hipotenso, nvel de conscincia reduzido e temperatura corporal baixa. Os animais que no recebem tratamento (uidoterapia) nesse estgio evoluem para o estgio terminal do choque, apresentando bradicardia, mucosas plidas e cianticas, hipotenso grave, pulso muito fraco ou ausente, hipotermia, anria e estupor ou coma. Nessa situao, a parada cardaca e respiratria iminente e os animais que atingem esse estgio dicilmente sobrevivem. O hemograma de animais infectados demonstra leucopenia, neutropenia e linfopenia. Na fase de recuperao, pode ocorrer leucocitose. Anemia pode ocorrer pela perda sangnea intestinal. Hipoproteinemia, pela perda de protenas plasmticas pelo intestino, elevao dos nveis de uria e creatinina por azotemia pr-renal e reduo dos nveis de potssio tambm podem estar presentes. Na necropsia, observa-se a mucosa intestinal congesta, hemorrgica e freqentemente recoberta por uma pseudomembrana. As placas de Peyer encontram-se atroadas. A medula ssea pode apresentar-se liquefeita e hipermica. A histopatologia intestinal revela necrose epitelial, colapso das vilosidades e aumento do inltrado inamatrio na lmina prpria.
a identicao do vrus por HA, sorologia pareada por HI e SN, testes de ELISA para a deteco de IgM, deteco dos vrions por ME podem ser utilizados para o diagnstico denitivo. Em casos clnicos, a grande concentrao de partculas virais nas fezes (pode chegar at 109 partculas/ grama) e a estabilidade viral favorecem a utilizao da ME. Uma alternativa a imunomicroscopia (IME) eletrnica, na qual os anticorpos so adicionados s suspenses fecais para a formao de complexos que favorecem a visualizao. O isolamento do vrus a partir de fezes ou de tecidos pode ser realizado em clulas de origem canina, como as MDCK e A-72, e/ou em clulas CRFK de origem felina.

O tratamento da gastrenterite pelo CPV de suporte e se baseia na reposio de uidos e eletrlitos, na antibioticoterapia de amplo espectro e no controle dos vmitos, para minimizar as perdas lquidas e eletrolticas. Terapias especcas com antivirais tm sido estudadas, sendo que o interferon-omega felino apresentou bons resultados em ces com parvovirose. possvel que essas substncias possam fazer parte do tratamento de rotina no futuro. Ces com parvovirose devem ser isolados e receber tratamento em um local especco. A limpeza e desinfeco do ambiente e equipamentos devem ser feitas com hipoclorito de sdio a 0,175%. A maneira mais efetiva de preveno da parvovirose canina a vacinao sistemtica de lhotes, que devem receber a primeira dose da vacina com seis a oito semanas de idade, recebendo duas doses de reforo a cada quatro semanas. Uma quarta dose pode ser efetuada aos seis meses de vida. A revacinao anual recomendada. Esse esquema recomendado para estimular a imunidade ativa medida que a imunidade passiva declina, o que geralmente ocorre entre seis e 20 semanas de vida. Por um perodo de duas a quatro semanas, os ttulos de anticorpos atingem nveis no-protetores, que interferem com a eccia das vacinas. Ou seja, h um perodo em que os anticorpos passivos inativam o vrus vacinal, porm no so sucientes para proteger os
5.2.3 Diagnstico
O diagnstico presuntivo na rotina clnica geralmente feito pelo histrico, sinais clnicos e hemograma. Porm, o diagnstico denitivo de parvovirose exige a identicao do vrus por testes especcos. Testes de ELISA para a deteco de antgenos virais nas fezes esto disponveis no mercado brasileiro. Outros testes, como
392
Captulo 14
animais contra a infeco natural. Recomenda-se manter os animais isolados at completarem a fase de imunizao, sempre observando a desinfeco do local. Vacinas com cepas pouco atenuadas podem diminuir a janela de susceptibilidade, pois o vrus replica e estimula uma imunizao ativa nos lhotes, mesmo com a presena de imunidade passiva. Nesses casos, alguns animais podem apresentar uma forma branda da enfermidade.
5.3 Parvovrus suno

A infeco pelo parvovrus suno (PPV) provavelmente a causa mais freqente e importante de falhas reprodutivas em sunos. Essas falhas so relacionadas com a infeco de embries e fetos, que resulta em mortalidade embrionria, mumicao fetal, abortamentos, natimortalidade e o nascimento de leites inviveis. Alm disso, a infeco pode resultar em infertilidade e repeties de cio. Em animais adultos no-gestantes, o PPV replica no intestino sem causar manifestaes clnicas. As maiores conseqncias da infeco devem-se infeco de fmeas soronegativas, geralmente primparas, durante a gestao. At o presente, somente um sorotipo do PPV foi identicado. Entretanto, existem diferenas de patogenicidade entre isolados de campo. O PPV relacionado antigenicamente com outros membros do gnero Parvovirus, podendo ser diferenciado por testes de SN e HA. A capacidade hemaglutinante do PPV tem sido utilizada no diagnstico da infeco, pelas tcnicas de HA e HI. Outra caracterstica importante do agente a resistncia a temperaturas ambientais e a variaes de pH, o que garante que o vrus permanea vivel no ambiente por vrios meses.
5.3.1 Epidemiologia
A infeco pelo PPV est amplamente distribuda na populao suna de todo o mundo. Uma das razes para isso a grande estabilidade do vrus no ambiente. Dessa forma, uma granja infectada pode manter o vrus durante meses, mesmo quando a higiene aparentemente satisfatria. Nas maiores regies produtoras de sunos, como o meio oeste dos Estados Unidos, a infeco pelo PPV enzotica na maioria dos rebanhos e,
com poucas excees, todas as porcas apresentam imunidade contra o agente. Alm disso, uma grande proporo das leitoas naturalmente infectada com o PPV antes da cobertura, desenvolvendo imunidade protetora contra o vrus, que provavelmente persiste por toda a vida. A introduo do PPV no rebanho pode ocorrer pela aquisio de reprodutores infectados. Quando o agente introduzido em um rebanho negativo, a disseminao rpida e muitas fmeas apresentam falhas reprodutivas. Em alguns casos, a infeco pode ser controlada e o vrus pode at ser erradicado da propriedade, principalmente em criaes pequenas (com menos de 100 matrizes). Nesses casos, a reduo da incidncia da doena ocorre pela reduo ou ausncia de animais susceptveis, uma vez que a imunidade conferida pela infeco natural longa e slida. Os surtos em granjas em que no h controle por vacinao podem ocorrer em perodos cclicos (normalmente a cada trs a quatro anos), pela reduo gradativa dos nveis de anticorpos. As maiores fontes de infeco, para os animais susceptveis dentro de uma granja, so as instalaes contaminadas. O PPV muito resistente a variaes de temperatura e a vrios desinfetantes comuns. Pode, portanto, permanecer infeccioso em excrees e secrees de animais infectados por vrios meses. A ampla distribuio do agente tambm levanta hipteses sobre a possibilidade de alguns sunos serem persistentemente infectados e excretarem o vrus periodicamente. Alm disso, h evidncias da ocorrncia de portadores imunotolerantes que sobreviveram infeco durante a fase fetal. No entanto, esses casos so raros e ainda no esto comprovados. Os machos podem desempenhar um papel importante na disseminao do PPV, uma vez que o vrus pode ser encontrado nos testculos. Alm disso, os machos tambm podem atuar como vetores para a disseminao do vrus entre fmeas susceptveis. Estudos sorolgicos demonstraram a grande prevalncia e disseminao do vrus no Brasil, principalmente nos estados de Minas Gerais, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. No entanto, acredita-se que o PPV esteja disseminado em todas as regies criadoras de sunos. A transmisso do vrus ocorre pelas vias oronasal e transplacentria. A imunidade passiva
Parvoviridae
393
protege os leites por longos perodos, podendo interferir com a imunidade ativa. Algumas fmeas podem permanecer susceptveis e, se forem infectadas durante a gestao, podem apresentar falhas reprodutivas. At 50% das primparas podem ser susceptveis na poca da primeira cobertura.

A infeco pelo PPV inicia-se principalmente pela via oronasal, pelo contato com fezes ou com restos de aborto. No entanto, a transmisso por smen contaminado durante o coito tambm pode ocorrer. No h evidncias diretas de que a transmisso por smen produza problemas reprodutivos nas fmeas infectadas. No entanto, acredita-se que as alteraes que ocorrem no tero durante a infeco possam interferir em estgios avanados da gestao. Aps a penetrao, o vrus replica em tecidos linfides, na medula ssea e nas criptas do intestino delgado. A infeco pode ser crnica, com a replicao do vrus nas clulas intestinais e excreo nas fezes por perodos prolongados, contribuindo para a contaminao ambiental. Tecidos fetais e membranas de abortos possuem grande importncia na transmisso e contaminao ambiental, devido quantidade macia de vrus presentes nesses fmites. A infeco transplacentria ocorre durante a fase de viremia na fmea gestante. Apesar da diculdade de se detectar o vrus no epitlio uterino, no se descarta a possibilidade de infeco direta por replicao neste rgo e nas membranas placentrias. Outro mecanismo sugerido seria a transferncia do vrus ao feto no interior de macrfagos. O PPV apresenta particular avidez pelos tecidos do embrio e/ou do feto e seus envoltrios. O feto sensvel aos efeitos do vrus durante a primeira metade da gestao. Aps este perodo, torna-se imunologicamente competente e capaz de eliminar a infeco pelo desenvolvimento de uma resposta imune ativa contra o vrus. A infeco embrionria ou fetal ocorre 10 a 15 dias aps a infeco da fmea, e a evoluo depende do estgio de gestao. Na fase embrionria (at 30 dias
depois da concepo), a infeco geralmente leva morte embrionria e reabsoro. Se a maioria dos embries morrer, a fmea pode retornar ao cio com intervalo prolongado. Se a maioria dos embries resistir, o resultado ser o nascimento de leitegadas pequenas, pois os embries mortos so reabsorvidos. A infeco fetal entre os 30 e 55 dias geralmente leva morte e mumicao fetal. A gestao pode ser levada a termo, e a fmea pode produzir uma leitegada composta por alguns leites saudveis e outros mumicados (Figura 14.9). A freqncia de natimortos tambm pode estar aumentada e pode ser conseqncia do retardo na pario. A infeco fetal aps os 70 dias geralmente no causa efeito deletrio sobre os fetos, pois, nessa fase, j esto com o sistema imune desenvolvido e so capazes de responder imunologicamente infeco. Durante a infeco intra-uterina, o vrus transmitido de um feto a outro, atingindo os diferentes fetos a determinados intervalos de tempo. Ou seja, a infeco de toda a leitegada no ocorre simultaneamente. Este fato pode explicar a presena de fetos mumicados em diferentes fases de desenvolvimento, muitas vezes mesclados com fetos normais (Figura 14.9).
Fonte: Mengeling (2006).
Figura 14.9. Efeitos do PPV na reproduo. A) Leitegada de uma porca inoculada experimentalmente com o PPV aos 34 dias de gestao. L: fetos do corno uterino esquerdo; R: fetos do corno direito. A foto foi tirada do animal abatido no dia 114 de gestao. B) Leitegada de uma porca infectada naturalmente com o PPV. Note o avanado grau de desidratao dos fetos.
394
Captulo 14
Cabe ressaltar que a ocorrncia de abortos rara durante a infeco pelo PPV, e essa caracterstica pode auxiliar no diagnstico diferencial de outras infeces que causam perdas reprodutivas. Os sinais da infeco geralmente so restritos s fmeas primparas e caracterizam-se por falhas reprodutivas, como o retorno ao cio, trs a oito semanas aps a inseminao ou coito. Algumas fmeas permanecem sem retorno ao cio por perodos maiores. Geralmente no h descrio de sinais clnicos em outros animais da granja. Dentre os sinais indicativos da infeco pelo PPV em uma granja destacam-se: a) nascimento de leitegadas pequenas, associadas com fetos mumicados de diferentes tamanhos, geralmente resultantes de fmeas no-vacinadas ou de primeira cria; b) aumento das taxas de retorno ao cio; c) ausncia de sinais clnicos nas fmeas afetadas; d) gestao falsa em algumas fmeas; e) leitegadas com fetos mumicados e normais; f) natimortalidade aumentada. Um resumo dos achados clnico-reprodutivos, em granjas afetadas de forma aguda pela parvovirose suna, est apresentado na Tabela 14.2.
Tabela 14.2 Achados clnico-reprodutivos observados durante surtos de infeco aguda pelo parvovrus suno (PPV) Parmetro
Nmero total de leites nascidos Vivos e mortos
de autlise e mumicados. Microscopicamente, observa-se necrose generalizada nos tecidos fetais com a presena de corpsculos intranucleares. Inamao e hipertroa endotelial, alm de inltrao de clulas mononucleares nas membranas placentrias e no epitlio uterino tambm so observados.
5.3.3 Diagnstico
A presena da infeco pelo PPV deve ser investigada sempre que houver aumento nos ndices de retorno ao cio e atraso na data de pario, associados com a presena de fetos mumicados e leitegadas com nmero reduzido de leites, especialmente em fmeas de primeiro ou segundo parto. Leitegadas, contendo alguns leites normais e outros mumicados, freqentemente em diferentes estgios de desenvolvimento, so fortes indicativos da infeco. Esses sinais geralmente no so acompanhados por outras manifestaes clnicas nas fmeas. O material a ser remetido para o laboratrio para conrmao do diagnstico deve incluir fetos mumicados, restos fetais e fragmentos de tecidos necrticos. Pode-se, ainda, enviar amostras de soro pareado das fmeas (isto , uma amostra coletada no momento da falha reprodutiva e outra coletada com 2 a 4 semanas de intervalo), amostras de soro dos fetos abortados, dos leites natimortos ou dos leites antes da ingesto do colostro. Os fetos mumicados podem apresentar grande quantidade de antgenos virais, que podem ser detectados por ELISA e IFA. Pode-se, ainda, detectar o vrus por HA, realizada com eritrcitos de cobaias. Tecidos e uidos fetais so indicados para serem testados por esta tcnica. Nos casos em que a infeco ocorre no perodo inicial da gestao, a presena do vrus de difcil deteco. Em geral, os testes sorolgicos so recomendados apenas quando tecidos de fetos mumicados no so disponveis. O uso de sorologia apresenta restries devido ampla disseminao da infeco, o que diculta a interpretao dos resultados. Nesse sentido, testes como a HI, SN e ELISA podem ser utilizados para o diagnsti-
Rebanho normal
Normal
Rebanho afetado
Reduzido
11.5 Porcas (< 10%); marrs (< 18%) 4-7% < 0,6% 1,0% < 3% Normal
< 9.5
% de leitegadas c/ < 9
20-40%
Natimortos Fetos mumificados Porcas sem cria/vazias Retorno retardado ao cio Intervalo desmame-cio
7-12% 1-4% 2-6% > 4% Normal
As leses so bem caractersticas e restritas aos fetos e tero. Os fetos podem apresentar diferentes aspectos e, pela infeco em diferentes fases, podem ser observados, em uma mesma leitegada, animais sadios, natimortos, em processo
Parvoviridae
395
co. No entanto, o seu uso restrito a amostras de soro pareado e anlise da variao dos ttulos de anticorpos entre uma amostra e outra. A deteco de anticorpos no soro fetal, de natimortos e de leites antes da primeira mamada so evidncias da infeco intra-uterina, uma vez que anticorpos maternais no atravessam a barreira transplacentria nessa espcie. O diagnstico diferencial deve considerar outras infeces que cursam com perdas reprodutivas, como a doena de Aujeszky, infeco pelo vrus da sndrome respiratria e reprodutiva (PRRSV), leptospirose, entre outras. Deve-se levar em considerao que, na infeco pelo PPV, no ocorrem manifestaes clnicas de doena em qualquer categoria animal e os abortos so raros.

Como a infeco pelo PPV endmica na maioria dos rebanhos sunos, o controle deve ser baseado na vacinao. Para esta nalidade, existem vacinas atenuadas e inativadas. No Brasil, s existem vacinas inativadas no comrcio, podendo ser monovalentes ou combinadas com antgenos de outros agentes virais e/ou bacterianos. Recomenda-se a vacinao das fmeas pelo menos 30 dias antes do perodo de cobertura (duas doses com 30 dias de intervalo) e a aplicao de reforos anuais. A imunidade passiva pode interferir com a vacinao de fmeas em cobertura antes dos sete meses de idade. A vacinao de reprodutores machos jovens tambm tem sido indicada para aumentar a eccia do programa de controle. A prtica de fornecimento de restos fetais e membranas placentrias para fmeas no-gestantes no recomendvel, pelo risco de disseminao de outros agentes.
evidncias de hipoplasia cerebelar congnita e de doena respiratria associadas com a infeco pelo BPV. Acredita-se que a diculdade em esclarecer o impacto patognico desse agente est associada dependncia de outros fatores, tais como: manejo, falha da imunidade passiva e a presena de infeces concomitantes. Pode-se especular que a alta prevalncia de anticorpos contra o agente em animais pode dicultar o aparecimento de casos clnicos decorrentes da infeco por este vrus. No Rio Grande do Sul, um inqurito sorolgico realizado com aproximadamente 4.000 bovinos leiteiros revelou 97% de positividade, sendo que 66,3% dos animais apresentavam um ttulo maior que 160 pela tcnica de HI. Tambm existem evidncias de resposta imune, tanto por anticorpos hemaglutinantes como neutralizantes, contra o BPV em fetos e terneiros recm-nascidos de vacas leiteiras sorologicamente positivas.
CONNER, M.E.; RAMIG, R.F. Viral enteric diseases. In: NATHANSON, N. (ed). Viral Pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.30, p.713-743 . DEVEY, J.J.; CROWE, D,T. Microenteral nutrition. In: BONAGURA, J.D. Kirks current veterinary therapy XIII. Philadelphia: Saunders, 2000. p.136-140. GAMOH, K. et al. The pathogenicity of canine parvovirus type2b, FP84 strain isolated from a domestic cat, in domestic cats. The Journal of Veterinary Medical Science, v.65, p.1027-1029, 2003. GASKELL, R.M.; BENNETT, M. Doenas infecciosas felinas. In: DUNN, J.K. Tratado de medicina de pequenos animais. So Paulo: Roca, 2001. p.953-978. GREENE, C.E. Infectious diseases of the dog and cat. 2.ed. Philadelphia: WB Saunders, 356p, 1998. GUILFORD, W,G.; STROMBECK, D.R. Gastrointestinal tract infections, parasites, and toxicoses. In: GUILFORD, W.G. et al. Small animal gastroenterology. 3.ed. Philadelphia: Saunders, 1996. p.411 432. HOSKINS, J.D. Canine viral enteritis. In: GREENE, C.E. Infectious diseases of the dog and cat. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 1998. p.40-49. HOSKINS, J.D. Update on canine parvoviral enteritis. Veterinary Medicine, v.92, p.694-709, 1997.
5.4 Parvovrus bovino

A infeco pelo parvovrus bovino (BPV), recentemente classicado no gnero Bocavirus, encontra-se disseminada mundialmente. Apesar de o agente ser freqentemente isolado de fezes de bovinos sadios, existem relatos de associao do isolamento do BPV com doena entrica em neonatos e em bovinos jovens. Existem, ainda,
396
HOUSTON, D.M; RIBBLE, C.S.; HEAD, L.L. Risk factors associated with parvovirus enteritis in dogs: 283 cases (19821991). Journal of American Veterinary Medical Association, v.15, p.542-546, 1996. HBNER, S.O. et al. Infeco intra-uterina e evoluo da imunidade passiva contra o parvovrus bovino. Revista de Patologia Tropical, v.25, p.263-271, 1996. HBNER, S.O. et al. Levantamento sorolgico de parvovrus bovino no rebanho leiteiro do RS, Brasil. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v.48, p.113-121, 1996. HUEFFER, K.; PARRISH, C.R. Parvovirus host range, cell tropism and evolution. Current Opinion in Microbiology, v.6, p.392-398, 2003. IKEDA, Y. et al. Apoptosis in feline panleukopenia virus-infected lymphocytes. Journal of Virology, v.72, p.6932-6936, 1998. IKEDA, Y. et al. Feline host range of canine parvovirus: recent emergence of new antigenic types in cats. Emerging Infectious Diseases, v.8, p.341-346, 2002. ISHIWATA, K.; MINAGAWA, T.; KAJIMOTO, T. Clinical effects of the recombinant feline interferon-omega on experimental parvovirus infection in beagle dogs. The Journal of Veterinary Medical Science, v.60, p.911-917, 1998. MACINTIRE, D.K.; SMITH-CARR, S. Canine parvovirus. Parte II. Clinical signs, diagnosis, and treatment. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.19, p.291-302, 1997. MANI, B. et al. Low pH-dependent endossomal processing of th inconing parvovirus minute virus of mice virion leads to externalization of the VP1 N-terminal sequence, N-VP2 cleavage and uncoating of the full-length genome. Journal of Virology, v.80, p.1015-1024, 2006. MARTIN, V. et al. Treatment of canine parvoviral enteritis with interferon-omega in a placebo-controlled challenge trial. Veterinary Microbiology, v.89, p.115-127, 2002. MENGELING, W.L. Porcine Parvovirus. In: LEMAN, A.D. et al. (eds). Diseases of swine. 7.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1992. Cap.23, p.299-311. MENGELING, W.L.; CUTLIP, R.C.; BARNETT, D. Porcine parvovirus: pathogenesis, prevalence and prophylaxis. Proceedings of the International Congress of the Pig Veterinary Society, v.5, p.KA15, 1978. MINAGAWA, T.; ISHIWATA, K.; KAJIMOTO, T. Feline interferon-omega treatment on canine parvovirus infection. Veterinary Microbiology, v.69, p.51-53, 1999.
Captulo 14
MOHR, A.J. et al. Effect of early enteral nutrition on intestinal permeability, intestinal protein loss, and outcome in dogs with severe parvoviral enteritis. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.17, p.791-798, 2003. MURPHY, F.A. et al. Parvoviridae. In: ___. Veterinary virology, 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 21, p.343-356. MUZYCZKA, M.; BERNS, K.I. Parvoviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.69, p.2327-2359. NAKAMURA, K. et al. Pathogenic potential of canine parvovirus types 2a and 2c in domestic cats. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v.8, p.663-668, 2001. PARRISH, C.R. et al. Natural variation of canine parvovirus. Science, v.230, p.1046-1048, 1985. PARRISH, C.R. et al. Global spread and replacement of canine parvovirus strains. Journal of General Virology, v.69, p11111116, 1988. PARRISH, C.R. Emergence, natural history and variation of canine, mink and feline parvoviruses. Advances in Virus Research, v.38, 403-450, 1990. PARRISH, C.R. Pathogenesis of feline panleukopenia virus and canine parvovirus. Baillieres Clinical Haematology, v.8, p.5771, 1995. PEREIRA, C.A.D. et al. Molecular characterization of canine parvovirus in Brazil by polymerase chain reaction assay. Veterinary Microbiology, v.75, p.127-133, 2000. POLLOCK, R.V.; COYNE, M.J. Canine parvovirus. The Veterinary Clinics of North America: small animal practice, v.23, p.555-568, 1993. POLLOCK, R.V.H.; POSTORINO, N.C. Feline panleukopenia and other enteric viral diseases. In: SHERDING, R.G. The cat diseases and clinical management. 2.ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, v.1, 1994. p.479-487. SHACKELTON, L.A. et al. High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.102, p.379-384, 2005. SMITH-CARR, S.; MACINTIRE, D.K.; SWANGO, L.J. Canine parvovirus. Parte I. Pathogenesis and vaccination. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.19, p.125-133, 1997.
PAPILLOMAVIRIDAE
Amauri A. Aleri, Sheila R. Wosiacki & Alice F. Aleri
15
399 400 402 402 404
404 404 404 405
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura e propriedades dos vrions 4 Estrutura e organizao genmica 5 O ciclo replicativo
5.1 Adsoro, penetrao e desnudamento 5.2 Transcrio e expresso das protenas virais 5.3 Replicao do genoma 5.4 Montagem do capsdeo e egresso
6 Patogenia 7 Patologia 8 Papilomavrus e tumores 9 Diagnstico 10 Imunologia 11 Imunoprolaxia 12 Doenas de importncia em medicina veterinria causadas por papilomavrus
12.1 Papilomatose 12.2 Hematria enzotica e tumores no trato digestrio superior de bovinos
405 405 406 407 407 408 409

409 410
411
1 Introduo
Os vrus da famlia Papillomaviridae infectam diferentes espcies de mamferos e aves e caracterizam-se pela propriedade oncognica, que responsvel pela produo de leses tumorais, benignas e malignas, nos epitlios cutneo e mucoso. Em medicina veterinria, as leses ocasionadas pela infeco com os papilomavrus determinam prejuzos econmicos considerveis bovinocultura tanto por perdas diretas, causadas pela morte de animais, quanto indiretas, representadas por redues na produtividade e no valor comercial dos animais e subprodutos como o couro. Em bovinos, a correlao entre a infeco pelo papilomavrus e o desenvolvimento de neoplasias tem sido extensivamente avaliada, no apenas pela repercusso econmica da infeco, mas tambm por ser um modelo experimental interessante para o estudo do sinergismo com fatores ambientais na etiologia das neoplasias. A infeco por membros da famlia Papillomaviridae ocasiona enfermidades semelhantes nas diversas espcies acometidas e est amplamente distribuda em todo o mundo. As leses cutneas so comumente denominadas papilomatose ou apenas verrugas, e so relatadas em quase todas as espcies de mamferos e em algumas aves e animais marinhos. A infeco do epitlio mucoso geralmente est associada com a formao de tumores malignos. Em seres humanos, a infeco pelo papilomavrus est intimamente associada ao cncer do colo do tero; e, em bovinos, a tumores vesicais (hematria enzotica bovina) e no trato digestrio superior (caraguat). A ocorrncia de papilomas cutneos em humanos descrita h sculos e est presente em relatos de origem grega e romana. As leses mucosas do colo do tero foram amplamente relatadas na Idade Mdia, ocasio em que todas as doenas sexualmente transmissveis eram consideradas como ocasionadas por um nico agente. O estudo do papilomavrus animal tambm tem uma longa histria. Em 1898, MFadycan e Hobday relataram a etiologia infecciosa do papilomavrus oral canino (COPV). No entanto, o primeiro papilomavrus animal foi identicado somente em 1933, por Richard Shope, que estudou o cottontail
rabbit papillomavirus (CRPV), que foi o primeiro vrus DNA oncognico identicado. O CRPV foi um importante modelo para os estudos pioneiros sobre a oncognese viral. Entretanto, assim como todos os outros membros dessa famlia, o CRPV tambm se manteve refratrio aos estudos virolgicos padres pela incapacidade de propagao do vrus em sistemas de cultivos celulares. Na dcada de 1950, os estudos com os papilomavrus perderam campo para os membros da famlia Polyomaviridae, que podem ser cultivados e multiplicados em cultivos de clulas convencionais. Por muitos anos, os papilomavrus, tanto na medicina humana quanto na veterinria, foram considerados de pouco interesse. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante e clonagem gnica na dcada de 1970, o primeiro genoma de papilomavrus foi clonado com sucesso. Esse passo foi importante para o reincio das pesquisas com os papilomavrus, que possuem vrios genes com potencial oncognico e so de grande importncia no estudo da oncologia molecular. As mudanas na percepo da importncia das infeces, em conjunto com o avano tecnolgico da biologia molecular, conduziram intensicao das pesquisas que proporcionaram aos papilomavrus uma posio de destaque no estudo do cncer e da virologia molecular. Historicamente, os papilomavrus foram agrupados em conjunto com os poliomavrus, constituindo a famlia Papovaviridae, cujo nome derivado das iniciais de seus trs membros (Papillomavirus, Polyomavirus e Simian Vacuolating Agent SV40). Todos os trs diferentes vrus apresentam propriedades semelhantes (tamanho e forma do vrion, ausncia de envelope e genoma constitudo por DNA ta dupla circular). Apenas com base no dimetro mdio dos vrions, a famlia Papovaviridae inicialmente inclua dois gneros: o Polyomavirus, com as espcies poliomavrus e o SV40, e o Papillomavirus. Estudos moleculares comparativos indicaram diferenas fundamentais entre eles, destacando-se o tamanho do genoma e a organizao genmica, na qual, praticamente, no so observadas similaridades na seqncia de nucleotdeos. Com isso, no ano 2000, o 7 Comit Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) reclassicou a famlia Papovaviridae em famlias
400
Captulo 15
Tabela 15.1. Classificao e doenas associadas com os papilomavrus Gnero

Alphapapillomavirus Betapapillomavirus
Biologia/patologia
Leses cutneas e mucosas em humanos e primatas. Leses cutneas em humanos, geralmente de forma latente. ativado aps eventos imunossupressivos. Leses cutneas em humanos com corpsculos de incluso intracitoplasmticos caractersticos. Leses fibropapilomatosas em ungulados. Infeces interespcies so relatadas. Leses cutneas em bovinos. Leses cutneas em eqinos. Leses cutneas em aves. Leses cutneas em roedores. Leses cutneas em aves. Leses cutneas e de mucosas em coelhos. Papilomavrus animal que causa leses cutneas e de mucosas. Leses cutneas em humanos com corpsculos de incluso intracitoplasmticos caractersticos. Leses cutneas benignas e malignas em humanos. Papilomavrus que induz verdadeiros papilomas no hospedeiro, causando leses cutneas e de mucosas. Isolado de leses genitais em cetceos.
Espcies
15 5
Espcies/n de tipos
Papilomavrus humano 32 Papilomavrus humano 5
Gammapapillomavirus
Papilomavrus humano 4
Deltapapillomavirus
Papilomavrus do alce europeu
Epsilonpapillomavirus Zetapapillomavirus Etapapillomavirus Lotapapillomavirus Thetapapillomavirus Kappapapillomavirus
1 1 1 1 1 2
Papilomavrus bovino 5 Papilomavrus eqino 1 Papilomavrus do Fringilla coelebs Papilomavrus Mastomys natalensis Papilomavirus Psittacus erithacus timneh Papilomavrus do coelho caudade-algodo Papilomavrus oral canino
Lambdapapillomavirus
Mupapillomavirus
Papilomavrus humano 1
Nupapillomavirus Xipapillomavirus
1 1
Papilomavrus humano 41 Papilomavrus bovino 3
Omikronpapillomavirus
Papilomavrus do Phocoena spinipinnis Papilomavrus oral dos hamsters
Pipapillomavirus
Fonte: ICTV (2004).
Leses mucosas em hamsters.
Papillomaviridae e Polyomaviridae. Nessa ocasio, a famlia Papillomaviridae continha apenas um gnero, o Papillomavirus. Em 2004, o 8 ICTV props a existncia de 16 gneros (Tabela 15.1).
2 Classicao
A famlia Papillomaviridae encontra-se em ativa expanso. Uma caracterstica viral de grande importncia para a classicao a impossibilidade de isolamento dos papilomavrus em cultivo celulares convencionais, o que diculta o processo de identicao e experimentao, as-
sim como a caracterizao de alteraes celulares e patolgicas da infeco. Nos ltimos 30 anos, com os avanos da biotecnologia, a taxonomia dessa famlia viral tem evoludo com base em algoritmos logenticos para a comparao de seqncias genmicas e subgenmicas. Existem fortes evidncias de que o genoma dos papilomavrus relativamente estvel e de que pequenas variaes provavelmente ocorram na mesma freqncia que em outros vrus DNA. De acordo com o ICTV, a atual classicao dos papilomavrus teve o objetivo de estabelecer a relao entre os tipos de papilomavrus, com-
Papillomaviridae
401
parar o termo tipo de papilomavrus nos padres taxonmicos espcie e gnero e investigar a relao entre a classicao taxonmica e as propriedades biolgicas e patolgicas. Assim, a famlia Papillomaviridae foi avaliada em bases logenticas e, atualmente, composta por 16 gneros (Tabela 15.1). Alguns desses agrupamentos logenticos coincidem com as propriedades biolgicas e patolgicas, enquanto outros divergem, mostrando apenas relaes moleculares. Os papilomavrus so altamente espcie/ tecido-especcos e tm sido descritos em diversas espcies de mamferos, como seres humanos, animais domsticos e selvagens, assim como em algumas espcies de aves. Infeces entre diferentes espcies hospedeiras so relatadas; no entanto, nenhum caso de infeco produtiva foi comprovado na segunda espcie. As espcies de
papilomavrus que infectam animais esto apresentadas na Tabela 15.2. A classicao por sorotipos no utilizada para a sistemtica dos papilomavrus, que se baseia na espcie hospedeira, na origem e extenso das leses, e no genoma viral, sendo referido como gentipos virais. O gene L1, que codica a principal protena do capsdeo, o mais conservado do genoma viral e tem sido utilizado para a identicao de novos tipos de vrus. Um novo isolado de papilomavrus reconhecido quando, aps o seqenciamento da seqncia codicante L1 (ORF, seqncia aberta de leitura, L1), houver diferena superior a 10% com os papilomavrus conhecidos e com seqncias disponveis em bancos genmicos. Diferena entre dois e 10% na homologia dene um subtipo, e inferior a 2% dene uma variante viral.
Tabela 15.2. Espcies de papilomavrus que infectam animais Gnero Espcies

1 2 3 4 Epsilonpapillomavirus Zetapapillomavirus Etapapillomavirus Thetapapillomavirus 1 1 1 1
Espcie/tipo
Papilomavrus do alce europeu (EEPV) Papilomavrus do cervo (DPV) Papilomavrus ovino 1 (OvPV-1) Papilomavrus bovino 1 (BPV-1) Papilomavrus bovino 5 (BPV-5) Papilomavrus eqino 1 (EcPV-1) Papilomavrus do Chaffinch (ChPV) Papilomavrus dos papagaios (PePV) Papilomavrus do coelhos cauda-dealgodo (CRPV) Papilomavrus oral dos coelhos (ROPV) Papilomavrus oral canino (COPV) Papilomavrus felino (FDPV) Papilomavrus bovino 3 (BPV-3) Papilomavrus oral dos hamsters (HaPV) Papilomavrus bovino 7 (BPV-7)
Outros papilomavrus
Papilomavrus do cervo reindeer
OvPV-2 BPV-2 -
Deltapapillomavirus
1 Kappapapillomavirus 2
Lambdapapillomavirus
1 2
BPV-4 e BPV-6
Xipapillomavirus
Pipapillomavirus No-classificado
1 -
402
Captulo 15
Embora ainda no utilizada com muita freqncia, a classicao dos papilomavrus em gnero e espcie tambm foi recentemente denida em bases logenticas. Diferentes gneros apresentam menos de 60% de similaridade na seqncia de nucleotdeos da ORF L1 e entre 23 e 43% de similaridade na seqncia completa do genoma viral. Entre as espcies virais pertencentes ao mesmo gnero, devem ser encontradas semelhanas entre 60 e 70% na seqncia da ORF L1. Atualmente, os bancos genmicos dispem da seqncia completa do genoma de 118 tipos de papilomavrus. Porm, esse nmero deve ser constantemente reavaliado, uma vez que novos estudos tm conduzido determinao de novos tipos, subtipos e variantes virais com grande freqncia.
Fonte: www.oralcancerfoundation.org
Figura 15.1. Fotomicrografia eletrnica de um papilomavrus humano.
4 Estrutura e organizao genmica 3 Estrutura e propriedades dos vrions

Os papilomavrus so pequenos vrus oncognicos no-envelopados, com 52 a 55 nm de dimetro. O capsdeo viral, com simetria icosadrica, composto por 72 capsmeros, sendo 60 capsmeros que se ligam de forma hexavalente e 12, de forma pentavalente. Os capsmeros so arranjados em superfcies com triangulao T = 7, originando microscopia eletrnica o aspecto arredondado (Figura 15.1). Cada capsmero composto por duas protenas codicadas pelo vrus: a protena principal (L1) e a protena secundria (L2). Partculas semelhantes ao vrus (VLPs) podem ser produzidas pela expresso somente da protena L1 ou pela combinao das protenas L1 e L2. Os vrions apresentam coeciente de sedimentao (S20, W) de 300 e densidade no cloreto de csio de 1.34 g/mL. O cido nuclico dos papilomavrus consiste de uma molcula de DNA de ta dupla circular, com 7.3 a 8 kpb. Nos vrions e nas clulas hospedeiras, o genoma est conjugado com histonas, formando um complexo semelhante cromatina celular. A massa molecular do cido nuclico de 5.0 x 106 daltons e representa 12% da massa do vrion. A partcula viral resistente s condies do meio ambiente e a solventes lipdicos, como o ter e o clorofrmio. Apesar do tamanho relativamente pequeno, a organizao do genoma dos papilomavrus muito complexa (Figura 15.2). No so observa-
Regio conservada e expressa aps a integrao
s R LC otoreres E6 m do pro gula re e 7945

7000
E7
1000
E1
L1
6000
BPV - 1
2000
5000 4000
3000
E2 E4
L2 E5
Regio pouco, ou no-expressa aps a integrao
Regio interrompida aps a integrao
Fonte: Alfieri, A.A.
Figura 15.2. Ilustrao esquemtica da organizao do genoma do papilomavrus bovino tipo 1.
Papillomaviridae
403
das diferenas na organizao genmica entre os gneros de papilomavrus. Todas as ORFs esto localizadas em uma das tas do DNA viral, indicando que apenas uma ta utilizada como molde para codicar as protenas virais. A ta codicante contm cerca de 10 ORFs, classicadas em dois segmentos principais, conforme a fase de transcrio: o segmento E contm oito ORFs a serem traduzidas, chamadas de iniciais (early E), e o segmento L contm duas ORFs tardias (late L). As ORFs E e L so encontradas em locais distintos do genoma. O segmento E representa 45% do genoma viral e codica protenas necessrias para as fases iniciais de replicao e transcrio viral. Nesse segmento, esto as ORFs que codicam as protenas regulatrias e as protenas oncognicas dos papilomavrus. As protenas iniciais so expressas em clulas recm-infectadas, em infeces no-produtivas, assim como em clulas transformadas. O segmento L representa 40% do
genoma viral e codica as protenas do capsdeo (L1 e L2), que so produzidas nas fases tardias da replicao viral e so encontradas apenas nas infeces produtivas. As ORFs dos papilomavrus esto sobrepostas e aninhadas, compactando vrios genes em uma pequena extenso do genoma. A massa molecular e a funo das protenas virais so bem conservadas entre as diferentes espcies de papilomavrus. Entre os segmentos genmicos L e E existe outro segmento, denominado LCR (long control region), que representa 15% (500-1.000 pb) do genoma viral. Essa regio no codica protenas, mas contm elementos promotores e regies regulatrias da replicao viral. A maioria dos elementos cis de regulao da replicao e transcrio do material gentico, assim como o ponto de origem (ori) da replicao esto contidos nessa regio. Em sntese, no genoma dos papilomavrus, so encontrados trs oncogenes (E5, E6 e E7), que
Tabela 15.3. Protenas codificadas pelo papilomavrus bovino tipo 1 Protena Tamanho (aminocidos) Funo
Em conjunto com a E2, a primeira protena a ser produzida. uma helicase dependente de ATP que separa as cadeias do DNA viral e age como fator de elongao na replicao do DNA. Atua como protena regulatria de oncogenes virais. Est envolvida tanto no controle da transcrio quanto na replicao do DNA. Atua como protena regulatria de oncogenes virais.
E1
605
E2
306
E4
120
So pequenas protenas, expressas tardiamente, produzidas por splicing alternativo e modificada aps a traduo. Esto envolvidas na transformao da clula hospedeira, desregulando a mitognese. Protena de transformao celular que interage com receptores de fatores de crescimento, obstruindo os mecanismos de supresso do crescimento. Altera o controle do ciclo celular. Protena de transformao celular que ao se ligar p53 (protena de supresso de tumores), ocasiona a sua degradao. Altera o controle do ciclo celular. Protena de transformao celular que ao se ligar pRb ou p107 (protenas de supresso de tumores) ocasiona a sua degradao. Altera o controle do ciclo celular. Protena principal do capsdeo. Representa 80% do capsdeo protico e contm epitopos que induzem anticorpos neutralizantes. Protena secundria do capsdeo viral. Tambm contm epitopos que induzem anticorpos neutralizantes.
E5
44
E6
137
E7
127
L1
495
L2
469
404
Captulo 15
modulam os processos de transformao celular; dois genes que codicam protenas reguladoras (E1 e E2), que modulam a transcrio e a replicao; e dois outros genes que codicam as protenas estruturais (L1 e L2) que compem o capsdeo viral. As ORFs E1, E2, L1 e L2 so particularmente bem conservadas entre todos os membros dessa famlia. Na Tabela 15.3, esto apresentadas as protenas codicadas pelos papilomavrus bovino tipo 1 e suas respectivas funes. O genoma dos papilomavrus pode ser encontrado no ncleo da clula infectada sob duas formas fsicas: a epissomal e a integrada. A epissomal encontrada em leses iniciais e benignas, sob a forma circular e em mltiplas cpias. A forma integrada encontrada apenas em clulas transformadas. Nessa forma, o genoma do papilomavrus encontra-se integrado ao cromossomo da clula hospedeira, com uma nica cpia por clula. A integrao do genoma viral ao cromossomo celular ocorre de forma aleatria, porm todas as clulas infectadas apresentam a integrao no mesmo stio.
5 O ciclo replicativo
5.1 Adsoro, penetrao e desnudamento
A infeco pelo papilomavrus iniciada com a adsoro dos vrions superfcie das clulas basais do epitlio. O receptor responsvel pela ligao dos vrions uma molcula conservada, presente na membrana celular, porm a sua identidade no conhecida. O vrus penetra, provavelmente, por meio de endocitose e transportado pelo citoesqueleto em direo ao ncleo. Durante essa etapa, ocorre a desestruturao e a perda do capsdeo viral, processo ainda pouco compreendido. Utilizando os poros nucleares, o DNA viral penetra no ncleo da clula hospedeira.
mltiplos promotores e formas alternativas de transcrio. Os primeiros indicadores de transcrio do genoma aparecem cerca de quatro semanas aps a infeco, quando pode ser detectada a expresso dos genes iniciais E1 e E2. Na infeco produtiva, as clulas da camada basal da epiderme, que possuem a capacidade de se multiplicar, aumentam a taxa de proliferao. Esse efeito, provavelmente, deva-se combinao das aes das protenas expressas pelo gene E5, que atuam em conjunto com receptores de fator de crescimento epidrmico; protena viral E6, que se liga protena p53; e protena E7, que se liga protena retinoblastoma (Rb). As oncoprotenas virais interferem, dessa forma, no ciclo vegetativo celular. A transformao promovida pelos papilomavrus complexa e depende dos produtos dos genes iniciais. As protenas de transformao podem ser diferentes entre os vrios tipos virais, e o mecanismo de ao dessas protenas ainda no est totalmente elucidado. O princpio geral consiste em duas ou mais protenas iniciais cooperando para formar o fentipo transformado. Alguns vrus podem transformar clulas por si s, como o papilomavrus bovino tipo 1 (BPV-1), e outros requerem a cooperao com um oncogene celular ativado, como o papilomavrus humano tipo 16 (HPV-16). Na maioria dos casos, parte ou todo o genoma do papilomavrus mantido nas clulas tumorais. Em casos excepcionais, como o papilomavrus bovino tipo 4 (BPV-4), o DNA viral pode ser perdido antes da transformao.
5.3 Replicao do genoma viral

A replicao do genoma viral ocorre no ncleo celular e realizada em diferentes etapas, de acordo com as fases de diferenciao das clulas do epitlio. Inicialmente, nas clulas abaixo da superfcie da derme, o DNA viral amplicado at um total de 50 a 400 cpias por clula. Aps esta fase inicial de replicao, o DNA viral passa a ser replicado em conjunto com o ciclo de diviso celular e o nmero de cpias virais por clula permanece constante. Nas clulas diferenciadas da epiderme, o DNA viral amplicado em grande nmero de cpias por clula e de forma descontrolada.
5.2 Transcrio e expresso das protenas virais

A expresso das protenas codicadas pelos papilomavrus complexa devido presena de
Papillomaviridae
405
5.4 Montagem do capsdeo e egresso

A montagem, maturao e a subseqente produo de vrions ocorrem no ncleo celular. As protenas tardias, L1 e L2, so expressas e a montagem do capsdeo ocorre mesmo sem a presena do DNA viral. Essa caracterstica de grande importncia para a produo de VLPs que apresentam potencial para utilizao em vacinas. As partculas virais so liberadas por interferncia da protena codicada a partir do gene E4, que desestabiliza a rede de queratina intracelular. Os vrions so, ento, agrupados e liberados das clulas.
6 Patogenia
Cada papilomavrus apresenta especicidade por uma nica espcie animal, na qual se replica de forma produtiva. Alguns tipos virais podem infectar uma segunda espcie animal. Nesses casos, produzem uma infeco no-produtiva, ou seja, sem a produo de vrions infecciosos, como ocorre no sarcide eqino, que um exemplo de infeco heterloga ocasionada pelos BPV-1 e BPV-2. Os papilomavrus so tambm tecido-especcos, com tropismo por clulas do epitlio escamoso. Os receptores celulares responsveis por esse tropismo ainda no so conhecidos, no entanto, alguns tipos de papilomavrus apresentam tropismo pelo epitlio cutneo e outros pelo epitlio mucoso. Outro aspecto importante que os papilomavrus necessitam da diferenciao celular do epitlio. Portanto, o cultivo em clulas indiferenciadas no pode ser realizado com xito, visto que as clulas podem ser infectadas, mas no ocorre a infeco produtiva. O ciclo de replicao viral completado nos processos de diferenciao das clulas epiteliais. Inicialmente, o vrus infecta os queratincitos basais, provavelmente por meio de microleses; expressa parte dos seus genes nas camadas basal e suprabasal; replica o genoma viral na regio de diferenciao das camadas espinhosa e granular; expressa os genes estruturais e transfere o DNA para as clulas da camada escamosa, onde a prognie viral nalmente liberada aps a descamao celular normal do epitlio. Ou seja, as diferentes etapas
da replicao ocorrem sucessivamente de acordo com o estgio de diferenciao celular (Figura 15.3). O perodo de incubao das patologias induzidas pelos papilomavrus varia de acordo com o local da clula infectada. As verrugas nas mos e ps de seres humanos apresentam longo perodo de incubao (6 a 18 meses), enquanto as verrugas genitais tm perodo de incubao de 2 a 6 meses. Os papilomavrus podem tambm ser encontrados em clulas polimorfonucleares do sangue perifrico, no entanto, no existem evidncias da sua multiplicao nessas clulas. Essa observao importante pela implicao que pode ter na patognese da infeco, pois sugere que a corrente sangnea pode carrear o vrus para diferentes tecidos.
7 Patologia
A infeco pelo papilomavrus pode ocasionar alteraes na morfologia e funo celular. Essas alteraes so reexos das mudanas genticas e siolgicas que se acumulam por longos perodos de tempo, levando perda progressiva do controle do ciclo celular, imortalizao celular e transformao tumoral. Nas clulas epiteliais transformadas, podem ser observadas alteraes do tipo hiperplasia e hipertroa. As clulas germinativas no so permissivas replicao viral e, ao se dividirem e se deslocarem para a superfcie, disseminam o vrus a todas as clulas irms que, ento, passam por processos de transformao e de proliferao de forma displsica, induzidos pelo vrus. A camada celular ca mais espessa, com clulas vacuolizadas, adquirindo a aparncia clssica de papiloma. Assim, o aspecto de verruga deve-se proliferao e no destruio celular. medida que as clulas infectadas passam pelo processo de diferenciao e queratinizao, elas se tornam permissivas replicao viral. Os vrions podem reinfectar as clulas adjacentes, sendo esta a razo pela qual os papilomas cutneos so contagiosos e aparecem agrupados. A infeco de vrias clulas basais origina colnias celulares sobrepostas, com a aparncia de verruga em forma de couve-or.
406
Captulo 15
Vrus introduzido por microleses Diferenciao dos queratincitos

Estrato crneo Camadas granulares
Replicao dos papilomavrus

Liberao de vrions maduros Vrions maduros
Camadas espinhosas superiores
Morfognese dos vrions Produo das protenas tardias Amplificao vegetativa do DNA Nveis altos de protenas iniciais (E4)
Camadas espinhosas inferiores Clulas amplificadores em trnsito (mitticas) Clulas basais e de reserva
(subsitituem as ampllficadoras)
Protenas dependentes da diferenciao E6 e E7 Protenas iniciais E1, E2, E3 e E4 Possvel stio alternativo de infeco Protenas iniciais E1 e E2 Infeco primria Estabelecimento da replicao Protenas iniciais E1 e E2
Membrana basal Derme (tecido conjuntivo, fibroblastos, endotlio vascular)
Fonte: adaptada de Frazer (2004) e Chow e Braker (1997).
Figura 15.3. Ilustrao esquemtica da infeco pelo papilomavrus em epitlio cutneo.
8 Papilomavrus e tumores
A progresso neoplsica um processo sem perspectiva para o vrus, visto que a clula transformada no mais permissiva maturao dos vrions. O genoma viral incorporado pela clula, mantido como um elemento extracromossmico, com replicaes sincronizadas com o ciclo celular, ou pode at mesmo ser perdido pelas clulas transformadas. O papilomavrus est associado com neoplasias, incluindo carcinomas urogenitais e cncer do trato respiratrio superior em humanos, cncer de pele em humanos e coelhos, cncer do canal alimentar superior e de bexiga em bovinos,
carcinoma oral em ces e, possivelmente, cncer do trato alimentar e de bexiga em humanos. Embora a etiologia viral de tumores esteja bem estabelecida, os mecanismos moleculares induzidos pelo vrus sobre a clula transformada ainda no so bem compreendidos. O DNA viral pode no estar presente em muitos tumores e em clulas transformadas in vitro. Essa caracterstica sugere que o vrus possa ser o responsvel pelos eventos iniciais da carcinognese, mas no pela continuidade das transformaes fenotpicas, quando a informao gentica do vrus no necessria para a manuteno da malignidade. Tambm no est claro como os fatores carcinognicos e os agentes promotores da carcinog-
Papillomaviridae
407
nese esto envolvidos nos diferentes estgios de desenvolvimento dos papilomas e carcinomas. Dois estgios da carcinognese a iniciao e a promoo que apresentam componentes independentes j foram descritos. Como a maior parte dos papilomas no progride para o cncer e o desenvolvimento maligno somente ocorre aps longo perodo de latncia, a infeco viral considerada como condio necessria, mas no suciente, para o desenvolvimento dos diferentes tipos de neoplasias epiteliais associados com os papilomavrus. O papiloma um tumor benigno, mas as alteraes displsicas ocasionadas pelo vrus podem originar a lenta progresso para uma doena maligna.
9 Diagnstico
A maioria das viroses pode ser diagnosticada por tcnicas tradicionais de Virologia, como os cultivos celulares, a microscopia eletrnica ou a sorologia. Entretanto, nenhum desses mtodos rotineiramente utilizado para a deteco do papilomavrus. A histologia possibilita a identicao de neoplasia intra-epitelial, que pode estar associada com vrus de potencial oncognico e que so de risco para a progresso do cncer. Por meio da histologia, no possvel identicar o tipo de papilomavrus associado com o efeito citoptico. A interpretao histolgica tambm dicultada quando as alteraes vrus-associadas so mnimas, alm de no permitir a identicao de infeco latente. A tcnica de imunoistoqumica um mtodo com baixa sensibilidade e especicidade e que exige a presena de grande concentrao de protenas virais. Apesar de ainda estar sob avaliao, a sorologia para o diagnstico de rotina do HPV tem mostrado algumas vantagens. No momento, a tcnica de VLP-ELISA (ensaio imunoenzimtico com partculas semelhantes a vrus) ainda apresenta baixa especicidade e sensibilidade. A impossibilidade do cultivo dos papilomavrus em sistemas in vitro de cultivos celulares tem direcionado o desenvolvimento de tcnicas de diagnstico baseadas na identicao do DNA viral. As principais tcnicas utilizadas para
a deteco do papilomavrus so: a hibridizao do cido nuclico e a reao em cadeia da polimerase (PCR). Diferentes mtodos de hibridizao foram desenvolvidos para a deteco do DNA do papilomavrus em fragmentos de tecidos e em esfregaos. O limiar de deteco varivel e, em sua maioria, esses mtodos apresentam baixa sensibilidade e especicidade. A tcnica de Southern blot considerada o padro ouro para a deteco do genoma do papilomavrus. Esse mtodo um valioso instrumento de pesquisa, mas no tem aplicao para a rotina diagnstica. Algumas variaes de mtodos de hibridizao j foram utilizadas para a deteco do DNA do papilomavrus, como o Dot blot, a hibridizao in situ, a hibridizao in situ com ltro, entre outras. Porm, todas essas tcnicas somente detectam infeces com mais de 10 a 20 cpias do genoma viral por clula e tambm no so utilizadas na rotina diagnstica. A PCR tem sido amplamente utilizada para o diagnstico e caracterizao molecular dos papilomavrus com bons nveis de sensibilidade e especicidade. A PCR possibilita ainda que os produtos amplicados sejam avaliados por anlises do polimorsmo dos fragmentos de restrio (RFLP) e, mais comumente, por seqenciamento, permitindo, assim, a elaborao de anlises logenticas. Segmentos do gene L1 so os mais utilizados para a amplicao tanto com o objetivo de diagnstico quanto para a caracterizao molecular de novas espcies e tipos virais.
10 Imunologia
As leses benignas produzidas na infeco cutnea e mucosa pelo papilomavrus apresentam tendncia de regresso espontnea. No entanto, algumas infeces com curso clnico prolongado e que determinam leses extensas podem, ocasionalmente, progredir para o cncer. Infeces pelo papilomavrus, ocasionando leses benignas, podem ser encontradas tanto em animais imunossuprimidos quanto imunocompetentes. Casos de papilomatose persistente geralmente so observados em animais imunossuprimidos. Um grande nmero de animais com
408
Captulo 15
papilomatose em um rebanho pode estar relacionado com fatores qumicos ou mecanismos imunomodulados, que podem ativar o vrus latente. A relao entre o nmero de clulas CD4+ e CD8+ no sangue perifrico de animais infectados com o papilomavrus signicativamente menor quando comparada com animais no-infectados, sugerindo uma depleo linfocitria. A maior susceptibilidade de animais jovens infeco pelo papilomavrus deve-se falta de reconhecimento do patgeno pelo sistema imune. Aps a infeco primria, os animais tornamse menos susceptveis ou mesmo resistentes a novas infeces. A regresso e o desaparecimento de leses benignas apresentam evidncias do desenvolvimento de imunidade sistmica, uma vez que todas ou a maioria das leses regridem simultaneamente. Aps o desaparecimento das leses, ocorre um perodo de resistncia reinfeco pelo mesmo tipo viral que ocasionou as leses. Entretanto, outro tipo viral pode produzir nova infeco com a produo de leses. A imunidade reinfeco mediada por anticorpos neutralizantes produzidos contra as protenas do capsdeo viral, principalmente contra a protena L1. A imunidade humoral tem importncia na preveno de infeco, mas no efetiva para a regresso das leses. Anticorpos contra as protenas iniciais E1 e E2 (encontradas no incio da infeco e responsveis pelos eventos primrios da replicao viral) e contra E6 e E7 (que so protenas envolvidas na transformao celular), so detectados em diferentes estgios da infeco. Os anticorpos contra E1 e E2 permanecem constantes e os anticorpos contra E6 e E7 declinam mais tardiamente. A regresso dos papilomas se deve a eventos celulares da imunidade, onde so encontrados inltrados de linfcitos T nas leses em processo de regresso. Os tipos celulares (CD8+/CD4+), predominantes nas diferentes camadas celulares do epitlio, podem variar de acordo com o tipo de papilomavrus envolvido na infeco. Por m, deve-se, ainda, considerar que aspectos genticos, nutricionais e imunolgicos relacionados ao hospedeiro e caractersticas pr-
prias de cada tipo viral podem inuenciar na forma de manifestao clnica e na evoluo da infeco pelo papilomavrus, bem como no processo de recuperao do animal infectado.
11 Imunoprolaxia
As pesquisas de vacinas contra o papilomavrus so prejudicadas pela incapacidade do vrus de replicar em cultivos celulares e tambm pela diculdade de adaptao em cultivos de tecidos. Os primeiros estudos realizados com vacinas contra os diferentes tipos de papilomavrus bovino foram realizados na dcada de 1990, quando se sugeriu a existncia de imunidade tipo-especca para esse vrus. Sucessos na prolaxia e na regresso de tumores epidermais e do trato digestrio foram obtidos em bovinos, tanto utilizando vacinas convencionais quanto vacinas produzidas por engenharia gentica. Inicialmente, dois tipos de vacinas foram considerados: vacinas prolticas, que induziriam anticorpos vrus-neutralizantes prevenindo a infeco, e vacinas teraputicas, que promoveriam a regresso das leses j estabelecidas, antes que a progresso maligna tivesse incio. Diferentes estratgias para a elaborao de vacinas tm sido utilizadas para o controle da infeco pelo papilomavrus, destacando-se entre elas: a) vacina autgena, preparada a partir de macerado de papilomas cutneos do animal de origem. Esse tipo de vacina tem sido utilizado em bovinos, caninos e coelhos, e experimentos controlados indicam um efeito positivo na regresso das leses; b) extratos heterlogos de papilomas cutneos, semelhantes a vacinas autgenas, preparados a partir de leses obtidas de diversos animais; c) vacina de vrus puricado. Este foi o primeiro tipo de vacina testada em bovinos e protege contra subseqentes desaos com vrus homlogos; d) protenas recombinantes expressas em bactrias induzem a formao de anticorpos neutralizantes produzidos contra epitopos conformacionais. Como vacina proltica, utiliza-se a protena L1 do capsdeo viral; e, para a regresso tumoral, so utilizadas as protenas iniciais E1, E2, E6 e E7. Para o BPV-4, a vacina com a protena
Papillomaviridae
409
L2 promove a regresso tumoral, provavelmente por estimular a resposta imune do hospedeiro a outras protenas virais; e) protenas recombinantes produzidas em sistema baculovrus tambm podem ser utilizadas como vacinas induzindo resposta imune celular; f) VLPs, produzidas a partir da expresso dos genes L1 ou L1 e L2 em bactrias. A protena L1 de forma isolada ou a associao das protenas L1 e L2, expressas a partir de clulas bacterianas recombinantes, produzem, por anidade qumica, o capsdeo viral e induzem a formao de anticorpos neutralizantes; g) vacina de DNA. Fragmentos de DNA plasmidial, codicando antgenos virais, so bombardeados juntamente com partculas de ouro diretamente no ncleo celular. Podem ser utilizados somente os genes L1 e E6 ou a sua associao com os genes iniciais E1, E2, E6 e E7, que apresenta maior ecincia. A imunidade induzida por essa vacina pode ser longa.
12 Doenas de importncia em medicina veterinria causadas por papilomavrus
12.1 Papilomatose
A papilomatose cutnea caracterizada pela formao de tumores benignos no epitlio cutneo e mucoso de vrias espcies animais, destacando-se as domsticas (bovinos, ovinos, sunos, eqinos e caninos), de laboratrio (coelhos e hamsters), selvagens (ursos, alces), mamferos aquticos (golnhos, peixes-boi), outros animais aquticos (tartarugas marinhas), aves (papagaios) e tambm os seres humanos. A papilomatose cutnea geralmente acomete indivduos jovens e/ou imunocomprometidos. Os papilomas cutneos podem ser encontrados em diversas localizaes anatmicas e com os mais variados tamanhos e morfologias, incluindo desde papilomas planos at em forma de gro de arroz e couve-or. A papilomatose bovina uma enfermidade infecto-contagiosa de grande importncia na pecuria mundial, tanto para as exploraes leiteiras quanto de corte. A enfermidade pode causar
prejuzos econmicos considerveis, destacandose a reduo no consumo de alimentos e conseqente perda de peso e/ou queda na produo de leite, predisposio a mastites e a outras infeces secundrias e reduo na qualidade do couro. Os prejuzos esto intimamente relacionados com a localizao anatmica e extenso das leses encontradas. Surtos de papilomatose cutnea bovina com prevalncias variadas so relatados em diversos estados brasileiros. O BPV-1 causa bropapilomas em tetos, pnis e em outras localizaes anatmicas; o BPV-2 tambm causa bropapilomas em diversas localizaes anatmicas, inclusive no esfago e rmen. Alm disso, responsvel pelo desenvolvimento de papilomas cutneos comuns. Em associao com a ingesto crnica de samambaia (Pteridium aquilinum), o BPV-2 tambm implicado na etiologia da hematria enzotica bovina; o BPV-3 tem sido isolado de papilomas cutneos comuns; o BPV-4 tambm isolado de leses cutneas e, quando em associao ao consumo crnico de samambaia, pode causar tumores no trato digestrio superior, popularmente conhecidos como caraguat; o BPV-5 causa bropapilomas em forma de gro de arroz no bere e tetos; e o BPV6 tambm o agente etiolgico de papilomas localizados na glndula mamria. Em 2007, no Japo, foram descritos dois novos tipos de BPV (BPV-7 e BPV-8) em leses cutneas, ainda no classicados em nvel de espcie. A papilomatose eqina um distrbio dermatolgico no muito comum, causada pelo papilomavrus eqino tipo 1 (EqPV-1). A infeco geralmente autolimitante e caracterizada por pequenas leses localizadas na regio da cabea e pescoo. Mais comum que a papilomatose cutnea em eqinos a infeco heterloga de eqinos com o BPV-1 ou BPV-2, resultando na produo do sarcide eqino. Essa infeco, mesmo no sendo produtiva, promove o aparecimento de grandes massas tumorais. O tratamento pode ser realizado por extirpao cirrgica ou com produtos imunoestimulantes, tais como a aplicao intralesional de BCG. A papilomatose ovina, causada pelo OvPV-1 e OvPV-2, no uma doena de importncia econmica, ocorre em uma pequena parcela da populao ovina e no provoca leses extensas.
410
Captulo 15
A papilomatose suna ocorre com maior freqncia na bolsa escrotal e interfere com a libido, tanto pela dor localizada quanto pela presena de aderncias. O agente etiolgico da papilomatose suna ainda no foi caracterizado. A papilomatose canina pode ser encontrada sob duas formas. A primeira e mais importante a forma oral, conhecida como papilomatose oral canina. Essa forma ocasionada pela infeco com o COPV, e caracteriza-se pelo aparecimento de pequenos papilomas pedunculados (1-2 cm de comprimento) na cavidade oral, podendo estender-se desde a gengiva at o palato. Os animais podem apresentar tambm leses ao redor da boca e olhos. As implicaes dessa forma de papilomatose so: a diculdade de alimentao e o mal-estar. A segunda forma, menos comum, a papilomatose cutnea propriamente dita, causada pelo CPV-1. Essa infeco pode causar leses, geralmente em pequeno nmero, distribudas em vrias regies do corpo do animal.
12.2 Hematria enzotica e tumores no trato digestrio superior de bovinos

Historicamente, a etiologia da hematria enzotica bovina foi relacionada a diversos fatores, incluindo decincias nutricionais, ingesto de plantas txicas, falta ou excesso de molibdnio no solo e agentes infecciosos, como bactrias (Corynebacterium renale), fungos (Fusarium spp), protozorios e at endoparasitos. Atualmente, a interao do papilomavrus bovino tipo 2 com carcingenos presentes na planta samambaia (Pteridium aquilinum) reconhecida mundialmente como a mais provvel causa da hematria enzotica bovina. A hematria enzotica bovina apresenta carter enzotico em determinadas regies geogrcas que renem condies ideais para o crescimento da samambaia. Essa planta invasora se desenvolve em solos pobres, cidos, com baixos teores de clcio e de fsforo e em regies com umidade relativa do ar elevada. A samambaia uma pteridta do gnero Pteridium, espcie aquilinum, e, no Brasil, encontrada apenas a subespcie caudatum, variedade arachnoideum.
A samambaia cosmopolita em todas as regies tropicais e, no Brasil, sua presena registrada em praticamente todos os estados. A samambaia apresenta em sua composio diversas substncias mutagnicas, carcinognicas e imunossupressivas. A toxicidade da planta comprovada experimentalmente, no entanto, a sua associao com a patogenia dos tumores vesicais e do trato digestrio ainda no est totalmente esclarecida. Substncias potencialmente mutagnicas e/ou carcinognicas foram isoladas da samambaia, incluindo a quercetina, ptaquilosdeos, -ecdysone, cido shikmico, aquildeo A, tanino, prunasina e camferol. A carcinogenicidade da planta tem sido atribuda quercetina, cido shikmico e ao ptaquilosdeo. Porm, a baixa freqncia de atividade citotxica desses compostos sugere que no sejam os provveis agentes etiolgicos diretos na intoxicao pela samambaia em bovinos. A natureza dos carcingenos no foi completamente elucidada e nenhum dos constituintes txicos isolados foi capaz de reproduzir, individualmente, todas as sndromes tpicas dessa intoxicao. Apesar da baixa palatabilidade, so vrias as condies em que a intoxicao natural pela samambaia pode ocorrer, como pela ingesto de fenos contaminados, superpastoreio, secas, geadas ou queimadas e a necessidade da ingesto de bras. A intoxicao pela samambaia em bovinos pode apresentar trs formas clnicas: intoxicao aguda, hematria enzotica crnica e tumores no trato digestrio superior. A hematria enzotica caracterizada pela presena de sangue na urina. As primeiras manifestaes ocorrem em animais adultos, com idade superior a trs ou quatro anos, sem preferncia de raa ou de sexo. A doena evolui devido s crises de hematria, associadas poliria e disria, intercaladas por perodos de remisso, que podem perdurar semanas, meses ou mesmo anos. A fase da hematria varivel, o volume de sangue perdido inconstante, e os animais tambm podem apresentar acentuada proteinria. Em algumas situaes, a hematria enzotica bovina pode ocorrer em associao com neoplasias do trato alimentar. Os tumores do trato digestrio superior obstruem a passagem de alimentos e, no exame
Papillomaviridae
411
clnico, so observados sinais de disfagia, regurgitao, dilatao do esfago proximal massa tumoral, perda de peso e timpanismo crnico recidivante. A ocorrncia desses tumores, embora de etiologia no conrmada experimentalmente, tem sido atribuda ingesto da samambaia, com uma possvel associao etiolgica com o BPV-4. Uma porcentagem signicativa dos animais com leses do trato digestrio superior tambm apresenta leses neoplsicas na bexiga urinria. Vrias observaes sobre a ocorrncia do papilomavrus bovino e carcinomas no trato digestrio superior de bovinos, associados com sinais de hematria enzotica e com ingesto da samambaia, j foram relatadas no Brasil e em outros pases. As toxinas da samambaia foram capazes de produzir tumores em animais de laboratrio livres da infeco pelo vrus, e este, isoladamente, foi capaz de produzir neoplasias na bexiga de bezerros que no tinham acesso samambaia. Resultados de vrios experimentos conrmaram que tanto o vrus quanto a samambaia esto envolvidos na carcinognese da bexiga. O efeito clastrognico dos componentes da samambaia tem sido avaliado in vitro e in vivo. No entanto, a contribuio potencial da clastrogenicidade do papilomavrus ainda no foi esclarecida. A anlise citogentica de clulas do sangue perifrico de animais alimentados em pastos infestados com samambaia demonstra um aumento signicativo na freqncia de aberraes na estrutura dos cromossomos, quando comparados com animais em pastos no infestados. Como os linfcitos so clulas-alvo da infeco latente do papilomavrus, sugere-se que o vrus possa contribuir para a produo de anormalidades cromossmicas nessas clulas. No se conhece um tratamento efetivo para esses distrbios, porm a retirada dos animais dos pastos infestados com a planta pode propiciar uma lenta recuperao, desde que no existam leses neoplsicas em estgios avanados de evoluo. Possibilidades de imunoprolaxia contra o BPV-2 e o BPV-4 para o controle e preveno da hematria enzotica bovina e de tumores no trato digestrio superior esto sendo desenvolvidas e avaliadas. Porm, resultados conclusivos ainda no foram produzidos.
BLOCH, N. et al. Identication of papillomavirus in scrapings from bovine warts by use of the polymerase chain reaction. Veterinary Research Communication, v.21, p.63-68, 1997. BORZACCHIELLO, G. et al. Presence of bovine papillomavirus type 2 DNA and expression of the viral oncoprotein E5 in naturally occurring urinary bladder tumours in cows. The Journal of General Virology, v.84, p.2921-2926, 2003. BORZACCHIELLO, G. et al. Bovine papillomavirus E5 oncoprotein binds to the activated form of the platelet-derived growth factor beta receptor in naturally occurring bovine urinary bladder tumours. Oncogene, v.25, p.1251-1260, 2006. CAMPO, M.S. Animal models of papillomavirus pathogenesis. Virus Research, v.89, p.249-261, 2002. CAMPO, M.S. Review: bovine papillomavirus and cancer. The Veterinary Journal, v.154, p.175-188, 1997. CAMPO, M.S. Infection by bovine papillomavirus and prospects for vaccination. Trends in Microbiology, v.3, p.92-97, 1995. CAMPO, M.S. Cell transformation by animal papillomaviruses. The Journal of General Virology, v.73, p.217-222, 1992. CAMPO, M.S. et al. Latent papillomavirus infection in cattle. Research in Veterinary Science, v.56, p.151-157, 1994. CAMPO, M.S.; JARRETT, W.F. Vacination against cutaneous and mucosal papillomavirus in cattle. Ciba Foundation Symposium, v. 187, p.61-73, 1994. CAMPO, M.S. et al. Association of bovine papillomavirus yype 2 and bracken fern with bladder cancer in cattle. Cancer Research, v.52, p.6898-6904, 1992. CHOW, L.T.; BROKER, T.R. Small DNA tumor viruses. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.12, p.267-301. FRAZER, I.H. Prevention of cervical cancer through papillomavirus vaccination. Nature Reviews. Immunology, v.4, p.46-54, 2004. FREITAS, A.C. et al. Viral DNA sequences in peripheral blood and vertical transmission of the virus: a discussion about BPV-1. Brazilian Journal of Microbiology, v.34, p.76-78, 2003. FAUQUET, C.M. et al. (Eds). Virus taxonomy, VIIIth Report of the International Committee of Taxonomy of Viruses. 2.ed. San Diego, CA: Elsevier Academic Press, 2005. 1162p. GAUKROGER, J.M. et al. Interaction between bovine papillomavirus type 4 and cocarcinogens in the production of malignant tumours. The Journal of General Virology, v.74, p.2275-2280, 1993. HOPKINS, N.C. Aetiology of enzootic haematuria. The Veterinary Record, v.118, p.715-717, 1986.
412
JARRET, W.F. et al. Studies on vaccination against papillomaviruses: the immunity after infection and vaccination with bovine papillomaviruses of different types. The Veterinary Record, v.126, p.473-475, 1990. JARRETT, W.F. et al. Studies on vaccination against papillomaviruses: prophylactic and therapeutic vaccination with recombinant structural proteins. Virology, v.184, p.33-42, 1991. NICHOLLS, P.K.; STANLEY, M.A. The immunology of animal papillomaviruses. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.73, p.101-127, 2000. OGAWA, T. et al. Broad-spectrum detection of papillomaviruses in bovine teat papillomas and healthy teat skin. The Journal of General Virology, v.85, p.2191-2197, 2004. OLSON, C.; PAMUKCU, A.M.; BROBST, D.F. Papilloma-like virus from bovine urinary bladder tumors. Cancer Research, v.25, p.840-849, 1965. OLSON, C. et al. A urinary bladder tumor induced by a bovine cutaneous papilloma agent. Cancer Research, v.19, p.779-783, 1959. ONIONS, D. Papillomaviruses: progress for human and veterinary medicine. Veterinary Journal, v.154, p.171-172, 1997. OTTEN, N. et al. DNA of bovine papillomavirus type 1 and 2 in equine sarcoids: PCR detection and direct sequencing. Archives of Virology, v.132, p.121-131, 1993. STOCCO DOS SANTOS, R.C. et al. Bovine papillomavirus transmission and chromosomal aberrations: an experimental model. The Journal of General Virology, v.79, p.2127-2135, 1998.
Captulo 15
TEIFKE, J.P.; WEISS, E. Detection of bovine papillomavirus DNA in equine sarcoids using the polymerase chain reaction. Berliner und Mnchener tierrztliche Wochenschrift, v.104, p.185-187, 1991. VILLIERS, E.M. et al. Classication of papillomaviruses. Virology, v.324, p.17-27, 2004. WOSIACKI, S.R. et al. Semi-Nested-PCR for detection and typing of bovine papillomavirus type 2 in urinary bladder and whole blood from cattle with enzootic haematuria. Journal of Virological Methods, v.126, p.215-219, 2005. WOSIACKI, S.R. Bovine papillomavirus type 2 detection in the urinary bladder of cattle with chronic enzootic haematuria. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v.101, p.635-638, 2006. WOSIACKI, S.R. et al. Papilomavrus bovino tipo 2 na etiologia da hematria enzotica. Semina: cincias agrrias, v.23, p.121130, 2002. WOSIACKI, S.R. Papilomavrus bovino tipo 2 em bexiga de bovinos na hematria enzotica: deteco utilizando a reao em cadeia pela polimerase e estudo histopatolgico. 2002. 110f. Dissertao (Mestrado em Cincia Animal) - Pr-Reitoria de Pesquisa e Ps-Graduao, Universidade Estadual de Londrina, 2002. WOSIACKI, S.R. Diagnstico e aspectos moleculares do papilomavrus bovino tipo 2 em rebanhos bovinos com hematria enzotica. 2005. 117f. Tese (Doutorado em Cincia Animal) -Pr-Reitoria de Pesquisa e Ps-Graduao, Universidade Estadual de Londrina, 2005.
ADENOVIRIDAE
Mauro Pires Moraes & Paulo Renato dos Santos Costa
16
415 415 417 419 419 421
421 422 426 427 427 428 428 428 428 429
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 Replicao 5 O ciclo replicativo 6 Adenovrus de interesse veterinrio
6.1 Adenovrus canino 6.1.1 Adenovrus canino tipo 1 6.1.2 Adenovrus canino tipo 2 6.2 Adenovrus bovino 6.3 Adenovrus eqino 6.4 Adenovrus de ruminantes silvestres 6.5 Adenovrus avirios 6.5.1 Aviadenovirus 6.5.2 Siadenovirus 6.5.3 Atadenovirus
430
1 Introduo
A famlia Adenoviridae abriga um grupo de vrus icosadricos grandes, sem envelope, com genoma DNA de ta dupla linear. A denominao dessa famlia originou-se do primeiro vrus do grupo, que foi isolado a partir de explantes de glndulas adenides humanas em 1953. No ano seguinte, o primeiro adenovrus de interesse veterinrio foi isolado de casos de hepatite canina. Desde 2002, o International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) classica os membros da famlia em quatro gneros: Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus e Siadenovirus. A partir do primeiro isolado, o vrus serviu de modelo para estudos de composio e organizao estrutural dos capsdeos com simetria icosadrica. Alm disso, os adenovrus tambm foram os primeiros modelos para a descrio das interaes entre vrus e receptores celulares, em estudos de cristalograa. O conhecimento acerca da estrutura e organizao dos vrions e do genoma favoreceu a utilizao desses vrus como vetores de expresso e viabilizou a produo de vrus quimricos, em esforos para o desenvolvimento de vacinas noconvencionais, assim como para a terapia gentica. Alm disso, esses conhecimentos impulsionaram o desenvolvimento de mtodos baseados em DNA desnudo, pois foi demonstrado que o sucesso desta abordagem estava associado com a ecincia da introduo articial do genoma nas clulas hospedeiras. A exemplo do primeiro isolado, a maioria dos adenovrus est envolvida em infeces respiratrias, mas esses vrus podem tambm estar associados com infeces do trato digestivo, de clulas parenquimatosas do fgado e de clulas endoteliais, com diferentes nveis de patogenicidade em vrias espcies. Alguns membros da famlia possuem impacto na medicina veterinria. Como exemplo, pode-se citar o adenovrus canino (CAdV), que apresenta dois representantes: o CAdV-1 e o CAdV-2. O primeiro o agente causal da hepatite infecciosa canina, e o segundo est envolvido na etiologia de uma doena respiratria multicausal, conhecida como tosse dos canis. Alm destes,
os adenovrus produzem perdas importantes na avicultura. A sndrome da queda de postura, a enterite hemorrgica dos perus, a bronquite das codornas, entre outras, so exemplos de efermidades provocadas por adenovrus nas aves.
2 Classicao
Seguindo os critrios de classicao preconizados pelo ICTV, os adenovrus so agrupados de acordo com vrias caractersticas, que incluem a morfologia do vrion, estrutura e organizao do genoma, replicao, reatividade antignica e propriedades biolgicas. So reconhecidos quatro gneros na famlia Adenoviridae: Mastadenovirus (com 25 espcies, das quais 20 ocialmente aceitas e cinco em estudo), Avianadenovirus (nove espcies, seis aceitas), Atadenovirus (sete espcies, uma aceita) e Siadenovirus (duas espcies). Vrias dessas espcies apresentam isolados que podem ser diferenciados entre si em sorotipos, de acordo com a reatividade sorolgica. Uma lista das espcies j descritas em animais est apresentada na Tabela 16.1. Existe um consenso, no entanto, que essa lista provavelmente subestimada, com base no nmero de isolados j identicados em humanos. Seis espcies de adenovrus j foram descritos em humanos (adenovrus humano tipo A at F), abrangendo mais de 50 sorotipos. As caractersticas genmicas e antignicas podem ser complementares e, algumas vezes, resultam em novas classicaes e agrupamentos de vrus, inclusive em novos gneros, como o Atadenovirus e Siadenovirus. O gnero Atadenovirus, que possui como prottipo o adenovrus ovino 287 (adenovrus ovino tipo D) foi criado, agrupando tambm vrus de bovinos anteriormente classicados como Mastadenovirus e com vrus de origem aviria, como o vrus da sndrome da queda de postura (adenovrus de patos tipo A), classicado anteriormente como Aviadenovirus. Essa nova classicao baseada principalmente em diferenas na organizao genmica e na similaridade do gene que codica a protena hexon desses vrus.
416
Captulo 16
Tabela 16.1. Adenovrus associados com enfermidades em animais Vrus

Adenovrus bovino (3 espcies)
Abreviatura
BAdV-A, BAdV-B, BAdV-C
Enfermidade/hospedeiro
Infeco subclnica ou doena respiratria leve em bovinos Hepatite infecciosa canina Traqueobronquite infecciosa (tosse dos canis) em ces Infeco subclnica ou doena respiratria leve. Broncopneumonia e doena generalizada com imunodeficincia em eqinos Infeco subclnica ou doena respiratria leve em ovinos Infeco subclnica ou doena respiratria leve em sunos Infeco subclnica ou doena respiratria leve em caprinos
Prottipo Adenovrus humano C (HAdV-C)
CAdV-1 Adenovrus canino CAdV-2
Gnero Mastadenovirus
Adenovrus eqino (2 espcies) Adenovrus ovino (3 espcies) Adenovrus suno (3 espcies) Adenovrus caprino (Proposto)
EAdV-A, EAdV-B
OAdV-A, OAdV-B, OAdV-C
PAdV-A, PAdV-B, PAdV-C
GAdV-A
Prottipo Adenovrus avirio A (FAdV-A)
Gnero Aviadenovirus
Adenovrus avirio (5 espcies)
FAdV-A, FAdV-B, FAdV-C, FAdV-D, FAdV-E
Hepatite, doena respiratria em galinhas
Adenovrus de gansos
GoAdV
Isolado de fgado e intestino de gansos
Prottipo Adenovrus ovino D (OAV-287)
Gnero Atadenovirus
Adenovrus bovino (2 espcies)
BAdV-D, BAdV-E
Infeco assintomtica ou doena respiratria em bovinos Edema pulmonar, hemorragia e vasculite em veados Hepatite em patos e sndrome da queda de postura em galinhas Infeco assintomtica ou doena respiratria leve em ovinos
Adenovrus cervdeo
DeAdV
Adenovrus de patos A
DAdV-A
Adenovrus ovino D
OAV-D
Prottipo Adenovrus de perus A (TAdV-A)
Gnero Siadenovirus
Adenovrus de perus A
TAdV-A
Enterite hemorrgica em perus e pacreatite em faises
Adenoviridae
417
As propriedades sorolgicas foram as primeiras utilizadas para a classicao dos adenovrus que apresentam caractersticas peculiares. Por exemplo, alguns determinantes antignicos presentes na regio interna dos hexons determinaram a classicao em gneros. H epitopos presentes nos pentons, localizados nos vrtices do capsdeo icosadrico, que tambm denem a especicidade de gneros. A classicao em sorotipos determinada pela reatividade com anticorpos neutralizantes e tambm com anticorpos inibidores da hemaglutinao. Os epitopos envolvidos com essas propriedades esto localizados na superfcie dos hexons e bras. Uma caracterstica interessante que anticorpos contra os epitopos localizados na bra e no seu boto terminal possuem fraca atividade neutralizante. Assim, a determinao estrutural sorolgica da famlia baseada na dominncia relativa de alguns determinantes, dependendo dos testes utilizados, mais do que na sua localizao nos vrions.

Os adenovrus possuem vrions hexagonais, icosadricos, sem envelope, com dimetro apro-
ximado de 80 nm, sem considerar as bras dos pentons. Na Figura 16.1, est apresentada uma representao esquemtica dos vrions da famlia Adenoviridae. A composio dos vrions de aproximadamente 13% de DNA e 87% de protenas. Os vrions no apresentam membranas lipdicas e, por isso, so resistentes a condies ambientais e a solventes orgnicos. No entanto, a infectividade dos adenovrus pode ser inativada por desinfetantes comuns. Os vrions apresentam densidade de 1,34 g.cm-3 em cloreto de csio; so resistentes a vrios desinfetantes e podem sobreviver temperatura ambiente por vrios dias em fmites. A infectividade inativada por gua quente (50 a 60C por mais de cinco minutos) e por desinfetantes base de iodo, fenol ou hidrxido de sdio. O capsdeo constitudo por 252 capsmeros, sendo 240 hexons e 12 pentons. Os hexons (trmeros do gene II, 120 kDa) formam as superfcies dos 20 tringulos eqilteros e so associados s protenas IIIa, IX, VI e VIII. Os vrtices desses tringulos so compostos pelos pentons (protena III, 85 kDa). Em cada vrtice, h um prolongamento protico conhecido como bra (protena IV, 62 kDa). Essas projees apresentam extenso varivel entre as espcies de vrus e podem
B
Ncleo
PT V VII X DNA
Capsdeo
III II IV IIIa VIII VI IX
Fonte: A) Dra Linda Stannard;www.uct.ac.za
Figura 16.1. Estrutura dos vrions da famlia Adenoviridae. A) Microscopia eletrnica de um adenovrus. Representao esquemtica de uma partcula vrica com os seus constituintes.
418
Captulo 16
possuir entre 20 e 50 nm. Na poro terminal de cada bra, h uma pequena estrutura globular formando um boto terminal. Essa extremidade da bra responsvel pela ligao do vrion aos receptores celulares. Na regio interna do vrion, localiza-se o genoma associado com quatro protenas (V, VII, X e protena terminal). As mltiplas cpias das protenas V (48,5 kDa, 180 cpias) e VII (18,5 kDa, 1070 cpias) apresentam-se conjugadas com o DNA viral e esto envolvidas no empacotamento e compactao do genoma. Em complexos de seis cpias, as protenas VII so muito similares estruturalmente e funcionalmente aos complexos de histonas da cromatina de eucariotas. A protena V medeia as interaes entre o ncleo e o capsdeo e tambm se associa aos pentons, estando provavelmente envolvida na localizao do
genoma durante a morfognese das partculas vricas. A protena terminal (55 kDa) apresenta ligao covalente em cada uma das extremidades 5 do DNA genmico e possui funo de primer durante a replicao do genoma. O genoma viral uma molcula nica de DNA de ta dupla linear, com 36 a 44 kbp (1 kpb = 1.000 pares de bases), possuindo entre 48 e 61% de G + C. A transfeco do genoma desprovido de protenas em clulas permissivas resulta no ciclo replicativo completo, com formao e liberao de prognie viral infecciosa. Por isso dito que o genoma dos adenovrus infeccioso. O genoma codica aproximadamente 40 protenas, com genes presentes nas duas cadeias de DNA, transcritos em direes opostas (Figura 16.2). Vrios desses genes originam transcritos que so processados pelo mecanismo de splicing
Leader:
2 i
3 x y z
L5
L4 ML L3
L2 L1 IX E1B VA E1A E3 L1 (iniciais) 20 30 40 50 60 70 80 E2A E2B IV a2 E4 90 100 E3 (tardio)
10
Fonte: adaptada de Shenk (2001).
Figura 16.2. Representao grfica da organizao genmica e dos transcritos dos adenovrus. Os transcritos iniciais so designados E (early), e os transcritos tardios so denominados L (late). Cada seta representa um mRNAs diferente produzido a partir da transcrio e processamento dos transcritos primrios.
Adenoviridae
419
antes de serem exportados para o citoplasma, onde sero traduzidos. Uma mesma regio transcrita pode originar diferentes RNAs mensageiros (mRNAs), que so produzidos por clivagem e remoo de seqncias internas (introns). A organizao genmica e os transcritos primrios produzidos pela transcrio dos genes dos adenovrus esto representados na Figura 16.2. O genoma dividido em 11 regies de transcrio, baseadas na regulao temporal da expresso, sendo cinco delas iniciais (E1A, E1B, E2, E3 e E4), duas intermedirias (IX e IVa2) e uma tardia (que origina cinco mRNAs L1 a L5). Destas regies, os genes iniciais codicam protenas no-estruturais, e as tardias codicam protenas estruturais.
plica em clulas de embrio de pato, hospedeiro natural do vrus. Os vrus isolados de perus e faises podem ser cultivados em clulas de linhagem de pncreas ou em clulas linfoblastides de perus (MDCT-RP19).
A interao inicial dos vrions com a superfcie das clulas-alvo ocorre pela ligao das extremidades globulares das bras dos pentons com os receptores celulares, que so molculas de integrinas especcas. Essas integrinas so denominadas receptores de adenovrus e vrus Coxsackie (CAR) e so os receptores para os adenovrus humanos mais estudados. Existem aproximadamente 105 molculas de receptores na superfcie de cada clula. A ligao inicial aos receptores seguida por uma segunda interao, entre a base da protena penton e um co-receptor presente na membrana plasmtica, pertencente famlia das integrinas. Uma delas seria a vitronectina. A internalizao do complexo vrion/receptor ocorre por endocitose dependente de clatrina. As vesculas endocticas so transportadas em direo ao ncleo. Durante o trnsito, ocorre a reduo gradativa do pH no interior das vesculas. A reduo no pH promove alteraes na estrutura da partcula viral, a desintegrao do capsdeo e a liberao do genoma associado com protenas. H evidncias de que o transporte para o ncleo da clula mediado pelos hexons, que se associariam aos microtbulos celulares. A desintegrao completa das partculas ocorre nas proximidades dos poros nucleares, atravs dos quais o genoma, ainda associado com algumas protenas, translocado para o interior do ncleo. Entre a ligao dos vrions aos receptores at a penetrao do genoma no ncleo podem transcorrer aproximadamente duas horas. A transcrio dos genes virais realizada pela RNA polimerase II e fatores celulares, que reconhecem mltiplos promotores dos genes iniciais e intermedirios, alm de um promotor que controla a expresso dos genes tardios. Esses genes esto distribudos nas duas tas do DNA genmico do vrus (Ver Figura 16.2).
4 Replicao
Os adenovrus possuem representantes em vrias espcies de hospedeiros. A replicao do genoma desses vrus ocorre no ncleo das clulas hospedeiras e resulta na produo de corpsculos de incluso basoflicos. Em geral, a replicao in vivo associada aos sistemas respiratrio ou gastrintestinal, mas outros tecidos e clulas tambm podem ser envolvidos. A replicao dos adenovrus pode interferir ou modular a resposta imunolgica do hospedeiro, podendo resultar em infeces persistentes e oportunistas. Vrios adenovrus so capazes de produzir tumores quando inoculados experimentalmente em hamsters recm-nascidos, porm ainda no foram descritos como agentes de tumores em seus hospedeiros naturais. Os adenovrus geralmente replicam em altos ttulos em clulas primrias e linhagens celulares, independentemente da fase do ciclo celular. A replicao acompanhada por alteraes na siologia celular e produo de efeito citoptico (ecp), culminando com a lise celular, que necessria para a liberao dos vrions. As linhagens celulares utilizadas para amplicao dos adenovrus in vitro geralmente so espcie-especcas. O CAdV replica em clulas da linhagem MDCK (Madin Darby canine kidney); enquanto o adenovrus eqino amplicado em clulas primrias de rim, pulmo e ovrio de eqinos. O vrus da sndrome de queda de postura de galinhas (adenovrus de patos tipo A) re-
420
Captulo 16
Os produtos dos genes de expresso imediata (E1A) esto envolvidos no controle do ciclo celular, pela expresso de fatores de transcrio e de replicao do DNA viral, promovendo um ambiente favorvel para a replicao do vrus. Nesta regio genmica, encontram-se os genes que modulam a resposta imune inata do hospedeiro e o ciclo celular, interferindo na atividade de interleucinas, como o fator de necrose tumoral (TNF), na produo de molculas do complexo de histocompatibilidade maior tipo 1 (MHC-I) ou, ainda, no mecanismo de induo da apoptose. As interaes dos adenovrus com as clulas hospedeiras, especialmente na regulao do ciclo celular e no antagonismo da resposta imunolgica, foram tratadas com maior profundidade no captulo referente replicao dos vrus DNA (Captulo 6). Na regio E2, esto presentes os genes cujos produtos esto envolvidos na replicao do DNA viral, como as protenas de ligao s tas simples de DNA, que esto associadas aos complexos de replicao; e tambm a DNA polimerase viral. A protena precursora da protena terminal (pTP), que se encontra ligada covalentemente s extremidades do genoma viral, tambm pertence a este grupo de genes. Acredita-se, ainda, que a pTP tambm esteja associada ao processo de morfognese dos vrions. A regio E3 do genoma dos adenovrus possui genes que codicam fatores de virulncia. Um dos principais produtos um polipeptdeo de 19 kDa que se liga cadeia pesada do complexo maior de histocompatibilidade I (MHC-I), provocando a sua reteno em compartimentos intracelulares e reduzindo a sua expresso na superfcie celular. Como conseqncia, ocorre uma reduo na capacidade dos linfcitos T citotxicos reconhecerem e destrurem clulas infectadas pelos adenovrus. Outro produto dessa regio (14,5 kDa) inibe a cascata de eventos ativados pelo fator de necrose tumoral (TNF), que promove a lise de clulas infectadas. Finalmente, os produtos da regio E4 esto envolvidos na regulao da replicao viral e do ciclo celular. Aps a expresso dos genes iniciais, a prxima fase do ciclo replicativo a replicao do
genoma. Esse processo ocorre com o acmulo da pTP que se liga s extremidades 5 das cadeias de DNA e serve como iniciador da replicao a partir das regies terminais. Essa protena possui um resduo oxidrila (OH) que serve de substrato para a DNA polimerase viral iniciar a polimerizao da cadeia de deoxiribonucleotdeos (dNTPs), formando a nova cadeia de DNA. A replicao das cadeias inicia nas extremidades e ocorre de forma contnua, ao contrrio da replicao semidescontnua do DNA celular, e ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, apenas uma das cadeias replicada, originando uma molcula de ta dupla. A cadeia restante circulariza, pelo pareamento das regies repetidas localizadas prximo s extremidades, formando uma estrutura semelhante a um cabo de frigideira (panhandle). A DNA polimerase reconhece a extremidade 5 e inicia a sntese da cadeia complementar. Um esquema mostrando as etapas da replicao do genoma dos adenovrus est apresentado na Figura 16.3. Aps a replicao do DNA viral e produo dos transcritos dos genes iniciais e intermedirios, a expresso gnica muda para a produo dos transcritos tardios. O controle dessa mudana complexo, e parece ser dependente do acmulo de fatores de transcrio, produtos dos genes da regio E1A e pela utilizao preferencial da ta que codica os genes tardios. O nico promotor dos transcritos tardios muito eciente e, por essa caracterstica, utilizado em vetores de expresso. Ocorre um grande acmulo de protenas estruturais e, nesta fase, aproximadamente 20 horas aps o incio do ciclo viral, ocorre a inibio da sntese de protenas celulares. Os transcritos tardios so exportados para o citoplasma e, aps a traduo nos ribossomos, as protenas so transportadas at o ncleo, onde participam da montagem dos vrions. Acredita-se que o genoma associado com protenas ingresse j em capsdeos pr-formados. Conseqentemente, possvel ocorrer a formao de partculas incompletas, sem a presena do genoma. O acmulo de protenas virais e a condensao da cromatina celular formam os corpsculos de incluso intranucleares que so observados nas clulas infectadas.
Adenoviridae
421
Primeira etapa
3 5 Tp .pTp
-OH
Segunda etapa
Tp 5 3
OH
.pTp 3
OH
5
-OH
Lineariza
3 5
3 5
5 3
+
5 3
Circulariza
5 3 3 5
3 5
Figura 16.3. Ilustrao esquemtica da replicao do genoma dos adenovrus. Na primeira etapa, apenas uma das cadeias replicada, de maneira contnua, a partir de uma das extremidades. A cadeia no-replicada circulariza para a formao de uma nova origem de replicao. A replicao desta cadeia inicia na extremidade e prossegue ao longo da cadeia, que, em seguida, assume a topologia linear. Ao final das duas etapas, as duas cadeias de DNA esto replicadas.
Os vrions recm-formados se acumulam no ncleo celular e a sua liberao depende da morte e lise celular. A morte celular ocorre pela falncia de mltiplas funes, principalmente pela interferncia do vrus com a expresso de protenas celulares, que ocorre na fase nal do ciclo replicativo. O nmero de vrions infecciosos produzidos por clula infectada varia para os diferentes adenovrus. Estima-se que sejam produzidas entre 10 e 2.300 partculas totais para cada vrion infeccioso. O ciclo replicativo do adenovrus est representado esquematicamente na Figura 16.4.
mitantes e so considerados estritamente espcie-especcos. Alguns adenovrus, porm, so oportunistas e causam infeces em associao com outros agentes, ou servindo como fatores predisponentes para infeces secundrias virais ou bacterianas. Vrios adenovrus possuem importncia como patgenos de animais.
6.1 Adenovrus canino

Dois tipos de adenovrus canino j foram descritos em ces: os adenovrus canino tipos 1 e 2 (CAdV-1 e CAdV-2), sendo considerados entre os principais adenovrus de animais. O CAdV-1 o agente etiolgico da hepatite infecciosa canina (HIC). A infeco pelo CAdV-2 caracterizada por sinais respiratrios de baixa severidade e
6 Adenovrus de interesse veterinrio

Os adenovrus geralmente causam infeces inaparentes ou com sinais clnicos leves, autoli-
422
Captulo 16
1 Citoplasma 2
H+ H+ H+ H+
6 9
4 5 7
11
Egresso por lise celular
10 Ncleo
Figura 16.4. Representao esquemtica do ciclo de replicao dos adenovrus. O vrion se liga a receptores especficos na membrana plasmtica (1) e internalizado por endocitose mediada por clatrina (2). A acidificao progressiva do interior do endossoma (3) leva desestruturao da partcula vrica e liberao do genoma prximo aos poros nucleares (4). A translocao do genoma para o ncleo seguida da transcrio dos genes iniciais (5), cujos mRNAs so traduzidos nos ribossomos (6), resultando em protenas que atuam na replicao do genoma (7). Aps a replicao do genoma, so transcritos os genes tardios (8), cujos mRNAs so traduzidos nas protenas estruturais (9), que penetram no ncleo e, juntamente com as cpias do DNA genmico recm-produzidas, participam da morfognese das partculas vricas (10). A prognie viral liberada por lise celular (11).
este vrus est associado com outros agentes na etiologia da traqueobronquite infecciosa canina (TIC).
6.1.1 Adenovrus canino tipo 1

A hepatite infecciosa canina (HIC) apresenta ocorrncia rara em regies onde a vacinao realizada regularmente. Entretanto, em populaes humanas com condies socioeconmicas baixas, a imunizao dos animais de estimao no uma prtica freqente, o que concorre para uma freqncia maior da infeco. A maioria das infeces pelo adenovrus canino so inaparentes
ou acompanhadas de sinais respiratrios leves. A HIC acomete principalmente animais no-vacinados com idade inferior a seis meses. A doena se apresenta geralmente de forma aguda, e os animais que sobrevivem a essa fase apresentam um prognstico favorvel. A HIC causada pelo adenovrus canino tipo 1 (CAdV-1), que pertence ao gnero Mastadenovirus. Esse vrus antigenicamente relacionado com o CAdV-2, agente associado com a traqueobronquite infecciosa ou tosse dos canis. A extenso da reatividade antignica cruzada pode ser evidenciada pela utilizao do CAdV-2 em formulaes de vacinas para ambas as enfer-
Adenoviridae
423
midades. Essa relao antignica tambm pode interferir no diagnstico, e a diferenciao entre estes dois agentes requer a utilizao de anticorpos monoclonais ou tcnicas moleculares.
6.1.1.1 Epidemiologia
O vrus excretado nas secrees e excrees dos ces infectados. A excreo pela urina pode persistir por mais de seis meses aps a recuperao clnica, e estes animais so a principal fonte de disseminao do CAdV-1. Os animais susceptveis adquirem a infeco pelo contato direto, pela via oronasal ou conjuntival; ou indireto, a partir de fmites contaminados. Alm dos ces domsticos, as raposas e outros candeos silvestres so susceptveis infeco pelo CAdV-1, e so considerados potenciais reservatrios do vrus. A infeco pelo CAdV-1 tem sido descrita em vrios pases europeus, nos EUA e tambm no Brasil. Acredita-se que esse agente apresente distribuio mundial. No entanto, a utilizao massiva de vacinas contra o CAdV a partir da dcada de 1960, aliada com proteo cruzada por anticorpos decorrentes da infeco natural pelo CAdV-2, tm reduzido a ocorrncia de casos da HIC em populaes caninas de vrias partes do mundo. Estudos prvios ao uso extensivo de vacinas em vrios pases (Alemanha, pases escandinavos, EUA e Japo) demonstraram que a prevalncia de anticorpos contra o CAdV variava entre 30 e 60% entre os ces testados. Um estudo sorolgico realizado, em 2006, com ces sem histrico de vacinao em Santa Maria, Rio Grande do Sul, revelou 43% (353/817) de amostras positivas.
6.1.1.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia

Aps a exposio pela via oronasal ou conjuntival, o vrus replica inicialmente nas tonsilas e nas placas de Peyer, disseminando-se para os linfonodos regionais e, eventualmente, atinge a circulao sangnea. A fase de viremia ocorre entre o quarto e o oitavo dia aps a infeco e resulta na disseminao do vrus para vrios r-
gos, como o fgado, os rins, o bao e os pulmes. As clulas parenquimatosas e as clulas endoteliais do organismo so os alvos principais para a replicao do CAdV-1. No fgado, so observadas congesto e necrose de coagulao multifocal, com o envolvimento dos hepatcitos da zona trs do cino de Rappaport (regio centrolobular) ou necrose lobular generalizada em casos graves. A extenso e a gravidade das leses hepticas esto relacionadas com a imunidade humoral. Ces experimentalmente infectados, que possuem ttulos baixos de anticorpos (<4), freqentemente desenvolvem insucincia heptica fulminante, coagulao intravascular disseminada (CID) e vo a bito (Figura 16.5). Ces com ttulos altos de anticorpos neutralizantes desenvolvem uma infeco clinicamente leve ou inaparente, e podem erradicar o vrus do sangue e do fgado na semana seguinte infeco. Foi demonstrado que os ces com ttulos moderados de anticorpos neutralizantes (entre 16 e 500) podem desenvolver hepatite crnica com inltrado mononuclear periportal e brose progressiva. Nesse mesmo estudo, os animais sobreviventes foram tratados com interferon humano (IFN), resultando na erradicao do vrus do organismo e na resoluo das leses hepticas. Nas infeces crnicas, o CAdV-1 pode ser identicado somente nos primeiros dias aps infeco, o que diculta o diagnstico virolgico em fases avanadas. Um estudo retrospectivo por imunohistoqumica e PCR em amostras de fgado de 45 ces com hepatite crnica e cirrose no demonstrou a presena do CAdV-1 ou de produtos virais, questionando a participao do agente na etiopatogenia das hepatites crnicas em ces. Ces naturalmente infectados e tambm ces que recebem vacina atenuada (mais raramente) com o CAdV-1 podem desenvolver leses oculares. Na fase de viremia, o vrus atinge o humor aquoso e replica no endotlio do trato uveal e da crnea, causando uvete anterior e edema de crnea. medida que os nveis de anticorpos neutralizantes aumentam, ocorre a deposio de imunocomplexos nos endotlios, ativao do sistema complemento e migrao de clulas inamatrias, resultando em extravasamento de lquido para o estroma da crnea.
424
Captulo 16
Na fase de viremia, o vrus pode se localizar e replicar nas clulas do endotlio glomerular e no epitlio dos tbulos renais. A leso inicial dos glomrulos causada pela deposio de complexos imunes (complexos antgeno-anticorpos), produzindo glomerulonefrite. Os ces jovens e no-vacinados so mais susceptveis doena. Entretanto, ces de qualquer idade, raa ou sexo podem ser infectados, caso no tenham sido previamente vacinados ou expostos ao agente. A doena pode se manifestar de forma superaguda ou aguda. A hepatite crnica pode ocorrer aps a infeco inicial pelo CAdV1, sem necessariamente ocorrer a manuteno do vrus no fgado. Os ces com a doena superaguda podem morrer dentro de poucas horas aps o surgimento dos sinais clnicos. Os sinais nesta fase incluem apatia, anorexia, palidez das mucosas e petquias, convulses e coma. Sinais neurolgicos
podem ocorrer e esto associados com hemorragia cerebral. A forma aguda da doena ocorre com maior freqncia. Essa forma caracterizada por apatia, anorexia, hipertermia, linfoadenopatia, taquicardia, taquipnia, tosse, dor abdominal, hepatomegalia, vmitos, diarria, edema subcutneo e ditese hemorrgica. A ictercia no comum na fase inicial da infeco, porm pode ser pronunciada em ces que sobrevivem hepatite aguda. A infeco pelo CAdV-1 pode produzir encefalopatia heptica ou encefalite no-supurativa. A encefalopatia heptica compreende as alteraes neurolgicas causadas por toxinas de origem gastrintestinal (p. ex.: amnia), que no so metabolisadas adequadamente pelo fgado comprometido. A encefalite no-supurativa mais rara e geralmente ocorre aps a infeco do sistema nervoso central (SNC). Esta forma manifesta-se clinicamente por estupor, ataxia, convulses e coma.
Exposio ao vrus
Tonsilas e linfonodos regionais
Sangue (viremia)
Olho
Fgado Ttulo de anticorpos

Baixo Alto
Rins
Endotlios dos demais rgos
Dias
Endotlio
Imunocomplexos Edema de crnea uvete
Hepatite aguda
Infeco Imunocomplexos inaparente Glomerulonefrite
Necrose centrolobular Complicaes oculares bito ou recuperao Hepatite crnica Nefrite intersticial
Coagulao intravascular disseminada (CID), Falncia mltipla de rgos bito
Fonte: adaptada de Greene (1998).
Figura 16.5. Achados clnicos e laboratoriais em casos de hepatite infecciosa canina. As barras horizontais correspondem ocorrncia cronolgica e durao dos respectivos achados clnicos e laboratoriais.
Adenoviridae
425
A uvete anterior e o edema de crnea, tambm conhecidas como olho azul, podem ser as nicas alteraes clnicas observadas em ces com infeces inaparentes (Figura 16.5). O edema de crnea pode ser acompanhado por dor ocular, blefaroespasmo e fotofobia. As leses oculares geralmente so brandas, com resoluo espontnea aps duas a trs semanas. Em casos mais severos, podem ocorrer glaucoma e/ou lcera de crnea. O surgimento das alteraes oculares so um indicativo de que o animal apresenta resposta imunolgica contra o vrus, e pode ser considerado um indicativo de bom prognstico. Essas alteraes ocorrem pela deposio de complexos imunes no endotlio vascular do corpo ciliar. Corpsculos de incluso podem ser observados nos tecidos-alvo de replicao viral. As incluses no ncleo dos hepatcitos so estruturas arredondadas, escuras, circundadas por um halo claro, resultante da migrao da cromatina e do nuclolo para a periferia nuclear. As incluses tambm podem ser encontradas no encfalo de ces que morrem com sinais de encefalite e nas clulas do epitlio tubular renal de ces com nefrite por deposio de complexos imunes.
Os ces com HIC podem apresentar vrias alteraes na necropsia. Os linfonodos podem estar edemaciados e hemorrgicos. Na cavidade abdominal, pode-se observar lquido de colorao clara ou avermelhada. Petquias ou equimoses podem ser observadas nas serosas. O fgado geralmente apresenta-se aumentado de volume, escuro, com exsudato brinoso depositado sobre a superfcie. A ictercia no observada com freqncia em ces que morrem na fase aguda da doena.
6.1.1.3 Diagnstico
Os achados clnicos e de patologia clnica no so patognomnicos para a hepatite infecciosa canina. Os achados hematolgicos iniciais so de leucopenia, neutropenia e linfopenia, pela infeco dos linfonodos e da medula ssea. Durante a fase de recuperao, geralmente ocorrem neutrolia e linfocitose (Figura 16.6). Trombocitopenia com ou sem alterao da funo plaquetria ocorrem freqentemente.
Pirexia Leucopenia Linfocitose Neurotrofilia ALT FA Coagulopatia Proteinria
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias a partir do incio da infeco
Fonte: adaptada de Greene (1998).
Figura 16.6. Patogenia da hepatite infecciosa canina em ordem cronolgica.
426
Captulo 16
Os nveis das enzimas hepticas e de bilirrubina podem estar elevados, dependendo do grau da necrose do parnquima heptico. Tambm podem ocorrer proteinria e bilirrubinria (Figura 16.6). Na prtica clnica, os achados da anamnese dos exames clnicos e laboratoriais podem ser indicativos da enfermidade. Entretanto, o diagnstico denitivo s pode ser elaborado mediante o isolamento do vrus, a deteco de cidos nuclicos ou de antgenos virais ou, ainda, pela demonstrao dos corpsculos de incluso intranucleares. Dentre as tcnicas de diagnstico utilizadas para a conrmao da infeco pelo CAdV-1 incluem-se o isolamento viral a partir de secreo nasal, urina, sangue e fezes. Aps a necropsia, pode-se isolar o vrus dos rins, bao, pulmo, linfonodos e do encfalo. O isolamento do vrus do fgado dicultado pela interferncia de enzimas hepticas, como a arginase, que inibe a replicao do vrus nas clulas de cultivo. O CAdV replica em clulas de origem canina, e a linhagem celular mais utilizada a MDCK (Madin-Darby canine kidney). Aps o isolamento, deve-se identicar o vrus por imunouorescncia (IFA), imunoperoxidase (IPX) ou PCR. Essas tcnicas podem ser realizadas diretamente nas amostras suspeitas, com a possibilidade de diferenciao entre os dois tipos de adenovrus caninos. A deteco de anticorpos pode ser realizada por testes de ELISA, soroneutralizao (SN) e inibio da hemaglutinao (HI), uma vez que o CAdV aglutina eritrcitos de galinha, de perus, de cobaias e de humanos. No possvel diferenciar-se os anticorpos contra o CAdV-1 daqueles contra o CAdV-2.
e contm antgenos de outros agentes virais e bacterianos. O desenvolvimento de leses oculares em ces vacinados com cepas atenuadas de CAdV-1 levou troca desse vrus pelo CAdV-2 nas formulaes das vacinas multivalentes. O protocolo de vacinao recomendado consta de duas ou mais aplicaes com intervalos de trs a quatro semanas. A primeira aplicao deve ser realizada entre a sexta e a dcima semana de vida dos lhotes.
6.1.2 Adenovrus canino tipo 2

A traqueobronquite infecciosa canina, ou tosse dos canis, um enfermidade multifatorial em que um dos agentes envolvidos o CAdV2. Alm deste, j foram relatados os seguintes agentes associados com a enfermidade: Bordetella brochisseptica, parainuenzavrus canino (CPIV), reovrus canino tipos 1, 2 e 3, Mycoplasmas spp e Ureaplasmas spp. No entanto, os agentes mais freqentemente isolados de casos da doena so o CPIV e a Bordetella bronchisseptica. Alguns fatores, como produtos de limpeza base de formol, poeiras, alteraes bruscas de temperatura e aglomerao de ces tambm podem favorecer o desenvolvimento da doena. A infeco resulta em leso do epitlio respiratrio, inamao aguda e perda da funo dos clios das vias areas. A transmisso do CAdV-2 ocorre por aerossis e freqente em locais que abrigam ces (exposies, abrigos, lojas, hospitais veterinrios e instalaes de pesquisa). O agente tambm pode ser transmitido por contato direto ou indireto por fmites (gaiolas, comedouros, bebedouros, funcionrios entre outros). O perodo de incubao varia entre cinco e sete dias, com extremos de trs e dez dias. Os sinais clnicos podem variar desde sinais respiratrios leves at doena respiratria severa. O principal sinal observado uma tosse seca e intermitente, de aparecimento sbito, podendo ser confundida com obstrues esofgicas. Pode-se observar ainda tonsilite, laringite, faringite e aumento das secrees nasal e ocular. Casos graves podem ocorrer aps infeces bacterianas secundrias, com o desenvolvimento de broncopneumonia, anorexia, tosse produtiva, febre e descarga culo-nasal mucopurulenta.
6.1.1.4 Controle e prolaxia

Ao contrrio de algumas hepatites virais em humanos, a HIC no possui nenhum tratamento especco. Portanto, o tratamento de casos suspeitos ou conrmados tipicamente de suporte. Atualmente existem, no mercado brasileiro, vacinas com vrus vivo modicado, contendo o CAdV-2, que conferem imunidade cruzada contra o CAdV-1. Essas vacinas so multivalentes
Adenoviridae
427
As tcnicas de diagnstico da infeco pelo CAdV-2 so as mesmas recomendadas para o CAdV-1. Nesses casos, pode-se utilizar como material o lavado laringotraqueal ou amostras de pulmo. O controle da enfermidade baseado no uso de vacinas multivalentes, cuja primovacinao deve ser realizada entre a sexta e dcima semanas de vida. Existem dois tipos de vacina contra a traqueobronquite infecciosa; uma de aplicao intranasal e outra injetvel (IM ou SC). As duas contm antgenos do CAdV-2 e do CPIV, alm de antgenos bacterianos (Bordetella bronchiseptica). A vacina intranasal considerada a mais efetiva, pois induz imunidade local (IgA). As vacinas no so capazes de prevenir a infeco, e mesmo os ces vacinados podem apresentar sinais clnicos leves ou infeco subclnica, podendo transmitir os agentes para outros ces. Outras recomendaes para o combate enfermidade incluem o isolamento dos animais afetados e o controle dos fatores ambientais mencionados.
cas sorolgicas utilizadas so a SN, a IDGA, HI e xao do complemento (FC). Na Europa, uma vacina contendo o BAdV-1, o BAdV-3 e o BAdV4 tem sido utilizada de forma limitada para o controle da enfermidade. O BAdV-3 tem sido extensivamente utilizado como vetor para vacinas recombinantes.
6.3 Adenovrus eqino

As infeces pelo adenovrus eqino tipo 1 (EAdV-1) so usualmente inaparentes ou acompanhadas por sinais respiratrios leves. A transmisso ocorre por contato direto, principalmente pelas vias oral e nasofarngea. Estudos sorolgicos indicam que a prevalncia da infeco varia entre 60 e 75% entre diferentes raas, sendo de 90% em animais da raa rabe. Isso demonstra a ampla disseminao do agente nos rebanhos eqinos. Os cavalos da raa rabe que apresentam imunodecincia primria severa uma doena autossomal que cursa com ausncia de linfcitos T e B funcionais apresentam uma maior susceptibilidade ao EAdV-1, principalmente aps o trmino da imunidade passiva. Animais com idade inferior a trs meses apresentam infeco generalizada aguda e fatal. Nesses casos, a morbidade da doena varia entre 10 e 15%, e a letalidade pode chegar a 100%. As leses podem ser encontradas em vrios rgos, como o pncreas, glndulas salivares, epitlio intestinal, renal, bexiga e clulas do trato respiratrio. A patogenia e a patologia das infeces pelo EAdV-1 so pouco conhecidas, pois em animais imunocompetentes essas infeces so geralmente autolimitantes. Alteraes macroscpicas e microscpicas podem ser observadas quase exclusivamente nos eqinos da raa rabe que morrem como resultado da infeco. No sistema respiratrio, observa-se bronquiolite, atelectasia pulmonar e pneumonia. Alteraes microscpicas incluem hiperplasia, corpsculos de incluso e necrose de clulas epiteliais do trato respiratrio e do epitlio de transio da pelve renal, ureter, bexiga urinria e uretra. O diagnstico da infeco pode ser realizado por isolamento viral em clulas de origem eqi-
6.2 Adenovrus bovino

O adenovrus bovino (BAdV) pode ser classicado em dez tipos e esses vrus esto geralmente associados com conjuntivite, pneumonia, enterite e/ou poliartrite. No entanto, alguns tipos tm sido isolados de bovinos sem sinais clnicos. Estudos sorolgicos demonstram que a infeco pelos BAdVs apresenta distribuio mundial. O adenovrus bovino tipo 3 (BAdV-3) considerado um importante patgeno respiratrio de bovinos jovens. Os sinais clnicos da infeco aguda incluem hipertermia, diculdade respiratria e descarga nasal e ocular. As leses so encontradas com maior freqncia nos pulmes, com reas de consolidao, colapso e ensema. Na microscopia, observa-se bronquiolite proliferativa, necrose e ocluso dos brnquios, alm de colapso dos alvolos. Corpsculos de incluso so encontrados nos tecidos pulmonares e das vias areas. O diagnstico da infeco pode ser realizado por isolamento do vrus ou por sorologia. Amostras de fezes e secrees oculares podem ser utilizadas para o isolamento viral. As tcni-
428
Captulo 16
na, a partir de secrees nasais ou de fragmentos de tecidos do sistema respiratrio. Tcnicas de deteco do DNA viral (PCR, hibrizao in situ, hibridizao) e de antgenos virais (ELISA e IFA) tambm podem ser realizadas em amostras de tecido. Testes sorolgicos pareados, como a SN e HI, tambm podem ser utilizados para o diagnstico da infeco. No h descries de programas de controle para esse agente, pois a maioria das infeces inaparente e autolimitante.
6.4 Adenovrus de ruminantes silvestres

(Deer adenovirus ou black tail deer adenovirus)
Alguns adenovrus tambm tm surgido como vrus emergentes. Em uma epidemia em 1993, um desses vrus se disseminou entre cervdeos (mule deer; Odocoileus hemionus) no estado da Califrnia, EUA. A infeco foi caracterizada por eroses no epitlio respiratrio e intestinal, hemorragias e abscessos no intestino. Histologicamente, foi observada vasculite sistmica e presena de corpsculos de incluso intranucleares. O diagnstico laboratorial foi baseado na deteco de antgenos virais nos tecidos por IFA e pela deteco do vrus por microscopia eletrnica.
6.5 Adenovrus avirios

Vrios adenovrus infectam aves, produzindo doenas como a sndrome da queda de postura, bronquite, imunossupresso, artrite e pancreatite. Dentre os adenovrus avirios existem representantes dos gneros Aviadenovirus, Siadenovirus e Atadenovirus, alm de referncias que classicam os Aviadenovirus em sorogrupos I, II e III.
Dentre as infeces respiratrias por adenovrus em aves, destaca-se a bronquite das codornas, produzida pelo adenovrus avirio A (Fowl adenovirus A; FAdV-A). A infeco de codornas jovens pelo FAdV-A pode resultar em mortalidade de 100%. No entanto, as taxas de mortalidade em aves com mais de quatro semanas de idade so reduzidas para menos de 25%. A infeco tambm pode produzir enterite e diarria. Os sinais clnicos so mais freqentes nas codornas de cabelo branco (Colinus virgianianus) e nas codornas japonesas (Coturnix coturnix japonica). Os efeitos so devastadores e podem inviabilizar a criao aps a ocorrncia de surtos. As aves que se recuperam da infeco desenvolvem imunidade duradoura. O controle da enfermidade baseiase em medidas preventivas, destinadas a evitar a introduo do vrus na criao, como a quarentena de aves a serem introduzidas e desinfeco das instalaes. O diagnstico pode ser realizado pelo isolamento do vrus do trato respiratrio e do intestino de aves durante a infeco aguda. Cinco adenovrus avirios tm sido associados com surtos de doena em frangos (FAdV tipos A, B, C, D e E). Essas epidemias se caracterizam por mortalidade elevada, podendo atingir at 30%. O curso da doena de trs a quatro dias e caracteriza-se por hepatomegalia e hemorragias. A hepatite pode ser demonstrada pela presena de corpsculos de incluso intranucleares eosinoflicos e material granular e brilar. A infeco pelos adenovrus avirios A ou B (Fowl adenovirus B; FAdV-B) pode ocorrer concomitantemente com a infeco pelo birnavrus ou pelo circovrus.
6.5.2 Siadenovirus
Apenas uma espcie de siadenovirus tem sido associada com enfermidade em aves, o adenovrus de perus A (Turkey adenovirus A; TAdVA). Essa espcie de vrus possui trs membros que infectam aves: o adenovrus de perus tipo 3 (Turkey adenovirus 3; TAdV-3), o adenovrus de faises (Pheasant adenovirus 1; PAdV-1) e o vrus da enterite hemorrgica dos perus (Turkey haemorrhagic enteritis virus; THEV). Esses vrus esto
6.5.1 Aviadenovirus
A infeco de aves pelos aviadenovirus cursa principalmente com manifestaes respiratrias e digestivas. A etiopatogenia dessas doenas pode estar relacionada com infeces concomitantes com outros vrus, como o birnavrus (doena de Gumboro) ou o circovrus (vrus da anemia infecciosa).
Adenoviridae
429
associados com trs sndromes distintas: a esplenomegalia dos frangos de corte (TAdV-3), a doena do bao marmreo dos faises (PAdV-1) e a enterite hemorrgica dos perus (THEV). Em faises, a doena do bao marmreo acomete aves com 12 a 32 semanas. Em frangos, a esplenomegalia geralmente se desenvolve em aves com mais idade. A enterite hemorrgica acontece em perus com idade superior a quatro semanas, com maior freqncia entre as sete e nove semanas. Aparentemente, as aves mais jovens so mais resistentes. Os sinais comuns s infeces por esses trs agentes incluem depresso, diarria hemorrgica e morte, geralmente uma semana aps a infeco. Existem evidncias de imunossupresso. O curso da doena em perus pode ser de 10 dias, apresentando-se de forma aguda ou superaguda. A mortalidade pode atingir 60% em perus; 20% em faises e at 10% em frangos, dependendo do isolado do vrus. A principal forma de transmisso desses vrus a horizontal, pela via fecal-oral, no existindo evidncias de transmisso vertical. As leses no bao dos faises so consideradas patognomnicas, com hiperplasia retculoendotelial e a presena de corpsculos de incluso intranucleares nas clulas. Esplenomegalia, edema pulmonar e congesto com contedo hemorrgico nos intestinos podem ser observados na necropsia. Os corpsculos de incluso podem ser detectados tambm em linfcitos B e em clulas mononucleares. O diagnstico da infeco pode ser realizado pelo isolamento dos TAdV-A aps a inoculao de material suspeito em clulas linfoblastides ou por inoculao de perus com cinco a dez semanas de idade (para o THEV). Antgenos virais podem ser detectados por IFA no bao, no intestino e em rgos linfides. As tcnicas de ELISA e IDGA podem ser utilizadas para deteco de antgenos em macerados de tecidos. A tcnica de PCR tem sido descrita para a deteco do genoma viral em amostras de tecidos. A sorologia pareada pode tambm ser empregada, podendo ser utilizadas as tcnicas de HI ou SN. O controle baseado principalmente na vacinao. Existe uma vacina atenuada disponvel para faises e perus. Essa vacina fornecida na
gua de bebida e deve ser administrada em aves com quatro a cinco semanas de idade, pela possibilidade de interferncia de anticorpos adquiridos passivamente.
6.5.3 Atadenovirus
A infeco mais importante por adenovrus em frangos a causada pelo adenovrus de patos A (Duck adenovirus A, DAdV-A). Alm de frangos, esse vrus produz infeces em patos e gansos. A doena causada pelo DAdV-A conhecida como sndrome da queda da postura (EDS, egg drop syndrome) ou EDS-76, em referncia ao ano do primeiro diagnstico realizado na Irlanda do Norte e Holanda, em 1976. Nesse mesmo ano, a doena foi descrita em aves reprodutoras do Rio Grande do Sul. As aves afetadas apresentaram queda de postura aps a aplicao de vacinas contra a doena de Marek, importadas, e que haviam sido produzidas em embries de pato. Atualmente, a infeco encontra-se disseminada mundialmente. A disseminao ocorreu principalmente por transmisso vertical a partir de reprodutoras infectadas e/ou pela utilizao de vacinas contaminadas. Na Amrica do Norte, onde no houve a utilizao de vacinas contaminadas, o impacto econmico foi menor. No obstante, neste continente, o vrus j foi isolado de patos e gansos selvagens. Os vrus isolados de pintos e patos da Europa apresentam maior virulncia se comparados com aqueles isolados de patos nos EUA. Tem sido observada uma associao da doena com matrizes de ovos marrons em comparao com matrizes poedeiras de ovos brancos, e o primeiro sinal observado a despigmentao dos ovos. A maioria dos pases desenvolvidos conseguiu a erradicao do vrus de criaes comerciais de aves reprodutoras. A principal forma de transmisso do DAdVA a vertical, e a fmea geralmente permanece soronegativa at o incio da postura. A transmisso horizontal, pela via orofecal, tambm pode ocorrer, porm a disseminao do vrus lenta. As aves positivas no transmitem o vrus aps a 45 semana de idade. A transmisso pode ocorrer entre galinhas, entre patos e entre gansos por
430
Captulo 16
contato direto ou por contato indireto, por meio de fmites contaminados. A replicao viral ocorre nos tecidos linfides, em um perodo de trs a quatro dias aps a infeco. Aos sete dias, o vrus pode ser detectado na glndula da casca e no oviduto. O vrus no replica na mucosa intestinal, portanto, as partculas virais encontradas nas fezes provavelmente so provenientes do oviduto. As leses ocorrem principalmente nas aves infectadas pela forma vertical, uma vez que a infeco natural de animais adultos limitada mucosa oral. Nesses casos, porm, pode tambm ocorrer viremia. As leses macroscpias incluem a atroa do oviduto, perda da funo ovariana e edema uterino. Raramente observa-se esplenomegalia, acidez do ovrio e presena de vulos na cavidade abdominal. Microscopicamente, observam-se corpsculos de incluso e necrose em clulas epiteliais da glndula da casca e do oviduto e inltrao de clulas inamatrias. Esses corpsculos so considerados achados patognomnicos da EDS. As patologias produzidas pelo vrus determinam a queda de postura de 10 a 30%, por seis a oito semanas. Tambm ocorre despigmentao da casca dos ovos, alm de postura de ovos com casca frgil ou sem casca. Na fase de crescimento das aves, pode-se observar diarria entre a 15 e 25 semanas de idade. Formas endmicas da infeco, produzidas por cepas pouco virulentas, podem se resumir em queda discreta da postura, que pode passar despercebida. O diagnstico pode ser realizado pelo isolamento do vrus em embries e broblastos de patos ou de gansos. Clulas de fgado de pintos so mais sensveis do que as clulas de origem renal para o isolamento. Fibroblastos de pinto ou ovos embrionados no so indicados para a amplicao do vrus. A presena do vrus pode ser detectada por hemaglutinao, utilizando-se eritrcitos de aves. Dentre os testes sorolgicos que podem ser utilizados esto a HI, ELISA, SN, IDGA e imunouorescncia indireta (IFI). As tcnicas de HI e SN possuem especicidade adequada, pois no detectam anticorpos contra outros adenovrus. Alguns animais infectados pela via vertical no
desenvolvem anticorpos at o incio da fase reprodutiva. Portanto, aves positivas para o vrus podem ser soronegativas; e a deteco de anticorpos deve ser realizada principalmente aps o pico da postura. A eliminao de matrizes positivas o mtodo denitivo para a erradicao da infeco das criaes. Pode-se tambm recorrer a mtodos mais conservadores, como a incubao somente de ovos de reprodutoras com idade superior a 45 semanas. A vacinao de lotes realizada com vacina inativada (adjuvante oleoso) e deve ser realizada antes da 18 semana de idade. Essa doena tem sido eliminada em alguns pases mediante a preveno do contato de frangos com aves aquticas, pela desinfeco regular dos equipamentos e pela clorao da gua de bebida.
BERCHIERI JR, A.; MACARI, M. Doenas das aves. Campinas: FACTA, 2000. 800p. BIRCHARD, S.J.; SHERDING, R.G. Manual Saunders: clnica de pequenos animais. So Paulo: Roca, 1998. 1592p. CAUDELL, D. et al. Diagnosis of infectious canine hepatitis virus (CAV-1) infection in puppies with encephalopathy. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.17, p.58-61, 2005. CENTER, S.A. Acute hepatic injury: hepatic necrosis and fulminant hepatic failure. In: GUILFORD, W.G. et al. Small animal gastroenterology. 3.ed. Philadelphia, PA: Saunders, 1996. p.654-704. CENTER, S.A.; HORNBUCKLE, W.E; HOSKINS, J.D. O fgado e o pncreas. In: HOSKINS, J.D. (ed). Pediatria veterinria. So Paulo: Manole, 1993. p.223-270. CHOUINARD, L. et al. Use of polymerase chain reaction and immunohistochemistry for detection of canine adenovirus type 1 in formalin-xed, parafn-embedded liver of dogs with chronic hepatitis or cirrhosis. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v.10, p.320-325, 1998. CORNELIUS, L.M. Interpreting increased liver enzyme activity in dogs. Veterinary Medicine, v.92, p.876-881, 1997. FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. GOCKE, D.J.; MORRIS, T.Q.; BRADLEY, S.E. Chronic hepatitis in a dog: the role of immune factors. Journal of the American Veterinary Medicine Association, n.156, p.1700-1705, 1970.
Adenoviridae
431
SNCHEZ-CORDN, P.J. et al. Glomerulonephritis Associated with Simultaneous Canine Adenovirus-1 and Dirolaria immitis Infection in a Dog. Journal of Veterinary Medicine, v.49, p.235239, 2001. SHENK, T. Adenoviridae. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLE, P.M. (eds). Fundamental virology. 3.ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996. p.979-1016. SHENK, T.E. Adenoviridae: the viruses and their replication.. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.67, p.2265-2300. SIMPSON, K.W.; CENTER, S.A.; BIRNBAUM, N. Fluid and electrolyte disturbances in gastrointestinal, pancreatic, and hepatic disease. In: DIBARTOLA, S.P. Fluid therapy in small animal practice. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 2000. p.330-374. TABOADA, J.; DIMSKI, D.S. Hepatic encephalopathy: clinical signs, pathogenesis, and treatment. Veterinary Clinics of North America: small animal practice, v.25, p.337-355, 1995. WATSON P.J. Chronic hepatitis in dogs: a review of current understanding of the aetiology, progression, and treatment. Veterinary Journal, v.167, p.228-241, 2004. ZEE, Y.C. Adenoviridae. In: HIRSH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Massachusetts: Blackwell Science, 1999. p.346349.
GREENE, C.E. Infectious canine hepatitis and canine acidophil cell hepatitis. In: ___. Infectious disease of the dog and cat. 2.ed. Philadelphia, PA: Saunders, 1998. p.22-28. HUGHES, D.; KING, L.G. The diagnosis and management of acute liver failure in dogs and cats. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, v.25, p.437-460, 1995. JOHNSON, B.C.; MILLER, W.W. Recognising ocular signs of systemic diseases in dogs. Veterinary Medicine, v.85, p.10761090, 1990. LAPPIN, M.R. Viral diseases. In: LEIB, M.S.; MONROE, W.E. (eds). Practical small animal internal medicine. Philadelphia, PA: Saunders, 1997. p.873-902. MARTIN, C.L. Ocular signs of systemic diseases. Modern Veterinary Practice, v.63, p.689-694, 1982. McCANDLISH, I.A.P. Infeces especcas caninas. In: DUNN, J.K. (ed). Tratado de medicina de pequenos animais. So Paulo: Roca, 2001. p.915-952. McFERRAN, J.B. Adenoviruses. In: CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.P. (eds). Veterinary diagnostic virology: a practioners guide. St Louis: Mosby, 1992, p.18-19. MURPHY, F.A. et al. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. p.327-335. RAKICH, P.M. et al. Immunohistochemical detection of canine adenovirus in parafn sections of liver. Veterinary Pathology, v.23, p.478-484, 1986.
HERPESVIRIDAE
Ana Cludia Franco1 & Paulo Michel Roehe
17
435 435
436 436 436
1 Introduo 2 Classicao e nomenclatura

2.1 Subfamlia Alphaherpesvirinae 2.2 Subfamlia Betaherpesvirinae 2.3 Subfamlia Gammaherpesvirinae
3 Propriedades gerais dos herpesvrus 4 Estrutura dos vrions

4.1 O ncleo 4.2 O capsdeo 4.3 O tegumento 4.4 O envelope 4.5 O genoma
438 438
439 439 439 439 440
5 Replicao
5.1 O ciclo replicativo 5.2 Infeco latente
440
441 445
6 Herpesvrus de interesse veterinrio

6.1 Herpesvrus de bovinos 6.1.1 Herpesvrus bovino tipo 1 6.1.2 Herpesvrus bovino tipo 2 6.1.3 Herpesvrus bovino tipo 4 6.1.4 Herpesvrus bovino tipo 5 6.1.5 Herpesvrus associados com a febre catarral maligna 6.2 Herpesvrus de caprinos 6.2.1 Herpesvrus caprino tipo 1
447
447 447 454 457 459 463 465 465
Colaboraram com sees especcas: Eduardo Furtado Flores (BoHV-2, BoHV-4); Renata Dezengrini (FeHV-1); Letcia F. da Silva (CpHV-1).
6.3 Herpesvrus de sunos 6.3.1 Herpesvrus suno tipo 1 (vrus da doena de Aujeszky) 6.4 Herpesvrus de eqinos 6.4.1 Herpesvrus eqino tipo 1 6.4.2 Herpesvrus eqino tipo 3 6.4.3 Herpesvrus eqino tipo 4 6.5 Herpesvrus de ces 6.5.1 Herpesvrus canino tipo 1 6.6 Herpesvrus de felinos 6.6.1 Herpesvrus felino tipo 1
467 467 472 472 475 476 478 478 479 479 481 481 484
6.7 Herpesvrus de aves 6.7.1 Vrus da doena de Marek 6.7.2 Vrus da laringotraquete infecciosa
485
1 Introduo
A palavra herpes origina-se da palavra grega herpein, que signica rastejar ou rastejamento. Esta palavra est relacionada com as primeiras observaes das leses causadas por vrus desta famlia, leses que pareciam rastejar na superfcie da pele das pessoas afetadas. Alm desta, outra propriedade muito importante apresentada por, virtualmente, todos os herpesvrus a capacidade de causarem infeces inaparentes ou latentes. Assim, uma vez infectado por um herpesvrus, o hospedeiro permanece portador do vrus na forma latente. A latncia caracterizada pela ausncia de replicao viral e de sinais clnicos, e dura toda a vida do hospedeiro. Durante esse perodo, o animal pode no apresentar sinais clnicos e raramente excreta o vrus. No entanto, a infeco latente pode ser ocasionalmente reativada por situaes de estresse, ocasies em que o vrus re-excretado pelo hospedeiro e pode se disseminar para indivduos susceptveis. Os herpesvrus so muito antigos e, aparentemente, vm co-evoluindo com os seus hospedeiros h quase um bilho de anos. As vrias semelhanas observadas na estrutura de diferentes herpesvrus sugerem que eles tenham surgido de um ancestral comum, que parece ter dado origem a duas linhagens: uma representada pelo herpesvrus alfa, beta e gama, que infectam aves e mamferos; e a outra representada pelos herpesvrus de animais de sangue frio. Estudos genticos sugerem que os herpesvrus evoluram paralelamente aos seus hospedeiros, o que explica o alto nvel de adaptao observado entre esses agentes e os seus hospedeiros naturais. A capacidade dos herpesvrus de causar infeces latentes duradouras nos seus hospedeiros naturais, sem causar doena grave ou mortalidade, possibilita a transmisso viral entre hospedeiros de forma altamente ecaz. Esse no o caso das infeces de hospedeiros acidentais, aos quais os herpesvrus no se encontram to bem adaptados. Nesses casos, infeces fatais podem ocorrer, como nas infeces de bovinos e ces com o herpesvrus suno tipo 1 (SuHV-1). Os herpesvrus esto amplamente distribudos na natureza. A maioria das espcies animais
serve de hospedeiro natural de pelo menos um membro da famlia. Apesar disso, os herpesvrus identicados at o momento ainda so em pequeno nmero, compreendendo aproximadamente 130 espcies. Existem vrios herpesvrus de importncia veterinria, visto que cada espcie domstica alberga pelo menos um desses agentes. Como exemplos, podem-se citar: os herpesvrus bovino tipos 1, 2, 4 e 5 (BoHV-1, BoHV-2, BoHV4 e BoHV-5); os herpesvrus eqino tipos 1, 3 e 4 (EHV-1, EHV-3, EHV-4); o SuHV-1 (tambm denominado de vrus da doena de Aujeszky ou da pseudoraiva, PRV); o herpesvrus caprino tipo 1 (CpHV-1); o herpesvrus canino tipo 1 (CaHV-1); o herpesvrus felino tipo 1 (FeHV-1); os herpesvrus de galdeos tipo 1 e tipo 2 (GaHV-1 e 2). Dentre os membros dessa famlia que infectam humanos, pode-se citar o herpesvrus humano 1 (HHV-1 ou vrus do herpes simplex, HSV-1); o herpesvrus humano 2 (HHV-2 ou HSV-2); o herpesvrus humano 3 (HHV-3, agente da varicelazoster,VZV); o citomegalovrus (HCMV); o vrus Epstein-Barr (EBV) e os herpesvrus humanos 6A, 6B, 7 e 8 (HHV-6A, HHV-6B, HHV-7, e HHV-8). A maioria dos herpesvrus de animais domsticos produz geralmente infeces inaparentes ou leves nos seus hospedeiros. Alguns herpesvrus so estreitamente associados com clulas, e um pequeno nmero deles tm capacidade oncognica, cuja infeco resulta na produo de tumores, como o GaHV-2 (agente da doena de Marek). Em geral os herpesvrus esto disseminados nas populaes animais e so detectados com freqncia em laboratrios de diagnstico, pois se multiplicam com facilidade em cultivos celulares (ex: SuHV-1, BoHV-1 e BoHV-5) ou em membrana corioalantide (ex: GaHV-2). Este captulo ir abordar somente as infeces causadas por herpesvrus que afetam animais de importncia em medicina veterinria.
2 Classicao e nomenclatura
Os membros da famlia Herpesviridae so classicados em trs subfamlias, de acordo com suas propriedades biolgicas: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Alm des-
436
Captulo 17
ses, existem vrios herpesvrus que ainda no foram denitivamente classicados, entre eles destaca-se o SuHV-2, o citomegalovrus de sunos. Os membros das respectivas subfamlias so agrupados em gneros, de acordo com a homologia das seqncias de DNA, similaridades na estrutura e organizao genmica e relao antignica. A Tabela 17.1 apresenta os principais herpesvrus que afetam animais e que sero abordados neste captulo. A nomenclatura dos herpesvrus, assim como de outras famlias virais, tem sido alvo de alteraes nas ltimas dcadas, fruto de tentativas de estabelecer uma nomenclatura universal para esses agentes. Assim, o vrus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1), que o prottipo da famlia, foi recentemente denominado HHV-1 (herpesvrus humano tipo 1). Outros vrus foram tambm renomeados, buscando adaptar-se s instrues do ICTV (International Committee for Taxonomy of Viruses). Para evitar confuso e contradio com os demais captulos, nos quais tais vrus so mencionados, este captulo utilizar a nomenclatura clssica consagrada. Os casos em que a nova nomenclatura for empregada sero assinalados.
2.2 Subfamlia Betaherpesvirinae

Os vrus que pertencem a essa subfamlia possuem uma gama restrita de hospedeiros e apresentam um ciclo replicativo longo, ou seja, a infeco progride lentamente em cultivos celulares. As clulas infectadas freqentemente apresentam aumento de volume (citomegalia) e a infeco natural resulta na produo de animais portadores. O vrus pode ser mantido de forma latente em tecidos glandulares, clulas linforreticulares, rins e outros tecidos. Esta subfamlia dividida nos gneros Cytomegalovirus (cujo prottipo o herpesvrus humano 5 [HHV-5], tambm denominado citomegalovrus humano [HCMV]), Muromegalovirus (prottipo: citomegalovrus murino) e Roseolovirus (cujo prottipo o herpesvrus humano 7, HHV-7). Esta famlia abriga importantes patgenos humanos, alm de abrigar vrus que afetam algumas espcies animais, como primatas e roedores.
2.3 Subfamlia Gammaherpesvirinae

Os vrus classicados nessa subfamlia tambm possuem uma gama restrita de hospedeiros. Alm disso, estabelecem infeces latentes principalmente em clulas linfoblastides. Alguns membros podem produzir infeces lticas em clulas epiteliides e broblsticas. Esses vrus possuem potencial oncognico e podem ser especicamente adaptados a linfcitos B ou T. Infeces latentes so freqentemente observadas em tecidos linfides. Essa subfamlia contm trs gneros: Lymphocryptovirus (cujo prottipo o herpesvrus humano tipo 4 [HHV-4] ou vrus Epstein-Barr [EBV]), Rhadinovirus (cujo prottipo o herpesvrus saimiri 2 [SaHV-2]) e Ictalurovirus (cujo prottipo o herpesvrus do catsh [IcHV1]). Vrios vrus classicados nessa subfamlia afetam espcies animais e alguns possuem importncia em medicina veterinria, como o agente da febre catarral maligna associada a ovinos (MCFV ou OvHV-2).
2.1 Subfamlia Alphaherpesvirinae

A classicao dos herpesvrus nessa subfamlia feita com base em suas caractersticas biolgicas: os alfaherpesvrus possuem uma gama varivel de hospedeiros, apresentam um ciclo replicativo relativamente curto (< 24 horas), destroem rapidamente as clulas de cultivo e estabelecem infeces latentes primariamente em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos. Essa subfamlia abriga os gneros Simplexvirus (cujo prottipo o HHV-1 ou HSV-1, agente do herpes labial), Varicellovirus (prottipo: HHV-3 ou VZV, agente da varicela-zoster), Mardivirus (prottipo: GaHV-2, agente da doena de Marek) e Iltovirus (prottipo: GaHV-1, agente da laringotraquete infecciosa [ILTV]). A maioria dos herpesvrus de importncia veterinria pertence ao gnero Varicellovirus (Tabela 17.1).
Herpesviridae
437
Tabela 17.1. Herpesvrus de importncia em medicina veterinria.
Subfamlia
Gnero
Varicellovirus
Espcie
Herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1)
Enfermidade
Rinotraquete infecciosa bovina/vulvovaginite pustular infecciosa/balanopostite pustular infecciosa, abortos. Mamilite herptica bovina
Herpesvrus bovino tipo 2 (BoHV-2) Herpesvrus bovino tipo 5 (BoHV-2) Herpesvrus canino tipo 1 (CaHV-1) Herpesvrus caprino tipo 1 (CpHV-1) Simplexvirus Herpesvrus eqino tipo 1 (EHV-1) Herpesvrus eqino tipo 3 (EHV-3) Herpesvrus eqino tipo 4 (EHV-4) Herpesvrus felino tipo 1 (FeHV-1) Herpesvrus suno tipo 1 (SuHV-1) Herpesvrus galdeo tipo 2 (GaHV-2) Mardivirus Herpesvrus galdeo tipo 3 (GaHV-3) Iltovirus Herpesvrus galdeo tipo 1 (GaHV-1)
Encefalite herptica bovina
Infeco herptica em ces
Infeco herptica em caprinos
Alphaherpesvirinae
Aborto herptico eqino
Exantema coital eqino
Rinopneumonite viral eqina
Rinotraquete viral dos felinos
Doena de Aujeszky ou pseudoraiva Doena de Marek
Doena de Marek
Laringotraquete viral infecciosa
Herpesvrus alcelaphine Febre catarral maligna tipo 1 (AlHV-1) Gammaherpesvirinae Herpesvrus bovino tipo 4 (BoHV-4) Herpesvrus ovino tipo 2 (OvHV-2) Herpesvrus ovino tipo 1 (OvHV-1) Herpesvrus suno tipo 2 (SuHV-2) Associao com doena? Sinais respiratrios, abortos Febre catarral maligna associada a ovinos Adenomatose pulmonar associada a herpesvrus Citomegalovrus de sunos
Vrus no-classificados
438
Captulo 17
3 Propriedades gerais dos herpesvrus

A incluso de um vrus na famlia Herpesviridae realizada com base na estrutura da partcula viral, no tipo e estrutura do genoma. Os vrions dos herpesvrus consistem de um ncleo (ou core) contendo uma molcula de DNA de ta dupla linear; um capsdeo icosadrico de aproximadamente 100 a 110 nm de dimetro envolvendo o ncleo; uma camada protica amorfa, chamada tegumento, que recobre o capsdeo; e um envelope lipoprotico contendo espculas de glicoprotenas na sua superfcie (Figura 17.1). O dimetro dos vrions varia entre 120 e 300 nm. As partculas no possuem uma forma bem denida, podendo ser aproximadamente esfricas ou apresentar contorno irregular. Dentre as razes para a variao do dimetro e da forma dos vrions esto a presena de quantidade varivel de tegumento e a sua distribuio irregular nas partculas. Os herpesvrus conhecidos apresentam algumas caractersticas biolgicas em comum, a saber: codicam um grande nmero de enzimas relacionadas com o metabolismo de nucleotdeos, sntese do cido nuclico e processamento de protenas;
a sntese do DNA viral e a montagem do capsdeo ocorrem no ncleo da clula hospedeira. A aquisio do envelope viral ocorre durante o trnsito dos nucleocapsdeos atravs da membrana nuclear ou atravs de organelas citoplasmticas envelopadas (p. ex.: complexo de Golgi); so capazes de permanecer latentes nos seus hospedeiros naturais. Nas clulas infectadas de forma latente, os genomas virais se mantm na forma circular epissomal, ocorrendo pouca ou nenhuma expresso gnica. Esses genomas retm a capacidade de replicar, o que ocorre por ocasio da reativao da infeco latente. Os herpesvrus so vrus facilmente inativados por lcoois e detergentes, em razo da presena do envelope lipoprotico. Os vrions perdem a infectividade aps o contato com isopropanol ou etanol a 70-80% por cinco minutos; formaldedo a 0,2-08% e glutaraldedo a 2%. Alm disso, os vrions so inativados pelo contato por dez minutos com substncias de pH abaixo de 3 e acima de 11.
4 Estrutura dos vrions

Os vrions dos herpesvrus variam de 120 a 300 nm em dimetro. Parte dessa variao se deve variabilidade na espessura do tegumento.
B
tegumento capsdeo ncleo protenas (core) membrana lipdica glicoprotenas genoma
envelope
Fonte: A) Dra Linda Stannard. Web.uct.ac.za. B) Adaptada de Dr. Marko Reschkes Group, Marburg.
Figura 17.1. Vrions de membros da famlia Herpesviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica do vrus do herpes simplex humano (HSV-1), o prottipo da famlia. B) Ilustrao simplificada de uma partcula vrica com os seus componentes.
Herpesviridae
439
Outra fonte de variao no dimetro dos vrions o estado do envelope. Envelopes virais intactos so impermeveis e, em geral, conferem uma forma praticamente esfrica s partculas. Envelopes danicados so permeveis a corantes. Vrions permeveis apresentam uma aparncia de ovo frito, com morfologia indenida e dimetro maior do que vrions intactos. A Figura 17.1 ilustra a estrutura de uma partcula vrica dos herpesvrus com os seus componentes.
4.1 O ncleo
O ncleo (ou core) de um vrion maduro contm o genoma viral conjugado com algumas protenas codicadas pelo vrus. Em alguns herpesvrus, o DNA parece estar suspenso por uma massa proteincea, que consiste de brilas que cam tambm embebidas na parte interna do capsdeo viral. O genoma parece estar compactado em uma forma toride ou de fuso e possui as extremidades livres, o que caracteriza os genomas lineares.
Estudos iniciais demonstraram que o tegumento apresentava aparncia amorfa, mas recentemente observou-se, por imunomicroscopia, que esse componente apresenta certa organizao estrutural, sobretudo nas proximidades dos vrtices do capsdeo. O tegumento pode estar distribudo assimetricamente, e sua espessura pode variar de acordo com a localizao do vrion dentro da clula infectada. Com isso, a morfologia e as dimenses das partculas vricas podem variar. Pelo menos oito tipos de protenas codicadas pelo genoma viral esto presentes no tegumento. Destas, duas apresentam funes importantes na replicao viral, a VP16 (TIF) e a VHS, envolvidas na ativao da transcrio dos genes alfa e na supresso da sntese protica celular, respectivamente.
4.4 O envelope
Estudos de microscopia eletrnica tm demonstrado que o envelope dos herpesvrus possui uma aparncia tipicamente trilaminar. O envelope viral origina-se de seces de membranas celulares alteradas e contm numerosas protruses de glicoprotenas. Essas protruses so mais numerosas e mais curtas do que as presentes na superfcie de outros vrus envelopados. Alm de conter vrias glicoprotenas, o envelope tambm contm lipdeos. O nmero e a quantidade relativa de glicoprotenas do envelope viral variam de acordo com o vrus. Assim, o HSV-1 codica pelo menos onze glicoprotenas, enquanto o nmero de molculas de glicoprotenas individuais pode chegar a 1.000 por vrion. As glicoprotenas do HSV-1 j identicadas so: a gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK e gM. Essas glicoprotenas desempenham importantes funes, incluindo a ligao a receptores celulares, fuso, penetrao e transporte das partculas virais entre clulas. No entanto, algumas delas no so essenciais para a replicao do vrus in vitro e podem ser deletadas experimentalmente sem afetar a capacidade do vrus replicar em cultivo celular. As glicoprotenas do envelope tambm medeiam as interaes dos vrions com o sistema imunolgico e se constituem em importantes alvos de anticorpos, muitos deles com atividade neutralizante.
4.2 O capsdeo
Os capsdeos dos herpesvrus so icosadricos e possuem um dimetro aproximado de 100 nm. Esta estrutura composta por 162 capsmeros, sendo 12 capsmeros pentamricos localizados nos 12 vrtices e 150 capsmeros hexamricos constituindo as faces triangulares do icosaedro. Os capsmeros so arranjados formando uma simetria icosadrica do tipo T = 16. Em preparaes de vrions, trs tipos de capsdeos podem ser observados sob microscopia eletrnica (ME): os capsdeos do tipo A so desprovidos da estrutura toride (ncleo) interna; os capsdeos do tipo B contm as protenas que se conjugam ao genoma, mas so desprovidos de DNA e, nalmente, os capsdeos que contm o DNA e as protenas associadas so denominados C. Pelo menos quatro tipos de protenas virais esto presentes na estrutura dos capsdeos.
4.3 O tegumento
O tegumento a camada protica que preenche o espao entre o capsdeo e o envelope.
440
Captulo 17
4.5 O genoma
Os genomas extrados de vrions e caracterizados at o presente so constitudos por molculas de DNA lineares de ta dupla. Nos vrions, essas molculas so compactadas ou empacotadas na forma de um toride ou fuso, com as extremidades livres, porm prximas. Os genomas lineares circularizam imediatamente aps a sua liberao no interior das clulas hospedeiras. O genoma possui entre 125 e 235 quilopares de bases (kbp), dependendo da espcie viral. O genoma do HSV-1 j foi seqenciado inteiramente e possui 152.2 kpb. Os genomas dos herpesvrus variam com relao extenso, composio (contedo de GC-AT) e presena de seqncias repetidas. A composio de bases do DNA dos herpesvrus varia de 31 a 75% de G-C em relao ao total de nucleotdeos. A composio de GC no genoma do HSV-1 de 68%. Alm disso, a distribuio do contedo de GC tambm pode ser desigual ao longo do genoma. A variao na extenso do genoma est associada principalmente com a presena de seqncias terminais e internas repetidas. Por outro lado, delees parciais tambm j foram relatadas, o que tambm pode resultar em variaes na extenso do genoma. Os genomas dos herpesvrus so organizados de formas diferentes com relao localizao e nmero de seqncias repetidas terminais e internas. De acordo com a organizao genmica, esses vrus so divididos em seis grupos designados pelas letras A a F (ver Figura 6.9; Captulo 6). A Figura 17.2 apresenta genomas representativos de trs desses grupos. O genoma dos herpesvrus possui mais de 70 genes, sendo que a maioria das protenas codicadas e as suas funes j foram identicadas ou deduzidas. Curiosamente, parte desses genes (35 genes no caso do HSV-1) codica protenas que no so essenciais para a replicao do vrus em cultivo celular. Os genes situados nas regies nicas (UL e US) esto presentes em apenas uma cpia no genoma, enquanto os genes localizados nas seqncias repetidas esto presentes em mais cpias. O signicado biolgico dessas duplicaes gnicas no conhecido. Os genes esto distribudos nas duas cadeias do DNA em orientaes obviamente opostas. Assim, a expresso dos
genes envolve a transcrio das duas cadeias. Os promotores de alguns genes esto situados nas regies codicantes de genes adjacentes, o que faz com que manipulaes genticas do genoma tenham que ser feitas com critrios cuidadosamente determinados. Os genes so transcritos pela maquinaria celular de transcrio (RNA polimerase II e fatores de transcrio), possivelmente assistida por fatores virais. A transcrio de cada gene origina um RNA mensageiro (mRNA), que possui cap na extremidade 5 e poliadenilado na extremidade 3. Poucos transcritos dos herpesvrus sofrem splicing antes de serem exportados para o citoplasma.
A DR EHV-2 (192kb) Regio UL DR
B Regio UL BoHV-1 (137kb) IR US IR
C a HSV-1 (152kb) Regio UL a' b US b'
Figura 17.2. Organizao do genoma de alguns herpesvrus. A) Genoma do tipo A: herpesvrus eqino tipo 2 (EHV-2); B) Genoma do tipo D: herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1); C) Genoma do tipo E: herpesvrus humano tipo 1 (HSV-1). UL) regio nica longa; US) regio nica curta; IR) repeties invertidas; DR) repeties diretas.
5 Replicao
Considerando-se que os membros da subfamlia Alphaherpesvirinae so os que apresentam maior importncia em medicina veterinria, esta seo abordar a replicao dos vrus dessa subfamlia. Dois ciclos replicativos com caratersticas distintas podem ser reconhecidos na biologia dos alfaherpesvrus: a infeco aguda ou produtiva (ciclo ltico) e a infeco latente (Figura 17.3).
Herpesviridae
441
Ativadores celulares
Infeco primria
Repressores celulares
Expresso dos genes alfa
Expresso dos genes alfa bloqueada
Expresso dos genes beta
?
Reativao
Expresso do LAT
Replicao do genoma
Infeco latente estabelecida
?
Expresso dos genes gamma Manuteno da latncia Estresse, Corticides Prognie viral
dos gnglios sensoriais e autonmicos, mas parece ocorrer tambm em menor escala em outros tipos celulares. O estabelecimento da infeco latente caracterizado pela interrupo do ciclo replicativo logo aps a penetrao do genoma no ncleo celular. Com isso, no h expresso gnica signicativa, no ocorrendo produo de protenas virais, replicao do genoma ou produo de prognie viral. Assim, o genoma viral permanece inativo no ncleo dos neurnios pelo resto da vida do animal. Em determinadas situaes, geralmente associadas com estresse, o genoma ativado e a expresso gnica reiniciada, resultando na retomada da infeco produtiva e na produo de prognie viral. O estabelecimento e reativao da latncia representam pontos-chave na biologia dos herpesvrus, pois permitem a permanncia indenida do vrus nos hospedeiros, acompanhada de episdios espordicos de reativao e excreo viral.

Infeco latente
Infeco produtiva
Figura 17.3. Etapa dos ciclos replicativos produtivo (ltico) e latente dos alfaherpesvrus. O ciclo replicativo ltico ocorre em clulas totalmente permissivas replicao e resulta na produo de prognie infecciosa. A infeco latente ocorre em clulas semipermissivas, principalmente neurnios, e resulta na manuteno do genoma viral sem expresso gnica ou produo de prognie viral. Em determinadas situaes, a infeco latente pode ser reativada e o vrus reassume a replicao produtiva.
A replicao produtiva ltica ocorre nos locais de penetrao do vrus no hospedeiro (epitlios e tecidos subjacentes) e, provavelmente, tambm em neurnios, antes do estabelecimento e durante a reativao da infeco latente. Esse ciclo caracteriza-se pela expresso de todos os genes virais, replicao do genoma e produo de prognie viral infecciosa. A ocorrncia do ciclo replicativo completo incompatvel com a sobrevivncia das clulas hospedeiras. A infeco latente ocorre em classes especcas de neurnios, principalmente em neurnios
O ciclo replicativo se inicia pela interao dos vrions com receptores da membrana plasmtica das clulas-alvo. Os alfaherpesvrus utilizam molculas de glicosaminoglicanos, como o sulfato de heparina, como receptores celulares. A interao dos vrions com as molculas de sulfato de heparina mediada pela glicoprotena C (gC). Entretanto, foi observado que clulas que no expressam esses receptores podem ser infectadas pelo HSV-1, porm, com menor ecincia. Isso indica que outras molculas tambm podem desempenhar o papel de receptores para a adsoro desses vrions. J foi demonstrado, por exemplo, que em vrus mutantes que no expressam a gC, a gD assume o papel de ligao aos receptores. A adsoro seguida da ligao de outra protena viral provavelmente a gD com coreceptores da membrana plasmtica. Um desses co-receptores membro da famlia de receptores do fator de necrose tumoral (TNF), chamado de HveA, presente principalmente em clulas linfides. Outro co-receptor pertence famlia dos receptores para poliovrus, do grupo das nectinas. A ligao com os co-receptores seguida de fuso do envelope viral com a membrana plasmtica, evento que ocorre na superfcie celular,
442
Captulo 17
sem a necessidade de internalizao por endocitose e acidicao dos endossomos. A fuso entre o envelope e a membrana plasmtica ocorre com a participao da gD, do heterodmero gH-gL e da gB. A transio entre o processo de adsoro e a penetrao muito rpida e ocorre em poucos minutos. Aps a fuso, algumas protenas do tegumento se dissociam do nucleocapsdeo e permanecem no citoplasma, enquanto outras so transportadas at o ncleo. O nucleocapsdeo, ainda associado com algumas protenas do tegumento, liga-se aos microtbulos celulares e , assim, transportado at as proximidades dos poros nucleares. Os nucleocapsdeos, ento, associam-se aos complexos dos poros nucleares, ocorrendo a sua desintegrao e a liberao do genoma no interior do ncleo. Os restos do capsdeo cam retidos no lado citoplasmtico da membrana nuclear. Acredita-se que o genoma circularize imediatamente aps a penetrao no ncleo. Assim, os mecanismos de transcrio e replicao do DNA viral ocorreriam em genomas circularizados. A transcrio do genoma viral se inicia logo aps a sua penetrao no ncleo. O DNA viral transcrito pela RNA polimerase II celular com o auxlio de fatores celulares e virais. A sntese de protenas virais regulada de forma precisa, pois a expresso de genes virais ocorre de forma coordenada e em ordem seqencial, em forma de uma reao em cascata. Vrios produtos dos genes virais so enzimas e protenas que se ligam ao DNA, envolvidas no processo de replicao do genoma. De acordo com a cintica de expresso e com a funo de seus produtos, os genes virais so divididos em trs grupos principais: genes alfa (immediate early ou de transcrio imediata), beta (early ou iniciais) e gama (late ou tardios). Os genes alfa e beta so expressos abundantemente antes da replicao do genoma, enquanto os genes gama somente so expressos em quantidades signicativas aps a replicao do DNA viral. Os primeiros genes a serem transcritos so os genes alfa, e a sua transcrio inicia imediatamente aps a liberao do genoma no interior do
ncleo. A transcrio desses genes requer a presena de uma protena que componente do tegumento viral, chamada VP16 ou TIF. Essa protena se conjuga com um fator celular e estimula a transcrio de quatro genes, cujos produtos so as protenas ICPO, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47. Essas protenas tm, como principal funo, estimular a transcrio dos genes beta. Os produtos dos genes beta, por sua vez, so, principalmente, enzimas e protenas acessrias envolvidas no metabolismo de nucleotdeos e na replicao do genoma, incluindo a polimerase viral. Dentre esses produtos incluem-se as enzimas timidina quinase (TK) e ribonucleotdeo redutase (RR), que catalisam a sntese de nucleotdeos trifosfato. As protenas beta tambm incluem protenas de ligao ao DNA, helicase (UL9) e a prpria DNA polimerase viral. Assim, a expresso dos genes beta seguida de intensa sntese de nucleotdeos e replicao do genoma. Aps a replicao do genoma, o terceiro grupo de genes expresso (genes tardios ou gama). Os produtos desses genes se constituem principalmente em protenas estruturais do ncleo, capsdeo e envelope, que so, ento, utilizadas na construo das partculas vricas. De acordo com a cintica de expresso e funo, os genes tardios podem ser divididos em gama-1 e gama-2. Vrias protenas virais so modicadas aps a sua sntese, modicaes que incluem clivagem proteoltica, fosforilao e glicosilao, entre outras. A maioria dessas modicaes ocorre por ao de enzimas celulares, embora algumas enzimas virais possam tambm estar envolvidas nesses processos. Simultaneamente expresso das protenas virais, ocorre a inibio da transcrio de genes, do processamento e transporte de mRNAs e sntese de protenas da clula hospedeira. Esses eventos so induzidos por protenas virais e tm como objetivo subverter a maquinaria celular para o processamento e transporte de mRNA virais e sntese de protenas virais. A maioria das protenas dos genes beta importada para o ncleo celular, onde se conjugam com o genoma, formando os stios pr-replicativos. Esses stios so os locais de iniciao da sn-
Herpesviridae
443
tese de DNA. Enquanto a sntese ocorre, as molculas de DNA recm-produzidas se acumulam em compartimentos replicativos, localizados em determinadas reas do ncleo, juntamente com os complexos de replicao. A sntese de DNA, a partir da molcula genmica parental, origina concatmeros, que so macromolculas lineares contendo vrias unidades genmicas unidas entre si pelas extremidades, as quais se acumulam no ncleo da clula hospedeira. A replicao do genoma viral depende de, pelo menos, sete protenas codicadas pelo vrus, mas provavelmente envolve tambm a participao de fatores celulares, como a DNA polimerase-primase, DNA ligase e topoisomerase II. Trs origens de replicao foram identicadas no genoma do HSV-1, sendo uma delas situada na regio repetida invertida S (e, portanto, em duas cpias) e a outra localizada no componente L. Os primeiros passos da replicao do genoma envolvem a ligao e alterao das seqncias de origem da replicao pela protena UL9. A protena ICP8 liga-se, ento, UL9 ou a regies de DNA de ta simples, e a UL9 inicia a sua atividade de helicase, separando as tas do DNA viral. O complexo helicase-primase, que contm as protenas virais UL5, UL8 e UL52, , ento, recrutado para o local onde se inicia a polimerizao das cadeiaslhas pela polimerase viral. A DNA polimerase do HSV-1 um heterodmero, composto pela protena UL30 associada com a protena UL42. A subunidade UL30 possui o stio cataltico responsvel pela polimerizao das novas cadeias e tambm possui atividade de proofreading (correo dos erros). A protena UL42 necessria para a processividade da UL30. Com base em informaes disponveis, foi proposto um modelo para a replicao do genoma do HSV-1 (Figura 17.4). Esse modelo prope o incio da replicao em uma molcula de DNA circularizada, seguida de replicao bidirecional que, posteriormente, alterada para um mecanismo de crculo rolante. O resultado da replicao a produo de molculas longas, formadas por cpias genmicas mltiplas. Esses concatmeros so posteriormente clivados, originando as molculas genmicas individuais.
A montagem dos nucleocapsdeos ocorre em vrias etapas. Aps a sntese das protenas tardias que participam da estrutura das partcu-
ICP8
UL9 Iniciao Helicase/ primase 3 Complexo polimerase
Replicao tipo Theta
UL9
5' Replicao por crculo rolante
3' 5'
Fonte: adaptada de Roizman e Knipe (2001).
Figura 17.4. Modelo para a replicao do genoma dos alfaherpesvrus. O DNA genmico circularizado logo aps a penetrao no ncleo (1). A UL9 se liga na origem de replicao, inicia a separao das cadeias e recruta a US8 (protena de ligao em DNA de fita simples) para se ligar nas cadeias separadas (2). A US9 e US8 recrutam as cinco protenas restantes, formando os complexos de iniciao (3), que iniciam a replicao bidirecional do tipo Theta (4). A replicao muda para o modo de crculo rolante por mecanismos desconhecidos (5). A replicao por crculo rolante produz multmeros do genoma que so, posteriormente, clivados em unidades genmicas.
444
Captulo 17
las, inicia-se o processo da montagem ainda no citoplasma. Essas protenas pr-associadas entre si so transportadas para o ncleo, onde a montagem do capsdeo nalizada pela incluso do DNA genmico no seu interior. A introduo do genoma viral nos capsdeos pr-formados envolve um processo no qual grandes concatmeros de DNA so clivados em monmeros e empacotados nos capsdeos pr-formados. Aps o encapsidamento do genoma, os nucleocapsdeos podem realizar o brotamento atravs da membrana nuclear interna. Esse processo mediado pela interao entre protenas do tegumento, adquiridas durante o brotamento e protenas do capsdeo; e entre protenas do tegumento e glicoprotenas virais presentes na membrana nuclear interna. O mecanismo pelo qual os nucleocapsdeos saem do espao entre as membranas nucleares interna e externa ainda no claro, existindo dois modelos possveis. O primeiro sugere que os nucleocapsdeos adquirem o envelope ao brotarem atravs da membrana nuclear interna. Este envelope seria perdido quando os vrions fusionam com a membrana nuclear externa, liberando os nucleocapsdeos desprovidos de envelope no citoplasma. O outro modelo sugere que nucleocapsdeos no citoplasma so diretamente encaminhados ao complexo de Golgi, onde adquirem o envelope por brotamento. Vesculas derivadas do aparelho de Golgi, contendo vrions envelopados, seriam, ento, transportadas at a superfcie celular, onde os vrions seriam liberados por exocitose. Estudos recentes demonstraram que a aquisio do envelope por vrions do SuHV-1 segue o primeiro modelo. Foi demonstrado que nucleocapsdeos do SuHV-1 recebem o tegumento no citoplasma da clula infectada e so reenvelopados no complexo de Golgi. Aps a adio do envelope, os vrions so liberados das clulas infectadas por fuso de vacolos, contendo os vrions com a membrana plasmtica, ou pela fuso entre clulas infectadas e no-infectadas, o que ocorre provavelmente atravs de junes celulares. O complexo formado entre as glicoprotenas I e E necessrio para esse tipo de dissemina-
o viral, provavelmente porque o complexo gIgE pode se ligar s junes celulares e mediar o movimento de vrions ao longo dessas junes. Quando os herpesvrus se multiplicam em clulas completamente permissivas, o ciclo replicativo completado em aproximadamente 18-20 horas. O ciclo replicativo produtivo dos alfaherpesvrus est ilustrado na Figura 17.5. As clulas infectadas com os alfaherpesvrus no sobrevivem infeco, por causa de severas alteraes estruturais e bioqumicas que ocorrem em conseqncia da replicao viral. Entre as alteraes estruturais, podem-se citar as alteraes na cromatina celular, duplicao e dobramento de membranas celulares, fragmentao e disperso das membranas do complexo de Golgi, insero de protenas virais em membranas celulares, rearranjo da rede de microtbulos e formao de corpsculos de incluso intranucleares. Entre as alteraes bioqumicas celulares, incluem-se o bloqueio da sntese de protenas celulares, degradao de mRNAs celulares, bloqueio da transcrio e reduo da sntese de RNA celular, inibio do processamento de mRNA e degradao seletiva de protenas celulares. Ainda, os herpesvrus podem interferir com o ciclo de diviso celular. Foi demonstrado que protenas codicadas pelo HSV-1 e tambm pelo BoHV-1 se ligam a protenas envolvidas no ciclo de diviso celular, como a ciclina D3. Neste caso especco, os produtos virais acabam por interferir com o processo de morte celular programada, ou apoptose, mantendo a clula viva durante a infeco. Os alfaherpesvrus replicam em uma variedade de clulas in vitro, incluindo clulas primrias e linhagens celulares da espcie homloga. A replicao caracterizada por disseminao rpida nos cultivos e destruio dos tapetes celulares, em razo da lise celular induzida pelo vrus. Alm de replicar em clulas da espcie homloga, os diferentes herpesvrus podem ser adaptados para replicar em clulas de outras espcies animais. Os cultivos celulares utilizados para o isolamento e multiplicao dos diferentes herpesvrus sero abordados nas respectivas sees.
Herpesviridae
445
16 1
15
Protenas alfa
Protenas beta
Protenas gama
10 13
mRNA- 3
mRNA-
mRNA- 9 12 14
8 Ncleo
11
Citoplasma
Figura 17.5. Ciclo replicativo dos alfaherpesvrus. Aps a ligao aos receptores, a penetrao ocorre por fuso do envelope com a membrana plasmtica na superfcie celular (1). Os nucleocapsdeos so transportados ao longo dos microtbulos (2) at os poros nucleares, onde ocorre o desnudamento e a liberao do genoma no interior do ncleo (3). Segue-se a transcrio dos genes alfa (4) que so traduzidos nas protenas alfa (5), cuja funo principal ativar a transcrio dos genes beta (6). As protenas beta (7) esto envolvidas na sntese de nucleotdeos trifosfato e na replicao do genoma (8). Os genes gama somente so transcritos aps a replicao do DNA (9) e codificam principalmente protenas estruturais (10). Parte dessas protenas penetra no ncleo e forma pr-capsdeos, nos quais o genoma introduzido (11). Os nucleocapsdeos adquirem o envelope por brotamento atravs da membrana nuclear interna (12). Podem perder o envelope ao atravessar a membrana nuclear externa e serem reenvelopados no aparelho de Golgi (13), ou so enviados em vesculas at o Golgi (14). Os vrions envelopados so transportados em vesculas do trans-Golgi at a superfcie celular (15), onde so liberados por exocitose (16).
5.2 Infeco latente

O estabelecimento de infeces latentes um dos aspectos mais marcantes e provavelmente uma propriedade de todos os herpesvrus. Essa propriedade est relacionada com a capacidade desses vrus se adaptarem aos hospedeiros de forma a mant-los vivos e, periodicamente, utiliz-los para se disseminar para novos hospedeiros. Na infeco latente, o genoma viral per-
manece inativo em clulas neuronais do hospedeiro, no resultando em produo de prognie viral infecciosa. A expresso gnica ausente ou muito restrita. Obviamente, a ausncia de replicao viral resulta na absoluta ausncia de sinais clnicos, caracterizando uma infeco totalmente subclnica e de difcil deteco. A infeco latente pelos alfaherpesvrus estabelecida principalmente em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos, para onde os nu-
446
Captulo 17
Infeco
Transporte retrgrado
Latncia
Crebro
Reativao
Transporte antergrado
Excreo Mucosa nasal
Gnglio trigmeo
Figura 17.6. Patogenia da infeco latente dos alfaherpesvrus. Aps a replicao primria, os nucleocapsdeos so transportados pelo fluxo axoplsmico retrgrado at os corpos neuronais localizados nos gnglios sensoriais e autonmicos. Nestes neurnios, o vrus replica produtivamente ou estabelece infeco latente. Sob certas condies, a infeco latente pode ser reativada e resulta em replicao produtiva. Os vrions produzidos so transportados de volta aos locais de replicao primria, onde replicam e so excretados. O acesso dos vrions ao encfalo pode ocorrer tanto durante a infeco aguda quanto aps a reativao.
cleocapsdeos so transportados pelos axnios ou dendritos aps a replicao produtiva nas mucosas. Este transporte ocorre pelo uxo axoplsmico retrgrado, atravs do qual os nucleocapsdeos atingem os corpos neuronais (Figura 17.6). Em determinadas classes de neurnios, a expresso dos genes alfa suprimida precocemente. Como os produtos desses genes so necessrios para as etapas seguintes de expresso gnica e replicao do genoma, o ciclo interrompido (ver Figura 17.3). Como resultado, o genoma viral persiste no ncleo desses neurnios na forma epissomal pelo resto da vida do animal. A infeco latente caracterizada pela presena do genoma sem expresso gnica signicativa, replicao do genoma ou produo de prognie viral. Animais examinados durante a infeco latente no apresentam indcios de infeco, com exceo da presena de anticorpos produzidos em resposta infeco aguda. Como todos os animais infectados cam portadores, a deteco de anticorpos contra os herpesvrus indica a condio de portador de infeco latente. Os principais stios de latncia so os gnglios sensoriais e autonmicos, dependendo do local de replicao primria do vrus. Assim,
infeces respiratrias ou orais resultam em colonizao dos neurnios sensoriais do gnglio trigmeo com o DNA viral. Os gnglios sacrais so os stios de predileo para a infeco latente que se segue s infeces genitais. Alm desses, alguns locais do sistema nervoso central (SNC) e perifrico, alm de tonsilas e linfcitos circulantes, dentre outros, podem abrigar o DNA viral latente. A importncia desses stios adicionais para a manuteno e reativao da latncia ainda so desconhecidos. Durante a maior parte do tempo, o genoma permanece inativo nos locais de latncia, no ocorrendo produo e excreo de vrus infeccioso. No entanto, em situaes geralmente associadas com estresse, a infeco latente reativada. A reativao se caracteriza pela retomada da replicao ltica nos neurnios hospedeiros e produo de prognie viral. Os vrions produzidos so transportados pelas mesmas vias nervosas de volta aos stios de infeco primria, onde o vrus replica produtivamente e excretado (ver Figura 17.6). A reativao da infeco , ocasionalmente, acompanhada de sinais clnicos e leses nos locais de replicao, que correspondem aos stios de infeco primria. A ocorrncia de sinais cl-
Herpesviridae
447
nicos associada com a reativao denominada recrudescncia e, geralmente, caracterizada por sinais mais brandos do que aqueles resultantes da infeco aguda. A recrudescncia clnica, no entanto, parece no ser uma ocorrncia freqente nas infeces por todos os herpesvrus. Na maioria das vezes, a reativao no acompanhada de manifestaes clnicas evidentes. Os mecanismos envolvidos no estabelecimento, manuteno e reativao das infeces latentes pelos alfaherpesvrus tm sido exaustivamente estudados, porm muitos detalhes moleculares so ainda desconhecidos. O estabelecimento de latncia depende da supresso precoce da expresso dos genes alfa, sem a qual prossegue o ciclo ltico. Durante a latncia, um nico transcrito viral detectado nos neurnios infectados, denominado transcrito relacionado latncia (LAT ou LTR). Aparentemente, esse transcrito no traduzido em protena, e a sua funo na manuteno e reativao da infeco latente permanece deconhecida. Sabe-se que a reativao experimental da infeco pela administrao de corticosterides acompanhada da reduo transitria da transcrio do LAT-LTR, o que sugere a participao desse transcrito na manuteno e reativao da latncia. De qualquer forma, acredita-se que o LAT-LTR seja um componente importante, porm no o nico, do mecanismo de latncia dos alfaherpesvrus. Interaes adicionais entre produtos virais e os neurnios, assim como a participao de mecanismos imunolgicos, tm sido sugeridos para explicar a infeco latente. importante ressaltar que animais latentemente infectados, que podem ser identicados por testes sorolgicos, so considerados fontes potenciais de infeco, sendo muito importantes do ponto de vista epidemiolgico, pois atuam como disseminadores do vrus.
6.1 Herpesvrus de bovinos

Dentre os herpesvrus de bovinos, destacamse os vrus pertencentes subfamlia Alphaherpesvirinae. O herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) tem sido associado com doena respiratria, genital e abortos; o BoHV-2 o agente da mamilite herptica e o BoHV-5 o agente da encefalite herptica (Figura 17.7). A espcie bovina tambm hospedeira natural ou pode ser infectada naturalmente por herpesvrus que pertencem subfamlia Gammaherpesvirinae: o BoHV-4, o herpesvrus ovino tipo 2 (OvHV-2) e o herpesvrus alcelano tipo 1 (AlHV-1). O OvHV-2 e AlHV-1 so os agentes etiolgicos da febre catarral maligna (MCF). O AlHV-1 est associado com a forma africana da enfermidade, que acomete bovinos, cervdeos e outros ruminantes no continente africano, enquanto o OvHV-2 o agente da MCF associada com ovinos, doena que acomete bovinos e outros ruminantes e possui distribuio mundial.
BoHV-5 Meningo-encefalite
BoHV-1 Doena genital (IPV/IBP)
BoHV-1 Doena respiratria (IBR)
BoHV-1 Abortos
BoHV-2 Mamilite
6 Herpesvrus de interesse veterinrio

A seguir, sero abordadas as principais doenas animais causadas por herpesvrus, dando nfase quelas que afetam animais de produo e de companhia. As doenas sero apresentadas por espcie animal, seguindo-se a ordem de classicao taxonmica das subfamlias.
Figura 17.7 Alfaherpesvrus de bovinos e enfermidades associadas.
6.1.1 Herpesvrus bovino tipo 1

O BoHV-1 um alfaherpesvrus e pertence ao gnero Varicellovirus. O vrus possui um genoma de aproximadamente 137 kbp, cuja seqncia completa de nucleotdeos j foi deter-
448
Captulo 17
minada. A organizao do genoma do BoHV-1 que pertence ao grupo D est apresentada na Figura 17.2. O BoHV-1 tem sido associado com diversas manifestaes clnicas em bovinos, que incluem a rinotraquete infecciosa (IBR), vulvovaginite pustular/balanopostite pustular infecciosa (IPV/IPB), abortos e infeco generalizada em neonatos (Figura 17.7.). Os isolados de campo do BoHV-1 podem ser subdivididos em trs diferentes gentipos: 1 (BoHV-1.1), 2a (BoHV1.2a) e 2b (BoHV-1.2b). Esta subdiviso em gentipos foi proposta com base em caractersticas genmicas e antignicas. Entretanto, associaes de determinados gentipos com certos quadros clnicos foram tambm evidenciadas. Assim, o BoHV-1.1 refere-se s amostras clssicas de vrus geralmente associadas com a doena respiratria (IBR). Esse subtipo tem sido freqentemente isolado de casos de IBR, assim como de abortos, sendo prevalente em muitos pases na Europa e nas Amricas. O BoHV-1.2a tem sido associado a uma ampla variedade de manifestaes clnicas, incluindo doena do trato genital (IPV e IPB), abortos e tambm infeces no trato respiratrio. O BoHV-1.2a tem prevalncia aparentemente elevada no Brasil, sendo o subtipo mais freqentemente isolado nos laboratrios de diagnstico virolgico. Esse subtipo estava presente na Europa antes da dcada de 1970 e, aps, tornou-se raro naquele continente. O BoHV-1.2b, por sua vez, tem sido associado com doena respiratria leve e IPV/IPB, mas at o presente no foi associado com abortos. Por isso, amostras do subtipo 2b so consideradas menos patognicas do que as amostras do subtipo 1. Os vrus do subtipo BoHV-.2b tm sido freqentemente isolados na Austrlia e Europa, mas so incomuns no Brasil, onde, at o presente, somente uma amostra desse subtipo foi identicada. Os isolados dos diferentes subtipos apresentam extensa reatividade sorolgica cruzada, que pode ser evidenciada por testes de soroneutralizao (SN). Nesses testes, o anti-soro produzido contra o vrus de um subtipo reage em ttulos semelhantes ou iguais tanto contra o vrus homlogo como contra o vrus heterlogo.
O vrus causador da IBR foi isolado pela primeira vez nos Estados Unidos em 1956. A partir de ento, inmeros estudos tm revelado a sua ampla distribuio em praticamente todo o mundo. Alguns pases europeus, como a Dinamarca e a Finlndia, conseguiram erradicar a infeco, tendo obtido essa condio por meio da identicao e eliminao de animais soropositivos. Outros pases, como a Alemanha e Sua, tm implementado programas de erradicao do BoHV-1 por meio da vacinao compulsria dos rebanhos, identicao e eliminao gradual dos animais portadores. No Brasil, o BoHV-1 foi isolado, pela primeira vez, de um caso de vulvovaginite na Bahia, em 1978. Vrios relatos posteriores conrmaram a ampla distribuio do vrus no pas, tanto pelo isolamento viral quanto pela deteco de anticorpos. Dados sobre prevalncia de infeces pelo BoHV-1 demonstram variaes entre 8 e 82% em vrias regies do pas. provvel que exista atualmente, no Brasil, uma parcela muito pequena de rebanhos livres do BoHV-1 (ou BoHV-5, como ser comentado a seguir). Estima-se, ainda, que o nvel mdio de prevalncia da infeco nos rebanhos situe-se entre 30 a 70%. Para uma populao bovina de aproximadamente 190 milhes de cabeas, pode-se estimar uma populao potencialmente infectada de 57 a 133 milhes de cabeas. As infeces pelo BoHV-1 podem ser transmitidas pelo contato direto e indireto entre animais, porque o vrus disseminado atravs de secrees respiratrias, oculares e genitais, sendo excretado em grandes quantidades por animais durante a infeco aguda. Nessa fase, os animais excretam o vrus por at 15-16 dias em ttulos de at 107 TCID50/ml. Em casos de reativao da infeco latente, a excreo de vrus ocorre por um perodo menor (2 a 7 dias, geralmente) e em menores quantidades. No obstante, a excreo viral que ocorre durante a reativao representa uma importante forma de transmisso e perpetuao do vrus na natureza. Por isso, os animais latente-
Herpesviridae
449
mente infectados so fontes potenciais de infeco para outros animais. As causas dos episdios de reativao permanecem parcialmente desconhecidas. No entanto, alguns fatores desencadeantes so notrios, como o estresse (p. ex.: induzido por transporte, desmame, descorne, parto, carncias nutricionais graves ou excesso de trabalho) e aplicao de drogas imunossupressoras (p. ex.: corticosterides). O vrus pode, ainda, estar presente no smen de touros infectados, podendo ser disseminado tanto por monta natural como por inseminao articial. A excreo pode ocorrer durante a infeco aguda ou nos episdios de reativao. A dose infecciosa mnima necessria para infectar uma fmea foi calculada em torno 102 TCID50. O smen contaminado durante a ejaculao, e o vrus no excretado de forma uniforme ou contnua por machos soropositivos. Logo, nem todas as amostras de smen de um touro portador tero vrus sucientes para infectar uma fmea. Entretanto, todos os touros soropositivos devem ser considerados potenciais transmissores da infeco a fmeas susceptveis. Alm do smen, o vrus tem sido eventualmente detectado no leite de vacas, chamando a ateno para mais este possvel veculo de transmisso. Apesar de os bovinos serem os principais reservatrios do BoHV-1, inquritos sorolgicos tm demonstrado a presena de anticorpos em diversas espcies de ruminantes silvestres, ovinos e caprinos. Alm disso, ovinos e caprinos desenvolvem infeces agudas e latentes e so potencialmente capazes de excretar vrus quando submetidos imunossupresso pela administrao de corticosterides. Alm das espcies domsticas citadas, bubalinos tambm so considerados como potenciais reservatrios do BoHV-1. Entretanto, a sua importncia na epidemiologia dos herpesvrus bovinos permanece desconhecida e merece ser investigada.
meiros sinais clnicos da infeco (congesto local, presena de secrees, leses vesiculares ou erosivas). Durante essa fase, altos ttulos virais so produzidos e excretados nas secrees, o que favorece a transmisso do vrus para outros animais. Aps a replicao inicial, o vrus invade as terminaes nervosas de neurnios sensoriais e transportado atravs de uxo axnico retrgrado at os corpos neuronais nos gnglios regionais. Nesses locais, o vrus estabelece infeco latente, durante a qual no h expresso de antgenos virais ou replicao. Existem tambm evidncias de que, aps a infeco primria, o vrus possa realizar uma viremia, provavelmente associada a moncitos e linfcitos, atravs da qual o vrus poderia disseminar-se no organismo animal e causar infeces fetais e abortos. Eventualmente, sob a inuncia de fatores externos, como estresse ou tratamento com glicocorticides, pode ocorrer a reativao da infeco latente, ocasio em que ocorre a produo de partculas virais infecciosas nas clulas nervosas e o transporte dessas partculas de volta ao stio de infeco primria. Nesses stios, o vrus replica e excretado em secrees, podendo ser transmitido para outros animais. A reativao da infeco latente pode, ocasionalmente, ser acompanhada de sinais clnicos geralmente moderados.
Rinotraquete infecciosa bovina

A infeco respiratria pode apresentar-se de forma subclnica, leve ou severa, podendo resultar em morbidade de at 100%, com mortalidade geralmente ausente ou baixa (<5%). As manifestaes clnicas incluem febre, depresso, anorexia, dispnia, taquipnia, tosse e descargas nasais serosas, que podem tornar-se mucopurulentas com a progresso da enfermidade e a ocorrncia de infeces bacterianas secundrias. A inamao local pode levar ao bloqueio das vias respiratrias superiores. Pela diculdade respiratria, os animais tendem a forar a respirao pela boca, levando salivao abundante. A mucosa nasal pode se apresentar hipermica e com leses vesiculares a erosivas. As eroses podem ser transitoriamente recobertas com membranas brinosas. Em animais em lactao, ocorre que-

Aps a penetrao na mucosa nasofarngea ou genital, o vrus realiza uma replicao primria nas clulas epiteliais locais, provocando lise celular e levando ao aparecimento dos pri-
450
Captulo 17
da na produo de leite. Em machos, pode haver prejuzos temporrios qualidade do smen, como anomalias morfolgicas e funcionais dos espermatozides. O curso da enfermidade rpido, e a recuperao clnica ocorre em at dez dias, caso no ocorram infeces bacterianas secundrias graves ou outras infeces virais associadas. Os animais afetados podem, ainda, apresentar conjuntivite uni ou bilateral que, em algumas circunstncias, pode ser a nica manifestao clnica da infeco. Surtos de IBR so mais freqentemente observados em animais jovens e esto geralmente associados com situaes de estresse e aglomerao de animais, incluindo eventos de transporte e connamento. Outros agentes virais e bacterianos podem estar associados com o BoHV-1 nesses episdios de doena respiratria, genericamente chamados de complexo respiratrio de bovinos. Os agentes virais freqentemente associados so o vrus da diarria viral bovina (BVDV), vrus da parainuenza 3 (bPI-3V) e o vrus respiratrio sincicial (BRSV), alm de pasteurelas. A infeco de fmeas soronegativas gestantes, com amostras virais de alta virulncia (BoHV1.1 ou 1.2a), pode resultar em abortos, que ocorrem principalmente entre o quinto e oitavo ms da gestao. Os abortos ocorrem geralmente aps um perodo de incubao de trs a seis semanas, durante o qual o vrus alcana o feto durante a viremia. At 25% das fmeas em gestao de um rebanho podem abortar durante um surto, constituindo-se em uma importante causa de perdas econmicas nas criaes de bovinos.
na mucosa. As vesculas evoluem para pstulas, que podem coalescer e formar lceras. As lceras freqentemente cam recobertas com material brinoso, de colorao branco-amarelada. Febre, anorexia e depresso podem estar presentes e podem ser agravadas por infeces bacterianas secundrias. Os animais apresentam dor ao urinar, apresentando a cauda erguida e freqentemente exionada lateralmente. As leses progridem at o 7-8 dia ps-infeco, regredindo rapidamente a partir de ento. Em reprodutores machos infectados com o BoHV-1, as leses desenvolvidas so semelhantes s descritas nas fmeas. Aps um perodo de um a trs dias de incubao, a mucosa do pnis e/ou prepcio apresenta-se hipermica e com pequenos pontos amarelados, que crescem e, eventualmente, coalescem, formando vesculas ou pstulas que, posteriormente, rompem-se, formando eroses ou ulceraes. Essas leses cam recobertas por material brinoso que pode recobrir extensas reas da mucosa. Em casos graves, hemorragias podem ocorrer na mucosa peniana. Durante a fase aguda, o animal se recusa a montar, freqentemente exterioriza o pnis e apresenta corrimento prepucial. A enfermidade geralmente regride rapidamente aps os dias 78 ps-infeco e, no havendo complicaes, o animal apresenta cura clnica ao redor dos dias 10-14 pi. Em infeces naturais, o quadro clnico pode ser mais brando, com evoluo mais rpida e sem complicaes clnicas. Formas subclnicas da infeco genital tambm podem ocorrer, o que diculta o diagnstico e o controle da infeco.
Vulvovaginite pustular/balanopostite pustular

A maioria das infeces genitais por herpesvrus em bovinos esto associadas com amostras de BoHV-1.2b. A IPV aguda se desenvolve aps a infeco do trato genital da fmea durante a cobertura ou inseminao articial. Pode, ainda, ocorrer por contato da mucosa com secrees contaminadas com o vrus. Aps um curto perodo de incubao (1 a 3 dias), a vulva se apresenta hipermica, edemaciada e com vesculas distribudas
6.1.1.3 Diagnstico
O diagnstico presuntivo da infeco por herpesvrus bovinos feito com base no histrico da propriedade, sinais clnicos e leses observadas ao exame clnico. A suspeita clnico-patolgica, no entanto, deve ser conrmada por exames laboratoriais. Durante infeces agudas, devem ser realizados testes para a deteco de vrus, antgenos ou DNA viral em amostras clnicas. As amostras geralmente utilizadas para a deteco de vrus so: suabes nasais e oculares, vaginais, de prepcio ou coletadas das reas com leses
Herpesviridae
451
evidentes; tecidos (traquia, pulmes) e fetos inteiros ou tecidos de fetos abortados (pulmes, fgado e rins). As amostras devem ser remetidas em gelo com a maior brevidade possvel. No recomendado congelar as amostras a -20C, pois esta temperatura pode inativar o vrus.
sena do DNA viral nos stios de latncia pode ser o nico e mais seguro indicativo da infeco.
Diagnstico sorolgico
Caso no tenha sido possvel obter amostras de tecidos ou secrees na fase aguda, a infeco pode ser diagnosticada por meio de testes sorolgicos. Para tal, devem-se realizar duas coletas de soro: a primeira durante a fase aguda e a segunda trs a quatro semanas aps. Um aumento de quatro vezes no ttulo de anticorpos entre as duas coletas indicativo da infeco e pode conrmar o diagnstico. Em fmeas em reproduo, conveniente fazer uma coleta de soro antes da gestao e manter a amostra congelada. Se houver qualquer problema reprodutivo de natureza infecciosa suspeita, uma nova coleta, aps o surgimento do problema (p. ex.: aborto), deve ser realizada, sendo ambas as amostras remetidas ao laboratrio. Por outro lado, a deteco de anticorpos no soro, em um teste isolado, indica somente que o animal teve contato prvio com o agente, seja por infeco natural (ou seja, potencial portador) ou por vacinao. Portanto, a deteco de anticorpos em uma amostra isolada de soro possui signicado limitado quando o objetivo diagnosticar um evento de doena clnica. As tcnicas sorolgicas mais utilizadas para o diagnstico sorolgico do BoHV-1 so o ELISA e a soro-neutralizao (SN). importante ressaltar que esses testes no so capazes de diferenciar os anticorpos produzidos contra o BoHV-1 daqueles produzidos contra o BoHV-5. Alm do seu uso como suporte investigao clnica, esses testes tm sido amplamente utilizados em inquritos epidemiolgicos, certicao de rebanhos e triagem de reprodutores destinados coleta e comercializao de smen. importante enfatizar que a deteco de anticorpos contra o BoHV-1 com exceo de anticorpos induzidos por vacinao indicativa da condio de portador. A Tabela 17.2 apresenta um resumo das manifestaes clnicas associadas com os herpesvrus bovinos, o material a ser enviado para o laboratrio e as tcnicas de diagnstico utilizadas.
Diagnstico virolgico
Um diagnstico rpido pode ser realizado por imunouorescncia (IFA) com anticorpos especcos, em cortes ou impresses de tecidos ou, ainda, em esfregaos de secrees. Nesses casos, o resultado pode ser obtido dentro de uma a duas horas. Usualmente, alm da IFA, suspenses de tecidos ou secrees so preparadas e inoculadas em cultivos celulares, visando ao isolamento do agente. Este o procedimento padro de diagnstico virolgico para o BoHV-1. Tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 produzem um efeito citoptico (ECP) bastante evidente em vrios tipos de clulas, incluindo cultivos primrios e linhagens estabelecidas. Via de regra, os cultivos primrios so mais sensveis para o isolamento viral do que linhagens contnuas. Entretanto, em razo de maior praticidade, clulas de linhagem (p. ex.: clulas da linhagem de rim de bovino, MDBK) so as mais utilizadas para o isolamento viral. O BoHV-1 e BoHV-5 geralmente causam ECP visvel entre 24 e 72 horas aps a inoculao. Em alguns casos, quando a concentrao de vrus no material original muito baixa, pode ser necessrio fazer mais de uma passagem do material inoculado. Raramente so necessrias mais do que duas ou trs passagens. Ao nal da terceira passagem, caso no haja evidncia de ECP, o material considerado negativo para vrus. Se houver ECP compatvel com herpesvrus, a identidade do agente deve ser conrmada por IFA ou imunoperoxidase (IPX), utilizando-se conjugados ou anticorpos monoclonais apropriados. A deteco de DNA viral em amostras clnicas por PCR tambm pode ser utilizada, apresentando as vantagens de rapidez, especicidade e sensibilidade. Esta tcnica, no entanto, tem aplicao restrita para o diagnstico de infeces agudas pelo BoHV-1. Possui aplicao importante na deteco da infeco latente, quando a pre-
452
Captulo 17
Tabela 17.2. Manifestaes clnicas, material a ser coletado e tcnicas utilizadas para o diagnstico das principais herpesviroses de bovinos
Manifestao
Doena respiratria
Agente provvel
BoHV - 1.1
Material/diagnstico
Secrees nasais
Diagnstico laboratorial
1. Isolamento 2. Imunofluorescncia (IFA) de clulas descamativas 3. PCR 1. Isolamento 2. Imunoistoqumica (IHC) 3. Histopatologia 1.Pesquisa de anticorpos (ELISA, SN)
Tecidos (pulmo, traquia)
Soro pareado
Aborto
BoHV - 1.1
Tecidos fetais (timo, bao, pulmo, traquia, crebro), placenta
1. Isolamento 2. PCR 3. IHC 4. Histopatologia Pesquisa de anticorpos 1. Isolamento 2. PCR Pesquisa de anticorpos 1. Isolamento 2. PCR Pesquisa de anticorpos 1. Isolamento 2. Microscopia eletrnica 3. IFA Pesquisa de anticorpos
Soro da vaca
Vulvovaginite
BoHV - 1.2
Secrees vaginais, lquido de vesculas Soro pareado
Balanopostite
BoHV - 1.2
Smen, secrees prepuciais Soro pareado
Mamilite Doena vesicular ou crostosa generalizada (PLSD) Doena neurolgica
BoHV - 2
Lquido folicular, crostas Soro pareado
BoHV - 5
Secrees nasais, crebro
1. Isolamento 2. IFA 3. IHC 4. PCR 5. Histopatologia Pesquisa de anticorpos
Soro pareado

As medidas de controle em relao ao BoHV-1 devem ser relacionadas com a severidade da infeco no rebanho, prticas de manejo e com a prevalncia da infeco. Em geral, podemse adotar duas principais estratgias de controle, de acordo com a situao epidemiolgica e histrico clnico dos rebanhos: controle com ou sem vacinao. Rebanhos com histrico comprovado da infeco, com sorologia elevada, sistemas de
recria e connamento que agregam novilhos de vrias procedncias, alm de propriedades com alta rotatividade de animais (compra-vendatransporte etc.) so recomendados a implementar a vacinao. Nessas situaes, a vacinao contnua e regular pode reduzir a circulao de vrus e a ocorrncia de doena clnica, reduzindo, conseqentemente, as perdas econmicas. Rebanhos de baixo risco, sem histrico da enfermidade/infeco ou sem sorologia positiva devem ser encorajados a implementar medidas de biossegurana para evitar a introduo da in-
Herpesviridae
453
feco. Nesses casos, o simples teste (e descarte) de qualquer animal a ser anexado ao rebanho, aliado com testes sorolgicos peridicos e descarte de eventuais positivos, geralmente so mtodos efetivos. Recomenda-se testar reprodutores a serem anexados aos rebanhos e, no caso de serem positivos, deve-se evitar a sua introduo. Rebanhos com sorologia alta, mas sem histrico clnico de doena respiratria ou genital, e sem problemas reprodutivos (retorno ao cio, infertilidade) podem ser mantidos sem vacinao, porm com monitoramento contnuo dos parmetros produtivos e clnicos. Alm do uso de vacinas, outras medidas de controle incluem o teste de smen e reprodutores, o uso de smen e embries livres de BoHV-1, bem como o monitoramento sorolgico peridico dos rebanhos. Centrais de coleta de smen deveriam de maneira ideal manter somente animais sorologicamente negativos para o BHV-1. No entanto, a freqente identicao de animais geneticamente superiores como soropositivos exige estratgias alternativas para que se possa utilizar o potencial gentico sem o risco de disseminao da infeco. Nesses casos, o manejo separado desses animais e o teste de todos os ejaculados para assegurar-se da ausncia do vrus so as medidas indicadas. Vacinas convencionais atenuadas ou inativadas tm sido utilizadas para controlar a disseminao do vrus e reduzir a severidade da doena clnica e as conseqentes perdas associadas ao BoHV-1. Vacinas com vrus vivo modicado tm sido produzidas por passagens mltiplas em cultivo celular ou por mutagnese induzida para produzir mutantes temperatura-sensveis (TS). Vacinas tradicionais, com vrus vivo modicado de administrao parenteral, oferecem risco de infeco fetal e abortamentos. Nesse sentido, a maior vantagem das vacinas intranasais TS a induo de imunidade local e mais rpida, aparentemente sem o risco de infeco fetal. Vacinas inativadas tm sido utilizadas principalmente em fmeas prenhes pelo fato de as vacinas vivas representarem um risco potencial
ao feto. Uma das maiores desvantagens dessas vacinas a necessidade de se associar adjuvantes para a obteno de uma resposta adequada. Alm disso, a magnitude e durao da imunidade conferida por essas vacinas so inferiores s vacinas vivas modicadas, o que exige revacinaes freqentes que aumentam o custo nal. As vacinas, se adequadamente administradas, podem conferir proteo adequada contra a enfermidade respiratria; sendo questionveis, entretanto, na proteo contra a doena genital e abortos. Vacinas com vrus vivo modicado representam riscos potenciais para fmeas gestantes. Nos casos em que a vacinao recomendada, indica-se a manuteno de um alto nvel imunitrio atravs de vacinaes peridicas e sistemticas. As vacinas atuais tambm so incapazes de proteger contra o estabelecimento de latncia com vrus de campo, ou seja, os animais vacinados podem se tornar latentemente infectados se forem posteriormente infectados. Embora utilizadas com relativo sucesso na preveno da enfermidade clnica e na reduo da circulao de vrus na populao, as vacinas tradicionais contra o BoHV-1 tm se mostrado incompatveis com programas de erradicao. Com isso, surgiu a necessidade de se elaborar vacinas que permitissem a diferenciao de animais infectados (portadores da infeco latente) dos animais vacinados. Para suprir essa necessidade, surgiram as vacinas com marcadores antignicos as vacinas diferenciais. Essas vacinas baseiamse na utilizao de um vrus vivo atenuado, contendo uma ou mais delees em genes que codicam protenas no-essenciais. O uso desse vrus como vacina, associado a um teste sorolgico que detecta anticorpos contra a protena deletada, permite a distino sorolgica entre animais infectados e vacinados (Figura 17.8). Essa estratgia tem se constitudo na base de programas de controle e erradicao do BoHV-1 em vrios pases europeus. Vacinas com essas caractersticas esto em fase de desenvolvimento no Brasil e devem estar disponveis comercialmente em um futuro prximo.
454
Captulo 17
A forma generalizada a PLSD afeta a pele de todo o corpo, principalmente da cabea, dorso e perneo. O BoHV-2 um tpico alfaherpesvrus. Os vrions possuem envelope e contm uma molcula de DNA de ta dupla como genoma. O genoma apresenta um alto grau de homologia com o vrus do herpes simplex humano (HHV-1 ou HSV). O BoHV-2 classicado na subfamlia Alphaherpesvirus, gnero Simplexvirus, do qual o HSV-1 o prottipo. Os isolados de campo do BoHV-2 apresentam uma grande similaridade gentica e antignica entre si. Alguns aspectos da organizao e seqncia do genoma tm sido muito estudados em razo deste vrus compartilhar vrios determinantes antignicos com uma srie de protenas codicadas pelo HSV-1 e HSV2. Pela sua semelhana com esses vrus, especula-se que a provvel origem do BoHV-2 seja de primatas e no de animais biungulados.
A infeco e doena associadas ao BoHV-2 j foram descritas em vrios pases e possuem alguma importncia econmica, principalmente em gado leiteiro. A ocorrncia de mamilite mesmo de carter transitrio pode resultar em perdas importantes devido reduo da produo de leite e ocorrncia de mastites. A enfermidade foi descrita no Brasil nas dcadas de 1970 e 1980. Um estudo sorolgico, realizado, em 2007, em duas importantes bacias leiteiras dos estados do Rio Grande do Sul e Paran, revelou uma soroprevalncia prxima a 30% em vacas em produo. Esses dados conrmam a presena e disseminao do vrus no rebanho brasileiro e corroboram observaes de campo que revelam a ocorrncia relativamente freqente de doena clinicamente compatvel com a causada pelo BoHV-2. A grande maioria dos casos que ocorrem a campo, no entanto, no diagnosticada em nvel laboratorial. A doena tambm j foi descrita em diversos pases, incluindo o Knia, EUA, Austrlia, Reino Unido, Itlia e Japo. As formas generalizada ou localizada da doena tm sido relatadas em diferentes reas geogrcas. As infeces generalizadas de pele

O herpesvrus bovino tipo 2 (BoHV-2) o agente da mamilite herptica, doena que possui repercusso sanitria em gado leiteiro, principalmente em regies de clima temperado. A mamilite herptica (BHM) a forma localizada da enfermidade, caracterizada por leses nos tetos e no bere. Em alguns casos, a doena se manifesta de forma generalizada, porm menos freqente, chamada de pseudo lumpy skin disease (PLSD).
Herpesviridae
455
tendem a ocorrer em reas tropicais e subtropicais, onde, possivelmente, espcies de ruminantes selvagens podem ser reservatrios do agente. Anticorpos neutralizantes contra o BoHV-2 j foram detectados em elefantes, bfalos e ruminantes selvagens. A BHM mais comum em gado leiteiro e em gado de corte submetido explorao intensiva e sob condio de estresse. Vacas de primeira cria geralmente desenvolvem leses mais severas e abundantes, que so registradas mais comumente durante o outono, quando a temperatura ambiental diminui. De fato, os relatos da enfermidade tm sido mais freqentes em regies que apresentam temperaturas baixas. O trauma fsico pode ser um fator importante na patogenia das leses pelo BoHV-2 e postula-se que as freqentes rachaduras da pele das tetas que ocorrem durante o outono poderiam, ao menos parcialmente, explicar essa ocorrncia estacional das leses. Aliado a esse fator, o edema siolgico do bere e tetas pode contribuir para o desenvolvimento das leses. A doena pode disseminar-se rapidamente entre os animais durante o outono e inverno. A forma de transmisso do vrus ainda no foi bem esclarecida, mas, provavelmente, ocorra por contato direto ou indireto, atravs de uidos vesiculares e crostas contaminadas. A transmisso por meio de equipamentos de ordenha tem sido investigada, mas no h resultados conclusivos. A participao do ordenhador ou de insetos como vetores para a transmisso mecnica tem sido considerada, embora no tenha sido conrmada experimentalmente. Na fase aguda, o vrus pode ser transmitido aos bezerros durante a mamada, e estes animais podem desenvolver leses vesiculares no focinho ou nas comissuras labiais. O BoHV-2, provavelmente, estabelea infeco latente aps a infeco aguda. Essa hiptese reforada pelo desenvolvimento freqente de leses nas tetas imediatamente aps o parto, sem fontes externas de infeco. As alteraes siolgicas, que ocorrem prximo e durante o parto, promoveriam o estmulo para reativao natural. No entanto, a biologia da infeco latente por esse vrus necessita ser mais bem investigada.

A presena de leses na pele (abrases e escaricaes) provavelmente facilite a instalao da infeco. Aps a penetrao, o vrus replica nas camadas mais profundas da epiderme e na derme, onde a replicao viral produz clulas gigantes multinucleadas. O perodo de incubao, aps inoculao experimental, varia entre quatro e nove dias. Os sinais iniciais se caracterizam por regies hipermicas circulares ou irregulares, geralmente com bordas bem denidas, na pele das tetas e do bere. A hiperemia seguida de edemaciao, e essas reas se apresentam salientes sobre a superfcie da pele. As vesculas nem sempre so observadas, pois se rompem rapidamente e do lugar a ulceraes superciais bem denidas de pele, com rpida formao de crostas. As bordas das feridas so bem denidas e necrticas. Em casos naturais, a leso tpica associada com a mamilite herptica caracteriza-se por uma depresso central na superfcie dos ndulos, necrose supercial da epiderme e um perodo curto de evoluo. As leses so encontradas principalmente nas tetas, mas podem disseminar-se pelo bere e regio perineal. Os tetos infectados apresentam-se inicialmente edematosos e doloridos. A doena autolimitante, e as leses no complicadas regridem rapidamente. A mastite a seqela mais comum, particularmente se a extremidade dos tetos est envolvida. Quando as leses so difundidas ou complicadas por mastite ou, ainda, por infeces secundrias graves, a cicatrizao retardada. Em rebanhos afetados em surtos naturais, a taxa de morbidade pode variar entre 18 e 90% e, embora a mortalidade seja baixa, as perdas devido doena podem ser graves. As perdas se devem incidncia maior de mastite, reduo na produo de leite em at 20%, descarte de algumas vacas por mamite grave, lceras intratveis e interferncia com os procedimentos de ordenha. A mamilite clnica pode ser reproduzida pela inoculao intradrmica ou cutnea do vrus nas tetas aps escaricao da pele. A doena cli-
456
Captulo 17
nicamente indistinguvel da infeco natural foi reproduzida pela inoculao do vrus em ovelhas lactantes. O vrus foi inoculado pela via cutnea aps a produo de abrases na pele. A forma cutnea da infeco (PLSD) apresenta ocorrncia mais rara e caracterizada por aparecimento sbito, com a formao de ndulos rmes, circulares e elevados distribudos na pele. Os ndulos desenvolvem um aspecto caracterstico: superfcie plana com centro ligeiramente deprimido. Essas leses podem ocorrer em qualquer parte do corpo, mas usualmente so mais prevalentes na cabea, pescoo, dorso e perneo. Depois de duas semanas, as leses secam e, em duas a quatro semanas, desprendem-se do corpo do animal, levando consigo a superfcie da pele e plos, os quais se reconstituem em poucos dias.
6.1.2.3 Diagnstico
A ocorrncia de mamilite vesicular ou crostosa em vacas leiteiras deve ter a sua etiologia investigada, pois outros agentes virais podem tambm estar envolvidos. Outras enfermidades de pele podem se manifestar de forma semelhante mamilite herptica bovina. Dentre essas, podem ser citadas: urticria, picadas de inseto, infeces pelos vrus do Pseudocowpox e Vaccinia. Estas ltimas so comuns no Brasil, principalmente na regio Sudeste. Por isso, o diagnstico clnicoepidemiolgico deve ser, sempre que possvel, acompanhado de comprovao virolgica e/ou sorolgica (ver Tabela 17.2). Para o diagnstico laboratorial da infeco pelo BoHV-2, so indicadas amostras de uido vesicular, crostas e soro sangneo coletados durante a fase aguda da doena. As chances de isolamento so maiores quando o lquido vesicular coletado antes da ruptura das vesculas. Em amostras coletadas das vesculas rompidas h algumas horas ou de leses crostosas, dicilmente se consegue isolar o agente. Por isso, recomendase a coleta de uido de vesculas ntegras, com o auxlio de seringas com agulhas nas. Alternativamente, o material pode ser coletado com suabes. Para o sucesso do isolamento, a temperatura
de conservao do material (4C) tambm crtica. reas de leses podem ser incisadas e xadas em formol 10% e enviadas para diagnstico histolgico ou microscopia eletrnica. As margens das leses podem ser dissecadas, colocadas em meio essencial mnimo e enviadas para serem submetidas a exames virolgicos. O contedo de partculas do vrus pode ser muito alto no uido de vesculas frescas, o que caracterstico de viroses vesiculares. O vrus presente pode ser propagado facilmente em cultivos celulares primrios, assim como em linhas celulares j estabelecidas. Clulas primrias de bovinos e clulas de linhagem de rim bovino (MDBK) so indicadas para o isolamento e cultivo do vrus. Deve-se ressaltar que, quando a suspeita etiolgica for BoHV-2, os cultivos devem ser incubados a 32C, pois o vrus no replica bem a 37C. Nas clulas de cultivo, o vrus produz ECP, caracterizado pela formao de massas celulares multinucleadas (sinccios) que aumentam em nmero e dimetro medida que se prolonga a incubao. Aps poucos dias, os sinccios tornam-se conuentes, estendendo-se por todo o tapete celular, que acaba por se desprender da superfcie dos frascos. Em estgios avanados, o vrus produz sinccios grandes, multinucleados, com incluses eosinoflicas intranucleares. A identicao do BoHV-2 isolado em cultivos celulares embora o ECP seja caracterstico e inconfundvel com outros vrus pode ser feito por SN com soro hiperimune ou por IFA. O BoHV-2 pode tambm ser identicado por ME aps colorao negativa. A ME pode ser realizada em uido vesicular obtido de leses frescas ou em fragmentos de pele obtidos por bipsia. Alm disso, um diagnstico rpido pode ser realizado pela colorao de Giemsa em microscopia tica, com material obtido por bipsia da periferia das leses vesiculares recentes. Esse mtodo permite a visualizao de incluses intranucleares. O diagnstico sorolgico de infeces por BoHV-2 pode ser realizado por SN ou ELISA em soros pareados. A sorologia tem aplicao quando se deseja detectar os portadores em uma populao de bovinos, uma vez que a condio de soropositivo indica a infeco latente.
Herpesviridae
457

Experimentos utilizando vacinas inativadas e atenuadas do BoHV-2 falharam em demonstrar proteo contra a doena clnica. No entanto, inoculaes parenterais, com isolados de campo, produzem leses locais sem excreo do vrus e conferem uma imunidade slida e duradoura. Existem protocolos descrevendo esses processos de imunizao, utilizando material vesicular recente ou mesmo de vrus propagado no laboratrio. No entanto, h risco da perpetuao do vrus pelo estabelecimento de infeces latentes em rebanhos nos quais esse mtodo utilizado. Atualmente, no existem vacinas comerciais disponveis contra o BoHV-2. Os mtodos de prolaxia devem incluir medidas higinicas da sala de ordenha e equipamentos, alm do combate a insetos, possveis vetores transmissores do agente. Outra medida proltica importante evitar a entrada de animais estranhos e realizao de quarentena para animais introduzidos no rebanho. Uma vez instalada a infeco no animal, pode-se utilizar antibioticoterapia tpica, reduzindo, assim, as infeces bacterianas secundrias nas leses. Para a desinfeco de ambientes e equipamentos, os desinfetantes base de iodforos parecem ser mais ecientes do que solues base de hipoclorito de sdio. A utilizao de agentes antivirais para tratamento de infeces por herpesvrus humanos estimulou pesquisas para investigar a ecincia destes sobre a replicao do BoHV-2. Alguns desses produtos podem ser promissores no tratamento dessas infeces, principalmente a vidarabina, que se mostrou mais eciente do que o aciclovir.
de 1,5 a 3 kb nas extremidades. Com base em anlise de restrio genmica, os isolados de campo podem ser divididos em dois grupos: o grupo da cepa DN-599, que abrange os isolados norteamericanos; e o grupo Movar 33/63, que abriga os isolados europeus. Alguns isolados europeus e asiticos no se enquadram em nenhum desses grupos. Os padres de clivagem enzimtica do genoma do BoHV-4 diferem marcadamente dos outros herpesvrus de bovinos. Os isolados de campo caracterizados at o presente no apresentam grande diversidade antignica e, aparentemente, pertencem ao mesmo sorotipo. Apenas diferenas discretas podem ser detectadas com o uso de alguns anticorpos monoclonais (AcMs). O BoHV-4 no apresenta relao antignica com os outros herpesvrus de bovinos. A replicao do BoHV-4 em cutivos celulares lenta e pouco eciente, parecendo depender de clulas em diviso. Alm de clulas bovinas, o vrus replica em determinadas clulas de origem humana.
A infeco pelo BoHV-4 parece estar amplamente distribuda na populao bovina, embora o nmero de estudos sorolgicos seja restrito. At o presente, a infeco j foi diagnosticada na Amrica do Norte, Europa e em alguns pases africanos e asiticos. Em alguns locais da frica, a soroprevalncia atinge 70% dos bovinos amostrados, enquanto na Blgica foram observados ndices de 15 a 30% e na Alemanha, de 18 a 38%. Alm de bovinos e ovinos, o vrus j foi isolado de gatos domsticos, o que constitui um achado incomum para os herpesvrus de ruminantes.

O herpesvrus bovino tipo 4 (BoHV-4) classicado na subfamlia Gammaherpesvirinae, juntamente com o vrus do Epstein-Barr (EBV) de humanos e o herpesvrus saimiri (SHV), com o qual apresenta grande similaridade. Alm da morfologia tpica dos herpesvrus, o BoHV-4 possui um genoma de 144-150 kb, que contm uma regio nica de 108 kb e aproximadamente 15 repeties
6.1.3.2. Patogenia, sinais clnicos e patologia

A patogenia da infeco pelo BoHV-4 muito pouco conhecida, sobretudo pela escassez de relatos de doena natural e pela diculdade de se reproduzir sinais clnicos pela inoculao experimental. A principal via natural de infeco pare-
458
Captulo 17
ce ser a oronasal, pela inspirao de aerossis ou por contato indireto com material contaminado. Foi tambm demonstrado que bezerros podem se infectar pela ingesto de leite contaminado. Aps a infeco, o vrus replica na mucosa respiratria superior e no epitlio intestinal, podendo infectar leuccitos e se disseminar sistemicamente para vrios rgos e tecidos. Dentre os tecidos infectados durante a infeco aguda, incluem-se principalmente a mucosa do trato respiratrio (nasal, traqueal e pulmonar) e o bao, com nveis inferiores de replicao nos linfonodos, rins, tonsilas e timo. Aps a infeco aguda, o BoHV-4 estabelece infeco latente em vrios stios, incluindo clulas mononucleares do bao e do sangue perifrico, alm do sistema nervoso. A persistncia do vrus em clulas da linhagem monoctica-macrofgica sugere que a infeco pode induzir efeitos imunossupressivos. A reativao da infeco pode ocorrer em situaes de estresse ou pode ser induzida pela administrao de dexametasona. Apesar de j ter sido isolado de bovinos com uma variedade de manifestaes clnicas, ainda hoje no existe um associao clara do BoHV-4 com determinada doena ou sndrome clnica. A reproduo experimental de doena em animais jovens ou adultos tambm no tem obtido sucesso. O vrus foi inicialmente isolado na Hungria, em 1963, de bezerros com doena respiratria e ceratoconjuntivite e, posteriormente, nos Estados Unidos, de uma novilha com sinais respiratrios. Posteriormente o agente foi isolado de animais com conjuntivite, infeco do trato respiratrio superior e pneumonia. Tambm foi identicado em animais com leses cutneas, dermatite mamria, enterite, metrite ps-parto e metrite crnica. A ocorrncia de abortos com a demonstrao do vrus no feto e em membranas fetais tambm j foi relatada. Existem relatos de associao do BoHV-4 com o BVDV em episdios de aborto. A inoculao experimental do BoHV-4 em vacas em diferentes fases da gestao resultou em morte de alguns fetos e abortamentos entre o terceiro e quarto meses de gestao. Mumicao e autlise fetal foram observadas em dois fetos. O vrus foi isolado de quatro dos 12 fetos abortados
ou mumicados/autolisados. Fetos inoculados aps o quarto ms nasceram vivos e saudveis. A associao do BoHV-4 com orquite, azoospermia e conjuntivite passageiras em touros tambm tem sido sugerida. Nesses casos, o vrus pode ser excretado pelo smen. A associao do BoHV-4 com qualquer das manifestaes mencionadas acima ainda questionvel, pois muitas tentativas de reproduo experimental da doena em bovinos e ovinos adultos falharam ou resultaram em sinais leves e inespeccos. Coelhos tm sido utilizados com relativo sucesso como modelo experimental para o BoHV-4, sobretudo para o estudo da patogenia da infeco reprodutiva.
6.1.3.3 Diagnstico e controle

O mtodo de eleio para o diagnstico o isolamento viral, embora o BoHV-4 seja de difcil replicao em cultivos celulares de rotina (p. ex.: MDBK). Infelizmente, poucos reagentes especcos so disponveis para a deteco de antgenos em tecidos e clulas. Para a deteco do BoHV-4 em tecidos e rgos, deve-se recorrer a tcnicas moleculares, como o Southern blot e PCR, pois seqncias genmicas esto disponveis em bancos de dados e permitem a elaborao de sondas e primers. Anticorpos contra o vrus podem ser detectados por imunodifuso em gar (IDGA), xao de complemento, imunouorescncia indireta (IFI) e ELISA. A infeco natural geralmente no induz nveis altos de anticorpos neutralizantes, razo pela qual a tcnica de SN no recomendada. No existem reagentes e kits diagnsticos comercialmente disponveis, o que indica a necessidade do desenvolvimento de reagentes para o diagnstico sorolgico dessa virose. No existe consenso sobre possveis medidas de controle a serem adotadas, em razo de que muito pouco conhecido sobre essa infeco. Tentativas de diagnstico de condies clnico-patolgicas compatveis com a infeco pelo BoHV-4 podem contribuir para um maior conhecimento sobre a infeco e possveis conseqncias clnico-patolgicas.
Herpesviridae
459

O herpesvrus bovino tipo 5 (BoHV-5) agente etiolgico da meningoencefalite ou encefalite herptica bovina, doena geralmente fatal que afeta principalmente animais jovens. O BoHV-5 muito semelhante ao BoHV-1 em diversos aspectos biolgicos, genticos e moleculares, de modo que a diferenciao desses dois vrus somente se tornou possvel h, aproximadamente, 20 anos, com o desenvolvimento de tcnicas moleculares. At ento, amostras de vrus atualmente reconhecidas como BoHV-5 eram consideradas subtipos do BoHV-1. Isso se dava em razo da grande similaridade entre os dois vrus, incluindo o efeito citoptico produzido em cultivos celulares e a reatividade cruzada em testes de IFA, para antgenos virais, e de SN e ELISA, para anticorpos. No entanto, as diferenas clnico-epidemiolgicas e moleculares existentes entre esses dois vrus justicaram a sua classicao como duas espcies virais distintas. Da mesma forma, alguns AcMs so capazes de distinguir entre BoHV-1 e BoHV-5, o que revela a existncia de diferenas antignicas entre esses vrus. Alm disso, embora a estrutura e organizao genmica sejam virtualmente idnticas e a homologia de nucleotdeos seja de aproximadamente 90%, a anlise enzimtica de restrio genmica e alguns protocolos de PCR podem diferenciar entre esses vrus. Ou seja, o BoHV-1 e BoHV-5 so muito semelhantes entre si em vrios aspectos, porm apresentam diferenas bem denidas que podem ser detectadas por mtodos especcos. Ainda hoje, a maioria dos testes sorolgicos e virolgicos so incapazes de distinguir esses dois agentes. Por isso, a histria natural do BoHV-5 ainda pouco conhecida. Pode-se especular que alguns estudos epidemiolgicos sobre o BoHV-1, realizados no passado, tenham confundido infeces causadas por esse vrus com aquelas causadas pelo BoHV-5. Assim, estudos adicionais so necessrios para poder se avaliar com preciso a verdadeira amplitude das infeces pelo BoHV-1 e BoHV-5 na populao bovina. O genoma do BoHV-5 (uma cepa brasileira, SV-507) foi recentemente seqenciado e possui 138.4 kb, enquanto o genoma do BoHV-1 possui
aproximadamente 137 kb. O genoma desses vrus codica mais de 70 produtos, entre os quais 10 a 12 glicoprotenas do envelope. Essas glicoprotenas desempenham importantes funes nas interaes entre os vrions e as clulas hospedeiras e se constituem em importantes alvos para anticorpos neutralizantes. Estudos clnico-patolgicos e virolgicos tm demonstrado que o BoHV-5 um importante agente de encefalite bovina no Brasil. Em um estudo que investigou as causas de encefalite nesta espcie (cerca de 10% do total de casos registrados), os herpesvrus foram superados em incidncia somente pela raiva. Como os herpesvrus isolados da maioria desses casos no foram tipicados, supe-se que o BoHV-5 seja o principal implicado, embora ocasionalmente o BoHV-1 tambm possa estar envolvido em infeces neurolgicas.
Em virtude da sua grande similaridade com o BoHV-1, a prevalncia e distribuio da infeco pelo BoHV-5, mundialmente, desconhecida. As infeces aparentes pelo BoHV-5 apresentam caractersticas epidemiolgicas peculiares, afetando animais jovens, com baixa morbidade e elevada mortalidade. Como nas infeces por outros herpesvrus, em funo da latncia e da ocorrncia de infeces subclnicas, a proporo de animais que desenvolve enfermidade clnica no um indicador apropriado do nmero de animais efetivamente infectados. Curiosamente, a infeco parece ser causa de morbidade e mortalidade importante somente em pases do Hemisfrio Sul, embora tenha sido descrita no Hemisfrio Norte h muito tempo. At 1993, somente duas amostras de BoHV-5 haviam sido isoladas nos EUA. A baixa ocorrncia de encefalites por herpesvrus em pases do Hemisfrio Norte, segundo alguns autores, poderia estar associada aos extensivos programas de vacinao contra o BoHV-1, cuja imunidade conferiria proteo tambm contra o BoHV-5. Na atualidade, no possvel precisar a real prevalncia e distribuio das infeces pelo BoHV-5, uma vez que no existem testes sorol-
460
Captulo 17
gicos capazes de diferenciar entre infeces por BoHV-5 ou BoHV-1. muito provvel que uma proporo ainda desconhecida dos animais identicados como positivos para o BoHV-1 tenham sido de fato infectados pelo BoHV-5. Tal prevalncia somente poder ser determinada a partir da disponibilidade de testes sorolgicos capazes de diferenciar infeces por BoHV-5 e BoHV-1. No obstante a diculdade de se determinar a prevalncia por testes sorolgicos, relatos clnico-patolgicos com ou sem conrmao virolgica tm conrmado a ampla e crescente disseminao do BoHV-5 em rebanhos brasileiros. No Rio Grande do Sul, o BoHV-5 tem sido freqentemente associado com surtos de meningoencefalite. Com base em evidncias clnicas (posteriormente conrmadas pelo isolamento do agente), a prevalncia da infeco nos estados do Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paran, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e So Paulo parece elevada. No entanto, impossvel precisar esses dados, uma vez que a infeco pode ocorrer sem manifestaes clnicas, sendo aparente somente aquela pequena proporo de casos em que os sinais so evidentes. Por essa razo, suspeita-se que a incidncia do BoHV-5 seja signicativamente maior do que os casos reportados. Alm da possvel da confuso com o BoHV-1, pela reatividade sorolgica cruzada, os sinais de comprometimento neurolgico semelhantes aos da raiva podem tambm conduzir a um diagnstico equivocado. Com ressalvas prevalncia e distribuio geogrca, a epidemiologia das infeces pelo BoHV-5 parece ser muito semelhante do BoHV1. Alm de bovinos, infeces naturais j foram demonstradas em ovinos e caprinos, embora o seu signicado epidemiolgico seja desconhecido. Experimentalmente, a infeco aguda e latente pelo BoHV-5 pode ser reproduzida em ovinos, caprinos e coelhos. Em infeces naturais e experimentais, o vrus excretado nas secrees nasais em altos ttulos e durante vrios dias (at 15-18 dias). Em surtos naturais, a disseminao do vrus entre aos animais parecer ser rpida, principalmente quando a densidade de animais elevada. Os surtos ocorrem geralmente associados com situaes de
estresse, ligadas ao desmame, transporte e mudana de alimentao. Esses surtos apresentam morbilidade varivel (1-10%) e letalidade elevada (prxima de 100%), ou seja, quase a totalidade dos animais que apresentam sinais neurolgicos evolui para o bito. A transmisso do BoHV-5 provavelmente ocorra de modo semelhante do BoHV-1, ou seja, por contato direto ou indireto entre animais. As secrees nasais representam o principal veculo para a transmisso do agente. A exemplo de outros herpesvrus, o BoHV-5 estabelece infeco latente em seus hospedeiros aps a infeco aguda, o que contribui para a sua persistncia na populao bovina. Essa infeco pode ser reativada pela administrao de corticides, simulando o que provavelmente ocorra em condies naturais. As reativaes naturais da infeco podem ser seguidas da recrudescncia clnica e inclusive levar morte, como sugerido pela ocorrncia de casos isolados de encefalite pelo BoHV-5 em animais adultos

A transmisso do vrus ocorre por contato direto ou indireto com animais ou secrees contaminadas. O vrus penetra pelo trato respiratrio superior e replica inicialmente na mucosa nasal, onde a replicao persiste por at mais de 15 dias. A replicao na mucosa nasal freqentemente associada com sinais respiratrios semelhantes aos observados nas infeces pelo BoHV-1, porm mais brandos. A seguir, o vrus invade os neurnios sensoriais regionais e transportado atravs do uxo axonal retrgrado para o gnglio responsvel pela inervao da regio (no caso das vias respiratrias, o gnglio trigmeo), onde atinge os corpos neuronais. Neste gnglio, o vrus pode estabelecer dois tipos de relao com o hospedeiro. No primeiro caso, o vrus estabelece uma infeco latente, durante a qual no h replicao viral ou expresso de antgenos virais. Nesse caso, o animal permanece portador da infeco, porm sem apresentar sinais clnicos evidentes. Esse , provavelmente, o resultado mais freqente das infeces pelo BoHV-5.
Herpesviridae
461
A segunda possibilidade que a replicao viral no gnglio trigmeo seja seguida do transporte do vrus para o encfalo, atingindo os neurnios de segunda ordem nos ncleos da ponte e bulbo. A partir desses stios, o vrus pode disseminar-se ao cerebelo e tlamo, alcanando subseqentemente o crtex cerebral. Experimentalmente, foi observado que o vrus pode se distribuir de forma heterognea pelas reas do encfalo. De sete bovinos inoculados com uma amostra de BoHV-5, quatro apresentaram o vrus disseminado em vrias regies do encfalo; dois deles apresentaram o vrus em determinadas regies (bulbo, ponte, mesencfalo e crtex olfatrio e frontal); enquanto outros dois continham o vrus somente no crtex olfatrio e frontal. Dois animais inoculados foram aparentemente capazes de erradicar a infeco, o vrus no foi detectado em tecidos aos 21 dias aps a infeco, apesar de ambos apresentarem leses de meningoencefalite no-supurativa. Estudos realizados em bovinos e coelhos infectados experimentalmente indicam que a via olfatria, pela qual o vrus atinge o crtex anterior atravs do sistema olfatrio, constitui-se na via principal de acesso ao sistema nervoso central (SNC) a partir da replicao primria na mucosa nasal. Em coelhos, a via olfatria fornece um transporte muito mais rpido e eciente do que a via trigeminal. De qualquer forma, a via trigeminal de transporte tambm importante, pois permite ao vrus atingir o local de estabelecimento de latncia. Existem evidncias de que as amostras de BoHV-5 apresentam diferentes nveis de neurovirulncia. Estudos em bovinos e coelhos revelaram variaes na neuroinvasividade (a capacidade do vrus de invadir, multiplicar e distribuir-se no SNC), assim como na neurovirulncia (capacidade do vrus de provocar leses no SNC). A doena neurolgica pelo BoHV-5 pode ocorrer em forma de surtos ou acometer em animais isolados. A enfermidade mais freqente em bezerros, sobretudo aqueles submetidos ao estresse da desmama e connamento. Os sinais observados em casos naturais so: depresso, andar cambaleante, bruxismo, protuso da lngua, salivao, exionamento do pescoo, opisttono,
cegueira, pressionamento da cabea contra anteparos, ataxia, decbito, convulses. Freqentemente esses sinais manifestam-se em crises, cujos espaamentos e intensidade intensicam-se gradativamente. Esses sinais nem sempre esto presentes em todos os casos e diferentes combinaes de sinais, com intensidades diferentes, tm sido relatados. Em alguns casos, uma depresso profunda o nico sinal evidente. Na grande maioria dos animais que apresenta sinais neurolgicos, a enfermidade progride para o bito, embora casos de recuperao aps sinais moderados tenham sido descritos. O curso clnico dura de poucas horas (8-12) a vrios dias e culmina com decbito, convulses e morte. Sinais respiratrios (hiperemia, corrimento nasal, diculdade respiratria) tm sido relatados tanto em infeces naturais como experimentais. Abortos tambm tm sido relatados em rebanhos acometidos de surtos de infeco neurolgica. Embora atualmente se acredite que a grande maioria dos casos de doena neurolgica historicamente atribudos ao BoHV-1 pela confuso em sua identicao tenham sido de fato causados pelo BoHV-5, alguns casos de doena neurolgica comprovadamente causados pelo BoHV-1 tambm j foram relatados. possvel tambm que o BoHV-5 possa produzir infeces genitais, pois o vrus j foi isolado de smen de touros e de episdios de aborto. J foi demonstrado que o vrus, associado a uma pequena percentagem de moncitos e linfcitos perifricos, pode produzir uma viremia transitria. Esta seria uma das possveis explicaes para a origem das infeces fetais e abortos. No entanto, estudos para denir a patogenia desse tipo de quadro ainda no foram realizados. consensual que a reativao da infeco latente pelos herpesvrus animais raramente cursa com sinais clnicos. No entanto, o desenvolvimento de sinais clnicos discretos, a exemplo do que ocorre com outros herpesvrus, parece no ser to raro, e a sua deteco depende de um exame mais acurado. No caso do BoHV-5, foi demonstrado que tanto a reativao natural quanto a induzida por dexametasona parecem ser freqentemente acompanhadas de sinais neurolgicos, que podem ser moderados e passageiros
462
Captulo 17
ou progressivos e fatais. A reativao da infeco latente acompanhada de recrudescncia clnica podem explicar os casos de meningoencefalite pelo BoHV-5 em que um nico animal do rebanho, geralmente adulto, afetado.
6.1.4.3 Diagnstico
Doena neurolgica de curso fatal, principalmente em bezerros, sugestiva de infeco pelo BoHV-5. Nesses casos, o diagnstico diferencial de raiva, listeriose, babesiose e encefalopatia espongiforme deve ser realizado. O diagnstico clnico-epidemiolgico deve ser, sempre que possvel, acompanhado de comprovao virolgica e/ou sorolgica (ver Tabela 17.2). Em casos de doena neurolgica em bovinos, o material enviado para o laboratrio de virologia (crebro) inicialmente testado para a raiva e, se negativo, deve ser testado para o BoHV-5. Utilizando-se o crebro suspeito, pode-se realizar vrios testes para comprovar a etiologia: a) IFA ou IPX em impresses frescas de tecido nervoso; b) isolamento viral; c) PCR; d) nos casos em que secrees nasais acompanham a amostra, a realizao de IFA no sedimento das clulas descamativas pode fornecer um diagnstico rpido e convel. Para isso, amostras de crebro e bulbo olfatrio devem ser remetidas resfriadas para tentativas de isolamento viral e/ou IFA. Fragmentos de crebro, acondicionados em formol a 10%, so teis para exames histolgicos. Encefalite nosupurativa, inltrao linfocitria perivascular, gliose focal ou difusa e corpsculos de incluso nos neurnios so achados comuns em casos de encefalite pelo BoHV-5. Secrees nasais e/ou brnquicas e pulmonares tambm so teis para o diagnstico. Amostras de soro pareadas, coletadas dos animais que, eventualmente, recuperem-se da doena neurolgica podem auxiliar na elaborao do diagnstico. A tcnica padro de diagnstico do BoHV-5 o isolamento viral em cultivo celular no qual o vrus produz ECP tpico de herpesvrus seguido de conrmao por IFA ou IPX. Em amostras clnicas conservadas de forma imprpria, no entanto, o isolamento do vrus pode ser problemtico. Nesses casos, deve-se recorrer a tcnicas de
deteco de antgenos ou PCR, pois as chances de se obter um resultado conrmatrio so maiores. A conrmao da identidade do agente e a sua diferenciao do BoHV-1 pode ser realizada por reatividade com determinados AcMs, anlise de restrio genmica e PCR diferencial, seguida ou no de seqenciamento do produto. O exame histolgico de sees do SNC tambm utilizado no diagnstico e, geralmente, revela quadros de encefalite no-supurativa, inltrao linfocitria focal ou difusa e manguitos perivasculares. Em alguns casos, o exame histolgico do crebro revela alteraes bem indicativas de infeco herptica, como a presena de corpsculos de incluso e necrose neuronal. No entanto, essas alteraes nem sempre esto presentes, indicando a necessidade de exames virolgicos para conrmar a identidade do agente. Casos de infeco neurolgica pelo BoHV-5 sem quaisquer alteraes histolgicas tambm j foram descritos. Amostras pareadas de soro, coletadas durante a doena aguda e 14-21 dias aps, podem ser submetidas a testes sorolgicos. Um aumento de quatro vezes nos ttulos de anticorpos indicativo da infeco aguda. Os testes sorolgicos mais comumente utilizados so SN e ELISA. A SN fornece quanticao dos anticorpos neutralizantes, enquanto o ELISA apenas qualitativo: positivo ou negativo. Cabe enfatizar que esses testes so incapazes de diferenciar anticorpos anti-BoHV-5 de anticorpos anti-BoHV-1.

Devido s semelhanas biolgicas e epidemiolgicas, as medidas de controle e prolaxia para o BoHV-5 so essencialmente as mesmas preconizadas para o BoHV-1. No existem, at o presente, vacinas especcas contra o BoHV-5 disponveis no mercado. Entretanto, com base na reatividade cruzada entre o BoHV-1 e BoHV-5, vacinas contra BoHV-1 vem sendo utilizadas no controle da meningoencefalite por BoHV-5. No entanto, o nvel de proteo heterloga conferido por essas vacinas permanece indeterminado.
Herpesviridae
463
6.1.5 Herpesvrus associados com a febre catarral maligna

Os agentes etiolgicos da febre catarral maligna (MCF) so o herpesvrus ovino tipo 2 (OvHV-2) e o herpesvrus alcelano tipo 1 (AlHV-1), membros do gnero Rhadinovirus, subfamlia Gammaherpesvirinae. O AlHV-1 est associado com a forma africana da enfermidade, que acomete bovinos, cervdeos e outros ruminantes no continente africano. O OvHV-2 o agente da forma da MCF associada a ovinos, doena que acomete bovinos e outros ruminantes e possui distribuio mundial.
6.1.5.1 Epidemiologia Forma africana

Os hospedeiros naturais do agente da forma africana da MCF e transmissores para outras espcies so os gnus (Conochaetes taurinus e Conochaetes gnu, em ingls, denominados wildebeest). No organismo desses animais, o vrus encontra-se fortemente associado com clulas, sendo raramente transmissvel entre animais adultos. Entretanto, a administrao de corticosterides, assim como a ocorrncia de estresse (por exemplo, transporte para zoolgicos) pode induzir a excreo de vrus. No perodo perinatal, o vrus pode ser detectado em secrees nasais, oculares e nas fezes de neonatos. Durante as temporadas de pario dos gnus, os povos africanos que convivem com esses animais acreditam que o vrus seja transmitido para bovinos pelo contato com a placenta, secrees placentrias ou pelas secrees dos recm-nascidos.
a infeco ocorre predominantemente de forma subclnica. Essa forma, tambm denominada MCF associada a ovinos (MCF-OA), possui ocorrncia espordica e tem sido descrita em vrios pases da Europa, Amrica do Sul, Amrica do Norte e em outras regies. Em regies endmicas, a MCF-OA pode ocorrer de forma espordica ou em surtos, com a ocorrncia de um nmero varivel de casos. No Brasil, a enfermidade tem sido documentada em bovinos desde 1924, nas regies Nordeste, Sudeste e Sul. O OvHV-2 produz uma infeco subclnica nos ovinos, seus hospedeiros naturais. Os ovinos disseminam o vrus durante a pario, e o agente penetra nos bovinos provavelmente pela via respiratria. Alm de ovinos, cabras e animais silvestres, como cervdeos, podem ser portadores do vrus e transmiti-lo para bovinos. Com o advento de tcnicas moleculares de diagnstico, como a PCR, foi possvel estabelecer que bovinos que eventualmente se recuperam da MCF-OA tornam-se portadores crnicos.

A patogenia da infeco ainda pouco conhecida. Os animais infectados apresentam uma viremia associada com clulas e a presena de vrus nas leses, que so provavelmente imunomediadas. O perodo de incubao varia entre 3 e 10 semanas, e a durao da doena clnica de 3 a 7 dias. Os eventos centrais da patogenia da MCF parecem envolver a infeco e perda da regulao funcional de determinadas populaes de linfcitos. A perda da atividade dos linfcitos supressores facilitaria a proliferao linfide observada na doena, enquanto a atividade descontrolada das clulas NK seria responsvel pela destruio tecidual. Embora a infeco aguda seja provavelmente seguida do estabelecimento de latncia, no existem evidncias de reativao e recrudescncia clnica. Os sinais clnicos da MCF incluem apatia, anorexia, febre, opacidade da crnea, corrimento
Forma no-africana
A forma no-africana da MCF uma doena infecciosa sistmica que ocorre em bovinos e outros ruminantes domsticos e silvestres, podendo ocorrer tambm em sunos. O OvHV-2 agente etiolgico dessa forma apresenta a espcie ovina como hospedeira natural. Nestes animais,
464
Captulo 17
Tabela 17.3. Principais achados clnico-patolgicos em surtos de febre catarral maligna diagnosticados no Rio Grande do Sul.
Fonte: adaptada de Rech et al. (2005).
Herpesviridae
465
nasal mucopurulento, salivao, diarria, lceras orais e nasais, ceratoconjuntivite, linfadenopatia, diarria, distrbios nervosos com movimentos de pedalagem, convulses e exantema cutneo. Os sinais clnicos apresentados pelos bovinos afetados em 15 propriedades, onde ocorreram casos isolados ou surtos de MCF no Rio Grande do Sul, esto apresentados na Tabela 17.3. Nesses episdios a doena apresentou um curso agudo ou subagudo e foi, na maioria das vezes, fatal. As leses macroscpicas envolvem principalmente os tratos digestivo, respiratrio superior e urinrio, alm de linfonodos, fgado, olhos e encfalo, e incluem leses erosivo-ulcerativas em vrias mucosas. As leses observadas no aparelho digestivo e respiratrio esto associadas com estomatite, faringite e laringite. Ocorre um aumento generalizado de volume dos linfonodos, que podem apresentar aspecto hemorrgico. Leses oculares, como opacidade da crnea, podem ser freqentes. Histologicamente, as leses consistem de vasculite com necrose brinide, inltrados mononucleares em vrios rgos, hiperplasia linfide e necrose dos epitlios de revestimento. Essas leses so consideradas patognomnicas ou muito caractersticas da doena. Pode ocorrer edema de meninges e formao de manguitos perivasculares em diferentes regies do crebro. Focos necrticos podem ser observados nos rins e fgado. H vasculite generalizada. A maioria dos animais infectados que desenvolvem a forma mais grave da doena morre em, aproximadamente, 10 dias.
amostras de soro de animais enfermos. A replicao eciente do OvHV-2 em cultivos celulares ainda no foi obtida, por isso o isolamento viral no utilizado no diagnstico. A trade de alteraes histolgicas da MCF consiste de vasculite, acmulos de clulas inamatrias mononucleares em vrios tecidos e necrose dos epitlios de revestimento. Na vasculite, ocorre necrose brinide da parede de artrias e veias e inltrao de linfoblastos, linfcitos e macrfagos na mdia, adventcia e espao perivascular. Essas leses estavam presentes em todos os casos de MCF em bovinos deste estudo e so altamente sugestivas da doena. O diagnstico diferencial da MCF em bovinos inclui outras doenas a vrus, como a febre aftosa, estomatite vesicular, diarria viral bovina/ doena das mucosas, lngua azul e peste bovina. Considerando-se a forma de transmisso do OvHV-2 para bovinos, a principal medida de controle evitar a criao conjunta de ovinos e bovinos. Uma alternativa separar os ovinos durante a pario, de modo a evitar a transmisso a bovinos atravs de placentas e uidos fetais. Alm disso, devem-se isolar bovinos afetados de bovinos sadios. No h vacinas disponveis contra a MCF.
6.2 Herpesvrus de caprinos 6.2.1 Herpesvrus caprino tipo 1

O herpesvrus caprino tipo 1 (CpHV-1) um alfaherpesvrus estreitamente relacionado com o BoHV-1. Esse vrus est associado com quadros de enterite e infeco generalizada fatal em cabritos recm-nascidos (at duas semanas de idade). A maioria das infeces em animais adultos subclnica, mas a infeco pode, ocasionalmente, resultar em sinais respiratrios, conjuntivite, vulvovaginite, balanopostite e abortos. Outro vrus caprino (CpHV-2), que pertence subfamlia Gammaherpesvirinae, tem sido recentemente associado com manifestaes compatveis com a febre catarral maligna (MCF) em algumas espcies de cervdeos. Esse vrus aparentemente no causa doena em caprinos, que, provavelmente, se constituem em seus hospedeiros naturais.

O diagnstico presuntivo da MCF baseado nos sinais clnicos e nas leses encontradas necropsia, e a presena de ovinos na propriedade um dado que auxilia o diagnstico. O diagnstico denitivo da doena pode ser realizado pelo uso de testes sorolgicos, deteco de antgenos virais por IFA ou IHC, isolamento viral (para o AlHV) e por PCR. As amostras a serem utilizadas para deteco do vrus e/ou DNA viral so: leuccitos frescos, tecido da tireide e glndula adrenal. A deteco de anticorpos realizada em
466
Captulo 17
A susceptibilidade dos caprinos ao herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) e a ocorrncia da infeco nessa espcie, alm do quadro clnico semelhante induzido por ambos os vrus nas respectivas espcies, tornou bastante difcil a classicao do CpHV-1 como um vrus distinto. As caracterizaes iniciais demonstraram que o vrus de caprinos (CpHV-1) distingue-se do BoHV1 por apresentar um ciclo replicativo mais curto, evidenciado por uma destruio mais rpida do cultivo celular in vitro; por sorologia cruzada unidirecional e por anlise de restrio enzimtica do genoma. Embora no existam diferenas signicativas nas propriedades fsico-qumicas de seus DNAs, a anlise de restrio demonstra claramente que o CpHV-1 e o BoHV-1 so espcies virais diferentes. No entanto, apesar de serem diferentes em seus mapas de restrio, ambos os vrus parecem ter mantido ou desenvolvido uma relao antignica durante a sua evoluo.
plicar e estabelecer infeco latente em bovinos aps infeco experimental. O possvel papel dessas outras espcies na epidemiologia da infeco permanece desconhecido.

A patogenia da infeco pelo CpHV-1 no est totalmente esclarecida. Em condies naturais, o CpHV-1 produz infeco primria que evolui para a infeco latente passvel de reativao. O CpHV-1 pode iniciar a infeco pelas vias nasal e genital. Quando a infeco ocorre pela via nasal, o vrus replica localmente e dissemina-se por viremia para o trato genital, onde pode causar aborto. Quando a penetrao ocorre na mucosa genital, o vrus apresenta replicao local e, aparentemente, no se dissemina para outros rgos e tecidos. Aps a infeco primria, o CpHV-1 estabelece infeco latente nos 3 e 4 gnglios sacrais e no gnglio trigeminal, dependendo da via de penetrao. A reativao do vrus dos stios de latncia tem sido muito difcil de ser demonstrada, tanto em infeces naturais como experimentais. Em condies naturais, a reativao e excreo do vrus pela via genital tm sido observadas em cabras com ttulos baixos de anticorpos neutralizantes ( 4) durante as estaes de monta, provavelmente como resultado de um estresse decorrente das alteraes hormonais associadas com o estro. Experimentalmente, a reativao e excreo viral foram obtidas somente aps a administrao de altas dosagens de dexametasona. Aps reativao da infeco latente, o CpHV-1 apresenta um comportamento similar ao da infeco primria: animais infectados pela via intranasal excretam o vrus pelas vias nasal e genital, enquanto os animais infectados pela via genital geralmente eliminam o vrus somente por esta via. Os sinais clnicos decorrentes da infeco pelo CpHV-1 so compatveis com infeco no trato gastrintestinal, genital e respiratrio. Embora a infeco seja subclnica na maioria dos animais adultos, sinais inespeccos, como hipertermia e leucopenia, tm sido descritos. Tambm tm sido descritos quadros de vulvovaginite, caracteriza-
O CpHV-1 foi inicialmente isolado na Califrnia, em 1975, de quadros de enterite severa em cabritos com poucos dias de vida. Posteriormente, o vrus foi detectado em rebanhos caprinos na Sua. Embora a distribuio do agente no tenha sido investigada, estudos sorolgicos e virolgicos demonstram que a infeco est presente em vrios pases europeus, Austrlia, Nova Zelndia, Canad e Estados Unidos, em nveis de prevalncia variveis. Em pases que possuem a caprinocultura comercial bem desenvolvida, como a Grcia e a Itlia, os nveis de prevalncia podem atingir entre 30 e 50% dos animais. Embora a infeco pelo CpHV-1 tenha sido descrita somente nos hospedeiros naturais, o CpHV-1 possui a capacidade de infectar espcies heterlogas. Anticorpos contra o CpHV-1 j foram detectados em algumas espcies silvestres, especialmente cervdeos. Cordeiros e bezerros inoculados experimentalmente no desenvolvem sinais clnicos, porm replicam o vrus e apresentam soroconverso. A exemplo do BoHV-1, que replica e estabelece infeco latente passvel de reativao em cabras, o CpHV-1 capaz de re-
Herpesviridae
467
dos por edema vulvar, eritema, eroses, lceras e descarga mucopurulenta. Diarria, conjuntivite, descarga nasal, tosse e dispnia tambm tm sido ocasionalmente observadas. Em caprinos jovens (entre uma e duas semanas de idade), o CpHV-1 responsvel por infeco sistmica, caracterizada por leses ulcerativas no trato grastrintestinal, geralmente associadas com alta morbidade e mortalidade. O tropismo seletivo do CpHV-1 pelo trato genital, a latncia nos gnglios sacrais e reativao da infeco latente, coincidente com o estro, sugerem que a disseminao do vrus dentro do rebanho provavelmente promovida pela monta natural.
6.2.1.3 Diagnstico
O diagnstico da infeco pelo CpHV-1, em casos clnicos suspeitos, pode ser realizado pelo isolamento do agente em clulas primrias ou contnuas de origem caprina ou ovina. O vrus produz ECP semelhante aos outros alfaherpesvrus. Conjugados policlonais contra o BoHV-1 produzem reao cruzada em testes de IFA e podem ser utilizados diretamente em tecidos ou em clulas de cultivo inoculadas. Uma vez isolado, o CpHV-1 pode ser diferenciado do BoHV-1 por anlise de restrio enzimtica. Episdios de aborto tm sido investigados pelo uso de PCR com primers especcos em tecidos de fetos abortados. Anticorpos contra o CpHV-1 podem ser investigados por SN ou ELISA, e a realizao de sorologia pareada pode indicar infeco aguda recente. Esses testes tambm tm sido utilizados em inquritos sorolgicos em rebanhos caprinos e em animais silvestres.
rebanho tm sido realizadas. Os resultados mais promissores foram obtidos com o uso de uma vacina inativada, porm o nvel de proteo parece depender da via do desao. Ou seja, a proteo foi mais slida nos animais desaados pela via nasal, quando comparada com os desaados pela via genital, que a rota mais provvel de infeco natural. Uma vacina contra o BoHV-1 foi testada em cabras e conferiu proteo parcial aps o desao com o CpHV-1. Considerando-se que os caprinos infectados tornam-se portadores latentes aps a infeco aguda, medidas como triagem e identicao de positivos seguida de descarte ou isolamento, para evitar a transmisso a outros animais, assim como o teste de novos animais introduzidos nos rebanhos, podem auxiliar a reduzir a circulao do vrus e a incidncia da infeco nos rebanhos. A susceptibilidade de cabras e bovinos ao CpHV-1 e BoHV-1, os ttulos nos quais os vrus so excretados pelos hospedeiros heterlogos e o contato estreito entre bovinos e cabras em criaes consorciadas sugerem que a infeco cruzada natural pode ocorrer. Alm disso, o estabelecimento de latncia no hospedeiro heterlogo e a possibilidade de reativao do BoHV-1 em cabras devem despertar preocupao em programas de erradicao.
6.3 Herpesvrus de sunos 6.3.1 Herpesvrus suno tipo 1

(vrus da doena de Aujeszky)
A doena de Aujeszky ou pseudoraiva causada pelo herpesvrus suno tipo 1 (SuHV-1), tambm denominado vrus da doena de Aujeszky ou vrus da pseudoraiva (PRV). Embora a nomenclatura atual recomende o uso da primeira denominao, o vrus mais conhecido como PRV. O SuHV-1 pertence ao gnero Varicellovirus, da subfamlia Alphaherpesvirinae, e possui um genoma DNA de ta dupla, com, aproximadamente, 150 kb, que codica mais de 70 protenas. Em regies endmicas, a doena de Aujeszky considerada uma importante causa de perdas econmicas na suinocultura, relacionadas

Em virtude da ampla distribuio do CpHV1 e das perdas econmicas decorrentes de abortos, natimortos e problemas reprodutivos, algumas medidas para preveno ou erradicao tm sido preconizadas. Apesar de ainda no existirem vacinas comerciais disponveis, tentativas de se produzir uma vacina que reduza a severidade da doena e a disseminao da infeco dentro do
468
Captulo 17
com as altas taxas de morbidade e mortalidade de leites, reduo da performance dos reprodutores e reduo do desenvolvimento dos animais em crescimento e terminao. Atualmente, grande parte da repercusso econmica da doena se deve a restries ao comrcio interestadual de reprodutores e internacional de reprodutores e produtos sunos. Em virtude dessas restries, vrios pases j erradicaram a doena dos rebanhos comerciais e vrios outros esto com programas de controle e erradicao em andamento.
At a dcada de 1980, a infeco pelo SuHV1 estava presente de forma endmica em praticamente todos os pases que possuam expresso na suinocultura. A crescente repercusso econmica da doena, sobretudo devido s restries ao comrcio de animais e produtos, motivou vrios pases a empreender programas de controle e erradicao. Atualmente, a infeco considerada erradicada em sudeos domsticos na Frana, Alemanha, ustria, Sua, Dinamarca, Reino Unido e nos Estados Unidos. Todavia, o SuHV-1 continua circulando nas populaes de sudeos silvestres nos Estados Unidos, Alemanha, Polnia, Frana, Itlia, dentre outros. Dessa forma, programas de vigilncia epidemiolgica devem continuar nas regies de risco, pois as populaes de sudeos silvestres podem atuar como reservatrios do vrus, o que diculta a erradicao completa da doena. No Brasil, a doena foi inicialmente diagnosticada em 1912, e, posteriormente, foi identicada em todos os estados das regies Sul, Sudeste e Centro-Oeste, alm da Bahia e Cear. Nos ltimos anos, a infeco tem sido mais freqentemente relatada em Santa Catarina (SC), o que fez com que fosse implementado um programa estadual de erradicao. O programa, nanciado por um esforo de parcerias rmadas entre a indstria, associao de produtores e governo, tem obtido sucesso em, gradualmente, erradicar o PRV de rebanhos sunos do estado. Desde julho de 2004, a doena de Aujeszky no identicada em SC. Em 2003, pela primeira vez, foram diagnosticados surtos da doena em sunos no Rio Grande
do Sul. Os focos foram prontamente identicados e a infeco foi erradicada. Os sunos so os hospedeiros naturais do SuHV-1, mas o vrus pode ser transmitido e causar doena grave em hospedeiros secundrios (ruminantes, felinos, caninos e roedores). Alm dessas espcies, os coelhos so particularmente sensveis infeco experimental. Os hospedeiros secundrios so geralmente terminais, e a excreo do vrus por estes animais insignicante. Eqinos e aves so muito pouco susceptveis infeco, e o homem refratrio. A infeco de carnvoros pode ocorrer pela ingesto de carnes contaminadas ou atravs de leses na pele ou mucosas. Os sunos que sobrevivem infeco se tornam portadores subclnicos do vrus na sua forma latente. Estes animais se constituem nos reservatrios do vrus e podem transmitir a infeco a outros animais sempre que ocorrer reativao da infeco. A exemplo dos outros herpesvrus, a infeco latente se constitui no ponto-chave da epidemiologia do SuHV-1 e representa um obstculo importante para o controle e erradicao da infeco de populaes sunas. Os ndices de morbidade e mortalidade, associados com a infeco, dependem da idade dos animais infectados e so mais altos em animais jovens. Em leites com 6 a 10 dias de idade, a morbidade pode atingir 95% e a mortalidade, 90%, enquanto entre animais com 21 a 35 dias, esses ndices podem ser de 45 e 30%, respectivamente. Em animais adultos, a mortalidade insignicante, e as perdas esto associadas principalmente com problemas reprodutivos. A freqncia de infeces respiratrias varivel e depende da cepa viral e de determinados fatores ambientais que inuenciam a disseminao do vrus. O vrus transmitido por contato direto ou indireto de animais susceptveis com secrees contaminadas ou animais infectados. Os animais excretam o vrus em secrees nasais e saliva por vrios dias aps serem infectados. O smen de machos contaminados e as secrees genitais e restos fetais de porcas que abortam tambm contm o vrus e podem transmiti-lo. Urina, fezes e leite tambm possuem alguma importncia como vias de excresso e eliminao. A infeco por
Herpesviridae
469
contato indireto pode ocorrer atravs da gua, rao, restos de matadouro, caminhes de transporte, roupas ou contato com materiais contaminados. Os animais latentemente infectados so considerados portadores, podem excretar o vrus periodicamente e so importantes na manuteno da doena na forma endmica.

As conseqncias clnico-patolgicas da infeco pelo SuHV-1 variam amplamente e dependem de fatores como idade e estado siolgico dos animais, via de infeco, dose e virulncia da cepa viral. A via mais comum de infeco a nasofarngea, e os sunos adquirem a infeco por contato direto ou indireto com animais doentes ou portadores, em particular com a saliva e secresses nasais contaminadas. O contato direto focinho-focinho tambm parece desempenhar um papel relevante na transmisso. A transmisso por aerossis a curtas distncias tambm ocorre e pode se constituir em importante forma de disseminao do vrus em regies de alta densidade populacional. Eventualmente o vrus pode infectar animais pela via digestiva, pelo coito ou pela inseminao articial. Em granjas que apresentam surtos ou a infeco endmica, gatos e ces podem contrair a doena pela ingesto de restos fetais. Os stios de replicao primria so os epitlios do trato respiratrio superior (nasal, etmoidal e farngeo), tonsilas e pulmes. Aps essa replicao inicial, o vrus pode atingir tecidos linfides regionais e se disseminar sistemicamente. A viremia, no entanto, parece no desempenhar um papel importante na patogenia. A invaso do encfalo parece ocorrer principalmente pela via nervosa olfatria, atravs da qual o vrus atinge os bulbos olfatrios e, posteriormente, disseminase pelo crebro. Outra via de acesso ao SNC o transporte ao longo das bras que constituem os nervos glossofarngeo e trigmeo. A infeco do gnglio trigmeo pode ser seguida de transporte subseqente at a ponte e restante do crebro ou do estabelecimento de latncia.
A replicao viral no SNC resulta em leses progressivamente severas que levam a disfunes motoras e, eventualmente, morte. Essas alteraes so mais comuns em leites com idade entre uma e duas semanas. Os sinais neurolgicos so gradativamente menos freqentes e menos severos em animais com mais idade e raros em animais adultos, apesar da ocorrncia da infeco neurolgica. Nestes animais, a replicao viral no encfalo parece apresentar um padro localizado. Sinais neurolgicos e morte so raros em animais de engorda. Animais de engorda e adultos freqentemente apresentam letargia e depresso durante episdios de infeco, o que pode ser atribudo ao envolvimento do SNC. A infeco, com determinadas cepas e em altas doses, freqentemente resulta em infeco e doena pulmonar. Nos pulmes, o vrus replica focalmente em uma variedade de tipos celulares, incluindo os macrfagos alveolares, clulas epiteliais alveolares, clulas da musculatura lisa, endoteliais e leuccitos. Como mencionado, a infeco tipicamente focal e no-disseminada. Assim, o SuHV-1 no considerado um agente respiratrio clssico, cuja infeco se dissemine pelos pulmes. A infeco dos macrfagos alveolares possui um signicado especial, pois afeta a primeira linha de defesa dos pulmes contra agentes invasores. Por isso, a infeco viral freqentemente acompanhada de infeco bacteriana secundria, que leva pneumonia, abscedao e pleurite. A viremia que pode ocorrer nesses casos ou aps infeco do trato respiratrio superior passageira e, provavelmente, de pouca importncia na patogenia da infeco. Aps a infeco aguda, tanto subclnica, quanto com sinais inespeccos, neurolgicos ou respiratrios, os animais permanecem portadores da infeco latente. Durante a latncia, o genoma viral permanece no gnglio nervoso responsvel pela inervao da rea onde ocorreu a infeco primria (usualmente no gnglio trigmeo). Esses animais podem, periodicamente, excretar o vrus para o meio ambiente durante a reativao da infeco. A infeco nos animais adultos , freqentemente, subclnica. As maiores perdas causadas pela infeco se devem a um elevado ndice de mortalidade e morbidade entre leites (at 100%
470
Captulo 17
em animais com menos de um ms), queda de produtividade das matrizes e reduo no desenvolvimento dos animais em crescimento e terminao. Em eventos de introduo do agente em rebanhos livres, a doena caracterizada por alta mortalidade na maternidade, abortos e por uma porcentagem varivel de animais apresentando sinais neurolgicos e respiratrios na creche, recria, terminao e gestao. Essa fase inicial dura de uma a trs semanas, com a reduo progressiva da intensidade dos sinais clnicos. Aps essa fase, os surtos se repetem com menor gravidade, a intervalos de tempo aproximadamente regulares. Nesses eventos, so afetados principalmente os leites entre quatro dias e quatro semanas de idade, com o arrefecimento dos sinais dentro de uma a duas semanas. Embora o vrus seja geneticamente pouco varivel, podem ocorrer diferentes formas clnicas, relacionadas com o tropismo de diferentes amostras virais, que podem afetar primariamente os sistemas respiratrio ou nervoso. Em leites, os sinais clnicos mais observados so: hipertermia, inapetncia, depresso, incoordenao, tremores musculares, decbito lateral, convulses e morte. Em animais mais velhos, observam-se hipertermia, anorexia e sinais respiratrios. Porcas em gestao manifestam retornos ao cio e a infeco pode resultar em mumicao, abortos, natimortos, malformaes, nascimento de leites fracos e infertilidade. Nesta categoria animal, os sinais clnicos neurolgicos so raros, mas podem ocorrer. Em bovinos, ovinos, ces e gatos, a infeco pelo SuHV-1 fatal, mas no contagiosa. Nesses animais, ocorre um intenso prurido no local da infeco, se esta ocorrer atravs da pele, o que seguido de sinais neurolgicos progressivamente severos e morte. Os achados de necropsia em sunos afetados, se presentes, so: congesto das meninges e aumento de volume do lquido cfalo-raquidiano, hemorragias, congesto ou focos necrticos nas amgdalas e laringe, rinite brinosa, edema pulmonar e consolidao dos lbulos pulmonares anteriores (no caso das amostras pneumotrpicas do vrus). As leses microscpicas observa-
das no pulmo so de pneumonia intersticial e necrose do epitlio bronquial. Observam-se, ainda, focos de necrose de 1 a 2 mm de dimetro no fgado, nas adrenais, bao e miocrdio. Em casos neurolgicos, ocorre meningoencefalite no supurativa, com ganglioneurite e mielite. Alm disso, observam-se intensa inltrao perivascular, necrose neural, gliose e neuronofagia.
6.3.1.3 Diagnstico
Em reas endmicas ou de risco, a ocorrncia de doena neurolgica em leites jovens (uma a duas semanas), sinais respiratrios em vrias faixas etrias e abortos devem suscitar uma investigao etiolgica, na qual o SuHV-1 deve ser considerado como um potencial suspeito. Se a infeco causada por uma amostra virulenta e cursa com sinais tpicos, uma anlise do curso clnico-patolgico do evento, associada com os achados de necropsia, podem levar a um diagnstico presuntivo relativamente seguro. No entanto, a conrmao etiolgica imprescindvel tambm pelo carter regulatrio do qual se reveste a enfermidade. O diagnstico laboratorial realizado pela identicao do vrus em tecidos e/ou em secrees de sunos doentes. O diagnstico rpido feito usualmente por testes de IFA direta em tonsilas, pulmo, traquia, bao, rins, fgado e crebro. O isolamento do vrus pode ser realizado a partir dessas amostras. O SuHV-1 replica em uma variedade de clulas de origem suna, sejam cultivos primrios ou linhagens contnuas, nas quais produz um efeito citoptico tpico. O vrus pode tambm ser multiplicado em clulas de origem bovina, como clulas de cornetos nasais. Os isolados de campo podem ser adaptados a replicar em clulas de linhagem bovina, como as MDBK. Aps o aparecimento do ECP que um indicativo forte da identidade do agente o vrus pode ser identicado por IFA ou IPX nos cultivos inoculados. A neutralizao viral com anti-soro especco uma alternativa para a identicao do vrus. Em alguns laboratrios, so utilizados testes de PCR para a deteco do genoma viral em amostras suspeitas. Esta tcnica possui aplicao especial para detectar infeces latentes.
Herpesviridae
471
Alternativamente, o diagnstico de um episdio de doena aguda pode ser estabelecido por anlise sorolgica de soro pareado. Para isso, amostras de soro devem ser coletadas dos animais doentes durante o curso da doena e trs a quatro semanas aps. Um aumento de ttulo de anticorpos igual ou superior a quatro vezes entre as coletas indicativo de infeco recente. Com base nisso, testes sorolgicos que permitam quanticar os anticorpos no soro (p. ex.: testes de SN ou ELISA) podem ser utilizados para a conrmao do agente responsvel pelo episdio. Vrios testes sorolgicos podem ser utilizados, mas o teste de ELISA mais sensvel, rpido e econmico do que o teste de SN. Variaes desse teste, quando usados em conjunto com vacinas diferenciais, permitem distinguir animais vacinados daqueles infectados naturalmente.

As estratgias de combate ao SuHV-1 variam de acordo com a situao epidemiolgica da infeco nas reas-alvo. Em todas as situaes, o papel dos portadores latentes se reveste de importncia fundamental e deve permear a planicao e adoo das medidas adequadas. Em geral, as estratgias de combate so baseadas em uma combinao de vacinao, identicao e descarte de soropositivos, alm de medidas gerais de preveno. Em reas livres que apresentam risco de introduo do agente, as medidas devem ter carter essencialmente preventivo, para reduzir as chances de introduo do vrus. Controle de trnsito de animais, barreiras sanitrias, quarentena e certicao de origem e condio sorolgica de animais e produtos introduzidos na rea, alm de vigilncia epidemiolgica sistemtica, so geralmente efetivos na manuteno da condio sanitria de regies com essas caractersticas. Em regies que apresentem focos espordicos, o controle pode ser realizado por uma combinao entre identicao e descarte de animais positivos (e de rebanhos infectados) e vacinao, associado com medidas preventivas gerais. As granjas infectadas devem ter os animais abatidos,
seguido de desinfeco rigorosa e vazio sanitrio. Rebanhos vizinhos e potencialmente expostos ao agente podem ser obrigados a adotar medidas semelhantes. Regies com essas caractersticas apresentam condies favorveis para adoo posterior de mtodos de erradicao. Em regies endmicas, o melhor mtodo de controle da doena a erradicao do vrus das criaes. Todavia, a preveno da doena clnica e da mortalidade pode ser feita atravs do uso de vacinas. Vrias vacinas so utilizadas no controle das infeces pelo SuHV-1, incluindo vacinas tradicionais e vacinas diferenciais. Uma grande limitao das vacinas tradicionais contra o SuHV-1 a induo de uma resposta humoral indistinguvel da resposta induzida em resposta infeco natural. Como virtualmente todos os animais infectados com alfaherpesvrus tornamse latentemente infectados, os animais soropositivos so considerados portadores do vrus. As vacinas diferenciais so as mais utilizadas no mundo inteiro, por possibilitar, atravs de teste sorolgico especco, a diferenciao de animais com anticorpos vacinais daqueles infectados com o vrus de campo. As vacinas diferenciais disponveis incluem vacinas com vrus vivo atenuado, vrus inativado e subunidades virais. A possibilidade de manipulao gentica do vrus para a produo de vacinas diferenciais tem permitido um avano notvel na erradicao do PRV em vrios pases. Sendo assim, a maioria dos programas de erradicao de pseudoraiva no mundo utilizam vacinas com marcadores antignicos que no contm a glicoprotena gE combinada com testes diferenciais para a identicao dos animais infectados. A vacina contra a pseudoraiva aprovada atualmente pelo Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento para uso no Brasil uma vacina inativada deletada na glicoprotena E (tambm chamada GI). Dessa maneira, pode-se identicar e diferenciar animais infectados com amostras de campo dos animais vacinados, se submetidos ao teste de ELISA diferencial para a gE (ausente na vacina). Todavia, no Estado de Santa Catarina, onde existe um programa ocial de erradicao da doena de Aujeszky desde 2001, permitido o
472
Captulo 17
uso de uma vacina com vrus atenuado com deleo no gene da gE. Este uso permitido apenas para sunos destinados ao abate. Existem vrias estratgias de erradicao da pseudoraiva, como a eliminao total do rebanho, teste e remoo com ou sem vacinao, ou vacinao por um determinado perodo de tempo antes da remoo. Os fatores que inuenciam qual opo escolher basicamente so os seguintes: a prevalncia de animais infectados no rebanho e na regio, a necessidade nanceira e estratgica de eliminar o problema o mais rpido possvel (barreiras para exportao de carnes e reprodutores) e o custo do programa. Devido capacidade do SuHV-1 de estabelecer infeco latente sem a manifestao de sinais clnicos, os sunos infectados, mas aparentemente sadios, so considerados potenciais disseminadores do vrus. Assim, torna-se cada vez mais importante que os suinocultores exijam a certicao sanitria ocial, emitida pelo Ministrio da Agricultura, dos rebanhos que fornecem reprodutores para a sua criao.
A infeco pelo EHV-1 enzotica na maioria das populaes eqinas e uma parcela signicativa dos animais de reas endmicas apresenta anticorpos contra o agente. Entretanto, a maioria dos testes sorolgicos no capaz de diferenciar anticorpos contra EHV-1 e EHV-4, devido extensa reatividade cruzada entre os dois vrus. Assim, a prevalncia da infeco pelo EHV-1, com base em testes sorolgicos, somente poder ser determinada com o uso de testes que diferenciem a resposta imunolgica dirigida a esses dois vrus. O EHV-1 transmitido de forma horizontal, por contato direto e indireto entre animais susceptveis e animais que esto excretando o vrus. O vrus excretado durante a infeco aguda e durante episdios de reativao da infeco latente. Geralmente, a durao e magnitude de excreo viral so signicativamente superiores durante a infeco aguda. No entanto, a excreo aps a reativao suciente para permitir a transmisso do vrus. Por isso, animais latentemente infectados so importantes fontes de infeco e manuteno da infeco nos rebanhos. Os eqinos so os nicos hospedeiros naturais conhecidos deste agente e animais de todas as idades podem ser afetados.
6.4 Herpesvrus de eqinos 6.4.1 Herpesvrus eqino tipo 1

O EHV-1 membro da subfamlia Alphaherpesvirinae, gnero Varicellovirus e se constitui em um importante agente de aborto em guas. Pelo fato de ser gentica e antigenicamente relacionado com o herpesvrus eqino tipo 4 (EHV-4, agente da rinopneumonite eqina), estes dois vrus eram antigamente considerados subtipos 1 e 2 do EHV-1, respectivamente. Entretanto, diferenas genmicas importantes entre os dois subtipos virais, demonstradas pela anlise por restrio enzimtica, justicaram a sua reclassicao. Assim, em 1988, os subtipos 1 e 2 do EHV-1 foram considerados duas espcies de vrus: EHV-1 e EHV-4. O EHV-1 possui um genoma de, aproximadamente, 145 a 150 kb e, de acordo com a organizao genmica, enquadra-se no grupo D dos alfaherpesvrus. O genoma do EHV-1 contm 76 genes descritos at o presente.

Em guas que abortam, o vrus excretado junto com os fetos abortados, uidos e restos placentrios, os quais podem conter altos ttulos de vrus. Os animais susceptveis geralmente adquirem a infeco pelo contato da mucosa respiratria com esses materiais. Com isso, o vrus penetra e se multiplica inicialmente no epitlio da cavidade nasal, faringe, traquia, brnquios e bronquolos, infectando a seguir leuccitos e clulas endoteliais de vasos sangneos e linfticos. A infeco, ento, dissemina-se para os linfonodos locais, a partir dos quais clulas mononucleares infectadas entram na circulao sangnea, resultando em uma viremia associada a clulas. Em fmeas prenhes, o vrus alcana o tero e atravessa
Herpesviridae
473
a barreira transplacentria, sendo transferido dos leuccitos infectados para o endotlio vascular. Como conseqncia, ocorre infeco de vasos e tecido uterino em algumas situaes, e de tecidos fetais em outras. Assim, os abortos podem ser causados tanto pela infeco e patologias graves nos tecidos do feto, causando a sua morte e expulso; como pela produo de vasculite, trombose, infartos dos cotildones e dano isqumico do endomtrio, o que ocorre pela replicao do vrus em clulas do endotlio de vasos uterinos. A infeco respiratria de guas prenhes freqentemente assintomtica ou acompanhada de sinais inespeccos. Quando causa infeces sintomticas, o que pouco freqente, o EHV-1 est associado com sinais respiratrios leves. As infeces respiratrias vm acompanhadas de aumento do volume de linfonodos locais e descarga nasal serosa, que pode se tornar mucopurulenta como conseqncia de infeces secundrias bacterianas. Os abortos podem ocorrer a partir do quarto ms de gestao, mas acontecem com maior freqncia a partir do stimo ms. s vezes, os abortos ocorrem na forma de surtos, tambm chamados de tempestades de abortos, quando mais de 50% dos potros podem ser perdidos. Os fetos geralmente so abortados espontaneamente, junto com a placenta, e esto sempre mortos, sendo que aqueles abortados antes dos seis meses de gestao esto geralmente autolisados. As fmeas infectadas na gestao tardia podem parir potros vivos, mas que so freqentemente anormais, apresentam fraqueza e diculdade respiratria e, em geral, morrem dentro de poucos dias aps o nascimento. importante observar que nem todas as amostras de EHV-1 apresentam o mesmo potencial abortignico, e que fatores do hospedeiro, como o estgio da gestao, tambm inuenciam no resultado da infeco. Assim, foi demonstrado que leses no tero de guas infectadas no nal da gestao podem ser mais graves do que nas guas infectadas no incio da gestao. A infeco perinatal nos neonatos resulta em uma doena fatal generalizada que cursa com diculdade respiratria e esporadicamente encefalite.
Eventualmente o EHV-1 invade o crebro dos animais infectados, provavelmente da mesma forma que atinge o tero. Ao chegar ao crebro, o vrus replica no endotlio de vasos, em neurnios e astrcitos, podendo induzir encefalomielite. A doena neurolgica devida ao EHV-1 pouco freqente e pode ou no estar associada com sinais respiratrios e/ou abortos. Animais de todas as idades so susceptveis, mas guas prenhes e potros em amamentao so particularmente afetados. O perodo de incubao nesses casos de seis a 10 dias. Os sinais clnicos variam desde uma leve ataxia at o decbito completo, com paralisia dos membros anteriores e posteriores. Animais que apresentam um curso leve geralmente se recuperam completamente. Aps a infeco primria, o EHV-1 estabelece infeco latente em tecidos linfides, leuccitos perifricos e nos gnglios trigmeos. Situaes estressantes, como o desmame, castrao e transporte, bem como o uso de corticosterides podem induzir a reativao do vrus. Dessa forma, o vrus pode ser disseminado para o meio ambiente e contaminar animais susceptveis ou pode causar infeces recorrentes, resultando em abortos ou casos de encefalomielite. Recentemente foi descrita uma nova forma espordica de infeco pelo EHV-1 em eqinos jovens, na qual o principal alvo da infeco o endotlio vascular dos pulmes. Nessa forma da infeco, a manifestao clnica predominante diculdade respiratria ou morte sbita. Os achados patolgicos da infeco pelo EHV-1 variam de acordo com os tecidos-alvo da replicao viral. Na infeco respiratria, os animais podem apresentar leses herpticas nas membranas mucosas de todos os segmentos do trato respiratrio superior. No epitlio respiratrio e centros germinativos dos linfonodos, observa-se necrose e presena de corpsculos de incluso. Nas infeces de guas gestantes, o EHV1 se multiplica no endotlio dos vasos uterinos e causa leses isqumicas, vasculite, trombose, infartos dos cotildones, levando ao aborto. Os abortos precoces so caracterizados pela autlise extensa do feto. Em abortos mais tardios, uma srie de leses macroscpicas pode ser observa-
474
Captulo 17
da, como edema subcutneo, edema pulmonar, esplenomegalia e necrose heptica. As leses histopatolgicas so caracterizadas por uma bronquiolite necrosante e hepatite. Na mortalidade perinatal, as principais leses aparecem no aparelho respiratrio, com pneumonia intersticial, atelectasia e edema pulmonar. So observadas tambm necrose tmica e depleo de linfcitos tmicos e esplnicos. Na doena neurolgica, observam-se pequenas hemorragias focais distribudas nas meninges, parnquima cerebral e medula. As alteraes histolgicas no sistema nervoso central incluem vasculite, congesto, trombose e degenerao isqumica. A imunidade contra o EHV-1, aps a infeco respiratria, curta, durando aproximadamente trs a quatro meses. A imunidade induzida aps o aborto mais duradoura, e a ocorrncia repetida de abortos pela mesma fmea rara. Os potros que mamam o colostro de guas soropositivas podem apresentar diferentes nveis de anticorpos protetores. Entretanto, a presena de anticorpos circulantes pode no ser suciente para induzir proteo contra a infeco, e a imunidade celular parece desempenhar um papel importante.
formao de aglomerados semelhantes a cachos de uva, produo de focos de destruio celular e destruio total do tapete. A identicao do vrus pode ser feita pelo uso de anticorpos monoclonais em testes de IFA ou IPX. Essas tcnicas tm sido tambm utilizadas para demonstrar a presena de antgenos virais em cortes de tecidos congelados. Como alternativa ao isolamento viral, tcnicas moleculares, como a PCR, podem ser utilizadas em amostras clnicas. A deteco de anticorpos no soro de animais com suspeita de infeco pelo EHV-1 pode ser realizada atravs das tcnicas de SN, xao de complemento e ELISA. A presena de leses teciduais caractersticas, como vasculite, pode ser sugestiva da infeco pelo EHV-1.

Em propriedades livres, o controle deve basear-se em medidas preventivas para impedir a introduo do vrus no rebanho. Alm de monitoramento sorolgico peridico dos animais, quaisquer animais anexados ao plantel devem ser testados previamente para evitar a introduo de portadores. Em propriedades que possuem animais soropositivos, alm dessas medidas, devese tentar manter os animais soropositivos separados dos demais, evitar a introduo de animais sem o uso de quarentena (trs semanas), separar as guas em gestao e guas com potros dos demais animais, e isolar do restante do rebanho as guas que abortaram. Alm disso, deve-se minimizar a presena de fatores estressantes, tais como desnutrio, superpopulao e transporte de fmeas em estado avanado de gestao. Vacinas inativadas e vivas atenuadas tm sido utilizadas na preveno da infeco pelo EHV-1. Experimentos tm demonstrado que as vacinas inativadas induzem melhor proteo contra abortos do que as vacinas vivas atenuadas. As vacinas inativadas devem ser aplicadas aos 5, 7 e 9 meses de gestao. Revacinaes anuais so recomendadas.
6.4.1.3 Diagnstico
O diagnstico da infeco pelo EHV-1 pode ser realizado pelo isolamento e identicao viral a partir de amostras clnicas. As amostras a serem coletadas e enviadas ao laboratrio incluem o pulmo, bao, fgado e timo fetais. Suabes nasais, lquido cfalo-raquidiano, medula e sangue total tambm podem ser utilizados para o isolamento viral em caso de encefalomielite (Tabela 17.4). O EHV-1 capaz de se multiplicar em cultivos celulares de outras espcies, alm da eqina, o que auxilia a diferenci-lo do EHV-4, que s se multiplica em clulas de origem eqina. Clulas RK-13 (rim de coelhos) e Vero (de primatas) so rotineiramente utilizadas para o isolamento e multiplicao do EHV-1 em laboratrios de virologia. Em cultivos celulares, o EHV-1 produz ECP tpico de herpesvrus: arredondamento celular,
Herpesviridae
475
Tabela 17.4. Manifestaes clnicas e material para diagnstico nas herpesviroses de eqinos
Vrus
Herpesvrus eqino tipo 1 (EHV-1) Herpesvrus eqino tipo 2 (EHV-2)
Doena (condio)
Abortos, infeco urogenital, doena respiratria.
Material para diagnstico

Tecidos fetais, suabes genitais ou nasais, soro pareado.
Conjuntivite, faringite
Suabes conjuntivais e farngeos.
Herpesvrus eqino tipo 3 (EHV-3) Herpesvrus eqino tipo 4 (EHV-4)
Doena venrea em guas e garanhes. Doena respiratria aguda em animais jovens, abortos.
Suabes das leses, soro pareado.
Suabes farngeos, tecidos fetais, soro pareado.
Fonte: adaptada de Evermann (1992).
6.4.2 Herpesvrus eqino tipo 3

O exantema coital eqino causado pelo herpesvrus eqino tipo 3 (EHV-3). Esse vrus tambm est classicado na subfamlia Alphaherpesvirinae, gnero Varicellovirus e apresenta alguma similaridade antignica com o EHV-1. Apesar dessas semelhanas antignicas, no h evidncias de reatividade sorolgica cruzada deste vrus com o EHV-1 ou com o EHV-4 em testes de SN. O exantema coital uma enfermidade aguda, geralmente leve, caracterizada pela formao de leses vesiculares, pustulares e exsudativas na mucosa genital e perineal especialmente de fmeas. Eventualmente os lbios e a mucosa nasal so tambm afetados.

O perodo de incubao da doena varia de dois a cinco dias, perodo em que o vrus replica no epitlio da mucosa genital. A replicao leva formao de vesculas, ppulas, pstulas e lceras na mucosa genital externa. Na ausncia de complicaes, a cura total ocorre em at duas semanas, mas os animais permanecem portadores latentes do vrus. A replicao viral na mucosa genital resulta na formao de vesculas, as quais evoluem para pstulas e lceras que se localizam na vulva, vagina, pnis e prepcio. As lceras normalmente cicatrizam em 14 a 21 dias. Eventualmente, quando as leses se formam sobre o epitlio pigmentado, manchas esbranquiadas podem ser observadas nos locais em que as lceras se desenvolveram. As leses genitais primrias causadas pelo vrus podem ser contaminadas por bactrias, originando infeces secundrias que, se no complicadas, so resolvidas em at duas semanas. Embora leses extensas possam ser observadas, a infeco se apresenta freqentemente de forma subclnica ou leve e, muito raramente, ocorrem sinais clnicos sistmicos como febre ou anorexia.
O exantema coital eqino apresenta ampla distribuio em populaes de eqinos, ocorrendo de forma endmica na maioria dos pases que possuem rebanhos numerosos. A transmisso do vrus ocorre principalmente por contato direto, durante o coito, e, possivelmente, o agente pode ser transmitido tambm por vetores mecnicos, como moscas contaminadas com secrees vaginais.
476
Captulo 17
Apesar de ter sido demonstrado que inoculaes experimentais intra-uterinas levam ao aborto, o EHV-3 geralmente no est associado com falhas reprodutivas em infeces naturais. Entretanto, as leses na mucosa genital so doloridas, o que pode diminuir a libido e levar recusa a monta pelos reprodutores. A exemplo dos outros herpesvrus, todos os animais infectados com o EHV-3 se tornam portadores da infeco latente, carreando o vrus pelo restante da vida. A reativao viral pode ocorrer ocasionalmente, levando excreo do vrus e possvel infeco de outros animais.
No existem vacinas disponveis contra o EHV-3. Os animais afetados devem ser isolados, e os reprodutores devem ser removidos do servio at que as leses tenham desaparecido. Tratamento tpico para prevenir a ocorrncia de infeces secundrias pode ser utilizado.
6.4.3 Herpesvrus eqino tipo 4

A rinopneumonite eqina causada pelo herpesvrus eqino tipo 4 (EHV-4), que tambm pertence subfamlia Alphaherpesvirinae, gnero Varicellovirus. Como mencionado anteriormente, esse vrus apresenta uma estreita relao gentica e antignica com o herpesvrus eqino tipo 1 (EHV-1, agente do aborto viral eqino). O EHV4 um dos principais agentes virais associados com infeces respiratrias de eqinos.
6.4.2.3 Diagnstico
O diagnstico laboratorial da infeco pelo EHV-3 pode ser realizado pelo uso de testes sorolgicos (SN) pareados ou pelo isolamento e identicao do vrus a partir de secrees e raspados da mucosa afetada (ver Tabela 17.4). Suabes coletados de leses genitais ou orais so submetidos ao isolamento viral em clulas de origem eqina. Deve-se ressaltar que vrios isolados do vrus so temperatura-sensveis, dessa forma, os cultivos celulares inoculados com o material suspeito devem ser mantidos a 33-34C. A identicao do vrus por IFA ou IPX deve ser realizada com cautela, pois o vrus compartilha alguns determinantes antignicos com o EHV-1. Assim, a identicao denitiva pode ser obtida pela neutralizao com soro hiperimune especco.
A infeco pelo EHV-4 apresenta-se disseminada nas populaes de eqinos, e uma grande parcela dos animais apresenta anticorpos contra o vrus. Cabe ressaltar, no entanto, que os anticorpos contra o EHV-4 no podem ser distinguidos daqueles direcionados contra o EHV-1 por testes sorolgicos de rotina. Assim, no se pode saber, com certeza, qual a parcela dos animais soropositivos nestes testes foi exposta a cada um dos agentes. Ou seja, no total de animais soropositivos contra o herpesvrus eqino, deve-se considerar que uma parcela pode ter sido infectada com cada um destes vrus, alm de possveis infeces mistas. Durante a infeco respiratria aguda, o vrus excretado em secrees nasais e expectoraes e pode ser transmitido por contato direto ou indireto. A transmisso por aerossis pode tambm ocorrer, mas depende da quantidade de vrus excretada, das condies climticas (temperatura, umidade, ventos) e da distncia entre os animais. A faixa etria mais freqentemente afetada pela infeco de potros de dois meses a um ano de idade.

Em propriedades livres, medidas preventivas devem ser adotadas para impedir a introduo do agente. Dentre essas, recomenda-se o teste de reprodutores a serem introduzidos no rebanho. Como forma de manter a condio sanitria do rebanho, apenas animais soronegativos devem ser incorporados ao plantel. Na ocorrncia de casos clnicos compatveis com o EHV-3, o diagnstico deve diferenci-lo do EHV-1. Uma vez conrmada a etiologia, recomenda-se o isolamento e descanso sexual dos animais afetados.
Herpesviridae
477

Aps a penetrao pela via respiratria, o vrus se multiplica no epitlio nasal, faringe, traquia e brnquios e, logo aps, dissemina-se para os linfonodos regionais. Durante a infeco primria, os animais jovens podem desenvolver leses erosivas caractersticas na mucosa respiratria. Em infeces agudas, corpsculos de incluso e necrose do epitlio respiratrio e dos centros germinativos dos linfonodos regionais podem ser observados. A infeco aguda seguida do estabelecimento de infeco latente nos gnglios trigmeos, e o vrus pode ser reativado periodicamente, geralmente em situaes ligadas ao estresse. Assim, animais soropositivos so considerados carreadores e potenciais disseminadores do vrus. Embora seja uma das infeces virais respiratrias mais comuns de eqinos, a infeco geralmente acompanhada de sinais leves a moderados. Os sinais clnicos mais freqentes so: febre, anorexia, aumento de volume dos linfonodos regionais, rinite e descarga nasal. A descarga nasal abundante e, inicialmente, apresenta-se serosa, passando a mucopurulenta com a ocorrncia de infeces bacterianas secundrias. Os sinais so observados aps um perodo de incubao de, aproximadamente, dois a dez dias. Em infeces no complicadas, os sinais clnicos persistem por dois a sete dias. Eventualmente pode ocorrer broncopneumonia grave em animais mais jovens, o que pode resultar em alguma mortalidade. Esses casos esto associados com condies de superlotao, higiene inadequada e presena de infeces secundrias graves. Em casos raros, a infeco de fmeas em gestao pelo EHV-4 pode resultar em abortos.
so apenas presuntivos, pois outros agentes podem estar envolvidos no quadro clnico. Assim, deve-se proceder a investigao etiolgica com o auxlio de testes laboratoriais. Em geral, pode-se recorrer ao isolamento e identicao do vrus em amostras clnicas ou sorologia pareada, com amostras coletadas durante a fase aguda e aps a recuperao clnica. Para o isolamento, so recomendadas amostras de secrees nasais (coletadas com suabes) ou sangue total, dando-se preferncia para as secrees. O isolamento deve ser realizado em clulas primrias ou de linhagem de origem eqina. A diferenciao entre EHV-1 e EHV-4 pode ser obtida pela inoculao do material suspeito em clulas eqinas (ED, derme eqina) e RK-13 (rim de coelhos). O EHV-1 capaz de replicar e produzir ECP em ambas as linhagens, enquanto o EHV-4 somente se multiplica nas clulas da espcie homloga. Os testes sorolgicos de eleio so a SN e o ELISA. A SN pode ser realizada para vericar o aumento do ttulo de anticorpos entre a fase aguda e a convalescena e, assim, conrmar a etiologia do evento clnico. Recentemente, um teste de ELISA foi desenvolvido para diferenciar entre anticorpos contra o EHV-1 e EHV-4.

As medidas de controle so basicamente as mesmas indicadas para os outros herpesvrus de eqinos e envolvem uma mescla de medidas preventivas (para evitar a introduo do agente ou de animais infectados no rebanho) com medidas para reduzir as chances de transmisso entre animais do rebanho. Animais adquiridos e aqueles que participaram de exposies e/ou competies devem ser submetidos quarentena no seu retorno para prevenir a introduo do agente. Existem vacinas inativadas e atenuadas contra o EHV-4, algumas delas bivalentes (contendo tambm o EHV-1). As vacinas devem ser administradas inicialmente aos trs ou quatro meses de idade, seguidas de reforos peridicos, especialmente durante a idade jovem, quando os animais so mais susceptveis.
6.4.3.3 Diagnstico
O diagnstico de infeces respiratrias em eqinos deve necessariamente considerar o EHV4 como um dos agentes suspeitos (ver Tabela 17.4). No entanto, a sintomatologia e o histrico
478
Captulo 17
6.5 Herpesvrus de ces 6.5.1 Herpesvrus canino tipo 1

O herpesvrus canino tipo 1 (CaHV-1) tambm classicado na subfamlia Alphaherpesvirinae, gnero Varicellovirus. Apenas um sorotipo viral foi identicado at o presente, e a variao antignica entre isolados de campo pequena. O vrus replica in vitro somente em clulas primrias ou de linhagens de origem canina. Quando cultivado nessas clulas, o vrus produz ECP bem evidente e alguns isolados induzem a formao de sinccios.
A infeco pelo CaHV-1 est distribuda mundialmente em caninos domsticos e tambm em candeos de vida selvagem. A doena causada pelo vrus ocorre principalmente em lhotes de at duas semanas de idade. Estudos de soroprevalncia so limitados, mas demonstram que entre 30 a 100% dos ces domsticos apresentam anticorpos contra o CaHV-1, indicando a ampla distribuio do vrus entre os ces. A transmisso do CaHV-1 ocorre pelo contato direto ou indireto dos neonatos com secrees oro-nasais e vaginais durante ou logo aps o parto. A transmisso pelo coito, assim como infeces intra-uterinas, tambm podem ocorrer. Aps a resoluo da infeco primria, ocorre o estabelecimento de infeces latentes, que persistem por toda a vida do animal. Os animais latentemente infectados podem periodicamente excretar vrus no ambiente durante os episdios de reativao. Nessas ocasies, o vrus pode ser transmitido para animais susceptveis.

O vrus excretado pelas fmeas durante ou logo aps o parto contamina os neonatos, nos quais o vrus replica na mucosa nasal, tonsilas e faringe. Nestes animais, pode ocorrer viremia associada a clulas (moncitos), seguida de replicao viral em rgos como o fgado, rins, tecidos linfticos, pulmes e sistema nervoso central. A
infeco fatal quando o vrus infecta neonatos que no receberam imunidade passiva das mes. Nesses casos, a morte ocorre com maior freqncia em animais com idade de uma e quatro semanas. Geralmente a fmea infecta a sua ninhada somente uma vez, quando, provavelmente, no transfere imunidade humoral suciente para os seus lhotes. A infeco de animais de mais de duas semanas de idade raramente fatal e resulta no desenvolvimento de infeces leves ou inaparentes. O perodo de incubao da doena de 6 a 10 dias, e a durao do perodo clnico pode ser bastante curta (um a trs dias em neonatos sem imunidade). Os sinais clnicos observados so: anorexia, dispnia, dor palpao abdominal, incoordenao motora e diarria. Pode haver descarga nasal hemorrgica e petquias nas mucosas. Em geral, no se observa elevao de temperatura. A mortalidade da ninhada pode ser de 100%, dependendo da idade em que ocorreu a infeco e da presena anticorpos maternos. O vrus pode ainda atravessar a barreira transplacentria e infectar os fetos durante a gestao, causando abortos ou o nascimento de lhotes fracos e com diculdade no desenvolvimento. O CaHV-1 pode tambm causar distrbios respiratrios em animais adultos, principalmente quando associado com outros agentes infecciosos, como a Bordetella bronchiseptica, vrus da cinomose (CDV), e vrus da parainuenza canina (cPI-2v). Em animais adultos, a infeco pode ainda causar infertilidade. As leses observadas em fmeas maduras esto caracterizadas principalmente por leses vesiculares e hemorragias vaginais, que so observadas principalmente durante o proestro. Os mesmos tipos de leses podem ser observados na mucosa genital masculina. Nos neonatos doentes, as leses observadas na necropsia afetam principalmente os rins, os quais se apresentam hemorrgicos e necrticos. Corpsculos de incluso intranucleares podem ser observados em reas necrticas. Alm dos rins, este tipo de leso pode ocorrer nos pulmes, fgado, bao e intestino. Pode ocorrer aumento de volume de linfonodos, e necrose de placenta freqentemente observada em fmeas prenhes infectadas.
Herpesviridae
479
Os ces infectados permanecem latentemente infectados. A infeco latente se localiza nos gnglios trigmeos ou lombo-sacrais. A reativao viral nas infeces latentes pode ser induzida por situaes estressantes, como treinamento, transporte, introduo de novos ces na propriedade ou pelo uso experimental de medicamentos imunodepressores como os glicocorticides.
poxvrus avirios como vetores, tm sido testadas, porm sem resultados promissores.
6.6 Herpesvrus de felinos 6.6.1 Herpesvrus felino tipo 1

O herpesvrus felino (FeHV-1) um alfaherpesvrus que infecta o trato respiratrio superior de gatos domsticos, produzindo uma doena conhecida como rinotraquete viral felina (FVR). As doenas do trato respiratrio dos felinos so freqentes em abrigos e gatis, e seguem ocorrendo mesmo com o uso disseminado de vacinas contra os principais agentes envolvidos: o FeHV-1, o calicivrus felino (FCV) e bactrias como a Chlamydophila felis e a Bordetella bronchiseptica. Alguns estudos demonstram que 80 a 90% dos casos de doena do trato respiratrio superior dos felinos so causados pelo FeHV-1 e/ou pelo FCV.
6.5.1.3 Diagnstico
A presena de leses caractersticas, como petquias, na superfcie dos rins e edema pulmonar, juntamente com a observao de corpsculos de incluso intracitoplasmticos, so indicativos da infeco pelo CaHV-1. O diagnstico denitivo da infeco feito pela demonstrao de antgenos virais em cortes de tecido atravs da tcnica de IFA ou pelo isolamento viral. O isolamento pode ser realizado em clulas de origem canina, a partir de amostras de tecidos como pulmes e rins de animais afetados.
6.6.1.1 Epidemiologia 6.5.1.4 Controle e prolaxia

Medidas para reduzir o estresse e minimizar o contato de fmeas prenhes com outros animais so indicadas para a preveno da ocorrncia da doena. Os lhotes recm-nascidos devem ser mantidos em locais abrigados e sob temperatura adequada, evitando-se a exposio a baixas temperaturas. Uma vacina de subunidades est disponvel na Europa desde 2003. A vacina especialmente indicada para fmeas durante a gestao e consiste de glicoprotenas virais puricadas associadas com adjuvante oleoso. Essa vacina demonstrou conferir boa proteo aos neonatos quando as mes so vacinadas duas vezes durante a gestao. As cadelas devem ser vacinadas durante o cio ou em fases iniciais da gestao e revacinadas uma a duas semanas antes do parto. Uma vacina atenuada, cold adapted (vrus que replica sob temperaturas abaixo da temperatura corporal), foi recentemente desenvolvida, mas ainda no est disponvel no comrcio. Outras abordagens vacinais, como a utilizao de A infeco pelo FHV-1 distribuda mundialmente. Anticorpos contra o agente podem ser detectados em mais de 70% dos gatos de criaes ou abrigos. Nos gatos domsticos criados com pouco contato com outros animais, a prevalncia de aproximadamente 50%. No Brasil, a ocorrncia da infeco e doena tem sido relatada em vrias regies. Sorologia positiva tambm j foi demonstrada entre felinos selvagens criados em cativeiro, que tambm so susceptveis ao vrus. A transmisso do agente ocorre principalmente pelo contato direto ou indireto com descargas nasais. O vrus pode ser transmitido tambm por aerossis e, com menor freqncia, por fmites contaminados. A mortalidade maior entre lhotes com menos de seis meses de idade. Gatos que sobrevivem infeco aguda desenvolvem a infeco latente e a reativao da infeco, permitindo a transmisso do vrus a outros animais. Os gatos portadores da infeco latente so os reservatrios do FeHV-1 e constituem a principal fonte de disseminao do agente nos gatis e abrigos de animais.
480
Captulo 17

Aps a penetrao pela via nasal, o vrus replica nas clulas epiteliais do trato respiratrio superior e atinge a conjuntiva ocular. Aparentemente no ocorre viremia e a infeco parece ser restrita ao trato respiratrio superior. O perodo de incubao de 24 a 48 horas, e os sinais clnicos podem ser mais facilmente observados aps trs a cinco dias da infeco, permanecendo por duas a trs semanas. Inicialmente observa-se descarga nasal serosa, que pode progredir para mucopurulenta pela colonizao bacteriana da mucosa. Outros sinais clnicos incluem descarga ocular, conjuntivite, ceratite, ulcerao da crnea, hipersalivao, lceras orais, desidratao, tosse, dispnia e anorexia. Infeces bacterianas secundrias podem produzir broncopneumonia e septicemia, principalmente em lhotes, podendo resultar na morte. Fmeas prenhes podem, ocasionalmente, abortar devido toxemia e hipertermia. As leses macroscpicas incluem necrose dos epitlios nasal, farngeo, da epiglote, laringe, traquia e tonsilas. Broncopneumonia, pneumonite intersticial, necrose focal, acmulo de clulas inamatrias e exsudato brinoso nos alvolos tambm podem ser observados. Microscopicamente, podem ser observadas incluses intranucleares nas clulas epiteliais.
semelhantes a cachos de uva, focos de destruio e, nalmente, destruio do tapete celular. O calicivrus felino (FCV) tambm produz efeito citoptico em cultivos celulares e, por estar freqentemente associado com doena respiratria, deve ser distinguido do FeHV. Para isso, podemse utilizar anticorpos especcos para um dos agentes nas tcnicas de IFA ou IPX, ou realizar-se neutralizao viral com anti-soro especco. A deteco de antgenos virais em tecidos por IFA e a deteco de anticorpos por sorologia pareada tambm podem ser teis no diagnstico laboratorial.

A FVR um problema sanitrio importante em abrigos, gatis e casas com criao mltipla de gatos, onde o controle nem sempre obtido somente com a utilizao de vacinas. Algumas medidas recomendadas incluem o tratamento individual de animais infectados, a implementao de um protocolo de vacinao macia e o isolamento de ninhadas de lhotes susceptveis. Drogas antivirais utilizadas contra o vrus do herpes simplex humano (HSV), como o Aciclovir, no so efetivas contra o FeHV-1. Portanto, o tratamento da FVR somente de suporte. Vacinas inativadas e uma vacina atenuada bivalente contra o FeHV-1 e o FCV esto disponveis comercialmente. Essas vacinas induzem uma resposta imunolgica que no impede a infeco, porm reduz a severidade da doena. Recomenda-se a primovacinao de lhotes com nove semanas de idade e uma segunda aplicao trs a quatro semanas aps. Reforos a cada trs anos so recomendados. As vacinas podem ser aplicadas pela via parenteral ou intranasal. A via intranasal apresenta vantagens como a estimulao rpida de proteo, ausncia de interferncia da imunidade passiva e estmulo de imunidade local (IgA) no principal stio de infeco. Uma vacina experimental, contendo um mutante deletado do FeHV-1, no qual se inseriu o gene da protena de capsdeo do FCV, est em fase de desenvolvimento e testes.
6.6.1.3 Diagnstico
O diagnstico presuntivo pode ser estabelecido pelo histrico e pelos sinais clnicos. No entanto, deve-se buscar conrmao laboratorial, pois outros agentes causam doena respiratria em felinos. O isolamento do vrus pode ser realizado pela inoculao de secrees nasais, conjuntivais e farngeas ou, ainda, de macerados de mucosa farngea, ocular ou nasal, em clulas de linhagem ou primrias de origem felina. O FeHV-1 produz efeito citoptico caracterstico dos herpesvrus, com arredondamento e desprendimento celular do tapete, formao de aglomerados de clulas
Herpesviridae
481
6.7 Herpesvrus de aves 6.7.1 Vrus da doena de Marek

A doena de Marek (MD) uma doena linfoproliferativa altamente infecciosa que afeta galinhas. As primeiras observaes relacionadas com esta enfermidade foram feitas pelo mdico veterinrio Jzsef Marek, em 1907, e relataram o desenvolvimento de polineurite e paralisia, resultantes de inltrao linfide em nervos perifricos. Posteriormente observou-se que a polineurite e os linfomas viscerais, ocasionalmente observados nas aves, tambm estavam associados com a mesma doena. O agente etiolgico dessa enfermidade foi identicado nos anos 1960. O agente da MD (Mareks disease vrus, MDV), um membro da subfamlia Alphaherpesvirinae e pertence ao gnero Mardivirus. O vrus foi inicialmente classicado como um Gammaherpesvirus pela sua habilidade de produzir tumores linfides em galinhas. Posteriormente foi reclassicado como um Alphaherpesvirus com base em sua estrutura, genoma e rpida replicao em cultivo celular. Trs sorotipos do MDV so conhecidos com base em anlise de precipitao em gel de gar, SN e PCR. Os vrus do sorotipo 1 (MDV-1) incluem os MDVs oncognicos e seus variantes atenuados em cultivo celular, entre estes algumas cepas vacinais. Dentro do sorotipo 2 (MDV2), encontram-se os vrus no-oncognicos, que ocorrem naturalmente em galinhas; e, no sorotipo 3, so agrupados os vrus no-oncognicos de perus (turkey herpesviruses, HVT). As amostras de campo do MDV-1 so agrupadas em quatro pattipos com base na sua capacidade de causar tumores em aves. As amostras do MDV-1 podem ser consideradas como: a) cepas baixa patogenicidade (mild, mMDV), b) cepas de baixa virulncia (virulent, vMDV), c) cepas de alta virulncia (very virulent, vvMDV) e d) cepas de altssima virulncia (very virulent plus, vv+MDV).
A produo de aves atualmente desenvolvida de forma bastante intensiva, o que favorece a rpida disseminao de agentes infecciosos em uma criao. A MD altamente contagiosa, e a infeco ocorre por inalao de poeira contaminada com o vrus presente nos criatrios. O MDV pode persistir por longos perodos no meio ambiente e to ubquo que, virtualmente, todas as aves domsticas do mundo acabam entrando em contato com o agente em alguma fase de suas vidas. A infeco nem sempre induz manifestaes clnicas, o que diculta a determinao da prevalncia e incidncia da infeco. A enfermidade ocorre comumente em galinhas, mas tambm tm sido descrita em perus, codornas e faises. A partir dos anos 1960, a despeito do uso de vacinas, surtos de MD, causados por amostras cada vez mais virulentas, vm ocorrendo no mundo todo. No Brasil, os frangos criados industrialmente recebem uma vacina contra MD com a cepa HVT no primeiro dia de vida. As aves de ciclo longo, como poedeiras, matrizes e avs, recebem uma combinao de vacinas dos sorotipos 1 (CVI 988/Rispens) e 3 (HVT). A vacinao reduz, mas no impede a infeco nem a excreo viral, o que favorece a seleo de cepas mutantes e, conseqentemente, problemas para o controle desta enfermidade. O MDV continua sendo um importante patgeno na produo avcola e tem sido intensivamente estudado por pesquisadores no mundo, porm pouco estudado no Brasil.

A patogenia da MD complexa e ainda no totalmente compreendida. A primeira fase da infeco inicia com a inalao do vrus pelo hospedeiro. Inicialmente, o vrus replica nas clulas epiteliais do trato respiratrio e, subseqentemente, infecta macrfagos locais e/ou clulas dendrticas. A partir dos pulmes, o vrus transportado sistemicamente para o bao, timo,
482
Captulo 17
e bursa de Fabricius (BF), onde pode ser detectado j 24 horas ps-infeco (pi). A partir desses rgos, o vrus infecta os linfcitos B e T e atinge um pico de replicao entre os dias 3 e 7 pi. Essas infeces so citolticas e causam atroa da BF e timo, resultando em grave imunossupresso. Aps a fase citoltica inicial, a infeco passa fase latente em linfcitos T a partir dos dias 6 e 8 pi. Durante esse perodo, o vrus pode ser transportado por linfcitos at a pele, onde uma infeco produtiva ocorre nos folculos das penas. O MDV um vrus estritamente associado com clulas, e partculas virais livres somente so produzidas pela replicao nos folculos das penas. A partir dessa replicao, o agente excretado para o ambiente, geralmente entre os dias 10 e 14 pi. A terceira fase da infeco consiste em uma infeco citoltica secundria que envolve tambm o sistema nervoso. Nessa fase, leses inamatrias importantes podem ser detectadas no crebro e nos nervos de galinhas adultas, por volta dos dias 9 a 15 pi. Uma quarta fase da infeco caracterizada pelo desenvolvimento de linfomas malignos de linfcitos T que se formam a partir do dia 12. Essa diviso da patogenia em quatro fases pode no ser to clara quando h infeco pelas amostras vv+ e quando a latncia no estabelecida. Linfcitos T, transformados pelo vrus e linhagens celulares derivadas de linfomas primrios, mantm os genomas virais integrados ao DNA celular, um aspecto nico entre os herpesvrus. Nas infeces latentes com os demais herpesvrus, o genoma latente permanece em uma forma epissomal no ncleo das clulas hospedeiras. O genoma do MDV contm vrios oncogenes, destacando-se o que codica a protena Meq, membro da famlia de oncogenes Jun/Fos. A composio gentica do hospedeiro inui decisivamente no resultado e gravidade da infeco pelo MDV. Protenas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) so fortemente associadas resistncia ou susceptibilidade gentica ao vrus. A polineurite crnica, paralisia transitria e os linfomas viscerais, observados inicialmente como sinais e leses caractersticos da MD, esto aos poucos ocorrendo com menor freqncia. As-
sim, os sinais clnicos muito graves causados pela forma aguda, relacionada com amostras vv+ tm sido cada vez mais comuns. Nos ltimos 20 anos, os sinais neurolgicos so dominantes e aparecem na forma de paralisia transitria na maioria das linhagens de galinhas. As amostras virais vv+ podem causar uma morbidade de mais de 90% e mortalidade devido a danos cerebrais graves. Nesses casos, a polineurite perifrica e os linfomas podem estar ausentes. As leses observadas na doena resultam, em grande parte, da inltrao e proliferao dos linfcitos T em tecidos, podendo estar associadas com leucemia, e tambm so conseqncias da resposta inamatria e lise de clulas no-linfides pela replicao viral. As leses encontradas em vsceras e gnadas correspondem a reas de leses linfomatosas, em geral pequenas e difusas, e ocorrem especialmente em aves que desenvolvem a forma aguda da infeco. Esses rgos se apresentam com volume aumentado e colorao acinzentada difusa. As leses linfomatosas no so facilmente distinguveis das leses induzidas pelo vrus da leucose aviria. Leses oculares relacionadas com inltrao linfocitria tambm podem ocorrer, de forma que h opacidade de crnea. Pele, msculo e pr-ventrculo podem ser tambm afetados pelos linfomas. A Tabela 17.5 apresenta as semelhanas e diferenas epidemiolgicas e clnico-patolgicas entre a MD e a leucose aviria.
6.7.1.3 Diagnstico
A disponibilidade de AcMs que reagem somente contra o MDV (e no contra o HVT) um pr-requisito para a identicao de tecidos ou clulas infectadas com este vrus. Esses AcMs podem ser utilizados em tcnicas de IFA ou IPX. Em tecidos infectados com o MDV, independente da linhagem da ave ou virulncia da amostra, quantidades detectveis de antgenos virais podem ser identicadas na BF, timo ou bao, a partir do dia 3 pi. Os mesmos testes podem ser utilizados para identicar antgenos do MDV em cultivos celulares inoculados com material suspeito, quando o ECP visvel.
Herpesviridae
483
Tabela 17.5. Principais diferenas clnicas e patolgicas entre a doena de Marek e a leucose aviria.
Caracterstica
Idade afetada Paralisias Leses macroscpicas Fgado Nervos Pele Bursa (tumores) Bursa (atrofia) Intestinos Corao Leses microscpicas Clulas pleomrficas Cls. blsticas uniformes Infiltrado na ris Tumor na bursa
Doena de Marek
2 - 7 meses Comuns
Leucose aviria
4 - 10 meses (+ de 16 semanas) Ausentes
Comum Comum Comum Raro Comum Raro Comum Sim No Sim Interfolicular
Comum Ausente Raro Comum Raro Comum Raro No Sim No Intrafolicular
Como o MDV estritamente associado a clulas, e partculas virais livres so produzidas somente nos folculos das penas a partir do dia 12 pi, o isolamento viral nas fases mais iniciais da infeco envolve a passagem cuidadosa de clulas intactas em clulas de rim de galinha (CKC) ou de broblastos de embrio de galinhas (CEF). O vrus tambm pode ser isolado da capa ogstica ou de macerados de bao pela inoculao em co-cultivos celulares ou de ovos embrionados. A inoculao pode ser feita na membrana crioalantide ou no saco da gema, e os embries devem ter aproximadamente quatro dias. A presena do vrus pode ser demonstrada pela deteco de antgenos por IFA. Um ensaio imunoenzimtico (ELISA) para a deteco de anticorpos antivirais, desenvolvido nos anos de 1980, foi mais sensvel do que testes de IFI utilizados anteriormente. Este tipo de ELISA pode ainda ser til tambm para avaliar a resposta humoral de animais vacinados. A infeco com as amostras mais virulentas induz uma resposta de anticorpos pobre e temporria, o que, provavelmente, ocorre em conseqncia da lise de linfcitos B que se desenvolve durante a infeco. O diagnstico da MD tambm pode ser realizado pela tcnica de PCR, utilizando DNA extrado de linfcitos. Amostras clnicas podem ser
positivas a partir do primeiro dia ps-infeco. Em estgios mais avanados da enfermidade, quando os folculos das penas esto produzindo partculas virais, as pontas das penas se constituem em uma fonte adequada para extrao de DNA viral. A amplicao de seqncias do MDV por PCR um mtodo direto de deteco e to sensvel quanto o isolamento em co-cultivo de capa ogstica em CEFs. Entretanto, PCR extremamente simples de executar, e os resultados podem ser obtidos em poucas horas. Ao contrrio do isolamento, que depende da presena de vrus viveis, as amostras para a anlise do PCR no precisam ser congeladas ou protegidas de inativao. Finalmente, a tcnica de PCR representa o nico teste rpido e sensvel para detectar a presena de MDV atenuado e patognico nas mesmas amostras.

Aps a identicao do MDV como o agente etiolgico da MD, os vrus MDV-2 e HVT (que no causam doena em galinhas) comearam a ser utilizados em vacinas vivas heterlogas contra a MD. A partir de ento, a incidncia da MD reduziu-se em 99% e este foi o primeiro exemplo de uma vacina ecaz contra um vrus que induz
484
Captulo 17
tumores. Entretanto, com o surgimento de amostras mais virulentas do MDV, tornou-se comum o uso combinado de vacinas mistas contendo o MDV-2 e HVT. Quando algumas amostras ainda mais virulentas surgiram, a primeira amostra apatognica de MDV (CVI 988-Rispens) comeou a ser utilizada em uma vacina viva modicada. Atualmente esta amostra vem sendo amplamente utilizada na confeco de vacinas contra a MD. Uma das principais restries das vacinas disponveis contra a MD a sua incapacidade de induzir imunidade esterilizante. Conseqentemente galinhas previamente vacinadas podem ser infectadas e disseminar o vrus de campo a outros animais. Esta provavelmente a fonte de amostras de MDV virulento que circula entre populaes de galinhas e pode contribuir para o surgimento de amostras cada vez mais virulentas. Partculas virais do MDV podem se manter viveis por longos perodos na poeira dos galpes, mas so sensveis ao tratamento com detergentes, etanol e isopropanol a 70%. O uso de prticas de higiene do ambiente e das pessoas que tm acesso s aves pode tambm limitar a introduo e disseminao do agente nos criatrios. Alm disso, o uso de quarentena e teste de aves de reposio podem tambm diminuir a presso de infeco e prevenir a ocorrncia de novos surtos.
Os principais hospedeiros naturais do ILTV so as galinhas, embora a doena j tenha sido observada tambm em faises e perus. Aves de todas as idades podem ser infectadas, mas os sinais clnicos mais caractersticos so observados em aves adultas. O ILTV apresenta uma distribuio mundial, tendo sido identicado em todos os pases que tm avicultura comercial desenvolvida. No Rio Grande do Sul, o primeiro surto de LT em galinhas foi descrito em 1974. O primeiro surto da doena em perus, no Brasil, foi relatado em 2004. O vrus transmitido de forma horizontal, e a transmisso ocorre quando as aves infectadas excretam o vrus pelas vias ocular e respiratria. Aerossis e secrees contaminadas entram em contato direto ou indireto com aves susceptveis, possibilitando a infeco de novos hospedeiros e a disseminao do vrus no lote.

O perodo de incubao de seis a doze dias, e o resultado da infeco primria depende do grau de patogenicidade da amostra viral, da idade e do estado imunolgico das aves. Durante a fase aguda da infeco, as aves infectadas excretam o vrus principalmente pelas secrees respiratrias. Aps penetrar pelas vias areas, o vrus replica inicialmente no epitlio respiratrio. A partir da, penetra em terminaes nervosas e transportado por via nervosa aos gnglios trigmeos, onde estabelece infeco latente. Aparentemente a infeco latente pode se estabelecer tambm no epitlio respiratrio e, at o momento, no foi descrita a ocorrncia de viremia durante a infeco pelo ILTV. Reativaes espordicas do vrus latente causam infeces inaparentes, mas produtivas, resultando em disseminao do vrus a aves susceptveis. Os efeitos da infeco nos lotes de aves variam de acordo com a amostra envolvida no surto. Amostras de alta virulncia provocam uma
6.7.2 Vrus da laringotraquete infecciosa

A laringotraquete infecciosa das aves (LT) uma doena respiratria aguda que afeta galinhas, faises e perus. O agente etiolgico da LT o herpesvrus de galdeos tipo 1 (GaHV-1, chamado tambm de ILTV), pertencente subfamlia Alphaherpesvirinae. A infeco pelo ILTV foi descrita, pela primeira vez, em 1926, nos Estados Unidos. A partir de ento, a doena foi identicada em vrios pases onde existem criaes comerciais importantes de aves. A LT uma infeco de importncia econmica que pode causar grandes prejuzos econmicos, principalmente em criaes de galinhas.
Herpesviridae
485
forma bastante grave da infeco, com altas taxas de morbidade e mortalidade. Por outro lado, amostras de baixa virulncia podem causar uma forma subclnica da infeco. Nos surtos mais agudos, a morbidade pode atingir de 90 a 100%, e a mortalidade pode chegar a 70%. Nestes casos, as aves podem morrer em at dois a trs dias psinfeco. Mais freqentemente, a mortalidade muito baixa (at 2%). A infeco afeta principalmente a traquia e laringe e caracterizada por tosse e dispnia. Em casos hiperagudos (raros), a tosse pode no ser observada, ocorrendo somente dispnia, cianose e morte sbita. Os sinais clnicos mais observados na fase aguda so: descarga nasal e traqueal e tosse. Pode ser observado ainda: conjuntivite, edema periorbital e ceratite; e as aves podem eliminar uma secreo traqueal mucosa e hemorrgica. As aves tendem a se recuperar em 7 a 10 dias ps-infeco. As leses associadas com infeco pelo ILTV se localizam predominantemente nas vias areas superiores. Freqentemente observa-se congesto acentuada da mucosa da laringe e traquia, que, em fases mais avanadas, podem se apresentar hemorrgicas e com exsudato caseoso. Corpsculos de incluso intranucleares podem ser observados nas clulas epiteliais da traquia. A infeco com amostras menos virulentas pode resultar em leses bem mais leves, em que apenas um edema facial, sinusite e conjuntivite so observados. A infeco pelo ILTV induz a produo de anticorpos neutralizantes, mas os ttulos de anticorpos no apresentam correlao direta com proteo. Dessa forma, mesmo animais soropositivos ao ILTV so susceptveis doena e podem desenvolver sinais clnicos quando infectados com o vrus de campo. Alm disso, foi demonstrado que aves bursectomizadas no produzem anticorpos anti-ILTV, mas podem car protegidas contra uma reinfeco, indicando a importncia da imunidade celular.
membrana corioalantide de ovos com embries de 9 a 11 dias de idade. Por volta do quarto dia ps-inoculao, observa-se o espessamento da membrana corioalantide e a formao de placas necrticas. O vrus tambm pode ser isolado pela inoculao dessas amostras em clulas primrias de rim ou de fgado de pintos. O ECP observado inclui a formao de sinccios, corpsculos de incluso intranucleares e lise das clulas infectadas. A identicao do vrus a partir de amostras clnicas ou do agente recentemente isolado pode ser realizada pelas tcnicas de IFA, PCR ou ME. A deteco de anticorpos pode ser realizada pelas tcnicas de IFI, SN, ELISA ou IDGA. Animais sorologicamente positivos, que no foram vacinados, so considerados portadores latentes e podem disseminar o vrus para animais susceptveis.

O controle da infeco pelo ILTV realizado pelo emprego de vrias medidas que visam evitar o contato das aves com o agente. Assim, galinhas de diferentes idades e origens no devem ser misturadas no mesmo lote; deve-se fazer uso de medidas de higiene e desinfeco adequadas dos galpes; controle de animais que entram em contato com as aves como roedores alm do uso sistemtico de vacinao. Vacinas vivas modicadas tm sido utilizadas na preveno da infeco durante dcadas em vrios pases. As amostras vacinais so atenuadas pela passagem em ovos embrionados ou cultivos celulares e podem ser aplicadas na gua de bebida ou por aerossis. Muitas dessas vacinas so ecazes, mas podem apresentar virulncia residual, que pode aumentar medida que o vrus vacinal circula na populao vacinada. Sendo assim, vrios surtos de LT tm sido atribudos a amostras vacinais que recuperaram a virulncia e comearam a causar infeces graves em aves susceptveis.
6.7.2.3 Diagnstico
O ILTV pode ser isolado a partir de amostras clnicas (traquia e pulmes) inoculadas na
ACKERMANN, M.; PETERHANS, E.; WYLER, R. DNA of bovine herpesvirus type 1 in the trigeminal ganglia of latently
486
infected calves. American Journal of Veterinary Research, v.43, p.36-40, 1982. ALEXANDER, H.S.; NAGY, E. Polymerase chain reaction to detect infectious laryngotracheitis virus in conjunctival swabs from experimentally infected chickens. Avian Diseases, v.41, p.646-693, 1997. ALICE, F.J. Isolamento do vrus da mamilite herptica no Brasil. Revista de Microbiologia, v.8, p.9-15, 1977. ALLEN, G.P. et al. Advances in understanding of the pathogenesis, epidemiology and immunological control of equine herpesvirus abortion. In: WERNERY, U. et al (eds). Equine infectious diseases. In: INTERNATIONAL CONFERENCE, 8. Dubai, United Arab Emirates: R&W Publications, Newmarket, 1999. p.129-146. ALLEN, G.P.; BRYANS, J.T. Molecular epizootiology pathogenesis and prophylaxis of equine herpesvirus-1 infections. Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, v.2, p.78-144, 1986. ARDANS, A.A. Herpesviridae. In: HIRSH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Massachusetts: Blackwell Science, 1999. Cap.63, p.350-365. BAATEN, B.J.; BUTTER, C.; DAVISON, T.F. Study of host-pathogen interactions to identify sustainable vaccine strategies to Mareks disease. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.100, p.165-177, 2004. BAGUST, T.J.; GUY, J.S. 1997. Laryngotracheitis. In: CALNEK, B.W. et al. (eds). Diseases of poultry. 10.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1997. p.527-539. BAIGENT, S.J. et al. Vaccinal control of Mareks disease: Current challenges, and future strategies to maximize protection. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.112, p.7886, 2006. BAIGENT, S.J.; DAVISON, T.F. Mareks disease virus: biology and life cycle. In: DAVISON, F.; NAIR, V. (Eds). Mareks disease, an evolving problem. Oxford: Elsevier, 2004. p.62-77. BARTHA, A. et al. Occurrence of encephalomyelitis caused by infectious bovine rhinotracheitis virus in calves in Hungary. Acta Veterinaria Academiae Scientiarum Hungaricae, v.19, p.145-151, 1969. BAUER, A.G. Primeira constatao do mal de Aujeszky no Rio Grande do Sul. Boletim do Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor, v.1, p.15-16, 1955. BECKER, Y. et al. Polymerase chain reaction for differentiation between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Mareks disease viruses (MDV) and vaccine viruses of MDV-serotypes 2 and 3. Journal of Virological Methods, v.40, p.307-322, 1992. BELL, S.A. et al. Temporal detection of equine herpesvirus infections of a cohort of mares and their foals. Veterinary Microbiology, v.116, p.249-257, 2006.
Captulo 17
BUONAVOGLIA, C. et al. Reactivation of caprine herpesvirus 1 in latently infected goats. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.19, n.4, p.275-281, 1996. CALNEK, B.W. Pathogenesis of Mareks disease virus infection. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.255, p.2555, 2001. CARRILLO, B.J. et al. Meningoencephalitis caused by IBR virus in calves in Argentina. Zentralblatt fur Veterinarmedizim. Reihe B, v.30, p.327-332, 1983. CHRISTENSEN, L.S. et al. Further evidence of long distance airborne transmission of Aujeszkys disease (Pseudorabies) virus. The Veterinary Record, v.132, p.317-321, 1993. dOFFAY, J.M.; MOCK, R.E.; FULTON, R.W. Isolation and characterization of encephalitic bovine herpesvirus type 1 isolates from cattle in North America. American Journal of Veterinary Research, v.54, p.439-534, 1993. DELHON, G. et al. Genome of bovine herpesvirus type 5. Journal of Virology, v.77, p.10339-10347, 2003. EDINGTON, N.; SMITH, B.; GRIFFITHS, L. The role of endothelial cell infection in the endometrium, placenta and fetus of equid herpesvirus 1 (EHV-1) abortions. Journal of Comparative Pathology, v.104, p.379-387, 1991. EHLERS, B. et al. Bovine herpesvirus type 2 is closely related to the primate alphaherpesviruses. Virus Genes, v.19, p.197-203, 1999. ENGELS, M. et al. Goat herpesviruses: biological and physicochemical properties. The Journal of General Virology, v.64, p.2237-2247, 1983. EVERMANN, J.F. Coital Exantema. In: CASTRO, A.E. & HEUSCHELE, W.P. Veterinary diagnostic virology. St Louis: Mosby Year Book. 1992. p159-160. FENNER, F. et al. Veterinary virology. 2.ed. San Diego: Academic Press, 1993. 666p. FORD, R.B. Feline viral upper respiratory disease: herpesvirus and calicivirus. In: WORLD CONGRESS OF THE WORLD SMALL ANIMAL VETERINARY ASSOCIATION, 30th., Mexico City, Mexico, 2005. Proceedings... Disponvel em: http://www. vin.com/proceedings/Proceedings.plx?CID=WSAVA2005&PI D=10952&O=Generic. Acesso em 15 dez. 2006. FRANCO, A.C. et al. A Brazilian gE-negative bovine herpesvirus type 1.2a is attenuated for cattle and induces protection against wild type virus challenge. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.22, p.135-140, 2002. FRAZIER, K. et al. Endometritis in postparturient cattle associated with bovine herpesvirus-4 infection: 15 cases. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.13, p.502-508, 2001.
Herpesviridae
487
ROCK, D.L. Latent infection with bovine herpesvirus type-1. Seminars in Virology, v.5, p.233-240, 1994. ROIZMAN, B. et al. The family Herpesviridae: an update. Archives of Virology, v.123, p.425-449, 1992. ROIZMAN, B.; PELLET, P.E. The Family Herpesviridae: a brief introduction. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.71, p.2381-2397. ROPERTO, F. et al. Natural caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) infection in kids. Journal of Comparative Pathology, v.122, p.298-302, 2000. SALVADOR, S.C. et al. Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvrus no Mato Grosso do Sul e So Paulo. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.18, p.76-83, 1998. SILVA, A.D. et al. Virological ndings from the recent outbreak of Aujeszkys disease in Rio Grande do Sul. Virus Review and Research, v.8, p.133-134, 2003. SILVA, A.M. et al. Experimental infection of sheep with bovine herpesvirus type-5 (BHV-5). Veterinary Microbiology, v.66, p.89-99, 1999. SIX, A. et al. Latency and reactivation of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) in goats and caprine herpesvirus 1 (CpHV-1) in calves. Archives of Virology, v.146, p.1325-1335, 2001. TEMPESTA, M. et al. A preliminary study on the pathogenicity of a strain of caprine herpesvirus-1. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.22, p.137-143, 1999b. TEMPESTA, M. et al. Experimental intravaginal infection of goats with caprine herpesvirus 1. Journal of Veterinary medicine. B, Infectious Diseases and Veterinary Public Health, v.47, p.197201, 2000. THIRY, J. et al. A live attenuated glycoprotein E negative herpesvirus 1 vaccine induces a partial cross-protection against caprine herpesvirus 1 infection in goats. Veterinary Microbiology, v.113, p.303-308, 2006. TIKOO, S.K.; CAMPOS, M.; BABIUK, L.A. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1): biology, pathogenesis and control. Advances in Virus Research, v.45, p.191-217, 1995. VAN MAANEN, C. Equine herpesvirus 1 and 4 infections: an update. The Veterinary Quarterly, v.24, p.58-78, 2002. VAN OIRSCHOT, J.T. Bovine viral vaccines, diagnostics and eradication: past, present and future. Advances in Veterinary Medicine, v.41, p.197-215, 1999. VOGEL, F.S.F. et al. Distribution of bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) DNA in the central nervous system of latently, experimentally infected calves. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.4512-4520, 2003.
FUCHS, W. et al. Molecular biology of avian infectious laryngotracheitis virus. Veterinary Research, v.38, p.261-279, 2007. GIBBS, E.P.J.; REWEYEMAMU, M.M. Bovine herpesvirus. I Bovine herpesvirus 1. II Bovine herpesvirus 2 and 3. The Veterinary Bulletin, v.47, p.317-343, 1977. GUY, J.S.; BARNES, H.J.; SMITH, L.G. Rapid diagnosis of infectious laryngotracheitis using a monoclonal antibody-based immunoperoxidade procedure. Avian Pathology, v.21, p.77-86, 1992. KAHRS, R.F. Infectious bovine rhinotracheitis and infectious pustular vulvovaginitis. In: ______. Viral diseases of cattle. 2.ed. Ames, Iowa: Iowa State University Press, 2001. Cap.18, p.159170. KLUGE, J.P. et al. Pseudorabies (Aujeszkys Disease). In: STRAW, B.E. et al. (Eds.) Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1999. p.233-246. METZLER, A.E.; SCHUDEL, A.A.; ENGELS, M. Bovine herpesvirus 1: molecular and antigenic characteristics of variant viruses isolated from calves with neurological disease. Archives of Virology, v.87, p.205-217, 1986. MORS, N.; ZANELLA, J.C. Programa de erradicao da doena de Aujeszky no Estado de Santa Catarina. In: CONGRESSO DE VETERINRIOS ESPECIALISTAS EM SUNOS, 11. Anais... Goinia: UFGO, p.126-131, 2003. MLLER, T. et al. Eradication of Aujeszkys disease in Germany. Journal of Veterinary Medicine. B, Infectious Diseases and Veterinary Public Health, v.50, p.207-213, 2003. MURPHY, F.A. et al. Herpesviridae. In: ______. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap.18, p.301326. OSORIO, F.A. Bovine mammillitis. In: CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.E. Veterinary diagnostic virology: a practioners guide. Baltimore: Mosby Year Book, 1992. Cap.26, p.83-85. PARSONSON, I.M.; SNOWDON, W.A. The effect of natural and articial breeding using bulls infected with or semen contaminated with, infectious bovine rhinotracheitis virus. Australian Veterinary Journal, v.51, p.365-369, 1975. PATEL, J.R.; HELDENS, J. Equine herpesviruses 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4)--epidemiology, disease and immunoprophylaxis: a brief review. Veterinary Journal, v.170, p.14-23, 2005. POVEY, R.C.; JAMES, Z.H. Bovine herpes mammillitis virus and vulvovaginitis. The Veterinary Record, v.92, p.224-229, 1973. RECH, R.R. et al. Febre catarral maligna em bovinos no Rio Grande do Sul: epidemiologia, sinais clnicos e patologia. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.25, p.97-105, 2005.
488
VOGEL, F.S.F. et al. Intrapreputial infection of young bulls with bovine herpesvirus type 1.2 (BHV-1.2): acute balanoposthitis, latent infection and detection of viral DNA in regional neural and non-neural tissues 50 days after experimental reactivation. Veterinary Microbiology, v.98, p.185-196, 2004. WEIBLEN R. al. Bovine meningo-encefalitis from IBR virus. The Veterinary Record, v.124, p.666-667, 1989.
Captulo 17
WITTER, R.L. Increased virulence of Mareks disease virus eld isolates. Avian Diseases, v.41, p.149-163, 1997. WYLER, R.; ENGELS, M.; SCHWYZER, M. Infectious bovine rhinotracheitis/vulvovaginitis (BHV-1). In: WITTMAN, G. (Ed). Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Hingham, MA: Kluwer, 1989. p.1-72.
POXVIRIDAE
Cludio Wageck Canal
18
491 491 493
493
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura dos vrions

3.1 O genoma
4 Replicao 5 Poxvrus de interesse veterinrio

5.1 Gnero Orthopoxvirus 5.1.1 Vrus da vaccinia 5.1.2 Vrus da varola dos bubalinos 5.1.3 Vrus da varola bovina 5.1.4 Vrus da varola dos camelos 5.1.5 Vrus da varola dos macacos 5.1.6 Vrus da ectromelia 5.1.7 Vrus Uasin Gishu 5.2 Gnero Capripoxvirus 5.2.1 Vrus da varola ovina e caprina 5.2.2 Vrus da doena da pele nodulosa 5.3 Gnero Suipoxvirus 5.3.1 Vrus da varola suna 5.4 Gnero Molluscipoxvirus 5.4.1 Vrus do Molluscum contagiosum 5.5 Gnero Yatapoxvirus 5.5.1 Vrus yabapox e tanapox 5.6 Gnero Avipoxvirus 5.6.1 Vrus da bouba aviria
495 497
497 497 498 498 498 499 499 499 500 500 501 502 502 503 503 503 503 504 504
5.7 Gnero Leporipoxvirus 5.7.1 Vrus do mixoma dos coelhos 5.8 Gnero Parapoxvirus 5.8.1 Vrus do ectima contagioso 5.8.2 Vrus da pseudovarola bovina 5.8.3 Vrus da estomatite papular bovina
505 505 506 506 508 509
6 Os poxvrus como vetores de expresso 7 Bibliograa consultada
509 511
1 Introduo
Os membros da famlia Poxviridae infectam diversas espcies de invertebrados e vertebrados, incluindo o homem. Os poxvrus foram os primeiros vrus estudados intensivamente em laboratrio, pois podem ser visualizados sob microscopia tica. Tambm foram os primeiros vrus a serem multiplicados e titulados em cultivo celular, puricados sicamente e caracterizados quimicamente. A histria da imunologia e a vacinologia est fortemente ligada a esses vrus, pois as observaes iniciais de proteo, associada com exposio deliberada a agentes infecciosos se devem a Edward Jenner, nos clssicos estudos com os vrus da varola bovina e humana. Alm disso, o agente da varola tambm foi o primeiro vrus erradicado da populao humana, em 1979, aps dcadas de programas macios de vacinao em todo o mundo. Apesar da erradicao da varola, considerada uma das principais molstias infecciosas humanas em todos os tempos, o interesse nos poxvrus tem se renovado nos ltimos anos. Parte desse interesse se deve possibilidade de se utilizar o genoma dos poxvrus para clonar e expressar genes heterlogos para uso em vacinas, como foi feito na vacina utilizada para o controle da raiva silvestre em candeos na Europa. Outra fonte recente de interesse nesses vrus advm da temeridade do seu uso potencial em bioterrorismo. Os poxvrus tambm so muito estudados como exemplos de interaes complexas entre os vrus e seus hospedeiros, pois o seu genoma codica uma srie de protenas que interagem com os mecanismos imunolgicos desencadeados em resposta infeco. As principais propriedades dos poxvrus so: a) possuem vrions grandes e complexos; b) os vrions contm diversas enzimas para a sntese e modicao de RNAs mensageiros (mRNA); c) o genoma consiste de uma molcula de DNA de
ta dupla com 130 a 300 kb; d) realizam a sua replicao inteiramente no citoplasma. A gama de hospedeiros das diferentes espcies de poxvrus varia de extremamente restrita a excessivamente ampla. A severidade da infeco tambm varia muito de uma espcie para outra, podendo resultar desde infeco autolimitante local at doena sistmica devastadora, como no caso da varola. No obstante, a doena tpica dos poxvrus acomete a pele, embora sinais clnicos generalizados possam estar presentes. A doena nas aves predominantemente proliferativa, enquanto nos mamferos predominam as leses vesiculares e pustulares.
2 Classicao
Os membros da Poxviridae so subdivididos em duas subfamlias: Entomopoxvirinae, que contm vrus que infectam insetos; e Chordopoxvirinae, cujos membros infectam os vertebrados e sero os objetos deste captulo. A subfamlia Chordopoxvirinae formada por oito gneros, denominados Orthopoxvirus, Capripoxvirus, Suipoxvirus, Leporipoxvirus, Avipoxvirus, Molluscipoxvirus, Yatapoxvirus e Parapoxvirus. O prottipo da famlia o vrus da vaccinia (VV), cujos hospedeiros naturais e origem permanecem controversos. Esse vrus foi isolado inicialmente de bfalos, mas parece ter sido transmitido para esses animais por humanos. A Tabela 18.1 apresenta a classicao das principais espcies de poxvrus que infectam os animais domsticos e a sua distribuio geogrca. Os membros de um gnero so relacionados gentica e antigenicamente entre si, alm de possurem a morfologia das partculas e a gama de hospedeiros similares. No entanto, tambm existe alguma reatividade sorolgica cruzada entre vrus de diferentes gneros, apesar da identidade gentica ser menor do que 75%. A Figura 18.1 apresenta uma rvore logentica para ilustrar a relao gentica entre os gneros e espcies dessa famlia.
492
Captulo 18
Tabela 18.1. Principais poxvrus que infectam os animais domsticos e o homem, seus hospedeiros e distribuio geogrfica.
Poxviridae
493
96 100
Vrus da varola dos camelos Vrus da varola humana Vrus da vaccinia Vrus yabapox
Orthopoxvirus
100
99 75 100 53
Vrus da varola ovina Vrus do mixoma Vrus da varola suna Vrus da estomatite papular bovina 100 100 Vrus do ectima contagioso Vrus da varola dos canrios Vrus da varola aviria Vrus do Molluscum contagiosum
Yatapoxvirus Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus Parapoxvirus Avipoxvirus Molluscipoxvirus
0,1
Fonte: Andr Felipe Streck
Figura 18.1. rvore filogentica construda a partir da anlise do gene que codifica a DNA polimerase de espcies dos diferentes gneros da famlia Poxviridae. A anlise foi realizada pelo mtodo de Neighbor-Joining (10.000 repeties) e utilizada a matriz de substituio Dayhoff Matrix Model (PAM). O comprimento dos ramos dado pelo nmero de substituies por stio.

Os vrions dos membros da famlia Poxviridae so grandes e complexos e contm as enzimas necessrias para a sntese de mRNA. A arquitetura do nucleocapsdeo complexa, j que no possui a simetria isomrica icosadrica ou helicoidal encontrados na maioria dos outros vrus. Os vrions possuem a forma de um tijolo arredondado, com dimenses que variam de 170 a 260 nm de largura/espessura por 300 a 450 nm de extenso. Os vrions do VV apresentam a forma de retngulos arredondados, com dimenses de 270 x 360 nm. O envelope lipoprotico de 30 nm de espessura envolve duas estruturas laterais (corpos laterais) e um ncleo (Figura 18.2). Uma forma extracelular do vrion possui um envelope adicional externo em relao a sua forma intracelular. O envelope adicional adquirido pelo brotamento atravs da membrana plasmtica; os vrions desprovidos do envelope adicional so liberados por lise celular e so menos infecciosos. Os vrions intracelulares desprovidos do envelope adicional so denominados IMV (intracellular mature virions), e os extracelulares com o duplo envelope so chamados de EEV (extracellular enveloped virions). A Figura 18.2 apresenta fotograas de microscopia eletr-
nica de dois poxvrus diferentes e uma ilustrao esquemtica dos respectivos vrions.
3.1 O genoma
O genoma dos poxvrus consiste de uma molcula de DNA linear de ta dupla com 130 kb (parapoxvrus) a 300 kb (avipoxvrus). O genoma contm seqncias repetidas invertidas do tipo hairpin (ITRs) de 0,1 a 12,4 kb nas extremidades e uma regio nica longa que ocupa a regio central (Figura 18.3). As duas cadeias de DNA que compem o duplex so unidas entre si nas extremidades por curvas (loops). As regies que formam as curvas so ricas em A-T e no so complementares, no permitindo o pareamento entre elas. Aproximadamente 50 seqncias genmicas completas de diferentes poxvrus j foram obtidas, permitindo uma descrio detalhada da estrutura, organizao genmica e dos genes individuais. Nos Chordopoxvirus, o nmero de genes de aproximadamente 150, embora mais de 300 genes j tenham sido deduzidos no genoma do poxvrus do canrio. Aproximadamente 90 dos 150 genes so conservados no genoma de todos os Chordopoxvirus e codicam produtos que par-
494
Captulo 18
Tbulos de superfcie
Corpo lateral
Membrana do ncleo
Orthopoxvirus
Envelope
Membrana externa
Tbulos de superfcie
Envelope
Membrana do ncleo
Parapoxvirus
Fonte: ME: Dr Stewart McNulty; qub.ac.uk. Ilustraes: adaptadas de Murphy et al.(1999).
Corpos laterais
Membrana externa
Figura 18.2. Vrions de membros da famlia Poxviridae (esquerda: fotos de microscopia eletrnica; direita: ilustrao esquemtica dos vrions). A, B) Vrions do gnero Orthopoxvirus; C, D) Vrions do gnero Parapoxvirus. Barra = 100 nm.
Repetio invertida 10 kbp
Seqncias nicas 160 kbp
Repetio invertida 10 kbp
Seqncias repetidas
Seqncias repetidas
0,9 kbp
1,3 kbp
1,3 kbp
0,9 kbp
Figura 18.3. Ilustrao esquemtica da estrutura do genoma dos poxvrus. O genoma constitudo por uma molcula de DNA de cadeia dupla cuja regio mais longa nica e apresenta as cadeias complementares e pareadas. Prximas s extremidades do genoma existem regies repetidas na orientao inversa, ricas em A-T, que no so exatamente complementares e, por isso, no esto pareadas. As extremidades do genoma so unidas entre si, formando uma inflexo (loop) e conferindo continuidade molcula de DNA.
Poxviridae
495
ticipam da replicao do DNA, da transcrio, da morfognese e da estrutura das partculas virais. Os genes mais conservados se localizam na regio central do genoma, e os genes localizados entre a regio central e as extremidades do genoma tendem a ser espcie-especcos e codicam protenas cujas funes antagonizam a resposta imune do hospedeiro. Esses genes so chamados coletivamente de genes de virulncia. Ao contrrio dos genes centrais conservados, vrios genes de virulncia so dispensveis para a replicao viral em cultivo celular. Uma das dezenas de protenas codicadas pelo genoma viral (peso molecular de 58 kDa) forma os tbulos da superfcie do vrion, que induzem a produo de anticorpos neutralizantes e inibidores da fuso celular. Oito protenas, incluindo uma hemaglutinina, foram identicadas no envelope externo dos vrions extracelulares e pelo menos quatro protenas esto conjugadas com o DNA genmico. Os poxvrus codicam vrias protenas envolvidas na evaso e modulao da resposta imunolgica do hospedeiro. Alguns genes provavelmente foram adquiridos recentemente dos hospedeiros por recombinao, pela sua semelhana com genes encontrados nas espcies animais infectadas. Esses genes codicam produtos envolvidos na resposta imune do hospedeiro (MHC classe I, interleucinas 10, 18 e 24, receptores do interferon gama e do fator de necrose tumoral II), alm de outros envolvidos na resistncia das clulas ao estresse oxidativo (glutaredoxina e glutationa peroxidase). Essa captura de genes do hospedeiro tem sido uma caracterstica decorrente na evoluo dos poxvrus e parece desempenhar um papel na adaptao desses vrus para resistir aos mecanismos de defesa do hospedeiro, pelo bloqueio da atividade de vrias citocinas, quimiocinas, serion-proteases e complemento, entre outras. Essa diversidade de estratgias utilizadas pelos poxvrus para assegurar a sua sobrevivncia tem propiciado o conhecimento de vrios aspectos da imunologia, virologia e inamao. Devido a natureza antiinamatria de vrias protenas dos poxvrus, algumas tm demonstrado potencial para o uso teraputico em inamaes agudas e crnicas.
4 Replicao
A maioria dos poxvrus replica com ecincia em cultivos celulares, com exceo dos parapoxvrus, poxvrus de sunos e vrus do Molluscum contagiosum. Esses vrus tambm podem ser multiplicados em ovos embrionados de galinhas, onde produzem placas (focos) esbranquiadas (pocks) na membrana corioalantide. Os poxvrus codicam todas as enzimas necessrias para a transcrio e replicao do genoma viral. Tambm trazem, nos vrions, as enzimas para a produo e modicao dos mRNA para a sntese de suas protenas, o que os tornou independentes do ncleo celular. Aps a fuso do vrion com a membrana plasmtica ou aps a endocitose, o ncleo viral liberado no citoplasma, onde ocorrem todas as etapas do ciclo replicativo. O processo de expresso gnica caracterizado pela transcrio temporal de trs classes de genes (genes iniciais, intermedirios e tardios). A transcrio de cada grupo de genes requer a presena de fatores de transcrio especcos que so produzidos pelos genes do grupo precedente. A transcrio iniciada pela RNA polimerase viral e outros fatores presentes no ncleo do vrion, e resulta na produo de mRNAs alguns minutos aps a penetrao, ainda no genoma no totalmente desnudo. Os mRNAs do VV so detectados 20 minutos aps a penetrao e atingem picos em aproximadamente 1 a 2 horas aps. As protenas produzidas pela traduo desses mRNAs completam o desnudamento do genoma e a transcrio de aproximadamente 100 genes iniciais. Essas etapas ocorrem previamente ao incio da replicao do DNA. Em clulas infectadas pelo VV, a replicao do DNA se inicia aproximadamente 1 a 2 horas aps a infeco e resulta na produo de at 10.000 cpias do genoma por clula, metade das quais ser empacotada na prognie viral. Em outros poxvrus, o incio da replicao pode ser mais tardio, como nos parapoxvrus (4-6 h) e poxvrus avirios (12-16 h). O incio da replicao parece ocorrer em ambas as extremidades do genoma e envolve a clivagem das cadeias de DNA no stio de iniciao, seguida de replicao
496
Captulo 18
por deslocamento da cadeia complementar. A replicao do genoma envolve a sntese de longos intermedirios concatamerizados (unidos pelas extremidades), que so subseqentemente clivados em unidades genmicas nicas. Aps o incio da replicao, ocorre uma mudana dramtica na expresso gnica, quando os produtos dos genes iniciais se ligam aos promotores de genes intermedirios e tardios, ativando a sua transcrio e conseqente expresso. Alguns fatores de transcrio de genes iniciais so sintetizados tardiamente na infeco e empacotados nos vrions para serem utilizados no incio do prximo ciclo de infeco. Pelo fato de os vrions serem constitudos por um grande nmero de protenas, razovel
que a produo da prognie dos poxvrus tambm seja um processo complexo e que necessite vrias horas para ser completada. A replicao e a produo de vrions ocorrem em determinados locais do citoplasma, denominados viroplasmas ou fbricas de vrus. Os vrions envelopados so liberados atravs de brotamento, e os vrions no-envelopados podem ser liberados por brotamento ou lise da clula. Ambas as formas dos vrions so infecciosas, embora as formas envelopadas infectem novas clulas mais rapidamente e parecem ser mais importantes na disseminao do vrus no organismo do hospedeiro. O ciclo replicativo dos poxvrus est ilustrado esquematicamente na Figura 18.4.
4 1
6 7
8 11 3 Ncleo 12 10 9
Citoplasma
14 13
Figura 18.4. Ciclo replicativo dos poxvrus. Os vrions se ligam a receptores de superfcie e penetram por fuso do envelope com a membrana plasmtica, liberando o ncleo (core) no citoplasma (1). As enzimas trazidas nos vrions sintetizam os mRNAs dos genes iniciais (2) que so traduzidos em protenas iniciais (3). As protenas iniciais participam do desnudamento completo do genoma (4), na sua replicao (5) e na transcrio dos genes intermedirios (6), cujos mRNAs so traduzidos em protenas (7). As protenas intermedirias esto envolvidas principalmente na transcrio dos genes tardios (8), e participam das fases finais de replicao (resoluo e separao das molculasfilhas de DNA) (11,12). As protenas tardias(9) fazem parte da estrutura vrica e participam da morfognese dos ncleos virais (10), que adquirem o envelope pelo brotamento no aparelho de Golgi (13) e so liberados da clula (14).
Poxviridae
497
5 Poxvrus de interesse veterinrio

Somente dois poxvrus so especcos do homem: o vrus da varola e o vrus do Molluscum contagiosum. Seis outras espcies de poxvrus podem, esporadicamente, causar infeces zoonticas. A Tabela 18.1 apresenta os principais poxvrus de interesse veterinrio, os quais sero detalhados a seguir.
5.1 Gnero Orthopoxvirus

Os ortopoxvrus so morfologicamente indistinguveis entre si e a sua replicao produz corpsculos de incluso citoplasmticos. Os membros desse gnero so antigenicamente relacionados e, por isso, um vrus pode ser utilizado em vacina para induzir imunidade protetora contra os demais. Essa imunidade parece ser de longa durao. Apesar de sua semelhana, esses vrus podem ser distinguidos por sorologia, aspectos morfolgicos, temperatura em que produzem leses na membrana corialantide de embries de galinha, por eletroforese de protenas, tcnicas de caracterizao gentica e efeito citoptico em cultivos celulares. As leses podem estar connadas a regies especcas da pele ou serem sistmicas. As leses de pele geralmente iniciam como ppulas, que evoluem para pstulas e crostas. Os hospedeiros naturais de vrias espcies de ortopoxvrus ainda no esto bem denidos e, possivelmente, incluam vrias espcies de roedores silvestres. Na maioria das infeces, o diagnstico pode ser realizado por microscopia eletrnica (ME) de material coletado das bordas das leses ou por isolamento viral. O isolamento pode ser realizado pela inoculao do material suspeito na membrana corioalantide de ovos embrionados de galinha, em cultivos celulares e em animais de laboratrio, pela inoculao aps escaricao da pele.
5.1.1 Vrus da vaccinia

O vrus da vaccinia (VV) o prottipo do gnero Orthopoxvirus e foi amplamente utilizado na formulao de vacinas para o controle e erra-
dicao da varola humana. O VV possui uma distribuio muito ampla e capaz de infectar uma grande variedade de espcies animais, em algumas das quais produz doena clinicamente semelhante causada pelos poxvrus especcos de cada hospedeiro. A sua ocorrncia em rebanhos leiteiros, em pocas anteriores a interrupo da vacinao contra a varola humana, era freqentemente associada com manifestaes clnicas semelhantes e, por isso, atribudas ao vrus da varola bovina. Aps a interrupo da vacinao contra a varola humana, acredita-se que praticamente a totalidade dos casos de varola bovina seja, de fato, associada com o vrus bovino. No entanto, desde 1999, vrios surtos de doena exantematosa e vesicular tm sido relatados em bovinos leiteiros na regio Sudeste do Brasil. Os surtos geralmente ocorrem em propriedades que realizam ordenha manual, sem os cuidados adequados de higiene. Em parte desses eventos, as leses foram observadas concomitantemente em pessoas e vacas. Nas vacas, as leses so semelhantes s descritas nos casos de infeco pelo VV. As leses iniciais nas tetas e bere se caracterizam por eritema rseo e edema localizado, que leva formao de vesculas. As vesculas rapidamente evoluem para ppulas e pstulas que, posteriormente, se rompem e supuram. O prximo estgio caracterizado pela formao de crostas escuras, algumas vezes recobrindo grandes reas que podem, subseqentemente, ulcerar. O curso da doena pode durar entre trs e quatro semanas. A ocorrncia de contaminao bacteriana secundria pode resultar em mastite. Bezerros que se amamentam nas vacas afetadas desenvolvem leses no focinho e na mucosa oral. As pessoas afetadas so geralmente aquelas que realizam a ordenha, apresentando leses nas mos, indicando que foram infectadas pelo contato com os animais. Algumas pessoas relatam a ocorrncia de cefalia, dores musculares, hipertermia e linfadenopatia. Um dos primeiros vrus caracterizados a partir desses eventos foi denominado Cantagalo, por ter sido isolado de um surto de doena vesicular bovina e humana no municpio com este nome no estado do Rio de Janeiro, em 1999. A anlise biolgica e molecular revelou que esse v-
498
Captulo 18
rus mais semelhante ao VV do que ao poxvrus da varola bovina. Alm disso, o vrus Cantagalo muito semelhante geneticamente ao VV antigamente utilizado em vacinas humanas contra a varola. Esses achados sugerem que este vrus pode ter se originado do VV vacinal, que provavelmente persistiu durante anos em alguma espcie de hospedeiro silvestre e, eventualmente, reemergiu, infectando bovinos e pessoas. Aps esse evento, vrios surtos de doena semelhante, com carter zoontico, tm sido descritos em vrias regies do pas, principalmente na regio Sudeste. Alm disso, todos os ortopoxvrus isolados desde 1963, no pas, foram identicados como derivados do VV. A caracterizao de alguns desses vrus isolados nos surtos recentes refora a hiptese da persistncia do VV em hospedeiros silvestres no Brasil e a sua reemergncia como importante patgeno de bovinos.
5.1.2 Vrus da varola dos bubalinos

O poxvrus dos bfalos (buffalopox) causado por um vrus to semelhante ao VV que no claro se representa uma espcie viral distinta ou no. Surtos dessa doena tm ocorrido nos bfalos-da-gua (Bubalis bubalis) na ndia, Indonsia e Egito. Como foi mencionado acima, vrios surtos causados pelo VV ou vrus geneticamente muito semelhantes ocorreram no Brasil desde 1999, o que resultou em perdas econmicas e afetou a sade dos fazendeiros que, provavelmente, se infectaram por contato direto com seus bovinos durante a ordenha. As leses pustulares nas tetas e bere de bfalas e vacas produtoras de leite assemelham-se quelas causadas pelo vrus da varola bovina. Em eqinos, a infeco resulta em uma apresentao clnica semelhante varola eqina ou dermatite papular eqina. O diagnstico pode ser conrmado por histopatologia, ME ou por isolamento do vrus.
Rssia. Os hospedeiros naturais do vrus so vrias espcies de roedores silvestres. Estes animais atuam como reservatrios do vrus, a partir dos quais pode ser transmitido para vrias espcies domsticas e silvestres. As caractersticas clnicas e as doenas associadas so muito semelhantes s causadas pelo VV, embora os vrus sejam antigenicamente distintos. Em vacas leiteiras, as leses esto geralmente connadas aos tetos. Nos gatos, a doena mais facilmente reconhecida e afeta principalmente os animais que vivem em reas rurais e so bons caadores. Outro fato que indica que os roedores se constituem nos hospedeiros naturais do vrus que a doena tem maior incidncia no outono, quando a populao de roedores maior. Nos gatos, os sinais clnicos iniciam com pequenas ppulas na cabea e membros anteriores, podendo ulcerar, seguido pela formao de crostas. Uma apresentao mais rara envolve coriza, conjuntivite e pneumonia, provavelmente advinda de contaminao bacteriana secundria ou imunodepresso causada pelo vrus da leucemia felina (FeLV) e vrus da imunodecincia felina (FIV). Eventualmente os gatos podem transmitir a doena para o homem, que geralmente desenvolve uma nica erupo maculopapular na mo ou na face. A seguir, podem advir sinais sistmicos, como nusea, febre e adenopatia. O curso da doena mais severo em crianas e, embora raro, pode resultar em morte. Vrios surtos da doena em zoolgicos so descritos na literatura, especialmente afetando os grandes felinos (chita, ocelote, lince, jaguar, puma, leo e pantera), alm de rinocerontes, elefantes e ocapis, com as chitas apresentando uma alta taxa de mortalidade. O diagnstico pode ser conrmado por histopatologia, ME ou isolamento do vrus. Doenas causadas pelo VV, vrus da mamilite herptica (herpesvrus bovino tipo 2 BoHV-2), devem ser consideradas no diagnstico diferencial da doena em bovinos. As medidas prolticas tm pouco impacto no controle e preveno da doena.
5.1.3 Vrus da varola bovina

A varola bovina (cowpox) ocorre principalmente na Europa e nas regies adjacentes da
5.1.4 Vrus da varola dos camelos

O vrus da varola dos camelos (camelpox) causa uma doena generalizada severa que cursa
Poxviridae
499
com o desenvolvimento de um grande nmero de leses na pele. A forma mais severa ocorre principalmente nos animais jovens, podendo causar uma mortalidade de at 25%. Este vrus distinguvel dos outros ortopoxvrus atravs do perl gerado por restrio enzimtica do genoma. A doena tem importncia nas regies em que os camelos so criados para transporte e produo de leite, como na frica, Oriente Mdio e sudoeste da sia. Este vrus aparentemente no infecta humanos, apesar da freqente exposio de pessoas aos animais infectados. Assim, a doena aparentemente restrita aos camelos. Um parapoxvrus (vrus de Ausdyk) tambm infecta camelos e causa um quadro clnico semelhante.
5.1.5 Vrus da varola dos macacos

Apesar de seu nome, os hospedeiros naturais desse vrus parecem ser os esquilos. Esse vrus zoontico e geralmente afeta pessoas que caam macacos e esquilos, para a sua alimentao, na frica Central e Ocidental. Nos ltimos anos, vrios casos e surtos localizados dessa doena tm sido relatados em pessoas na frica. A transmisso do vrus entre pessoas incomum e, assim, parece ser improvvel que a doena se estabelea e se perpetue na populao. mais provvel que a doena continue a ocorrer esporadicamente em pessoas que se expem ao agente pelo contato com os hospedeiros naturais. Os sinais clnicos so semelhantes aos da varola humana, e a enfermidade pode ser prevenida utilizando-se imunizao com o VV.
5.1.6 Vrus da ectromelia

O vrus da varola dos camundongos (mousepox), ou vrus da ectromelia, disseminou-se no mundo todo atravs do transporte de camundongos de laboratrio e seus produtos. Existem duas formas de apresentao clnica: uma fatal aguda, em que ocorre uma extensiva necrose do bao e fgado, com a morte ocorrendo poucas horas aps o incio dos sinais; e a outra crnica, caracterizada por leses ulcerativas nos ps, cauda e focinho. A transmisso ocorre por pequenas abrases na pele e por via respiratria. Uma forma importante de
introduo do vrus em colnias de camundongos atravs de soro de camundongo, lquido asctico, tumores e tecidos. Algumas linhagens so mais resistentes, e a apresentao clnica pode ser leve ou inaparente (C56BL/6, AKR), j outras so muito sensveis (BALB/c, C3H, DBA). A infeco pelo vrus da ectromelia tem sido extensivamente utilizada como modelo para o estudo da patogenia de infeces vricas sistmicas. Aps a penetrao e replicao prxima ao local de entrada (geralmente a pele), onde a replicao produz uma pequena leso papular, o vrus replica nos linfonodos regionais e produz uma viremia primria. Esta viremia permite ao vrus atingir vrios rgos, entre eles o fgado e o bao, onde replica e produz necrose. Essa replicao seguida de uma viremia secundria, pela qual o vrus atinge outros rgos, inclusive a pele, produzindo as leses mculo-papulares e vesiculares caractersticas. Estas leses so seguidas de prurido intenso e ulcerao e se constituem na via de excreo do agente. Dentre os modelos de patogenia, o do vrus da ectromelia um dos mais clssicos, e muitas informaes sobre a patogenia das infeces vricas foram obtidas a partir desse modelo. A introduo desse vrus em uma colnia tem conseqncias devastadoras, desta forma, o diagnstico deve ser feito rapidamente. A varola dos camundongos pode ser diagnosticada por histopatologia, sendo observados corpsculos de incluso citoplasmticos eosinoflicos nas bordas das leses de pele. Atravs de ME, podem ser observados vrions em qualquer tecido infectado. O vrus tambm pode ser isolado em cultivos de clulas de embrio de camundongo e identicado por tcnicas imunolgicas. A preveno e o controle so baseados na quarentena e regras de importao de vrus, de camundongos e seus produtos que podem carrear o vrus. O monitoramento sorolgico regular das colnias tambm deve ser feito, principalmente para diagnosticar as infeces subclnicas.
5.1.7 Vrus Uasin Gishu

O vrus Uasin Gishu, vrus da varola dos cavalos, tem sido isolado somente no Leste da frica. Podem ser encontradas duas formas da
500
Captulo 18
doena: uma em que as leses vesiculares se desenvolvem e outra que apresenta leses mltiplas na mucosa oral.
5.2.1.2 Patogenia e sinais clnicos

Os sinais clnicos variam entre as raas e apresentam variaes de acordo com as regies geogrcas de ocorrncia da doena. Aps aproximadamente uma semana de incubao, durante a qual ocorre uma viremia, o vrus disseminase para a pele, linfonodos, bao, rins e pulmes. A replicao viral nesses tecidos resulta em sintomatologia clnica, como febre, rinite, dispnia, edema de plpebras e conjuntivite. Os animais arqueiam o dorso e param de se alimentar. As leses de pele iniciam por pequenas vesculas que evoluem para ppulas, pstulas, necrose e formao de crostas. Essas leses so mais abundantes nos lbios, lngua, gengiva, narinas externas e pele, principalmente nos locais com cobertura escassa de l. Leses tambm podem ocorrer no trato digestivo, respiratrio, fgado, rins e outros. No caso da varola caprina, a mortalidade pode chegar a 50%, quando acomete raas nativas, e at 100% em raas europias. Em rebanhos susceptveis de ovinos, a doena pode afetar mais de 75% dos animais e causar uma mortalidade de at 50%. Em cordeiros jovens, a mortalidade pode atingir 100%.
5.2 Gnero Capripoxvirus 5.2.1 Vrus da varola ovina e caprina

Dentre as doenas causadas pelos poxvrus, a varola dos ovinos (sheeppox) e a varola dos caprinos (goatpox) esto entre as mais importantes em medicina veterinria. Essas doenas so de noticao obrigatria na maioria dos pases onde ocorrem, e o seu diagnstico essencial para o comrcio e trnsito internacional de pequenos ruminantes.
As varolas ovina e caprina ocorrem no sudoeste da sia, ndia e na maior parte da frica, embora a distribuio geogrca dos dois vrus seja diferente. Essa distribuio geogrca distinta sugere que essas doenas sejam causadas por vrus diferentes. Contudo, estes vrus no podem ser diferenciados atravs de sorologia e a anlise de restrio do genoma indica que so geneticamente muito semelhantes. As cepas de vrus da varola dos ovinos parecem ser mais relacionadas com o vrus da pele nodulosa (lumpy skin) do que com o vrus da varola dos caprinos. Nos animais infectados, o vrus excretado nas exsudaes e descamaes de leses de pele, alm de secrees nasais e oculares durante a fase aguda da doena. A infeco ocorre pela inalao de aerossis ou por feridas e abrases na pele, alm da picada de insetos. A estabulao e o connamento dos animais facilitam esta forma de transmisso. Aps a recuperao clnica da doena, os animais cam imunes a reinfeces pelo mesmo vrus. Por isso, em reas endmicas, a doena generalizada e a mortalidade so raras. J em rebanhos livres da doena, a sua introduo pode resultar em surtos graves. Animais de todas as idades so susceptveis, embora os mais jovens sejam acometidos com maior severidade.

Na maioria dos casos, o diagnstico pode ser realizado com bases nos achados clnicos. Diculdades podem ser encontradas quando houver a presena simultnea do vrus do ectima contagioso (orf), ou em rebanhos parcialmente imunes, nos quais a doena pode ser branda. Fragmentos de pele ou tecidos podem ser obtidos por bipsia para a conrmao do diagnstico atravs de exames histolgicos, ME ou por isolamento viral em clulas de ovinos ou caprinos. Em alguns pases, existe um teste comercial de captura de antgeno para a deteco do vrus da varola caprina. Para a sorologia, podem ser utilizadas a soroneutralizao (SN) e imunouorescncia indireta (IFI). Vrus atenuados e inativados tm sido utilizados na formulao de vacinas para uso nas regies onde essas doenas so endmicas. A vacinao deve ser repetida anualmente, e a resposta
Poxviridae
501
induzida pelas vacinas com vrus atenuados tem sido melhor, provavelmente porque a imunidade mediada por clulas a mais importante para a proteo. Esses vrus tambm tm sido testados como vetores para a confeco de vacinas contra outras viroses de pequenos ruminantes.
5.2.2 Vrus da doena da pele nodulosa

A doena da pele nodulosa (lumpy skin disease, LSD) uma enfermidade aguda ou subaguda ou mesmo cursa como infeco subclnica de bovinos que se caracteriza por febre e formao de mltiplos ndulos rmes na pele, placas necrticas nas mucosas e infartamento de linfonodos perifricos. A doena clinicamente semelhante manifestao cutnea disseminada que ocorre na infeco pelo BoHV-2, denominada pseudo lumpy skin disease. O agente etiolgico (lumpy skin disease virus, LSDV) um poxvrus, originrio provavelmente de caprinos, cujo prottipo e primeiro isolado foi denominado vrus Neethling. Este agente gentica e antigenicamente relacionado aos poxvrus de ovinos e caprinos. Essa semelhana tem permitido o uso do poxvrus de ovinos em vacinas para o controle da LSD em bovinos em alguns pases. O LSDV replica em altos ttulos em uma variedade de clulas de cultivo, mas os isolados de campo demoram a produzir efeito citoptico aps o seu isolamento. O vrus tambm pode ser multiplicado em embries de pinto e na membrana crio-alantide de ovos embrionados de galinha. O vrus muito estvel sob condies ambientais, podendo manter a sua viabilidade em crostas por at 30 dias.
De um foco inicial, a doena pode disseminar-se por longas distncias. Os mais provveis meios de manuteno do vrus entre as epidemias so os bovinos com infeco subclnica ou animais silvestres, possivelmente alguns bubalinos. As raas bovinas europias so mais susceptveis do que as zebunas. A doena no apresenta mortalidade considervel, mas pode trazer prejuzos econmicos importantes devido ao longo tempo em que causa condio debilitante, durante a qual os animais se alimentam pouco e perdem peso. A ocorrncia peridica de surtos em vrios pases africanos refora a necessidade de se adotar medidas de combate enfermidade.

No incio da doena, os animais perdem o apetite e apresentam lacrimejamento e descarga nasal. Na maioria dos animais afetados, ocorre um infartamento generalizado dos linfonodos superciais. A doena caracterizada por febre bifsica, que seguida pelo aparecimento de ndulos na pele que, subseqentemente, se tornam necrticos. Essas leses envolvem a derme e a epiderme. Ndulos tambm so observados na mucosa da boca e narinas. Algumas leses cutneas ou nas mucosas podem ser maiores e apresentarem uma regio central de tecido necrtico que, posteriormente, perde a pele e resulta em lceras profundas. Essas lceras podem levar vrios meses para cicatrizar. Vrios ndulos podem coalescer e formar grandes placas. As leses cutneas se resolvem rapidamente ou persistem como grandes lceras por at meses. Miases ou infeces bacterianas secundrias podem complicar a enfermidade. Os animais com infeces sistmicas podem car muito debilitados e podem ocorrer abortos. A taxa de mortalidade normalmente inferior a 5%, mas o desempenho produtivo prejudicado dos animais infectados pode ocasionar grandes perdas econmicas para os rebanhos atingidos. A imunidade adquirida aps a recuperao da doena geralmente dura pelo resto da vida do animal. Bezerros lhos de mes imunes adquirem imunidade colostral, que confere boa proteo por, aproximadamente, seis meses.
A LSD disseminou-se progressivamente durante o ltimo sculo por toda a frica, onde segue causando surtos com grande freqncia. O agente foi responsabilizado por somente um surto fora desse continente, em Israel, em 1989. A principal forma de disseminao da doena atravs de picadas de insetos hematfagos. Por isso os surtos geralmente ocorrem em pocas de grande abundncia desses vetores (estaes chuvosas).
502
Captulo 18

A apresentao clnica da doena em animais de zonas endmicas altamente sugestiva da doena. Para a conrmao laboratorial, podese coletar material de leses recentes e identicar incluses intracitoplasmticas pelo exame histolgico. O material das crostas pode ser examinado na ME ou inoculado em cultivos de clulas de testculo de cordeiro. A conrmao da identidade do agente isolado deve ser realizada por IFA. Anticorpos especcos podem ser pesquisados por SN. O diagnstico diferencial deve considerar principalmente a infeco generalizada pelo BoHV-2 (pseudo lumpy skin disease) que, geralmente, mais leve, causa leses mais superciais e apresenta um curso mais curto. A infeco pelo BoHV-2 tambm se caracteriza pela presena de incluses intranucleares, em contraste com as incluses citoplasmticas observadas na LSD. Outras doenas que cursam com leses em mucosas, como a peste bovina, infeco pelo BVDV e febre catarral maligna tambm devem ser consideradas. Como o vrus disseminado principalmente por insetos, medidas como quarentena e controle do trnsito de animais so geralmente pouco efetivas. Portanto, o controle baseia-se fundamentalmente na vacinao. Assim, vrus atenuados tanto o LSDV como o vrus da varola ovina ou caprina tm sido utilizados na vacinao proltica dos rebanhos. A imunizao com o vrus Neethling atenuado confere uma longa proteo aps uma nica aplicao, mas a reao inamatria no local da vacinao pode ser severa e levar reduo temporria na produo de leite por vacas em lactao. Bezerros, lhos de vacas natural ou articialmente imunizadas, no necessitam ser vacinados, mas aqueles nascidos de mes susceptveis devem ser vacinados quando da ocorrncia de surtos. A vigilncia sanitria com erradicao tem sido utilizada em pases vizinhos s reas endmicas, e os bovinos que so introduzidos nessas reas devem ser previamente imunizados.
5.3 Gnero Suipoxvirus 5.3.1 Vrus da varola suna

A varola suna (swinepox) uma doena aguda, porm leve, que afeta principalmente sunos jovens e se caracteriza pela formao de ppulas, pstulas e crostas cutneas. No passado, manifestaes clnicas semelhantes foram observadas tambm durante a infeco de sunos com o vrus vaccinia, utilizado para imunizar pessoas contra a varola. Aps a erradicao da varola do mundo e a interrupo da vacinao humana, essa doena tem sido atribuda somente ao poxvrus suno. O agente da varola suna o poxvrus suno (swinepoxvirus), nica espcie que compe o gnero Suipoxvirus. Esse vrus possui morfologia semelhante aos ortopoxvrus, como o vrus da vaccinia, com o qual compartilha alguns determinantes antignicos. Os vrions so altamente resistentes sob condies ambientais e podem resistir em escaras ou crostas por at um ano a temperatura ambiente. Os vrus de campo no replicam bem em cultivos celulares e a sua propagao exige adaptao prvia aos cultivos. O vrus no replica na membrana crio-alantide de ovos embrionados. Assim como outros poxvrus de animais domsticos, esse vrus tem sido utilizado como vetor no desenvolvimento de vacinas para essa espcie.
O poxvrus suno especco dessa espcie, e a infeco distribuda mundialmente. Durante a infeco aguda, o vrus excretado pela saliva e em secrees conjuntivais dos animais infectados e tambm est presente nos uidos das leses. Crostas e escaras podem abrigar o vrus vivel no ambiente durante meses. A transmisso do vrus pode ocorrer por contato direto ou indireto entre animais e tambm mecanicamente atravs de piolhos (Hematopinus suis). Os piolhos infectados podem abrigar o vrus infeccioso por at dois meses. Outros insetos hematfagos tambm podem
Poxviridae
503
potencialmente transmitir o vrus mecanicamente. A transmisso transplacentria tambm pode ocorrer e resulta na produo de leses na pele, lngua e mucosa bucal de leites recm-nascidos.

O vrus possui um tropismo marcante por clulas da epiderme e, em casos graves, pode tambm infectar clulas epiteliais do trato respiratrio superior e digestivo. O perodo de incubao da doena de quatro a 14 dias, e seguido de doena branda com leses geralmente restritas pele. A doena afeta sunos de todas as idades, embora os animais jovens estejam mais predispostos. Febre baixa e breve pode preceder o desenvolvimento de ppulas, que, em um ou dois dias, tornam-se pstulas umbilicadas, que evoluem para crostas. As crostas normalmente caem por volta de uma semana, e a cicatrizao se completa em trs semanas. O estgio vesicular geralmente no observado. As leses podem ocorrer em qualquer local da superfcie do corpo, embora sejam mais abundantes no abdome, na face interna das coxas e nas orelhas. A mortalidade usualmente baixa, mas a morbidade em certos rebanhos pode ser muito alta e causar um srio retardo no crescimento da leitegada. Contaminao secundria das leses por bactrias pode levar formao de abscessos e, eventualmente, ocasionar certa mortalidade. Leses extensas podem resultar do hbito dos animais se coarem em objetos ou anteparos. Os sunos recuperados podem desenvolver imunidade slida, mesmo na ausncia de anticorpos neutralizantes detectveis, o que sugere que a imunidade celular ou humoral local sejam mais importantes para a proteo.
No existem vacinas disponveis para a enfermidade, embora tentativas de imunizao com vrus adaptado em cultivo celular tenham surtido resultados promissores. O controle da doena geralmente obtido pela eliminao dos piolhos, associado com medidas de higiene e desinfeco de ambientes e instalaes.
5.4 Gnero Molluscipoxvirus 5.4.1 Vrus do Molluscum contagiosum

A doena causada pelo vrus do Molluscum contagiosum especca dos humanos, mas ser abordada nesta seo por ser confundida com infeces zoonticas causadas por outros poxvrus. A doena ocorre em crianas em todos os continentes, mas mais comum em alguns pases, como o Congo e Nova Guin. Fontes de contgio bastante comuns so as piscinas coletivas e ginsios de esporte, e as crianas se infectam pelo contato direto com pequenas leses nas mos; a infeco de adultos ocorre freqentemente pela via sexual. A enfermidade caracterizada por ndulos bem delimitados, com 2 a 5 mm de dimetro, limitados epiderme e que ocorrem em qualquer regio do corpo, com exceo da palma das mos e sola dos ps. Os ndulos no causam dor e podem levar vrios meses at a recuperao completa.
5.5 Gnero Yatapoxvirus 5.5.1 Vrus yabapox e tanapox

Os vrus yabapox e tanapox infectam naturalmente humanos e macacos no Oeste da frica. O vrus yabapox causa tumores grandes e benignos em reas desprovidas de plos da face, nas palmas da mo e ps e nos espaos interdigitais, alm das mucosas dos lbios, palato, narinas e sinus de macacos, embora possa infectar humanos em contato com os macacos doentes. O vrus tanapox causa uma doena em humanos, provavelmente contrada pela picada de artrpodos, que adquirem o vrus de algum animal reservatrio. As leses iniciam como ppulas,

As leses na pele, associadas infestao de piolhos, so sugestivas da enfermidade, mas a conrmao laboratorial importante para descartar outras doenas vesiculares. O diagnstico denitivo pode ser obtido por IFA, ME de raspados das leses ou pelo isolamento do agente em cultivo de clulas de sunos.
504
Captulo 18
que progridem para vesculas, geralmente sem o aparecimento de pstulas. Tambm podem ocorrer febre, dor de cabea e prostrao.
5.6 Gnero Avipoxvirus 5.6.1 Vrus da bouba aviria

O vrus da varola aviria tambm muito conhecido como vrus da bouba aviria. As espcies virais classicadas dentro do gnero so especcas de aves e so antigenicamente relacionadas, embora possam ser diferenciadas pelo espectro de hospedeiros, por sorologia e pela formao diferencial de leses em cultivos de clulas e na membrana corioalantide de ovos embrionados. Os vrios vrus deste gnero tambm apresentam patogenicidade diferente de acordo com as espcies de aves. Esses vrus tm sido isolados de todas as espcies de aves domsticas e silvestres e tm recebido denominao relacionada com os seus hospedeiros.
Os avipoxvrus so distribudos mundialmente e as suas infeces tm sido descritas h sculos. Criaes de galinhas, perus e pombos podem sofrer perdas considerveis em algumas pocas do ano, geralmente relacionadas com a presena de um maior nmero de vetores transmissores do agente. O avipoxvrus de galinhas altamente infeccioso para galinhas e perus, raramente para pombos e nada para os patos e canrios. J o poxvrus de perus virulento para os patos.
ca, cutnea ou ambas. A forma cutnea a mais comum nos surtos. As aves afetadas geralmente apresentam poucos sinais sistmicos, como depresso, reduo leve ou moderada do ganho de peso e produo de ovos. As leses evoluem de ppulas para vesculas, pstulas e crostas, dependendo do momento da observao. As regies desprovidas de penas so mais atingidas, principalmente a cabea, pescoo, patas, pernas e ao redor da cloaca. Uma apresentao incomum das leses em reas emplumadas do corpo (dorso e coxas) teve grande repercusso econmica na regio Sul do Brasil nos anos 1990. A forma diftrica se caracteriza por leses na parte superior do trato respiratrio e digestivo, que podem resultar em dispnia, inapetncia, descarga nasal e ocular. As leses nas mucosas caracterizam-se por placas salientes de colorao amarelada, principalmente na boca. Essas leses geralmente acompanham as leses cutneas, mas podem ocorrer isoladamente em alguns indivduos. Resposta imunolgica humoral e celular pode ser detectada aps a recuperao da infeco, mas os anticorpos maternos no so capazes de proteger a prognie.

As leses cutneas e diftricas podem ser examinadas histologicamente e apresentam incluses citoplasmticas. O material coletado pode tambm ser submetido ao isolamento viral. O isolamento pode ser realizado pela inoculao do material em aves susceptveis, por escaricao da crista ou puno da membrana da asa ou atravs de inoculao na membrana corio-alantide de ovos embrionados de 9 a 12 dias. Em cultivos de clulas de aves, o vrus pode no produzir efeito citoptico evidente em uma inoculao inicial. O diagnstico laboratorial importante para diferenci-la da laringotraquete infecciosa, micotoxicose T-2 e decincia de biotina e cido pantotnico. Em regies e pocas do ano mais propensas ocorrncia da doena, os pintos devem ser vacinados j no primeiro dia de vida, por via subcutnea, no incubatrio, ou in ovo no 18 dia de incu-

A transmisso do vrus pode ocorrer por contato direto ou indireto, mas a transmisso mecnica por insetos geralmente a mais importante. A transmisso mecnica por artrpodos o provvel mecanismo de transmisso e disseminao dos diferentes avipoxvrus para as diversas espcies de aves. O perodo de incubao da enfermidade varia entre 4 e 10 dias para galinhas, perus e pombos. A doena pode ocorrer numa forma diftri-
Poxviridae
505
bao. Para a imunizao, podem ser utilizadas cepas virulentas de galinhas que so inoculadas no folculo da pena ou por escaricao da asa ou da perna. Os poxvrus de canrios e de pombos so naturalmente atenuados para galinhas e tambm tm sido utilizados como vacina. O controle da populao de insetos nas pocas problemticas tambm pode ser muito eciente para diminuir a disseminao da doena durante um surto. O tratamento dos animais afetados com antibiticos tambm pode reduzir as infeces secundrias durante os surtos da doena.
nalmente todos os anos devido ao aumento da populao de artrpodes vetores e presena de muitos coelhos jovens susceptveis.

A transmisso do agente pode ocorrer por secrees respiratrias, mas mais comum atravs de artrpodos, como mosquitos, moscas, carrapatos, pulgas e piolhos. Esses artrpodos atuam como vetores mecnicos. O vrus replica nos tecidos prximos picada do inseto e nos linfonodos regionais. A viremia que se segue est associada s clulas, principalmente aos linfcitos. O edema gelatinoso, que mais evidente na cabea e ao redor da rea anogenital, e a blefaroconjuntivite, com secreo ocular opalescente, do aos animais uma aparncia leonina. Os coelhos infectados cam febris e muito apticos, alguns podendo morrer em menos de 48 horas. A maioria dos animais infectados, no entanto, morre em at 12 dias. A progresso e morte rpida pela doena so mais comuns com isolados da Califrnia. Nos coelhos que sobrevivem por mais tempo, o edema subcutneo ocorre em todo o corpo dentro de 2 a 3 dias. A presena do vrus pode ativar a infeco por Pasteurella multocida, resultando em secreo nasal. Temperaturas baixas tambm podem aumentar a severidade da doena. A mortalidade que varia entre 25 e 90% inuenciada tanto pela virulncia da cepa de campo quanto pela resistncia gentica da populao de coelhos.
5.7 Gnero Leporipoxvirus 5.7.1 Vrus do mixoma dos coelhos

O vrus do mixoma o agente da mixomatose, que uma doena generalizada e altamente fatal em coelhos europeus. A denominao da doena se deve ao edema subcutneo gelatinoso que se desenvolve nos animais infectados. Em coelhos selvagens das Amricas, o vrus causa bromas benignos. O vrus do mixoma foi o primeiro vrus introduzido no meio ambiente com o objetivo de controlar uma populao de animais, estratgia utilizada na Austrlia para controlar a populao de coelhos silvestres.
Os hospedeiros naturais do vrus so as espcies de coelhos das Amricas, Sylvilagus brasiliensis, na Amrica do Sul, e S. bachmani na Amrica do Norte. Nesses hospedeiros, o vrus causa um broma cutneo benigno. Contudo, nos coelhos da Europa (Oryctolagus cuniculus), o vrus causa uma doena generalizada que geralmente fatal. Na dcada de 1950, o vrus foi introduzido na populao de O. cuniculus da Europa, Chile e Austrlia para o controle biolgico dessas populaes. Num primeiro momento, mais de 99% da populao de coelhos infectados morria, e a doena tornou-se endmica nessas regies. Aps um determinado perodo, foram detectadas cepas de vrus atenuadas, assim como populaes de coelhos resistentes. Nos locais onde a doena ainda se manifesta, as epidemias ocorrem sazo-

O diagnstico de mixomatose em coelhos europeus pode ser feito pelas manifestaes clnicas. O isolamento do vrus ou a deteco de um poxvrus indistinguvel do VV no exsudato ou leses conrma o diagnstico. O isolamento pode ser feito por inoculao de coelhos, inoculao na membrana corioalantide de ovos embrionados de galinha ou em cultivos de clulas de coelhos ou galinhas. A proteo dos coelhos de laboratrio ou de criaes comerciais pode ser obtida utilizando-se uma vacina viva com uma cepa do vrus do mixoma atenuado ou com o vrus do broma dos
506
Captulo 18
coelhos, um vrus relacionado aos Leporipoxvirus. A reduo das populaes de artrpodes vetores ou o impedimento de sua entrada nos criatrios tambm auxilia no controle da doena em reas endmicas.
5.8 Gnero Parapoxvirus

Os trs parapoxvrus mais importantes em veterinria so: o vrus do ectima contagioso dos ovinos (orf); o vrus da pseudovarola bovina e o vrus da estomatite papular bovina. Esses vrus tambm infectam vrias espcies de animais terrestres e aquticos. As leses causadas pelos parapoxvrus tendem a ser localizadas e proliferativas. As leses causadas pelas trs espcies virais so indistinguveis e se iniciam com ppulas, que aumentam e se tornam granulosas e crostosas, podendo persistir por vrias semanas antes de regredir. Essas trs espcies virais so potencialmente zoonticas e podem afetar pessoas que possuem contato com os animais, como criadores, ordenhadores e veterinrios. As leses nas pessoas se desenvolvem com maior freqncia nas mos e so geralmente localizadas e autolimitantes. Os parapoxvrus possuem vrions com morfologia que difere dos outros gneros de poxvrus, apresentando protenas tubulares organizadas de forma cruzada na superfcie do vrion (ver Figura 18.2). Essa caracterstica possui utilidade para o seu diagnstico, pois permite diferenciao de outros poxvrus atravs da ME.
O OrfV se multiplica em cultivos primrios ou linhagens celulares de ovinos, bovinos e humanos, mas no replica na membrana crio-alantide de ovos embrionados. Isolados de campo apresentam considervel variabilidade gentica, que pode ser evidenciada por anlise de restrio enzimtica do genoma. No entanto, essa variabilidade gentica no se reete em diferenas antignicas detectveis por testes de SN, ou seja, os diferentes isolados so antigenicamente relacionados e apresentam reatividade sorolgica cruzada.
O vrus ocorre em todas as regies do mundo onde existem criaes de ovinos e caprinos e mantido nas populaes por infeces persistentes e tambm pela sua longa sobrevivncia em crostas secas no ambiente. O vrus pode permanecer vivel em crostas secas nas pastagens durante vrios meses e at anos. A disseminao da doena pode ocorrer por contato direto ou indireto por fmites e, principalmente, por pastagens contaminadas. Alm das pastagens, as instalaes, estbulos e utenslios podem abrigar o vrus vivel por longo tempo e servir de veculo para a sua transmisso. Forragens abrasivas contaminadas com o vrus facilitam a instalao da infeco e podem resultar em infeco disseminada. Cordeiros tambm podem adquirir a infeco ao mamarem nas ovelhas com leses nas tetas. Em criaes intensivas, a infeco se dissemina rapidamente, principalmente em connamentos de cordeiros para engorda. A enfermidade afeta animais de todas as idades, mas mais grave em cordeiros lactentes que perdem peso e podem at morrer de inanio por no se alimentarem devido s leses nas comissuras orais. Condies decientes de higiene, decincia de vitamina A, estresse e outras condies que causem imunodepresso predispem ocorrncia de surtos severos. Infeces subclnicas provavelmente tambm ocorram. As taxas de morbidade aps a introduo do agente em rebanhos livres podem atingir 100%, mas a mortalidade geralmente baixa e deve-se principalmente a complicaes secundrias e inanio em cordeiros jovens.
5.8.1 Vrus do ectima contagioso

O vrus do ectima contagioso, ou vrus da orf (OrfV) o agente etiolgico do ectima contagioso dos ovinos e caprinos, tambm chamado de boca sarnenta, dermatite pustular contagiosa de ovinos, estomatite pustular contagiosa, dermatite labial infecciosa e orf. A palavra orf derivada de uma expresso inglesa antiga para rugoso (rough). Em algumas regies do Brasil, a doena em ovinos denominada boqueira. O ectima contagioso uma enfermidade exantematosa vesicular e pustular localizada que afeta ovinos, caprinos e outros pequenos ruminantes. A enfermidade tem distribuio mundial.
Poxviridae
507
O vrus tambm pode infectar espcies silvestres que compartilham pastagens com caprinos e ovinos afetados e, ocasionalmente, ces e humanos envolvidos na criao dessas espcies podem tambm ser infectados.
5.8.1.3 Diagnstico
O diagnstico presuntivo baseia-se nos dados clnicos e epidemiolgicos. As leses crostosas so tpicas, inicialmente afetam poucos animais e rapidamente se disseminam para todos os animais jovens que nunca foram infectados ou vacinados. Em rebanhos virgens, a enfermidade se alastra e infecta animais de todas as idades. Ao exame microscpico, podem ser observadas clulas em forma de balo e corpsculos de incluso do tipo B nas leses epiteliais. O diagnstico clnico, aliado ao histrico e informaes epidemiolgicas, , geralmente, suciente para denir a etiologia da doena. No entanto, o vrus pode ser identicado por ME a partir de crostas coletadas dos animais doentes. O vrus pode tambm ser isolado em clulas cutneas ou de testculo de embrio ovino. Na prtica clnica, o diagnstico geralmente clnico, podendo ser acompanhado de conrmao por ME.

O vrus geralmente penetra pela pele ou juno mucocutnea dos lbios e focinho, pelo contato direto entre animais ou pelo contato e leses causadas por pastagens abrasivas. O perodo de incubao varia entre dois e seis dias. A doena caracterizada por leses nos lbios e focinho, mas pode afetar a boca e lngua, principalmente em cordeiros jovens, alm das reas interdigitais, genitlia e bere. As ppulas e vesculas progridem rapidamente para pstulas e posterior formao de crostas. As leses crostosas so salientes na pele e, freqentemente, apresentam rachaduras e sangramento, podendo predispor a contaminaes secundrias e miases. Traumas leves tambm podem fazer as crostas carem e as leses sangrarem. As leses nos lbios levam reduo da ingesto de pasto ou amamentao, o que leva perda progressiva de peso. As perdas tambm podem decorrer do desenvolvimento de infeces bacterianas e parasitrias (miases) nas leses. Nos casos no complicados, o curso da doena dura alguns dias e seguido da resoluo das leses. A durao da doena no rebanho, no entanto, pode se estender por semanas e at meses, pela infeco gradativa e seqencial de outros animais susceptveis. Na forma genital, as leses podem ocorrer no escroto, prepcio e pnis ou na mucosa vulvar e no perneo. Leses tambm ocorrem com freqncia no bere e nas tetas, o que faz com que as ovelhas evitem a mamada dos cordeiros. A forma generalizada, que no muito comum, geralmente fatal e caracteriza-se pelo desenvolvimento de leses tpicas generalizadas na pele e nas mucosas da boca, faringe e esfago. Uma pleuropneumonia supurativa, devido a contaminaes bacterianas secundrias, termina agravando o quadro e uma das principais responsveis pela mortalidade.

Em reas endmicas, o controle baseia-se na vacinao macia dos rebanhos, utilizando-se o vrus virulento coletado de leses ou multiplicado em cultivos celulares. No Brasil, a vacina disponvel foi produzida pela escaricao cutnea e inoculao do vrus nas leses. A vacinao realizada pela deposio de gotas da vacina em escaricaes da pele, produzidas com objetos pontiagudos (agulhas hipodrmicas) em reas do corpo que no resultem em leses importantes e que no permitam a lambedura, como as axilas e as faces internas das coxas. A vacinao das ovelhas antes do perodo de nascimento dos cordeiros diminui o risco de uma epidemia. A ocorrncia de infeces crnicas, a possibilidade de ovinos previamente expostos se reinfectarem e a longa permanncia do vrus vivel no ambiente tornam difcil a erradicao da doena uma vez estabelecida no rebanho. Em casos de surtos, os animais afetados devem ser separados dos demais e mantidos sob observao para evitar complicaes bacterianas
508
Captulo 18
ou parasitrias. Tratamento tpico das leses e administrao de vitamina A, alm de antibioticoterapia, para evitar contaminaes secundrias, tambm so indicados. Quando possvel, os animais no afetados devem ser mudados de potreiro, evitando o pastoreio em pastagens altamente contaminadas. O fornecimento de alimento macio e palatvel pode favorecer a continuidade da alimentao e a recuperao dos animais afetados. Rebanhos livres devem investir na preveno da introduo do agente, atravs de quarentena de animais eventualmente introduzidos na propriedade.
5.8.2 Vrus da pseudovarola bovina

A pseudovarola bovina (pseudocowpox) ocorre em todo o mundo, mas possui pouca importncia sanitria e econmica na maioria dos pases onde ocorre. uma doena branda e comum de bovinos, que afeta principalmente vacas em lactao. Na Inglaterra, a prevalncia de rebanhos que j apresentaram casos alta; na frica do Sul, a doena tem sido implicada em perdas importantes para rebanhos leiteiros, principalmente pela reduo na produo de leite. Neste pas, a doena tem sido associada a condies precrias de higiene e manejo de gado leiteiro. O vrus da pseudovarola (um parapoxvrus) muito semelhante e possivelmente trata-se da mesma espcie de vrus ao agente da estomatite papular bovina e apresenta alguma relao tambm com o vrus do ectima contagioso dos ovinos. O vrus replica em clulas de cultivo derivadas de bovinos e ovinos, mas no na membrana crio-alantide de ovos embrionados. O agente geralmente introduzido nos rebanhos pela introduo de animais infectados. Uma vez introduzida, a infeco se dissemina lentamente entre os animais do rebanho leiteiro, por contato direto ou indireto. A transmisso ocorre freqentemente pelos bezerros, quando esto se amamentando, ou por moscas, alm dos equipamentos de ordenha e mos do ordenhador. Como foi mencionado, a transmisso do agente e a sua disseminao no rebanho esto diretamente liga-
das a condies inadequadas de higiene e manejo da ordenha. O perodo de incubao situa-se ao redor de seis dias, aps o qual aparecem leses eritematosas nas tetas. As leses evoluem para ppulas com um centro umbilicado e, posteriormente, para crostas abundantes, seguidas de descamao. Vesculas e pstulas recobertas com crostas tambm so comuns, resultando em crostas com aspecto tpico, com a forma de anel ou ferradura. As crostas geralmente so descamadas em poucos dias, mas podem tambm durar por semanas. Contaminaes bacterianas secundrias podem agravar o quadro da infeco aguda e retardar a resoluo, o que pode acarretar em queda importante na produo de leite do rebanho. Leses semelhantes podem ocorrer no focinho de bezerros que esto mamando nas vacas afetadas. A imunidade gerada pela infeco tem curta durao, e infeces recidivantes (mais comuns) ou crnicas (ocasionais) podem ocorrer. O vrus pode ser transmitido e infectar humanos por contato direto, resultando no chamado ndulo do ordenhador (milkers nodule). Alm das leses locais (mos), a fase aguda da doena em humanos pode incluir febre e infartamento dos linfonodos regionais. A enfermidade humana geralmente leve, benigna e se resolve em poucos dias. O diagnstico indicado a microscopia eletrnica sob colorao negativa de material coletado a partir das leses (vesculas ou crostas), em que partculas vricas tpicas podem ser visualizadas. O isolamento viral pode ser tentado, mas geralmente requer vrios dias. Testes sorolgicos no so indicados para o diagnstico e no tm sido mais utilizados. O diagnstico diferencial deve incluir a varola bovina (cowpox), doena de lumpy skin e mamilite herptica (BoHV-2). O controle deve ser realizado mediante medidas de higiene adequadas de ordenha, que devem incluir o mergulho dos tetos em desinfetantes apropriados. O isolamento dos animais afetados e o manejo separado da ordenha podem reduzir a circulao do vrus entre os animais. No existem vacinas disponveis contra essa enfermidade.
Poxviridae
509
5.8.3 Vrus da estomatite papular bovina

A estomatite papular bovina uma doena de importncia limitada em condies normais de manejo de gado leiteiro. A enfermidade ocorre em todo o mundo e parece estar limitada espcie bovina, embora os humanos possam ser eventualmente infectados. A incidncia maior ocorre em bovinos com idade inferior a dois anos, porm pode acometer animais de todas as idades. Tem sido sugerido que o vrus possa estabelecer infeces latentes e, assim, permanecer nos seus hospedeiros por longo tempo. A doena se caracteriza pela produo de exantemas papulares no focinho, lbios e gengivas, e , geralmente, localizada e benigna. O parapoxvrus causador da enfermidade pode ser propagado em cultivos celulares de origem humana, bovina e ovina, porm no replica em ovos embrionados de galinha ou em animais de laboratrio. O vrus excretado pelas secrees nasais e orais, e a transmisso provavelmente ocorra por contato direto ou indireto. O perodo de incubao geralmente de trs a cinco dias. A doena caracterizada pelo desenvolvimento de leses similares pseudovarola bovina nos lbios, papilas bucais, coxim dental, palato mole e duro, lngua, focinho e narinas. Ppulas hipermicas, com necrose na rea central e anis coloridos concntricos, so leses caractersticas. A doena geralmente localizada e no h evidncias de envolvimento sistmico. A maioria dos casos clnicos observada na primavera e incio do vero. A taxa de morbidade, aps a introduo do agente em um rebanho susceptvel, pode atingir 100%. O estresse ou outras situaes de imunodepresso parecem precipitar a enfermidade em animais susceptveis. Por isso a doena pertence ao complexo de doenas associadas ao estresse e aglomerao de animais (crowding syndrome complex). Embora o vrus possa ser isolado em cultivo celular, o diagnstico laboratorial de eleio a ME em material obtido das crostas ou em raspados das leses. Testes sorolgicos no so utilizados.
Doenas que cursem com estomatite em bovinos, como a infeco pelos vrus da febre aftosa (FMDV), da diarria viral bovina (BVDV) e peste bovina (RPV) devem ser consideradas no diagnstico diferencial. O controle da doena feito por medidas de higiene adequadas para evitar a propagao do agente. No existem vacinas comerciais disponveis. Recentemente, uma vacina heterloga, baseada no agente do ectima contagioso dos ovinos, foi desenvolvida, mas no h consenso com relao a sua eccia.
6 Os poxvrus como vetores de expresso

A primeira descrio do uso do VV, como vetor, ocorreu em 1982, e, desde ento, os poxvrus tm se tornado vetores de expresso muito utilizados. A sua utilizao pode ser feita com o m de estudar a biologia molecular dos poxvrus, produzir e caracterizar a funo de protenas e, principalmente, na produo de vacinas replicativas. Vrias caractersticas tornam os poxvrus recombinantes excelentes candidatos para esta ltima nalidade: a) a estabilidade da vacina liolizada; b) o seu baixo custo, facilidade de produo e administrao; c) a sua capacidade de induzir resposta imune humoral e celular contra os antgenos cujos genes foram inseridos no genoma; d) a sua utilizao permite a discriminao da resposta vacinal da induzida pela infeco natural, j que somente alguns antgenos do patgeno de interesse so expressos; e) a possibilidade de deletar grandes pores de seu genoma e inserir vrios genes exgenos, o que permite a produo de vacinas multivalentes. Resumidamente, a estratgia de uso de poxvrus como vetores de expresso consiste na introduo de genes heterlogos no genoma desses vrus. A infeco dos poxvrus recombinantes in vitro (cultivos celulares) ou in vivo (em animais) resulta na expresso das protenas de interesse cujos genes foram introduzidos no genoma. O uso dessa estratgia em vacinas muito interessante, pois genes de protenas de outros vrus de interesse podem ser incorporados ao genoma dos
510
Captulo 18
poxvrus e, assim, obtm-se uma vacina viral que expressa antgenos de diferentes vrus. Como fator indesejvel, deve-se considerar que, dentro de um determinado gnero da famlia Poxviridae, existe uma relao antignica estreita que pode resultar em proteo cruzada entre diferentes espcies de vrus. Dessa forma, a existncia de imunidade contra o vrus selvagem que deu origem ao vetor pode reduzir o sucesso da vacinao com o vrus recombinante. Algumas estratgias que utilizam diferentes combinaes de vetores e rotas de imunizao tm sido utilizadas para evitar esse problema. Para ser utilizados como vetores, as cepas virais candidatas devem ser atenuadas de forma a no causar doena no hospedeiro. Essa atenuao tem sido obtida pela passagem sucessiva do vrus em hospedeiros heterlogos, pela deleo de genes envolvidos na patogenicidade e pela insero de genes que aumentem a resposta imune ao vetor. Vrios poxvrus, como o VV, podem infectar um grande nmero de espcies animais. Se isso representa uma vantagem, pois permite o seu uso como vacina em vrias espcies, pode tambm se constituir em uma restrio. Dessa forma, deve ser determinado o risco da infeco e os seus possveis efeitos em outras espcies que podem ser, acidentalmente, infectadas aps a liberao de um poxvrus recombinante no meio ambiente ou pela disseminao do vrus recombinante a partir de um animal vacinado. Vrios vetores derivados dos poxvrus de suno, ovino, caprino e parapoxvrus foram descritos e experimentalmente testados. A primeira vacina de poxvrus recombinante utilizada foi o VV, contendo o gene da glicoprotena G do vrus da raiva (RabV). Este vetor foi construdo a partir da insero do cDNA da gG do RabV no local do gene da timidina quinase da cepa Copenhagen do VV. Essa vacina foi utilizada para a imunizao oral de raposas e outros carnvoros de vida livre contra a raiva, a partir de 1987, na Blgica, e propiciou o controle e at mesmo a erradicao desta doena de vrios pases europeus. Um avano importante na utilizao dos poxvrus como vetores vacinais foi obtido quando se
demonstrou que os avipoxvrus poderiam servir de vetores ecazes e seguros de vacinas para mamferos. A sua multiplicao natural restrita s aves, contudo, a sua inoculao em clulas de mamferos resultou na expresso de genes inseridos no seu genoma e a inoculao em mamferos induziu uma imunidade protetora. Essa imunizao na ausncia de replicao produtiva eliminou a possibilidade de disseminao do vetor a partir do animal vacinado para os contatos ou meio ambiente. Alm disso, a utilizao deste vetor em espcies que no so reservatrios dos avipoxvrus torna improvvel a ocorrncia de recombinao que altere a patogenicidade do vetor. A outra grande vantagem da utilizao dos avipoxvrus como vetores a possibilidade de aplicao em animais com imunidade prvia contra o VV. Na ltima dcada, houve um grande nmero de relatos da utilizao de uma cepa de poxvrus de canrio (canaripox) atenuada recombinante em animais e humanos, cando bem determinada a sua segurana e eccia na induo de proteo. Uma vacina experimental contra o vrus da AIDS (HIV) foi produzida pela insero do gene da gp160 no genoma desse poxvrus. Vrias vacinas de uso veterinrio, baseadas no poxvrus do canrio, esto disponveis comercialmente no Brasil e em outros pases. Dentre estas se incluem: a) vacina contra o vrus da cinomose canina (CDV), na qual o poxvrus vetor contm os genes das glicoprotenas H e F; b) vacina contra o vrus da leucemia felina (FeLV), em que o vrus vetor contm o gene da glicoprotena de superfcie do FeLV; c) vacina contra o vrus do Nilo Ocidental (WNV) para uso em eqinos, no qual o gene da principal glicoprotena de superfcie do WNV foi inserido no genoma do vrus vetor. Essa estratgia to promissora e o desenvolvimento das vacinas to gil, que se pode antecipar que o nmero de vacinas animais, utilizando o poxvrus do canrio como vetor, ampliar-se- signicativamente nos prximos anos. Pode-se especular tambm que a utilizao criteriosa de poxvrus recombinantes, como vetores vacinais, propiciar a preveno, erradicao e cura de algumas doenas que causam impacto na sade animal.
Poxviridae
511
LEFKOWITZ, E.J.; WANG, C.; UPTON, C. Poxviruses: past, present and future. Virus Research, v.117, p.105-118, 2006. McFADDEN, G. Poxvirus tropism. Microbiology, v.3, p.201-213, 2005. Nature Reviews.
ARLEN, P.M.; KAUFMAN, H.L.; DiPAOLA, R.S. Pox Viral Vaccine Approaches. Seminars in Oncology, v.32, p.549-555, 2005. BARNARD, B.J.H. et al. Lumpy skin disease. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. Infectious diseases of livestock. Oxford: Oxford University Press, 1994. Cap.52, p.604612. BERNARDINO, A. Bouba Aviria. In: MACARI, M.; BERCHIERI JR, A. Doenas das aves. Campinas, SP: FACTA, 2000. p.333338. BEUKEMA, E.L.; BROWN, M.P.; HAYBALL, J.D. The potential role of fowlpox virus in rational vaccine design. Expert Review of Vaccines, v.5, p.565-577, 2006. BULLER, R.M.; PALUMBO, G.J. Poxvirus pathogenesis. Microbiological Reviews, v.55, p.80-122, 1991. CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.P. Veterinary diagnostic virology: a practitioners guide. St. Louis, MO: Mosby, 1992. 285p. DAMON, I.K. Poxviruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 5.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. Cap.75, p.2947-2975. FENNER, F.; BULLER, R.M.L. Mousepox. In: NATHANSON, N. (Ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.22, p.535-553. GHERARDI, M.M.; ESTEBAN, M. Mucosal and systemic immune responses induced after oral delivery of vaccinia virus recombinants. Vaccine, v.17, p.1074-1083, 1999. GHERARDI, M.M.; ESTEBAN, M. Recombinant poxviruses as mucosal vaccine vectors. The Journal of General Virology, v.86, p.2925-2936, 2005. HAGA, I.R.; BOWIE, A.G. Evasion of innate immunity by vaccinia virus. Parasitology, v.130, p.S11-25, 2005. HAIG, D.M.; MERCER, A.A. Ovine Diseases. Orf. Veterinary Research, v.29, p.311-326, 1998. HOUSE, J.A.; HOUSE, C.A. Swine Pox. In: STRAW, B.E. et al. (Eds). Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1999. Cap.23, p.291-294. HUGHES, A.L.; FRIEDMAN, R. Poxvirus genome evolution by gene gain and loss. Molecular Phylogenetics and Evolution, v.35, p.186-195, 2005. KERR, P.J.; JACKSON, R.J. Myxoma virus as a vaccine vector for rabbits: antibody levels to inuenza virus haemagglutinin presented by a recombinant myxoma virus. Vaccine, v.13, p.1722-1726, 1995.
MOSS, B. Poxviridae: The Viruses and Their Replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 5.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. Cap.74, p.2905-2945. MUNZ, E.; DUMBELL, K. Orf. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. Infectious diseases of livestock. Oxford: Oxford University Press, 1994. Cap.54, p.616-620. MUNZ, E.; DUMBELL, K. Sheeppox and goatpox. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. Infectious diseases of livestock. Oxford: Oxford University Press, 1994. Cap.53, p.613615. MURPHY, F.A. et al. Poxviridae. In: ___. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. Cap.16, p.277-291. PASTORET, P.P.; BROCHIER, B. The development and use of vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies: a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection, v.116, p.235-240, 1996. PASTORET, P.P.; VANDERPLASSCHEN, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.26, p.343-355, 2003. PATTYN, S.R. Monkeypoxvirus infections. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.19, p.92-97, 2000. QUINN, P.J. et al. (Eds). Poxviridae. In: ___. Microbiologia veterinria e doenas infecciosas. Porto Alegre: Artmed, 2005. p.327-334. STOTT, J.L. Poxviridae. In: HIRSH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Malden, MA: Blackwell Science Inc., 1999. Cap.64, p.365-370. TAYLOR, J. et al. Efcacy studies on a canarypoxrabies recombinant virus. Vaccine, v.9, p.190-193, 1991. TRIPATHY, D.N. Swinepox virus as a vaccine vector for swine pathogens. Advances in Veterinary Medicine, v.41, p.463-480. TRIPATHY, D.N. The impact of vaccines and the future of genetically modied poxvirus vaccines for poultry. Animal Health Research Reviews, v.5, p.263-266, 2004. YERUHAM, I.; ABRAHAM, A.; NYSKA, A. Clinical and pathological description of a chronic form of bovine papular stomatitis. Journal of Comparative Pathology, v.11, p.279-286, 1994.
ASFARVIRIDAE
Gustavo Delhon1
19
515 515 515 517
517 517 517 517 518 518 519
1 Introduo 2 Classicao 3 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica 4 Replicao

4.1 Adsoro 4.2 Penetrao 4.3 Expresso gnica 4.3.1 Transcrio 4.3.2 Sntese e modicao das protenas 4.4 Replicao do DNA viral 4.5 Morfognese
5 Vrus da peste suna africana

5.1 Epidemiologia 5.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.2.1 A infeco nos carrapatos 5.3 Imunidade 5.4 Diagnstico 5.5 Controle e prolaxia
520
520 521 523 523 523 524
524
Traduo: Fernanda Silveira Flores Vogel
1 Introduo
A famlia Asfarviridae constituda por apenas uma espcie viral, o vrus da peste suna africana (ASFV), origem da sua denominao. O ASFV um vrus DNA envelopado, grande e complexo, que compartilha vrios aspectos da estrutura do genoma e estratgia de replicao com os poxvrus. A replicao do ASFV ocorre no citoplasma das clulas hospedeiras, em stios perinucleares bem denidos, denominados fbricas de vrus. Esse vrus exibe uma regulao temporal da expresso gnica e apresenta a estrutura do genoma similar aos poxvrus, incluindo as seqncias repetidas invertidas terminais, uma regio central conservada e regies variveis nos segmentos terminais do genoma. O ASFV o agente etiolgico da peste suna africana (ASF), uma enfermidade severa e muito importante de sunos, principalmente no continente africano. A ASF tem sido observada desde os primrdios do sculo 20 no sul e no leste da frica e inicialmente era caracterizada pelos aspectos clnico-patolgicos semelhantes aos da peste suna clssica (CSF). No entanto, foi observado, posteriormente, que essas duas enfermidades so muito diferentes. Na segunda metade do sculo 20, a ASF foi detectada no sul e oeste da Europa e posteriormente em Cuba, Repblica Dominicana, Haiti e Brasil. Atualmente, a ASF est erradicada da maioria dos pases, mas permanece enzotica na frica subsaariana. Na frica, o ASFV se mantm em ciclos selvticos com infeco de sudeos selvagens e de carrapatos do gnero Ornithodoros. A capacidade de infectar carrapatos faz do ASFV o nico arbovrus entre os vrus DNA. Os sudeos selvagens infectados com o ASFV geralmente so assintomticos e apresentam baixos nveis de viremia. Por outro lado, a infeco de sunos domsticos resulta em conseqncias diversas manifestaes clnicas, que vo desde infeces subclnicas at doena altamente fatal.
lia recentemente estabelecida: Asfarviridae (Asfar, african swine virus e vrus relacionados). Como anteriormente citado, os vrus desta famlia apresentam caractersticas semelhantes s de outros vrus DNA grandes que replicam no citoplasma, incluindo os membros das famlias Poxviridae, Iridoviridae e Phycodnaviridae. A replicao desses vrus relativamente independente da maquinaria de transcrio da clula hospedeira. A anlise genmica por restrio enzimtica permitiu a classicao do ASFV em cinco tipos principais. Os vrus isolados nas Amricas e Europa pertencem ao mesmo grupo gentico, enquanto os isolados africanos apresentam uma variao maior, provavelmente pelo maior tempo de evoluo e divergncia gentica. Os isolados de campo do ASFV apresentam diferentes nveis de virulncia em sunos.
3 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica

Os vrions do ASFV so envelopados e possuem entre 175 e 215 nm de dimetro. As partculas vricas so constitudas por mais de 50 polipeptdeos e apresentam uma estrutura complexa, mas regular, quando observados sob microscopia eletrnica (Figura 19.1). Os vrions possuem simetria icosadrica e apresentam vrias camadas concntricas, resultando em um dimetro de aproximadamente 200 nm. O core (ou ncleo) possui 80 nm e composto por uma estrutura nucleoprotica eletrodensa envolta por uma camada protica espessa, chamada de capa do ncleo ou matriz. Estima-se que um tero da massa protica dos vrions esteja presente na matriz. Envolvendo esta estrutura central (core + matriz), existe uma membrana lipdica dupla, originalmente denominada membrana interna. Essa membrana provavelmente derivada de cisternas do retculo endoplasmtico (RE). Externamente membrana interna, est localizado o capsdeo, que composto por mltiplas cpias da protena estrutural p72 (tambm referida como p73). Essa estrutura contm um tero da massa protica dos vrions e determina a estrutura icosadrica do vrion. Os capsmeros do ASFV so arranjados de forma hexagonal, possuem 13 nm de dimetro
2 Classicao
O ASFV o nico membro no gnero Asvirus e tambm da famlia Asfarviridae, uma fam-
516
Captulo 19
Envelope externo Capsdeo Membrana interna 1 Membrana interna 2 Ncleo ou core Matriz ou capa do ncleo
200 nm
Fonte: A) Dra Sharon Brookes, IAH, Pirbright, UK ( ICTVdB).
Figura 19.1. Vrions da famlia Asfarviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion do ASFV; B) Ilustrao esquemtica de um vrion e seus componentes.
e apresentam uma cavidade central. O nmero de triangulao do ASFV tem sido estimado em T=189 a T=127, sugerindo que entre 1.892 e 2.172 capsmeros formam o capsdeo. Revestindo externamente o capsdeo existe uma membrana lipdica adquirida pelo brotamento do vrus na membrana plasmtica, mas que no necessria para a infectividade viral. O genoma do ASFV constitudo por uma molcula de DNA de ta dupla de aproximadamente 190 kb, com regies terminais repetidas e invertidas que contm estruturas secundrias (hairpin-loops) prximas s extremidades. Prximo aos hairpins terminais so encontradas seqncias semelhantes quelas envolvidas na resoluo dos concatmeros durante a replicao do genoma dos poxvrus. A regio central de 125 kbp do genoma contm genes conservados entre os diferentes isolados, enquanto as regies terminais so variveis, possuindo genes com diferentes composies e nmeros de cpias entre isolados. Nessas regies esto presentes os genes pertencentes a famlias multignicas, que so importantes para a determinao do espectro de hospedeiros e da virulncia. O genoma do ASFV codica cerca de 150 protenas, indicando a complexidade estrutural e biolgica deste vrus. A maioria dessas protenas
codicada pela regio mais conservada do genoma. Entre essas, esto as protenas de membrana e outras protenas estruturais, alm de protenas recentemente envolvidas nas diversas etapas de morfognese das partculas vricas. Outras protenas do ASFV apresentam seqncias similares a protenas ou enzimas celulares, incluindo aquelas que participam do metabolismo de nucleotdeos, da replicao e reparo do DNA, da transcrio e da modicao de protenas, e tambm as protenas requeridas para atividades enzimticas que esto presentes nos vrions ou so induzidas em clulas infectadas. O ASFV tambm codica protenas que medeiam as interaes vrus-clula hospedeira, determinam a virulncia e interferem em mecanismos que favorecem a replicao viral na clula hospedeira, incluindo homlogos dos inibidores de apoptose celulares (IAP), Bcl-2, IkB, protenas semelhantes lecitina e protenas CD2. Notavelmente, vrias protenas que inuenciam na virulncia e no espectro de hospedeiros esto entre as mais variveis entre os isolados do ASFV. Os vrions do ASFV so estveis sob condies ambientais, resistindo a amplas variaes de temperatura e pH. O vrus preserva a viabilidade aps seis meses em embutidos, ou aps anos em carnes congeladas, indicando que os subprodu-
Asfarviridae
517
tos de sunos podem ser importantes meios de disseminao de vrus. Os vrions intactos so muito sensveis a solventes lipdicos, detergentes e agentes oxidantes, como o hipoclorito. Em condies de laboratrio, o armazenamento de tecidos infectados a -20C no recomendado, enquanto a -70C a infectividade mantida por tempo indeterminado.
morfognese viral, que se localizam prximo ao centro de organizao dos microtbulos. De fato, a ruptura dos microtbulos induzida por drogas inibe a sntese de DNA viral, o acmulo e protenas e a replicao do genoma, indicando que o transporte ao longo dos microtbulos importante nas etapas iniciais da replicao do ASFV.
4 Replicao
O vrus capaz de replicar em uma variedade de clulas de origem suna e pode tambm ser adaptado para multiplicar em linhagens celulares de outras espcies. Grande parte dos conhecimentos sobre a biologia do ASFV foi adquirida a partir de estudos sobre a sua replicao em cultivos celulares.
4.3 Expresso gnica 4.3.1 Transcrio

Os vrions do ASFV contm a RNA polimerase dependente de DNA, sugerindo que a transcrio e sntese de RNAs mensageiros (mRNA) se inicia imediatamente aps a penetrao, independente de enzimas e fatores celulares. A expresso gnica do ASFV, semelhante a dos poxvrus, consiste de uma transcrio inicial de genes virais especcos e de uma fase tardia de transcrio. Essa fase tardia dependente de sntese protica prvia e do incio da replicao do DNA. A expresso dos genes iniciais pode ser detectada j duas horas aps a infeco (pi), com o pico da sntese ocorrendo entre 4 e 8 horas pi. Os transcritos iniciais possuem uma pequena seqncia lder no-traduzida na regio 5 e possuem extremidades 3 distintas. A expresso dos genes tardios totalmente dependente da replicao do DNA viral e atinge o pico entre 12 a 16 horas pi. H evidncias de que os transcritos tardios tambm contm seqncias no-traduzidas na extremidade 5 e terminam com seqncias de poli-timidina (poliT). Uma classe intermediria de mRNAs com cintica de transcrio distinta tem sido caracterizada. Embora sejam dependentes da replicao do DNA viral como os genes tardios, os transcritos intermedirios utilizam stios de iniciao diferentes e apresentam uma cintica diferente de produo. Esses transcritos podem ser detectados entre 4 e 6 horas aps a infeco e atingem expresso mxima ao redor de 6 a 8 horas pi, decrescendo durante o mximo da expresso dos genes tardios. Similarmente, os genes intermedirios do vrus vaccinia so transcritos a partir do DNA viral recm-replicado e codicam fatores de transcrio necessrios expresso dos genes
4.1 Adsoro
Vrias protenas virais se ligam a componentes da superfcie da clula hospedeira, incluindo a protena conservada p12 (p061R), a protena estrutural p54, e a protena de membrana p30 (tambm chamada de p32 e de pCP204L). Evidncias sugerem a participao da p72 e p54 na ligao do vrus com a membrana celular, e da p30 na internalizao do vrion. No entanto, anticorpos neutralizantes contra essas protenas no so sucientes para conferir proteo em camundongos. Embora a identidade dos receptores que medeiam a adsoro e penetrao do ASFV no seja conhecida, molculas potencialmente envolvidas no papel de receptor tm sido detectadas na superfcie de macrfagos sunos.
4.2 Penetrao
A internalizao do ASFV nas clulas independente de temperatura e de energia, mas um processo dependente de reduo do pH, o que sugere o mecanismo de endocitose mediada por receptor. Neste caso, a fuso do envelope do ASFV com a membrana celular ocorreria nos endossomos. Tem sido sugerido que os ncleos dos vrions seriam transportados no sentido retrgrado ao longo dos microtbulos at os stios de
518
Captulo 19
tardios. Fatores de ativao dos genes do ASFV ainda no foram identicados, mas alguns produtos possuem homologia com fatores de transcrio do vrus vaccinia.
maturao das protenas. O ASFV codica uma protena homloga a enzima celular que conjuga protenas com a ubiquitina celular (pI215L), direcionando-as para a degradao.
4.3.2. Sntese e modicao das protenas

A produo das protenas do ASFV inicia em fases bem precoces do ciclo e segue a mesma cintica da transcrio, resultando inicialmente na sntese de protenas no-estruturais e, mais tardiamente, na produo das protenas estruturais. As protenas produzidas sofrem diferentes modicaes aps a traduo. Aproximadamente 100 protenas virais de 10 a 220 kDa podem ser detectadas em clulas infectadas, e as protenas tardias correspondem a aproximadamente o dobro das protenas iniciais. Embora as protenas estejam preferencialmente localizadas nas fbricas virais, outros padres de localizao so observados, incluindo o nuclear, citoplasmtico difuso e em membranas celulares. O ASFV codica duas poliprotenas, a pp220 (pCP2475L) e a pp62 (pCP530R) que sofrem clivagem pela protease viral aps a traduo e durante a morfognese dos vrions, originando as protenas estruturais maduras. A pp220 foi a primeira precursora de protenas estruturais descrita para os vrus DNA e apresenta 2475 aminocidos miristilados. Essa proliprotena sofre um processamento temporalmente regulado originando intermedirios de 90 e 55 kDa, e as protenas estruturais maduras p150, p37, p34 e p14. As duas poliprotenas so expressas tardiamente na infeco e seu processamento ocorre entre uma e trs horas aps a sua sntese. As protenas resultantes se constituem nos principais componentes da camada de revestimento externo do ncleo dos vrions. A protena pS273R apresenta similaridade com proteases encontradas no vrus vaccinia e nos adenovrus, alm de ser semelhante a proteases celulares. Esta enzima uma protease de cistena, responsvel pela clivagem da p220, sendo encapsidada nos vrions. O ASFV produz efeitos adicionais em nvel de traduo ou aps esta traduo, afetando o direcionamento, estabilidade e

A sntese de DNA viral em moncitos de sunos infectados in vitro inicia-se trs a quatro horas aps a infeco e atinge nveis mximos ao redor de 5 horas pi. O ASFV codica vrias enzimas que esto envolvidas na replicao do genoma, incluindo uma topoisomerase de DNA, helicase, polimerase, ligase e protenas de associao com o DNA. A replicao do genoma parece ocorrer em duas fases. Uma fase inicial, que ocorre no ncleo e uma tardia e mais proeminente, que ocorre no interior das fbricas virais. Em concordncia com o papel do ncleo celular na replicao do DNA, a replicao viral marcadamente inibida em clulas Vero enucleadas. No entanto, extratos citoplasmticos coletados 8 horas pi foram capazes de suportar a sntese de DNA, indicando que o ncleo requerido somente nas fases iniciais. Foi demonstrada a atividade de transporte citoplasma-ncleo de duas protenas virais estruturais: a p37 e a protena de reparo do DNA. O mecanismo de replicao do genoma do ASFV no est bem esclarecido. A presena de dmeros formados pela ligao entre as seqncias terminais do genoma sugere um mecanismo de replicao via formao de concatmeros, cujas unidades genmicas esto ligadas entre si. Aps a replicao, as molculas de DNA resultantes, presentes nas fbricas virais, se condensam em uma estrutura pr-nucleide que inserida em partculas icosadricas durante a maturao dos vrions. Algumas protenas codicadas pelo genoma viral provavelmente medeiam funes que indiretamente aumentam ou asseguram a delidade da replicao do genoma, incluindo aquelas envolvidas no metabolismo de nucleotdeos e no reparo no DNA. O aumento de atividade enzimtica celular induzida pela replicao viral e/ou a presena de protenas virais homlogas indicam que a timidina quinase, timidilato sintetase, ribo-
Asfarviridae
519
nucleotdeo sintetase e dUTPase virais proporcionam um aumento signicativo na quantidade de desoxiribonucleotdeos disponveis para a sntese de DNA. A dUTPase seria responsvel por minimizar a incorporao errada de deoxiuridina genotxica ao genoma viral. Alm disso, o vrus codica diferentes protenas envolvidas no reparo do DNA, que realizam a remoo de nucleotdeos errados incorporados cadeia nascente de DNA.
4.5 Morfognese
A replicao viral ocorre primariamente em fbricas virais que so inicialmente observadas s 6-8 horas aps a infeco. Entre 12 e 24 horas pi As fbricas virais contm um acmulo denso de um material membranoso amorfo, e uma quantidade crescente de capsdeos vazios imaturos e de partculas virais maturas. Durante os estgios iniciais da morfognese, a principal protena estrutural, p72, recrutada do citoplasma e se associa com membranas do RE. Estruturas membranosas laminares adotam uma forma polidrica que progride para a formao do capsdeo na face convexa, e da capa do core na superfcie cncava da membrana. A observao de que as membranas precursoras dos vrions apresentam duas camadas bilipdicas contguas com a membrana do RE, alm da presena de protenas virais associadas a essa organela; e de protenas virais no lmen do RE (pXP124L), nas fbricas virais e em vrions puricados, sugerem que um colapso nas cisternas do RE permitiria que as suas membranas formassem as membranas internas do vrion. A p54, uma protena de ligao com a clula hospedeira e que se liga dinena, tambm crtica para os eventos precoces envolvendo o recrutamento dos precursores das membranas ao RE. Essa protena essencial para a replicao viral e sua supresso inibe a morfognese anteriormente formao dos precursores do envelope. Concomitantemente formao do capsdeo, a camada protica do core se forma na face interna da membrana e compreeende principalmente produtos da protelise das poliprotenas p220 e p62. O processamento das poliprotenas ocorre juntamente
com a montagem da partcula viral e essencial morfognese do ncleo ou core. A formao das fbricas virais envolve alteraes drsticas no citoplasma da clula hospedeira, incluindo o rearranjo de organelas, das membranas e do citoesqueleto. A infeco pelo ASFV induz a perda da cadeia do compartimento de secreo tardio do trans Golgi. As mitocndrias migram e se acumulam prximas s fbricas virais em um evento dependente dos microtbulos, assumindo uma morfologia consistente com um aumento da respirao e em sincronia com a induo do estresse mitocondrial pelas protenas virais, como a Hsp60. A cadeia de microtbulos se desorganiza aps o incio da replicao viral e formao das fbricas virais, resultado da redistribuio das protenas e perda funcional do centrossomo. As fbricas virais lembram agressomos, que so incluses perinucleares que contm acmulos de protenas celulares. Entre as semelhanas dessas estruturas esto o recrutamento dos chaperones e de mitocndrias, formao de microtbulos, rearranjo dos lamentos intermedirios e o colapso da vimentina. Embora os vrions maduros intracelulares sejam infecciosos, eles so transportados para a membrana plasmtica onde so liberados por brotamento, formando os vrions extracelulares envelopados. A habilidade da protena viral tardia p14.5 em se ligar ao DNA e interagir com a p72 sugere um papel no encapsidamento do genoma. No entanto, a supresso da p14.5 indica uma funo adicional dessa protena, envolvendo a movimentao de vrions intracelulares para a membrana plasmtica. De modo semelhante ao transporte dos vrions nos microtbulos para as fbricas virais no incio da infeco, tardiamente os vrions recm-formados se alinham nos microtbulos e, por transporte antergrado, so transportados das fbricas virais para a membrana plasmtica. Este transporte dependente de quinesina, uma protena motora convencional que recrutada para as fbricas virais e para os vrions citoplasmticos. Os vrions do ASFV na superfcie celular tambm podem induzir a nucleao da actina, similarmente ao vrus vaccinia, que utiliza caudas de actina para facilitar a disseminao direta entre clulas.
520
Captulo 19
5 Vrus da peste suna africana

O ASFV o agente etiolgico da peste suna africana (ASF), uma doena severa de sunos domsticos e que afeta tambm sudeos silvestres, nos quais produz infeco subclnica ou de severidade moderada. Historicamente, a enfermidade tem sido restrita frica subsaariana, onde endmica, mas j foi esporadicamente encontrada em pases europeus e americanos. A doena clssica em sunos domsticos caracterizada por hemorragias generalizadas, principalmente em tecidos linfides, e por altas taxas de mortalidade. O agente mantido na natureza atravs de ciclos alternados de infeco em carrapatos e em sudeos selvagens.
Transmisso por carrapatos
Infeco de sunos domsticos
Ciclo em criaes domsticas
Possvel transmisso sem a participao de carrapatos Transmisso por carrapatos
5.1 Epidemiologia
Na frica subsaariana, o ASFV mantido em um ciclo selvtico entre os sudeos selvagens e os carrapatos do gnero Ornithodoros (Figura 19.2). Os warthogs (Potamochoerus aethiopicus) so os principais hospedeiros naturais, mas o vrus tambm foi demonstrado em populaes de bushpigs (sunos selvagens, P. porcus) e javalis (Sus scrofa ferus). Tentativas de reproduzir a infeco em outras espcies animais no obtiveram sucesso. Na natureza, o vrus encontrado em populaes de carrapatos Ornithodoros sp., onde pode persistir durante anos. Nos carrapatos, o vrus pode ser transmitido pela via sexual e tambm de forma vertical para a prognie, contribuindo para a sua perpetuao na natureza. Os carrapatos infectados se constituem no elo entre as populaes de warthogs e os sunos domsticos, podendo introduzir a infeco principalmente em criaes de sunos ao ar livre. Uma vez introduzido em criaes domsticas, o vrus pode ser disseminar entre os animais por contato direto e indireto, sem a participao dos carrapatos. Em sunos com a infeco aguda, o vrus detectado em todas as secrees e excrees, incluindo a secreo ocular, nasal, farngea, genital, urina e fezes. A transmisso natural entre sunos provavelmente ocorre pela via oronasal. Diferentemente dos sunos domsticos, a infeco de warthogs geralmente subclnica e
Adulto persistentemente infectado
Infeco de carrapatos
Ciclo silvestre
Transmisso transovariana
Warthogs jovens
Inoculao do vrus
Fonte: adaptada de Plowright et al. (1994).
Figura 19.2. Ciclo silvestre e domstico do vrus da peste suna africana (ASFV) na frica.
cursa com nveis baixos de viremia. A maioria dos warthogs adultos em reas enzoticas so soropositivos e, provavelmente, muitos deles so persistentemente infectados. Outras espcies de sudeos silvestres (bushpigs, javalis) raramente apresentam sinais clnicos da infeco e so mais resistentes transmisso por contato direto e indireto do que os sunos domsticos. No entanto, a durao da viremia nessas espcies pode se estender. Embora a replicao do ASFV in vitro em leuccitos de sunos domsticos e de warthogs
Asfarviridae
521
seja similar, a replicao, disseminao e induo de apoptose em linfcitos in vivo so reduzidas nos sudeos silvestres quando comparada com os sunos domsticos. As taxas de morbidade e mortalidade da ASF em sunos domsticos podem atingir 100%. No entanto, vrios fatores podem inuenciar esses ndices, incluindo a virulncia da cepa viral. Aps surtos de ASF, no raro encontrar animais que sobreviveram infeco. Esses animais geralmente apresentam uma infeco crnica ou subaguda e sobrevivem. Os animais que sobrevivem infeco primria apresentam uma resposta imune capaz de proteger contra a reinfeco frente ao vrus homlogo, mas podem permanecer susceptveis a cepas heterlogas. Animais portadores so importantes na manuteno e disseminao do agente. Estudos sorolgicos em reas endmicas tm demonstrado ndices de soropositividade de at 8% em sunos enviados ao abate. Na natureza, o ASFV infecta carrapatos do gnero Ornithodoros sp. e pode ser isolado desses insetos at vrios anos aps a infeco. A infeco natural dos carrapatos pode ocorrer em todos os estdios de desenvolvimento, com ecincia de infeco variando entre 0,3 a 1,7%. Os carrapatos podem se infectar ao sugar sangue de sudeos virmicos ou por transmisso sexual, transovariana e transestadial. Os ttulos virais em carrapatos infectados coletados de warthogs variam entre 104 and 106 HAD50. A infeco em carrapatos caracterizada pelo estabelecimento de infeco persistente, na qual a replicao viral ocorre em nveis altos em certos tecidos e rgos. Os carrapatos infectados excretam o vrus tanto na saliva como nos uidos coxais. Diferenas na taxa de infeco, na dose infecciosa e em infeces persistentes tm sido observadas de acordo com a cepa viral. A infeco pelo ASFV endmica na maioria dos pases da frica subsaariana e foi ocasionalmente detectada em pases europeus, do Caribe e da Amrica. O vrus foi introduzido na Europa mais de uma vez, provavelmente pelo movimento de animais ou de subprodutos. A partir da Pennsula Ibrica, o vrus atingiu a Frana, Ilhas da Madeira, Sardenha e Malta, Blgica e Holanda. Em todos os casos, a infeco parece ter sido prontamente erradicada. A infeco foi tambm
detectada em uma ocasio em Cuba (1971), onde a erradicao exigiu o sacrifcio de 400.000 animais. No nal da dcada de 1970, o ressurgimento da doena na Pennsula Ibrica foi acompanhado de surtos na Repblica Dominicana, Haiti, Cuba e Brasil. Esses surtos tambm foram prontamente combatidos. Atualmente a doena se mantm endmica apenas na metade sul da frica.
5.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia

Quando os sunos so expostos pela via oronasal, o vrus replica inicialmente na mucosa farngea, nas tonsilas e os linfonodos regionais, de onde se dissemina sistemicamente pelo sangue. O vrus infecta primariamente as clulas do sistema fagoctico mononuclear, incluindo macrfagos teciduais e linhagens especcas de clulas reticulares. Os tecidos infectados apresentam leses extensas, principalmente quando infectados por cepas de alta virulncia. Cepas de virulncia moderada tambm infectam esses tipos celulares, mas os graus de envolvimento tecidual e a severidade das leses so menores. A habilidade do ASFV em replicar e induzir citopatologia nos macrfagos in vivo parece ser crtico para a virulncia do vrus. Na patogenia da infeco pelo ASFV, a apoptose ou morte celular programada parece desempenhar um papel importante. A infeco de sunos resulta em apoptose de macrfagos, de megacaricitos e principalmente de linfcitos. A apoptose dos linfcitos signicativa nos linfonodos, no bao e no timo, e a causa primria da depleo de linfcitos e imunodecincia que caracterstico da doena. Diferentemente dos macrfagos, os linfcitos no so susceptveis infeco pelo ASFV. Isto sugere que um mecanismo indireto, possivelmente envolvendo citoquinas secretadas pelos macrfagos infectados, seja responsvel pela apoptose dos linfcitos. As hemorragias, edemas e infuses de lquidos nas cavidades corporais parecem estar associadas com trombocitopenia, coagulopatia, brinlise e disfribinogenemia, e tambm com a perda da integridade do endotlio vascular. A formao de complexos imunes e liberao de
522
Captulo 19
prostaglandina E por macrfagos infectados podem ser responsveis pela agregao plaquetria e trombocitopenia. A brinlise e desbrinogenemia parecem estar associadas com a liberao de ativadores do plasminognio por macrfagos ativados em resposta infeco. As leses observadas em casos crnicos tm sido atribudas a componentes auto-imunes, incluindo a deposio de complexos imunes e induo de inamao nos rins, pulmes e pele. Diferentes genes do ASFV e diferentes regies gnicas esto associados com a patogenia e a virulncia da infeco em sunos domsticos, mas no afetam a replicao do vrus em macrfagos in vitro. Dois desses genes, o UK (DP96R) e o 23-NL (DP71L ou 114L), esto localizados prximos regio altamente varivel do genoma e se constituem em provveis fatores de virulncia e, portanto, alvos para a manipulao gentica para a produo de mutantes vacinais. A infeco de sunos domsticos pode resultar em diferentes formas clnicas, variando desde infeco subclnica at doena fatal, dependendo de fatores virais e do hospedeiro. Na forma aguda da doena, o perodo de incubao varia entre cinco e 15 dias. Os animais infectados apresentam febre (41-42C), anorexia, congesto, cianose da pele, aumento da freqncia cardaca e respiratria, descarga nasal, incoordenao, vmito e nalmente coma e morte. Os animais infectados com o ASFV geralmente morrem entre dois e nove dias aps a infeco. Os achados patolgicos na infeco aguda incluem leucopenia, linfopenia de linfcitos T e B, trombocitopenia, apoptose de clulas mononucleares e de linfcitos, hemorragias nos linfonodos, no fgado, nos rins, e nos tratos respiratrio e gastrintestinal, congesto da pele e de membranas serosas e grave edema pulmonar interlobular. A infeco subaguda dura aproximadamente trs a quatro semanas, e os animais apresentam febre remitente, perda de peso, pneumonia, dispnia, insucincia cardaca e edema nas articulaes. Hemorragias nos linfonodos e em outros tecidos podem ser observados na necropsia, mas no so to freqentes como nas infeces agudas. A infeco persistente pelo ASFV tem sido descrita em warthogs e em sunos domsticos que
sobrevivem infeco. Em condies experimentais, a persistncia viral a seqela observada em sunos domsticos que sobrevivem infeco. Nesses animais, o DNA viral pode ser detectado por PCR nos moncitos at 500 dias aps a infeco; no entanto, partculas vricas infectivas no so consistentemente isoladas dessas amostras. A exemplo dos outros vrus DNA grandes, o AFV afeta e modula a resposta imunolgica do hospedeiro. Os macrfagos infectados medeiam alteraes na resposta celular e, provavelmente, desempenham um papel importante na apoptose severa observada em tecidos linfides. O ASFV inibe a expresso de citoquinas pr-inamatrias como o TNF, IFN, e IL-8, enquanto induz a produo de TGF pelos macrfagos infectados. No entanto, um aumento da expresso do TNF tem sido descrita na infeco pelo ASFV in vitro e in vivo. Esse aumento pode possuir um papel central na patogenia da infeco, incluindo alteraes na permeabilidade vascular, na coagulao e na induo de apoptose em linfcitos no infectados. Os achados hematolgicos nos animais doentes incluem leucopenia, acompanhada de linfopenia absoluta, monocitopenia e neutropenia. A leucopenia parece ser devida destruio de linfcitos, moncitos e neutrlos pela replicao viral. No entanto, a infeco de linfcitos ainda no foi inequivocamente demonstrada. A trombocitopenia se desenvolve em estgios avanados, e os nveis de plaquetas podem car drasticamente reduzidos. Os achados macroscpicos nos casos agudos e subagudos incluem cianose (azul-purprea) na pele, principalmente no focinho, extremidades das orelhas, cauda e extremidades dos membros. Nveis variados de congesto, juntamente com petquias e equimoses esto freqentemente presentes na face lateral e inferior do pescoo, no peito, abdome e membros. Aumento de volume e hemorragias em linfonodos superciais e viscerais se constituem nos achados mais marcantes da forma aguda da doena. As cavidades corporais geralmente contm uma quantidade varivel de lquido amarelado ou sanguinolento, material brinoso e cogulos sangneos. As serosas apresentam congesto, petquias ou equimoses. Hemorragias no peri-
Asfarviridae
523
crdio e endocrdio tambm so freqentemente observadas em casos agudos. Hemorragias difusas ou petquias/equimoses tambm so encontradas em uma variedade de rgos e tecidos, como a mucosa traqueal e farngea, espao pleural, estmago, rins, entre outros. As leses na forma crnica diferem marcadamente, sobretudo, em relao s hemorragias e necrose do tecido linforreticular, que so achados pouco freqentes e menos proeminentes do que nas formas aguda e subaguda.
Em sunos que sobrevivem infeco observa-se imunidade slida contra a cepa homloga. Animais que sobrevivem infeco por cepas de virulncia moderada ou por variantes atenuadas desenvolvem uma resistncia de longa durao ao desao frente a vrus homlogos, mas raramente frente a vrus heterlogos.
5.4 Diagnstico
O reconhecimento de surtos de ASF aguda no difcil quando os achados clnico-patolgicos e epidemiolgicos so analisados. No entanto, a diculdade ocorre no diagnstico de infeco subaguda, crnica e subclnica, principalmente em pases onde a enfermidade endmica em sunos criados ao ar livre. Sempre que possvel, o diagnstico da ASF deve ser conrmado por testes laboratoriais, e para isto uma gama de tcnicas est disponvel. Nestes testes incluem-se mtodos para deteco de vrus, antgenos e cidos nuclicos virais, alm de anticorpos especcos. O teste de hemadsoro (HAD) um teste sensvel e rotineiramente utilizado para detectar o ASFV aps inoculao em cultivo celular. No entanto, nem todas as cepas do ASFV apresentam atividade de hemadsoro. Essas cepas podem, ento, ser identicadas pelo efeito citoptico (ECP) seguido da deteco de antgenos virais por imunouorescncia. Isolados de campo do ASFV replicam bem em cultivos de moncitos e macrfagos sunos, e podem ser adaptados a replicar em clulas de linhagem, com as PK-15 e Vero. Vrios testes de ELISA tm sido desenvolvidos para a deteco de anticorpos especcos contra o ASFV e so particularmente teis para o diagnstico rpido e em grande escala. Recentemente, mtodos baseados na reao da polimerase em cadeia (PCR) e PCR em tempo real tm sido desenvolvidos, constituindo-se em mtodos sensveis e especcos de deteco do agente, mesmo em estgios pr-clnicos da infeco. O diagnstico diferencial deve considerar a peste suna clssica, babesiose, tripanossomase, erisipela, pasteurelose, salmonelose e antrax.
5.2.1 A infeco nos carrapatos

Aps a infeco experimental do Ornithodoros porcinus porcinus, uma replicao inicial ocorre nas clulas fagocticas presentes no epitlio do intestino. Aos 15 dias pi a replicao viral detectada em clulas no diferenciadas do trato digestivo. A disseminao da infeco do intestino para outros tecidos, incluindo as glndulas salivares e glndulas coxais, ocorre em duas a trs semanas aps a infeco. Stios secundrios de replicao viral incluem os hemcitos (tipo I e III), tecido conjuntivo, glndulas coxais, glndulas salivares e tecido reprodutivo. Para que a infeco pelo ASFV no artrpode seja generalizada, a replicao nas clulas do intestino parece ser de grande importncia. Essa importncia foi demonstrada atravs da infeco dos carrapatos com a cepa patognica Malawi Lil20/1, que no capaz de replicar nas clulas intestinais ao infectar os carrapatos.
5.3 Imunidade
A resposta humoral e celular so componentes importantes da imunidade contra o ASFV. Anticorpos anti-ASFV so capazes de proteger os sunos de uma infeco grave e fatal. Embora anticorpos neutralizantes direcionados s protenas virais p30, p54 e p72 sejam encontrados em animais convalescentes, estes no so sucientes para conferir proteo. Linfcitos T CD8+, que se desenvolvem em seis a sete dias aps a infeco, parecem desempenhar um importante papel na resposta imune protetora contra o ASFV.
524
Captulo 19
5.5 Controle e prolaxia

Atualmente no existem vacinas disponveis contra o ASFV e o controle da infeco baseia-se em procedimentos de quarentena e abate dos animais infectados. Tentativas de imunizar animais com extratos de clulas infectadas, com o sobrenadante de leuccitos de sunos infectados e com vrions inativados falharam na induo de uma resposta imune protetora. A imunizao de sunos com uma vacina atenuada por deleo de genes de virulncia conferiu proteo contra o vrus homlogo, mas no contra cepas heterlogas. O controle da ASF em reas de alto risco na frica essencial e deve se concentrar em medidas que evitem o contato entre os sunos domsticos e os reservatrios silvestres do vrus, juntamente com procedimentos como vazio sanitrio e desinfeco de instalaes e ambientes. Na frica do Sul e Qunia, essa poltica tem sido aplicada com sucesso considervel. Outras medidas de controle incluem a erradicao dos carrapatos e o controle da movimentao de animais, e da importao e exportao de sunos e seus subprodutos. Pases livres devem concentrar esforos para impedir a introduo do agente, atravs de barreiras sanitrias que impeam a entrada de animais e subprodutos de reas potencialmente de risco.
JOUVENET, N. et al. Transport of african swine fever virus from assembly sites to the plasma membrane is dependent on microtubules and conventional kinesin. Journal of Virology, v.78, p.7990-8001, 2004. KLEIBOEKER, S.B. et al. African swine fever virus infection in the argasid host, Ornithodoros porcinus porcinus. Journal of Virology, v.72, p.1711-1724, 1998. KONNO, S.; TAYLOR, W.D.; DARDIRI, A.H. Acute African swine fever: proliferative phase in lymphoreticular tissue and the reticuloendothelial system. The Cornell Veterinarium, v.61, p.71-84, 1971. MISKIN, J.E. et al. A viral mechanism for inhibition of the cellular phosphatase calcineurin. Science, v.281, p.562-565, 1998. MONTGOMERY, R.E. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya Colony). Journal of Comparative Pathology, v.34, p.159-191, 1921. OURA, C.A.; POWELL, P.P.; PARKHOUSE, R.M. African swine fever: a disease characterized by apoptosis. The Journal of General Virology, v.79, p.1427-1438, 1998. PICCONE, M.E. et al. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response. Journal of Virology, v.78, p.1858-1864, 2004. PLOWRIGHT, W.; THOMSON, G.R.; NESER, J.A. African swine fever. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (eds.) Infectious diseases of livestock. Cape Town, South Africa: Oxford, 1994. Cap.51, p.568-599. SIMON-MATEO, C.; ANDRES, G.; VINUELA, E. Polyprotein processing in African swine fever virus: a novel gene expression strategy for a DNA virus. The Embo Journal, v.12, p.2977-2987, 1993. TULMAN, E.R.; ROCK, D.L. Novel virulence and host range genes of African swine fever virus. Current Opinion in Microbiology, v.4, p.456-461, 2001.
BLASCO, R. et al. Variable and constant regions in African swine fever virus DNA. Virology, v.168, p.330-338, 1989. DIXON, L.K. et al. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.100, p.117-134, 2004. ESTEVEZ, A.; MARQUEZ, M.I.; COSTA, J.V. Two-dimensional analysis of African swine fever virus proteins and proteins induced in infected cells. Virology, v.152, p.192-206, 1986. GOMEZ-PUERTAS, P. et al. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response. Virology, v.243, p.461-471, 1998. HINGAMP, P.M. et al. A ubiquitin conjugating enzyme encoded by African swine fever virus. The EMBO Journal, v.11, p.361366, 1992.
CALICIVIRIDAE
John Neill1
20
527 527 528
529
1 Introduo 2 Histrico e classicao 3 Estrutura e propriedades dos vrions

3.1 Estrutura do genoma, expresso gnica e replicao
4 Calicivrus de importncia em medicina veterinria

4.1. Calicivrus felino 4.1.1. Epidemiologia 4.1.2. Patogenia e sinais clnicos 4.1.3 Preveno e controle 4.2 Vrus do exantema vesicular dos sunos
531
531 531 531 532 532
5 Outros calicivrus
5.1 Vrus dos lees marinhos de San Miguel 5.2 Lagovrus (vrus da doena hemorrgica dos coelhos) 5.3 Norovrus e sapovrus
533
533 533 534
6 Diagnstico e controle 7 Bibliograa consultada
534 535
Traduo: Luiz Carlos Kreutz
1 Introduo
A famlia Caliciviridae possui importantes patgenos de animais, incluindo o calicivrus felino (FCV), o vrus do exantema vesicular dos sunos (VESV), o vrus dos lees marinhos de San Miguel (SMSV) e o vrus da doena hemorrgica dos coelhos (RHDV). Alm disso, calicivrus tambm j foram isolados de ces, macacos, bovinos, martas, galinhas, rpteis, anfbios e insetos. Geralmente, os calicivrus esto associados doenas do trato respiratrio, doenas gastrintestinais ou doenas sistmicas. Em humanos, os calicivrus so importantes causas de gastrenterites, principalmente em crianas e idosos. Os calicivrus possuem um amplo espectro de hospedeiros e devido a similaridades de morfologia, dimenses e propriedades fsicas, foram originalmente classicados na famlia Picornaviridae. Possuem vrions pequenos, sem envelope, e apresentam como genoma uma molcula de RNA linear de ta simples e polaridade positiva. Com o desenvolvimento das tcnicas de biologia molecular, foi possvel realizar uma anlise mais precisa desses vrus, principalmente da seqncia de nucleotdeos do genoma e das protenas codicadas. Com essas informaes, percebeu-se que os calicivrus no eram relacionados aos picornavrus, e assim foram classicados em uma nova famlia, denominada Caliciviridae. A famlia Caliciviridae composta por quatro gneros: Vesivirus, Lagovirus, Norovirus e Sapovirus. Os vesivrus e lagovrus infectam principalmente animais. Os norovrus e sapovrus infectam primariamente humanos, mas j foram tambm encontrados em bovinos e sunos. Atualmente, discute-se a possibilidade de que animais domsticos possam ser os reservatrios dos calicivrus que infectam humanos.
2 Histrico e classicao
Os calicivrus foram originalmente descritos nos Estados Unidos, em meados da dcada de 1930, associados com uma doena vesicular contagiosa grave, posteriormente denominada
exantema vesicular dos sunos (VES). Esse vrus, at ento desconhecido, foi denominado vrus do exantema vesicular dos sunos (VESV). Devido a similaridades fsicas, o agente foi originalmente classicado como vrus da febre aftosa (FMDV). No entanto, o VESV foi posteriormente reconhecido como um novo agente viral, principalmente porque os hospedeiros eram diferentes daqueles do FMDV. Em 1972, um calicivrus foi isolado de lees marinhos na ilha de San Miguel, Califrnia, e denominado de San Miguel sea lion virus (SMSV). O isolamento do SMSV foi realizado a partir de fetos de lees marinhos abortados. O VESV e o SMSV so morfolgica e imunologicamente similares e compartilham caractersticas genticas. Esses vrus causam doenas vesiculares e compem um genogrupo nico. O calicivrus felino (FCV) foi isolado na dcada de 1950 de um surto de doena em felinos. Inicialmente acreditava-se que a doena era causada pelo vrus da panleucopenia felina (FPLV), um membro da famlia Parvoviridae. Observouse, no entanto, que o vrus isolado produzia efeito citoptico com extrema rapidez em cultivos celulares de origem felina, o que no poderia ser atribudo ao FPLV. O FCV est freqentemente associado com doena respiratria em felinos e atualmente considerado um dos principais patgenos dessa espcie. Os trs calicivrus (VESV, SMSV e FCV) so classicados no gnero Vesivirus. Em 1984, na China, observou-se uma doena hemorrgica em coelhos, da qual foi isolado um agente viral denominado vrus da doena hemorrgica dos coelhos (RHDV). Desde ento, a doena tem sido detectada em outros pases asiticos e tambm na Europa. Em 1986, na Europa, isolouse um vrus de lebres com doena hemorrgica, o qual foi denominado vrus da sndrome das lebres marrons europias (EBHSV). Estudos retrospectivos em amostras de fgado preservadas datam a existncia do vrus pelo menos desde 1976. Ambos os vrus causam doenas similares, porm diferem antigenicamente e tambm no espectro de hospedeiros que infectam. O RHDV e o EBHSV compem o gnero Lagovirus.
528
Captulo 20
Os calicivrus entricos humanos foram descritos pela primeira vez aps anlises por meio de imunoeletromicroscopia em amostras de fezes obtidas de surtos de diarria em crianas de escolas de Norwalk, Ohio, em 1968. Esse vrus, denominado de agente Norwalk, tem sido, desde ento, membro de um grande grupo de calicivrus causadores de gastrenterite em humanos. Esses vrus gastrentricos, denominados vrus pequenos de morfologia arredondada (small round structured virus = SRSV), no possuem as depresses peculiares na forma de clice observadas por microscopia eletrnica nos calicivrus e, por isso, no foram classicados na famlia Caliciviridae. Um segundo grupo de vrus, os calicivrus humanos clssicos (HuCVs), que possuem as tpicas depresses em forma de clice na superfcie, causam doenas entricas idnticas aquelas causadas pelo SRSV. Os vrus originalmente classicados como SRSV compem agora o gnero Norovirus e o HuCVs so classicados no gnero Sapovirus.
3 Estrutura e propriedades dos vrions

Os calicivrus so vrions pequenos (27-40 nm), icosadricos, sem envelope, formados por 180 cpias idnticas de uma nica protena, arranjadas em 90 dmeros, com a forma de arcos. A associao dessas unidades forma 32 depresses em forma de clice na superfcie dos vrions. A forma dessas depresses suscitou o termo calicivrus. Os vrions so relativamente resistentes ao calor e desinfetantes, ter e clorofrmio, mas no resistem muito a condies de pH baixo (3 a 5). A densidade das partculas vricas varia entre 1.33 e 1.41 g/cc. Outras caractersticas fsicas e moleculares importantes dos calicivrus encontram-se discriminadas na Tabela 20.1. A Figura 20.1 apresenta uma micrograa eletrnica de colorao negativa de um calicivrus e um modelo de reconstruo tridimensional de uma partcula do vrus Norwalk.
Tabela 20.1. Propriedades biolgicas, estruturais e moleculares dos vrus pertencentes a famlia Caliciviridae.
Vesivirus
Espectro de hospedeiros Sinais clnicos Amplo Leses vesiculares, abortos, infeco do Trato respiratrio superior Sim
Lagovirus
Coelhos, lebres Hepatite, doena Hemorrgica
Norovirus
Humanos, sunos, camundongos Hepatite, doena hemorrgica
Sapovirus
Humanos, bovinos, sunos Hepatite, doena hemorrgica
Replicao em cultivo celular Morfologia tpica de calicivrus (ME)
No
Apenas o norovrus murino
Apenas o calicivrus 1 entrico suno
Sim
Sim
No
Sim
Extenso do genoma 7.7 - 8.3 kb2 Nmero de ORFs Extenso da ORF1 (aminocidos) Massa da protena do capsdeo (kDa)
1
7.35 2 2345
4
7.65 3 1790 58-60
7.4 2 2281 58-60
3 1763-18782 73-78 ; 59-61

2
60
Apenas a cepa adaptada em cultivo; 2 FCV-SMSV/VESV; 3 Protena precursora do capsdeo; 4 Protena do capsdeo madura
Caliciviridae
529
B B
Fonte: A) Dra C. Bchen-Osmond, ICTVdB; B) Dr B. V. Venkataran, Baylor College of Medicine.
Figura 20.1. Vrions da famlia Caliciviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de colorao negativa de um calicivrus tpico; B) Modelo tridimensional de uma partcula do vrus Norwalk.
3.1 Estrutura do genoma, expresso gnica e replicao

O genoma dos calicivrus constitudo por uma molcula de RNA de ta simples, linear, de polaridade positiva, cuja extenso varia entre 7.3 e 8.3 kb, de acordo com o gnero (Tabela 20.1). O genoma possui uma pequena protena covalentemente ligada na extremidade 5 (5 VPg) e poliadenilado em sua extremidade 3 (Figura 20.2). No citoplasma das clulas infectadas, o genoma serve como RNA mensageiro (mRNA). O RNA genmico possui trs ORFs (seqncias abertas de leitura). A ORF-1, localizada na poro 5, ocupa aproximadamente 65% da extenso do genoma. Esta ORF codica as protenas no-estruturais (alm da VPg), que so produzidas pela
traduo direta do RNA genmico. As protenas no-estruturais incluem a replicase viral (polimerase de RNA dependente de RNA), protease de cistena e helicase de RNA. Algumas delas ainda no tiveram a sua funo identicada. Estas protenas apresentam seqncias especcas de aminocidos tambm presentes nas protenas com funes equivalentes dos picornavrus. A ORF-1 traduzida em uma poliprotena precursora, que posteriormente clivada pela protease nas protenas individuais. Aps a sua produo pela clivagem da poliprotena, a replicase viral sintetiza uma cpia de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa). Esta molcula servir de molde para a sntese de um RNA mensageiro subgenmico (mRNAsg) que ser traduzido na protena
ORF1
Vpg P5.6 p32 P39 (NTPase) P30 P13 (VpG) P76 (Pro - pol) capsdeo AAA(n)
ORF2 ORF3
Figura 20.2. Estrutura e organizao do genoma do calicivrus felino (FCV). A posio e massa molecular das protenas codificadas pelas ORFs esto indicadas.
530
Captulo 20
do capsdeo. Em etapas tardias do ciclo, o DNA complementar serve de molde para a sntese do RNA genmico. A replicase viral responsvel por todas essas etapas. No tero 3 do genoma, encontra-se a ORF2, que codica a protena do capsdeo. Esta ORF no traduzida diretamente a partir do RNA genmico. Ao contrrio, a protena do capsdeo produzida pela traduo de um mRNAsg, que, por sua vez, produzido pela transcrio da cpia de RNA de sentido antigenmico. A transcrio do mRNAsg inicia imediatamente antes do cdon de iniciao da ORF, que codica a pro-
tena do capsdeo, e termina na extremidade 3 do RNA antigenmico. Esse mRNAsg tambm poliadenilado e contm a VPg ligada poro 5. Nos lagovrus e sapovrus, a ORF-2, que codica as protenas no-estruturais, encontra-se na mesma seqncia de leitura da ORF-2 que, codica a protena do capsdeo (Figura 20.3). Nesses vrus, acredita-se que a protena do capsdeo seja clivada a partir da poliprotena no-estrutural, pela ao da protease de cistena. Porm, esta protena tambm pode ser produzida a partir do mRNAsg.
Vesivirus
VPg
Genoma RNA 7.7 to 8.3 kb
polyA
Protenas no-estruturais ORF1
VPg
RNA subgenmico 2.4 to 2.7 kb

Protena do capsdeo ORF2 ORF3
polyA
Lagovirus
VPg
Genoma RNA 7.35 kb
polyA
Protenas no-estruturais ORF1 Protena do capsdeo
VPg
RNA subgenmico 2.1 kb

Protena do capsdeo ORF2
polyA
Norovirus
VPg
Genoma RNA 7.65 kb
polyA
Protenas no-estruturais ORF1
VPg
RNA subgenmico ?
Protena do capsdeo ORF2 ORF3
polyA
Sapovirus
VPg
Genoma RNA 7.4 kb
polyA
Protenas no-estruturais ORF1 Protena do capsdeo
VPg
RNA subgenmico ?
Protena do capsdeo ORF2
polyA
Figura 20.3. Organizao genmica dos vrus dos gneros Vesivirus, Lagovirus, Norovirus e Sapovirus. A linha contnua representa o RNA genmico com a protena de ligao do genoma (VPg) na extremidade 5' e a cauda poliA na extremidade 3'. Os RNAs mensageiros subgenmicos (tanto os j caracterizados como os provveis) esto demonstrados abaixo da regio da qual eles so transcritos. Os retngulos abaixo do RNA genmico representam as ORFs com a provvel posio das respectivas protenas. Nos lagovrus e sapovrus, a protena do capsdeo pode ser produzida tanto pela traduo direta do genoma e clivagem a partir da protena no-estrutural como pela traduo de um mRNAsg.
Caliciviridae
531
Uma pequena ORF adicional (ORF-3) est presente na poro extrema da regio 3 do RNA genmico e traduzida a partir do mRNAsg (ver Figuras 20.2 e 20.3). Essa ORF codica uma pequena protena bsica, que includa em quantidade pequena nos capsdeos dos vrions maduros. A funo dessa protena parece estar relacionada ao empacotamento do RNA genmico e estabilizao da partcula viral. A ORF-3 parece ser traduzida aps a traduo da ORF-2, utilizando um mecanismo de terminao/reiniciao. Os calicivrus penetram por endocitose e replicam no citoplasma das clulas hospedeiras, mediadas por receptores, e a penetrao depende da acidicao dos endossomos. O VESV e FCV apresentam uma replicao rpida e ltica em clulas de cultivo derivadas das espcies homlogas. O FCV produz arredondamento e desprendimento das clulas do tapete em clulas de linhagem de rim felino (CRFK). O VESV tambm replica em clulas de linhagem Vero. Dentre os provveis calicivrus recentemente isolados, aqueles derivados de gastrenterite de sunos e de doena vesicular genital de ces replicam bem em clulas de cultivo; os outros no so facilmente cultivveis.
cruzada tm sido observadas entre cepas, porm outras seqncias de aminocidos so responsveis pela reatividade cruzada.
4.1.1 Epidemiologia
A infeco pelo FCV parece estar amplamente difundida nas populaes de felinos domsticos e tambm tem sido detectada em alguns feldeos silvestres. A transmisso natural ocorre por contato direto ou indireto por fmites contaminados ou por aerossis. O vrus pode ser carreado mecanicamente entre animais pelo prprio homem. O FCV prontamente transmitido por animais durante a infeco aguda. No entanto, a maior fonte de vrus parece ser os animais cronicamente infectados, que so portadores subclnicos da infeco. O estado de portador se desenvolve aps a fase aguda da doena, e importante na manuteno do FCV na populao felina. Os gatos infectados cronicamente apresentam o FCV nas tonsilas e faringe, onde o vrus replica em nveis baixos durante meses ou at anos. Essa replicao em baixos nveis nas tonsilas e a constante disseminao ocorre mesmo na presena de anticorpos protetores. O estresse pode participar na recrudescncia da infeco e aumento da excreo viral. O vrus excretado em secrees oro-nasais. Recentemente, alguns estudos demonstraram que calicivrus antigenicamente distintos do vrus original pode ser recuperado de gatos com infeco crnica. Isso demonstra que as mutaes produzidas durante a replicao, uma caracterstica comum dos vrus RNA, importante no estabelecimento e manuteno da infeco crnica.
4 Calicivrus de importncia em medicina veterinria 4.1 Calicivrus felino

O calcivrus felino (FCV) um agente cosmopolita, e considerado um patgeno importante de feldeos. comum em gatos domesticados, e j foi isolado de guepardos na Austrlia, e de diversas outras espcies de felinos em zoolgicos. O agente tambm j foi isolado de casos de glossite em ces. At o presente, apenas um nico sorotipo foi identicado, isso provavelmente porque o anti-soro produzido contra uma cepa do FCV reage com todos os isolados. Essas reaes sorolgicas cruzadas devem-se principalmente presena de seqncias conservadas de aminocidos na protena do capsdeo, e que so importantes para a ligao do vrus aos receptores celulares. Algumas diferenas na proteo
4.1.2 Patogenia e sinais clnicos

O vrus penetra principalmente pela via oronasal e replica inicialmente na orofaringe. O perodo de incubao da enfermidade varia entre dois e seis dias, e os animais infectados podem apresentar uma variedade de sinais clnicos. A infeco pode ser subclnica ou aguda, e, na maioria das vezes, apresenta baixa morbidade e baixa mortalidade. No entanto, em abrigos ou colnias, a morbidade pode ser alta aps a introduo do
532
Captulo 20
agente. As infeces mais severas so caracterizadas por rinite, traquete e pneumonia, e produo de vesculas na cavidade oral, as quais evoluem para ulceraes do epitlio. As leses vesiculares so geralmente restritas s cavidades nasal e oral. O quadro clnico tambm apresenta febre, anorexia e descarga ocular e nasal. Uma sndrome de claudicao transitria pode tambm ser observada em gatinhos e se caracteriza por dor muscular, edema das articulaes (poliartrite) e laminite. A infeco de fmeas prenhes pode resultar em abortos. Nas infeces com cepas de FCV mais virulentas, a mortalidade pode atingir 30% em gatos com idade inferior a 12 semanas, e est geralmente associada com extensiva pneumonia e consolidao pulmonar. Alm disso, cepas altamente virulentas tm sido descritas recentemente, associadas com surtos caracterizados por ictercia, edema e alta mortalidade. O estado de portador crnico pode se estabelecer em animais que se recuperam da infeco.
4.2 Vrus do exantema vesicular dos sunos

A importncia maior do VESV deve-se ao fato de o agente produzir manifestaes clnicas confundveis com a febre aftosa. Por isso, possui importncia estratgica e se constitui em doena de noticao obrigatria, devendo ser diferenciada de outras doenas vesiculares de sunos. J foram identicados 13 diferentes sorotipos, classicados de A a M. Alguns desses sorotipos so indistinguveis do vrus isolado de lees marinhos (SMSV). Infeces naturais pelo VESV j foram identicadas em sunos, eqinos, caninos e animais silvestres. Os mamferos marinhos se constituem nos seus provveis reservatrios. O VESV considerado extinto das populaes domsticas de sunos, mas ainda parece existir em mamferos marinhos. Isto pode representar um risco potencial de reintroduo do agente em criaes de sunos. O VESV se dissemina pelo contato direto com animais infectados e tambm por via oral, pela alimentao com restos de alimentos contendo tecidos crus de animais infectados. O VESV foi identicado, pela primeira vez, no incio da dcada de 1930, em surtos amplamente disseminados e aparentemente sem relao entre si. O nico fator epidemiolgico comum aos surtos era o fato de ocorrerem em granjas que alimentavam sunos com restos de alimentos no-cozidos, oriundos de restaurantes que serviam frutos do mar. Surtos posteriores foram tambm associados com a alimentao de restos crus ou mal cozidos de carne de sunos infectados. Esses surtos estavam limitados Califrnia at o ano de 1951, quando um trem, carregado com carcaas frescas de sunos da Califrnia, deixou resduos no estado de Wyoming, as quais foram subseqentemente fornecidas a sunos. Esse fato deu incio a uma epizootia que atingiu 42 estados e somente terminou no nal de 1956. As medidas tomadas para a erradicao da enfermidade incluram a identicao e sacrifcio dos animais doentes, quarentena e proibio da alimentao de sunos com restos crus de alimentos. Essa doena foi declarada ocialmente erradicada dos EUA em 1959, aps trs anos consecutivos sem novos ca-

Existem atuamlente diversas vacinas para o FCV, tanto monovalentes como associadas com o herpesvrus felino. Existem vacinas atenuadas para aplicao intranasal, intraconjuntival e intramuscular. No entanto, sabe-se que a vacinao no previne a infeco. O nmero limitado de cepas de FCV includas nas vacinas pode no induzir proteo cruzada contra todas as cepas que circulam na populao felina. Alm disso, algumas cepas, como a F9, tm sido usadas por muitos anos e podem no ser antigenicamente relevantes para a proteo contra isolados circulantes no momento, e que se encontram disseminadas na populao felina. Gatos vacinados podem se infectar com cepas heterlogas; e, em alguns casos, podem disseminar o vrus infectante por um determinado tempo aps uma infeco subclnica. A utilizao de vacinas vivas modicadas geralmente segura. Porm, possvel a produo de sinais clnicos leves, particularmente em gatinhos, logo aps a primovacinao. Os animais devem ser vacinados a partir dos trs meses de idade, quando os nveis de anticorpos maternos j se reduziram signicativamente.
Caliciviridae
533
sos. Alm dos EUA, a enfermidade j foi relatada na Islndia e no Hava. A infeco de sunos pelo VESV resulta em febre (40,5-41C), seguida da formao de vesculas nas regies mais frias do corpo, como as narinas, lbios, lngua e mucosa oral. As vesculas geralmente se rompem aps 48-72 horas, deixando lceras circulares. O rompimento das vesculas resulta no extravasamento do uido para os tecidos vizinhos, principalmente a mucosa oral e tambm o espao interdigital, sola e a banda coronria dos cascos. O aparecimento de vesculas secundrias nos ps causa imensa dor, e os sunos podem relutar e mesmo se recusar a caminhar at a recuperao. A morbidade nos rebanhos afetados era geralmente alta e a mortalidade geralmente baixa. No entanto, algumas cepas estavam associadas com maiores ndices maiores de mortalidade. Clinicamente, a enfermidade muito semelhante febre aftosa, porm apresenta um curso mais brando e geralmente se resolve em menos de duas semanas.
As caractersticas clnicas da infeco pelo SMSV so similares quelas associadas com o VESV. Mamferos marinhos infectados com o SMSV apresentam formaes vesiculares nas partes mais frias do corpo, como as nadadeiras. A infeco pelo SMSV tambm tem sido associada com falhas reprodutivas e mortalidade neonatal. A infeco de sunos com o SMSV causa uma doena clinicamente indistinguvel daquela causada pelo VESV.
5.2 Lagovrus (vrus da doena hemorrgica

dos coelhos)
O lagovrus RHDV foi inicialmente isolado na China, em 1984, em um surto de doena de coelhos importados da Alemanha. Outros surtos foram subseqentemente relatados em outros pases, e a sua etiologia foi inicialmente associada com carne de coelho importada da China. No entanto, o RHDV foi identicado na Europa em coelhos domsticos ao mesmo tempo em que foi detectado na populao de coelhos silvestres, indicando que esse vrus j se encontrava presente no continente. No nal da dcada de 1980, o RHDV foi identicado no Mxico, mas foi rapidamente erradicado pela eliminao dos animais infectados. Por outro lado, um vrus isolado de lebres marrons (EBHSV), que causa sinais semelhantes ao RHDV, havia sido descrito anteriormente na Europa e poderia estar presente naquele continente desde 1976. Esses vrus se disseminam pela via oral, nasal e transmisso parenteral. O vrus encontra-se presente nas secrees dos animais infectados. Embora existam evidncias consistentes, at o presente, no se sabe, com certeza, se o EBHSV pode ser transmitido por insetos. Em um relato, os insetos foram incriminados como vetores de escape do vrus das ilhas Wardang, na costa da Austrlia, onde esse vrus foi testado como um agente biolgico para o controle de coelhos europeus. A partir da ilha de Wardang, insetos contendo o vrus podem ter sido transportados com o vento at o continente, onde o vrus ocasionou a infeco de coelhos em toda a Austrlia. A disseminao do vrus causou a morte de 65 a 90% dos coelhos em algumas regies.
5 Outros calicivrus
5.1 Vrus dos lees marinhos de San Miguel
O vrus dos lees marinhos de San Miguel (SMSV) j foi isolado de muitas espcies de cetceos e pinpedes (focas, lees marinhos, elefantes marinhos, lobos marinhos e morsas), e tambm de peixes marinhos. Anticorpos contra diversos sorotipos do SMSV e do VESV tm sido detectados nessas espcies. Dessa forma, props-se que as populaes de mamferos marinhos possam servir de reservatrios, a partir das quais o SMVS e o VESV poderiam ser reintroduzidos nas espcies domsticas. De fato, o SMSV pode infectar animais, como os sunos e bovinos, e pode ser propagado em cultivos celulares de primatas. Outros vrus que pertencem ao gnero Vesivirus infectam primatas (Pan-1), bovinos (Bos-1), cetceos (Tor-1) e rpteis (Cro-1), e ilustram a diversidade de espcies que podem ser infectadas. Recentemente, o SMSV causou uma infeco em um laboratorista, adicionando assim os humanos em seu espectro de hospedeiros.
534
Captulo 20
A doena aguda causada pela infeco com o RHDV em coelhos europeus caracterizada por anorexia e taquipnia, convulses e, ocasionalmente, secreo nasal sanguinolenta. A febre comum no incio da infeco, porm, nos estgios avanados, observa-se hipotermia. A infeco experimental geralmente causa a morte em 48-72 horas. A maioria dos principais rgos internos afetada: os pulmes, traquia e rins apresentam hemorragias, enquanto o bao e o fgado apresentam-se aumentados de volume e com colorao vermelho-escura. A morte dos animais sobrevm a uma hepatite necrosante. Observa-se tambm coagulao intravascular disseminada. Coelhos com menos de quatro semanas de idade no apresentam sinais clnicos da infeco e geralmente sobrevivem. Lebres infectadas com o EBHSV apresentam sinais clnicos semelhantes queles da infeco pelo RHDV. A patogenia da infeco com o EBHSV, as manifestaes clnicas e taxas de mortalidade so similares s observadas na infeco pelo RHDV.
sibilidade de transmisso entre espcies. A caracterizao molecular de calicivrus isolados de humanos e animais tem demonstrado uma grande similaridade. Recombinaes genticas j foram observadas nesses vrus e deram origem a novas variantes.
6 Diagnstico e controle
O diagnstico da infeco causada pelo calicivrus tem sido realizada pelo isolamento viral e por testes de soroneutralizao (SN). O isolamento permite a multiplicao do vrus em cultivos de clulas susceptveis, a partir de amostras clnicas. No entanto, o isolamento restrito aos calicivrus que replicam em cultivos celulares, como o FCV, SMSV e VESV. Por outro lado, as infeces por todos os calicivrus podem ser diagnosticadas utilizando a SN para pesquisar anticorpos no soro de animais convalescentes. Testes de ELISA tambm tm sido utilizados para diagnosticar sorologicamente as infeces por calicivrus humanos e podem tambm ser adaptados para detectar antgenos virais em amostras clnicas. O uso do teste evita a necessidade de se realizar o isolamento e/ou SN, que so mais demorados e laboriosos. A utilizao da microscopia eletrnica de transmisso tambm tem sido utilizada extensivamente no diagnstico das infeces por calicivrus. No entanto, essa tcnica no muito sensvel e somente detecta amostras que possuam mais de um milho de partculas virais por mililitro. Alm disso, necessrio que as amostras sejam coletadas no pico da replicao viral, o que pode reduzir o tempo ideal de coleta para poucas horas. Com a caracterizao molecular de diversas cepas de calicivrus, testes de diagnstico mais rpidos, sensveis e baratos foram desenvolvidos. Os testes mais notveis so aqueles baseados na reao em cadeia da polimerase (PCR). Primers para a PCR de todos os gneros de calicivrus, tm sido descritos e podem ser utilizados para o diagnstico. Com exceo do calicivrus felino, no existem vacinas disponveis para o VESV ou para os outros calicivrus animais.
5.3 Norovrus e sapovrus

Os calicivrus humanos so reconhecidos como importantes causas de gastrenterites, e a principal forma de transmisso a via fecal-oral. Os norovrus e sapovrus produzem sinais clnicos indistinguveis; no entanto, h diferenas na epidemiologia e imunologia. Os norovrus esto primariamente associados com doenas em crianas na idade escolar, alm de adultos. J os sapovrus infectam preferencialmente crianas mais novas e bebs. Os sapovrus induzem imunidade que pode prevenir reinfeces posteriores, enquanto os norovrus induzem imunidade de curta durao, e os indivduos podem ser reinfectados. Nos animais domsticos, os norovrus e os sapovrus podem eventualmente causar gastrenterite severa, mas podem, tambm ser isolados de animais clinicamente sadios. A gastrenterite caracterizada por um perodo relativamente curto de diarria (2 a 3 dias), letargia e anorexia. possvel que os animais domsticos de produo sejam os reservatrios dos calicivrus entricos de humanos, existindo, portanto, a pos-
Caliciviridae
535
KREUTZ, L.C.; JOHNSON, R.P.; SEAL, B.S. Phenotypic and genotypic variation of feline calicivirus during persistent infection in cats. Veterinary Microbiology, v.59, p.229-236, 1998. NEILL, J.D. Nucleotide sequence of a region of the feline calicivirus genome which encodes picornavirus-like RNA-dependent RNA polymerase, cysteine protease and 2C polypeptides. Virus Research, v.17, p.145-60, 1990. NEILL, J.D.; MEYERS, R.F.; SEAL, B.S. Genetic relatedness of the caliciviruses: San Miguel sea lion and vesicular exanthema of swine viruses constitute a single genotype within the Caliciviridae. Journal of Virology, v.69, p.4484-4488, 1995. RADFORD, A.D. et al. The challenge for the next generation of feline calicivirus vaccine. Veterinary Microbiology, v.117, p.1418, 2006.
GREEN, K.Y. et al. Taxonomy of the caliciviruses. The Journal of Infectious Diseases, v.181, p.S322-330, 2000. HERBERT, T.P.; BRIERLEY, I.; BROWN, T.D. Detection of the ORF3 polypeptide of feline calicivirus in infected cells and evidence for its expression from a single, functionally bicistronic, subgenomic mRNA. The Journal of General Virology, v.77, p.123-127, 1996. HURLEY, K.E. et al. An outbreak of virulent systemic feline calicivirus disease. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.224, p.241-249, 2004. KREUTZ, L.C.; SEAL, B.S. The pathway of feline calicivirus entry. Virus Research, v.35, p.63-70, 1995.
PICORNAVIRIDAE
Elizabeth Rieder & Mrio Celso S. Brum
21
539 540 541 543 546
546 547 548 549 551 552 552 554 555 556 557 558 558 559 559 559 560
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 Replicao 5 Picornavrus de interesse veterinrio

5.1 Vrus da febre aftosa 5.1.1 Situao da febre aftosa na Amrica do Sul e Brasil 5.1.2 O agente 5.1.3 Epidemiologia 5.1.4 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.1.5 Imunidade 5.1.6 Diagnstico 5.1.7 Controle e prolaxia 5.1.8 Vacinas 5.1.9 Perspectivas 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 Vrus da doena vesicular dos sunos Enterovrus suno tipo 1 Enterovrus sunos tipos 2-11 Enterovrus bovino Rinovrus eqino e bovino Vrus da encefalomiocardite Vrus da encefalomielite das aves
560
1 Introduo
A famlia Picornaviridae uma das mais antigas e variadas famlias virais, abrangendo mais de 200 vrus classicados em nove gneros. Esses vrus tm sido muito utilizados como modelos em pesquisas de diversos aspectos da Virologia. Os membros desta famlia os picornavrus so vrus pequenos, icosadricos, sem envelope e possuem uma molcula de RNA linear de polaridade positiva como genoma. O nome da famlia derivado de pico (pequeno) e RNA, em referncia ao genoma de cido ribonuclico. A famlia abriga importantes patgenos humanos e animais, como o poliovrus humano (agente da poliomielite ou paralisia infantil) e o vrus da febre aftosa (foot and mouth disease virus, FMDV). Em 1897, Loefer e Frosch apresentaram a descoberta inovadora de um agente ltrvel como causa da febre aftosa (foot and mouth disease, FMD) e, em seguida, a primeira evidncia de que uma doena animal poderia ser causada por um vrus. Em 1909, o poliovrus foi descrito como o agente etiolgico da poliomielite humana por Landteiner e Popper. Enders e colaboradores, em 1949, foram os primeiros a multiplicar o
poliovrus em clulas de mamferos cultivadas in vitro, iniciando a era moderna dos cultivos celulares. Esta tecnologia levou ao desenvolvimento de duas vacinas altamente ecazes para a preveno da poliomielite: a vacina inativada desenvolvida por Jonas Salk (1960) e a vacina atenuada desenvolvida por Albert Sabin (1973). Em 1981, o poliovrus tornou-se o primeiro vrus RNA a ter o seu genoma clonado e completamente seqenciado. Em 1985, a estrutura tridimensional dos vrions de dois membros da famlia dos picornavrus: o poliovrus tipo 1 e o rinovrus tipo 14, foi resolvida por cristalograa, abrindo perspectivas para novas abordagens s terapias antivirais e vacinologia. Em 2002, vrions infecciosos foram produzidos a partir de cDNA sintetizado in vitro, utilizando deoxioligonucleotdeos complementares ao RNA do poliovrus. Os picornavrus tm sido isolados de vrias espcies de vertebrados, incluindo humanos, primatas no-humanos, cavalos, sunos, roedores e pssaros (Tabela 21.1). Os vrus pertencentes a esta famlia so responsveis por enfermidades importantes em humanos, incluindo o resfriado (mais de 100 sorotipos de rinovrus), doenas do trato digestivo e do sistema nervoso central,
Tabela 21.1. Doenas causadas pelos principais picornavrus.
Vrus
Poliovrus (PV) Coxsackie Hepatite A Echovrus Rinovrus Febre aftosa (FMDV) Rinovrus eqino (EqRV) Hepatite dos patos Encefalomiocardite (EMCV) Doena vesicular dos sunos (SVDV) Enterovrus bovino (BEV)
Doena
poliomielite (meningite) resfriado, diarria infantil, conjuntivite aguda hepatite tipo A doena respiratria, encefalite resfriado febre aftosa doena respiratria aguda hepatite dos patos miocardite, encefalite doena vesicular dos sunos associado com doena entrica e respiratria
Espcie
humanos humanos humanos e macacos humanos humanos, macacos bovinos, ovinos, caprinos, sunos eqinos pato domstico sunos, roedores sunos bovinos
540
Captulo 21
como meningites, encefalites e paralisia (vrus Coxsackie, echovrus e poliovrus), doena heptica (vrus da hepatite A) e infeco cardaca (vrus Coxsackie). Entre os picornavrus de interesse veterinrio esto o vrus da febre aftosa (FMDV), o vrus da encefalomiocardite dos camundongos (EMCV), o enterovrus bovino (BEV) e o agente da doena vesicular dos sunos (SVDV). O prottipo da famlia o poliovrus, agente etiolgico da poliomielite em humanos. Esse vrus o mais estudado em termos do ciclo replicativo, estrutura do vrion, interao com receptores virais, estrutura e funo das protenas virais e com relao aos mecanismos de expresso gnica. O FMDV um dos principais vrus de animais, pela grande repercusso sanitria e econmica da infeco, sobretudo, devido s barreiras impostas ao comrcio internacional de animais e subprodutos oriundos de reas endmicas ou de risco.
2 Classicao
Os picornavrus so atualmente subdivididos em nove gneros: Enterovirus (vrus de sunos e smios), Cardiovirus (encefalomiocardite, EMCV e vrus de Theiler), Rhinovirus (rinovrus humano), Hepatovirus (vrus da hepatite A), Erbovirus, Teschvirus (vrus da polioencephalomielite dos sunos), Aphtovirus (FMDV e vrus da rinite eqina) e Parechovirus (antigo echovrus 22 e 23). Curiosamente, os picornavrus de diferentes gneros possuem homologia de nucleotdeos inferior a 45% entre si (menos de 34% de similaridade
em nvel de aminocidos). Por exemplo, os enterovrus humanos que apresentam 111 sorotipos so divididos em quatro grupos genticos (A, B, C e D). At recentemente, cada sorotipo de picornavrus era designado como uma espcie viral separada. A nova denio adota a seguinte regra: uma espcie de picornavrus uma classe ou grupo taxonmico (polythetic) de sorotipos relacionados logeneticamente ou isolados que compartilham: a) uma limitada abrangncia de hospedeiros e receptores celulares; b) um grau signicante de compatibilidade nos processos proteolticos, replicao, montagem e recombinao gentica; c) mapas genmicos essencialmente idnticos. Logo, a classicao atual baseada em diversos parmetros, incluindo morfologia, organizao genmica, estratgias de replicao, padres de clivagem de protenas e identidade gentica. Com base nesses critrios, alguns enterovrus foram reclassicados do gnero Enterovirus para formar os gneros Hepatovirus e Parechovirus. Os enterovrus e hepatovrus, que infectam os hospedeiros via trato digestivo, so altamente resistentes ao pH baixo do estmago e a enzimas proteolticas do trato digestivo. Por outro lado, os rinovrus e outros vrus que replicam no trato respiratrio so lbeis em ambientes cidos (Tabela 21.2). A caracterstica de instabilidade a pH inferior a 7,0 do FMDV resulta em diferenas no desnudamento durante a infeco de clulas de cultivo, comparado com outros picornavrus, e, provavelmente, tambm interfere em termos de especicidade tecidual e rgos alvos nos hospedeiros.
Tabela 21.2. Propriedades fsico-qumicas dos picornavrus.
Gnero
Aphthovirus Cardiovirus Enterovirus Hepatovirus Rhinovirus
Estabilidade ao pH
Lbil, < 7 Estvel, 3 - 9 Estvel, 3 - 9 Estvel Lbil, < 6
Densidade Buoyant
1,43 - 1,45 1,34 1,34 1,34 1,40
Coeficiente de sedimentao
142 - 146S 160S 160S 160S 160S
Picornaviridae
541

As partculas vricas dos picornavrus so icosadricas (25-30 nm de dimetro), sem envelope e contm uma molcula de RNA de ta simples e polaridade positiva como genoma. O capsdeo possui uma superfcie externa regular, perfeitamente simtrico, e composto por 60 unidades estruturais. Cada uma dessas unidades, denominadas protmero, formada por uma cpia das quatro protenas estruturais: VP1, VP2, VP3 e VP4 (Figura 21.1). Essas protenas so produzidas pela clivagem enzimtica de uma poliprotena precursora (P1). As protenas so estveis e protegem o genoma de ambientes hostis, proporcionando um meio de transmitir o genoma entre clulas e entre hospedeiros. Os vrions dessa famlia so resistentes ao ter, clorofrmio e lcool, porm a radiao inica, o fenol e formaldedos inativam o vrus rapidamente. A estabilidade dos picornavrus sob condies ambientais desempenha um papel importante na epidemiologia e nas formas de controle das doenas a eles associadas. A seqncia de aminocidos que constituem as protenas estruturais, bem como a conformao e as relaes entre elas formam estruturas onde se localizam os receptores canyons nos poliovrus e rinovrus e loops nos aftovrus. Essas seqncias so determinantes do tipo celular que pode ser
infectado, portanto, possuem inuncia direta no tropismo e patogenia viral. Alm da determinao do host range in vitro e in vivo, esses stios, juntamente com outras regies do capsdeo, so altamente antignicos e so alvos de anticorpos do hospedeiro. A variabilidade dessas regies e conseqentemente a sua reatividade sorolgica determina a diferenciao dos vrus em sorotipos e subtipos. O genoma dos picornavrus uma molcula de RNA de ta simples, polaridade positiva e possui entre 7 e 8,5 kb (dependendo da espcie viral). O RNA genmico possui uma protena denominada VPg (3B) covalentemente ligada na sua extremidade 5, e uma cauda poliA na extremidade 3 (Figura 21.2). Pelo fato de possuir polaridade positiva e poder ser traduzido diretamente pelos ribossomos, o RNA genmico infeccioso quando introduzido articialmente em clulas permissivas. O RNA genmico e os RNA mensageiros (mRNAs) dos picornavrus no possuem cap na extremidade 5. Por isso, a sua traduo depende do reconhecimento pelos ribossomos por meio de um mecanismo diferente dos mRNAs celulares. Os RNAs virais so reconhecidos pelos ribossomos atravs de uma estrutura secundria localizada na regio no-traduzida (untranslated region 5UTR) denominada stio interno de
B
RNA
VP1 VP3 VP2
VP 4
VP1 VP2 VP3
Fonte: A) Dr Thomas Burrage, USDA, PIADC. B) Adaptada de Flint et al. (2000).
Figura 21.1. Partculas vricas da famlia Picornaviridae. A) Fotos de microscopia eletrnica de vrions do FMDV em colorao negativa. B) Representao esquemtica do vrion e seus componentes.
542
Captulo 21
ORF
5' UTR VPg L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D 3' UTR poly (A)
Traduo
Poliprotena
L P1 P2 Clivagem Protenas estruturais Protease L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B (VPg) 3C 3D Protenas no-estruturais P3
Replicao do genoma Alterao da transcrio, traduo e processamento protico celular Encapsidao do genoma
Figura 21.2. Organizao do genoma do vrus da febre aftosa (FMDV), mostrando os componentes do RNA (linha), os genes e os produtos primrios da traduo (retngulos em branco) e os produtos finais da clivagem (retngulos em cinza). A funo das protenas est resumida abaixo da figura.
entrada dos ribossomos (internal ribossomal entry site IRES). Prximo extremidade 5, existe uma longa regio no-traduzida (5UTR), que varia entre 740-1.300 nt, precedendo o cdon de iniciao da nica e longa seqncia aberta de leitura (open reading frame, ORF). A regio 5UTR possui funo na traduo, inui na virulncia e, possivelmente, desempenhe alguma funo na morfognese das partculas vricas. Prximo extremidade 3, existe outra regio no-traduzida (50-100 bases, 3UTR) que contm stios importantes para a replicao do genoma e infeces produtivas (Figura 21.2). A 5UTR do FMDV apresenta mais de 1.300 nt de extenso e muito maior do que aquelas presentes no genoma dos enterovrus e poliovrus (740 bases) ou dos cardiovrus e EMCV (850 bases). A 5UTR dos aftovrus contm um segmento curto, conhecido como fragmento S (apro-
ximadamente 350 bases), seguido por mais de 100 bases, contendo aproximadamente 90% de citosina, com um nmero pequeno de uracilas (U) e adeninas (A) (poliC). O fragmento S e poliC so seguidos por um segmento de RNA de mais de 700 nt, que pode formar estruturas secundrias altamente conservadas. Essas estruturas incluem pseudoknots (PKs) repetidos em linha, um elemento cis-acting envolvido na replicao do RNA (cre) e uma estrutura relacionada com a iniciao da traduo (IRES). O elemento IRES nos aftovrus possui aproximadamente 450 nucleotdeos e contm duas regies ricas em pirimidinas imediatamente anteriores a cada cdon de iniciao alternativo. O fragmento S, a seqncia poliC e as estruturas PK ocupam as primeiras 600 bases do genoma do FMDV, enquanto uma pequena estrutura na forma de trevo, com cerca de 100 nucleotdeos (ou menos), encontrada no genoma
Picornaviridae
543
dos enterovrus. Como esta estrutura em forma de trevo tem sido descrita relacionada replicao do RNA de vrios picornavrus, inclusive o poliovrus, provavelmente o fragmento S, poliC e PKs dos aftovrus podem tambm apresentar funo na replicao do genoma do FMDV. Os elementos IRES do genoma dos picornavrus so divididos em trs grupos, de acordo com diferenas nas estruturas secundria e terciria altamente conservadas. O IRES do grupo 1 encontrado no genoma dos enterovrus e rinovrus; do grupo 2 presente nos aftovrus e cardiovrus, e os hepatovrus possuem o IRES do grupo 3. Dentro de cada grupo h um grau maior de conservao das estruturas secundrias do que da seqncia de nucleotdeos propriamente dita. Todos os elementos IRES dos picornavrus apresentam uma regio rica em pirimidinas prxima ao cdon de iniciao (Figura 21.3).
As protenas no-estruturais esto envolvidas na replicao do genoma e no processamento da poliprotena. A clivagem inicial da poliprotena executada pela proteinase 2Apro no stio P1/P2. Nos aftovrus e cardiovrus, esta clivagem ocorre na juno P1 2A/2B pela a 2Apro e, no stio P1/P2, pela Lpro. A maioria das outras clivagens mediada pela atividade da protease 3Cpro e seu precursor 3CDpro.
4 Replicao
A primeira etapa no ciclo replicativo dos picornavrus a interao dos vrions com os receptores celulares. Os receptores so determinantes do tropismo tecidual, tendo uma inuncia fundamental na patogenia da doena. Cada grupo de vrus ou at mesmo cada vrus apresenta um mecanismo de penetrao nico. Alguns picornavrus (FMDV e rinovrus) so internalizados por endocitose, e a penetrao do genoma ocorre a partir da vescula endoctica acidicada. No poliovrus e, provavelmente, em alguns outros, a penetrao ocorre na membrana plasmtica, sem a necessidade de internalizao. Tem sido proposto que a VP1 do poliovrus penetraria na membrana, formando poros atravs dos quais o genoma seria ejetado para o interior da clula. Essa atividade da VP1 dependente de sua ligao ao receptor, que provoca alteraes na sua estrutura. Nos vrus que so internalizados por endocitose, o processo de internalizao acompanhado de uma srie de alteraes conformacionais no capsdeo viral, levando ao desnudamento e liberao do genoma no citoplasma celular. Durante as ltimas duas dcadas, vrias molculas de superfcie celular foram identicadas como receptores para os picornavrus. A maioria desses receptores pertence superfamlia das imunoglobulinas (Ig), incluindo o VCAM1, ICAM-1, CAR e CD155 (receptor de poliovrus), e superfamlia das integrinas, como 21, v1, v3, v6, v8 (parechovrus humano 1 [hPEV1], echovrus 1, aftovrus e alguns enterovrus como o Coxsackie A9 [CAV9]). Outros receptores, como os similares ao SCR (decay-acceleranting factor [DAF]) e molculas LDL (VLDL-R), so tambm utilizados.
Seqncia GNRA
IV
Rica em A-C
V
IRES tipo I
II I
III
VI
Regio rica em pirimidinas Regio varivel AUG Regio codificante
Fonte: adaptada de Rueckert (1996).
Figura 21.3. Estruturas secundrias do RNA genmico dos picornavrus que formam os IRES (stios internos de entrada para os ribossomos). Um IRES do tipo I representado na figura.
O RNA genmico possui uma nica e longa ORF, cuja traduo resulta em uma poliprotena de, aproximadamente, 2.400 aminocidos. Essa poliprotena clivada medida que vai sendo produzida, originando os precursores das protenas estruturais e no-estruturais (ver Figura 21.2). A poliprotena contm uma regio que origina as protenas do capsdeo (P1) e por duas regies que originam as protenas no-estruturais (P2 e P3).
544
Captulo 21
Nos vrions dos poliovrus e rinovrus, os stios de ligao aos receptores so os canyons. Mutaes nesses locais reduzem ou abolem a sua capacidade de se ligar superfcie celular. No entanto, os capsdeos do FMDV e vrus Coxsackie A9 no possuem depresses ou canyons proeminentes. Esses vrus se ligam aos receptores atravs de loops especcos, localizados na VP1. No FMDV, foi demonstrado que uma seqncia R-G-D (arginina glicina asparagina) responsvel pela ligao s molculas de integrinas que servem de receptores. Mutaes nesta seqncia reduzem drasticamente ou previnem a ligao dos vrions aos receptores. O vrus Coxsackie A9 tambm utiliza uma seqncia idntica na VP1 para interagir com os receptores. Porm, mutaes nessa trinca de aminocidos no impedem que o vrus se ligue superfcie celular, sugerindo a existncia de outros receptores. O ciclo de replicao dos picornavrus ocorre integralmente no citoplasma das clulas hospedeiras (Figura 21.4). O RNA genmico serve como molde para a traduo e para a replicao, resultando em uma interao complexa entre fatores de traduo do hospedeiro e de replicao do RNA. Para isso, a traduo e sntese de RNA ta negativa (intermedirio replicativo) dos poliovrus so coordenadas pela interao de um complexo de fatores virais e celulares. Isso ocorre em pequenas vesculas, originadas a partir de membranas celulares, nas quais as protenas noestruturais do vrus cam associadas. Aps o desnudamento e liberao no citoplasma, o RNA viral traduzido diretamente pelos polirribossomos. O IRES forma uma estrutura secundria complexa que serve de stio de ligao para os ribossomos, ou seja, o reconhecimento do RNA independente de cap, ao contrrio do que ocorre com os mRNAs celulares. A seguir, os ribossomos so direcionados ao cdon de iniciao da traduo, sem a necessidade de escanear as seqncias anteriores, como ocorre nos mRNAs que possuem cap. A traduo da ORF resulta em uma poliprotena, que rapidamente clivada nos precursores P1, P2 e P3 e, em seguida, origina as protenas individuais. As protenas no-estruturais possuem papel importante na replicao do genoma e em funes relacionadas.
A replicao do RNA ocorre aps alguns ciclos de traduo e maturao das protenas. A replicao ocorre em duas etapas, e realizada pela polimerase RNA dependente de RNA (3Dpol), com o auxlio de protenas virais e celulares. O RNA genmico inicialmente transcrito em molculas complementares (sentido negativo), que so usadas como molde para a sntese de mltiplas cpias de RNA genmico. Dentre estes, alguns so traduzidos em protena, enquanto outros sero includos nas partculas virais (Figura 21.4). Embora as etapas bsicas da replicao sejam razoavelmente conhecidas, pouco se conhece sobre os detalhes desses processos e sobre as funes das seqncias e estruturas cis-acting contidas no RNA dos picornavrus. Duas questes ainda no esclarecidas se referem sntese da cadeia negativa e ao modo como a polimerase viral reconhece o RNA viral entre os outros mRNA poliadenilados celulares. Devido ausncia de atividade de correo da polimerase 3Dpol, erros so freqentemente produzidos durante a replicao, resultando na incorporao de nucleotdeos incorretos. Em razo disso, cada novo genoma contm aproximadamente uma mutao. Logo, a populao de RNA viral consiste de quasispecies, uma coleo de membros geneticamente diferentes, que podem se adaptar rapidamente a novos ambientes por seleo. As etapas nais do ciclo replicativo envolvem a montagem dos capsdeos e a maturao dos vrions por clivagem da VP0 em VP2 e VP4. Os mecanismos de montagem e maturao ainda necessitam maior entendimento. Em termos gerais, os produtos da clivagem da regio P1 pela 3Cpro so organizados em uma estrutura protmera, contendo uma cpia das protenas VP0 (VP2 e VP4), VP1 e VP3. Cinco protmeros podem formar pentmeros, e doze pentmeros formam o capsdeo. Partculas intermedirias tm sido identicadas em clulas infectadas por picornavrus, incluindo protmeros, pentmeros, partculas contendo RNA e com uma VP0 no clivada e, ainda, partculas com a VP0 no-clivada e sem o RNA (capsdeo vazio). O ciclo replicativo dos picornavrus est ilustrado na Figura 21.4.
Picornaviridae
545
1
Vpg
2
Fatores auxiliares (helicase, protease)
4
Polimerase
4
Precursores do capsdeo Vpg
Complexo replicativo
AAA
AAA AAA AAA
AAA
Procapsideo
AAA
Ncleo
5'
Prognie viral
5' RI
Replicao do genoma
Figura 21.4. Ciclo replicativo dos picornavrus. 1) Ligao aos receptores; 2) Penetrao; 3) Traduo do RNA genmico; 4) Clivagem dos precursores proticos; 5) Replicao do genoma, via produo de um RNA intermedirio (complementar); 6) Morfognese; 7) Egresso por lise celular.
A competio dos RNA virais (sem cap) com os mRNA celulares (com cap), no momento da traduo, resultaria em desvantagem para o vrus. No entanto, os picornavrus possuem um mecanismo pelo qual podem assegurar a traduo dos seus mRNA em detrimento da traduo dos mRNAs celulares. Uma protease viral cliva fatores celulares necessrios para a traduo dependente de cap, que o mecanismo utilizado pela clula para traduzir os seus mRNAs. Nos poliovrus e rinovrus, a clivagem do fator de iniciao da traduo eIF4G pela protease 2Apro impede a formao do complexo de traduo na extremidade 5 com cap. No FMDV, a clivagem realizada pela protease L (lder). Assim, na impossibilidade de realizar a traduo convencional, a maquinaria celular passa a traduzir mRNAs que possuem outras estruturas para o reconhecimento pelos
ribossomos. Como foi visto, os RNAs dos picornavrus possuem a estrutura IRES, que permite que os ribossomos se liguem ao RNA e iniciem a traduo. A traduo direcionada pelo IRES altamente eciente e rpida, fazendo com que o ciclo de replicao seja completado em poucas horas (~3-5 horas) e com que uma clula infectada possa produzir at 106 partculas vricas. Esse mecanismo faz com que a infeco pelos picornavrus resulte em inibio da sntese protica celular. J com duas horas de infeco, a traduo de mRNA celulares est praticamente parada, sendo substituda pela traduo de mRNAs virais. Uma caracterstica marcante dos picornavrus a sua alta capacidade citoltica em clulas de cultivo. As alteraes morfolgicas das clulas iniciam com arredondamento celular, aumento da refratilidade, retrao, picnose nuclear, dege-
546
Captulo 21
nerao e desprendimento das clulas da monocamada. Um pequeno nmero de partculas suciente para formar um foco infeccioso no tapete celular, que geralmente comea entre um e sete dias aps a infeco. Quando presente em grandes concentraes, os picornavrus podem causar a lise completa da monocamada em poucas horas. Alguns vrus necessitam um perodo de adaptao para produzirem os efeitos citopticos caractersticos. Nenhum cultivo celular capaz de suportar a replicao de todos os picornavrus. Geralmente, utilizam-se clulas de origem humana ou de primatas no-humanos para os vrus que infectam humanos; e clulas da espcie hospedeira para a propagao dos vrus de interesse veterinrio. Alguns animais de laboratrio so susceptveis infeco pelos picornavrus e a sua infeco experimental consegue reproduzir alguns aspectos da infeco. Alguns dos vrus dessa famlia (poliovrus, Coxsackie e alguns enterovrus) podem ser inoculados experimentalmente em primatas no-humanos e camundongos. Os vrus de interesse veterinrio, como o FMDV, podem ser inoculados em espcies susceptveis, como sunos ou bovinos, e tambm em animais de laboratrio, como as cobaias e os camundongos lactentes.
com brevidade. Para informaes mais completas, recomenda-se a literatura especca.
5.1 Vrus da febre aftosa

O primeiro registro descrevendo a febre aftosa (FMD) foi realizado por Fracastorius, na regio de Verona, Itlia, em 1546. A demonstrao do agente causal deve-se a Loefer e Frosch, em 1897, que, pela primeira vez, demonstraram que uma doena animal poderia ser causada por um agente ltrvel, ou seja, por um vrus. No princpio do sculo 19, a FMD encontrava-se disseminada nos rebanhos bovinos da Europa, e isso estimulou o incio das investigaes sobre o vrus. Juntamente com o poliovrus humano, o FMDV um dos picornavrus mais estudados. Os trabalhos iniciais objetivaram a caracterizao de diferentes isolados, identicao de sorotipos, reproduo da enfermidade em animais de laboratrio e desenvolvimento de vacinas. O FMDV notvel por sua transmissibilidade extremamente alta entre animais, como bovinos, ovinos, caprinos, sunos e outros biungulados selvagens; assim como por sua ampla distribuio geogrca. A doena caracterizada por alta morbidade, podendo causar mortalidade em animais jovens e perdas produtivas severas em adultos. As perdas diretas referem-se queda na produo, principalmente em bovinos leiteiros e sunos. As perdas indiretas relacionam-se com a restrio ao comrcio internacional de animais vivos e subprodutos, e com o impacto social, causado pelas aes de controle da infeco. A situao epidemiolgica do FMDV no mundo reete o nvel de desenvolvimento econmico de cada regio. O vrus encontra-se erradicado da Europa, Amrica do Norte, Austrlia e Nova Zelndia. Os pases da Amrica do Sul apresentam surtos espordicos, com maior ou menor freqncia, dependendo do pas. A infeco endmica na maioria dos pases da frica e sia (Tabela 21.3). A implementao de programas de vacinao em massa contra o FMDV, aps a Segunda Guerra Mundial, resultou em sucesso na erradicao da doena da Europa Ocidental e regio
5 Picornavrus de interesse veterinrio

A seguir sero descritas as principais enfermidades causadas pelos membros da famlia Picornaviridae que possuem interesse veterinrio. A enfermidade de maior destaque a febre aftosa, seguida da doena vesicular dos sunos. A febre aftosa (FMD) a enfermidade animal que possui maior repercusso em nvel mundial, devido a sua alta infecciosidade e contagiosidade, perdas na produtividade e prejuzos econmicos por causa dos embargos comerciais. A doena vesicular dos sunos, por ser confundvel com a febre aftosa, tambm possui certa importncia. Porm, a sua ocorrncia restrita a determinadas regies faz com tenha uma importncia reduzida no cenrio mundial. Os outros vrus possuem menor importncia clnica e, assim, sero abordados
Picornaviridae
547
Tabela 21.3. Distribuio mundial do vrus da febre aftosa.
Regio
Oceania Amrica do Norte Amrica Central e Caribe Amrica do Sul frica sia
Sorotipo presente rea livre

rea livre rea livre A, O e C SAT1, 2, 3, A, O, C A, O, C, sia1
Sul da Amrica do Sul. Alguns pases ou regies nunca registraram a presena do agente (Austrlia e Nova Zelndia), e outros conseguiram erradicar e se manter livres da enfermidade por longos perodos de tempo. A FMD foi descrita, pela ltima vez, em 1929, nos EUA; em 1952, no Canad e, em 1954, no Mxico. A vacinao massiva dos rebanhos bovinos na Europa e regio Sul da Amrica do Sul, durante muitos anos, resultou no controle da enfermidade e, por m, na virtual erradicao do vrus. Essa situao gerou uma idia de controle da enfermidade, e a vacinao foi descontinuada. Aps alguns anos da interrupo dos programas de imunizao, criou-se uma situao epidemiolgica perigosa. Populaes bovinas completamente susceptveis ao agente, deteriorao dos servios veterinrios de emergncia e falta de conscientizao dos produtores e pblico em geral, aliados com o intenso movimento de pessoas e abertura de fronteiras comerciais entre pases e regies, proporcionou a disseminao do vrus entre rebanhos e regies, alterando consideravelmente o mapa da distribuio da doena no mundo nos ltimos dez anos. Como exemplos, podem ser citados os surtos de FMDV em Taiwan (1997), Brasil (2000-2001), Argentina (2001), Uruguai (2001), Reino Unido (2001) e Holanda (2001). Um surto de FMD pode custar milhes de dlares em perdas de produo e de animais, movimentao de animais e subprodutos, restrio a mercados consumidores e de exportao, afetando a estabilidade e a economia da regio. A importncia de outras doenas vesiculares em bovinos deve-se,
sobretudo, sua semelhana clnica com a FMD e necessidade de diagnstico diferencial. No incio do ms de agosto de 2007, foi diagnosticado um surto de FMD na regio de Surrey, Inglaterra. A identicao da amostra viral recuperada dos bovinos afetados indicou a presena do FMDV tipo O1 BFS. Essa amostra foi originalmente isolada na epidemia de 1967 no Reino Unido e, desde ento, no havia sido mais identicada circulando em qualquer regio do mundo, estando restrita ao uso laboratorial. As evidncias sugerem que esse surto originou-se de um escape acidental ou intencional do Instituto de Sade Animal (Institute of Animal Health, WHO/FAO) em Pirbright, ou de uma companhia de produtos veterinrios que utiliza parte das instalaes para a produo de vacinas. Durante o ms de julho de 2007, essa amostra foi utilizada no laboratrio de Pirbright em testes de diagnstico e na produo de vacinas. Aps a conrmao do surto, as autoridades adotaram medidas severas de controle e movimentao animal, com o objetivo de conter o surto e evitar a disseminao para outras reas do pas.
5.1.1 Situao da febre aftosa na Amrica do Sul e Brasil

O primeiro registro da presena do FMDV no continente americano foi realizado, em 1870, nos Estados Unidos, e, posteriormente, na provncia de Buenos Aires, Argentina (1865, 1867 e 1870), Uruguai (1870), Chile (1871) e, no Brasil, nos estados do Rio Grande Sul e Minas Gerais (1895). No incio do sculo 20, a enfermidade disseminou-se para outros estados brasileiros e para outros pases na Amrica do Sul. Na dcada de 1950, foi criada uma organizao denominada PANAFTOSA, ligada Organizao Pan-Americana de Sade, com o objetivo de coordenar as aes de controle, diagnstico e preveno da FMD na Amrica do Sul. Desde a dcada de 1950, quando os programas de controle do FMDV iniciaram, muitos progressos foram obtidos. O primeiro pas da Amrica do Sul a obter a condio de rea livre do FMDV sem vacinao, reconhecido pela OIE, foi o Chile, em 1988, e, desde ento, no tem registrado a presena do agente. A deciso da Unio
548
Captulo 21
Europia (EU) em interromper a vacinao no princpio dos anos 1990 estimulou pases como Argentina, Uruguai e regio Sul do Brasil a intensicarem o combate enfermidade para terem acesso ao mercado consumidor europeu. Como resultado de intensos programas de preveno e controle, o Uruguai (em 1994), a Argentina e Paraguai (em 1997) e os estados brasileiros do Rio Grande do Sul e Santa Catarina (em 1998) obtiveram da OIE a condio de reas livres do FMDV com vacinao. Essa situao progrediu para vrios outros estados brasileiros nos anos seguintes, resultando em uma populao de aproximadamente 190 milhes de bovinos livres do vrus na regio Sul da Amrica do Sul. O maior objetivo da regio era a obteno a condio de rea livre de FMDV sem vacinao, situao que favoreceria a abertura de mercados livres da enfermidade. O Uruguai interrompeu a vacinao, em 1994, e obteve junto a OIE a condio de pas livre sem vacinao em 1996. Seguindo esse procedimento, a Argentina e o Paraguai interromperam a vacinao em 1999, e os estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina em 2000. A euforia com a possvel erradicao do agente da regio Sul da Amrica do Sul foi seguida de acontecimentos que possibilitaram a formao de uma imensa populao bovina totalmente susceptvel. Alguns dos fatores que contriburam para essa situao foram: a) progressiva perda da proteo de uma grande populao em um curto perodo de tempo; b) movimentao de um grande nmero de animais entre as regies; c) presena de reas endmicas em algumas regies do continente; d) decincia na preveno sanitria; e) substancial reduo da infra-estrutura veterinria para aes de controle, preveno, diagnstico e educao; f) subavaliao dos riscos de reintroduo do vrus; g) prevalncia dos interesses polticos e comerciais sobre os requerimentos sanitrios; h) omisso nos cumprimentos dos procedimentos e normas do Cdigo Internacional de Sade Animal da OIE, bem como falta de transparncia e veracidade na informao da situao sanitria de alguns pases. Ou seja, em um curto perodo de tempo, toda a infra-estrutura sanitria foi enfraquecida, perdendo a capaci-
dade de desenvolver aes de preveno e controle da enfermidade. Nos anos que se seguiram obteno da condio de zona livre de FMDV, a regio sul da Amrica do Sul presenciou a reemergncia do agente em diversos pases ou estados (Tabela 21.4). Alguns pases da Amrica do Sul (Equador, Bolvia, Venezuela, Norte do Brasil, algumas regies da Colmbia), onde a explorao bovina com ns de exportao inexpressiva, o combate enfermidade no prioritrio, perpetuando reas endmicas ou de situao desconhecida. Esforos governamentais tm sido feitos com o objetivo de conscientizar a regio da gravidade do problema e para que medidas de combate sejam adotadas por todos os pases.
5.1.2 O agente
O FMDV pertence ao gnero Aphthovirus, apresentando sete sorotipos (A, O, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 e sia 1). Cada tipo possui um amplo nmero de subtipos antigenicamente relacionados, porm diferenciveis sorologicamente. Os tipos e sorotipos produzem doena clinicamente indistinguvel, porm apresentam diferentes distribuies geogrcas e situaes epidemiolgicas. Por exemplo, os sorotipos SAT-1, SAT-2 e SAT-3 nunca se difundiram alm do continente africano. Outro exemplo o FMDV tipo C, que permaneceu oculto durante muitos anos, sendo quase considerado extinto, at que ressurgiu em um surto da regio Amaznica do Brasil em 2004. Algumas variaes de virulncia entre sorotipos e subtipos podem ser observadas. Aps a infeco com um determinado sorotipo, o animal estar protegido contra a infeco pelo mesmo sorotipo, mas permanece susceptvel infeco por um sorotipo diferente. Ou seja, no h proteo cruzada entre os diferentes sorotipos, em razo das diferenas antignicas entre eles. A diferena antignica entre subtipos dentro de um tipo pode ser acentuada em alguns casos, e os nveis de neutralizao cruzada podem ser insucientes para conferir proteo. Essa situao pode resultar em comprometimento da eccia das vacinas.
Picornaviridae
549
Tabela 21.4. Surtos de febre aftosa diagnosticados na Amrica do Sul e notificados OIE durante os anos de 2000 a 2006.
Pas
Paraguai Argentina Brasil Colmbia Uruguai Argentina Uruguai Brasil Paraguai Venezuela Bolvia Paraguai Bolvia Argentina Peru Brasil Colmbia Brasil Colmbia Equador Brasil Argentina Brasil
Estado/Provncia
Espcie
Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Sunos e bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Sunos e bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos Bovinos e bfalos
Sorotipo
FMDV A FMDV O FMDV O FMDV O FMDV O FMDV A FMDV A FMDV A FMDV O FMDV O FMDV O FMDV A e O FMDV O FMDV O FMDV O FMDV O FMDV A FMDV C FMDV A FMDV O FMDV O FMDV A FMDV O ??? FMDV O FMDV O
Formosa Rio Grande do Sul Antiquia Artigas Buenos Aires Soriano Rio Grande do Sul Canind
2002
2001
2000
Chuquisaca Boqueron La Paz Salta Lima Par Santander Amazonas Bogot Manibi Mato Grosso do Sul Corrientes M.Grosso do Sul e Paran Esmeralda M. Grosso do Sul Pichincha
2006
2005
2004
2003
Equador Brasil Equador
5.1.3 Epidemiologia
A transmisso do FMDV entre os animais pode ocorrer de vrias formas. As principais so a transmisso direta pelo contato de animais susceptveis com animais infectados e por contato indireto, pelo contato dos animais com fmites ou subprodutos contaminados. A disseminao ocorre pelo contato com secrees e excrees oriundas de animais infectados, transporte de animais, em exposies, feiras, remates, entre outras. A disseminao indireta pode ocorrer por meio de pessoas (trabalhadores, produtores
e veterinrios), veculos, vesturio, equipamentos, sobras de alimentos usados para alimentao de animais, principalmente sunos. A persistncia do vrus no meio ambiente est relacionada com as condies ambientais. Embora o FMDV seja sensvel a inuncias ambientais, como pH abaixo de 6.5, radiao solar e dessecao, o vrus pode sobreviver por longos perodos sob baixas temperaturas e em locais com relativa umidade. Durante a infeco, o vrus excretado nos tecidos e uidos das leses, na saliva, ar expirado, secrees nasais, sangue, leite, smen e urina. A excreo viral nas secrees e excrees inicia
550
Captulo 21
geralmente 24 horas antes do aparecimento dos sinais clnicos, diminuindo consideravelmente at cinco a sete dias aps o desenvolvimento das leses. Quando os sinais clnicos se tornam bem evidentes, a excreo viral j est reduzida. A reduo nos ttulos de vrus excretados coincide com o surgimento e aumento dos nveis de anticorpos neutralizantes. O pico da excreo em bovinos, sunos e ovinos pode ocorrer antes do aparecimento dos sinais clnicos. Os sunos so os grandes disseminadores do vrus atravs de aerossis; os bovinos so bastante sensveis a infeco pelo trato respiratrio, e os ovinos podem ser considerados os eliminadores silenciosos, pois as leses so muito discretas. Em bovinos, 10-30 gramas de material oriundos de uma vescula da lngua freqentemente contm mais de 1 bilho de unidades infectantes do vrus. Um bovino adulto pode facilmente excretar mais de 1014 partculas virais por dia. Essa grande quantidade de vrus produzida e excretada ir se disseminar no ambiente e aderir aos equipamentos, materiais orgnicos e inorgnicos, ambiente, animais e pessoas, que servem de veculos para a transmisso do agente. Aps a manipulao de animais doentes ou no contato com secrees, excrees, manipulao de equipamentos, utenslios e restos mortais de animais, o vrus pode permanecer nas roupas e sapatos das pessoas e, dessa forma, ser disseminado para animais susceptveis. Casos em que o homem (trabalhadores, produtores e veterinrios) carreou mecanicamente o vrus j foram bem descritos e caracterizados. A presena viral nas secrees oronasais de pessoas que manipularam animais infectados pode ser observada por at 48 horas ps-exposio. A quantidade de vrus reduz consideravelmente com o tempo, e nunca foi possvel comprovar a transmisso do vrus presente nessas secrees para animais. O sucesso na transmisso do vrus presente nessas secrees estaria diretamente relacionado com a distncia e com o tempo de exposio do animal. Na literatura, existem algumas descries da infeco de humanos com o FMDV. Geralmente esses casos esto relacionados com pessoas que manipularam grandes concentraes do vrus e desenvolveram algum tipo de leso clnica, po-
rm nunca foi comprovado o envolvimento do FMDV como agente causal. O FMDV excretado em grande quantidade no ar expirado pelos animais, principalmente os sunos. A transmisso por aerossis pode ocorrer e est diretamente relacionada com a quantidade e concentrao de aerossis produzidos e com a distncia entre os animais. Condies ambientais como umidade, temperatura, ventos, pH do ambiente e tamanho das partculas so determinantes neste tipo de transmisso. No surto do Reino Unido de 1967-1968, a associao dos dados epidemiolgicos com as condies meteorolgicas indicou uma possvel disseminao pelo vento. No continente africano e em regies tropicais, onde as condies meteorolgicas so de calor intenso e baixa umidade do ar, essa forma de disseminao improvvel. O real papel dos animais portadores ou carriers na epidemiologia da infeco no est totalmente denido. Vrios registros de surtos que iniciaram aps a introduo de bovinos que haviam se recuperado da infeco apontam para um possvel envolvimento desses animais, porm ainda falta a conrmao. Em circunstncias normais, os animais portadores no excretam o vrus e este no pode ser detectado no meio onde o animal vive. O risco de um animal portador iniciar um surto muito baixo e deve ser diferenciado da introduo de animais com infeces subclnicas ou com leses no-detectadas. Nesse ltimo caso, os pequenos ruminantes podem possuir um papel importante, pois as leses nessas espcies so discretas e de difcil observao. O animal portador denido como sendo um animal sem sinais clnicos, em que o vrus infeccioso pode ser recuperado das secrees orofarngeas aps um perodo de 28 dias ps-infeco. Esses animais podem ter sofrido infeces clnicas ou subclnicas. A imunidade conferida pela vacinao no impede o estabelecimento de uma infeco subclnica e a conseqente produo do estado de portador. O estabelecimento da infeco persistente depende do sorotipo envolvido, e a durao depende da espcie envolvida e de fatores individuais. Em bovinos, o perodo de permanncia pode variar de meses at um ano e facilmente atingir mais de 50% dos animais. Esse
Picornaviridae
551
perodo poder ser maior nos bfalos africanos (Syncerus caffer), chegando at cinco anos, porm a mdia de um a trs anos. Os bfalos asiticos domsticos (Buballus arnee) permanecem portadores por vrios meses. Nos pequenos ruminantes, como ovelhas e cabras, a persistncia menos estudada, porm atinge uma parcela menor da populao e por um perodo no superior a seis meses. Por razes desconhecidas, os sunos no permanecem portadores. A infeco natural pelo FMDV atinge vrias espcies de animais da ordem Artiodactyla (biungulados), incluindo vrios cervdeos, antlopes, impalas, lhamas, gazelas, sunos selvagens e capivaras. Os sinais clnicos nessas espcies so mais discretos ou moderados, e o estado portador pode se detectado, porm de maneira inconsistente. Nos zoolgicos, comum a presena de animais susceptveis ao FMDV e, por causa da intensa movimentao de animais entre parques zoolgicos, a possibilidade da introduo deve ser considerada. O grande risco dos animais selvagens a manuteno da infeco e a transmisso do vrus para as criaes domsticas de ruminantes e sunos. Essa uma preocupao constante na frica, onde animais da grande populao de vida livre freqentemente entram em contato com criaes comerciais. As normas da OIE, que estabelecem o comrcio internacional de animais e produtos, no fazem distino entre animais domsticos e selvagens para considerar a situao epidemiolgica do pas ou regio. A variabilidade gentica do vrus (por volta de oito substituies de nucleotdeos por ciclo de replicao) tem sido utilizada na caracterizao de isolados do FMDV, ao se determinar o padro de distribuio geogrca durante um surto. Uma regio de 200 nucleotdeos no gene da VP1 tem sido utilizada para comparaes genmicas entre os isolados de FMDV. Diferenas inferiores a 4% entre dois isolados indicam um origem comum recente, enquanto diferenas de 15% ou mais apontam para origens geogrcas distintas ou surtos separados por muitos anos. Os isolados com identidade superior a 85% so agrupados como topotipos e tendem ser restritos quanto distribuio geogrca.

A maioria das infeces pelo FMDV inicia pela penetrao do vrus pelas vias respiratrias superiores, seguida de uma multiplicao inicial na mucosa da orofaringe. A seguir, o vrus pode se disseminar localmente e replicar nas vias areas inferiores, inclusive nos pulmes. O vrus tambm pode penetrar atravs de solues de continuidade na pele do focinho, das patas e tetas. Aps a replicao inicial, o vrus atinge a corrente sangnea e distribui-se por todo o organismo do animal. O vrus pode replicar em vrios tecidos e, geralmente, as leses so observadas nesses stios de replicao, como cavidade oronasal, patas, corao, tetas e glndula mamria. O pico de infectividade ocorre nas horas anteriores ao surgimento das leses e se reduz consideravelmente nos trs a quatro dias subseqentes. As leses so geralmente severas e resultam em queda na performance do animal, podendo produzir seqelas que inuenciam na produtividade futura. O vrus tambm excretado em altos nveis em gotculas e aerossis pela respirao e pelas fezes, urina, leite e smen. Os bovinos so infectados principalmente por inalao, freqentemente a partir de sunos, que secretam grande quantidade de vrus por aerossis respiratrios. Os sunos so infectados principalmente por ingesto de alimentos contaminados. Em sunos, ovinos e caprinos, os sinais clnicos so similares, porm mais suaves. Nessas espcies, a claudicao o sinal predominante. Em ovinos, a infeco pode se disseminar pelo rebanho com sinais discretos ou mesmo assintomtica. A febre aftosa no considerada um problema de sade pblica, embora alguns casos de infeco humana j tenham sido documentados. A FMD uma doena vesicular altamente contagiosa e os sinais clnicos so atribudos replicao viral nos epitlios, o que resulta na formao de vesculas. Os sinais clnicos so precedidos de viremia e um perodo de depresso, apatia, febre, laminite e anorexia. As leses vesiculares podem ser observadas na cavidade oral, na lngua, narinas, espao interdigital, banda co-
552
Captulo 21
ronria e nas tetas. Acompanhando o desenvolvimento das vesculas, salivao excessiva e descarga nasal podem ser observadas. As vesculas podem variar de 0,5 a 1 cm de dimetro e encontram-se preenchidas com um uido que possui altas concentraes de vrus. As leses progridem rapidamente, rompendo-se e formando reas ulceradas e erodidas que rapidamente cicatrizam. Antes da resoluo completa das leses pode ocorrer a infeco secundria, agravando ainda mais o quadro. Como conseqncia das leses, ocorre um comprometimento da funcionalidade do rgo, o que explica a anorexia, diculdade de movimentao e amamentao. Seqelas podem incluir deformidades e inclusive a perda completa do casco. O perodo de incubao de dois a 21 dias (mdia de 3 a 8), mas o vrus geralmente eliminado do organismo antes dos sinais clnicos desaparecerem. A morbidade pode atingir os 100%, mas a mortalidade muito baixa em animais adultos. Em animais jovens, os ndices de mortalidade so freqentemente altos, podendo ser atribudo capacidade do vrus de infectar o msculo cardaco. A leso resultante no miocrdio conhecida como corao tigrado. Alm das leses observadas nos epitlios citados anteriormente, o vrus pode replicar e produzir leses nos pilares do rmen. Em bovinos leiteiros, freqentemente ocorre uma queda na produo leiteira por causa das leses na pele do bere e a replicao do vrus na glndula mamria. Abortos podem ocorrer devido s conseqncias sistmicas da infeco e no como resultado da infeco fetal.
A evoluo gentica do FMDV bastante rpida devido s altas taxas de mutao. Isto resulta em diversidade antignica, o que pode ocasionar falhas na proteo pelos anticorpos. Esse fato possui implicao direta na seleo de amostras usadas para produo de antgenos vacinais, em que se deve utilizar variantes virais imunodominantes que so capazes de induzir proteo para um amplo nmero de variantes do mesmo sorotipo. Os animais recm-nascidos que possuem imunidade passiva adquirida da me esto protegidos da infeco. Essa imunidade proporcional condio imunolgica da me e quantidade de colostro ingerido pelo recm-nascido. A vida mdia da imunidade passiva para bovinos e sunos em torno de 21 dias, podendo ser detectada at os quatro ou cinco meses de idade. Esse tipo de imunidade possui inuncia direta na resposta do animal vacinao.
5.1.6 Diagnstico
A caracterstica da alta infecciosidade do FMDV e as srias implicaes sanitrias da infeco exigem um diagnstico urgente e preciso. A possibilidade de FMD deve ser considerada sempre que houver doena vesicular em ruminantes ou sunos, devido ao fato de outros vrus produzirem leses similares. A apresentao clnica pode auxiliar, porm no suciente para o diagnstico denitivo. Podem ocorrer infeces mistas, de variantes com virulncia alterada ou, ainda, com manifestaes clnicas mascaradas pela imunidade parcial do rebanho. Por essas razes, a suspeita clnico-epidemiolgica deve necessariamente ser conrmada por testes laboratoriais. O diagnstico da FMD realizado pela demonstrao do vrus ou de antgenos virais em tecidos e uidos de animais infectados. A investigao sorolgica pode ser empregada, porm em razo da diculdade de diferenciao entre resposta sorolgica vacinal daquela induzida pela infeco natural, no recomendvel para regies endmicas ou onde a vacinao praticada. Em casos suspeitos de FMD, a noticao do servio ocial veterinrio obrigatria e premente. A coleta, transporte e processamento da
5.1.5 Imunidade
A proteo imunolgica conferida pela infeco natural ou pela vacinao mediada por anticorpos neutralizantes. Existe uma forte correlao entre nveis desses anticorpos e proteo. No h evidncias de que a imunidade celular desempenhe um papel relevante na proteo da infeco com o FMDV. A imunidade especca para o sorotipo e subtipo com o qual o animal foi infectado ou vacinado, ou seja, a imunidade conferida contra um sorotipo no ir proteger o animal da infeco clnica com outro sorotipo.
Picornaviridae
553
amostra devem ser realizados por pessoal tcnico capacitado e em laboratrios de segurana credenciados. Os materiais de eleio para o diagnstico da enfermidade incluem fragmentos do epitlio e uido coletado de vesculas no rompidas ou recentemente rompidas. O material deve ser misturado em partes iguais de meio de transporte contendo glicerol e meio fosfatado (0,04 M). No caso de falta de meio de transporte, meio essencial mnimo ou PBS podem ser utilizados. Por causa da fragilidade do vrus a variaes de pH, recomenda-se manter um pH entre 7,2 e 7,6 na amostra. Em casos suspeitos de infeco subclnica ou com leses discretas, pode-se coletar sangue com anticoagulante e/ou soro. Na presena da mortalidade de animais jovens, tecidos, como o msculo cardaco, tireide e linfonodos, podem ser coletados. Quando as leses so discretas ou suspeita-se de infeces subclnicas e convalescentes, pode-se coletar sangue com anticoagulantes e uido esofgico-faringeano (OP), com auxlio de coletores do tipo probang. O OP deve possuir restos celulares e ser livre de sangue ou lquido ruminal. Aps a coleta, o lquido deve ser misturado com meio de transporte (0,08M soluo de fosfato, 0.01% albumina srica bovina, antibiticos, 0,002% vermelho de fenol e com pH 7,2). O material coletado deve ser acondicionado em um recipiente limpo e vedado para evitar o vazamento da amostra ou a penetrao de contedo que possa alterar o pH, inativando o vrus. O transporte deve ser realizado imediatamente aps a coleta e sob refrigerao (4C ). Em situaes nas quais o intervalo entre a coleta e a chegada ao laboratrio forem superiores a 24 horas, as amostras devem ser congeladas em nitrognio lquido ou gelo seco. Os testes de rotina utilizados para o diagnstico da FMD so: isolamento viral, xao de complemento e ELISA de captura. Para o isolamento viral, uma frao do tecido deve ser macerada e o sobrenadante inoculado em cultivo celular. Se o material coletado for o lquido vesicular, pode ser inoculado diretamente. Os cultivos primrios de tireide bovina so as clulas de eleio para o isolamento do FMDV, mas cultivos primrios de rim de bovino, suno e cordeiros tambm podem
ser utilizados. As linhagens celulares BHK-21 e IBRS-2 tambm so utilizadas para o isolamento, porm possuem menor sensibilidade. A conrmao da presena viral e identicao do sorotipo presente em amostras que produziram efeito citoptico so realizadas por testes de xao do complemento ou ELISA. Outra forma de isolamento viral a inoculao em camundongos lactentes (2-7 dias de idade). Alguns isolados de campo necessitam de mais de uma passagem antes para se tornarem adaptados a camundongos. O indicativo da presena viral a mortalidade dos animais inoculados aps 48 horas; e a identicao do sorotipo realizada pelos mesmos testes, utilizando-se uma suspenso do msculo esqueltico dos animais mortos. Em casos onde no observado efeito citoptico nos cultivos ou mortalidade nos camundongos em 48 horas, a amostra deve ser congelada, descongelada e inoculada novamente antes de ser considerada negativa. As provas de xao de complemento e ELISA de captura so utilizadas para a deteco de antgenos virais. O teste de ELISA o recomendado pela OIE/FAO para a demonstrao da presena de antgenos virais e identicao do sorotipo presente na amostra. O teste de ELISA possui maior sensibilidade e especicidade, sendo indicado na ausncia do primeiro. O uso de testes para a deteco de anticorpos contra as protenas no-estruturais deve ser realizado com cautela e fundamenta-se no fato de que somente animais infectados e no aqueles vacinados desenvolvem anticorpos contra essas protenas. De fato, os animais vacinados com vacinas inativadas desenvolvem anticorpos apenas contra as protenas estruturais, pois no ocorre replicao viral e as protenas no-estruturais no so sintetizadas. No entanto, protenas noestruturais podem acidentalmente contaminar as vacinas durante a sua produo, resultando na induo de anticorpos nos animais vacinados. Esse problema mais comum em animais que receberam mltiplas doses de vacinas. Por esta mesma razo, as vacinas devem ser puricadas para a remoo de todos os traos de protenas no-estruturais.
554
Captulo 21
Os testes para a deteco de anticorpos so a soro-neutralizao (SN), ELISA e VIAA (virus infection-associated antigen). Os testes de SN e ELISA so utilizados e reconhecidos para certicao para comrcio internacional. O teste de SN especco para o vrus utilizado e requer de dois a trs dias para a obteno do resultado. Alm disso, existe a necessidade de um laboratrio equipado e seguro, pois este teste requer a manipulao de vrus vivo. O teste de ELISA especco, sensvel e rpido (4-5 horas) e no envolve manipulao de vrus. Testes de ELISA que detectam anticorpos contra as protenas 3D e 3ABC foram desenvolvidos e apresentam sensibilidade e especicidade aceitveis. O VIAA detecta anticorpos contra protena polimerase 3D, envolvida na replicao viral. Dessa forma, o VIAA no sorotipo especco e pode resultar em falsos-positivos em animais que foram vacinados vrias vezes. Por isso, tem sido recomendada a sua substituio pelo ELISA. O EITB (enzyme-linked immuno-electrotransfer blot), desenvolvido pelo PANAFTOSA, possui sensibilidade superior ao VIAA e amplamente utilizado no programa de controle da FMD no Brasil. A deteco de animais portadores realizada atravs do isolamento viral do vrus presente no uido esfago-farngeo. Esse material submetido ao tratamento com TTE (triuortricloroetano) para dissociar os vrions dos anticorpos neutralizantes e de outras substncias inibidoras. A conrmao da presena e do tipo viral realizada atravs da inoculao em cultivo celular e ELISA de captura. Diversos testes de RT-PCR e PCR em tempo real foram desenvolvidos para a realizao do diagnstico rpido da infeco. O PCR em tempo real de execuo rpida, pode ser adaptado para utilizao a campo, sendo capaz de detectar e diferenciar os sete sorotipos possveis. O foco dos esforos no diagnstico do FMDV envolve o desenvolvimento de testes rpidos e que sejam capazes de diferenciar a infeco ativa da resposta vacinao e tambm detectar os animais portadores.

O estabelecimento de uma estratgia universal e denitiva para o controle da FMD contro-
verso e complexo. As medidas a serem adotadas por uma regio ou pas devem ser baseadas na situao epidemiolgica de cada caso. Alm disso, vrios fatores devem ser considerados para a escolha das melhores alternativas, destacando-se o impacto domstico e externo nas exportaes, a perda de produtividade animal, as conseqncias econmicas para a regio, bem-estar animal, entre outras. Durante a ocorrncia de um surto, extremamente prudente avaliar as medidas que esto sendo adotadas, para que o estudo do risco de disseminao do vrus contemple as necessidades dos segmentos envolvidos. As experincias de vrios pases e regies indicam essa necessidade. Em reas livres naturais ou que erradicaram o agente, devem-se aplicar medidas preventivas para evitar a introduo do vrus. Essas medidas incluem barreiras sanitrias, restrio ao trnsito de animais oriundos de reas de risco, desinfeco, quarentena e vacinao (quando indicado). Essas medidas devem ser aplicadas contnua e sistematicamente, sobretudo se existirem reas de risco nas proximidades. A vigilncia deve tambm incluir a conscientizao dos produtores, manuteno da estrutura de diagnstico, vigilncia e combate. Em casos de surtos em reas livres ou paraendmicas, a primeira opo para erradicar o surto a adoo do rie sanitrio, abatendo-se e incinerando os animais infectados, os contatos e susceptveis. Essa alternativa a mais econmica e ecaz quando um pequeno nmero de animais est envolvido e se for realizada de forma rpida. Outra vantagem do uso desse mtodo a obteno do certicado de zona livre em um curto perodo de tempo. No entanto, em regies onde a densidade populacional elevada e ocorre um intenso movimento entre pessoas e animais, essa alternativa pode ser problemtica, sobretudo se o vrus j tiver sido disseminado. Outro aspecto que deve ser considerado a infra-estrutura para o sacrifcio dos animais e destruio das carcaas, pois durante essas operaes grandes quantidades de material infeccioso so geradas e podem servir de fonte para disseminao. Uma desvantagem desse mtodo de combate refere-se eliminao de um nmero excessivo de animais, provavelmente muitos sem necessidade, o que repercute negativamente na sociedade.
Picornaviridae
555
Existem vrias combinaes possveis de medidas de combate a surtos. As vantagens e desvantagens variam de acordo com a apresentao. No existe um modelo de medidas que devam ser adotadas para todos os casos. A escolha de um modelo deve ser montada de acordo com a realidade da regio envolvida. Porm, em todas as situaes, a organizao e rapidez das aes iro contribuir para a reduo da disseminao do vrus. Logo aps a conrmao do diagnstico, a propriedade (ou a regio) deve ser interditada, evitando-se a sada de quaisquer animais ou produtos que possam servir de veculos para a transmisso viral. Os animais afetados e os potencialmente em contato devem ser abatidos, e as carcaas incineradas ou enterradas com cobertura de cal. Outros ruminantes da propriedade tambm devem ter o mesmo tratamento. Deve-se ressaltar que o FMDV extremamente infeccioso e as medidas devem ser drsticas e rgidas para evitar a sua disseminao a partir do foco. A estratgia pode exigir a vacinao perifocal, ou seja, das propriedades vizinhas num raio de 3 km. Essa imunizao produz um cinturo de imunidade ao redor do foco e diculta a sada do vrus. Aps o abate e a destruio das carcaas, procede-se a desinfeco das instalaes e equipamentos. A restrio ao movimento de animais pode seguir at que se tenha segurana que no h mais risco de disseminao. Esses procedimentos devem ser seguidos de um vazio sanitrio, que pode chegar a trs meses. Nesse perodo, a propriedade deve permanecer completamente vazia de quaisquer animais susceptveis ao vrus. O vazio sanitrio seguido da introduo de animais sentinela, geralmente bovinos jovens soronegativos. Esses animais so introduzidos para monitorar a presena residual do agente e so monitorados clnica e sorologicamente para a presena do vrus. Nos casos positivos, deve-se novamente realizar a depopulao, desinfeco e vazio sanitrio. Quando os sentinelas no apresentam sinais de infeco, doena ou soroconverso aps um determinado perodo (60-90 dias), pode-se proceder a repopulao da propriedade. A vacinao uma importante alternativa para o controle da infeco e erradicao da en-
fermidade de reas endmicas e paraendmicas. Essa alternativa pode ser usada em regies endmicas, para reduzir gradativamente a circulao do vrus e a incidncia da enfermidade, ou em ocasies de surtos, para impedir a propagao do vrus. A eccia da vacinao em regies endmicas est diretamente relacionada com a cobertura vacinal. Resultados promissores so obtidos com cobertura vacinal acima de 80% da populao bovina. No entanto, esses nveis de cobertura so insucientes para o objetivo de erradicao. O objetivo da vacinao durante um surto impedir a disseminao do vrus para outras propriedades. A imunidade conferida pela vacinao consegue reduzir signicativamente a quantidade de vrus excretada por um animal aps quatro a cinco dias da aplicao. A ocorrncia de novos surtos ir diminuir gradativamente aps a aplicao da vacina, podendo resultar em preveno de novos focos em 15 a 20 dias. As medidas de controle e erradicao devem ser constantemente revistas e atualizadas, de acordo com o surgimento de novas situaes. O monitoramento constante da situao epidemiolgica mundial deve ser uma rotina e servir de alerta. A manuteno de uma rede eciente de vigilncia, diagnstico, controle e divulgao das aes deve ser prioridade em qualquer situao.
5.1.8 Vacinas
As vacinas contra a FMD so produzidas a partir de preparaes de vrus cultivados em cultivos celulares e inativados quimicamente. Essas preparaes so combinadas com adjuvantes para potencializar a resposta imune. O processo de produo altamente tecnicado e desenvolvido em laboratrios de segurana para evitar escape de vrus. Diferentes testes para assegurar a qualidade e determinar a massa antignica, potncia e inocuidade so realizados antes da liberao de um lote de vacinas. Vacinas formuladas com adjuvantes base de hidrxido de alumnio, com ou sem saponina, so indicados somente para ruminantes. As vacinas com adjuvante oleoso (dupla emulso) podem ser utilizadas para sunos e ruminantes. A capacidade imunognica entre os sorotipos varivel, ou seja, para o soro-
556
Captulo 21
tipo O, necessria uma massa antignica maior do que para os sorotipos A, C e sia 1. As razes para essa diferena no so conhecidas. Em termos gerais, a massa antignica varia entre 1-10g de partculas 146S para cada amostra presente na vacina. Os componentes das vacinas devem reetir a situao epidemiolgica de cada regio e podem variar de constituio conforme o caso e a espcie envolvida. As vacinas podem ser monovalentes, isto , formuladas com somente um sorotipo; ou multivalentes, sendo formuladas com mais de um sorotipo (p. ex.: A, O e sia 1). Podem tambm ser formuladas com vrias amostras de um mesmo sorotipo (p. ex.: A). A maioria das vacinas comercializadas no Brasil e na Amrica do Sul so trivalentes, contendo amostras virais dos sorotipos A24 Cruzeiro, O1 Campos e C3 Indaial. Essas cepas so representativas dos vrus circulantes na regio e imunodominantes, ou seja, so capazes de conferir proteo contra possveis variantes. Existe uma constante necessidade de vigilncia sorolgica dos isolados em surtos para certicar-se que as vacinas disponveis so prprias para os respectivos locais e para identicar o eventual aparecimento de novas variantes. Os sorotipos A e O so os que apresentam um maior nmero de variantes. A eccia da vacinao dependente de vrios aspectos, dentre eles do armazenamento em temperatura adequada. Vacinas conservadas entre 3-8C so estveis por at dois anos. A aplicao deve ser realizada com os animais contidos, especialmente fmeas gestantes. Vacinas com adjuvante aquoso devem ser aplicadas pela via subcutnea, preferencialmente na regio do pescoo ou poro cranial da escpula. O volume recomendado varia entre 2-3 ml para bovinos e 1-2 ml para pequenos ruminantes. Os animais jovens devem receber a mesma dose dos adultos. As vacinas oleosas so administradas em bovinos e sunos pela via intramuscular. Em bovinos, recomenda-se a regio superior do pescoo, e, em sunos, a regio posterior da orelha. Os constituintes das vacinas so puricados, as reaes no stio de vacinao so discretas, e as reaes analticas so incomuns. Reaes podem ocorrer devido a problemas na aplicao e, geralmente, esto relacionadas com problemas de contaminao da
seringa ou no momento da vacinao. Reaes inamatrias granulomatosas que persistem por algumas semanas tm sido freqentemente relatadas aps o uso de vacinas com adjuvante oleoso. A imunidade induzida pela vacinao capaz de proteger os animais da doena clnica e o pico de produo de anticorpos atingido aps quatro ou cinco semanas da aplicao. A segunda dose deve ser aplicada 30 dias aps a primeira vacinao. Vacinaes anuais so recomendadas para manter os nveis de imunidade do rebanho. A resposta imune produzida pela vacinao no esterilizante, ou seja, os animais vacinados e desaados com o vrus so infectados. No caso dos ruminantes, esses animais podem tornar-se portadores. No entanto, nunca houve comprovao da transmisso do vrus entre animais portadores e susceptveis. Animais jovens respondem satisfatoriamente vacinao, porm, em razo da imunidade materna interferir na resposta vacinao, recomenda-se vacinar somente animais com idade superior a dois meses.
5.1.9 Perspectivas
A febre aftosa responsvel pelas maiores restries ao comrcio internacional de animais e seus subprodutos. Quando um surto ocorre em um determinado pas, seus parceiros comerciais interrompem a importao de animais, produtos animais e freqentemente de outros produtos agrcolas. Tais circunstncias resultam em perdas permanentes de mercado para os pases afetados. Muito tem sido realizado para melhorar as vacinas e mtodos de diagnsticos, assim como para o desenvolvimento de terapias para conter a propagao viral. No entanto, nenhuma alternativa ainda est disponvel comercialmente, abrindo uma rea interessante para pesquisa e desenvolvimento. A febre aftosa clinicamente semelhante e assim pode ser confundida com a rinotraquete infecciosa bovina (IBR), lngua azul, mamilite herptica e peste bovina. Tambm semelhante estomatite vesicular, doena vesicular suna e exantema vesicular dos sunos. Por isso, testes rpidos e capazes de diferenciar entre essas enfermidades so necessrios.
Picornaviridae
557
Alguns conceitos em relao ao FMDV e as medidas de controle so baseados em suposies ou em situaes de pocas anteriores. O papel dos animais portadores na epidemiologia da enfermidade nunca foi totalmente comprovado. Mesmo assim, formas de diferenciao entre animais vacinados e portadores deve ser um dos focos de estudos futuros. O conceito de que as vacinas no possuem eccia deve ser combatido. As medidas de erradicao e eliminao dos animais infectados e contatos devem ser adotadas de acordo com a realidade da regio e as conseqncias resultantes. Pelo menos, muito discutvel descartar um grande nmero de animais e desestabilizar uma regio ou pas inteiro somente para a manuteno da condio sanitria e comercial. As diferentes formas como os surtos de 2001, no Reino Unido e Uruguai, foram combatidos serviram como um bom exemplo do potencial social e psicolgico do impacto que se segue a uma epidemia de FMD. O intenso comrcio de animais e seus subprodutos no mundo, muitas vezes ilegal, a mobilidade cada vez maior das pessoas, reduo na vacinao de rebanhos, a constante expanso de amostras do FMDV e a maior interao das pessoas com a vida silvestre devem ser considerados para a formulao de programas de preveno. No momento do surgimento de um foco da enfermidade, vrios aspectos devem ser considerados, e as aes devem ser tomadas o mais breve possvel. Com a evoluo do surto, as medidas devem ser avaliadas constantemente, levando em considerao todos os segmentos da sociedade envolvida ou possivelmente afetada e, se necessrio, novas medidas devem ser consideradas e implementadas. Na dcada passada, a Amrica do Sul atingiu uma situao privilegiada em relao ao controle. Porm, devido a diversos fatores, a erradicao no foi possvel, e a regio deparou-se com a reemergncia da FMD. Para avanar no controle e obter a erradicao da enfermidade da regio, existe a necessidade de conscientizao de todos os pases, principalmente dos pases em que a produo bovina no desenvolvida, para esforos direcionados ao combate aos focos. O papel dos pases produtores ser de extrema importncia, pois esses devem liderar, e at mesmo nanciar, os programas de combate doena na
regio, pois certamente sero os mais favorecidos com a abertura do comrcio internacional.
5.2 Vrus da doena vesicular dos sunos

A doena vesicular dos sunos (SVD) uma enfermidade moderamente contagiosa e aguda, caracterizada por febre e produo de vesculas no focinho, boca, ps e tetas. A doena pode ser introduzida em uma granja por animais infectados, restos de alimentos ou dejetos contaminados. Os sunos so os nicos hospedeiros naturais, e a doena pode variar em gravidade, mas raramente fatal. Altos ttulos virais esto presentes no animal, nos seus uidos corporais e excrees. Os sinais clnicos da SVD incluem ainda febre, perda de apetite, diculdade de locomoo (por causa das vesculas nas patas). O desenvolvimento das vesculas ocorre entre 2 e 11 dias aps a infeco. O pico da viremia ocorre 2 a 4 dias aps a infeco e persiste por, aproximadamente, sete dias. A recuperao ocorre normalmente em 1 a 3 semanas, mas partculas virais infecciosas podem ser encontradas nas fezes por at trs meses em animais portadores. O SVDV pode permanecer vivel por mais de 30 dias sob refrigerao, com o pH entre 3,9-9,1. As leses vesiculares em sunos so clinicamente indistinguveis das causadas pelo FMDV, pelo vrus da estomatite vesicular e vrus do exantema vesicular; e suas caractersticas histopatolgicas tambm so muito similares. As leses vesiculares se desenvolvem na lngua, lbios e focinho, bandas coronrias e regio posterior das patas, e iniciam como uma regio hipermica e que aumenta com o progresso da formao das vesculas. O epitlio da regio plantar pode tornar-se frouxo, podendo ocorrer a perda do casco. As leses na boca, nos lbios e focinho so menos freqentes. As leses freqentemente sofrem infeces bacterianas secundrias. O primeiro relato de SVD foi descrito na Itlia, em 1966, e o agente etiolgico foi identicado em 1968. Desde ento, a doena tem sido esporadicamente descrita na Europa, Japo, Hong Kong e Taiwan. No h relatos da presena da SVD nas Amricas. O vrus pertence ao gnero Enterovirus e altamente relacionado com o vrus Coxsackie B5 de humanos (CV-B5). Baseados na
558
Captulo 21
similaridade de nucleotdeos, tem sido proposto que o SVDV foi introduzido na populao suna pela transmisso do CV-B5 a partir de humanos. Os vrions so muito estveis sob pH cido, no ambiente e resistem aos desinfetantes comuns. A viabilidade pode ser mantida aps dessecao, congelamento, fermentao e processo de defumao usado para preservar produtos sunos, podendo persistir no material contaminado por longo perodo de tempo. Somente um sorotipo do SVDV foi descrito at o presente, e o vrus no apresenta reatividade sorolgica cruzada com outros picornavrus, incluindo os enterovrus sunos. O diagnstico da SVD baseia-se em testes laboratoriais, que so absolutamente necessrios para diferenci-la da FMD. As amostras a serem enviadas ao laboratrio incluem sangue com anticoagulante para isolamento viral, soro, tecidos de leses e lquidos vesiculares. O diagnstico realizado atravs do isolamento viral em clulas de cultivo, por xao do complemento e ELISA de captura para a deteco de antgenos; ou atravs de SN, para a deteco de anticorpos. Os resultados dos testes de ELISA e SN so disponveis em um a trs dias. A caracterizao da amostra, para usos epidemiolgicos, pode ser realizada por seqenciamento de determinadas seqncias da VP1. A microscopia eletrnica tambm pode ser utilizada para a visualizao de partculas vricas no material clnico. A preveno deve ser direcionada, a m de evitar a introduo do vrus em reas e rebanhos livres, pelo estrito controle de animais importados de reas infectadas e pela regulamentao do movimento de animais ou produtos de origem animal. O controle deve tambm incluir inspeo veterinria, testes sorolgicos e certicao de propriedades. O controle tambm deve contar com sistemas de deteco e diagnstico rpidos, vigilncia sorolgica e sistema de informao sobre a doena. Atualmente, no existem vacinas disponveis contra o SVDV.
varia entre 4 e 28 dias, e os sinais clnicos caracterizam-se por febre, anorexia, depresso, evoluo para sinais neurolgicos como tremores e incordenao, convulses, coma e morte. A patogenicidade inuenciada pela amostra viral, idade e condio imunolgica dos animais. Em casos severos, a mortalidade pode atingir at 75%, principalmente em animais jovens. A transmisso ocorre por contato com animais infectados ou por objetos contaminados com o vrus. Aps a penetrao, o vrus replica no trato alimentar e linfonodos associados, disseminando-se por viremia, onde atinge e infecta o sistema nervoso central. As leses neurolgicas incluem gliose, manguitos perivascular e degenerao neuronal. O diagnstico realizado atravs do isolamento viral em cultivo celular (primrio ou linhagem) de origem suna e demonstrao do agente por imunouorescncia. O diagnstico diferencial deve ser feito de outras enfermidades que infectam o sistema nervoso central, como peste suna africana, peste suna clssica, raiva entre outras. O controle pode ser realizado pelo do uso de vacina inativadas ou atenuadas, alm de medidas de isolamento, quarentena e desinfeco.
5.4 Enterovrus sunos tipos 2-11

Os enterovrus sunos constituem um grupo de vrus (2-11) presentes em virtualmente todas as criaes sunas. A sua identicao foi realizada na dcada de 1960, na Europa Oriental. A grande maioria das infeces possui apresentao subclnica. Os enterovrus sunos so classicados no gnero Enterovirus da famlia Picornaviridae, e as propriedades estruturais so semelhantes s descritas para o restante da famlia. A alta resistncia a variaes de pH (2-9) e tambm a temperaturas abaixo de 15C favorece a sua permanncia por longo tempo no meio ambiente. A transmisso ocorre por contato direto ou indireto, entre animais ou de animais com dejetos contaminados. Embora se acredite que a maioria das infeces seja subclnica, em determinadas circunstncias so observadas infeces clnicas. Nesses casos, observam-se: doena entrica, respiratria, abortos e outras falhas reprodutivas, alm de doena neurolgica. Os enterovrus so facilmente isolados e cultivados em clulas de cultivo primrias
5.3 Enterovrus suno tipo 1

O enterovrus suno-1 o agente etiolgico da polioencefalomielite suna ou doena de Teschen. O perodo de incubao da enfermidade
Picornaviridae
559
ou de linhagem de origem suna, como as IBRS-2 e PK-15. O diagnstico somente deve ser buscado quando existe a suspeita clnica. A conrmao da presena do agente realizada pelo isolamento em cultivo, seguido da deteco de antgenos por imunouorescncia ou imunoperoxidase. A sorologia e xao do complemento so mtodos auxiliares na classicao em sorotipos e tambm para demonstrar a ocorrncia da infeco. Medidas de preveno e controle devem ser tomadas somente nos casos conrmados do envolvimento do enterovrus na etiologia da enfermidade.
5.5 Enterovrus bovino

Um grande nmero de enterovrus tem sido isolado do trato digestivo, respiratrio e reprodutivo de bovinos. Alguns isolados so associados com manifestaes clnicas, como diarria, doena respiratria e abortos. No entanto, tentativas de reproduzir essas manifestaes pela inoculao experimental de animais tm, geralmente, resultado infrutferas. Isso diculta o estabelecimento da patogenia e da real importncia desses vrus. Sabe-se, porm, que so vrus amplamente difundidos na populao bovina, pois um percentual altssimo de animais e rebanhos possui sorologia positiva. Em alguns casos de doena respiratria, as leses presentes podem ser confundidas com a FMD. As propriedades biolgicas dos enterovrus bovinos so as mesmas descritas para outros membros no mesmo gnero. Em razo da facilidade de replicao desses vrus em clulas de cultivo, a grande maioria dos isolados so achados acidentais ou isolados de infeces subclnicas. A conrmao da identidade do agente pode ser realizada por ME ou por tcnicas de deteco de antgenos. Neutralizao com anti-soro especco tambm um mtodo de identicao desse vrus, aps o seu isolamento em cultivo celular.
tgenos menores, sem muita importncia clnica. Existem dois rinovrus eqinos (EqRV), 1 e 2, que foram inicialmente classicados de acordo com a sua estabilidade ao pH. O rinovrus eqino 1 sensvel ao pH cido, caracterstica semelhante ao FMDV, o que fez com que fosse classicado no gnero Aphtovirus. Curiosamente, os sinais clnicos em eqinos lembram os sinais observados em bovinos com FMD. Alm disso, alguns animais podem apresentar comprometimento sistmico. O rinovrus eqino tipo 2 resistente ao pH cido, caracterstica semelhante aos enterovrus. No entanto, o seqenciamento do genoma revelou semelhana com os cardiovrus. At o presente, o rinovrus eqino 2 no foi associado com manifestaes clnicas. A infeco pelo rinovrus bovino (BoRV) geralmente cursa de forma subclnica ou sinais respiratrios leves. Esses vrus esto classicados no gnero Rhinovirus e apresentam caractersticas estruturais e biolgicas semelhantes aos outros membros do gnero, incluindo a labilidade ao pH baixo. Em infeces clnicas, os sinais clnicos apresentados so: febre, depresso, anorexia, lacrimejamento, conjuntivite, descarga nasal e diculdade respiratria, nos casos graves. Pelo fato de os sinais clnicos serem discretos ou inespeccos, o diagnstico deve ser realizado pelo isolamento do vrus em cultivo celular e deteco dos antgenos por imunouorescncia.
5.7 Vrus da encefalomiocardite

O vrus da encefalomiocardite (EMCV) foi identicado, em 1960, no Panam e, desde ento, tem sido descrito em vrios locais, como os Estados Unidos, Europa, frica e alguns pases da Amrica Central. A sua presena foi descrita no Brasil em 1985. O EMCV pertence ao gnero Cardiovirus, resistente a solventes orgnicos e s variaes de pH, e possui atividade hemaglutinante em eritrcitos de ratos, ovinos, cobaias e eqinos. O ECMV considerado um vrus originalmente de roedores, porm capaz de infectar uma variedade de outros mamferos, como chimpanzs, macacos, elefantes, lees, esquilos, sunos, entre outros. Os roedores so considerados os principais reservatrios do vrus, dos quais o
5.6 Rinovrus eqino e bovino

Os rinovrus constituem um grupo de vrus que infectam vrias espcies de mamferos, incluindo humanos, eqinos e bovinos. Em bovinos e eqinos, os rinovrus so considerados como pa-
560
Captulo 21
vrus pode ser isolado, com freqncia, de fezes e urina. Assim, os principais veculos de transmisso para sunos so o alimento e gua contaminados com fezes ou urina de roedores. Em sunos jovens, os sinais clnicos caracterizam-se por anorexia, paralisia, dispnia e morte sbita devido miocardite. Em animais recm-desmamados, a mortalidade pode se aproximar de 100%. Em animais jovens e adultos, as infeces so geralmente subclnicas. Fmeas prenhes podem apresentar problemas reprodutivos como aborto, reabsoro, natimortalidade, mumicao fetal e nascimento de animais prematuros. As leses macro e microscpicas so auxiliares no diagnstico. O diagnstico do EMCV de animais que morreram de miocardite ou em fmeas com problemas reprodutivos realizado pelo isolamento viral em cultivo celulares ou em ovos embrionados. A conrmao do agente realizada pela deteco de antgenos virais nas clulas de cultivo por imunouorescncia. A presena de roedores mortos na propriedade, sem causa aparente, seguida do isolamento viral a partir desses animais pode conrmar o diagnstico. As medidas de preveno e controle da enfermidade devem ser direcionadas para o combate de roedores.
logo aps a introduo do vrus no avirio, e esses ndices se reduzem com o estabelecimento da infeco na criao. O diagnstico realizado atravs do isolamento viral a partir de macerados do crebro de pintos doentes. O isolamento pode ser feito pela inoculao via intracerebral em pintos de um dia, o que reproduz a enfermidade neurolgica em at 28 dias. Outra forma de isolamento viral a inoculao no saco da gema de ovos embrionados de 5-7 dias de incubao. Aps 12 dias, os embries so necropsiados e a presena de atroa muscular da perna e morte embrionria indicativa da presena do agente. Pelo fato do AEV no produzir efeito citoptico em clulas de cultivo, a tcnica de isolamento no recomendada para o diagnstico. A deteco de anticorpos atravs de SN ou ELISA podem auxiliar no diagnstico. O controle da enfermidade realizado pela depopulao da granja ou pelo uso de vacinas atenuadas ou inativadas.
AGOL, V.I.; PAUL, A.V.; WIMMER, E. Paradoxes of the replication of picornaviral genomes. Virus Research, v.62, p.129147, 1999. BARNETT, P.V. et al. Evidence that high potency foot-and-mouth disease vaccine inhibits local virus replication and prevents the carrier state in sheep. Vaccine, v.22, p.1221-1232, 2004. BAXT, B.; RIEDER, E. Molecular aspects of foot-and-mouth disease virus virulence and host range: role of host cell receptors and viral factors interactions. In: SOBRINHO, F.; DOMINGO, E. (eds). Foot-and-mouth disease: current perspectives. Norfolk, UK: Horizon Press, 2004. Cap.7, p.145-172. BERGMANN, I.E. et al. Diagnosis of persistent aphthovirus infection and its differentiation from vaccination response in cattle by use of enzyme-linked immunoelectrotransfer blot analysis with bio-engineered nonstructural viral antigens. American Journal of Veterinary Research, v.54, p.825-831, 1993. CORREA MELO, E.; LOPEZ, A. Control of foot and mouth disease: the experience of the Americas. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.21, p.695-698, 2002. DAWE, P.S. et al. Natural transmission of foot-and-mouth disease virus from African buffalo (Syncerus caffer) to cattle in a wildlife area of Zimbabwe. The Veterinary Record, v.134, p.230232, 1994.
5.8 Vrus da encefalomielite das aves

O vrus da encefalomielite das aves (AEV) produz a enfermidade conhecida como encefalomielite das aves (AE), que acomete principalmente pintinhos com 1 a 4 semanas de idade. J em aves com idade superior a 28 dias, as infeces so geralmente subclnicas. Perus, faises e codornas so tambm susceptveis infeco, que geralmente subclnica ou com manifestaes clnicas leves. Existe somente um sorotipo do vrus, porm observada uma variao de virulncia entre os isolados de campo. A principal forma de transmisso transovariana, e as manifestaes clnicas so observadas em pintos com at quatro semanas de vida. A apresentao clnica da AE caracteriza-se por ataxia, incordenao, tremores da cabea e pescoo e morte. Em aves adultas, os sinais so discretos, porm observa-se queda na postura que pode chegar a 15%. Uma alta morbidade e mortalidade so observadas
Picornaviridae
561
RIEDER, E.; WIMMER, E. Cellular receptors of Picornaviruses: an overview. In: SEMLER, B.L.; WIMMER, E. (eds). Molecular Biology of Picornaviruses. Washington, DC: ASM Press, 2002. p.61-70. RUECKERT, R.R. Picornaviridae: The Viruses and Their Replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.21, p.609-654. RUECKERT, R.R.; WIMMER, E. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. Journal of Virology, v.50, p.957-959, 1984. SUTMOLLER, P. et al. Control and eradication of foot-andmouth disease. Virus Research, v.91, p.101-104, 2003. VAN DER HEIDE, L. Encephalomyelitis. In: SWAYNE, D.E. et al. A laboratory manual for the isolation and identication of avian pathogens. 4.ed. Tallahassee, FL: American Association of Avian Pathologists, 1998. Cap.35, p.197-199. VAN REGENMORTEL, M.H.V. et al. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego, CA: Academic Press, 2000. 1162p.
DOEL, T.R. FMD vaccines. Virus Research, v.91, p.81-100, 2003. FENNER, F.J. et al. Caliciviridae. In: ______. Veterinary Virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1993. Cap.23, p.425-430. FENNER, F.J. et al. Picornaviridae. In: ___. Veterinary Virology. 2.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1993. Cap.22, p.403-423. GRUBMAN, M.J. et al. Biochemical map of polypeptides specied by foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, v.50, p.579-586, 1984. HOUSE, J.A.; HOUSE, C.A. Vesicular diseases. In: STRAW, B.E. et al. (eds). Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1999. Cap.25, p.327-340. KITCHING, R.P.; SALT, J.S. The interference by maternallyderived antibody with active-immunization of farm animals against to food-and-mouth disease. The British Veterinary Journal, v.151, p.379-389, 1995. LYRA, T.M.P.; SILVA, J.A. A febre aftosa no Brasil, 1960-2002. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v.56, p.565-576, 2004. OIE. Foot and mouth disease. In. ___. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. 3.ed. Paris, France: OIE, 1996. Cap.2.1.1, p.47-56.
FLAVIVIRIDAE
Julia F. Ridpath & Eduardo Furtado Flores
22
565 565
565 566
1 Introduo 2 Caractersticas comuns aos membros da famlia Flaviviridae

2.1 O vrion e o genoma 2.2 O ciclo replicativo
3 Caractersticas que diferenciam os membros da famlia Flaviviridae 4 Classicao

4.1 Gnero Flavivirus 4.1.1 Vrus da Louping ill 4.1.2 Vrus Wesselbron 4.1.3 Vrus da encefalite japonesa 4.1.4 Vrus do Nilo Ocidental 4.2 Gnero Pestivirus 4.2.1 Vrus da peste suna clssica 4.2.2 Vrus da diarria viral bovina 4.2.3 Vrus da doena da fronteira 4.3 Gnero Hepacivirus
567 568
568 570 571 571 572 576 579 582 589 589
590
1 Introduo
A famlia Flaviviridae abriga vrios vrus de importncia em sade humana e animal. Os membros dessa famlia possuem vrions pequenos, envelopados, que contm uma molcula de RNA linear de polaridade positiva como genoma. A famlia dividida em trs gneros: Flavivirus (do latim avus amarelo), Pestivirus (do latim pestis peste) e Hepacivirus (do grego heptos fgado). A famlia Flaviviridae foi estabelecida h poucos anos e abriga vrios vrus anteriormente classicados na famlia Togaviridae (avivrus e pestivrus), alm dos hepacivrus, que foram identicados posteriormente. Os avivrus (denominao dos membros do gnero Flavivirus) so transmitidos primariamente por insetos. O prottipo desse gnero (e da famlia) o vrus da febre amarela (YFV), responsvel por doena severa em humanos em regies tropicais/equatoriais. O YFV mantido na natureza por meio de infeces alternadas em mamferos silvestres e insetos e, ocasionalmente, transmitido a humanos. Os vrus do Nilo Ocidental (WNV) e das encefalites japonesa (JEV) e Saint Louis (SLEV) so tambm vrus zoonticos de importncia em sanidade animal. O vrus da dengue possui grande importncia como patgeno humano. O gnero Pestivirus inclui o vrus da peste suna clssica (CSFV), o vrus da diarria viral bovina (BVDV) e o vrus da doena da frontei-
ra (BDV), que infectam exclusivamente animais. O vrus da hepatite C (HCV) um patgeno exclusivamente de humanos, no transmitido por insetos e se constitui no nico membro do gnero Hepacivirus.
2 Caractersticas comuns aos membros da famlia Flaviviridae

Os membros da famlia Flaviviridae apresentam vrias caractersticas em comum, que serviram de base para a sua classicao nessa famlia. Essas caractersticas incluem a estrutura e morfologia dos vrions, o tipo, estrutura e organizao do genoma e os aspectos bsicos da expresso gnica e replicao viral. Essas propriedades comuns, quando analisadas em conjunto, indicam que esses vrus provavelmente derivam de um ancestral comum.
2.1 O vrion e o genoma

Todos os membros da famlia possuem vrions esfricos (40-60 nm de dimetro) que contm um nucleocapsdeo icosadrico revestido externamente por um envelope derivado das membranas da clula hospedeira (Figura 22.1). Em algumas espcies, os vrions possuem um formato esfrico, tendendo a hexagonal, pois o envelope est intimamente associado ao nucleocapsdeo. A presena do envelope torna esses
B
Protenas do capsdeo Genoma RNA Membrana lipdica Glicoprotena E Glicoprotena M
Fonte: A) PHIL Library, CDC.
Figura 22.1. Morfologia e estrutura das partculas vricas da famlia Flaviviridae. A) Foto de microscopia eletrnica de vrions do vrus do Nilo Ocidental (WNV); B) Ilustrao esquemtica de uma partcula vrica com os seus componentes.
566
Captulo 22
vrus susceptveis inativao por solventes orgnicos e detergentes. O envelope contm duas (avivrus e hepacivrus) ou trs (pestivrus) glicoprotenas virais inseridas. O genoma consiste de uma ta simples de RNA de polaridade positiva, com 9 a 12.3 kb. Esta molcula de RNA apresenta duas regies notraduzidas (UTRs) prximas s extremidades 5 e 3 e possui uma nica fase aberta de leitura (ORF) (Figura 22.2). Durante o ciclo replicativo, no ocorre a produo de RNA mensageiros subgenmicos. As protenas estruturais so codicadas no tero prximo extremidade 5; enquanto os genes das protenas no-estruturais localizamse nos dois teros prximos extremidade 3. A ORF traduzida em uma longa poliprotena, que clivada em protenas individuais medida que produzida. A estrutura e organizao genmica comparada dos vrus pertencentes aos trs gneros da famlia esto apresentados na Figura 22.2.

O esquema geral de replicao dos vrus da famlia Flaviviridae est representado na Figura 22.3. A replicao do genoma e a produo da prognie viral ocorrem inteiramente no citoplasma da clula hospedeira. A penetrao dos vrions nas clulas ocorre por endocitose, aps a interao entre protena(s) do envelope viral e receptores da membrana plasmtica. Aps a acidicao dos endossomos, ocorre a fuso do envelope com a membrana endossomal, o capsdeo dissocia-se, e o genoma liberado no citoplasma. O RNA genmico de polaridade positiva traduzido em toda a sua extenso, originando uma poliprotena que clivada em protenas individuais medida que sintetizada. A clivagem da poliprotena por proteases celulares e virais origina as protenas estruturais e no-estruturais. As protenas no-estruturais auxiliam no processo
Gnero Flavivirus 11 Kb, 5' UTR cap

5' UTR
C Pre-M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5
3' UTR
Gnero Pestivirus 12,3 Kb, 5' UTR IRES

5' UTR
N
pro
p7
3' UTR
NS2-3
NS4-A
rns
E1
E2
NS4-B
NS5A
NS5B
Gnero Hepacivirus 9,4 Kb, 5' UTR IRES

5' UTR
C E1 E2 NS2 NS3
NS4A
3' UTR
NS4B NS5A NS5B
Protenas no-estruturais Protenas estruturais Protena estrutural imunodominante
Figura 22.2. Estrutura e organizao genmica comparada de vrus dos trs gneros da famlia Flaviviridae.
Flaviviridae
567
O vrion penetra na clula e desnudo Replicao RNA RNA cadeia negativa
Genoma RNA cadeia positiva Traduo
Poliprotena Clivagem ps-traduo Protenas estruturais
Protenas no-estruturais Prognie RNA cadeia positiva
Prognie viral
Figura 22.3. Representao esquemtica do ciclo replicativo dos vrus da famlia Flaviviridae.
de clivagem desta poliprotena e atuam na replicao do genoma. A replicao do genoma envolve a sntese de uma molcula de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa). Esse RNA serve de molde para a sntese do RNAs de polaridade positiva que serviro para mais etapas de traduo e, posteriormente, sero encapsidados como genoma da prognie viral. As protenas estruturais so utilizadas na montagem e construo da prognie viral. A morfognese das novas partculas virais ocorre na regio perinuclear do citoplasma, em associao com as membranas do complexo de Golgi e do retculo endoplasmtico liso. As partculas recm-formadas aparecem em vacolos no citoplasma e a sua liberao ocorre pela fuso dessas vesculas com a membrana plasmtica. A ruptura da clula no parece ser um pr-requisito para a liberao dos vrions. As conseqncias da replicao viral para a siologia e integridade das clulas variam de acordo com o vrus e com a clula hospedeira, e vo desde infeces absolutamente inaparentes (avivrus em clulas de mosquitos; BVDV no-citoptico em clulas de mamferos) at lise e destruio celular (avivrus em clulas de vertebrados; BVDV citoptico em linhagens celulares de bovinos).
3 Caractersticas que diferenciam os membros da famlia Flaviviridae

Os gneros da Flaviviridae diferem entre si na extenso do genoma, em alguns detalhes da estrutura e organizao genmica, no nmero e funo de produtos gnicos e em alguns aspectos biolgicos. Vrias dessas caractersticas so utilizadas para a sua classicao em gneros e espcies. As principais diferenas entre os gneros esto apresentadas na Tabela 22.1. Os pestivrus codicam duas protenas que no so encontradas nos outros gneros: a protena no-estrutural Npro, que codicada pelo primeiro gene da ORF, e a glicoprotena Erns. A Npro uma proteinase cuja nica funo conhecida se autoclivar da poliprotena logo aps a sua sntese; a Erns (ou E0) uma glicoprotena associada ao envelope viral e pode tambm ser secretada das clulas infectadas. Alm disso, a Erns possui atividade ribonuclease. Enquanto a maioria dos avivrus e hepacivrus so inativados sob pH baixo, os pestivrus podem ser diferenciados por resistirem inativao por pH baixo e por apresentarem certa estabilidade em uma ampla faixa de pH.
568
Captulo 22
Tabela 22.1. Caractersticas gerais dos trs gneros da famlia Flaviviridae.
Gnero
Genoma
Extenso 5'
Multiplicao eficiente em cultivo

X X -
Hospedeiros
Humanos Animais domsticos Animais silvestres
Vetores artrpodes
X
Flavivirus Pestivirus Hepacivirus
11kb
5' cap
X X -
X X -
12.5kb IRES 9,6kb IRES
4 Classicao
De acordo com propriedades biolgicas, ecolgicas e moleculares, os membros da Flaviviridae so divididos em trs gneros: Flavivirus, Pestivirus e Hepacivirus. A seguir, so descritas as principais caractersticas dos vrus de cada gnero.
4.1 Gnero Flavivirus

So utilizados sete critrios para a classicao das espcies neste gnero, que sero descritas a seguir.
Flavivrus transmitidos por mosquitos: vrus Aroa, dengue, Kedougou, Cacipacore, encefalite japonesa (JEV), Koutango, encefalite Murray Valley (MVEV), Nilo Ocidental (WNV), Yaounde, Kokobera, Ntaya, Bagaza, Ilhus, Israel turkey, Tembuso, Zika, Banzi, Bouboui, Edhe Hill, Jugra, Saboya, Sepid, Uganda, Wesselbron e vrus da febre amarela (YFV); Flavivrus sem vetor artrpode conhecido: vrus Entebbe dos morcegos, Yokose, Modoc, Apoi, Cowbone Ridga, Sal Vieja, San Perlita, Rio Bravo, Bukalasa dos morcegos, Carey Island, Dakar Bat, Montana Myotis, Phnom Pehn Bat.
Caractersticas antignicas Homologia de seqncias de nucleotdeos ou de aminocidos

As diferentes espcies de vrus classicados no gnero Flavivirus so mais divergentes entre si quando comparadas com a divergncia existente entre os membros dos gneros Pestivirus e Hepacivirus. No entanto, as estruturas secundrias nas regies UTRs 5 e 3 do RNA genmico so conservadas entre as espcies desse gnero. De acordo com essas caractersticas, os vrus do gnero Flavivirus podem ser divididos em trs grupos genmicos. Alguns desses vrus no apresentam vetores artrpodes conhecidos: Flavivrus transmitidos por carrapatos: vrus Gadget Gully, Kyasanur Forest, Langat, Louping Ill, febre hemorrgica Omsk, Powassan, Royal Farm, Tick-borne encephalitis (TBEV), Seabird tick-borne, Kadam, Meaban, Saumarez Reef e vrus Tyuleniy; Todos os vrus do gnero Flavivirus so antigenicamente relacionados entre si. No entanto, testes de neutralizao viral tm sido utilizados para identicar sorogrupos entre os vrus altamente relacionados. Com base na similaridade antignica detectada nesses testes, a maioria dos vrus do gnero tem sido classicada em um dos oito sorogrupos: dois sem vetor conhecido (Modoc e Rio Bravo); dois transmitidos por carrapatos (TBEV e Tyuleniy) e quatro transmitidos por mosquitos (Uganda S, dengue, Ntaya e JEV). No entanto, alguns vrus, incluindo o prottipo da famlia, o YFV, no se enquadram em nenhum desses sorogrupos.
Origem geogrca
Enquanto os avivrus, como gnero, apresentam uma ampla distribuio geogrca, as es-
Flaviviridae
569
pcies virais so restritas a certas regies. O YFV encontrado apenas em regies tropicais e subtropicais da frica e da Amrica do Sul. O vrus da dengue encontrado somente em reas tropicais da sia, Oceania, frica, Austrlia, Amrica do Sul e Amrica do Norte. O JEV restrito ao sudoeste da sia, enquanto o TBEV encontrado na Europa e Norte da sia. A distribuio geogrca de uma determinada espcie de vrus est geralmente relacionada com a presena da espcie de vetor envolvida na transmisso. A origem geogrca pode ser utilizada como um dos critrios para a classicao.
Hospedeiros
O espectro de hospedeiros dos avivrus inclui uma variedade de espcies de vertebrados e de artrpodes. Os artrpodes adquirem a infeco ao ingerir o sangue de um vertebrado infectado e so responsveis pela manuteno desses vrus na natureza (Figura 22.4). Os ciclos de transmisso natural sero discutidos posteriormente, nas caractersticas ecolgicas.
Apresentao clnica
Os avivrus variam amplamente no seu potencial patognico. Mais de 50% produzem doena clnica em humanos e muitos so patognicos para diferentes espcies animais, como aves, sunos, eqinos, caninos, grouse (espcie de ave do Hemisfrio Norte) e musaranhos. Os avivrus patognicos podem ser divididos em trs categorias maiores: aqueles que produzem infeco no sistema nervoso central (SNC), acompanhada de meningoencefalite (WNV e SLEV); os associados com febre, artralgia e eritemas (dengue), e aqueles associados com febre hemorrgica (YFV).
Vetores
A maioria dos avivrus (78%) mantida, amplicada e disseminada mediante ciclos de transmisso natural que requerem artrpodes hamatfagos que transmitem o vrus para os hospedeiros vertebrados (Figura 22.4). A necessidade do vetor artrpode se d, basicamente, em razo da inecincia de transmisso direta entre os hospedeiros vertebrados. No h evidncia do desenvolvimento de doena nos hospedeiros invertebrados aps a infeco, sugerindo que a interao do vrus com o inseto bem equilibrada. Os vetores mais comumente utilizados pelos vrus do gnero Flavivirus so os mosquitos (50%), seguidos pelos carrapatos (28%).
Caractersticas ecolgicas
A maioria dos avivrus mantida na natureza por meio da replicao alternada em hospe-
Vertebrado humano ou animal domstico Mosquito ou carrapato
Vertebrado silvestre Pode no ocorrer ou insignificante para a disseminao
Figura 22.4. Ciclo de transmisso natural dos flavivrus. O vrus mantido em ciclos alternados em aves, mamferos silvestres e mosquitos e apenas ocasionalmente transmitido para o homem ou para animais domsticos.
570
Captulo 22
deiros invertebrados (artrpodes hematfagos) e em vertebrados (Figura 22.4). Como descrito anteriormente, os vetores invertebrados se infectam ao ingerir o sangue de um vertebrado infectado. O vrus replica nos tecidos do vetor e, aps alguns dias, pode ser transmitido a outro hospedeiro vertebrado pela picada do inseto que inocula o agente juntamente com a saliva. Os principais hospedeiros vertebrados, para a maioria dos avivrus, so diferentes espcies de pssaros ou de mamferos silvestres. A infeco de humanos ou de animais domsticos tipicamente incidental e no necessria para a manuteno do vrus na natureza. No entanto, esporadicamente, pode-se observar transmisso do agente entre humanos e entre animais domsticos. A exceo o vrus da dengue, que mantido em populaes humanas pela transmisso por mosquitos. Nos demais avivrus, os nveis de viremia, durante a infeco aguda em mamferos domsticos, so geralmente baixos. No entanto, estes podem representar uma fonte potencial de infeco para os humanos. Por exemplo, vacas, cabras e ovelhas podem excretar o vrus pelo leite e este ser um veculo para a infeco de humanos. A epidemiologia dos avivrus diferente entre os diferentes gneros e mesmo entre os membros de um mesmo gnero, e bastante complexa em alguns vrus. Ou seja, vrios fatores precisam estar presentes para que ocorra a infeco em um indivduo ou em um rebanho. Alguns avivrus dependem de diferentes espcies de hospedeiros vertebrados e invertebrados. Para outros, o ciclo de transmisso permanece no esclarecido. Enquanto muitos requerem artrpodes como vetores, 12% das espcies de avivrus conhecidas so agentes com potencial zoontico e so transmitidas entre roedores e morcegos e no se tem conhecimento de nenhum vetor artrpode. Os avivrus replicam in vitro em uma variedade de clulas de mamferos, de aves e de insetos. A replicao em clulas de vertebrados , geralmente, acompanhada de citopatologia severa e lise celular, embora alguns tipos celulares possam apresentar uma infeco persistente. Ao contrrio, a infeco de clulas de mosquitos geralmente no-citoptica e infeces persisten-
tes so facilmente estabelecidas. A induo de citopatologia em algumas dessas clulas uma exceo. A infeco dos vetores artrpodes geralmente crnica e os insetos permanecem infectados por toda a vida.
Flavivrus de importncia veterinria

Historicamente, os vrus Louping ill, Wesselbron (WBV) e da encefalite japonesa (JEV) so considerados os mais importantes dentro do gnero Flavivirus do ponto de vista da medicina veterinria. Mais recentemente, o WNV tem expandido a sua distribuio geogrca e tem sido associado com um nmero expressivo de casos em vertebrados. A Tabela 22.2 apresenta as principais caractersticas dos avivrus de importncia veterinria.
4.1.1 Vrus da Louping ill

O vrus da Louping ill causa uma encefalomielite que foi observada inicialmente em ovinos. Ocorre mais freqentemente no vero e no inverno e a sua denominao se d pelo andar saltitante dos animais infectados. Embora originalmente isolado na Esccia e na Inglaterra, o vrus encontra-se amplamente distribudo no continente europeu. O ciclo de transmisso envolve o carrapato Ixodes ricinus como vetor. Este vrus pode infectar vrias espcies de mamferos, incluindo humanos, e os ovinos so os hospedeiros principais. Os animais infectados se tornam virmicos e desenvolvem uma resposta febril bifsica. O segundo pico febril ocorre juntamente com o aparecimento dos sinais clnicos que incluem ataxia, hiperexcitabilidade, tremores e paralisia. As ovelhas que desenvolvem sinais nervosos dicilmente sobrevivem. Nas demais espcies, o desenvolvimento dos sinais clnicos est geralmente associado com a idade, com o status nutricional e com a ocorrncia de infeces secundrias. A conrmao do diagnstico pode ser feita pelo isolamento viral a partir do SNC, por sorologia e pela histopatologia do encfalo. O isolamento do vrus pode ser realizado em cultivo celular ou pela inoculao intracerebral em camundon-
Flaviviridae
571
Tabela 22.2. Vrus do gnero Flavivirus associados com enfermidades de importncia veterinria.
Vrus
Encefalite japonesa (JEV)
Vetores
Mosquitos
Espcie afetada
Eqinos, suinos Principalmente ovinos, mas tambm humanos, bovinos, sunos, eqinos, cervdeos e red grouse cativos Principalmente ovinos, mas tambm humanos, bovinos, caprinos, sunos, eqinos, mulas, camelos, cobaias, coelhos, ces e aves silvestres
Apresentao clnica
Encefalite, nascimento de leites fracos e inviveis
Ocorrncia
sia
Louping ill
Carrapatos
Encefalite
Esccia, Irlanda do Norte
Wesselsbron (WBV)
Mosquitos
Abortos, hepatite, hemorragias, malformaes congnitas
frica
Nilo Ocidental (WNV)
Mosquitos
Principalmente pssaros, mas tambm causa doena importante em humanos e eqinos. Encefalite, doena febril Infecta + de 30 espcies de invertebrados e + de 150 espcies de aves. Perus Eqinos Eqinos Encefalite Encefalite Encefalite
frica, Europa, Estados Unidos, Mxico, norte da Amrica Central
Israel turkey meningoencephalitis Kunjin
Mosquitos Mosquitos
Israel Austrlia Austrlia
Murray Valley (MVEV) Mosquitos
gos. O controle da enfermidade baseado na imunizao dos cordeiros, tratamento de ovelhas para evitar a infestao pelos carrapatos vetores e controle ambiental para reduzir a populao de carrapatos.
4.1.2 Vrus Wesselbron

O vrus Wesselbron (WBV) encontrado no continente africano, transmitido pelos mosquitos Aedes cavallus e Aedes ciculuteolus e apresenta um amplo espectro de hospedeiros (Tabela 22.2). A doena reprodutiva associada ao WBV praticamente s ocorre em ovinos e caracterizada por abortos e por morte neonatal. A infeco nas ovelhas geralmente subclnica. Fetos abortados podem apresentar artrogripose, hidroencefalia, porencefalia e hipoplasia cerebelar. Malformaes congnitas raramente so observadas. Infeco aguda fatal em cordeiros pode cursar com anorexia, letargia, fraqueza, depresso nos ancos e aumento da freqncia respiratria. A resposta febril geralmente bifsica, com o segundo pico febril de maior durao (3-6 dias). Os bovinos po-
dem ocasionalmente ser infectados e vacas prenhes podem apresentar aborto ou parir bezerros fracos e/ou inviveis. O diagnstico pode ser realizado pelo isolamento viral e por testes de soroneutralizao (SN). O isolamento viral realizado pela inoculao intracerebral em camundongos lactentes. Como medida de controle, uma vacina viva modicada tem sido utilizada. No entanto, esta vacina no recomendada para uso em animais prenhes e sua eccia questionada. Por essas razes, as medidas de controle so basicamente direcionadas ao controle dos mosquitos vetores.
4.1.3 Vrus da encefalite japonesa

O vrus da encefalite japonesa (JEV) utiliza mosquitos como vetores para a sua transmisso e encontra-se amplamente distribudo na sia, com recente expanso para o norte da Austrlia. O JEV antigenicamente relacionado com o SLEV e com o WNV. A encefalite japonesa uma doena de importncia primria em humanos, embora o vrus possa acometer tambm eqinos e causar
572
Captulo 22
aborto em sunos. O ciclo biolgico desse vrus envolve mosquitos do gnero Culex, pssaros e mamferos. Na epidemiologia, a espcie suna pode funcionar como a principal espcie amplicadora do vrus. A infeco em eqinos produz enfermidade com sinais clnicos moderados a fatais, depois de 8 a 10 dias aps a infeco. Os sinais neurolgicos so similares aos descritos nas demais encefalites e podem incluir: cegueira, ataxia, diculdade de deglutio, andar irregular, incoordenao, andar em crculos, estupor e coma. A infeco em sunos adultos geralmente subclnica e o seu impacto nessa espcie deve-se transmisso transplacentria, cuja patogenia muito semelhante da infeco pelos parvovrus. As conseqncias da infeco transplacentria incluem aborto, mumicao fetal, nascimento de leites com sinais neurolgicos e nascimento de animais aparentemente saudveis.
4.1.4 Vrus do Nilo Ocidental

O vrus do Nilo Ocidental (West Nile virus, WNV) foi, inicialmente, identicado em uma mulher com quadro febril em uma provncia da Uganda, frica, em 1937. A provncia era denominada West Nile (Nilo Ocidental), da a denominao da doena e do agente. Nas dcadas seguintes, o WNV foi reconhecido como um dos arbovrus mais difundidos em pssaros, mosquitos e humanos, com distribuio em algumas regies da frica, no Oriente Mdio, Europa Mediterrnea, ndia, em algumas regies da sia e Austrlia. A grande maioria das infeces humanas nessas regies, no entanto, era subclnica ou acompanhada de sinais clnicos leves. Surtos importantes em humanos ocorreram em Israel (1951-1954, 1957) e na frica do Sul (1974). Evidncias sorolgicas da infeco em eqinos datam de 1956 (Egito) e 1960 (Israel), e os primeiros relatos clnicos da doena nessa espcie foram realizados no Egito, em 1963. Desde ento, surtos de doena febril e neurolgica em eqinos tm sido ocasionalmente descritos no Oriente Mdio, norte da frica e em pases europeus mediterrneos. A partir da dcada de 1990, os relatos de doena humana muitas vezes severa au-
mentaram, a infeco e a doena foram relatadas em vrias espcies animais e em reas at ento aparentemente livres do agente. Nas ltimas dcadas, epizootias da doena causada pelo WNV em eqinos tm sido descritas em Marrocos (1996 e 2003), Itlia (1998), Israel (2000), Sul da Frana (2000, 2003, 2004), alm de evidncia sorolgica da circulao de vrus relacionados em vrios outros pases europeus, asiticos e da Oceania. O marco histrico da doena do Nilo Ocidental foi a sua introduo em Nova Iorque, em 1999, quando causou mortalidade em pssaros de vida livre e de zoolgicos e provocou doena em 67 pessoas, provocando a morte de 21. A partir da, o vrus se disseminou rapidamente por praticamente todos os estados norte-americanos, provocando infeco e doena em uma variedade de pssaros silvestres, mamferos silvestres e domsticos (especialmente eqinos) e tambm em humanos. At maio de 2007, a infeco foi relatada em 24 mil pessoas (752 mortes) e causou doena em mais de 25.000 eqinos (mortalidade aproximada de 35-40%). Esses nmeros provavelmente ultrapassam em magnitude os nmeros at ento relatados para a enfermidade, durante dcadas, nas regies de origem. Concomitantemente com a sua difuso na direo oeste nos EUA, a infeco avanou na direo norte (Canad) e est avanando na direo sul (Mxico, Amrica Central e Caribe). Nos ltimos anos, evidncias sorolgicas indicam a presena da infeco em eqinos e muares na Colmbia (2004-2005), e o vrus j foi identicado em casos de doena neurolgica em eqinos na Argentina (2006). A rpida e explosiva disseminao do WNV, nos EUA, permitiu o conhecimento (ou o surgimento) de padres epidemiolgicos at ento ignorados, como a notvel amplitude de vetores e hospedeiros vertebrados susceptveis ao vrus, alm do reconhecimento de novas formas de transmisso. At o presente, a infeco natural ou experimental pelo WNV j foi demonstrada em mais de 150 espcies de aves passeriformes ou no e em vrias espcies de mamferos domsticos e de vida livre, anfbios e rpteis, alm de humanos. Dentre as espcies de interesse veterinrio, os eqinos apresentam importncia peculiar, pois so muito susceptveis infeco natural e,
Flaviviridae
573
freqentemente, desenvolvem um quadro severo de encefalite. No entanto, a infeco tambm tem sido demonstrada em outros mamferos e aves de criao.
4.1.4.1 O agente
O WNV pertence ao complexo antignico do JEV e SLEV e apresenta reatividade sorolgica cruzada com vrios vrus desse complexo, o que diculta o seu diagnstico por mtodos imunolgicos. Os isolados do WNV podem ser divididos em duas linhagens genticas: os vrus da linhagem 1 circulam na Amrica do Norte (desde 1999), Europa, sia e Austrlia; os vrus da linhagem 2 tm sido isolados da frica subsaariana e Madagascar. Os vrus da linhagem 1 podem ser divididos em quatro cls, que possuem distribuio geogrca e virulncia distintas; os isolados norte-americanos pertencem ao cl B e so altamente virulentos para camundongos, ao contrrio da maioria dos outros vrus das duas linhagens. O WNV, introduzido nos Estados Unidos em 1999, possui uma alta homologia de nucleotdeos (99,7%) com um vrus isolado de surtos em Israel poucos anos antes, o que indica a sua provvel origem. Esse vrus apresenta virulncia para corvos americanos (Corvus brachyrynchos) e para outras espcies de pssaros (pardais, pssaros cantores), o que o distingue de outros WNV que circulam na frica e Austrlia. Isolados atenuados do WNV, provavelmente descendentes do vrus original introduzido nos EUA, tm sido identicados em aves em alguns estados norteamericanos e na Amrica Central. provvel que esta variao genotpica e fenotpica se constitua em um reexo da adaptao gradativa do WNV aos novos hospedeiros. Assim, diferenas genotpicas e fenotpicas (virulncia, preferncia por vetores, adaptao a novos hospedeiros) possivelmente sero identicadas em isolados do WNV das Amricas nos prximos anos.
Um resumo da distribuio geogrca do WNV, com base em relatos clnicos, virolgicos e
sorolgicos foi apresentada no incio desta seo. A rpida expanso da infeco nas Amricas, sobretudo na direo oeste e sul, sugere que novos casos clnicos ou evidncias sorolgicas provavelmente sero relatados nos prximos anos nas Amricas Central e do Sul. As condies ecolgicas nessas regies (clima, ora e fauna) so propcias para a introduo e manuteno do agente em ambientes silvestres, com exposio ocasional de animais domsticos e humanos, como tem ocorrido nos EUA. A exemplo de outros avivrus, o WNV transmitido primariamente por insetos hematfagos sobretudo mosquitos , que adquirem o vrus ao realizarem o repasto sangneo em aves virmicas, consideradas os reservatrios naturais do agente. Os insetos so capazes de transmitir o agente aps um perodo de incubao intrnseco, no qual o vrus replica em seus tecidos. Os principais vetores de transmisso do WNV so as vrias espcies de mosquitos do gnero Culex sp., embora outros mosquitos possam tambm ter alguma participao na transmisso. Dentre as dezenas de espcies de Culex, existem diferenas na ecincia de transmisso do agente. Nos Estados Unidos, j foram identicadas aproximadamente 60 espcies de Culex capazes de transmitir o WNV, porm menos de 10 so consideradas importantes na transmisso do vrus. Espcies de Culex exclusivamente ornitoflicas transmitem o vrus apenas entre aves. No entanto, algumas espcies realizam repasto tanto em aves como em mamferos, podendo transmitir o vrus de aves virmicas para mamferos e humanos. J foi demonstrada a transmisso transovariana do vrus nos insetos, assim como a sua presena em fmeas hibernando. Isto pode explicar a permanncia do agente aps o inverno em regies temperadas ou frias. Os hospedeiros naturais do WNV na natureza so aves silvestres de diferentes espcies. A infeco natural j foi demonstrada em mais de 150 espcies de aves silvestres e domsticas em todo o mundo. As aves apresentam uma grande variabilidade de susceptibilidade infeco e doena pelo WNV e tambm apresentam potencial distinto de transmisso. Assim, os corvdeos, passeriformes (pssaros cantores, rabos-de-palha,
574
Captulo 22
pardais), chadriiformes (aves de banhados), corujas e falconiformes desenvolvem nveis de viremia sucientes para infectar uma grande parcela dos mosquitos que realizam o repasto sangneo. Pombos, pica-paus, gansos, marrecos e patos no desenvolvem altos ttulos de vrus no sangue e, assim, no infectam uma parcela signicativa dos mosquitos. Corvdeos, gralhas e pardais so altamente infecciosos para mosquitos e tambm apresentam mortalidade de aproximadamente 40% quando infectados. Os chadriiformes (aves pernaltas de regies alagadias) e anseriformes (ganso domstico) so altamente susceptveis infeco e enfermidade. Os psitacdeos e galinceos so menos susceptveis. O papel de aves migratrias na disseminao do WNV ainda desconhecido, mas a rpida difuso do vrus nas Amricas aponta para uma provvel participao dessas aves. Os nveis de viremia desenvolvidos por eqinos e humanos alm de outros mamferos no so sucientes para infectar ecientemente os mosquitos e proporcionar a transmisso. Assim, estas espcies no participam da transmisso do agente atravs de vetores. Outras formas de transmisso, pouco freqentes e de importncia epidemiolgica questionvel, j foram descritas. Algumas espcies de rs e rpteis (crocodilos jovens), alm de hamsters, podem desenvolver nveis de viremia compatveis com a transmisso atravs de mosquitos, mas o seu papel na transmisso natural do vrus desconhecido. O carter epidmico e o grande nmero de pessoas infectadas nos EUA permitiram o reconhecimento de novas formas de transmisso at ento ignoradas. Assim, foi demonstrado que o WNV pode ser transmitido de mes virmicas para os fetos atravs da placenta e tambm para os recm-nascidos, pelo colostro e leite. O vrus pode ser transmitido por transfuso sangnea e tambm por transplantes de rgos. Essas formas provavelmente no possuem importncia epidemiolgica em reas endmicas, mas devem ser consideradas em situaes de epidemias. H tambm relatos de infeco de tcnicos de laboratrio que, acidentalmente, se inocularam o agente durante a manipulao laboratorial. Em animais, a transmisso do WNV sem o envolvimento de mosquitos foi demonstra-
da em aves que ingeriram carcaas de pssaros infectados; em crocodilos inadvertidamente alimentados com carcaas de eqinos infectados; e entre perus criados em condies intensivas, provavelmente atravs de aerossis. A transmisso por contato direto ou indireto com secrees e excrees de aves virmicas foi demonstrada experimentalmente (entre aves e entre crocodilos) e pode ocorrer sob determinadas condies na natureza. Apesar dessas outras formas j terem sido demonstradas, a transmisso por mosquitos a mais importante e a principal responsvel pela circulao do vrus na natureza.

Vrias espcies de aves e mamferos so susceptveis infeco natural pelo WNV, e a susceptibilidade de outras diversas espcies foi demonstrada experimentalmente. Dentre as espcies infectadas naturalmente que desenvolveram a doena, podem ser citados crocodilos, alpacas, ces, ovinos cervdeos e lobos. Sorologia positiva em nveis variveis tem sido detectada em ursos, candeos silvestres, coelhos silvestres, lmures, camelos e primatas no-humanos cativos, entre outros. De particular interesse foi um surto ocorrido em uma criao comercial de, aproximadamente, 10.000 crocodilos, dos quais 1.250 morreram aps um curso clnico com sinais neurolgicos. A infeco foi provavelmente introduzida na criao em carcaas de eqinos utilizadas para alimentar os crocodilos. Em ovinos, alpacas, ces e lobos, a enfermidade neurolgica tambm foi esporadicamente relatada. Vrias outras espcies foram infectadas experimentalmente com sucesso, o que estende consideravelmente o espectro de possveis hospedeiros do WNV. Esta seo se concentrar na descrio da enfermidade em eqinos, aves e humanos, nos quais a infeco possui maior repercusso sanitria e epidemiolgica. a) Eqinos: os eqinos so particularmente susceptveis infeco pelo WNV e freqentemente desenvolvem uma enfermidade aguda com comprometimento neurolgico. Apesar de
Flaviviridae
575
sua alta susceptibilidade, os eqinos no produzem nveis de viremia sucientes para infectar insetos e, assim, servir de amplicadores do vrus. Ou seja, os eqinos infectados no disseminam o vrus atravs de insetos hematfagos. Evidncias sorolgicas indicam que a maioria das infeces em eqinos assintomtica ou leve, passando despercebida por criadores e tratadores. Acredita-se que apenas 15-20% das infeces resulte em manifestaes clnicas, aps um perodo de incubao de 3 a 14 dias. Aps a replicao inicial nas proximidades do stio de inoculao, o vrus alcana os linfonodos regionais e, subseqentemente, o sangue, atravs do qual invade o SNC aps atravessar a barreira hematoenceflica. No SNC, o vrus infecta e destri neurnios e tambm outras clulas, o que contribui para a sintomatologia neurolgica. A maioria das infeces no-fatais seguida da erradicao do vrus do organismo pelo sistema imunolgico. Os sinais clnicos variam entre os surtos e entre os animais afetados. Os sinais mais comumente relatados so: anorexia, fraqueza, depresso, incoordenao, ataxia e decbito. Hipertermia nem sempre est presente. Bruxismo, andar em crculos, hiperexcitabilidade, pressionamento da cabea contra anteparos e convulses tambm tm sido relatados. As taxas de letalidade em eqinos variam entre 25 e 45%. No surto ocorrido nos EUA, em torno de 1/3 dos animais morreu ou foi sacricado devido sua extrema condio. Animais que sobrevivem 2-3 semanas aps o aparecimento dos sinais geralmente se recuperam; b) Aves: a infeco pelo WNV j foi detectada em mais de 150 espcies de aves domsticas e silvestres. A susceptibilidade das aves infeco varia amplamente de acordo com a espcie. Dentre as espcies domsticas, os gansos so os mais susceptveis e, freqentemente, desenvolvem doena neurolgica quando infectados. Taxas de mortalidade de 25 a 40% tm sido relatadas em infeces naturais, e de at 75% em infeces experimentais. Por outro lado, galinceos e psitacdeos esto entre as espcies menos susceptveis infeco. Dentre as espcies silvestres, os passeriformes (pssaros de vrias espcies, entre os quais os pardais, rabos-de-palha, pssaros cantores), corvdeos e charadriiformes
(aves pernaltas de banhados) so as mais susceptveis. Essas espcies desenvolvem altos nveis de viremia e excretam grandes quantidades de vrus. Nas aves que desenvolvem a doena, os sinais caractersticos incluem depresso, letargia, penas arrepiadas, alm de sinais neurolgicos como: ataxia, paralisia, movimentos de pedalagem, torcicolo, opisttono e incoordenao. A morte geralmente sobrevm em menos de 24 horas. As taxas de mortalidade so geralmente elevadas. Em pardais e corvdeos, mais de 50% dos animais que manifestam sinais clnicos vo a bito. Alm da espcie, fatores como a idade das aves e a cepa viral inuenciam nas conseqncias clnico-patolgicas da infeco. Acredita-se que a infeco seja subclnica ou leve em grande parte das espcies de aves infectadas naturalmente; c) Humanos: a exemplo dos eqinos, aproximadamente 80% das infeces humanas pelo WNV so subclnicas. Dentre os pacientes que desenvolvem a doena, a grande maioria apresenta uma doena aguda autolimitante, caracterizada por hipertermia, cefalia, fadiga, dores musculares e fraqueza. Algumas pessoas apresentam sinais gastrintestinais, pequenas manchas avermelhadas na pele e eritemas. Rigidez e dor no pescoo, diculdade de concentrao tambm tm sido relatados e podem perdurar por semanas e at meses. A doena neuroinvasiva (meningite, encefalite) ocorre em menos de 1% das pessoas infectadas, e mais comum em idosos e em pessoas imunocomprometidas. A severidade da doena neurolgica varia desde desorientao leve at coma e morte. No surto ocorrido nos EUA, 9% das pessoas que apresentaram doena neuroinvasiva foram a bito. Aproximadamente 10% dos pacientes que apresentam doena neurolgica desenvolvem paralisia cida, semelhante da poliomielite.
4.1.4.4 Diagnstico
Para o diagnstico, amostras do encfalo devem ser utilizadas na tentativa de isolamento viral. Em aves, podem-se utilizar amostras de rim, corao, crebro e intestino. O isolamento viral pode ser realizado em clulas Vero ou em clulas de rim de coelho (RK-13). Aps a produo
576
Captulo 22
de efeito citoptico (ECP), a identidade do agente pode ser conrmada por IFA ou IPX, ou, ainda, por neutralizao com anti-soro especco. Para a deteco de cidos nuclicos virais em tecidos, pode-se utilizar a tcnica de RT-PCR; e o teste de imunoistoqumica para deteco de antgenos. Anticorpos podem ser detectados no soro de eqinos atravs do teste ELISA, de HI e testes de reduo de placa (PRA). Os mtodos de HI e PRA so os mais utilizados para deteco de anticorpos no soro de aves. Em alguns testes sorolgicos, pode ocorrer reao cruzada com avivrus relacionados, como SLEV e JEV. Em eqinos, o diagnstico diferencial deve considerar outras enfermidades que cursam com depresso e sinais neurolgicos, como as encefalites do leste, oeste e venezuelana, raiva e tripanosomase.

A vacinao sistemtica o meio mais efetivo de proteger eqinos da infeco e doena em reas endmicas. Nos EUA, j existem algumas vacinas licenciadas para uso em eqinos, porm ainda no existem vacinas comerciais para humanos ou aves. O aumento da importncia da enfermidade, a partir de sua introduo e disseminao na Amrica do Norte, resultou na intensicao na pesquisa e desenvolvimento de vacinas para proteger animais domsticos especialmente eqinos e gansos e tambm humanos. Alm de proteger espcies economicamente importantes da doena, a vacinao deve reduzir os nveis de viremia e, assim, reduzir tambm as oportunidades de transmisso por vetores. At 2007, vacinas convencionais inativadas, atenuadas e recombinantes haviam sido desenvolvidas e testadas em eqinos. Dessas, quatro j foram disponibilizadas comercialmente nos EUA. Em geral, as vacinas testadas conferem boa proteo contra doena clnica e tambm reduzem os nveis de viremia. A vacina mais promissora, no entanto, j disponvel no comrcio dos EUA e em outros pases, uma vacina recombinante, na qual os genes que codicam as protenas de envelope do WNV foram introduzidas no genoma do poxvrus do canrio, que , ento, utilizado para
imunizar os animais. Em estudos experimentais, essa vacina foi capaz de proteger de viremia 100% dos eqinos desaados 30 dias aps a vacinao e 90% daqueles desaados um ano aps a imunizao, sendo que nenhum animal desenvolveu sinais clnicos. Vacinas de DNA e tambm vacinas vivas recombinantes, utilizando a cepa vacinal 17D do vrus da febre amarela (YFV) como vetor, tm sido desenvolvidas e testadas em animais de laboratrio. Vacinas para uso humano e em aves domsticas de importncia econmica tambm esto em desenvolvimento e podem ser licenciadas nos prximos anos. Alm da vacinao, medidas de combate aos vetores e que visem minimizar a exposio de pessoas e animais aos insetos tm sido recomendadas em reas endmicas. Alm dessas medidas, o uso de inseticidas, larvicidas, repelentes (para uso em eqinos) e dispositivos para reduzir o acesso dos vetores, e de telas de proteo para evitar o acesso de aves a instalaes animais tem sido preconizado. Locais propcios para a reproduo de mosquitos (depsitos de gua) devem ser investigados e combatidos. Lmpadas que no atraem insetos devem ser preferencialmente utilizadas em estbulos, alm do uso de telas nas aberturas. Deve-se tambm evitar o contato de quaisquer tipos de aves sejam domsticas ou silvestres com os eqinos. Essas medidas reduzem a probabilidade de contato dos animais domsticos com os vetores, mas no eliminam totalmente o risco de transmisso. Em reas livres que apresentem o risco de introduo do agente, o monitoramento sorolgico de aves silvestres e tambm de eqinos pode ser til para detectar, de forma precoce, a eventual introduo da infeco e, assim, desencadear a tomada de medidas pertinentes. Para isso, um sistema gil de coleta de amostras e de testes laboratoriais se faz necessrio.
4.2 Gnero Pestivirus

As espcies reconhecidas e em fase de reconhecimento que pertencem ao gnero Pestivirus esto descritas no Tabela 22.3. O vrus da peste suna clssica (CSFV) e o vrus da diarria viral bovina (BVDV) so importantes patgenos de su-
Flaviviridae
577
nos e bovinos, respectivamente, e esto presentes em todos os continentes. O vrus da doena da fronteira de ovinos (BDV) possui importncia limitada. Outros pestivrus recentemente identicados aguardam classicao denitiva (Tabela 22.3).
Tabela 22.3. Espcies de vrus classificadas no gnero Pestivirus.
Espcie
Vrus da peste suna clssica Vrus da diarria viral bovina tipo 1
Abreviatura
CSFV BVDV- 1 BVDV- 2 BDV
Hospedeiro
Sunos, ovinos? Ruminantes domsticos e silvestres, sunos Ruminantes domsticos e silvestres, sunos Ovinos, caprinos, cervdeos, sunos?
Vrus da diarria viral bovina tipo 2 Vrus da doena da fronteira dos ovinos
Espcies virais provisrias Vrus Giraffe Vrus HoBi Vrus Pronghorn Girafas Bovinos? Antlope Pronghorn
Apenas trs dos critrios utilizados para diferenciar espcies do gnero Flavivirus so utilizados para diferenciar os pestivrus: hospedeiro de origem, reatividade sorolgica e homologia de nucleotdeos do genoma. Os critrios ecolgicos, espcie e distribuio geogrca dos vetores no so utilizados, pois esses vrus no so transmitidos por insetos. O critrio da apresentao clnica no utilizado, pois variaes das cepas dentro das espcies podem afetar a apresentao clnica (p. ex.: existem cepas de alta e baixa virulncia do CSFV). Alm disso, a infeco por diferentes espcies de pestivrus pode determinar quadros clnicos semelhantes (p. ex.: malformaes congnitas em ovinos podem ocorrer tanto pela infeco transplacentria pelo BDV como pelo BVDV). Assim, a classicao das espcies dos pestivrus utiliza trs critrios: a) hospedeiro de origem: o critrio mais problemtico a ser estabelecido e pode no se constituir em um indicador denitivo para a diferenciao. Os pestivrus foram originalmente classicados como BVDV, CSFV e BDV, baseados na espcie hospedeira da qual foram isola-
dos. Este critrio de classicao complicado, pois alguns pestivrus no so restritos a um nico hospedeiro. O BVDV, por exemplo, capaz de infectar bovinos, ovinos e tambm sunos; b) caractersticas antignicas e reatividade sorolgica cruzada: todos os pestivrus so antigenicamente relacionados. No entanto, os ttulos de anticorpos neutralizantes no soro de animais previamente expostos so geralmente mdios a altos frente espcie homloga e baixos (ou mesmo no reativos) frente s demais espcies; ou seja, a reatividade sorolgica cruzada entre as espcies de pestivrus baixa e pode ser bastante varivel tambm entre diferentes isolados de uma mesma espcie viral. Anticorpos monoclonais (AcMs) podem ser utilizados para diferenciar as espcies de pestivrus; c) homologia entre as seqncias de nucleotdeos: a comparao entre as seqncias de nucleotdeos o critrio mais seguro para diferenciar as espcies de pestivrus. A regio 5UTR a mais comumente utilizada para a deteco e caracterizao de variaes no genoma, uma vez que apresenta segmentos altamente conservados, o que facilita a amplicao por PCR. No entanto, como a regio da Npro nica dos pestivrus, ela se constitui na regio de eleio para a comparao e caracterizao inicial de isolados. A anlise logentica das seqncias que codicam a Npro revelou sete grupos genticos principais dentro do gnero Pestivirus (Figura 22.5). Quatro desses ramos correspondem s quatro espcies conhecidas: BVDV-1, BVDV-2, BDV e CSFV. Os trs ramos restantes correspondem a um pestivrus isolado de girafa, de um isolado de antlope e um ramo composto por trs vrus, sendo um isolado brasileiro de soro fetal bovino, um isolado contaminante de cultivo celular e outro isolado brasileiro de bfalo. Alm do gentipo, as cepas de pestivrus podem ser agregadas em subgentipos. Dois subgentipos dentro do BVDV-1 (BVDV-1a e BVDV1b) e do BVDV-2 (BVDV-2a e BVDV-2b) tm sido descritos nas Amricas do Norte e do Sul. Uma diversidade maior observada entre as cepas europias nos sete diferentes subgentipos reportados. A importncia prtica da existncia desses subgentipos ainda precisa ser esclarecida.
578
Captulo 22
Ramo do BDV
Cepas tpicas de BDV Ovelha Chamois Reindeer
Ramo do CSFV
Isolado de ovino Cepas de CSFV tpicas
Girafa
HoBi
Ramo do BVDV-2 Ramo do BVDV-1

Antlope Pronghorn
Figura 22.5. Agrupamento filogentico de isolados de pestivrus com base na homologia de nucleotdeos do gene da pro protena N .
A infeco pelos pestivrus, em geral, pode resultar tanto em infeces agudas como em infeces persistentes. A infeco persistente resultante da habilidade desses vrus em atravessar a placenta e estabelecer infeco e imunotolerncia no feto. A infeco transplacentria, seguida do nascimento de animais persistentemente infectados (PI), pode ocorrer nas infeces por qualquer dos pestivrus. No entanto, os animais PI do BVDV parecem desempenhar um papel mais importante na epidemiologia da infeco e so considerados os mantenedores desse vrus na natureza.
Biotipos dos pestivrus

Embora no sejam utilizados para diferenciar as espcies, dois biotipos existem entre os
pestivrus: os vrus citopticos (cp) e os no-citopticos (ncp). Os vrus ncp constituem-se na maioria dos isolados de campo e so capazes de produzir infeces persistentes em fetos. Os vrus cp se originam dos ncp por mutaes e rearranjamentos genticos. Embora as diferenas nos bitipos tenham sido inicialmente observadas em laboratrio, posteriormente tambm foi demonstrada a sua importncia prtica. Cepas de BVDV ncp podem estabelecer infeces persistentes em fetos infectados entre os dias 40 e 120 de gestao. Esses animais nascem PI e, se forem superinfectados com uma amostra de BVDV cp antigenicamente semelhante, podem desenvolver a doena das mucosas (DM), que uma forma altamente fatal da infeco.
Flaviviridae
579
4.2.1 Vrus da peste suna clssica

O vrus da peste suna clssica (CSFV) um patgeno importante de sudeos e causa doena severa tanto em sunos domsticos como silvestres. Com exceo de alguns pases de onde foi erradicada, a enfermidade possui ampla distribuio e, aproximadamente, 70 pases reportaram a ocorrncia de surtos entre 1994 e 2005. A CSF uma doena altamente contagiosa e de difcil combate em reas de alta concentrao de criaes comerciais ou com populao numerosa de sudeos silvestres. Por isso considerada uma doena estratgica do ponto de vista sanitrio pela Organizao Internacional de Epizootias (OIE). Os pestivrus so antigenicamente relacionados e um soro policlonal reage contra todos os membros do gnero, mas no com membros de outros gneros da Flaviviridae. No entanto, o uso de MAbs especcos para a E2 e Erns permitiu a identicao de at 21 subtipos antignicos do CSFV at o presente. Isolados antigenicamente distintos so encontrados em regies diferentes em pocas diversas. Por outro lado, o vrus apresenta uma taxa de mutao relativamente baixa e os isolados obtidos de surtos subseqentes em uma mesma regio so muito semelhantes entre si. Por isso, a anlise logentica de isolados de campo tem sido muito utilizada como suporte em estudos epidemiolgicos e na identicao da origem de isolados envolvidos em novos surtos. A anlise logentica de CSFV isolados de diferentes continentes permitiu a identicao de trs grupos genticos e de vrios subgrupos dentro de cada grupo. Os isolados do grupo 3 ocorrem apenas na sia; todos os vrus isolados na dcada de 1990 em pases europeus pertencem ao grupo 2 e so diferentes das cepas de referncia. Os isolados do grupo 1 parecem circular predominantemente na Rssia, embora j tenham sido identicados tambm em Cuba.
Afora os pases que j erradicaram o CSFV e aqueles que esto em vias de erradicao, o vrus
possui distribuio mundial. A CSF endmica em grande parte da sia. Na frica, os dados so escassos, mas a doena j foi relatada em Madagascar. O vrus foi erradicado dos EUA, Canad, Nova Zelndia e Austrlia. Os pases escandinavos j o erradicaram de suas criaes comerciais, mas a existncia de uma numerosa populao de sudeos silvestres tem dicultado a erradicao denitiva daquele continente. Nesses pases, a vacinao foi banida a partir da dcada de 1990, mas o vrus tem sido esporadicamente reintroduzido a partir de outros pases ou da populao de sudeos silvestres. Pases da Europa Central e Oriental tm seguido a orientao de controle sem vacinao, mas a infeco tem sido ocasionalmente detectada, principalmente nos pases menos desenvolvidos. A infeco pelo CSFV tem permanecido endmica em vrios pases da Amrica Central e do Sul, embora a vacinao sistemtica tenha reduzido drasticamente a sua ocorrncia nas ltimas dcadas. Surtos tm ocorrido nos ltimos anos em pases do Caribe (Cuba e Repblica Dominicana). O Mxico segue com relativo sucesso com um programa de erradicao, apesar de alguns tropeos peridicos. No Brasil, a infeco era endmica em vrias regies at a dcada de 1980. Programas ociais de controle/erradicao que envolveram o uso macio da vacina viva modicada (cepa chinesa), obtiveram sucesso e reduziram drasticamente a ocorrncia da doena. Atualmente, a infeco est em vias de erradicao, e o pas pode ser dividido em duas reas epidemiologicamente distintas: a) uma rea livre da doena e que concentra mais de 80% do rebanho nacional e as principais granjas e indstrias suincolas (regies Sul, Sudeste, Centro-Oeste e parte da regio Nordeste); e b) uma regio onde ainda ocorrem focos isolados da doena, porm com baixa densidade suna e sem expresso comercial/industrial (parte da regio Nordeste e regio Norte). Entre 2002 e 2005, foram registrados aproximadamente seis focos nessas reas. Em fevereiro de 2006, foi noticado um foco da enfermidade em uma criao no-comercial da Paraba. Focos recentes de peste suna clssica foram relatados na frica do Sul (2005), Alemanha (2006), Brasil (2006), Bolvia (2006), Guatemala
580
Captulo 22
(2006), Crocia (2006), Equador (2007), Nicargua (2007) e Rssia (2007). Em todos esses casos, a infeco cou restrita a uma ou poucas propriedades e foi aparentemente controlada por aes imediatas de combate. O conhecimento da real situao da enfermidade em muitos pases dicultado pela falta de programas ociais efetivos de vigilncia, pela existncia de presses poltico-econmicas, que evitam a divulgao de dados, e pelo possvel efeito da vacinao em mascarar a circulao do agente e a ocorrncia da doena. Por essas razes, acredita-se que a incidncia real da doena supere, em muito, os relatos ociais. A infeco pelo CSFV ocorre principalmente por via oronasal, embora os animais possam tambm se infectar atravs de outras superfcies mucosas, da conjuntiva ou de abrases da pele. Embora a aerossolizao seja mnima a partir das excrees e secrees dos animais infectados, o vrus pode sobreviver em fmites e em ambientes contaminados por at duas semanas. Alm da transmisso direta e indireta entre animais, produtos sunos frescos, congelados ou curtidos podem manter o vrus vivel e servir de veculos para a infeco pela via oral. Nesse sentido, a importao de produtos sunos contaminados tem sido responsabilizada pela introduo do agente em reas livres. A transmisso indireta atravs de pessoas, de animais silvestres e de fmites pode ocorrer, embora o modo exato como o vrus se dissemina entre criaes ainda no seja conhecido.

A severidade e caractersticas da doena dependem da cepa e dose do vrus, da idade do animal e do status reprodutivo. O perodo de incubao varivel, mas geralmente varia entre 2 e 14 dias. As tonsilas se constituem nos rgos de predileo aps a exposio pela via oronasal. A partir das tonsilas, o vrus drenado para os linfonodos regionais e da para outros tecidos linfides, como a medula ssea e acmulos linfides do trato digestivo (placas de Peyer). A replicao do CSFV nos tecidos linfides permite que o vrus atinja a circulao sangnea e altos ttulos vi-
rais podem ser detectados no sangue perifrico. Apenas tardiamente aps a infeco que o vrus invade o fgado, o pncreas e os rins. O intervalo de tempo entre a infeco das tonsilas e o aparecimento do vrus em rgos parenquimatosos depende da virulncia da cepa viral. Cepas altamente virulentas podem ser detectadas nesses rgos j aos seis dias aps a infeco. Tanto em infeces subclnicas como em infeces clnicas, hemorragias mltiplas podem ser observadas. Essas hemorragias so mais freqentemente detectadas nos linfonodos e nos rins, mas tambm podem ser observadas na bexiga, na pele, no corao, na laringe e na mucosa intestinal. A freqncia e a extenso das hemorragias esto associadas com a virulncia da cepa viral e com a destruio de clulas endoteliais dos capilares sangneos, com a trombocitopenia e com sntese anormal de brinognio. Em rebanhos de cria infectados com cepas de baixa virulncia, ndices reprodutivos baixos podem ser o nico sinal. Inversamente, a infeco com cepas altamente virulentas pode determinar taxas de mortalidade prximas a 100%. Os sinais clnicos iniciais resultantes da infeco por cepas de alta virulncia incluem febre alta, fraqueza, anorexia e constipao seguida por diarria. Um dos primeiros sinais da infeco clnica conjuntivite com descarga ocular difusa. Vrios dias depois, aparecem manchas avermelhadas no abdome e as orelhas podem apresentar colorao prpura. A recuperao dos animais infectados com cepas de alta virulncia difcil, e estes geralmente morrem uma a duas semanas aps a infeco. Convulses podem ser observadas na fase nal da doena. Embora os sinais clnicos geralmente apaream dentro de 2 a 14 dias, em alguns casos, os animais s apresentam sintomatologia aps um perodo prolongado (superior a 30 dias). Cepas de baixa virulncia podem determinar infeces subclnicas ou leves. Os sinais clnicos, quando presentes, podem incluir perda de apetite, sonolncia, fraqueza, diarria e febre. Leucopenia observada na grande maioria dos casos. A resposta imune desenvolvida em resposta infeco nem sempre efetiva para erradicar o vrus do organismo. Como conseqncia, os animais
Flaviviridae
581
podem car cronicamente infectados. Os sinais clnicos da infeco crnica incluem retardo do crescimento, perda de plos, febre, diarria e perda de peso. Os sinais so intermitentes e podem persistir, com aumentos e redues peridicos da severidade, por semanas ou meses. Animais cronicamente infectados so imunodeprimidos e, conseqentemente, so mais susceptveis a infeces por outros patgenos. Esses animais geralmente morrem em resultado da infeco pelo CSFV ou por causa de infeces secundrias. Embora a infeco crnica seja relativamente rara, muito importante na disseminao da infeco, pois os animais infectados excretam o vrus de forma contnua. A infeco de fmeas prenhes freqentemente resulta em infeco fetal e pode levar a perdas reprodutivas. As conseqncias e a severidade da infeco fetal dependem da virulncia da cepa viral e da fase de gestao em que ocorre. A infeco fetal pode resultar em abortos, natimortos, nascimento de leites fracos e inviveis, tremor ou malformaes congnitas. Fetos infectados intra-uterinamente tambm podem nascer saudveis, livres do vrus ou persistentemente infectados (PI). Os animais PI apresentam viremia persistente e geralmente morrem em alguns meses.
imunouorescncia (IFA) e ELISA. O isolamento viral geralmente realizado em clulas primrias ou de linhagem suna, incluindo as clulas PK-15. Como a maioria dos isolados no induz citopatologia, a identicao deve ser realizada pela deteco de antgenos (IFA ou imunoperoxidase, IPX), com o uso de anticorpos policlonais ou monoclonais. A diferenciao do BVDV-1, do BVDV-2 e do BVD pode ser realizada atravs de testes sorolgicos, pela utilizao de anticorpos monoclonais ou por RT-PCR diferencial. Nos ltimos anos, as tcnicas de ELISA e RT-PCR tm conquistado espao no diagnstico do CSFV. O ELISA um teste rpido e simples, pode ser utilizado para triagem de animais febris ou doentes e aplicvel para se testar um nmero grande de amostras. A tcnica de RT-PCR mais complexa, mas pode ser til por sua sensibilidade e rapidez, podendo ser empregada para o diagnstico pr-clnico em estgios iniciais de surtos. Recentemente, o PCR em tempo real revelou a sua utilidade potencial no diagnstico inicial de surtos pelo CSFV.
4.2.1.4 Prolaxia e controle

A enfermidade altamente transmissvel e de difcil controle em regies de alta concentrao de criaes sunas e tambm em reas que possuem populaes de sudeos silvestres. A alimentao de sunos com restos de alimentos permanece sendo um importante fator para a introduo da infeco em reas livres, pois o agente pode permanecer vivel por vrios dias em uma variedade de subprodutos sunos. Portanto, a proibio do uso de subprodutos sunos para alimentao animal imperativa no combate enfermidade nessas regies. A restrio movimentao de animais em reas de risco, medidas gerais de biossegurana nos rebanhos e reduo da concentrao de rebanhos em reas crticas so altamente recomendveis e tm surtido bons resultados. A vacinao contra o CSFV possui uma longa histria e remonta aos anos 1960, quando vacinas atenuadas altamente efetivas foram desenvolvidas e utilizadas. O uso sistemtico, contnuo e macio dessas vacinas em nvel regional
4.2.1.3 Diagnstico
A maioria das amostras do CSFV circulantes possui baixa virulncia, o que diculta o diagnstico clnico, principalmente em animais adultos. Da mesma forma, a infeco pode apresentar um perodo de incubao de vrias semanas no caso de rebanhos o que requer vrios ciclos de amplicao at se tornar clinicamente aparente. Isso geralmente retarda o diagnstico e a adoo de medidas de combate, e pode comprometer o sucesso dessas medidas. Por isso, um diagnstico pr-clnico seria de enorme benefcio para o combate a essa enfermidade. Pelo fato da CSF no apresentar sinais patognomnicos, o diagnstico da enfermidade deve ser conrmado pelo isolamento viral ou pela deteco de antgenos virais no sangue ou nos tecidos. Os testes de eleio para esta nalidade so a
582
Captulo 22
e/ou nacional demonstrou ecincia em reduzir drasticamente a ocorrncia da doena e a circulao do vrus ao longo dos anos. Vrios pases realizaram tais procedimentos e conseguiram reduzir signicativamente a ocorrncia e o impacto econmico-sanitrio da infeco nas ltimas dcadas. A vacinao proltica macia ainda utilizada em vrios pases e pode representar uma etapa de transio rumo ao controle sem vacinao (acompanhado de identicao e remoo de infectados), como adotado por diversos pases, incluindo o Brasil. O controle sem vacinao, no entanto, s deve ser adotado quando a incidncia atingir nveis baixos e a infeco se tornar espordica. Em pases que erradicaram o CSFV, a vacinao macia foi banida. Nesses pases, somente permite-se a vacinao de emergncia no caso de surtos, embora vrios pases europeus que experimentaram tais eventos no tenham recorrido a essa medida. Vacinas com marcadores antignicos seriam de valor inestimvel nesses casos. Em casos de surtos, os casos conrmados e os animais em contato devem ser sacricados ou colocados em quarentena. A interdio da propriedade e de reas vizinhas ao trnsito de animais, subprodutos e possveis veculos de transmisso tm sido adotados nessas situaes. A vacinao perifocal ou regional de emergncia pode ser considerada, desde que permitida pela legislao sanitria do pas. Vrias vacinas tm sido utilizadas ao longo dos anos no combate ao CSFV em reas endmicas e espordicas. Em pases subdesenvolvidos e em desenvolvimento, a vacina atenuada (cepa chinesa) possuiu papel fundamental no controle e eventual erradicao da infeco. Nos ltimos anos, novas tecnologias tm sido desenvolvidas para a produo de vacinas mais efetivas e adequadas aos programas de controle e erradicao. Essas vacinas incluem vetores virais, expressando protenas do envelope do CSFV (poxvrus, herpesvrus, adenovrus), protenas recombinantes, vacinas de subunidade (E2, Erns), peptdeos sintticos, vacinas de DNA, entre outras. A diferenciao entre animais vacinados e infectados com o vrus de campo, assim como a possibilidade de vacinao oral de sudeos silvestres, constituemse em metas importantes no combate infeco.
4.2.2 Vrus da diarria viral bovina

A doena associada com o BVDV foi inicialmente descrita por pesquisadores da Universidade de Cornell, em 1946, e se caracterizava como uma enfermidade aguda transmissvel marcada por leucopenia severa, febre alta, depresso, diarria, eroses no trato gastrintestinal e hemorragias. Cinco rebanhos foram afetados e apresentaram taxas de morbidade entre 33 e 88% e de mortalidade entre 4 e 8%. Posteriormente, outra forma da doena causada pelo BVDV foi identicada e denominada de doena das mucosas (DM). Esta forma apresentava algumas caractersticas clnico-patolgicas da doena anteriormente descrita, mas se diferenciava por no ser transmitida experimentalmente e por apresentar baixa morbidade e alta mortalidade. A etiologia da DM permaneceu obscura at o reconhecimento de que apenas animais persistentemente infectados (PI) desenvolviam essa forma da doena. Ao longo de seis dcadas, uma grande variedade de manifestaes clnicas foi associada com a infeco por este agente. Essas manifestaes podem ser agrupadas em quatro formas principais: doena aguda leve (gastrentrica, respiratria), doena aguda severa (gastrentrica, respiratria, hemorrgica), doena das mucosas (DM), BVD crnica (recentemente reconhecida como uma forma da DM). No obstante essa variedade de apresentaes clnicas, as maiores conseqncias da infeco pelo BVDV parecem estar relacionadas com as perdas reprodutivas que determina. Os isolados de campo do BVDV apresentam uma grande variabilidade antignica, devido presena de regies hipervariveis na glicoprotena E2. De acordo com as caractersticas genticas e antignicas, os isolados podem ser divididos em dois grupos: BVDV-1 e BVDV-2. Os vrus pertencentes ao gentipo 1 abrangem a maioria das cepas de referncia e os vrus utilizados em vacinas, alm de muitos isolados com virulncia baixa a moderada. Os vrus pertencentes ao gentipo 2 foram inicialmente isolados de surtos de BVDV aguda e doena hemorrgica no Canad em 1993-1994, mas incluem tambm isolados de virulncia baixa e moderada. Os isolados do BVDV-1 e BVDV-2 j foram divididos em sub-
Flaviviridae
583
grupos genticos (BVDV-1a e 1b; BVDV-2a e 2b), porm a relevncia clnica e epidemiolgica dessa subdiviso ainda no est esclarecida. A reatividade sorolgica cruzada entre BVDV-1 e BVDV-2 geralmente baixa, e isto apresenta implicaes importantes para o diagnstico e eccia de vacinas. O BVDV infecta naturalmente uma variedade de ruminantes domsticos e silvestres, alm de sunos; os bovinos so considerados os seus hospedeiros naturais. In vitro, o BVDV capaz de replicar em uma variedade de clulas de cultivo de vrias espcies, inclusive de origem humana. Com base no efeito da replicao em cultivo celular, os isolados de BVDV podem ser divididos em citopticos (cp) e no-citopticos (ncp). Os isolados ncp se constituem nos BVDV verdadeiros e so responsveis pela maioria das infeces naturais e pelas infeces fetais persistentes. Os isolados cp se constituem em uma minoria; no so capazes de produzir infeces persistentes e so isolados quase que exclusivamente de animais com a DM. Os BVDV cp so gerados nos animais PI a partir do vrus ncp original, atravs de mutaes, recombinaes, delees ou rearranjos genticos que levam expresso na protena NS3 como um polipeptdeo individual. Em contraste, os vrus ncp expressam apenas a protena precursora NS23. Embora o papel da NS3 na citopatologia ainda no esteja esclarecido, essa protena considerada o marcador molecular dos BVDV cp.
O BVDV apresenta distribuio mundial e praticamente todos os pases que possuem bovinocultura signicativa j relataram a sua presena. A infeco pelo BVDV j foi descrita em vrias espcies silvestres, porm a relevncia epidemiolgica desses achados permanece incerta. Recentemente, os pases escandinavos implementaram programas de erradicao. Com base no sucesso inicial desses programas, pases como Alemanha, Frana, Estados Unidos e Rssia tambm iniciaram programas de erradicao do BVDV. No entanto, a erradicao do vrus desses pases
mais difcil devido intensicao do processo produtivo e grande populao bovina e intensa movimentao de animais. A infeco pelo BVDV tem sido descrita no Brasil desde o nal dos anos 1960. Vrios relatos clnico-patolgicos, virolgicos e sorolgicos demonstram a ampla distribuio da infeco no rebanho bovino brasileiro. Os ndices de soropositividade nos diversos estudos variam entre 18 e 84%. Vrus dos dois gentipos (BVDV-1 e BVDV-2) j foram identicados no pas, e, aproximadamente, dois teros pertencem ao gentipo 1. O BVDV j foi isolado de diversas origens, incluindo soro fetal comercial, fetos abortados, animais PI, animais com DM, com doena respiratria, com doena gastrentrica, de rebanhos com problemas reprodutivos. Sorologia positiva em caprinos, bubalinos, javalis cativos e cervdeos silvestres tambm j foi relatada no pas. Os bezerros PI se constituem nos principais reservatrios e fontes de disseminao do vrus. Esses animais excretam o vrus continuamente em altos ttulos em secrees (nasais, saliva, smen, leite) e excrees (urina, fezes contm pouco vrus). Durante a infeco aguda, os animais infectados tambm excretam o vrus, porm em ttulos inferiores e por menos tempo (3 a 10 dias). O vrus transmitido entre animais principalmente por contato direto (focinho-focinho, coito, mucosa-mucosa) e indireto (focinho-secrees/excrees, focinho-feto abortado/placenta, contato com secrees/excrees). Transmisso iatrognica (agulhas ou material cirrgico contaminado, luvas de palpao, tatuadores, aplicadores de brinco) e por smen contaminado, alm de outros veculos tambm pode ocorrer. A transmisso vertical aos embries/fetos uma conseqncia freqente da infeco de vacas prenhes. O smen coletado de touros PI ou durante a infeco aguda tambm pode transmitir o vrus a fmeas pela inseminao articial. A introduo do vrus nos rebanhos pode ocorrer por: a) introduo de animais PI; b) introduo de fmeas gestando fetos PI; c) introduo de animais durante a infeco aguda; d) contato entre animais de rebanhos vizinhos (essa ltima forma parece possuir importncia limitada).
584
Captulo 22
4.2.2.2 Patogenia e manifestaes clnicas

O epitlio do trato respiratrio superior, orofaringe e o tecido linfide regional parecem ser os stios primrios de replicao aps a infeco pela via oro-nasal. As conseqncias e a severidade da infeco aguda pelo BVDV dependem de uma srie de fatores que incluem a cepa viral (e o bitipo), o status imunolgico do animal, o status reprodutivo e a ocorrncia de infeces secundrias. Embora o primeiro relato de BVD tenha sido de uma forma aguda severa, os casos posteriormente relatados demonstraram que a maioria das infeces agudas de animais imunocompetentes cursava sem manifestaes clnicas aparentes ou com sinais discretos. De acordo com as conseqncias clnico-patolgicas e epidemiolgicas, pode-se dividir a infeco pelo BVDV em duas categorias principais: infeco aguda de animais no-prenhes e infeco aguda de fmeas prenhes.
Infeco aguda de animais no-prenhes

A maioria das infeces de animais imunocompetentes assintomtica, mas pode cursar com quadros febris leves, muitas vezes imperceptveis. Alguns isolados de maior virulncia podem provocar um perodo febril curto, acompanhado por sialorria, hiperemia e descarga nasal, tosse e diarria. O perodo de incubao varia entre 3 e 7 dias e seguido de hipertermia transitria e leucopenia. O vrus pode ser detectado no sangue entre 4 e 6 dias aps a infeco e pode persistir por at 15 dias. Sinais de infeco respiratria tambm podem ser observados. Leses ulcerativas na mucosa oral podem estar presentes. Nos casos de infeco aguda com comprometimento respiratrio e/ou digestivo, antgenos virais podem ser detectados por imunoistoqumica (IHC) nas tonsilas, linfonodos regionais, pulmes e epitlio intestinal. O tecido linfide (tonsilas, linfonodos, tecido linfide associado a mucosas, placas de Peyer) se constitui em importante stio de replicao viral. A enfermidade geralmente autolimitante, cursando com morbidade alta
e mortalidade muito baixa ou nula. No entanto, mortalidade considervel pode, ocasionalmente, ocorrer em animais jovens, principalmente associada com o BVDV-2. A enfermidade pode acometer todas as categorias de animais, principalmente bezerros maiores de seis meses. O BVDV tambm imunossupressor, podendo predispor os animais infectados a infeces com outros agentes patognicos. Assim, casos de enfermidade entrica ou respiratria por outros patgenos virais (herpesvrus bovino tipo 1 [BoHV-1]; vrus respiratrio sincicial bovino [BRSV] e vrus da parainuenza tipo 3 [bPI3v]) e bacterianos podem ser potencializados durante a infeco aguda pelo BVDV. Enfermidade respiratria crnica, associada com diferentes bactrias, e quadros persistentes de dermatite tambm tm sido associados com a infeco pelo BVDV em bezerros connados. At o nal dos anos 1980, a importncia maior do BVDV era atribuda s conseqncias da infeco transplacentria: perdas reprodutivas, produo de animais PI e DM. No entanto, no nal dos anos 1980, casos severos de BVDV aguda se tornaram mais freqentes. Casos descritos entre os anos de 1977 e 1987 revelaram que 10% dos casos de infeco clnica aguda pelo BVD em animais adultos apresentavam trombocitopenia. Um surto, em um rebanho leiteiro no estado de Nova Iorque, resultou em 50% de morbidade e 20% de mortalidade. Esses animais apresentavam febre, diarria sanguinolenta, hemorragias e tempo de coagulao retardado. Esta forma de apresentao da infeco pelo BVDV foi posteriormente caracterizada como uma forma distinta de BVD, denominada de BVD aguda hemorrgica (sndrome hemorrgica). Surtos importantes dessa enfermidade foram descritos no Canad entre 1993 e 1994, resultando na morte de aproximadamente 32 mil animais (taxa de mortalidade de 22,4% entre bezerros). Em torno de 150 rebanhos de leite, 660 de corte e 100 de vitelos foram afetados; e animais de diferentes faixas etrias foram afetados e morreram. As leses encontradas eram similares s observadas na DM. No entanto, dois importantes pontos diferenciam a infeco aguda hemorrgica pelo BVDV da DM: a presena de vrus citoptico
Flaviviridae
585
e as taxas de morbidade e mortalidade. Enquanto a patogenia da DM exige necessariamente a presena de vrus dos dois bitipos (cp e ncp), a forma severa de BVD aguda apresenta apenas um bitipo do vrus, geralmente ncp. Alm disso, as taxas de mortalidade na DM so de 100%, e a taxa de morbidade baixa (correspondente ao nmero de animais PI em um rebanho). Na forma severa de BVD aguda, as taxas de mortalidade so baixas, porm a taxa de morbidade alta. Geralmente, entre 50 a 90% dos animais clinicamente infectados se recuperam. Os surtos de infeco aguda pelo BVDV esto diretamente relacionados com a virulncia da cepa envolvida. A disseminao de cepas de baixa virulncia na populao ocorre como resultado do contato direto com animais PI, o que limita a disseminao desses vrus. J a disseminao de vrus de alta virulncia ocorre de forma semelhante ao CSFV, ou seja, a partir de animais com a infeco aguda.
Infeco aguda de fmeas prenhes

A infeco de fmeas prenhes soronegativas freqentemente seguida de transmisso transplacentria do vrus ao embrio ou feto. As conseqncias da infeco do concepto dependem do estgio de gestao em que ocorre a infeco, do biotipo (cp/ncp) e da cepa do vrus. Podem ocorrer reabsoro embrionria (com retorno ao cio em intervalos regulares ou irregulares), abortos, mumicao fetal, natimortos, nascimento de bezerros fracos e inviveis, que morrem em seguida ou apresentam crescimento retardado; ou o nascimento de animais PI. Em geral, abortos em qualquer fase de gestao podem ser atribudos ao BVDV. Fetos infectados no tero nal da gestao freqentemente nascem normais, livres do vrus e soropositivos. As possveis consequncias da infeco pelo BVDV esto ilustradas na Figura 22.6.
BVDV
ncp ou cp Soropositivo, livre do vrus ncp Bezerro PI Natimortos Malformaes Bezerros PI Infertilidade Abortos
ncp ou cp
Atrofia da retina cegueira

Embrio muito susceptvel Efeitos na fertilizao, implantao Leses no SNC Bezerros saudveis soropositivos
Imunotolerncia (PI) Abortos
40
80
120
160
200
240
280
D I A S D E G E S TA O
Figura 22.6. Conseqncias da infeco de fmeas bovinas prenhes pelo BVDV, de acordo com o bitipo do vrus e com o estgio de gestao.
586
Captulo 22
A ocorrncia de malformaes fetais um achado muito comum em rebanhos infectados e geralmente acontece quando a infeco ocorre entre os 100 e 150 dias de gestao. As malformaes principais podem ser encontradas no sistema nervoso central (hipoplasia cerebelar, microcefalia, hidrocefalia, mielinizao deciente na medula espinhal) e nos olhos (atroa ou displasia da retina, catarata, microftalmia), podendo observar-se, ainda, aplasia tmica, braquignatismo, retardo de crescimento e artrogripose. Em muitos rebanhos, as malformaes so os primeiros e, algumas vezes, os nicos achados que indicam a presena do vrus.
de animais PI que sobrevivem at a idade adulta, podendo se tornar reprodutores e transmitir o vrus para a prognie (fmeas) ou pelo smen (machos). Fmeas PI que atingem a idade adulta e cam prenhes geralmente produzem bezerros PI.
Etiopatogenia da doena das mucosas

A doena das mucosas (DM) uma enfermidade gastrentrica fatal, desencadeada quando um animal PI (portador de um BVDVncp) superinfectado com um BVDV citoptico (BVDVcp) antigenicamente semelhante. O BVDVcp que determina o desenvolvimento da DM geralmente se origina do BVDVncp do prprio animal PI por mutaes. Vrios tipos de mutaes, delees e rearranjamentos genticos tm sido identicados na gerao de BVDVcp, todos esses mecanismos resultam na expresso da protena viral NS3. Outras fontes de vrus citopticos que podem determinar a DM incluem vrus de vacinas vivas modicadas ou transmisso de vrus cp a partir de outros animais PI. Nos animais que desenvolvem a DM, os dois vrus (ncp e cp) esto presentes (Figura 22.7). A DM invariavelmente fatal, ocorre principalmente em animais com seis meses a dois anos de idade e se caracteriza por febre, leucopenia, diarria, inapetncia, desidratao, leses erosivas nas narinas e na boca e morte dentro de poucos dias. Na necropsia, eroses e ulceraes podem ser encontradas no trato gastrintestinal, particularmente nas placas de Peyer. No esfago, essas leses apresentam-se no sentido longitudinal, com aspecto de arranho de gato. As placas de Peyer apresentam-se edematosas, hemorrgicas e necrticas. O contedo intestinal escuro e aquoso e observa-se enterite catarral ou hemorrgica. A histopatologia revela uma necrose extensiva dos tecidos linfides, incluindo as placas de Peyer, nos centros germinativos do bao e linfonodos. Devido proporo de animais PI em um rebanho ser geralmente muito baixa, a morbidade da DM tambm baixa. A letalidade prxima de 100%.
Infeco persistente
O estabelecimento da infeco persistente ocorre quando o feto infectado entre os 40 e 120 dias de gestao (Figura 22.6). Os fetos infectados nesse perodo desenvolvem imunotolerncia ao vrus infectante e o seu organismo jamais consegue erradicar o vrus. Esses animais tornam-se portadores permanentes e excretam o vrus continuamente em secrees e excrees. Os bezerros que nascem PI so geralmente soronegativos. Os fetos que so infectados aps o 125 dia de gestao so considerados imunocompetentes e podem desenvolver uma resposta imunolgica que, freqentemente, resulta na erradicao do agente. Os fetos congenitamente infectados podem apresentar alguns defeitos em decorrncia da infeco transplacentria ou podem nascer aparentemente normais. Os animais PI podem apresentar crescimento retardado, malformaes congnitas ou ser aparentemente saudveis. Alguns apresentam crescimento retardado e so mais susceptveis a infeces secundrias. Como descrito anteriormente, apenas cepas de BVDV no-citopticas podem estabelecer infeces persistentes. Animais persistentemente infectados com o BVDV representam o maior reservatrio do vrus na natureza e, por isso, so considerados mantenedores do vrus na natureza. A maioria dos animais PI morre nos primeiros meses de vida, no entanto, alguns deles podem viver at os dois anos ou mais. Existem vrios relatos
Flaviviridae
587
ncp
cp Bezerro PI BVDV ncp

5' UTR N
pro
p7
Doena das mucosas ncp + cp

3' UTR NS2-3
NS4-A NS4-B
rns
E1
E2
NS5A
NS5B
NS2-3
NS2-3 NS3
No-citoptico (ncp)
Citoptico (cp)
Figura 22.7. Etiopatogenia da doena das mucosas (DM). Em bezerros nascidos imunotolerantes e persistentemente infectados com um BVDV ncp, mutantes cp podem ser gerados a partir de mutaes do vrus original. A replicao do par de vrus (ncp/cp) leva ao desenvolvimento da enfermidade, que apresenta curso fatal. A principal diferena molecular entre os vrus ncp e cp a expresso da protena NS3 pelo vrus cp, enquanto o ncp expressa apenas o precursor NS23.
Na DM crnica, menos comum, os sinais clnicos so inespeccos. Observa-se inapetncia, perda de peso e apatia progressiva. A diarria pode ser contnua ou intermitente. Algumas vezes, ocorrem descarga nasal e descarga ocular persistente. reas alopcicas e de hiperqueratinizao podem aparecer, geralmente no pescoo. Leses erosivas crnicas podem ser observadas na mucosa oral e na pele. Laminite, necrose interdigital e deformao do casco podem tambm ocorrer. Esses animais podem sobreviver por muitos meses e, geralmente, morrem aps debilitao progressiva.
4.2.2.3 Diagnstico
Deve-se suspeitar de infeco pelo BVDV sempre que houver uma ocorrncia de perdas embrionrias, abortos, malformaes fetais, nascimento de animais fracos ou morte perinatal. Alm disso, casos de doena entrica e/ou respiratria com componentes hemorrgicos (melena, petquias em mucosas, serosas etc.), eroses e ulceraes no trato digestivo tambm so sugestivos dessa infeco. Essas manifestaes ocorrem principalmente, mas no exclusivamente, em
animais jovens. Bezerros fracos, com crescimento retardado e predisposio a outras enfermidades devem ser considerados potencialmente suspeitos de serem PI. O teste padro de diagnstico o isolamento do agente em cultivos celulares seguido por identicao por IFA ou IPX, pois a maioria das amostras no-citoptica. Clulas de origem bovina, particularmente as primrias, so muito susceptveis ao vrus. O sangue (especialmente os leuccitos) de animais infectados de forma aguda ou persistente muito rico em vrus. Em geral, os ttulos de vrus no sangue de animais PI so muito maiores do que em animais com a infeco aguda. Alm do isolamento, antgenos virais podem ser demonstrados em tecidos (fetos abortados, placentomas, fragmentos de tecidos coletados na necropsia) por IF e IPX. Um teste de ELISA de captura de antgeno, destinado a detectar protenas virais no soro de animais PI, apresenta boa especicidade e sensibilidade e pode ser realizado para testar um grande nmero de amostras. Bipsias de pele (fragmentos de orelha) para a deteco de antgenos virais por IPX ou ELISA tm sido popularizadas na Amrica do Norte para a
588
Captulo 22
triagem e deteco de animais PI. Isolamento do vrus ou deteco de RNA viral por PCR no leite tem sido utilizado para identicar rebanhos leiteiros infectados. O diagnstico sorolgico geralmente realizado pela tcnica de SN ou ELISA. A identicao de soropositividade de um animal indica apenas exposio prvia ao agente. Animais infectados de forma aguda, soroconvertem 10-14 dias aps a infeco inicial. Nestes animais, a sorologia pareada pode indicar a infeco. Animais PI geralmente no apresentam anticorpos no soro, j que no so capazes de responder imunologicamente ao vrus. Exames sorolgicos de rebanhos, devido prtica de vacinao, tm valor epidemiolgico limitado e servem unicamente para vericar o status sorolgico e a possvel circulao do vrus no rebanho. Em termos de controle ou erradicao, o diagnstico de BVDV deve ser focado na deteco dos animais PI. O isolamento viral e/ou deteco de antgenos no plasma e/ou em bipsias de orelha por ELISA/IPX so os mtodos de eleio.

O controle da infeco pelo BVD pode ser efetuado com ou sem o uso de vacinas, dependendo do histrico do rebanho, do risco de introduo do agente e de outros fatores epidemiolgicos. O controle com vacinao indicado para rebanhos com alta rotatividade de animais, rebanhos com sorologia positiva, com histrico de doena clnica ou reprodutiva, e com conrmao virolgica de BVDV. Tambm indicado para propriedades de terminao de novilhos, nas quais animais de vrias procedncias so agrupados e mantidos em alta densidade por rea. Rebanhos leiteiros, com introduo freqente de animais e troca de reprodutores, tambm podem ser aconselhados a realizar a vacinao. Rebanhos que comercializam reprodutores, mesmo que sejam negativos, podem vacinar os animais destinados venda, o que protege de eventual infeco nos rebanhos de destino. Nos Estados Unidos, existem dezenas de vacinas contra o BVDV, mono e polivalentes, ate-
nuadas e inativadas. No Brasil, todas as vacinas para o BVDV disponveis atualmente so inativadas, contendo adjuvante oleoso ou hidrxido de alumnio. Essas vacinas possuem tambm antgenos de outros agentes infecciosos como o BoHV1, bPI3v e BRSV e algumas contm pasteurelas. A vacinao deve seguir o esquema indicado pelos fabricantes. Geralmente, os bezerros so vacinados aos 4 a 6 meses de idade e revacinados de 30 a 40 dias aps. Alguns animais podem, ainda, possuir anticorpos maternos nessa idade. Assim, recomendada uma revacinao aos 8 ou 12 meses. Revacinaes a cada 6 a 12 meses devem ser realizadas para manuteno da imunidade. No caso das fmeas, recomenda-se revacinao previamente temporada de monta (2 a 3 semanas antes da cobertura). Vacinas com vrus atenuado so disponveis nos EUA e em outros pases e apresentam maior eccia, porm oferecem o risco de infeco fetal. As vacinas contra o BVDV, se corretamente utilizadas, podem conferir proteo razovel contra a doena clnica, porm so geralmente pouco ecientes para induzir proteo fetal. Vacinas produzidas com cepas de BVDV-1 em geral induzem proteo parcial ou incompleta contra cepas de BVDV-2. No Brasil, a maioria das vacinas contm apenas vrus do gentipo 1, porm algumas vacinas recentemente importadas e outras em vias de produo incluem tambm vrus do gentipo 2. A tendncia que as vacinas futuras contra o BVDV contenham os dois gentipos, alm de representantes dos subgentipos. O controle sem vacinao indicado para rebanhos fechados, sem o ingresso freqente de animais e, conseqentemente, de baixo risco. Rebanhos extensivos de gado de corte geralmente se enquadram nessa categoria. Esse tipo de controle tambm indicado para rebanhos cujos parmetros reprodutivos e clnicos no registrem eventos sugestivos da infeco pelo BVDV. Rebanhos com sorologia negativa e cujo ingresso de animais seja raro ou eventual tambm no apresentam grande risco de introduo do agente. Nesses casos, pode-se utilizar o controle sem vacinao, que objetiva manter o status negativo do rebanho. Para evitar a introduo da infeco,
Flaviviridae
589
deve-se recorrer a medidas bsicas de biossegurana e testar, para vrus, todos os animais antes de ingressarem na propriedade. Com essa medida, possvel manter rebanhos livres da infeco, pois a principal forma de introduo da infeco por meio de animais infectados (na fase aguda ou persistente). Bezerros (potencialmente PI) e vacas prenhes soropositivas (potencialmente carreando fetos PI) devem ser especialmente considerados, pois representam potenciais formas de introduo do vrus nos rebanhos. Em rebanhos suspeitos de possuir animais PI ou com histrico de casos clnicos suspeitos de BVDV, o controle deve enfatizar a identicao e remoo desses animais. Nos pases escandinavos, o programa de erradicao tem por principal objetivo a identicao e a remoo dos animais PI. Nesses pases, a vacinao no foi utilizada como parte do programa de erradicao devido ao fato de que, com a vacinao, se perde o indicador sorolgico da presena da infeco no rebanho. A incidncia do BVDV era relativamente baixa, o que encorajou a implementao do programa de erradicao sem a utilizao da vacinao. Alm disso, a importao de animais, o transporte e a densidade eram relativamente baixos quando comparadas com outros pases. Em pases em que a prevalncia do BVDV prxima ou acima de 50%, associada com grande movimentao e importao de animais, programas de controle e erradicao provavelmente devem utilizar a vacinao do rebanho alm da identicao e eliminao dos animais PI.
lhas prenhes, o vrus capaz de atravessar a barreira transplacentria e infectar o feto, resultando em abortamentos, nascimento de cordeiros fracos e inviveis, alm de malformaes congnitas. Em animais que nascem a termo, as conseqncias da infeco dependem da fase de gestao em que ocorreu a infeco. Quando a infeco ocorrer aps os 80 dias de gestao, pode ocorrer o nascimento de cordeiros com cobertura escassa e anormal de l, geralmente pequenos, fracos e com graus variveis de tremor. Outros cordeiros infectados pelo BDV podem apresentar anormalidades esquelticas, como uma desproporcionalidade dos membros anteriores, cabeas pequenas e ossos nos. Similarmente ao BVDV em bovinos, os cordeiros podem nascer persistentemente infectados com o BDV e excretar o vrus continuamente. No entanto, sabe-se que cordeiros que nascem PI do BDV apresentam uma viabilidade reduzida quando comparados aos bezerros PI do BVDV. A sua importncia da epidemiologia da infeco incerta, mas provavelmente menor do que no BVDV, devido sua baixa viabilidade e pouco tempo de vida. O diagnstico da infeco pelo BDV pode ser realizado por isolamento viral ou por imunoistoqumica nos tecidos. Existem poucas vacinas e kits de diagnstico para o BDV disponveis no mercado mundial.
4.3 Gnero Hepacivirus

At o momento s existe uma espcie reconhecida dentro deste gnero (Tabela 22.4). No entanto, existem seis grupos genticos chamados de cls. As diferenas genticas entre os cls so signicativas (25 a 35% em nvel de nucleotdeos). Esses cls no so considerados espcies diferentes at o presente, pois caractersticas de diferenciao taxonmica, como sorotipos ou diferenas nos hospedeiros, que justicassem essa classicao ainda no foram identicadas.
4.2.3 Vrus da doena da fronteira

A doena da fronteira (border disease, BD) uma doena reprodutiva de ovinos causada por um pestivrus denominado BDV. Alm dos ovinos, o BDV pode infectar naturalmente caprinos, bovinos e sunos. A infeco de ovelhas no prenhes geralmente subclnica, mas pode cursar com febre leve e leucopenia transitria. Em ove-
590
Captulo 22
Tabela 22.4. Espcies virais do gnero Hepacivirus.
Espcies reconhecidas
Vrus da hepatite C (HCV) hepatitis C virus Grupos genticos dentro das espcies HCV clade 1 HCV clade 2 HCV clade 3 HCV clade 4 HCV clade 5 HCV clade 6
BOLIN, S.R.; RIDPATH, J.F. Range of viral neutralizing activity and molecular specicity of antibodies induced in cattle by inactivated bovine viral diarrhea virus vaccine. American Journal of Veterinary Research, v.51, p.703-707, 1990. BROWNLIE, J. et al. Protection of bovine fetus from bovine viral diarrhoea virus by means of a new inactivated vaccine. The Veterinary Record, v.137, p.58-62, 1995. BROWNLIE, J. The pathogenesis of bovine virus diarrhea virus infection. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.9, p.43-59, 1990. COLIJN, E.O.; BLOEMRAAD, M.; WENSVOORT, G. An improved ELISA for the detection of serum antibodies direct against classical swine fever virus. Veterinary Microbiology, v.59, p.15-25, 1997. COLLETT, M.S. et al. Bovine viral diarrhea virus genomic organization. Archives of Virology. Supplementum, v.3, p.1927, 1991. COLLETT, M.S. Molecular genetics of pestivirus. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.15, p.145-154, 1992. COLLETT, M.S.; MOENING V.; HORZINEK, M.C. Recent advances in pestivirus research. The Journal General Virology, v.70, p.253-266, 1989. CONDIT, R.C. Principles of Virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.2, p.19-51. CORAPI, W.V.; DONIS, R.O.; DUBOVI, E.J. Characterization of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus. American Journal of Veterinary Research, v.51, p.1388-1394, 1990. DE MOERLOOZE, L. et al. The coding region for the 54-kDa protein of several pestiviruses lacks host insertions but reveals a Zinc nger-like domain. Virology, v.177, p. 812-815, 1990. DINTER, Z.; MOREIN, B. (Eds). Virus Infections of Ruminants. New York, NY: Elsevier, 1990. DONIS, R.O. Molecular biology of bovine viral diarrhea virus and its interactions with the host The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.393-423, 1995. DONIS, R.O. Molecular biology of bovine viral diarrhea virus and its interactions with the host. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.393-423, 1995. FAUQUET , C.M. et al. (Eds). Virus taxonomy, VIIIth Report of the International Committee of Taxonomy of Viruses. 2.ed. San Diego, CA: Elsevier, 2005. 1162p. FLORES, E.F. et al. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) in Brazil: history, current situation and perspectives. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.3, p.125-134, 2005.
Espcies provisrias
GB virus B
BAKER, J.C. Clinical aspects of bovine virus diarrhea infection. Revue Scientique et Technique (International Ofce of Epizootics), v.9, p.25-41, 1990. BAKER, J.C. The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.425-445, 1995. BAKER, J.C. The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.425-445, 1995. BEAUDEAU, F. et al. Evaluation of a blocking ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) antibodies in serum and milk. Veterinary Microbiology, v.80, p.329-337, 2001. BECHER, P.; ORLICH, M.; THIEL, H.J. RNA Recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease. Journal of Virology, v.75, p.6256-6264, 2001. BOLIN, S. Control of bovine viral diarrhea virus infection by use of vaccination. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.615-626,1995. BOLIN, S.; LITTLEDIKE, E.T.; RIDPATH, J.F. Serologic detection and practical consequences of antigenic diversity among bovine viral diarrhea virus in a vaccinated herd. American Journal of Veterinary Research, v.52, p.1033-1047, 1991. BOLIN, S.R. Control of bovine viral diarrhea infection by use of vaccination The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.615-623, 1995. BOLIN, S.R. The pathogenesis of mucosal disease. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.489-500, 1995.
Flaviviridae
591
MEYERS, G.; THIEL, H.J. Molecular characterization of pestiviruses. Advances in Virus Research, v.47, p.53-118, 1996. OLAFSON, P. et al. An apparently new transmissible disease of cattle. The Cornell Veterinarian, v.36, p.205-213, 1946. PENSAERT, M.B. (Ed). Virus infections of porcines. New York, NY: Elsevier, 1989. POTGIETER, L.N. Immunology of bovine viral diarrhea virus. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.501-520, 1995. QI, F.; RIDPATH, J.F.; BERRY, E.S. Insertion of a bovine SMT3B gene in NS4B and duplication of NS3 in a bovine viral diarrhea virus genome correlate with the cytopathogenicity of the virus. Virus Research, v.57, p.1-9, 1998. RIDPATH, J.F. BVDV genotypes and biotypes: practical implications for diagnosis and control. Biologicals, v.31, p.127131, 2003. RIDPATH, J.F.; BOLIN, S.; DUBOVI, E. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes. Virology, v.205, p.66-74, 1994. RIDPATH, J.F.; NEILL, J.D. Detection and characterization of genetic recombination in cytopathic type 2 bovine viral diarrhea viruses. Journal of Virology, v.74, p.8771-8774, 2000. SPICKLER, A.R.; ROTH, J.A. (Eds). Emerging and Exotic Disease of Animals. 2.ed. Ames, IA: Institute for International Cooperation in Animal Biologics, Iowa State University College of Veterinary Medicine, 2004. STUDDERT, M.J. (Ed). Virus Infections of Equines. New York, NY: Elsevier Science Publishers, 1996. TAUTZ, N.; MEYERS, G.; THIEL, H.J. Processing of polyubiquitin in the polyprotein of an RNA virus. Virology, v.197, p.74-85, 1993. TAUTZ, N.; THIEL, H.J. Cytopathogenicity of pestivirus: cleavage of bovine viral diarrhea virus NS2-3 has to occur at a dened position to allow viral replication. Archives of Virology, v.148, p. 1405-1412, 2003. VAN DER MEULEN, K.M.; PENSAERT, M.B.; NAUWYNCK, H.J. West Nile in the Vertebrate World. Archives of Virology, v.150, p.637-657, 2005. VAN OIRSCHOT, J.T.; BRUSCHKE, C.J.M.; VAN RIJN, P.A. Vaccination of cattle against bovine viral diarrhoea. Veterinary Microbiology, v.64, p.169-183, 1999. WHITMORE, H.L.; ZEMJANIS, R.; OLSON, J. Effects of bovine viral diarrhea virus on conception in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.178, p.1065-1067, 1981.
FLORES, E.F. et al. Clinical, pathological and antigenic aspects of bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 2 isolates identied in Brazil. Virus Reviews and Research, v.4, p.55, 1999. FLORES, E.F. et al. Phylogenetics analysis of brazilian bovine viral diarrhea virus type 2 (BVDV-2) isolates: evidence for a subgenotype within BVDV-2. Virus Research, v.87, p.51-60, 2002. FLORES, E.F.; DONIS, R.O. Isolation of a mutant MDBK cell line resistant to bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection due to a block in viral entry. Virology, v.208, p.565-575, 1995. FLORES, E.F.; KREUTZ, L.C.; DONIS, R.O. Swine and ruminant pestiviruses require the same cellular factor to enter bovine cells. The Journal of General Virology, v.77, p.1295-1303, 1996. FRANCKI, R.I.B. et al. Classication and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on the taxonomy of viruses. Archives of Virology. Supplementum, v.2, p.223-233, 1991. FULTON, R.W.; BURGE, L.J. Bovine viral diarrhea virus types 1 and 2 antibody response in calves receiving modied live virus or inactivated vaccines. Vaccine, v.19, p.264-274, 2001. GILLESPIE, J.H.; BAKER, J.A., McENTEE, K. A cytopathogenic strain of virus diarrhea virus. The Cornell Veterinarian, v.50, p.73-79, 1960. GREISER-WILKE, I. et al. Heterogeneous expression of the non-structural protein p80/p125 in cells infected with different pestiviruses. The Journal General Virology, v.73, p.47-52, 1992. HORZINEK, M.C. Non-artropod-borne togaviruses. New York: Academic Press, 1981. 200p. HORZINEK, M.C. Pestivirus-taxonomic perspectives. Archives of Virology. Supplementum, v.3, p.1-5, 1991. HOUE, H. Epidemiology of bovine viral diarrhea virus The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.11, p.521-547, 1995. HOWARD, C.J.; CLARKE, M.C.; BROWNLIE, J. Comparisons by neutralization assays of pairs of non-cytopathogenic and cytopathogenic strains of bovine virus diarrhoea virus isolated from cases of mucosal disease. Veterinary Microbiology, v.13, p.361-369, 1987. KIRKLAND, P.D. et al. The impact of perstivirus on an articial breeding program for cattle. Australian Veterinary Journal, v.67, p.261-263, 1990. KMMERER, B.M. et al. The genetic basis for cytopathogenicity of pestivirus. Veterinary Microbiology, v.77, p.117-128, 2000. KUNO, G. et al. Phylogeny of the Genus Flavivirus. Journal of Virology, v.72, p.73-83, 1998.
TOGAVIRIDAE
23
595 595 597 598
598

5 Epidemiologia 6 As encefalites eqinas (ou encefalomielites eqinas)

6.1 Encefalite eqina venezuelana 6.1.1 O agente 6.1.2 Epidemiologia 6.1.3 Patogenia, sinais clnicos e patologia 6.1.4 Imunidade 6.1.5 Diagnstico 6.1.6 Controle e prolaxia 6.2 Encefalite eqina do leste 6.2.1 Epidemiologia 6.2.2 Patogenia e sinais clnicos 6.2.3 Diagnstico 6.2.4 Controle e prolaxia 6.3 Encefalite eqina do oeste 6.3.1 Epidemiologia 6.3.2 Patogenia e sinais clnicos 6.3.3 Diagnstico 6.3.4 Controle e prolaxia
601 602
602 603 603 606 607 608 608 609 609 610 610 610 610 611 611 611 611
611
1 Introduo
A famlia Togaviridae abrange um grupo de vrus envelopados que possuem uma molcula de RNA de cadeia simples e polaridade positiva como genoma. A denominao Toga deriva da aparncia frouxa do envelope viral lembrando a vestimenta romana , observada nas primeiras imagens dos vrions obtidas por microscopia eletrnica. No entanto, estudos posteriores demonstraram que o envelope desses vrus encontra-se intimamente associado ao nucleocapsdeo. Esta famlia composta por dois gneros: Alfavirus e Rubivirus. O gnero Alfavirus abriga vrios patgenos humanos e animais, cuja principal caracterstica em comum a transmisso por vetores artrpodes. O gnero Rubivirus abriga apenas o vrus da rubola, um patgeno exclusivo de humanos e que no transmitido por insetos. Classicamente, a Togaviridae era uma famlia maior e inclua os avivrus, pestivrus e outros vrus at ento pouco caracterizados. Diferenas moleculares levaram os avivrus (e os pestivrus) a serem reclassicados na famlia Flaviviridae. Os alfavrus so considerados arbovrus (arthropod borne virus) clssicos, juntamente com os avivrus e os buniavrus. Dentre os alfavrus de interesse veterinrio, destacam-se os vrus das encefalites eqinas do leste (EEEV), oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV), alm de outros arbovrus de encefalites de importncia regional em vrios pases. O prottipo da famlia o vrus Sindbis (SIN), isolado inicialmente de mosquitos no Egito e, ocasionalmente, associado com infeces em humanos. Apesar da sua importncia clnica limitada, contribuies inestimveis sobre a arquitetura da partcula viral, estrutura e funo das glicoprotenas do envelope e regulao da expresso gnica foram obtidas com estudos do SIN de outro alfavrus, o vrus Semliki Forest (SFV). Nos ltimos anos, o SIN tambm tem sido testado como vetor para terapia gnica e vacinas. Os alfavrus podem infectar naturalmente vrias espcies de aves, pequenos mamferos e insetos, sendo mantidos na natureza graas a ciclos alternados nessas espcies. A distribuio geogrca de cada espcie de alfavrus geral-
mente limitada, e determinada pela existncia de condies ecolgico-ambientais para a sobrevivncia e atividade dos vetores. Para a maioria dos alfavrus, as infeces de animais domsticos e humanos constituem-se em eventos acidentais e possuem, portanto, importncia epidemiolgica limitada. Para poucos alfavrus, os ciclos de replicao em espcies domsticas (eqinos e aves) podem contribuir para a sua amplicao e desencadeamento de epizootias/epidemias. Alm da estrutura e epidemiologia similar, os alfavrus so antigenicamente relacionados entre si e apresentam vrias propriedades genticas, moleculares e biolgicas semelhantes. Este captulo aborda inicialmente as caractersticas gerais da famlia Togaviridae e a, seguir, as viroses associadas com os alfavrus de importncia veterinria.
2 Classicao
A famlia Togaviridae composta por dois gneros: Alfavirus e Rubivirus. O gnero Alfavirus abrange aproximadamente 30 espcies de vrus, alguns dos quais tm sido associados com doena em animais domsticos (eqinos e aves), silvestres (aves e mamferos) e ocasionalmente humanos. Esses vrus possuem caractersticas estruturais e morfolgicas em comum, so transmitidos por insetos e apresentam uma considervel relao antignica. Grande parte da reatividade antignica cruzada deve-se similaridade da protena do capsdeo. De acordo com o grau de similaridade antignica, os alfavrus podem ser distribudos nos seguintes grupos: o WEEV apresenta vrios sorotipos, e o seu grupo inclui ainda o vrus Highlands J e o SIN; o VEEV possui sete sorotipos (I a VII), e alguns variantes dentro do sorotipo I (AB, C, D, E e F); o EEEV possui dois variantes antignicos (sul e norte-americano); o grupo antignico do SFV inclui ainda os vrus Mayaro, Getah, Ross River, ONyong-Nyong e Chikungunya. A reatividade sorolgica cruzada observada apenas entre vrus do mesmo grupo e no entre os gneros. Apesar de sua relao antignica, os membros do gnero Alfavirus apresentam diferenas antignicas e moleculares, que podem ser detectadas por testes sorolgicos e por anlise de seqncias genmicas.
596
Captulo 23
Pouco se sabe sobre possveis diferenas e semelhanas no ciclo replicativo da maioria dos alfavrus, embora seja evidente que cada membro do gnero apresenta um potencial patognico distinto. Grande parte dos conhecimentos sobre a estrutura e replicao desses vrus foi obtida a partir de estudos com os vrus prottipos SIN e SFV. O gnero Rubivirus possui apenas o vrus da rubola, que no apresenta relao antignica com os alfavrus. No entanto, algumas propriedades estruturais e biolgicas indicam que esses dois gneros evoluram de um mesmo ancestral. Os humanos so os nicos hospedeiros conheci-
dos dos rubivrus, e a sua transmisso no envolve a participao de insetos. Na Tabela 23.1, esto relacionados os principais alfavrus associados com enfermidades em animais e humanos. O potencial zoontico dos alfavrus tem sido relatado principalmente para o EEEV, WEEV e VEEV. Tambm tem sido relatada doena febril, acompanhada de eritema e artrite em humanos, associada com os alfavrus Ross River (Austrlia, Oceano Pacco), SFV (frica), Mayaro (Trinidad e Tobago, Amrica do Sul) e vrus do grupo do Sindbis (frica, sia e Austrlia).
Tabela 23.1. Principais alfavrus de interesse mdico e veterinrio.
Vrus
Hospedeiros naturais
Aves silvestres de reas pantanosas
Espcies afetadas
Eqinos, aves domsticas (faises, galinha, emas, patos)
Eqinos
Enfermidade
Vetores
Mosquitos (Culiseta melanura, Aedes sollicitans, A.vexans) Mosquitos (Culex tarsalis)
Distribuio
Encefalite eqina do leste (EEEV) Encefalite eqina do oeste (WEEV) Encefalite eqina venezuelana (VEEV) Getah Higlands J Chikungunya (CHIK)
Doena febril, encefalite
EUA (costa leste e do Golfo do Mxico), Amrica Central e Caribe, costa norte da Amrica do Sul Plancies centrais e ocidentais dos EUA e Canad Amrica Central, norte/noroeste da Amrica do Sul Sudeste Asitico Amricas frica, ndia, Sudeste Asitico Amrica do Sul, Trinidad e Tobago
Aves silvestres, pequenos mamferos Roedores silvestres, eqinos (vrus epizoticos) Pssaros, mamferos Pssaros, mamferos (?)
Encefalite, doena febril
Eqdeos (eqinos, asininos, burros)
Encefalite, doena febril
Mosquitos (Culex sp) Mosquitos Mosquitos
Eqinos Eqinos
Doena febril Doena febril, encefalite Doena febril, exantema, artralgias Doena febril, exantema, artralgias Doena febril, exantema, artralgias Doena febril, exantema, artralgias Doena febril, exantema, artralgias Doena febril, rara encefalite
Primatas
Primatas, humanos
Mosquitos
Mayaro (May)
Primatas
Primatas, humanos
Mosquitos
Onyong-nyong (ONN)
Primatas
Humanos
Mosquitos
Africa
Ross River (RR)
Mamferos silvestres
Mamferos, humanos
Mosquitos
Austrlia, Ilhas do Pacfico Norte da Europa, frica, sia e Austrlia
Sindbis (SIN)
Pssaros
Pssaros, humanos Pssaros, humanos, eqinos
Mosquitos
Semliki Forest (SFV)
Pssaros
Mosquitos
frica
Togaviridae
597

Os vrions da famlia Togaviridae esto entre os vrus envelopados mais simples. Os vrions so esfricos ou levemente pleomrcos, com dimetro aproximado de 70 nm (Figura 23.1), com um nucleocapsdeo isomtrico, com aproximadamente 40 nm de dimetro, formado por 240 cpias da protena do capsdeo (C), arranjadas em simetria icosadrica. O nucleocapsdeo revestido externamente por um envelope lipdico, intimamente associado, derivado da membrana plasmtica da clula hospedeira. O envelope apresenta 80 projees externas (peplmeros), cada uma formada pela associao de trs heterodmeros das glicoprotenas E1 e E2. Uma das extremidades da E2 projeta-se internamente e interage com o nucleocapsdeo. As trs protenas estruturais principais apresentam massas de 30-33 kDa (C), 50 kDa (E1) e 45 kDa (E2). Uma terceira glicoprotena de envelope (E3, 10 kDa) e uma protena transmembrana pequena (6 kDa) tambm foram identicadas nos alfavrus. Alm da funo estrutural, as glicoprotenas do envelope desempenham funes importantes no incio da replicao (ligao nos receptores, penetrao) e constituem-se em fatores de virulncia em modelos animais. As glicoprotenas tambm possuem atividade hemaglutinante e so alvos de anticorpos neutralizantes. Os vrions possuem massa molecular 52x106; densidade Buoyant 1.18-1.19 g/cm3-3 em sacarose
e coeciente de sedimentao 280S. So sensveis a solventes orgnicos, detergentes, irradiao e so relativamente instveis sob condies ambientais. Aproximadamente 30% da massa total dos vrions composta por lipdios. O genoma dos alfavrus uma molcula de RNA de cadeia simples, linear, de polaridade positiva, com extenso de 9.7 (rubivrus) a 11.8 kb (alfavrus) (Figura 23.2). A extremidade 5 possui uma estrutura cap e a extremidade 3 poliadenilada. Pequenas seqncias no-traduzidas so encontradas prximo s duas extremidades e, provavelmente, possuem importncia para a transcrio e replicao do genoma. As seqncias traduzveis (open reading frames, ORFs) esto agrupadas em dois mdulos: os genes das protenas no-estruturais (nsPs) esto localizados nos dois teros prximos extremidade 5 e so expressos pela traduo direta do genoma. As protenas nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4 so produzidas pela clivagem da poliprotena precursora. Os genes que codicam as protenas estruturais (C, E1, E2, E3) fazem parte de uma ORF localizada na regio prxima a extremidade 3 do genoma. Esses genes so expressos pela traduo de um RNA mensageiro (mRNA) subgenmico (26S), que produzido a partir da cpia de RNA de sentido antigenmico. A traduo deste mRNA tambm resulta na produo de uma poliprotena, cuja clivagem seqencial resulta nas protenas estruturais.
598
Captulo 23
mRNA 26S
Cap
5'
C E3 E2 E1
3'
NsP1
NsP2
NsP3
NsP4
A(n)
Sntese de Helicase Sntese de Polimerase/ Capsdeo RNA (-) Protease RNA (+) replicase Capping
Glicoprotenas do envelope
Aproximadamente 12 kb
Fonte: adaptada de Schlesinger e Schlesinger (1996).
Figura 23.2. Estrutura e organizao do genoma dos alfavrus. As provveis funes dos produtos esto apresentadas abaixo de cada gene.
4 Replicao
Os alfavrus replicam em uma variedade de linhagens celulares, incluindo clulas BHK21 (baby hamster kidney cells), Vero (African green monkey kidney), alm de cultivos primrios de embries de galinha (CEF) e de pato. A replicao viral nessas clulas produz altos ttulos de vrus e acompanhada de citopatologia severa e morte celular. A replicao em clulas de mosquitos, por outro lado, geralmente no acompanhada de citopatologia ou alteraes aparentes na siologia celular, a exemplo do que ocorre in vivo. A infeco natural em mosquitos persistente, sem alteraes evidentes na siologia do vetor. Clulas C6/36, derivadas de Aedes albopictus, tambm so rotineiramente utilizadas para amplicar os alfavrus em laboratrio.

Os alfavrus so capazes de infectar vrias espcies in vivo e diferentes tipos de clulas in vitro. Para isso, provavelmente so capazes de utilizar diferentes receptores para iniciar a infeco. Alternativamente, podem utilizar um nico receptor, mas que esteja presente em todas as espcies e clulas que infectam. O SIN parece utilizar receptores distintos em diferentes linhagens: o receptor de alta anidade da laminina em clulas BHK-21 e em outras clulas de mamferos; uma protena de 63 kDa em clulas de CEF e protenas
com 10 e 74 kDa em clulas de neuroblastoma de camundongos. Molculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) tm sido identicadas como receptores para o SFV em clulas de mamferos. A penetrao do vrus envolve a interao inicial da protena E2 e/ou E1 com os receptores na superfcie celular, seguida de internalizao dos vrions por endocitose. Anticorpos contra a E2 possuem atividade neutralizante, indicando a importncia desta glicoprotena no processo de ligao e/ou penetrao. A penetrao dos nucleocapsdeos no citoplasma ocorre aps a fuso do envelope viral com a membrana dos endossomos, o que ocorre sob pH baixo (pH 5 a 6). Classicamente, foi demonstrado que a penetrao dos nucleocapsdeos no citoplasma ocorre aps a fuso do envelope viral com a membrana dos endossomos sob pH baixo (pH 5 a 6), o que classicaria esses agentes como vrus ph-dependentes. Recentemente foi demonstrado um mecanismo alternativo (ou adicional) de penetrao do vrus SIN em clulas de mamferos. Esse mecanismo envolveria a formao de estruturas semelhantes a poros, pela protena E1, na membrana plasmtica. Esses poros permitiriam a ejeo do genoma diretamente no citoplasma, sem a penetrao do nucleocapsdeo como um todo, a exemplo do que ocorre em alguns vrus sem envelope (poliovrus). As alteraes conformacionais na E1 necessrias para a ocorrncia desse processo necessitariam pH baixo, mas a penetrao do genoma ocorreria
Togaviridae
599
a pH prximo do neutro. A fuso/penetrao em clulas de insetos parece no depender da acidicao dos endossomos. O desnudamento provavelmente ocorra pela interao das protenas do nucleocapsdeo com os ribossomos da clula hospedeira. No caso do mecanismo recentemente descrito (formao de poros), o genoma j desprovido da maioria das protenas do nucleocapsdeo seria ejetado no citosol. A primeira etapa aps o desnudamento a traduo direta de parte do RNA genmico pelos ribossomos. A traduo da ORF dos genes das protenas no-estruturais (localizada nos dois teros do genoma prximos extremidade 5) resulta na produo de uma poliprotena que clivada medida que vai sendo produzida, dando origem s protenas no-estruturais nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4 (Figura 23.3). Tem sido demonstrado que a clivagem do precursor nsP1-nsP2-nsP3
ocorre mais tardiamente, ao contrrio da clivagem da nsP4, que parece ocorrer imediatamente aps a sua produo. No vrus SIN, a atividade polimerase foi mapeada na nsP4, que possui uma seqncia GDD presente em vrias RNA polimerases virais. Um complexo formado pela nsP4 e por outras nsPs responsvel pela replicao do genoma (complexo replicase), que ocorre via sntese de uma molcula de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa). Esta molcula serve inicialmente de molde para a transcrio dos mRNAs subgenmicos (26S). A nsP2 parece atuar na regulao da sntese da cadeia negativa de RNA e na iniciao da sntese do mRNA subgenmico, alm de possuir atividade de protease. A nsP1 possui atividade de metil-transferase. Os mRNAs subgenmicos (26S) so traduzidos, originando uma poliprotena que , ento, clivada, dando origem s protenas estruturais
5 Cap
Genoma
Genes protenas no-estruturais Genes protenas estruturais
3 A (n)
Traduo
Poliprotena
Clivagem
NSP1 NSP2 NSP3
NSP4
Replicao
Transcrio
3 5
RNA antigenmico (negativo)
Cap
mRNA subgenmico
A (n)
Traduo
Poliprotena
Clivagem
C Precursor
Processamento co- e ps-traduo
Clivagem
Precursor E1
Clivagem
E3 E2
Figura 23.3. Estratgia de expresso gnica e replicao do genoma dos alfavrus.
600
Captulo 23
do capsdeo (pC) e s glicoprotenas do envelope E1 e E2 (e E3 em alguns vrus) (Figura 23.3). As glicoprotenas so sintetizadas pelos ribossomos, associados membrana do retculo endoplasmtico rugoso (RER). Aps a sua sntese como uma poliprotena precursora (E3-E2-E1), essas glicoprotenas sofrem extensivas modicaes ps-traducionais (glicosilao, acilao) no RER e no aparelho de Golgi. Parte dessas alteraes e o processamento proteoltico nal, que resulta nas glicoprotenas individuais, ocorre no interior de vesculas durante o transporte para a membrana plasmtica, onde essas protenas sero inseridas. O RNA antigenmico tambm serve de molde para a sntese de cpias com a sua extenso total, que correspondem ao RNA genmico. Es-
sas cpias podem servir de molde para outros ciclos de traduo e transcrio, e sero, eventualmente, encapsidadas. O complexo replicase responsvel pela sntese do RNA antigenmico, dos mRNAs subgenmicos e das cpias genmicas do RNA. A montagem dos nucleocapsdeos ocorre associada com membranas no citoplasma, pela conjugao do RNA genmico recm-formado com mltiplas cpias da protena C. Os nucleocapsdeos so transportados at a membrana plasmtica, onde interagem com as caudas das glicoprotenas recm-inseridas e completam a maturao por brotamento. O ciclo replicativo ocorre inteiramente no citoplasma (Figura 23.4).
1 11
2
H+ H+
10 9 6 7a
7b 4 10
Citoplasma
Ncleo
Figura 23.4. Ilustrao esquemtica do ciclo replicativo dos alfavrus. 1) Ligao nos receptores celulares; 2) Internalizao por endocitose mediada por clatrina; 3) Penetrao e desnudamento; 4) Traduo parcial do genoma e produo das protenas no-estruturais (nsPs); 5) Sntese do RNA antigenmico; 6) Transcrio da regio das protenas estruturais e produo do mRNA subgenmico (26S); 7) Traduo do mRNA 26S produzindo as protenas do capsdeo (7a) e do envelope (7b). 8) Sntese do RNA genmico; 9) Morfognese dos nucleocapsdeos; 10)
Togaviridae
601
Em clulas de vertebrados, a replicao dos alfavrus acompanhada por uma supresso na sntese de macromolculas celulares. Isso produz distrbios severos e irreversveis na siologia, que resultam inevitavelmente na morte celular. Em clulas de inseto, o brotamento e maturao ocorrem em membranas internas, e no na membrana plasmtica. Os vrions recm-formados so transportados no interior de vesculas e liberados no meio extracelular por exocitose, sem causar lise celular. A estratgia de expresso gnica e replicao dos alfavrus e ciclo replicativo esto ilustrados nas Figuras 23.3 e 23.4, respectivamente. A exemplo de outros vrus RNA, os alfavrus apresentam uma alta taxa de mutaes e tambm esto propensos a recombinaes no genoma. Essas mutaes e recombinaes possuem importncia na evoluo desses vrus e algumas delas tm sido associadas com alteraes de patogenicidade. Os VEEV epizoticos, capazes de produzir altos nveis de viremia e infeco neurolgica em eqinos e humanos, surgem esporadicamente a partir de mutaes no genoma dos vrus enzoticos. Evidncias genticas indicam que o WEEV surgiu por recombinao entre o EEEV e um vrus semelhante ao SIN.
5 Epidemiologia
Os alfavrus so mantidos na natureza por meio de ciclos alternados em hospedeiros verte-
brados e mosquitos. Os mosquitos se infectam durante o repasto sangneo em hospedeiros virmicos. Aps um perodo de replicao nos tecidos do inseto, o agente transmitido a outro hospedeiro pela inoculao de saliva contaminada. O vrus, ento, replica no hospedeiro, produzindo viremia e, s vezes, enfermidade. Os alfavrus apresentam um amplo espectro de hospedeiros in vivo e in vitro. Uma grande variedade de vertebrados (mamferos e aves) e insetos susceptvel infeco natural e experimental por esses vrus. Os hospedeiros naturais dos alfavrus so as aves (vrias espcies), pequenos mamferos (principalmente roedores e marsupiais) e primatas. Infeces naturais j foram relatadas em morcegos e em outros mamferos pequenos. Os eqdeos tambm so freqentemente infectados por vrias espcies de alfavrus, embora o seu papel na epidemiologia da maioria deles permanea controverso. As conseqncias da infeco natural nas espcies hospedeiras variam desde infeces subclnicas agudas ou crnicas (aves, insetos) at enfermidades fatais. A capacidade de hospedeiros vertebrados servirem de fonte de infeco e participarem do ciclo de transmisso do agente depende dos nveis de viremia e da preferncia especca dos insetos hematfagos. O ciclo natural dessas infeces geralmente no envolve humanos ou animais domsticos, que so hospedeiros acidentais e no participam da transmisso e manuteno do agente na natureza (Figura 23.5).
Ciclo natural
Figura 23.5. Histria natural dos alfavrus. Vrias espcies de aves silvestres so os hospedeiros naturais do vrus, enquanto aves e mamferos domsticos, alm do homem, so hospedeiros acidentais.
602
Captulo 23
As interaes especcas entre os vrus, vetores e hospedeiros vertebrados tendem a connar cada espcie de vrus a determinadas reas geogrcas ou nichos ecolgicos. Essa delimitao geogrca, no entanto, no absoluta e, ocasionalmente, esses vrus podem ser encontrados fora de seus nichos ecolgicos naturais. Isso tem ocorrido nas epizootias causadas pelo VEEV, que atingiram o Mxico e Sul dos Estados Unidos; e tambm com o EEEV e WEEV, que tm sido freqentemente identicados em regies remotas da Amrica Central e do Sul. Sobreposio de reas de ocorrncia de mais de uma espcie de vrus tambm tem sido demonstrada para os vrus da VEE.
6 As encefalites eqinas
(ou encefalomielites eqinas)
Vrios alfavrus so associados com infeco e enfermidade do sistema nervoso central (SNC) de eqinos (ver Tabela 23.1). Na maioria dos casos, esses animais so hospedeiros acidentais (ou terminais) e no participam do ciclo de transmisso desses vrus. Embora alguns alfavrus do Velho Mundo possam causar encefalite, os alfavrus das Amricas que esto mais freqentemente envolvidos em epizootias em eqinos e so denominados genericamente de vrus das encefalites eqinas. Esse complexo de vrus abrange os vrus das encefalites do Leste (EEEV), Oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV). As infeces por esses vrus possuem certa delimitao geogrca, sobretudo por condies ecolgico-ambientais que proporcionam interaes do agente com seus hospedeiros naturais e insetos vetores. No obstante, esses vrus so freqentemente detectados fora de suas regies originais, o que demonstra que os limites geogrcos de sua distribuio so tnues e relativos. A abrangncia geogrca dos vrus do complexo VEEV maior e compreende desde o Norte da Argentina at os EUA, com atividade viral notadamente maior no Norte e Noroeste da Amrica do Sul, Amrica Central e Mxico. Nas ltimas dcadas, epizootias/epidemias associadas ao VEEV tm vitimado centenas de milhares de
eqinos e milhares de pessoas nas Amricas. Em contraste, a EEE e a WEE possuem importncia predominantemente regional nos EUA (embora essas viroses j tenham sido detectadas em outros pases, inclusive no Brasil) e o nmero de casos (eqinos e humanos) tem sido muito menor. A ecologia dessas viroses tem vrios aspectos em comum, porm difere em relao aos hospedeiros naturais, vetores e participao dos eqinos no ciclo de transmisso do vrus. As infeces pelos alfavrus das encefalites eqinas tm sido detectadas no Brasil desde o incio do sculo XX. O EEEV j foi isolado de eqinos nos estados de So Paulo, Pernambuco, Bahia, Minas Gerais e Rio de Janeiro; e o WEEV j foi isolado de cavalos no estado do Rio de Janeiro. A presena desses dois vrus na regio Amaznica foi demonstrada por sorologia e/ou por isolamento do agente de eqinos, mosquitos, aves e mamferos silvestres. A infeco pelo EEEV tem sido demonstrada por exames sorolgicos em pessoas no Vale do Ribeira (SP), em aves e eqinos do Pantanal (MS) e na Mata Atlntica (SP). O VEEV tambm foi isolado de primatas na regio Amaznica e de mosquitos e morcegos na regio Sudeste do Pas. No nal da dcada de 1990, o VEEV foi associado a um surto de encefalite em cavalos no Paran. Outros estudos sorolgicos tm demonstrado a circulao desses e de outros arbovrus em vrias regies do Brasil, principalmente nas regies Sudeste (Mata Atlntica), Centro-Oeste (Pantanal Mato-grossense) e Norte (Amaznia). Pela sua importncia e impacto em sade animal e pela sua abrangncia, que atinge boa parte do territrio brasileiro, este captulo abordar, com mais detalhes, a encefalite eqina venezuelana (VEE). As encefalites oeste (WEE) e leste (EEE) sero abordadas resumidamente no nal.
6.1 Encefalite eqina venezuelana

Os agentes da encefalite eqina venezuelana (VEE) so os alfavrus mais importantes de eqinos e humanos das Amricas. Surtos de doena febril e encefalite tm sido freqentemente
Togaviridae
603
descritos na Amrica Latina nas ltimas dcadas, envolvendo milhares de eqinos e humanos. Os primeiros casos da enfermidade foram descritos, em 1930, no Norte da Amrica do Sul, e afetaram eqinos, asininos e muares. Entre 1938 e 1973, vrios surtos de propores considerveis ocorreram a intervalos de aproximadamente 10 anos no Norte e Noroeste do Continente Sul-Americano. Um surto de propores maiores ocorreu na Amrica Central e Mxico entre 1969 e 1972, afetando e matando milhares de eqdeos e centenas de pessoas. Um esforo internacional integrado conseguiu controlar o surto em 1972. A ausncia de relatos da doena na regio, entre 1973 e 1992, levantou a suspeita de uma possvel extino dos agentes. No entanto, vrios casos foram descritos na ltima dcada, reacendendo as discusses sobre a enfermidade e colocando-a entre as principais doenas emergentes de animais e humanos das Amricas. Surtos de menores propores, atingindo eqinos e humanos, foram descritos na Venezuela em 1992. No Mxico, os eventos mais recentes afetaram apenas eqinos. Em 1993, foram relatados 125 casos, resultando em 63 mortes; em 1996, 32 eqinos foram afetados e 12 morreram. Desde ento, casos espordicos em cavalos tm sido descritos no Mxico e em pases da Amrica Central, conrmando o carter enzotico da infeco. O surto de maior proporo ocorreu em 1995 e atingiu entre 75.000 e 100.000 pessoas (mais de 300 mortes) e milhares de eqinos e muares na Venezuela e Colmbia. As medidas de emergncia incluram a vacinao de mais de 100.000 eqinos na Colmbia, combate aos vetores e restrio movimentao de animais. Esse esforo impediu a disseminao da infeco na direo sul. Nos anos de 1999, 2000 e 2003, pequenos focos localizados de VEE foram relatados em algumas regies da Venezuela. Embora com menor freqncia e propores, casos espordicos e inclusive surtos de VEE, tm sido descritos em outros pases da Amrica do Sul. A histria natural da enfermidade, incluindo a persistncia do agente em reservatrios silvestres e a existncia de condies ecolgico-epidemiolgicas apropriadas indicam que tais eventos continuaro a ocorrer.
6.1.1 O agente
O VEEV pertence a um grupo de alfavrus antigenicamente relacionados que compe o complexo VEE. O complexo VEE abrange seis diferentes subtipos e vrias espcies e variantes (Tabela 23.2). Esses vrus so agrupados de acordo com a sua relao antignica, e cada grupo apresenta virulncia e potencial epizotico distintos. Dentre esses, apenas os subtipos IAB e IC tm sido associados com epizootias/epidemias e utilizam eqinos para a sua amplicao e disseminao e, por isso, so denominados VEEV epizoticos. Os outros sorotipos (ID e IE) e os demais vrus do complexo VEE possuem ocorrncia enzotica e so geralmente avirulentos para a espcie eqina. Os vrus enzoticos so mantidos por meio de ciclos de infeco em pequenos mamferos e insetos em orestas ou regies pantanosas, so avirulentos para eqinos e parecem no utilizar essa espcie para amplicao e manuteno. As caractersticas morfolgico-estruturais e o esquema geral de replicao do VEEV parecem no diferir muito do que foi estabelecido para os vrus prottipos SIN e SFV. O VEEV utiliza a protena ligante da laminina como receptor celular, mas passagens mltiplas em cultivo podem selecionar mutantes da glicoprotena E2 capazes de se ligar ao sulfato de heparina. O VEEV apresenta um estreito espectro de vetores susceptveis, cada espcie de vrus sendo capaz de replicar em uma ou poucas espcies de mosquitos.
6.1.2 Epidemiologia
A distribuio dos subtipos do complexo VEEV nas Amricas, de acordo com os surtos ocorridos no ltimo sculo, est apresentada na Figura 23.6. Os vrus enzoticos so mantidos perenemente em ciclos silvestres silenciosos (sem causar doena em espcies domsticas) nas orestas e regies pantanosas da Amrica Central e Norte-Noroeste da Amrica do Sul. Os VEEV epizoticos tm sido associados com epizootias peridicas em eqinos, algumas vezes associadas com epidemias em humanos, principalmente no Norte e Noroeste da Amrica do Sul. As reas
604
Captulo 23
Tabela 23.2. Alfavrus do complexo VEEV, padres de transmisso, espcies afetadas, vetores e distribuio
Subtipo Espcie (vrus) VEEV VEEV Variante AB C D E F Padro de Patgeno transmisso eqino Epizotica Epizotica Enzotica Enzotica Enzotica Enzotica A
B (Bijou
Distribuio
Vetor Mosquitos mamiferoflicos Mosquitos mamiferoflicos C.aikenii; C.vomerifer, C.pedroi,C. adamesi C.taeniopus Desconhecido C.cedecei C.portesi Oecieus vicarius Desconhecido Desconhecido Desconhecido Desconhecido C. delpontei
Sim Sim No
Amricas (Sul,
Amrica do Sul Amrica do Sul e Central
VEEV VEEV
Varivel Amrica Central e Mxico ? No No ? ? ? ? ? ? Brasil Sul da Flrida (EUA) Amrica do Sul Amrica do Sul e do Norte Oeste do Peru Oeste do Peru Brasil Brasil Norte da Argentina
Mosso das Pedras
II
Everglades Mucambo Tonate
Enzotica Enzotica Enzotica Enzotica Enzotica Enzotica Enzotica
III
Mucambo Mucambo
C (71D1252) D (V407660)
IV V VI
Pixuna Cabassou Rio Negro
Fonte: adaptado de Weaver et al. (2004)
de ocorrncia de cada sorotipo so exclusivas e auto-excludentes e estendem-se desde o Norte da Argentina at as Montanhas Rochosas nos EUA. Uma exceo a ocorrncia concomitante de trs subtipos (IC, IIIC e IIID) na Floresta Amaznica peruana. A especicidade das interaes entre as diferentes espcies de vrus, seus vetores e hospedeiros naturais, aliada existncia de barreiras naturais pode explicar a delimitao geogrca dessas viroses. No entanto, alguns subtipos ou variantes tm sido ocasionalmente identicados fora de seus nichos ecolgicos originais. Pelo menos dez espcies de mosquitos podem participar da epidemiologia e transmisso dos vrus da VEE, incluindo os gneros Culex sp. e Aedes sp., e a ecincia de transmisso varia entre as diferentes espcies de vetor e de vrus. Os hospedeiros naturais dos vrus do complexo VEE so pequenos mamferos (principalmente roedores). Os vrus enzoticos so mantidos na natureza por ciclos alternados nessas espcies e em
mosquitos. Os roedores parecem desempenhar um papel preponderante como hospedeiros desses vrus nas diversas regies de ocorrncia. Pequenos marsupiais e morcegos tambm tm sido sugeridos como possveis hospedeiros. Embora as aves no possuam papel importante como reservatrios, pssaros costeiros podem participar da disseminao desses agentes. Os vrus enzoticos geralmente no causam doena em eqinos; no entanto, casos espordicos de doena febril e, ocasionalmente, encefalites tm sido descritos em humanos. A origem dos VEEV epizoticos, associados com surtos peridicos de encefalite em eqinos e humanos, constituiu-se em um tema de intensas investigaes durante dcadas. As epizootias ocorriam aproximadamente a cada dez anos, sem atividade viral detectvel nos intervalos entre os surtos. Uma caracterstica comum dessas epizootias era a participao de eqinos na amplicao do vrus. Embora humanos, ovinos, ces, roedo-
Togaviridae
605
res, morcegos e algumas espcies de aves sejam susceptveis aos VEEV epizoticos. Em todas as epidemias reportadas havia o envolvimento preponderante de eqinos. Evidncias recentes indicam que os VEEV epizoticos surgem esporadicamente a partir de mutaes de VEEV enzoticos (principalmente do tipo ID), ou seja, os VEEV enzoticos, avirulentos e pouco capazes de serem amplicados em eqinos seriam mantidos na natureza atravs de ciclos alternados em pequenos mamferos e insetos. Mutaes espordicas nesses vrus resultariam em variantes com espectro de hospedeiro e virulncia alterados
(VEEV epizoticos), capazes de serem amplicados e causarem doena grave em eqinos (Figura 23.7). O surgimento de VEEV epizoticos a partir de vacinas mal inativadas tambm parece ter contribudo para algumas epizootias. Recentemente foi demonstrado que os VEEV epizoticos podem se manter na natureza por vrios anos aps o trmino das epizootias, embora o mecanismo de persistncia ainda no tenha sido determinado. Infeces agudas ou persistentes em outras espcies animais (bovinos, roedores) e a utilizao de outros artrpodes como vetores tm sido sugeridos para explicar essa persistncia. A
1971 subtipo IAB 1925-38, 1941-3, 1949, 1959, 1968-9, 1973 subtipo IAB 1962-4, 1992-3, 1995 subtipo IC 1969-1972 subtipo IAB 1952, 1967-68 subtipo IAB
1993, 1996 subtipo IE
1925-1946, 1950, 1958, 1969, 1973 subtipo IAB
1942-1946 subtipo IAB
Fonte: adaptada de Weaver et al. (2004).
Figura 23.6. Ocorrncia e distribuio de surtos associados com os diferentes subtipos do complexo VEEV nas Amricas.
606
Captulo 23
Ciclo Epizotico Ciclo Enzotico

Mutao/ seleo
(-)
Figura 23.7. Histria natural e epidemiologia dos VEEV enzoticos e epizoticos.
transmisso vertical do vrus prognie, atravs da infeco dos ovos, pode contribuir para a manuteno do vrus na populao de mosquitos. Uma vez gerados por mutaes dos vrus enzoticos, os VEEV epizoticos podem utilizar uma variedade de espcies de mosquitos para a sua disseminao. Devido ampla e rpida disseminao que ocorre entre eqinos e proximidade desses animais com humanos, as epizootias esto freqentemente associadas com epidemias em pessoas. Esses episdios tm apresentado dimenses variveis desde casos isolados at dezenas de milhares de casos. Embora possvel, a participao de humanos na amplicao e disseminao dos VEEV nas grandes epidemias parece ser limitada, devido exposio restrita dos humanos aos mosquitos vetores. No entanto, o potencial de disseminao dos VEEV epizoticos por mosquitos urbanos, como o Aedes aegypti, no deve ser negligenciada. Uma grande epidemia que ocorreu nos arredores de Maracaibo (Venezuela) sugere que outros vetores e/ou transmisso entre humanos possam ter participado da disseminao do agente. Outros insetos (moscas, carrapatos e outros caros) podem,
ocasionalmente, participar da transmisso mecnica dos VEEV. Uma caracterstica nica que diferencia os VEEV dos outros alfavrus a sua alta infectividade em aerossis. Com isso, o vrus poderia infectar hospedeiros por inalao. A importncia dessa via de transmisso na epidemiologia da infeco desconhecida, porm parece ser limitada.

Aps a inoculao pela picada do mosquito vetor, o vrus replica em tecidos prximos ao local de inoculao e nos linfonodos regionais, produzindo uma viremia primria. A replicao secundria ocorre em rgos linfides e em tecidos musculares, resultando em uma viremia secundria e eventual invaso do crebro. O vrus tambm pode replicar no trato respiratrio superior, pncreas e fgado. A partir do sangue, o vrus pode invadir o crebro por transporte passivo atravs do endotlio vascular, replicao nas clulas endoteliais, infeco do plexo coride e epndima e/ou por transporte no interior de mo-
Togaviridae
607
ncitos e linfcitos. Em animais de laboratrio, o VEEV parece utilizar vias nervosas para invadir o encfalo a partir da cavidade nasal ou de stios perifricos. Diferentemente de outros alfavrus, os stios preferenciais de replicao do VEEV fora do SNC so os rgos linfides. A replicao do VEEV est associada com depleo linfide na medula ssea e destruio de linfcitos nos linfonodos e bao. Os quadros de encefalite so acompanhados por vrias alteraes histopatolgicas que incluem inltrao neutroflica, degenerao neuronal, vasculite necrosante e destruio de clulas de Purkinge. A patologia da infeco pelo VEEV tem sido estudada mais detalhadamente em animais de laboratrio como hamsters, cobaias e camundongos. Aps um perodo de viremia, o vrus eliminado do sangue e tecidos perifricos aps 4 a 5 dias. A depleo linfide geralmente passageira, e os rgos linfides afetados retornam sua aparncia e constituio quase normais aps poucos dias. O vrus pode ser detectado no crebro entre o 2 e 3 dia aps a inoculao intranasal e parece atingir o encfalo atravs dos nervos olfatrios. A invaso do encfalo aps inoculao perifrica tambm parece ter a participao de vias nervosas. No encfalo, os principais alvos do vrus so os neurnios, e quadros de encefalite clssica, com manguitos perivasculares e inltrao linfocitria, so freqentes. A infeco pelos vrus do complexo VEE tanto em eqinos como em humanos pode estar associada a uma variedade de manifestaes, indo desde infeces subclnicas at encefalite de curso fatal. Os sorotipos enzoticos (I-E, II, III e IV) so avirulentos para eqinos e, geralmente, produzem nveis baixos de viremia, sem produzir sinais clnicos. Alguns VEEV enzoticos podem ser virulentos para humanos. Os sorotipos epizoticos (IAB e IC), geralmente, produzem altos ttulos de viremia em eqinos e so virulentos para essa espcie e para humanos. A infeco em humanos, geralmente, resulta em doena febril com sinais clnicos sistmicos (hipertermia, calafrios, letargia, cefalia). O envolvimento do sistema nervoso central (encefalite) ocorre apenas esporadicamente (menos de 0,5% dos adultos e at 4% das crianas) e mais
leve do que os quadros associados com o EEEV e WEEV. Os sinais iniciais de letargia, sonolncia e confuso mental leve podem progredir para vertigens, ataxia, rigidez na nuca, paralisia e coma, em casos severos. Em epidemias com sorotipos epizoticos altamente neurovirulentos, quadros de encefalite podem ser observados em 4 a 14% das pessoas infectadas. A infeco de eqinos com os VEEV epizoticos seguida do aparecimento de sinais clnicos sistmicos (hipertermia, depresso, taquicardia, anorexia) entre o 2 e 5 dia ps-infeco. O percentual de animais que evolui para a infeco neurolgica e morte varivel e parece estar diretamente relacionado com o nvel de viremia produzido. Os VEEV epizoticos, geralmente, produzem altos ttulos de viremia, o que parece ser raro entre os vrus enzoticos. Isso sugere que a neurovirulncia est associada com a capacidade do vrus de replicar em tecidos extraneurais e, a partir da, invadir o crebro. A progresso da enfermidade sistmica para a morte, sem a ocorrncia de manifestaes neurolgicas, relativamente freqente. Nos animais que evoluem para a infeco neurolgica, os sinais especcos geralmente so observados de 5 a 10 dias aps a infeco. Esses animais podem apresentar incoordenao motora, andar em crculos, cegueira parcial, fotofobia, diculdade de deglutio, bruxismo e hiperexcitabilidade. Em fases avanadas, podem ocorrer ataxia, paralisia, decbito e convulses. Em infeces experimentais, a morte ocorre aproximadamente sete dias aps o incio dos sinais clnicos. Em surtos naturais causados por VEEV epizoticos, a taxa de letalidade pode atingir 50 a 70% dos animais acometidos. Os animais que se recuperam podem permanecer com seqelas neurolgicas. Outros animais domsticos, como ces, caprinos, ovinos e coelhos, tambm so freqentemente afetados durante as epizootias e podem desenvolver doena febril e encefalite fatal.
6.1.4 Imunidade
A infeco natural pelo VEEV induz imunidade de longa durao, provavelmente por toda a vida do animal. A proteo contra vrus heterlogos pode ocorrer e depende do grau de similaridade antignica entre os vrus.
608
Captulo 23
Durante a infeco aguda, o aparecimento de anticorpos neutralizantes coincide com o desaparecimento do vrus do sangue, indicando a importncia desses anticorpos na resoluo da viremia e na recuperao da doena clnica. Em exposies subseqentes, os anticorpos neutralizantes parecem desempenhar um papel importante na preveno e limitao da replicao viral. Acredita-se que os linfcitos T citotxicos tambm desempenhem um papel importante, sobretudo, na resoluo da infeco primria.
6.1.5 Diagnstico
O diagnstico da enfermidade em eqinos deve considerar os aspectos clnicos (doena sistmica progressivamente grave, podendo estar associada com sinais neurolgicos), epidemiolgicos (histrico da doena na regio, presena e exposio a mosquitos vetores, outros eqinos afetados). Sinais tpicos de encefalite em regies endmicas devem ser considerados potencialmente suspeitos de infeco pelo VEEV e investigados. No entanto, quadros de encefalite bem caracterizados nem sempre esto presentes, o que pode confundir a suspeita inicial. Alm disso, animais infectados pelo VEEV tambm podem morrer subitamente, sem manifestar sinais clnicos evidentes. A enfermidade causada pelo VEEV pode ser confundida com outras doenas que produzem manifestaes neurolgicas, como as encefalites do oeste (WEE) e do leste (EEE), pelo vrus do Nilo Ocidental (WNV), peste eqina, ttano, raiva, meningite bacteriana e algumas intoxicaes. Essas doenas devem ser consideradas para o diagnstico diferencial. O diagnstico denitivo requer a realizao de testes sorolgicos e/ou isolamento e identicao do vrus e/ou de antgenos virais. O diagnstico laboratorial mais empregado em eventos epidmicos a sorologia. Testes imunoenzimticos de captura (ELISA), para detectar imunoglobulinas da classe IgM especcas para o VEEV, so utilizados no diagnstico da infeco aguda. A conrmao pode ser realizada por testes de soro-neutralizao (SN) ou inibio da hemaglutinao (HI) com amostras pareadas de soro.
O isolamento do vrus de animais doentes difcil, pois a viremia geralmente transitria. Em animais que morrem ou so sacricados, tentativas de isolamento do vrus do crebro podem produzir bons resultados. Inoculao intracerebral em camundongos lactentes ou em clulas de cultivo (Vero, BHK-21) so os mtodos mais utilizados em tentativas de isolamento do agente. Tcnicas moleculares de deteco de cidos nuclicos virais (RT-PCR) ou protenas (imunoistoqumica) tm sido implementadas na rotina laboratorial e permitem a deteco do agente em uidos corporais, em tecidos frescos ou xados. Em casos de isolamento positivo (efeito citoptico nos cultivos, doena neurolgica e morte nos camundongos), o agente deve ser identicado por tcnicas imunolgicas, utilizando-se anticorpos monoclonais ou policlonais especcos. A diferenciao entre sorotipos particularmente importante para diferenciar-se entre os VEEV enzoticos e epizoticos. Nesses casos, a diferenciao pode ser realizada por testes de HI e SN ou por seqenciamento de regies especcas do genoma.

A medida mais eciente para prevenir a ocorrncia de casos de VEE em regies endmicas a vacinao sistmica de eqinos. Programas ociais de vacinao com distribuio gratuita de vacinas tm sido implementados durante e aps os surtos na Venezuela, Colmbia e Mxico. Esses programas tm sido ecientes para limitar a circulao de vrus e a ocorrncia da doena. Infelizmente, esses programas no so mantidos por longo tempo aps os surtos. Como conseqncia, a imunidade da populao se reduz gradativamente e atinge nveis baixos em 5 a 10 anos e tambm pela substituio gradativa dos animais imunizados. A vacina viva modicada TC-83 tem sido amplamente utilizada em vrios pases da Amrica Latina e produz imunidade rpida e duradoura. Essa vacina foi obtida por 83 passagens do VEEV em clulas de corao suno e produzida no Mxico, Venezuela e Colmbia. utilizada para vacinar eqinos durante surtos e tambm
Togaviridae
609
em perodos sem atividade viral detectvel e tambm para vacinar tcnicos de laboratrio que trabalham com o agente. Uma verso multivalente inativada da TC-83, contendo tambm antgenos do EEEV e WEEV, tem sido utilizada nos EUA e em alguns pases da Amrica do Sul. A imunidade induzida por essa vacina deixa a desejar e, por isso, no recomendada para regies endmicas. Recentemente, uma vacina geneticamente manipulada (cepa 3526) foi desenvolvida e, provavelmente, ir substituir a TC-83, tanto para eqinos como para humanos. A limitao do movimento de eqinos durante os surtos no tem sido efetiva no controle desses eventos, pois os animais so assintomticos durante um a trs dias aps a infeco. O controle de mosquitos por inseticidas aplicados por via area foi utilizado em alguns surtos que apresentam envolvimento humano. A preveno da infeco humana pode ser obtida evitando-se a exposio aos mosquitos vetores e pelo uso de repelentes. Essas medidas so particularmente importantes para pessoas que vivem ou trabalham nas proximidades de eqinos em regies endmicas com grande atividade dos vetores (vrzeas, orestas) e durante os surtos.
antignicos norte e sul-americanas com base em testes de HI.
6.2.1 Epidemiologia
O vrus mantido em reas alagadias de gua salgada ou doce, prximas regio costeira, em ciclos que envolvem vrias espcies de pssaros silvestres e uma espcie principal de mosquito, o Culiseta melanura. Esse mosquito se alimenta apenas em aves e no transmite o agente a outros hospedeiros. As aves infectadas normalmente no desenvolvem enfermidade. O EEEV, geralmente, aparece nas populaes de pssaros no nal da primavera, amplicado pela transmisso entre pssaros durante o vero e atinge nveis muito altos no nal do vero e no incio do outono. Em algumas regies, como o sul do estado de New Jersey, esse ciclo ocorre durante todo o ano. Em alguns anos, a infeco permanece restrita aos pssaros sem o envolvimento de eqinos e humanos. No entanto, sob certas condies climticas, as populaes de vetores e vrus podem ser amplicadas de tal maneira que proporcionem condies para que o vrus escape de seu nicho ecolgico. Nessas situaes, mosquitos que se alimentam em aves e em mamferos podem adquirir o vrus ao se alimentar em aves durante a fase virmica e transmiti-lo a outras espcies (principalmente eqinos e humanos). Os mosquitos de vrzeas de gua doce, Coquilletidia perturbans, e de gua salgada, Ochlerotatus sollicitans, so os principais transmissores do agente aos eqinos, e parecem se constituir no elo de ligao entre o ciclo silvestre e os animais domsticos. Os eventos de escape do vrus de seu habitat e a transmisso a outras espcies podem ocorrer em nveis baixos ao longo do ano, mas so mais freqentes e epidemiologicamente importantes da segunda metade do vero at o incio do outono. Nessa poca, casos de enfermidade em pessoas, eqinos e em outras espcies de animais domsticos ocorrem com maior freqncia. A transmisso aos eqinos ocorre exclusivamente pela picada de mosquitos que haviam previamente realizado repasto sangneo em aves virmicas.
6.2 Encefalite eqina do leste

O vrus da EEE um dos membros do complexo das encefalites eqinas, antigenicamente relacionado, mas distinto do VEEV e WEEV. O agente tem sido identicado no Norte da Amrica do Sul, Brasil, Amrica Central e Caribe, mas a infeco ocorre, principalmente, em vrzeas e regies pantanosas prximas ao litoral do oceano Atlntico e Golfo do Mxico no Sudeste dos Estados Unidos. O EEEV j foi esporadicamente detectado em reas continentais mais internas dos Estados Unidos. O envolvimento humano espordico, com apenas 163 casos tendo sido reportados nos EUA desde 1964. Por outro lado, os eqinos e tambm criaes de aves domsticas (faises e emas) tm sido freqentemente afetados. Outras espcies domsticas, como ces, tm sido esporadicamente afetadas. Os vrus da EEE so tradicionalmente classicados em variantes
610
Captulo 23
Alm do envolvimento de eqinos, surtos do EEEV tm sido descritos em criaes de faises, emas, frangos de corte, marrecos-de-pequim e de algumas aves silvestres ameaadas de extino. A infeco introduzida e transmitida nessas criaes por mosquitos vetores. ndices considerveis de morbidade, mortalidade e prejuzos econmicos tm sido relatados. Por isso, vacinas de uso eqino tm sido utilizadas para minimizar o impacto econmico e ecolgico desses eventos.
6.2.3 Diagnstico
O diagnstico clnico-epidemiolgico deve ser conrmado por testes laboratoriais. A deteco de IgM na fase aguda por testes imunoenzimticos o mtodo de eleio. Sorologia pareada por SN ou HI tambm podem ser realizadas. O isolamento do vrus do sangue dicultado pela transitoriedade da viremia. Deteco de cidos nuclicos virais no sangue ou em tecidos (por PCR) e de protenas em cortes de tecidos congelados ou paranizados (por imunoistoqumica) tambm tm sido utilizados.

A infeco em eqinos pode cursar com uma variedade de manifestaes clnicas, que vo desde infeco inaparente, doena sistmica sem sinais neurolgicos, at doena neurolgica e morte. O perodo de incubao de, aproximadamente, cinco dias, aps o qual os animais comeam a apresentar hipertermia, depresso, anorexia, sonolncia e fraqueza. A doena neurolgica mais pronunciada e severa do que nas infeces pelo WEEV e VEEV e cursa com distrbios visuais (cegueira parcial ou total), fotofobia, bruxismo, disfagia, incoordenao motora, pressionamento da cabea contra anteparos, andar em crculos, ataxia, paralisia, coma e morte. Irritabilidade e agressividade tambm podem ocorrer. A taxa de letalidade pode atingir 90%. Os animais que se recuperam aps um curso leve podem apresentar seqelas neurolgicas. A patologia similar s outras encefalites, porm sem o envolvimento do sistema linforreticular, como observado na infeco pelo VEEV. Em humanos, a infeco pode causar uma variedade de manifestaes. A maioria dos indivduos infectados no apresenta sinais clnicos; uma parcela apresenta sinais inespeccos (hipertermia, cefalia, calafrios, faringite); e poucos demonstram envolvimento neurolgico, com febre abrupta, cefalias severas, vertigens, rigidez na nuca, coma e morte. Aproximadamente a metade destes pacientes vai a bito. comum (aproximadamente 35%) a ocorrncia de seqelas neurolgicas permanentes nos indivduos que sobrevivem doena neurolgica.

A vacinao de eqinos nas reas endmicas o mtodo mais eciente de controle. Vacinas monovalentes, bivalentes (+WEEV) e trivalentes (WEEV+VEEV) inativadas tm sido utilizadas nessas reas. No h vacinas para uso humano. A preveno da infeco humana deve basear-se na preveno exposio aos vetores e no uso de repelentes nas reas endmicas.
6.3 Encefalite eqina do oeste

A WEE causada por um alfavrus (WEEV) antigenicamente relacionado com o EEEV (84% de homologia de aminocidos) e pertencente ao mesmo grupo antignico do SIN. O WEEV parece ter se originado de recombinao entre o VEEV e um vrus do grupo do Sindbis. Tanto o WEEV como o EEEV apresentam uma alta freqncia de mutaes e recombinaes. A caracterizao gentica do WEEV tem sugerido que esses vrus se originam de isolados enzoticos por mutaes e seleo. Os vrus enzoticos so aparentemente avirulentos para eqinos. A enfermidade foi, inicialmente, descrita nos Estados Unidos em 1930. Em 1941, uma epizootia/epidemia atingiu 300.000 eqinos e mais de 3.000 pessoas. Desde ento, eventos epidmicos de pequenas propores ou casos isolados tm sido ocasionalmente relatados. De 1964 at 2005, foram descritos 639 casos em pessoas. A maioria dos casos envolveu pessoas que vivem ou adquiriram a infeco no meio rural, habitat dos reservatrios naturais do
Togaviridae
611
agente. Embora j tenha sido detectada em outros pases das Amricas, a infeco pelo WEEV ocorre principalmente nas plancies e vales do Centro e Oeste dos EUA e Sul do Canad.
6.3.1 Epidemiologia
A expanso da agricultura irrigada nas plancies e vales da regio Central e Oeste dos EUA e no Canad criou condies que favoreceram a perpetuao do agente. O WEEV mantido em ciclos alternados em pssaros e outras aves silvestres (e tambm domsticas) e insetos. Os mosquitos do gnero Culex sp. parecem ser os principais vetores, embora os A. melanimon e A. dorsalis tambm sejam vetores ecientes. A agricultura irrigada e as condies climticas apropriadas favorecem a ocorrncia de superpopulaes de Culex tarsalis e a conseqente manuteno da infeco. Pssaros silvestres que se alimentam de gros nessas lavouras constituem-se nos reservatrios naturais e amplicadores do vrus. O ciclo natural do agente envolve principalmente pssaros, mas pode envolver tambm pequenos mamferos silvestres. Os eqinos e humanos so hospedeiros acidentais e parecem no participar do ciclo de transmisso do agente. A capacidade do WEEV em replicar em mosquitos a temperaturas relativamente baixas permite a ocorrncia da infeco desde o incio do vero at incio do outono, e tambm em algumas regies do Canad.
leves (hipertermia, cefalia e sonolncia); raramente ocorrem sinais neurolgicos severos, encefalite e coma. A doena geralmente mais branda do que a associada com o EEEV, mas geralmente mais grave em crianas, podendo atingir ndices de fatalidade de at 10%.
6.3.3 Diagnstico
O diagnstico clnico-epidemiolgico deve ser conrmado por testes laboratoriais. Os mesmos procedimentos utilizados para o VEEV so recomendados para a conrmao laboratorial da infeco pelo WEEV.

A vacinao de eqinos com uma vacina multivalente inativada (VEEV, EEEV e WEEV) constitui-se na base dos programas de controle em reas endmicas. A vacinao , geralmente, realizada antes do vero, em duas doses, com intervalo de 14 a 21 dias, seguidas de revacinaes anuais. Em reas de atividade de vetores durante o ano inteiro, os potros devem ser vacinados aos 3-6 meses de idade e revacinados anualmente. No h vacinas disponveis de uso humano. Medidas de controle/preveno em reas endmicas incluem a preveno exposio aos vetores e/ou uso de repelentes. A maior atividade dos vetores ocorre no crepsculo e durante a noite.

A infeco de eqinos pelo WEEV pode variar desde subclnica at encefalite de curso fatal. O quadro de encefalite geralmente mais freqente e mais caracterstico do que nas infeces pelo VEEV, mas geralmente menos severo do que na infeco pelo EEEV. As manifestaes clnicas so semelhantes. A patogenia e patologia so similares ao VEEV e EEEV, porm sem o envolvimento linforreticular e sistmico (fgado, bao e sistema respiratrio) observado nas infeces pelo VEEV. Os ndices de fatalidade podem atingir entre 20 e 40% dos animais afetados. A infeco humana acidental e geralmente cursa de forma subclnica ou com sinais clnicos
BRUNO-LOBO, G.; BRUNO-LOBO, M.; TRAVASSOS, J.; PINHEIRO, F.; PAZIN, I. P. Estudos sobre arbovrus. III. Isolamento de vrus sorologicamente relacionado ao sub-grupo Weaster Sindbis de um caso de encefalomielite eqina no Rio de Janeiro. An. Microbiol. v.9, pt.A, p. 183-1, 1961. CALISHER, C. H.; KINNEY, R. M.; DE SOUZA LOPES, O.; TRENT, D. W.; MONATH, T. H.; FRANCY, D. B. Identication of a new Venezuelan equine encephalitis virus from Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg. v.31, n. 6, p. 1260-1272, Nov. 1982. FARRAR, M.D.; MILLER, D.L.; BALDWIN, C.A.; STIVER, S.L.;HALL, C.L. Eastern equine encephalitis in dogs. J.Vet. Diagn.Invest. v. 17, n. 6, p. 614-617, 2005. FERREIRA, I. B.; PEREIRA, L. E.; ROCCO, I. M.; MARTI, A. T.; SOUZA, L. T. M.; IVERSSON, L. B. Surveillance of arbovirus infections in the atlantic forest region, state of So Paulo, Brazil. I:
612
Detection of hemaglutination-inhibiting antibodies in wild birds between 1987 and 1990. Rev. Inst. Med. Trop. So Paulo. v.36, p. 265-274, 1994. FERNANDEZ, Z.; RICHARTZ, R.; TRAVASSOS DA ROSA, A.; SOCCOL, V. T. Identication of the encephalitis equine virus, Parana, Brazil. Rev. Saude Publica. v. 34, n.3, p. 232-235, jun. 2000. IVERSSON, L. B.; SILVA, M. S.; TRAVASSOS DA ROSA, A. P. A.; BARROS, R. S. V. Circulation of Eastern equine encephalitis, Western equine encephalitis, Ilhus, Maguari and Tacaiuma viruses in equines of the Brazilian Pantanal, South America. Rev. Inst. Med. Trop. So Paulo. v. 35, p. 355-359, 1993. JOHNSON, K. M.; MARTIN, D. H. Venesuelan Equine Encephalitis. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. v.18, p. 79-116, 1974. JOHNSTON, ROBERT E.; PETERS, C. J. Alphaviruses. In: Fields virology, third edition. Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, et al. Lippincott: Raven, 1996. KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M. eds. Fields virology. 4th. ed. New York: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. MURPHY, FREDERICK A.; GIBBS E. P. J.; HORZINEK, MARIAN C.; STUDDERT, MICHAEL J. Togaviridae. In: Veterinary virology. 3th. ed., 1999. NAVARRO, JUAN-CARLOS; MEDINA, GLADYS; VASQUEZ, CLOVIS; COFFEY, LARK L.; WANG, ERYU; SUREZ, ALEXANDER; BIORD, HERNN; SALAS, MARLENE; WEAVER, SCOTT C. Postepizootic Persistence of Venezuelan Equine Encephalitis Virus, Venezuela. Emerging Infectious Diseases. www.cdc.gov/eid . v. 11, n. 12, Dec. 2005. RICHARTZ R. R. T. Deteco de anticorpos inibidores de hemaglutinao para Alphavrus em soro de eqinos do estado do Paran [dissertao]. Curitiba(PR): Universidade Federal do Paran; 1994. RICO-HESSER, R.; WEAVER, S. C.; DE SIGER, J.; MEDINA, G.; SALAS, R. A. Emergence of a new epidemic/epizootic Venezuelan equine encephalitis virus in South America. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92:5278-81.
Captulo 23
RIVAS, F.; DIAZ, L. A.; CARDENAS, V. M.; DAZA, E.; BRUZON, L.; ALCALA, A. et al. Epidemic Venezuelan equine encephalitis in La Guajira, Colombia, 1995. J. Infect. Dis. 1997; 175:828-32. ROMANO-LIEBER, N. S.; IVERSSON, L. B. Serological survey on arbovirus infection in residents of an ecological reserve. Rev. Saude Pblica. 2000 Jun; 34(3):236-42. SCHLESINGER, SONDRA; SCHLESINGER J. MILTON. Togaviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fundamental Virology, Third Edition edited by B. N. Fields; D. M. Knipe; P. M. Howley, et al. Lippincott Raven Publishers, Philadelphia 1996. WALDER, R.; SUAREZ, O.M.; CALISHER C. H. Arbovirus studies in the Guajira region of Venezuela: activities of Eastearn equine encephalitis and Venezuelan equine encephalitis viruses during na interepizootic period. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1984; 33: 699-707. WALTON, T. E.; ALVAREZ O. Jr.; BUCKWALTER, R. M.; JOHNSON, K. M. 1973. Experimental infection of horses with enzootic and epizootic strains of Venesuelan Equine Encephalomyelitis Virus. J. Infect. Dis. 128:271-82. WANG, E.; BOWEN, R. A.; MEDINA, G.; POWERS, A. M.; KANG, W; et al. 2001. Virulence and viremia characteristics of 1992 epizootic subtype IC Venezuelan equine encephalitis viruses and closely related enzootic subtype ID strains. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:64-69. WEAVER, S.C. Host range, amplication and arboviral disease emergence. Arch.Virol. Suppl. 2005: 19:33-44. WEAVER, SCOTT C.; FERRO, CRISTINA; BARRERA, ROBERTO; BOSHELL, JORGE; NAVARRO, JUAN-CARLOS. Venezuelan Equine Encephalitis. Annu. Ver. Entomol. 2004. 49:141-74. WEAVER, S. C.; PFEFFER, M.; MARRIOTT, K.; KANG W.; KINNEY, R. M. Genetic evidence for the origins of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IAB outbreaks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999; 60:441-8.
CORONAVIRIDAE
Luciane Teresinha Lovato & Renata Dezengrini
24
615 615 615 618 620
620 621 621 622 622 623 623 623 623 624 624 625 625 626 626 626 627 627 628 628 628 629
1 Introduo 2 Classicao 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 Replicao 5 Coronavrus de interesse veterinrio

5.1 Vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 5.1.3 Imunidade 5.1.4 Diagnstico 5.1.5 Preveno e controle 5.2 Coronavrus respiratrio dos sunos 5.3 Vrus da diarria epidmica dos sunos 5.4 Vrus da encefalomielite hemaglutinante dos sunos 5.5 Coronavrus felino e vrus da peritonite infecciosa dos felinos 5.5.1 Epidemiologia 5.5.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 5.5.3 Imunidade 5.5.4 Diagnstico 5.5.5 Preveno e controle 5.6 Coronavrus canino 5.6.1 Epidemiologia 5.6.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 5.6.3 Imunidade 5.6.4 Diagnstico 5.6.5 Preveno e controle 5.7 Coronavrus canino respiratrio
5.8 Coronavrus bovino 5.8.1 Epidemiologia 5.8.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 5.8.3 Imunidade 5.8.4 Diagnstico 5.8.5 Preveno e controle 5.9 Vrus da bronquite infecciosa das galinhas 5.9.1 Epidemiologia 5.9.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 5.9.3 Imunidade 5.9.4 Diagnstico 5.9.5 Preveno e controle 5.10 Coronavrus dos perus 6 Torovrus de interesse veterinrio 6.1 Vrus Berne eqino 6.2 Vrus Breda bovino
629 630 630 631 631 631 632 632 632 633 634 634 634 635 635 635
7 Coronavrus humanos 8 Bibliograa consultada
636 636
1 Introduo
A famlia Coronaviridae possui dois gneros: o Coronavirus e o Torovirus. Os Coronavirus so vrus RNA envelopados, possuem o maior genoma conhecido entre os vrus RNA e esto envolvidos principalmente em doenas respiratrias e digestivas de animais e humanos. Em algumas enfermidades especcas, outras manifestaes, como a poliserosite, miocardite, hepatite, encefalomielite, nefrite e imunopatologias, podem estar associadas com patgenos desse gnero. O envelope desses vrus apresenta longas espculas que do partcula viral um aspecto tpico de coroa, derivando da o nome da famlia. Outro aspecto importante desses vrus o complexo mecanismo de replicao viral, que inclui a produo de RNAs mensageiros (mRNA) subgenmicos. Essa forma complexa de replicao resulta em uma alta freqncia de recombinaes. Por essa razo, muitos desses vrus apresentam uma grande variao antignica, com a existncia de vrios sorotipos circulantes. Importantes doenas vricas de animais domsticos, como a bronquite infecciosa das galinhas, a gastrenterite transmissvel dos sunos e a peritonite infecciosa dos felinos tm como agente etiolgico algum dos coronavrus. O interesse por essa famlia aumentou recentemente devido classicao de um novo coronavrus humano, o vrus da pneumonia asitica (SARS-COV). Os coronavrus humanos conhecidos antes do aparecimento do vrus da SARS eram pouco patognicos e, principalmente, envolvidos em resfriados comuns. No gnero Torovirus, esto classicados apenas dois vrus que causam doena em animais. Os patgenos animais desse gnero causam diarria, sendo que o vrus Berne (BEV) infecta eqinos e o vrus Breda (BRV) infecta bovinos. Neste captulo, sero discutidos alguns aspectos gerais da famlia Coronaviridae e das doenas de interesse veterinrio com nfase para os vrus do gnero Coronavirus. Alguns tpicos especcos abordados para os vrus do gnero Torovirus sero mencionados no texto.
2 Classicao
Os vrus da famlia Coronaviridae esto classicados na ordem Nidovirales, juntamente com as famlias Arteriviridae e Roniviridae. Esses vrus apresentam diferenas morfolgicas, mas so agrupados nessa ordem por possurem uma estratgia nica e comum de replicao. A expresso gnica desses vrus ocorre pela transcrio de vrios mRNAs subgenmicos, sintetizados a partir de um RNA intermedirio de polaridade negativa. Os coronavrus so subdivididos em trs grupos (grupos I, II e III), de acordo com a sua reatividade sorolgica. Dentro desses grupos, os vrus so classicados de acordo com o seu hospedeiro natural, com a seqncia de nucleotdeos e relaes sorolgicas. Na Tabela 24.1, so apresentados os vrus que compem os gneros Coronavirus e Torovirus.

Os coronavrus possuem vrions envelopados e pleomrcos cujo dimetro pode variar de 80 a 120 nm, apresentando um dimetro mdio de 100 nm. A aparncia desses vrus, quando observados na microscopia eletrnica (ME), deu origem ao nome da famlia. Os vrions possuem geralmente uma forma esfrica, com o envelope circundado por peplmeros ou projees externas de aproximadamente 20 nm de extenso, que conferem partcula uma aparncia similar a uma coroa. Essas projees externas so formadas pelas glicoprotenas S da superfcie do envelope viral. Na Figura 24.1, apresenta-se uma foto de ME e um esquema da estrutura dos vrions da famlia Coronaviridae. A glicoprotena S apresenta uma massa molecular entre 150 e 180 kd e possui trs domnios; um domnio externo maior, que, em algumas espcies, dividido em dois domnios (S1 e S2); um domnio transmembrana e um pequeno domnio interno. Essa glicoprotena responsvel pela ligao dos vrions aos receptores celulares, induz
616
Captulo 24
Tabela 24.1. Classificao dos coronavrus em grupos de acordo com a reatividade sorolgica.
Grupo antignico
Vrus
TGEV PRCoV
Hospedeiro
Suno Suno Suno Gatos Gatos Ces Humanos Suno Bovino Perus Camundongos Humanos Galinhas Bovinos Bovinos Eqinos Eqinos Humanos Sunos
Doena
Gastrenterite Respiratria, subclnica Gastrenterite Peritonite Enterite, assintomtica Enterite Resfriado comum Encefalite, definhamento Gastrenterite Enterite Hepatite Resfriado comum Traqueobronquite, nefrite Subclnica Gastrenterite Subclnica Gastrenterite Gastrenterite Subclnica
PEDV FIPV
Coronavirus
FCoV CCoV HCoV-229E HEV
II
BCoV TCoV MHV HCoV-OC43
III
IBV BToV
Torovirus
BRV EToV BEV HToV PToV
B
M E S
RNA
Fonte: A) PHIL Library, CDC.
Figura 24.1. Vrions da famlia Coronaviridae. A) Microscopia eletrnica de vrions do SARS-Co B) Ilustrao esquemtica de um vrion com os seus componentes. M: protena de membrana; E, S: glicoprotenas do envelope; N: nucleoprotena.; RNA: genoma.
Coronaviridae
617
a fuso do envelope com a membrana plasmtica e apresenta importantes stios antignicos que induzem a produo de anticorpos neutralizantes e induzem a resposta imune celular. No envelope, tambm esto presentes vrias cpias da protena M, que uma protena de membrana que possui um pequeno domnio externo, um domnio com trs passagens atravs da membrana e um grande domnio interno. A protena M interage com o nucleocapsdeo, atua na morfognese e brotamento dos vrions e forma o revestimento do ncleo (core) do vrion. Recentemente foi identicada outra pequena protena do envelope, que tambm parece estar envolvida na morfognese dos vrions no nal da replicao, denominada protena E, sobre a qual pouca informao est disponvel. Alguns coronavrus apresentam ainda a protena hemaglutinina-esterase (HE). A HE possui atividade de acetilesterase e responsvel pela clivagem do cido silico. Essa protena parece no ser essencial para a replicao dos vrus, mesmo naqueles que a possuem na sua superfcie. Por outro lado, a presena da HE pode inuenciar a patogenicidade dos vrus em animais. A HE induz hemaglutinao e hemadsoro e, provavelmente, contribui nos processos de penetrao e liberao do vrus das clulas infectadas.
O genoma dos coronavrus uma molcula de RNA de cadeia simples e polaridade positiva. O RNA genmico pode ter de 27 a 32 kb, sendo o maior genoma entre os vrus RNA. A extremidade 5 do genoma possui uma estrutura cap e a extremidade 3 poliadenilada, como ocorre nos mRNA celulares. Nas proximidades da regio 5 do genoma se localiza uma seqncia de 65 a 98 nucleotdeos denominada lder, seguida de uma seqncia de 200 a 400 nt, que no traduzida. Prxima extremidade 3 e imediatamente anterior regio poliadenilada est presente uma regio no-traduzida (UTR) de 200 a 500 nt. A estrutura e organizao do genoma dos coronavrus est ilustrada esquematicamente na Figura 24.2. As protenas virais no-estruturais so codicadas na regio mais prxima da extremidade 5 do genoma, enquanto as protenas estruturais so codicadas prximas extremidade 3. Os dois teros iniciais do genoma correspondem ao gene L e codicam a polimerase viral (polimerase de RNA dependente de RNA replicase). Essa regio possui duas seqncias abertas de leitura (ORFs) sobrepostas, que so traduzidas em uma poliprotena no incio do ciclo replicativo. Em todos os coronavrus, a seqncia de genes no genoma 5 Pol S E M N 3. Entre esses genes
0kb
30kb
5' L
RNA genmico
Pol
3'UTR AAAAn
3'
RNA antigenmico
5' S RNAs mensageiros subgenmicos E M N

AAAAn AAAAn AAAAn AAAAn
(Fonte: adaptada de Knipe et al. (2001)
Figura 24.2. Ilustrao esquemtica do genoma dos coronavrus. L) lder; Pol) gene da replicase; S) gene da glicoprotena; E) gene da glicoprotena; M) gene da protena de membrana; N) gene da protena do nucleocapsdeo. O RNA de sentido antigenmico e os mRNAs subgenmicos produzidos durante o ciclo replicativo esto ilustrados abaixo. A protena traduzida a partir de cada um desses mRNAs est indicada.
618
Captulo 24
podem ser encontradas outras ORFs que codicam algumas protenas no-estruturais e tambm a protena HE. A presena dessas ORFs, a sua extenso, a forma de expresso e a distribuio podem variar entre os coronavrus. O genoma dos coronavrus est associado com mltiplas cpias de uma fosfoprotena viral (N), formando um nucleocapsdeo helicoidal. A protena N possui um domnio de associao ao RNA que facilita sua ligao ao genoma viral. Essa protena associa-se tambm protena M no processo de morfognese das partculas virais. Em alguns vrus, foi demonstrado que o nucleocapsdeo helicoidal est envolvido por uma estrutura interna de, aproximadamente, 65 nm de dimetro, que possui uma forma aparentemente esfrica, possivelmente icosadrica (Figura 24.1). Os coronavrus, a exemplo de outros vrus RNA, sofrem mutaes freqentes no seu genoma em funo dos erros cometidos pela RNA polimerase. Vrios mutantes ts (sensveis temperatura) do vrus da hepatite dos camundongos (MHV) j foram identicados. Alm disso, alguns coronavrus que causam doenas em animais foram originados a partir de delees no genoma de vrus preexistentes. Este o caso do coronavrus respiratrio dos sunos (PRCoV), que se originou a partir do TGEV por uma deleo no gene que codica a protena S. O surgimento de cepas mais virulentas do coronavrus felino entrico (FCoV), responsveis pela peritonite infecciosa felina (FIP), tambm parece estar relacionado com delees do genoma. A alta freqncia de recombinao outro aspecto importante na gentica dos coronavrus que pode ter reexos importantes na patogenia e na epidemiologia desses vrus. Embora os coronavrus no possuam um genoma segmentado, a alta freqncia de recombinao provavelmente possa ser explicada pela complexidade da replicao, envolvendo etapas de transcrio descontnua. O mecanismo de recombinao entre cepas de campo j deu origem a diferentes subtipos do vrus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) e alguns isolados de FCoV parecem ter se originado da recombinao entre o vrus felino e o CCoV. Uma freqncia de recombinao de 25% para todo o genoma foi observada no MHV, um dos coronavrus mais estudados.
Os vrions dos coronavrus so facilmente inativados por solventes lipdicos, agentes oxidantes, formaldedo, detergentes e desinfetantes comuns. Os vrions das diferentes espcies de coronavrus apresentam tambm uma grande sensibilidade ao calor e estabilidade ao pH cido, e alguns so estveis a pH 3.0. Os vrions possuem uma massa molecular de aproximadamente 400x106, densidade Buoyant de 1.15 1.19 g/cm3 em sucrose e 1.23 1.24 g/cm3 em CsCl.
4 Replicao
A primeira etapa da replicao dos coronavrus a ligao dos vrions, pela glicoprotena S, aos receptores na membrana celular. Esses receptores j foram identicados para alguns coronavrus, mas ainda so desconhecidos para outros. Os vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos (TGEV), da peritonite infecciosa felina (FIPV) e, provavelmente, o coronavrus canino (CCoV) utilizam a aminopeptidase N como receptor. A aminopeptidase N uma metaloprotease associada membrana plasmtica. Alguns vrus, como o coronavrus bovino (BCoV), que possuem a protena HE no envelope, podem, ainda, utilizar o cido silico como receptor. A penetrao dos vrions na clula hospedeira pode ocorrer por duas vias possveis. Pode ocorrer aps endocitose, pela fuso do envelope viral com a membrana da vescula endoctica na presena de um pH cido para alguns coronavrus (Figura 24.3). Outros coronavrus no necessitam do pH baixo para a fuso e, nesses casos, a penetrao ocorre pela fuso do envelope com a membrana plasmtica na superfcie da clula. O desnudamento do genoma ocorre logo aps a penetrao e envolve mecanismos ainda no totalmente esclarecidos. Provavelmente necessita da participao de fatores celulares. Assim que o genoma liberado no citoplasma, o gene 1 (pol) traduzido em uma poliprotena, para a produo da replicase viral e outras enzimas envolvidas com a replicao do RNA. Apesar dos coronavrus possurem um genoma de sentido positivo que serve como mRNA, os demais genes no so sintetizados pela traduo direta do RNA genmico. A polimerase viral re-
Coronaviridae
619
cm-sintetizada utiliza o RNA genmico como modelo para fazer uma cpia de RNA intermedirio de sentido negativo. A partir deste RNA negativo sero produzidas cpias de RNA de extenso genmica que sero, posteriormente, includas nas partculas virais e cpias de mRNA subgenmicos, que sero traduzidos nas demais protenas estruturais e no-estruturais necessrias para a produo da prognie viral. O nmero de mRNA subgenmicos pode variar de cinco a sete, dependendo do vrus. A extenso desses mRNA tambm varivel. Apenas a ORF mais prxima da extremidade 5 tradu-
zida, embora alguns mRNA possuam duas ou trs ORFs. Na extremidade 5 de todos os mRNA subgenmicos, encontra-se a seqncia lder, que idntica seqncia que encontrada na extremidade 5 do RNA genmico. A seqncia lder apresenta, na sua extremidade 3, uma seqncia de 7 a 18 nt, homloga a uma seqncia encontrada entre os genes do RNA genmico, denominada seqncia intergnica ou seqncia associada transcrio (TAS). A TAS do vrus da hepatite murina (MHV) possui a seqncia UCUAAAC e a extremidade 3 da seqncia lder desse vrus consiste em vrias repeties da seqncia UCUAA.
12 1
11
3
AAAAA
Golgi
7b
AAAAA AAAAA AAAAA
RER
10
AAAAA AAAAA
9 7a
AAAAA
Ncleo
Figura 24.3. Ilustrao simplificada do ciclo replicativo dos coronavrus. 1) Ligao aos receptores celulares; 2) Internalizao por endocitose (nem todos); 3) Penetrao por fuso do envelope com a membrana endoctica; 4) Traduo da regio 5 do genoma e produo da polimerase; 5) Sntese da cpia antigenmica; 6) Sntese dos mRNAs subgenmicos; 7a e 7b) Traduo dos mRNAs subgenmicos nas protenas estruturais; 8) Sntese do RNA genmico; 9) Conjugao do RNA genmico com protenas do nucleocapsdeo; 10) Brotamento do nucleocapsdeo no RER ou Golgi; 11) Transporte da prognie viral em vesculas at a membrana plasmtica; 12) Egresso por exocitose.
620
Captulo 24
O mecanismo da sntese dos mRNA subgenmicos ainda no foi esclarecido, mas h trs hipteses para explic-lo. A primeira hiptese denomina-se transcrio iniciada pela seqncia lder. Nesse caso, ocorreria inicialmente a transcrio da seqncia lder a partir da cpia negativa do RNA. Este transcrito se ligaria a qualquer seqncia intergnica e serviria como primer ou iniciador para a transcrio do mRNA a partir dessa seqncia intergnica. Outra hiptese seria a transcrio descontnua durante a sntese do RNA de cadeia negativa. Nesse modelo, a polimerase que est sintetizando a cpia de RNA negativa a partir do RNA genmico faria uma parada em uma seqncia intergnica e, em seguida, saltaria para a extremidade 3 da seqncia lder do RNA genmico copiando esta regio. Esse processo resultaria na produo de um mRNA subgenmico negativo que serviria de modelo para cpias de RNA positivo. Evidncias experimentais suportam essas duas hipteses. Uma terceira hiptese tambm tem sido descrita, embora seja menos provvel, na qual mRNA subgenmicos seriam incorporados ao vrion juntamente com o RNA genmico. Assim, os mRNA trazidos nos vrions serviriam de modelo para a sntese de cpias negativas, que seriam, ento, copiadas em novos mRNAs. A traduo dos mRNA subgenmicos ocorre em ribossomos associados membrana dos retculos endoplasmticos (RE) ou livres no citoplasma. Aps a traduo, as protenas so processadas de acordo com sua nalidade, podendo ser fosforiladas, glicosiladas e/ou clivadas. A traduo das protenas estruturais S, M e HE realizada por ribossomos na membrana do RE. Essas protenas so, posteriormente, glicosiladas e a protena S clivada em S1 e S2 em alguns coronavrus. A protena N traduzida por ribossomos livres no citoplasma e fosforilada em seguida. A protena E passa por um processo de acilao e localiza-se na regio perinuclear de clulas infectadas. A replicao do RNA ocorre em complexos de replicao associados com membranas intracitoplasmticas. Aparentemente, esses complexos so formados pelas protenas virais e, possivel-
mente, por protenas celulares associadas. Inicialmente acreditava-se que a replicao do RNA genmico deveria ocorrer de forma contnua, utilizando um RNA de cadeia negativa completo como modelo, em oposio aos mRNA subgenmicos produzidos na transcrio. Contudo, evidncias recentes demonstram que a sntese do RNA genmico tambm parece ocorrer de forma descontnua, envolvendo uma seqncia lder. A morfognese dos vrions inicia-se com a associao de mltiplas cpias da protena N com o genoma viral e a formao do nucleocapsdeo helicoidal. Em seguida, o nucleocapsdeo interage com a protena M nas membranas do RE ou no complexo de Golgi, levando formao do envoltrio interno do nucleocapsdeo e ao seu empacotamento nas partculas que brotaro para o interior desses compartimentos. Para a formao da partcula viral, a protena E atua em conjunto com a protena M. Os vrions brotam a partir de uma estrutura especializada de membrana, localizada entre o RE e o complexo de Golgi. Os coronavrus se acumulam em vesculas, que so transportadas at a membrana plasmtica, e so liberados por exocitose. Todas as etapas do ciclo replicativo ocorrem no citoplasma. O ciclo replicativo dos coronavrus est representado esquematicamente na Figura 24.3.
5 Coronavrus de interesse veterinrio

A seguir, sero abordadas as principais coronaviroses de animais, de acordo com a espcie afetada.
5.1 Vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos

O TGEV produz uma doena entrica altamente contagiosa em leites, descrita pela primeira vez, nos Estados Unidos, em 1946. Esse vrus pertence ao grupo I dos coronavrus e apenas um sorotipo do vrus foi identicado at o presente. O vrus apresenta relao antignica com o coronavrus canino (CCoV), vrus da peritonite infecciosa felina (FIPV), coronavrus entrico felino (FCoV), coronavrus humano (HCoV), vrus
Coronaviridae
621
da diarria epidmica dos sunos (PEDV) e com o coronavrus respiratrio dos sunos (PRCOV). Essas relaes antignicas resultam em reaes sorolgicas cruzadas entre os vrus. No entanto, apesar da semelhana antignica, foram observadas vrias diferenas na biologia dos vrus, tanto in vitro como in vivo. O CCoV e o TGEV replicam em clulas de origem canina e felina, entretanto o CCoV e o FIPV no replicam em clulas sunas, nas quais o TGEV replica. A infeco experimental de leites com o FIPV resultou em diarria e leses intestinais tpicas de TGE, mas a infeco de leites com o CCoV no provocou manifestaes na maioria dos casos, tendo sido observado apenas uma atroa leve das vilosidades de alguns animais. A partcula viral do TGEV difere um pouco dos demais coronavrus porque apresenta uma estrutura de ncleo (core) interno de aproximadamente 65 nm, envolvendo o nucleocapsdeo helicoidal. A forma dessa estrutura no bem denida, mas, aparentemente, icosadrica. No genoma do TGEV, alm dos genes descritos anteriormente, esto presentes outros trs genes que codicam protenas no-estruturais. Dois desses genes so denominados 3a e 3b e esto localizados entre os genes das protenas S e M. O outro gene recebeu o nmero sete e localiza-se entre o gene da protena N e a regio 3UTR.
PCRV desenvolveriam imunidade cruzada contra o TGEV. De fato, experimentos realizados com a inoculao do PRCOV e posterior desao com o TGEV demonstraram que pode haver proteo cruzada entre esses vrus. O TGEV transmitido principalmente pela via fecal-oral, pelo contato direto entre animais ou pela contaminao da rao, utenslios, veculos ou pessoas. A transmisso por aerossis ou por meio de pssaros contaminados tambm deve ser considerada. Ainda no est claro como o vrus mantido durante as estaes quentes, mas a ocorrncia de infeces subclnicas em algumas propriedades (na forma endmica da doena), a existncia de outros hospedeiros e a existncia do estado de portador na espcie suna tm sido consideradas.
5.1.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos

A patogenia da TGE tpica dos coronavrus entricos, cuja replicao restringe-se ao trato digestivo. O TGEV penetra pela via oral e conduzido at o intestino delgado (ID), resistindo ao pH baixo e s enzimas proteolticas do trato digestivo. O vrus replica nas clulas epiteliais das vilosidades do ID, provocando distrbios funcionais e destruio dessas clulas. Esses distrbios resultam na reduo da atividade enzimtica no ID, na interrupo dos processos digestivos normais e no transporte de nutrientes e eletrlitos. Esses aspectos caracterizam a sndrome da mabsoro que ocorre na doena. Ocorre tambm uma alterao no transporte de sdio no jejuno, tendo como conseqncia o acmulo de lquido e eletrlitos no lmen intestinal, o que contribui para a produo da diarria. Outra disfuno observada o extravasamento de protenas plasmticas. A desidratao e acidose metablica so as mais provveis causas da morte. A principal leso observada no intestino o achatamento ou atroa das vilosidades, que evidente particularmente no jejuno, mas pode estar presente tambm no leo e, com menor freqncia, no duodeno. A TGE pode se manifestar nas formas epidmica e endmica. A forma epidmica mais
5.1.1 Epidemiologia
A TGE uma doena prevalente no Hemisfrio Norte, principalmente em reas de produo suna intensiva dos Estados Unidos e em alguns pases da Europa. Nessas regies, a doena ocorre de forma sazonal durante o inverno, o que atribudo alta estabilidade do vrus em baixas temperaturas e incidncia solar reduzida. No Brasil, j houve o registro de ocorrncia da doena, mas esta no comumente encontrada na populao suna brasileira. Nos ltimos anos, foi observada uma reduo na incidncia da TGE em pases europeus, e os pesquisadores esto atribuindo essa reduo circulao endmica do PRCOV na populao suna. Os animais que entram em contato com o
622
Captulo 24
freqentemente observada e caracteriza-se pela propagao muito rpida da doena na propriedade, com alta mortalidade de leites de at duas semanas de idade. Isso contrasta com os sinais leves e sem mortalidade observados em animais adultos. Os animais apresentam anorexia, letargia, diarria, perda de peso e vmito. A infeco em neonatos resulta em rpida desidratao e a taxa de mortalidade de aproximadamente 100%. Essa taxa reduzida com o aumento da idade dos leites, at as duas semanas. As fmeas em lactao podem apresentar febre, anorexia, agalaxia, diarria e vmito, que pode estar associada com o contato com a prole infectada ou tambm com aspectos endcrinos especcos da fase de lactao. Essa forma da doena geralmente se resolve em duas a trs semanas na propriedade. A forma endmica da doena menos freqente e se manifesta com sinais clnicos semelhantes, porm mais brandos do que os observados na forma epidmica. Essa forma ocorre em propriedades em que a infeco mantida pela introduo contnua de animais susceptveis. A taxa de mortalidade baixa, atingindo 10 a 20% dos animais. Nesse caso, os leites geralmente apresentam a doena entre os seis dias de idade at duas semanas aps o desmame. As fmeas lactantes no apresentam sinais clnicos e transferem imunidade aos leites.
provaram que a neutralizao do vrus ocorre no lmen do intestino pelos anticorpos adquiridos pela ingesto de colostro ou leite, evitando assim a infeco das clulas epiteliais. Essa forma de imunidade foi denominada imunidade lactognica. A presena de IgG sistmica parece no ter papel importante na proteo contra a doena. A resposta imune celular provavelmente desempenhe um papel importante na imunidade ativa contra o TGEV. Apesar dos diversos estudos, o papel dos linfcitos T-auxiliares (Th) e citotxicos (Tc) foi pouco esclarecido. O envolvimento de linfcitos Th na induo da proliferao de linfcitos B e sntese de anticorpos foi sugerido pela identicao de trs epitopos para essas clulas na protena viral N. Por outro lado, observou-se um aumento no nmero de clulas NK e Tc em leites infectados com o TGEV, sugerindo a sua participao na resposta imune contra esse vrus. Evidncias da participao da imunidade celular atravs de linfcitos Th, Tc e clulas NK foram tambm observadas em testes de uma vacina que possui um vetor baculovrus que expressa as protenas S, N e M do TGEV.
5.1.4 Diagnstico
O diagnstico presuntivo deve basear-se nas manifestaes clnicas e nos aspectos epidemiolgicos da doena. O diagnstico denitivo necessita a realizao de testes laboratoriais de deteco de vrus ou de antgenos virais. A imunouorescncia (IFA), realizada em cortes de criostato ou em esfregaos de mucosa intestinal, a tcnica mais usual de diagnstico. A imunoperoxidase (IPX) tambm tem sido utilizada em alguns casos. O isolamento do vrus geralmente um processo demorado e, muitas vezes, infrutfero, mas pode ser realizado em clulas de tireide ou de testculos sunos, nas quais a replicao viral resulta na produo de efeito citoptico. A deteco de antgenos virais nas fezes tambm pode ser realizada pelo uso de um ensaio imunoenzimtico (ELISA). A microscopia eletrnica (ME) no recomendada para a deteco do TGEV, porque no h como diferenci-lo do PEDV. A sorologia pareada (coleta de duas amostras de soro, uma no incio da infeco e outra 14 dias aps) tam-
5.1.3 Imunidade
Anticorpos contra o TGEV podem ser detectados no soro aos 14 dias aps a infeco, persistindo por seis meses e, possivelmente, at por anos. Anticorpos das classes IgM, IgG e IgA esto presentes. Os animais que se recuperam so considerados protegidos contra o vrus, entretanto, em alguns casos, essa proteo pode ser incompleta. A proteo parece estar relacionada com a presena de IgA no lmen intestinal, o que foi comprovado pela observao de que leites nascidos algumas semanas aps um surto de TGE no eram afetados pelo vrus. Essa proteo seria conferida pelo contnuo suprimento de IgA no colostro e no leite de fmeas que sofreram a infeco recentemente. Estudos posteriores com-
Coronaviridae
623
bm pode ser um auxlio ao diagnstico. A deteco de anticorpos pode ser feita pelas tcnicas de soroneutralizao (SN) e ELISA.

O controle da doena deve enfatizar principalmente a preveno da introduo do agente na propriedade. Isso pode ser obtido pela adoo de medidas como: adquirir animais somente de fontes sabidamente negativas e evitar a introduo de material, equipamento ou pessoal proveniente de propriedades com a doena. Existem algumas vacinas contendo o vrus atenuado ou inativado disponveis no comrcio de outros pases. O esquema mais utilizado nas regies que apresentam a infeco a vacinao das porcas prenhes com a vacina atenuada algumas semanas antes do parto. No entanto, as vacinas utilizadas at o presente tm sido pouco efetivas na preveno da doena. Vacinas de subunidades e vacinas recombinantes em vetores virais esto em fase de pesquisa e desenvolvimento. Uma medida considerada efetiva para o controle a exposio de porcas prenhes algumas semanas antes do parto ao vrus encontrado nas fezes de animais infectados. Esse procedimento conhecido como infeco controlada e consiste na introduo oral de fezes ou pores intestinais de animais infectados nas porcas. Essa prtica, quando aplicada, deve possuir o acompanhamento de um mdico veterinrio.
grande ecincia. Atualmente o vrus endmico na Europa e em algumas regies dos Estados Unidos. Na grande maioria dos casos, os animais so infectados e ocorre soroconverso logo aps o desmame. Em condies experimentais, a inoculao do vrus em leites que no receberam o colostro reproduziu a doena respiratria; no entanto, a infeco a campo parece ser geralmente subclnica. O vrus se propaga atravs de aerossis e pode percorrer longas distncias quando transportado pelo vento. O controle da infeco muito difcil pela sua facilidade de propagao e contgio, e no existem vacinas disponveis. Como a infeco por esse vrus no representa um grande problema sanitrio e econmico, no existem maiores preocupaes com o desenvolvimento de vacinas ou com o seu controle.
5.3 Vrus da diarria epidmica dos sunos

A diarria epidmica dos sunos uma doena clinicamente semelhante TGE, e os animais infectados apresentam uma diarria aquosa como a principal manifestao clnica. Esta doena tem sido descrita apenas na Europa e em alguns pases da sia. Existe s um sorotipo do PEDV, includo no grupo I dos coronavrus, que no apresenta relao antignica com os demais coronavrus sunos ou de outras espcies. A nica relao antignica detectada at o presente foi com a protena do nucleocapsdeo do FIPV. Animais de todas as idades podem desenvolver a doena, e a taxa de mortalidade pode atingir at 50% em neonatos e em leites com idade inferior a trs semanas. No entanto, em alguns casos, pode chegar a 80%. A taxa de mortalidade mais baixa e a lenta propagao da doena no rebanho (semanas) so consideradas as principais diferenas epidemiolgicas entre essa doena e a TGE. No existem vacinas ou estratgias de controle especcas descritas para a doena.
5.2 Coronavrus respiratrio dos sunos

O coronavrus respiratrio dos sunos (PRCoV) foi inicialmente identicado em granjas que no apresentavam histrico clnico de TGE, mas os sunos testados apresentaram sorologia positiva para o TGEV. O PRCoV apresenta aproximadamente 96% de homologia com o TGEV e tambm pertence ao grupo I dos coronavrus. Essas caractersticas explicam a reao sorolgica cruzada entre esses vrus. Aparentemente, o PRCoV evoluiu a partir do TGEV, por delees na regio que codica a glicoprotena S. O PRCoV apresenta tropismo por clulas do sistema respiratrio, replicando nesses tecidos com
5.4 Vrus da encefalomielite hemaglutinante dos sunos

O vrus da encefalomielite hemaglutinante dos sunos (HEV) j foi descrito no Canad, nos Estados Unidos e em alguns pases europeus e
624
Captulo 24
asiticos. Mesmo nos locais onde a presena da infeco foi demonstrada, a ocorrncia da doena parece ser baixa. O vrus apresenta apenas um sorotipo, que responsvel pela produo de diferentes sndromes clnicas e pertence ao grupo II dos coronavrus. A infeco pode resultar em encefalite aguda ou em uma sndrome de vmito e denhamento (vomiting and wasting disease, VWD). No primeiro caso, alm de anorexia e letargia, so observados sinais neurolgicos, tais como: tremores musculares, paresia posterior progressiva, hiperestesia, cegueira, coma e morte. A sndrome do vmito e denhamento ocorre de forma crnica e caracteriza-se por anorexia, letargia, vmito, perda progressiva de peso e constipao. Ambas as manifestaes so observadas apenas em leites nascidos de mes sorologicamente negativas, quando so infectadas nas primeiras semanas de vida. A infeco ocorre pela via nasal, por aerossis ou por contato direto. Na encefalomielite, o vrus replica na mucosa nasal e da se propaga para os nervos perifricos e para o encfalo. Na sndrome do vmito e denhamento, o vrus replica inicialmente na mucosa nasal e propaga-se para as tonsilas, trato respiratrio superior, encfalo e estmago. Nas regies em que o agente est presente, a infeco ocorre de forma endmica e no existem vacinas disponveis para o seu controle.
5.5.1 Epidemiologia
Os coronavrus felinos infectam membros da famlia Felidae, causando desde infeces subclnicas at a forma mais severa da doena, que a peritonite infecciosa (FIP). A infeco pelo FCoV muito comum em gatos domsticos, o que foi demonstrado pela alta soropositividade na populao felina de diversos pases. Anticorpos contra o vrus foram detectados em 80 a 90% das amostras coletadas em gatis, e em 10 a 50% das amostras coletadas em residncias que possuam um nico gato, nos Estados Unidos e Europa. No Brasil, so escassos os dados sobre a prevalncia e distribuio do agente na populao felina. Em So Paulo, somente uma dentre 22 amostras de soro e efuso pleural ou peritoneal de 10 gatos e um leo foi positiva por PCR. Em um estudo realizado nos arquivos do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria, foram diagnosticados 13 casos de PIF entre 638 gatos necropsiados no perodo de 1970 a 2001. Os animais infectados excretam o vrus em altos ttulos nas fezes, sendo a rota fecal-oral a forma mais freqente de transmisso. O RNA do vrus j foi detectado em fezes de gatos saudveis, infectados natural ou experimentalmente por perodos prolongados. Em alguns gatos, a infeco transitria e o vrus ser erradicado do organismo dentro de alguns meses aps a infeco. Aproximadamente 13% dos gatos permanecem infectados cronicamente, como portadores saudveis, excretando o vrus por perodos prolongados, possivelmente por toda vida. Apenas 5 a 10% dos gatos soropositivos para o FCoV iro desenvolver a forma severa da doena. A presena do vrus j foi demonstrada em populaes de felinos selvagens de vida livre ou cativos. Em estudos realizados na frica, 25% dos feldeos selvagens foram positivos para anticorpos no soro ou cido nuclico viral nas fezes. O guepardo, que uma espcie em risco de extino, muito susceptvel ao vrus, e animais dessa espcie apresentam a forma clnica da doena com maior freqncia do que gatos domsticos. Entre os gatos domsticos, foi observada uma incidncia mais alta da FIP em animais de raa pura quando comparados com as raas mistas. A doena ocorre com maior freqncia em
5.5 Coronavrus felino e vrus da peritonite infecciosa dos felinos

O coronavrus felino (FCoV) pertence ao grupo I dos coronavrus e apresenta dois bitipos, classicados pelas diferenas de patogenicidade. O bitipo mais freqente o coronavrus felino entrico (FCoV), que causa diarria leve em gatos. O outro bitipo o agente etiolgico da peritonite infecciosa felina (FIPV), uma doena de curso fatal. Dois sorotipos de coronavrus felinos foram identicados, denominados coronavrus felino tipos I e II, de acordo com as caractersticas antignicas dos isolados de FCoV e FIPV. Os dois sorotipos possuem isolados de casos de FIP, e a grande maioria dos coronavrus felinos tem sido classicada como sorotipo I, porm alguns isolados de FIPV so encontrados no sorotipo II, que composto, em sua maioria, por isolados entricos.
Coronaviridae
625
animais entre os seis meses e cinco anos de idade, sendo mais comum em animais com menos de um ano.

O coronavrus felino entrico infecta as clulas epiteliais das vilosidades intestinais, provocando a sua destruio, apresentando manifestaes clnicas de diarria e m-absoro. Aps a infeco inicial, com a apresentao ou no de manifestaes clnicas, o vrus permanece replicando no intestino e sendo excretado nas fezes. A habilidade do FIPV de replicar em macrfagos e invadir os tecidos intestinais e o sangue foi considerada a responsvel pela diferena na patogenia dos dois bitipos do vrus. Essa diferena foi observada em cultivos de macrfagos peritoneais, nos quais os isolados virulentos infectaram um nmero maior de macrfagos e produziram ttulos mais altos quando comparados com os isolados avirulentos. Entretanto, tem sido demonstrada a presena do vrus no sangue de animais que no desenvolveram a forma severa da doena, por longos perodos aps a infeco inicial. A presena do vrus no sangue e nos tecidos levaria replicao contnua, propiciando o surgimento de cepas mutantes com virulncia aumentada. A mutao do FIPV muito bem documentada e consiste em uma deleo de aproximadamente 300 bp na extremidade 3 do genoma. Essa mutao foi detectada em vrios isolados de tecidos de felinos que morreram da forma clnica da FIP e de gatos em que a doena foi induzida experimentalmente. A hiptese mais aceita a de que o FIPV origina-se a partir de mutaes do FCoV no animal infectado. A infeco pelo coronavrus pode produzir enterite leve, mas a maioria dos casos de infeco experimental ou natural cursa sem manifestaes clnicas. Alguns animais infectados podem desenvolver a forma severa da doena: a FIP, caracterizada pela debilitao progressiva, que culmina com a morte do animal. Os sinais iniciais no permitem a diferenciao de outras doenas sistmicas dos felinos e incluem perda de peso, anorexia, febre crnica, letargia e debilidade. A FIP pode ocorrer sob trs formas distintas: a for-
ma clssica, tambm chamada de efusiva ou mida; a forma seca ou no-efusiva ou a combinao de ambas. Na forma efusiva, ocorre um aumento progressivo do volume do abdome devido ao acmulo de lquido viscoso e amarelado na cavidade abdominal (ascite). A quantidade de lquido varivel, podendo atingir at um litro. A cavidade torcica tambm pode apresentar efuso pleural, que pode resultar em sinais de insucincia respiratria. Ictercia pode estar presente se houver envolvimento do fgado. A forma seca da doena caracteriza-se pela presena de leses piogranulomatosas em um ou mais rgos. Os animais com essa forma da doena podem apresentar sinais de insucincia heptica ou renal e doena pancretica. Distrbios neurolgicos e leses oculares tambm tm sido descritos.
5.5.3 Imunidade
Observaes clnicas e experimentais demonstraram que animais que apresentam anticorpos contra o coronavrus felino desenvolvem uma forma mais aguda e severa da doena quando reinfectados. Essa forma conhecida como sndrome da morte sbita. Nesses animais, as manifestaes clnicas e leses surgem rapidamente e eles apresentam tambm um perodo menor de sobrevivncia. O papel dos anticorpos preexistentes na patogenia da doena ainda no est totalmente esclarecido, mas acredita-se que esses anticorpos facilitariam a replicao do vrus e levariam a uma severidade maior da doena. A replicao mais eciente do vrus estaria associada com uma maior capacidade de infectar macrfagos, por causa do fenmeno da ADE (antibody dependent-enhancement), que consiste na facilitao da penetrao viral em macrfagos em funo da presena dos anticorpos. Nesse caso, os complexos vrus-anticorpo seriam ligados por receptores Fc de membrana do macrfago, o que facilitaria a sua penetrao nas clulas. Em outras palavras, ao invs de proteger, os anticorpos aumentariam a ecincia da penetrao e replicao viral. A manifestao ou no dos sinais clnicos da FIP estariam ligados resposta imune celular. Animais que apresentam uma resposta imune celular eciente no desenvolvem a doena. Por
626
Captulo 24
outro lado, animais que desenvolvem uma resposta imune celular parcial apresentam a forma no efusiva da doena. Os animais que no apresentam resposta imune desenvolvem a forma efusiva da doena.
5.5.4 Diagnstico
O diagnstico da FIP no animal vivo apresenta diculdades e deve basear-se mais na investigao clnica do que em testes laboratoriais. A deteco de anticorpos por IFA e ELISA tem sido amplamente aplicada mundialmente em laboratrios de diagnstico. So considerados positivos para o vrus os animais com ttulos moderados a altos. Entretanto, felinos que apresentam sinais clnicos podem ser soronegativos; assim como animais que nunca apresentaram manifestaes clnicas podem ter ttulos altos de anticorpos. Ento, mesmo que o diagnstico sorolgico seja amplamente utilizado, no deve ser considerado denitivo. A apresentao de ttulos altos de anticorpos e de sinais clnicos compatveis com a FIP pelo animal deve ser considerada importante. Se o felino apresenta ttulos baixos ou soronegativo, a FIP deve car no nal da lista das suspeitas. At h pouco tempo, o diagnstico denitivo s era possvel aps a morte do animal, pela patologia e histopatologia. Atualmente possvel realizar o diagnstico atravs de tcnicas de biologia molecular, e vrios protocolos de RT-PCR j foram descritos.
la por toda a vida, em razo da ampla disseminao do vrus. O controle da doena pelo uso de vacinao um ponto polmico. At o momento j foram produzidas vrias vacinas que falharam em conferir proteo. Vacinas produzidas com vrus semelhantes ao FCoV, como o coronavrus humano, canino e suno, foram testadas sem sucesso. O maior problema para a produo de vacinas o possvel papel dos anticorpos na exacerbao dos sinais clnicos (ADE). Este efeito foi observado em testes vacinais realizados com o FCoV atenuado e tambm com um vrus vaccinia recombinante, expressando a protena S. A induo de uma forte resposta imune celular parece ser o ponto crtico para a preveno da doena. Vacinas com plasmdeos DNA ou vetores virais carreando genes que expressam protenas internas do vrus como a M (membrana) e a N (nucleocapsdeo) tm sido sugeridas para induzir preferencialmente resposta celular e, assim, minimizar o risco de ADE. Atualmente existe uma vacina comercial disponvel. Esta vacina foi produzida com um vrus mutante ts e protegeu gatos contra a FIP; entretanto, a sua eccia e segurana seguem sendo temas de debate.
5.6 Coronavrus canino

O coronavrus canino (CCoV) est associado com surtos espordicos de enterite em ces. O vrus foi isolado, pela primeira vez, na Alemanha, em 1971, a partir das fezes de ces com enterite. Desde ento, esse agente tem sido amplamente detectado em ces clinicamente saudveis ou em ces que apresentam vmitos e diarria severa. As caractersticas gerais de estrutura e do ciclo de replicao do CCoV so semelhantes aos descritos para a famlia Coronaviridae. O CCoV pertence ao grupo I dos coronavrus e tambm propenso a recombinaes no genoma. Os genes das protenas M e S, que possuem importantes propriedades biolgicas e imunolgicas, so os principais locais de recombinao. Diferenas na seqncia de nucleotdeos desses genes indicam a existncia de uma diversidade gentica entre cepas de referncia e isolados de campo. Alguns

O controle e preveno da infeco pelo FCoV so complicados pelo fato de o vrus estar amplamente disseminado na populao felina. Algumas recomendaes foram elaboradas no II Simpsio de Coronavrus Felino e Peritonite Infecciosa Felina, realizado na Esccia, em 2002. Uma das medidas recomendadas o isolamento de gatas prenhes duas a trs semanas antes do parto, com a subseqente quarentena da gata e dos lhotes, e desmame dos lhotes com a idade de quatro a seis semanas. O objetivo desse procedimento seria, principalmente, o de retardar a ocorrncia da infeco, pois muito difcil evit-
Coronaviridae
627
autores sugerem a existncia de dois gentipos: o CCoV tipo I e o CCoV tipo II. Alguns isolados altamente virulentos j foram identicados, associados com altos ndices de mortalidade. Esses relatos demonstram a necessidade de se investigar as possveis implicaes dessas variaes antignicas na eccia das vacinas contra o CCoV.
latrans Say), as hienas (Crocuta crocuta) e os lobos (Canis lupus). Alm dos ces e outros candeos, gatos domsticos tambm podem ser infectados, demonstrando soro-converso, porm sem o desenvolvimento de sinais clnicos.
5.6.1 Epidemiologia
Ces de todas as idades e raas so susceptveis infeco pelo CCoV. No entanto, os lhotes so mais sensveis e freqentemente desenvolvem sinais clnicos de enterite, alm de apresentarem ndices maiores de mortalidade. A doena ocorre com maior freqncia em canis, abrigos e locais onde h convvio entre os ces. O vrus altamente contagioso e dissemina-se rapidamente na populao canina. A principal fonte do vrus so as fezes de ces infectados, alm de fmites contaminados, e a infeco ocorre principalmente pela via oral. O vrus pode ser excretado nas fezes por at duas semanas aps a infeco, porm alguns estudos demonstraram a eliminao por longos perodos (entre 37 e 180 dias). Ces sem manifestaes clnicas tambm podem excretar o vrus nas fezes por perodos prolongados. H evidncias sorolgicas de que o CCoV apresenta distribuio mundial. Dados de prevalncia so variveis e alguns fatores que podem interferir nos resultados desses estudos so listados a seguir: a) pequeno nmero de amostras testadas; b) uso de diferentes tcnicas de deteco de anticorpos; c) presena de amostras de soro de ces vacinados; e d) maior importncia da imunidade local aps a infeco natural. Estudos de prevalncia, realizados na Austrlia, demonstraram que 15,8% dos ces que convivem com at outros dois ces no mesmo domiclio apresentavam anticorpos contra o CCoV; enquanto 40,8% dos animais mantidos em canis eram soropositivos. Inquritos sorolgicos, realizados na Itlia, detectaram 90,8% de animais positivos; na Inglaterra, 76%; na Turquia, 74,3%; e, no Japo, 44,1%. No Sul do Brasil, um estudo com ces no-vacinados de Santa Maria detectou 50,4% (412/817) amostras positivas. A infeco pelo CCoV tambm foi demonstrada em outros animais, como os coiotes (Canis

A infeco dos ces ocorre pela via fecaloral. Aps a ingesto, o CCoV atinge o intestino delgado e replica nas clulas epiteliais das vilosidades, e a sua excreo nas fezes se inicia entre um e dois dias aps a infeco. O vrus passa pelo estmago, resistindo ao pH cido, e, aps a replicao no epitlio do duodeno, dissemina-se na superfcie intestinal at o leo. No foi demonstrada a replicao do vrus no clon. O vrus pode se disseminar aos linfonodos mesentricos e, ocasionalmente, alcana o bao e o fgado. Os sinais clnicos se iniciam entre um e quatro dias aps a infeco. Como a mortalidade geralmente baixa, as necropsias no so freqentes. Macroscopicamente, o intestino delgado encontra-se dilatado, o contedo lquido e de colorao amarelada ou esverdeada. A mucosa intestinal encontra-se hipermica e, em alguns casos, hemorrgica. Os linfonodos mesentricos podem estar edemaciados. Microscopicamente, a replicao viral resulta em atroa e fuso das vilosidades intestinais, depresso das criptas, achatamento das clulas epiteliais, aumento na celularidade da lmina prpria e aumento de clulas globosas. Os ces infectados podem apresentar sinais leves a moderados de enterite. As manifestaes mais freqentemente observadas so: diarria, vmito, desidratao, perda de apetite, letargia, o que, ocasionalmente, levam os ces jovens morte. A infeco conjunta com outros vrus (parvovrus, adenovrus ou vrus da cinomose), bactrias ou parasitas geralmente produz uma forma mais severa e at mesmo fatal da doena. O estresse outro fator que pode agravar as manifestaes clnicas. Quando no ocorre agravamento dos sinais, a recuperao clnica acontece aps uma semana de infeco. Embora o CCoV no seja freqentemente associado com doena
628
Captulo 24
respiratria em caninos, um estudo recente relata a presena de um coronavrus em ces com sinais respiratrios. O agente identicado nesses casos, no entanto, provavelmente seja um novo coronavrus canino.
5.6.3 Imunidade
A infeco pelo CCoV restrita ao intestino e geralmente no ocorre viremia. Portanto, os ttulos de anticorpos produzidos em resposta infeco so geralmente baixos. Em inoculaes experimentais, a presena de IgM foi inicialmente detectada no plasma trs dias aps a inoculao. J a IgG foi detectada entre o 4 e o 7 dia ps-inoculao. Anticorpos neutralizantes contra o vrus podem ser detectados a partir de dez dias aps a infeco, e pequenas quantidades de IgG, IgM e IgA podem ser detectadas no duodeno. A infeco natural e a vacinao com vacina viva atenuada pela via oronasal induzem altos nveis de IgA no intestino. Estas imunoglobulinas esto diretamente relacionadas com a proteo contra a infeco pelo CCoV. Vacinas atenuadas, aplicadas pela via oral, conferem maior proteo, pois a resposta imune mediada por IgA, associada mucosa, previne a adsoro do CCoV s clulas epiteliais das vilosidades intestinais. A imunidade materna capaz de proteger os neonatos por um perodo varivel, que depende do ttulo de anticorpos que a me transfere aos lhotes. H descries de durao da imunidade passiva por quatro a cinco semanas; no entanto, os estudos a respeito da durao da resposta imune ao CCoV so escassos.
clulas primrias de rim, timo e membrana sinovial canina. As clulas de linhagem de rim canino A-72 so particularmente susceptveis ao CCoV, alm de clulas de embrio e de linhagem de rim felino (CRFK). O vrus produz efeito citoptico caracterizado pela formao de sinccios; a conrmao da identidade do agente realizada por IFA. Esta tcnica tambm pode ser realizada em crioseces de intestino. Existem kits baseados em cromatograa para a deteco de antgenos do CCoV em fezes de ces. As tcnicas de RT-PCR e RT-PCR em tempo real realizadas diretamente das fezes tambm tm sido utilizadas, principalmente em pesquisas. Testes de vacinas experimentais demonstraram que essas tcnicas detectam quantidades menores de vrus excretadas nas fezes, por perodos maiores, quando comparadas com o isolamento viral. A sorologia de pouca utilidade, em termos de diagnstico, por dois fatores: a) o coronavrus est muito distribudo na populao canina e a infeco, muitas vezes, subclnica; b) a deteco de anticorpos no soro no indica exposio recente ao vrus. A sorologia pareada poderia ser til, demonstrando soroconverso. Para a deteco de anticorpos no soro, so utilizadas as tcnicas de SN, IPX e ELISA. Um kit de ELISA que detecta IgM est disponvel comercialmente, para uso em clnicas e consultrios; a presena desta imunoglobulina no soro indica infeco recente pelo CCoV.

Para a preveno da infeco e doena pelo CCoV, deve-se evitar o contato de ces soronegativos com ces infectados. Condies de estresse, causadas pela falta de sanidade, aglomerao, desmame e infeces concomitantes por parasitas e outros vrus favorecem o desenvolvimento de enterite nos ces infectados. No meio ambiente, o vrus facilmente inativado pelo calor e por solventes lipdicos. No entanto, em temperaturas baixas, pode manter-se infeccioso por longos perodos. O CCoV estvel sob pH cido, sobrevivendo a um extremo de pH 3.0.
5.6.4 Diagnstico
A deteco do vrus nas fezes ou no intestino constitui-se na forma mais objetiva de diagnstico, diferenciando-a da enterite por outros agentes, como o parvovrus, o rotavrus e os picornavrus. O diagnstico laboratorial freqentemente realizado por ME a partir das fezes. O isolamento do vrus no muito utilizado, entretanto diferentes laboratrios obtiveram sucesso utilizando
Coronaviridae
629
O tratamento da enterite pelo CCoV de suporte e baseia-se na restituio do equilbrio hdrico-eletroltico, alm do controle de infeces bacterianas e parasitrias concomitantes. Existem vrias vacinas multivalentes que possuem antgenos do CCoV inativados. No entanto, a eccia dessas vacinas questionvel pela importncia da imunidade local na mucosa intestinal, uma vez que vacinas inativadas no induzem a produo de IgA local. Anticorpos no soro no so capazes de prevenir a infeco, apenas reduzem a gravidade da doena, e isto s ocorre a partir de trs semanas aps a aplicao das vacinas. A existncia de diversidade antignica entre cepas e isolados do CCoV tambm compromete a eccia das vacinas inativadas contra o CCoV. Vacinas vivas atenuadas j foram testadas, e resultados promissores foram demonstrados atravs da aplicao oral em uma nica dose. Ces vacinados pela via oral apresentaram ttulos mais altos de IgA do que ces vacinados pela via intramuscular. Aps o desao, os ces que receberam a vacina pela via oral no excretaram o vrus nas fezes, enquanto os ces vacinados pela via intramuscular excretaram o vrus por um perodo mdio de 10 dias. Em outro estudo semelhante, testando uma vacina inativada, aplicada pela via intramuscular, os animais excretaram o vrus nas fezes por um tempo mdio de 11 dias. Uma vacina atenuada foi licenciada, em 1983, nos Estados Unidos, mas a comercializao foi proibida logo em seguida devido ao grande nmero de reaes adversas. Essas reaes foram observadas principalmente quando a vacina foi aplicada em conjunto com vacinas atenuadas para o parvovrus, vrus da cinomose e adenovrus.
Este coronavrus foi isolado de uma populao canina abrigada em um centro de recolhimento de ces de rua na Inglaterra. Os animais apresentavam sinais clnicos semelhantes traqueobronquite infecciosa canina, tambm conhecida como tosse dos canis. No entanto, a doena respiratria no foi controlada com vacinas comerciais contra essa sndrome, aplicadas previamente ao diagnstico laboratorial do surto. A anlise logentica indicou que este vrus, denominado coronavrus canino respiratrio (CRCV), apresenta uma grande homologia com os coronavrus respiratrios de bovinos (BCoV, 98,8%) e humanos (HCoV-OC43, 98,4%), pertencentes ao grupo II do gnero coronavrus, e pequena homologia com o CCoV (cepa 1-71, 68,53%), que classicado no grupo I. Alm disso, constatou-se a presena do gene da hemaglutinina esterase (HE) na cepa respiratria; uma caracterstica dos coronavrus pertencentes ao grupo II. Caso esses dados sejam conrmados, este vrus dever ser classicado dentro da famlia Coronaviridae, como um coronavrus canino distinto do CCoV. Embora estudos de prevalncia sejam escassos, um trabalho recentemente publicado demonstrou soropositividade de 17,8% (160/898) para o CRCV em ces no Japo. Um estudo retrospectivo demonstrou que amostras de soro coletadas de ces, j em 1998, apresentavam anticorpos contra o vrus, sugerindo a existncia prvia do CRCV em ces daquele pas.
5.8 Coronavrus bovino

O coronavrus bovino (BCoV) um agente envolvido principalmente com diarria em bezerros, mas tambm pode estar envolvido em doena respiratria em bezerros e com diarria em bovinos adultos. Esse vrus est amplamente disseminado na populao bovina e foi identicado, pela primeira vez, em casos de diarria em bezerros nos Estados Unidos, em 1973. O BCoV possui uma morfologia tpica dos coronavrus, com dimetro aproximado de 120 nm, e apresenta a protena hemaglutinina-esterase (HE) no envelope, alm das protenas S, M e
5.7 Coronavrus canino respiratrio

Desde a dcada de 1970, descreve-se a existncia do coronavrus canino (CCoV), associado com doena entrica. Ao contrrio de vrios coronavrus de outras espcies, que so associados com sinais respiratrios. No entanto, relatos recentes sugerem um coronavrus como agente etiolgico de doena respiratria em ces.
630
Captulo 24
E, sendo classicado como um coronavrus tipo II. O genoma possui aproximadamente 32 kb e a glicoprotena S do envelope clivada em duas subunidades: S1 e S2.

A manifestao clnica mais comum da infeco pelo BCoV a diarria em bezerros de trs a 21 dias de idade, embora o vrus possa infectar e causar doena animais com at trs meses. A doena caracterizada pela presena de fezes lquidas no intestino, leite coagulado nas fezes, febre, debilidade, depresso e desidratao severa. O choque e a morte podem ocorrer caso no sejam adotadas medidas de controle e tratamento de suporte. Outra doena atribuda infeco pelo BCoV a disenteria de inverno, que ocorre em regies frias, nas quais os animais so estabulados durante o perodo de frio ou criados em connamentos. Essa doena caracteriza-se por diarria aguda, ftida e, muitas vezes, sanguinolenta em animais jovens e adultos. Tambm se observa a reduo na produo de leite, depresso e anorexia. O BCoV tem sido isolado tambm de bezerros connados que apresentam sinais de doena respiratria. No entanto, a participao do agente na produo de doena respiratria ainda no totalmente comprovada. A inoculao intranasal com as cepas virais de origem respiratria induziu diarria, mas no induziu sinais respiratrios. Por outro lado, a vacinao de bezerros contra o BCoV reduziu a prevalncia de doena respiratria, sugerindo um papel do vrus na enfermidade. O vrus penetra pela via oral e atinge o intestino pela via digestiva, onde replica em entercitos das vilosidades da poro distal do intestino delgado e tambm em uma pequena extenso do clon. A diarria ocorre como conseqncia da m-absoro e distrbios da atividade intestinal, provocados pela atroa das vilosidades induzida pela replicao viral. Ocorre uma rpida perda de gua e eletrlitos, o metabolismo da glicose e da lactose podem ser alterados, ocorrendo hipoglicemia e acidose ltica, podendo resultar em choque e morte. At o presente momento no foi possvel identicar diferenas sorolgicas ou moleculares denitivas entre as cepas que causam as manifestaes entricas daquelas associadas com sinais respiratrios.
5.8.1 Epidemiologia
A infeco pelo BCoV resulta em alta morbidade e baixa mortalidade entre os animais infectados. As fezes so consideradas a maior fonte de vrus infeccioso, mas os animais infectados podem excretar o vrus tambm nas secrees nasais. O BCoV endmico na populao bovina, e anticorpos contra o vrus podem ser detectados em grande parte da populao. Evidncias indicam que o vrus mantido nos rebanhos em bezerros e vacas que apresentam infeco clnica ou crnica. O estado de portador e infeco persistente tambm tm sido sugeridos, mas ainda no foram comprovados. Infeces recorrentes no mesmo animal tambm podem ocorrer. Estudos epidemiolgicos demonstraram a presena desse vrus em vrios pases. O BCoV foi detectado nas fezes de 28,1% dos animais testados em um inqurito na Turquia. Na Coria, o BCoV foi detectado em 32 propriedades com animais que apresentavam sinais clnicos da disenteria de inverno. Nos Estados Unidos e no Canad, a presena do BCoV tem sido freqentemente descrita nas secrees nasais e fezes de bovinos connados que apresentam sinais de doena respiratria. Anticorpos contra esse vrus foram detectados em 89% das amostras de leite de 2.236 propriedades testadas na Sucia. No Brasil, foram realizados poucos estudos de prevalncia, mas a presena do vrus j foi demonstrada no estado de So Paulo. Setenta e duas amostras fecais de bezerros com diarria foram coletadas em vrias propriedades, e 39% delas foram positivas para o vrus. O BCoV tambm foi detectado em amostras fecais de bovinos adultos com diarria durante o inverno, sugerindo a ocorrncia da forma de disenteria de inverno no rebanho brasileiro. Embora o nmero de estudos seja reduzido, provvel que a infeco esteja amplamente difundida no rebanho bovino brasileiro, a exemplo do que ocorre em outros pases.
Coronaviridae
631
Inoculaes experimentais em vacas e bezerros demonstraram que as mesmas cepas de BCoV podem causar diarria em terneiros e disenteria de inverno em animais adultos. Estudos comparativos indicaram que os vrus isolados do trato respiratrio ou do intestino foram capazes de replicar em ambos os tecidos de bezerros inoculados. A inoculao experimental com a cepa respiratria resultou em doena entrica em bezerros privados de colostro. Na necropsia, pode-se observar os intestinos distendidos com fezes lquidas e moldadas por muco no clon. Na histopatologia, observa-se atroa severa das vilosidades do intestino delgado, com descamao do epitlio e substituio das clulas epiteliais de absoro por clulas imaturas com morfologia cubide.
da alta incidncia da doena em bezerros a partir do quinto dia de vida.
5.8.4 Diagnstico
A diarria neonatal em bezerros uma sndrome de etiologia complexa com o possvel envolvimento de coronavrus, rotavrus, bactrias entricas (E. coli e Salmonella spp.), protozorios e parasitas. Esses agentes podem produzir a doena isoladamente ou em conjunto. Na maioria dos casos, as manifestaes clnicas so muito semelhantes, o que diculta a realizao do diagnstico diferencial com a determinao da causa especca. Por essa razo, o diagnstico etiolgico denitivo requer a realizao de provas laboratoriais. A ME realizada nas fezes a opo mais indicada para a realizao do diagnstico. A IFA tambm pode ser aplicada para a pesquisa de antgenos do vrus no intestino. O isolamento do vrus pode ser realizado em clulas primrias de rim bovino ou em clulas da linhagem Vero. O isolamento requer o tratamento prvio do inculo com tripsina, para facilitar a penetrao e replicao viral. Os isolados de campo so difceis de isolar e, geralmente, requerem vrias passagens para adaptao ao cultivo celular antes de produzirem efeito citoptico. A tcnica de RT-PCR tambm tem sido utilizada para o diagnstico do BCoV.
5.8.3 Imunidade
A resposta imune humoral de bovinos infeco pelo BCoV foi estudada em animais com a forma respiratria da doena e tambm pela inoculao experimental em bezerros privados de colostro. Alguns dias aps a infeco, so detectados anticorpos contra as protenas estruturais S, HE, N e M. Anticorpos com atividade neutralizante so direcionados contra as glicoprotenas de superfcie S e HE. Aps a inoculao da cepa respiratria, o nal da excreo viral nas secrees nasais coincidiu com o aparecimento de anticorpos neutralizantes, sugerindo um importante papel desses anticorpos na erradicao da infeco. O papel da imunidade celular na proteo contra o BCoV desconhecido. A neutralizao do vrus no lmen intestinal por IgA, parece ser a forma mais efetiva de proteo contra a diarria neonatal. Nesse caso, a imunidade passiva de grande importncia na proteo dos bezerros nos primeiros dias de vida. Imunoglobulinas das classes IgG1, IgG2 e IgA so detectadas no colostro de vacas com altos ttulos de anticorpos contra o BCoV. A queda na quantidade de anticorpos na transio de colostro para leite tem sido apontada como uma possvel causa

A preveno completa da infeco pelo BCoV no possvel, mas boas condies de manejo e higiene podem reduzir as conseqncias da infeco. Ateno especial deve ser dispensada para a sanidade durante o parto. Vacinas vivas modicadas esto disponveis no mercado e a sua aplicao recomendada, quando o BCoV est presente na propriedade, em vacas prenhes e em recm-nascidos. A vacinao das vacas objetiva induzir altos ttulos de anticorpos e, assim, aumentar o nvel de imunidade passiva transmitida pelo colostro.
632
Captulo 24
5.9 Vrus da bronquite infecciosa das galinhas

A infeco pelo vrus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) foi descrita pela primeira vez no estado da Dakota do Norte, nos Estados Unidos, em 1931. Essa infeco pode manifestar-se por distrbios respiratrios, reprodutivos e/ou renais. O IBV o vrus prottipo da famlia Coronaviridae, pertence ao grupo III dos coronavrus e, como outros membros dessa famlia, apresenta uma grande variao nos antgenos de superfcie, o que implica na existncia de vrios sorotipos e subtipos. Essa caracterstica biolgica resulta em vrias conseqncias, principalmente em relao a patogenia e epidemiologia desse vrus.
As aves infectadas so as maiores fonte de infeco e contaminao no meio ambiente. Aps a recuperao da doena clnica, algumas aves permanecem persistentemente infectadas, excretando o vrus por um longo perodo nas fezes e em aerossis. O local de persistncia ainda no foi denido, mas o tecido renal um possvel candidato.

O vrus replica inicialmente no trato respiratrio, de onde se dissemina pelo sangue para vrios rgos. Alm do trato respiratrio, o vrus tem sido isolado tambm dos ovidutos, rins e trato intestinal. O vrus pode ser encontrado tambm na bursa de Fabricius, o que poderia explicar os efeitos imunossupressivos do IBV. Os achados macroscpicos mais freqentemente observados so a presena de exsudato seroso, catarral ou caseoso na traquia, fossas nasais, brnquios e, eventualmente, nos sacos areos. Em aves de postura, o material uido da gema pode ser encontrado na cavidade abdominal, em funo do rompimento do ovo em formao e das leses permanentes no oviduto. Quando a cepa possui nefrotropismo, os rins podem apresentar-se plidos e edemaciados, com deposio de uratos nos tbulos e ureteres. Microscopicamente podem ser observadas: inltrao linfide, hiperplasia, edema, descamao e perda de clios no epitlio respiratrio. A intensidade das leses pode variar de acordo com a virulncia da cepa. No tecido renal, pode ser observada nefrite intersticial aguda ou subaguda. A forma respiratria da doena a mais comum e caracteriza-se por respirao ofegante, associada com acmulo de material caseoso na siringe; tosse, estertores, espirro e descarga nasal em aves jovens. O consumo de gua e alimento reduzido e, como conseqncia, o ganho de peso tambm ca reduzido. Em aves com idade superior a seis semanas, os sinais so semelhantes, porm a descarga nasal observada com menor freqncia. Nessas aves, a infeco pode passar despercebida. Em aves de postura, so observadas a queda na produo e da qualidade dos
5.9.1 Epidemiologia
O IBV est presente em todos os pases que possuem avicultura comercial ou domstica. Surtos da doena podem ocorrer mesmo em populaes vacinadas. As cepas Massachussets (Mass) e Connecticut (Conn) so consideradas padro para o vrus, sendo, assim, utilizadas em vrias vacinas. Em alguns pases, vrios sorotipos do vrus esto circulando na populao avcola, o que diculta o diagnstico e controle. A galinha considerada a principal e nica espcie naturalmente susceptvel ao vrus e que desenvolve a doena. Entretanto, isolados de coronavrus muito semelhantes ao IBV tm sido associados com doena respiratria e renal em criaes comerciais de faises. Os coronavrus isolados de perus no produzem doena em galinhas e vice-versa. O IBV transmitido principalmente por aerossis, mas as aves se infectam tambm pela ingesto de gua e alimentos contaminados com material fecal. O vrus muito contagioso e encontrado em altos ttulos na traquia de aves doentes e nas fezes de aves em recuperao. O vrus pode sobreviver por dias ou at semanas no meio ambiente, principalmente sob baixas temperaturas. Os sinais clnicos se desenvolvem dentro de 18 a 36 horas aps o contato com as aves infectadas. A infeco geralmente resolvida em aproximadamente 14 dias.
Coronaviridae
633
ovos, alm de sinais respiratrios. comum a postura de ovos com casca mole, deformada ou mesmo sem casca, devido s leses produzidas nos ovidutos. Essas leses podem ser produzidas de forma permanente em aves jovens e, neste caso, o problema somente ser detectado na poca de postura. Algumas cepas do IBV apresentam um tropismo maior pelo tecido renal, produzindo leses proeminentes nos rins. As aves infectadas por essas cepas apresentam depresso, penas arrepiadas e aumento no consumo de gua. A urolitase pode ser uma das conseqncias da infeco. A taxa de mortalidade da doena respiratria geralmente baixa e se deve, principalmente, a complicaes por infeces bacterianas secundrias, principalmente por Escherichia coli. Em alguns casos, foram observados edema facial, aerosaculite e uma taxa de mortalidade um pouco mais elevada. A infeco com cepas de patogenicidade mista, que causam leses na traquia e rins, pode induzir mortalidade de at 25%. Alm das perdas por ganho de peso reduzido e mortalidade, a infeco pelo IBV em frangos de corte leva ao aumento na condenao de carcaas durante o abate.
5.9.3 Imunidade
Os mecanismos imunes, associados com a eliminao e proteo contra o IBV, ainda no esto esclarecidos, mas os diferentes ramos da resposta imune parecem estar envolvidos em maior ou menor grau. A resposta imune inata atravs do interferon (IFN) e a resposta imune adaptativa atravs de anticorpos e linfcitos T parecem desempenhar um papel importante. O grande nmero de sorogrupos e sorotipos um fator complicador na induo da proteo contra esse vrus. As aves naturalmente infectadas ou vacinadas com o IBV estaro protegidas contra o vrus homlogo, mas a proteo cruzada contra cepas heterlogas varivel. Evidncias indicam que a resposta imune protetora induzida principalmente por antgenos da superfcie do vrus. Estudos realizados com as protenas S1, N e M demonstraram que apenas os eptopos de S1 foram capazes de
induzir proteo contra o vrus. Os principais determinantes antignicos do IBV encontram-se em regies das glicoprotenas S1 e S2. Peptdeos recombinantes construdos com seqncias da S1 e S2 induziram resposta imune humoral, celular e proteo frente ao desao; enquanto peptdeos da protena N no induziram proteo, apesar da induo de anticorpos e linfcitos T. O papel dos anticorpos na proteo controverso, uma vez que alguns pesquisadores encontraram boa correlao entre ttulos de anticorpos e proteo; enquanto outros no encontraram correlao alguma. Anticorpos das classes IgG e IgA foram detectados na lgrima, em lavados traqueais e no oviduto, e tambm nos contedos cecais e duodenais de aves inoculadas com o vrus. Estes anticorpos foram detectados j aos sete dias aps a inoculao. A proteo conferida pela imunizao com a protena recombinante S1 no foi correlacionada com ttulos de anticorpos. Da mesma forma, altos nveis de anticorpos na secreo lacrimal no determinaram proteo contra o desao viral. Por outro lado, a importncia dos anticorpos na resoluo da infeco cou demonstrada em experimentos que detectaram um aumento na severidade da doena produzida pelo IBV em aves bursectomizadas, quando comparadas com aves normais. Reforando esta hiptese, ttulos altos de anticorpos neutralizantes na secreo nasal desempenharam importante papel na proteo contra a reinfeco. Evidncias para a participao da resposta celular vieram da deteco de linfcitos Tc especcos para o IBV em secrees respiratrias de aves infectadas. A importncia dessas clulas na proteo contra o IBV cou demonstrada pela transferncia passiva de linfcitos Tc de aves infectadas para pintos, que foram posteriormente desaados. Os pintos que receberam essas clulas caram parcialmente protegidos, apresentando uma forma mais branda da doena. Esses resultados indicam que, embora os Tc paream possuir um papel importante, este no o nico mecanismo atuante na proteo contra o vrus. A imunidade passiva transferida da galinha para o pinto confere alguma proteo contra vrus homlogo. Pintos com ttulos altos de anticorpos foram ecientemente protegidos no primeiro dia de vida, mas no apresentaram a mesma prote-
634
Captulo 24
o aos sete dias de idade. Neste caso, a proteo apresentou uma correlao signicativa com a presena de nveis altos de anticorpos no sistema respiratrio, mas no no soro.
5.9.4 Diagnstico
O diagnstico laboratorial do IBV pode ser realizado pelo isolamento e identicao do vrus. O material mais adequado para o isolamento viral a traquia, cujo material pode ser coletado com o auxlio de suabes ou fragmentos de tecido durante o exame post-mortem. Fragmentos dos rins e dos ovidutos tambm so indicados para o isolamento, pois o vrus pode replicar nesses tecidos. Suabes cloacais e tonsilas cecais tambm podem ser coletados. O mtodo mais utilizado para o isolamento do vrus a inoculao na cavidade alantide de embries de galinha com nove a onze dias. As alteraes produzidas pelo vrus so o nanismo e congesto dos vasos sangneos, visveis ao exame em ovoscpio. Em muitos casos, so necessrias trs a quatro passagens para se observar as leses. Algumas cepas do vrus podem matar os embries em 48 a 72 horas. O isolamento atravs de uma ou no mximo duas passagens de 24 horas em ovos embrionados, com posterior deteco por RT-PCR, uma estratgia que tem sido bastante utilizada por vrios laboratrios. Outra forma de isolar o vrus a inoculao em explantes de anel traqueal de pintos de um dia. Nesse caso, a presena do vrus ser detectada pela ciliostase (parada do movimento ciliar) que ocorre dois a trs dias aps a inoculao. A utilizao de cultivos celulares no recomendada para o isolamento, porque necessria uma adaptao prvia dos vrus aos cultivos. A propagao do IBV em cultivos celulares utilizada somente para a realizao de tcnicas sorolgicas e pesquisas com cepas adaptadas. A identicao do vrus pode ser realizada por IFA, IPX, ME ou imunodifuso em gel de gar (IDGA). ELISA utilizando anticorpos monoclonais pode ser aplicada para detectar o vrus e tambm para determinar os sorotipos no uido alantide ou cultivos de traquia. As tcnicas moleculares, como RT-PCR e nested-PCR, tm
sido cada vez mais utilizadas. Essas tcnicas permitem a obteno de resultados mais acurados quando se objetiva identicar diferentes cepas do vrus. Para a deteco de anticorpos contra o IBV, podem ser empregados os testes de inibio da hemaglutinao (HI), SN, IDGA e ELISA. A sorologia complicada pela grande quantidade de sorotipos existentes que apresentam antgenos especcos de grupo e especcos do sorotipo. A tcnica de ELISA rotineiramente utilizada para monitoramentos e pesquisa e detecta antgenos de grupo. A SN e HI so consideradas sorotipoespeccas.

O controle da bronquite infecciosa realizado pela vacinao, com vacinas atenuadas administradas na gua, em aerossis ou diretamente na conjuntiva. Vacinas inativadas de aplicao individual tambm so utilizadas. Grande parte das vacinas contm a cepa Massachussets, por ter sido este vrus inicialmente isolado de vrios pases. Em alguns pases, so includas cepas locais, por causa da grande variao antignica do vrus. As aves de corte so geralmente vacinadas com um ou sete dias de idade e no recebem reforo. Para aves de postura, so recomendados diferentes protocolos de vacinao, com uma vacinao inicial no pinto (um ou sete dias) e um ou mais reforos durante o perodo de postura. No recomendada a aplicao da primeira dose de vacina no pinto de um dia pela possibilidade de interferncia da imunidade passiva. No obstante, este um procedimento freqentemente utilizado.
5.10 Coronavrus dos perus

O coronavrus dos perus (turkey coronavirus TCoV) o agente etiolgico da doena conhecida como Bluecomb Disease (doena da crista azul), sendo classicado como um coronavrus grupo II. O TCoV foi inicialmente isolado em criatrios do estado americano de Minessota, na dcada de 1950. Posteriormente, o agente foi identicado
Coronaviridae
635
em vrias regies daquele pas, no Canad e na Austrlia. A doena caracteriza-se por uma enterite que cursa com diarria, anorexia, depresso e perda de peso. Perus de todas as idades so susceptveis, mas a doena mais freqente em peruzinhos com poucas semanas de vida. A mortalidade varivel e depende de outros fatores, como a presena de infeces secundrias, condies climticas e prticas de manejo. A transmisso do TCoV ocorre pela via fecal-oral, de forma direta ou por utenslios, alimentos, gua e outros veculos contaminados. A transmisso mecnica por cascudinhos dos avirios, aves silvestres, ces, roedores e moscas tambm tem sido esporadicamente descrita. Perus recuperados da infeco so resistentes reinfeco pelo TCoV, e esta resistncia parece estar associada com a presena de IgA na mucosa intestinal. O diagnstico do TCoV pode ser realizado pela deteco do vrus nas fezes ou no intestino, pela microscopia eletrnica ou por imunoistoqumica. No h vacinas disponveis no mercado contra este vrus. Uma doena entrica nova de perus, que cursa com altos ndices de morbidade e mortalidade, vem sendo observada em criaes industriais de perus em vrios pases, inclusive no Brasil. Esta doena foi denominada de sndrome da mortalidade por enterite em peruzinhos (poult enteritis-mortality syndrome PEMS). Os sinais clnicos so: diarria, depresso severa, desidratao, anorexia, imunossupresso e perda de peso. A etiologia dessa doena no est totalmente esclarecida; no entanto, acredita-se que o TCOV possua um papel importante na sua etiologia. A deteco de maior prevalncia do vrus em reas em que a doena ocorre, quando comparada com reas indenes, sugerem essa associao. Alm disso, a co-infeco de perus de poucos dias de vida com o TCOV e a Escherichia coli reproduziu as manifestaes clnicas observadas nos surtos naturais. Por outro lado, a infeco apenas com o TCOV no induziu a doena e, em alguns casos de doena natural, o vrus no pode ser isolado. Portanto, o papel do TCOV na PEMS ainda uma questo controversa, embora as evidncias indiquem alguma participao do agente na etiologia dessa doena.
6 Torovrus de interesse veterinrio

Os torovrus tm sido detectados em humanos com gastrenterite (HToV) e em sunos (PToV), alm de bovinos e eqinos. So conhecidos dois torovrus que infectam bovinos: o torovrus bovino (BToV) e o vrus breda bovino (BRV); e dois que infectam eqinos: o torovrus eqino (EToV) e o vrus berne eqino (BEV). Somente o BRV e o BEV produzem doena clnica em seus hospedeiros. Anticorpos contra o BRV e o BEV j foram detectados em vrios outros mamferos. Estudos genticos demonstraram a semelhana dos torovrus com os outros membros da famlia Coronaviridae na estrutura, na organizao genmica e na estratgia de replicao, com a produo de mRNA subgenmicos. Os vrions apresentam uma morfologia pleomrca, com um nucleocapsdeo tubular, e, quando examinados sob microscopia eletrnica, exibem uma forma de rim ou de bacilo. Esses vrus possuem um genoma RNA de sentido positivo com 25 a 30 kb.
6.1 Vrus Berne eqino

O vrus Berne eqino (BEV) foi isolado e identicado em Berna, na Sua, em 1983, de material proveniente de um eqino com diarria. Anticorpos contra o vrus foram posteriormente detectados em eqinos de outros pases da Europa, mas ainda no houve descrio de outros casos da doena. O vrus foi extensivamente estudado e, pelas suas caractersticas, foi classicado nesse gnero. Aparentemente, esse vrus possui pouca importncia como patgeno para a espcie eqina. O torovrus eqino (EToV) pertence ao gnero torovrus, no entanto no associado a doena nessa espcie.
6.2 Vrus Breda bovino

O vrus Breda bovino (BRV) causa diarria e desidratao em bovinos naturalmente infectados ou aps a inoculao experimental. O vrus infecta clulas epiteliais dos intestinos delgado e grosso de bezerros de at cinco a seis meses
636
Captulo 24
de idade. A diarria ocorre 24 a 72 horas aps a inoculao, juntamente com anorexia e depresso, que podem durar de trs a cinco dias. O vrus produz leses nas clulas das vilosidades e criptas intestinais, causando necrose e exfoliao dos entercitos. O BRV no replica bem em cultivo celular e foi associado com enterite, pela primeira vez, em 1982. O vrus j foi detectado na Holanda, Alemanha, Sua, Inglaterra, Frana, Itlia, frica do Sul, Costa Rica, Estados Unidos e Canad. Nos EUA, aproximadamente 90% do gado de leite soropositivo. Na Holanda, 6,4% dos animais com diarria eram positivos para o BRV, enquanto apenas 1,7% de assintomticos foram positivos. Existem dois sorotipos do vrus, o BRV-1 e o BRV-2. Vacas assintomticas provavelmente servem de reservatrios do vrus. O torovrus bovino (BToV) uma espcie de vrus distinta do BRV e tem sido detectado em secrees nasais, embora no cause doena.
7 Coronavrus humanos
Os coronavrus humanos (HCoV) so responsveis por 15-20% dos resfriados comuns que afetam a populao. As cepas HCoV-229E e HCoV-OC43 so freqentemente envolvidas, embora exista uma variabilidade antignica muito grande entre os isolados desses vrus. Os surtos ocorrem principalmente no inverno, com um perodo de incubao que varia entre dois e quatro dias. Alguns dos sinais clnicos observados so: febre, dor de cabea, dor de garganta, descarga nasal e tosse. Os indivduos infectados so suscetveis a reinfeces com o mesmo vrus ou com outro antigenicamente diferente. Esta segunda infeco pode resultar em sintomatologia semelhante primeira ou em uma forma mais branda. Um novo coronavrus humano denominado SARS-CoV altamente patognico foi isolado recentemente de pacientes com uma sndrome denominada pneumonia asitica (SARS, severe acute respiratory disease). A enfermidade foi inicialmente detectada na China, em novembro de 2002. O vrus disseminou-se, posteriormente, pela sia, por alguns pases europeus e pelo Canad, infectando mais de 8.000 pessoas e matando 774.
O ltimo caso foi descrito em abril de 2004. As pessoas afetadas apresentavam febre, cefalia, dispnia e evidncia radiolgica de pneumonia. O vrus associado com essa doena era diferente de todas as espcies de coronavrus conhecidas at ento. Estudos epidemiolgicos e moleculares demonstraram que o vrus teve origem em um animal silvestre e adaptou-se espcie humana. O hospedeiro natural do vrus ainda no foi determinado, mas os candidatos mais provveis so o masked palm civet cat e o racoon dog, ambas espcies tpicas da China. Foi tambm sugerido que o gato civet teria servido somente de hospedeiro intermedirio, no qual o vrus foi amplicado, e no como o reservatrio original do vrus. Recentemente um coronavrus foi identicado em morcegos, com grande homologia com o da SARS, sugerindo que essa possa ser a origem do vrus da SARS. A pneumonia asitica foi rapidamente controlada graas ao trabalho desenvolvido por uma rede de prossionais em todos os locais onde houve a ocorrncia da infeco, interconectados atravs da Organizao Mundial de Sade (OMS WHO).
ADDIE, D.D. et al. Secong international feline coronavirus/ feline infectious peritonitis symposium. Recommendations from workshops of the second international feline coronavirus/feline infectious peritonitis symposium. J. Feline Med. Surg., v.6, n.2, p.125-130, 2004. ADDIE, D.D. et al. Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J. Gen. Virol., v.84, n10, p.27352744, 2003. ANIMAS S.B. et al. Experimental infection with avian infectious bronchitis virus (Kagoshima-34 strain) in chicks at different ages. J. Vet. Med. Sci., v.56, n.3, p.443-447, 1994. BANDAI, C.S. et al. Canine coronavirus infections in Japan: virological and epidemiological aspects. J. Vet. Med. Sci., v.61, p.731-736, 1999. BATTILANI, M. et al. Quasispecies composition and phylogenetic analysis of feline coronaviruses (FCoVs) in naturally infected cats. FEMS Immunol. Med. Microbiol., v.28, n.39 p.141-147, 2003. BENETKA, V. et al. Prevalence of feline coronavirus types I and II in cats with histopathologically veried feline infectious peritonitis. Vet Microbiol., v.26, n.99, p.31-42, 2004.
Coronaviridae
637
HAIJEMA, B.J. et al. Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specic genes provide protection against feline infectious peritonitis. J. Virol., v.78, n.8, p.3863-3871, 2004. HASOKSUZ, M. et al. Detection of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in Northwestern Turkey. Acta Vet. Hung., v.53, n.1, p.137-146, 2005. HERREWEGH, A.A. et al. Detection of feline coronavirus RNA in feces, tissues, and body uids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol., v.33, n.3, p.684689, 1995. HIRSH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary microbiology. Massachusetts: Blacwell Science, 1999. KANESHIMA, T. The prevalence of a group 2 coronavirus in dogs in Japan. J. Vet. Med. Sci., v.68, n.1, p.21-25, 2006. IGNJATOVIC, J.; SAPATS, S. Identication of previously unknown antigenic epitopes on the S and N proteins of avian infectious bronchitis virus. Arch. Virol., v.150, n.9, p.1813-1831, 2005. IGNJATOVIC, J. et al. Pathogenicity of Australian strains of avian infectious bronchitis virus. J. Comp. Pathol., v.126, n.2-3, p.115-123, 2002. IGNJATOVIC J.; SAPATS, S. Avian infectious bronchitis virus. Rev. Sci. Tech., v.19, n.2, p.493-508, 2000. JABRANE, A. et al. Pathogenicity of porcine respiratory coronavirus isolated in Quebec. Can. Vet. J., v.35, n.2, p.86-92, 1994. JEONG, J.H. et al. Detection and isolation of winter dysentery bovine coronavirus circulated in Korea during 2002-2004. J. Vet. Med. Sci., v.67, n.2, p.187-189, 2005. JEREZ, J.A. et al. Deteco de rotavrus e coronavrus em fezes de bezerros neonatos com diarria criados em vrios municpios do Estado de So Paulo, Brasil. Arquivo do Instituto Biolgico, So Paulo, v. 69, n. 2, p.19-23, 2002. KAPIL, S. et al. Cellular immune status of coronavirus-infected neonatal calves. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., v.17, n.2, p.133-138, 1994. KEENAN, K.P. et al. Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1-71: studies by virologic, histologic, histochemical, and immunouorescent techniques. Am J Vet Res., v.37, n.3, 247-56, 1976. KENNEDY, M. et al. Deletions in the 7a ORF of feline coronavirus associated with an epidemic of feline infectious peritonitis. Vet. Microbiol., v.8, n.81, p.227-234, 2001. KISS, I. et al. Prevalence and genetic pattern of feline coronaviruses in urban cat populations. Vet. J., v.159, n.1, p.64-70, 2000.
BINN, L.N. et al. Recovery and characterization of a coronavirus from military dogs with diarrhea. Proc. Ann. Meting US An. Health Assoc., v.78, p.359-366, 1974. BRANDO, P.E. et al. Bovine coronavirus detection in adult cows in Brazil. Arquivo do Instituto Biolgico, So Paulo, v. 69, n. 2, p.103-104, 2002. BRIAN, D.A.; BARIC, R.S. Coronavirus genome structure and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol., v.287, p1-30, 2005. COX, E. et al. Intestinal protection against challenge with transmissible gastroenteritis virus of pigs immune after infection with the porcine respiratory coronavirus. Vaccine, v.11, n.2, p.267-272, 1993. Bchen-Osmond, C. Famlia Coronaviridae. In: International Committee on taxonomy of viruses, Oracle, 2004 . Disponvel em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/19000000. htm. Acesso em: 18 set. 2006. CROUCH, C.F. et al. Lactogenic immunity following vaccination of cattle with bovine coronavirus. Vaccine, v.19, n.2-3, p.189-196, 2000. DECARO N. et al. Fecal immunoglobulin A antibodies in dogs infected or vaccinated with canine coronavirus. Clin. Diagn. Lab. Immunol., v.11, n.1, p.102-105, 2004. DEZENGRINI, R. Soroprevalncia de infeces vricas em ces de Santa Maria, RS; e seleo e caracterizao de linhagens celulares resistentes ao vrus da diarria viral bovina. 2006. 62f. Dissertao (Mestrado em Medicina Veterinria) Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2006. CASTRO, A.E.; HEUSCHELE, W.P. Veterinary diagnostic virology, a practitioners guide. St Louis: Mosby Year Book, 1992. 285p. ERLES, K. et al. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology, v.310, p.216-223, 2003. GALLAGHER, T.M.; BUCHMEIER, M.J. Coronavirus spike proteins in viral entry and pathogenesis. Virology. v.279, n.2, p.371-374, 2001. GONON, V. et al. Clearance of infection in cats naturally infected with feline coronaviruses is associated with an anti-S glycoprotein antibody response. J. Gen. Virol., n.9, p.2315-2317, 1999. GREEN, J.S. et al. Serologic response of captive coyotes (Canis latrans Say) to canine parvovirus and accompanying proles of canine coronavirus titers. J. Wildl. Dis., v.20, n.1, p.6-11, 1984. GUNN-MOORE, D.A. et al. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Vet. Microbiol., v.62, n.3, p193-205, 1998.
638
KNIPE et al. Fields Virology. 4. ed. New York: Lippincott Williams & Wilkins. 2001. LAU S.K. et al. Severe acute respiratory syndrome coronaviruslike virus in Chinese horseshoe bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., v.27, n.102, p.140-145, 2005. LIU, L. et al. Molecular epidemiology of bovine coronavirus on the basis of comparative analyses of the S gene. J. Clin. Microbiol., v.44, n.3, p.957-960, 2006. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3. ed. San Diego: Academic, 1999. 629p. NAYLOR, M.J. et al. Canine coronavirus in australian dogs. Austr. Vet. J., v.79, p.116-119, 2001. PEI, J. et al. Memory T cells protect chicks from acute infectious bronchitis virus infection. Virology. v.306, n.2, p.376-384, 2003. PENSAERT, M.B. Porcine epidemic diarrhea. In: STRAW, B.E. et al. Diseases of swine. Ames: Iowa State University, 1999. Cap.16, p.179-185. PRATELLI, A. Genetic evolution of canine coronavirus and recent advances in prophylaxis, Veterinary Research, v.37, p.191-200, 2006. PRATELLI, A. et al. Prevalence of canine coronavirus antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay in dogs in the south of Italy. Journal of Virological Methods, v.102, p.67-71, 2002. ROTTIER, P.J.M. The molecular dynamics of feline coronaviruses. Vet. Microbiol., v.69, n.1-2, p.117-125, 1999. SAIF, L.J.; WESLEY, R.D. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory coronavirus. In: STRAW, B.E. et al. Diseases of swine. Ames: Iowa State University, 1999. Cap.24, p.295-324. SAIF, L.J. Mucosal immunity: an overview and studies of enteric and respiratory coronavirus infections in a swine model of enteric disease. Vet. Immunol. Immunopathol., v.54, n.1-4, p.163-169, 1996. SAIF, L.J. et al. Experimentally induced coronavirus infections in calves: viral replication in the respiratory and intestinal tracts. Am. J. Vet. Res., v.47, n.7, p.1426-1432, 1986. SOBESTIANSKY, J. et al. Clnica e patologia suna. Goinia: Art 3 Impressos Especiais, 1999. 464 p. STORZ, J. et al. Comparison of hemagglutinating, receptordestroying, and acetylesterase activities of avirulent and virulent bovine coronavirus strains. Arch. Virol., v.125, n.1-4, p.193-204, 1992.
Captulo 24
TENNANT B.J., et al. Studies on the survival of canine coronavirus under different environmental conditions. Vet Microbiol., v.42, n.2-3, p.255-259, 1994. TENNANT, B.J. et al. Canine coronavirus infection in the dog following oronasal inoculation. Res. Vet. Sci., v.51, n.1, p.11-18, 1991. TIMONEY, J.F. et al. Hagan and Bruners microbiology and infectious diseases of domestic animals. 8. ed. Ithaca: Cornell University, 1988. 951p. TRAVEN, M. et al. Experimental reproduction of winter dysentery in lactating cows using BCV - comparison with BCV infection in milk-fed calves. Vet. Microbiol., v.81, n.2, p.127-151, 2001. VENNEMA, H. Genetic drift and genetic shift during feline coronavirus evolution. Vet. Microbiol., v.69, n. 1-2, p.139-141, 1999. VENNEMA, H. et al. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology, v.30, n.243, p.150-157, 1998. WESLEY, R.D.; WOODS, R.D. Induction of protective immunity against transmissible gastroenteritis virus after exposure of neonatal pigs to porcine respiratory coronavirus. Am. J. Vet. Res., v.57, n.2, p.157-162, 1996. WESLEY, R.D.; LAGER, K.M. Increased litter survival rates, reduced clinical illness and better lactogenic immunity against TGEV in gilts that were primed as neonates with porcine respiratory coronavirus (PRCV). Vet. Microbiol., v.1, n.95, p.175-186, 2003. WESLEY, R.D. The S gene of canine coronavirus, strain UCD-1, is more closely related to the S gene of transmissible gastroenteritis virus than to that of feline infectious peritonitis virus. Virus Res., v.61, n.2, p.145-152, 1999. YESILBAG, K. et al. Canine coronavirus infection in Turkish dog population. J. Vet. Med., v.51, p.353-355, 2004. ZHANG, X. et al. Comparison of the S genes and the biological properties of respiratory and enteropathogenic bovine coronaviruses. Arch Virol., v.134, n.3-4, p.421-426, 1994.
ARTERIVIRIDAE
Marcelo de Lima & Fernando Abel Osorio
25
641 641 641 643
643 644 644 645 645
1 Introduo 2 Classicao 3 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica 4 Ciclo replicativo
4.1 Adsoro e penetrao 4.2 Replicao do genoma 4.3 Produo de RNAs mensageiros subgenmicos 4.4 Traduo e processamento das protenas 4.5 Morfognese e egresso
5 Arterivrus de importncia veterinria

5.1 Vrus da arterite eqina 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia e sinais clnicos 5.1.3 Patologia 5.1.4 Imunidade 5.1.5 Diagnstico 5.1.6 Controle e prolaxia 5.2 Vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos 5.2.1 Epidemiologia 5.2.2 Patogenia e sinais clnicos 5.2.3 Imunidade 5.2.4 Diagnstico 5.2.5 Controle e prolaxia
646
646 646 647 648 648 648 649 649 650 651 652 652 653
6 Perspectivas 7 Bibliograa consultada
654 654
1 Introduo
Durante a dcada de 1990, semelhanas na estrutura e morfologia dos vrions, na seqncia de nucleotdeos e organizao genmica, alm de propriedades biolgicas em comum, levaram o vrus da arterite eqina (EAV), o vrus elevador da lactato-desidrogenase (LDEV), o vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) e o vrus da febre hemorrgica dos smios (SHFV) a serem agrupados em uma nova famlia viral, a Arteriviridae. O nome da famlia foi derivado da doena causada pelo EAV em eqinos. Acredita-se que exista uma ligao evolutiva entre os arterivrus e os membros da famlia Coronaviridae, apesar de diferenas marcantes estruturais, genmicas e biolgicas. Essa relao decorrente de semelhanas existentes nos genes que codicam as enzimas do complexo replicase e tambm devido utilizao de estratgias similares de expresso gnica. Os arterivrus compartilham diversas propriedades biolgicas e moleculares, so restritos aos seus hospedeiros naturais e possuem a capacidade de causar infeces persistentes assintomticas em hospedeiros susceptveis (Tabela 25.1). Alm disso, a produo de um grupo de RNAs mensageiros subgenmicos (mRNAsg) que, posteriormente, so traduzidos em protenas estruturais, constitui-se em uma propriedade nica dos arterivrus e coronavrus e serviu como base para a criao da ordem Nidovirales (do latim; nido = ninho).
2 Classicao
Ordem: Nidovirales Famlia: Arteriviridae Gnero: Arterivirus Espcies: vrus da arterite eqina (EAV), vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV), vrus elevador da lactato desidrogenase (LDEV), vrus da febre hemorrgica dos smios (SHFV).
3 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica

Os membros da famlia Arteriviridae possuem vrions relativamente pequenos (45-60 nm de dimetro), esfricos e com superfcie aproximadamente regular. Possuem um nucleocapsdeo possivelmente icosadrico, com dimetro entre 25 e 35 nm, envolto por um envelope lipoprotico com pequenas projees (Figura 25.1). Os vrions perdem a infectividade rapidamente quando expostos a temperaturas 4C e so instveis em solues com baixas concentraes de detergentes no-inicos ou com pH abaixo de 6 ou acima de 7.5. O genoma consiste de uma molcula linear de RNA, ta simples, de sentido positivo, com aproximadamente 13-15 kb. A organizao genmica muito similar entre os membros da famlia Arteriviridae. O RNA viral infeccioso quando
Tabela 25.1. Doenas animais associadas com infeces por arterivrus.
Vrus
EAV PRRSV LDEV SHF
Hospedeiro
Eqinos Sunos Camundongos Macacos
Conseqncias da infeco
Infeces persistentes em garanhes, artrite, abortamentos, pneumonia em potros Infeces subclnicas, enfermidade respiratria e distrbios reprodutivos Infeces subclnicas em colnias de camundongos Doena sistmica, hemorragias e morte
642
Captulo 25
introduzido articialmente em clulas permissivas, possui uma estrutura cap na extremidade 5 e uma cauda de poli-A na extremidade 3. Uma representao esquemtica da estrutura e organizao do genoma dos arterivrus est apresentada na Figura 25.2. As protenas no-estruturais so traduzidas pela traduo das ORFs (open reading frames) 1a e 1b que abrangem cerca de 80% do genoma policistrnico dos arterivrus. A ORF1a extremamente varivel, enquanto a
ORF1b possui um alto nvel de conservao entre todos os arterivrus. As outras ORFs, localizadas na extremidade 3 do genoma, codicam protenas estruturais que permanecem associadas como componentes dos vrions. Essas protenas so produzidas pela traduo de um grupo de um grupo de RNA mensageiros subgenmicos (mRNAsg), que, por sua vez, so produzidos pela transcrio da cpia de RNA de sentido antigenmico.
Arteriviridae
643
4 Ciclo replicativo
Os arterivrus replicam ecientemente em cultivos primrios de macrfagos de seus hospedeiros naturais. O SHFV e o PRRSV replicam tambm em clulas da linhagem MA-104 e suas derivadas (MARC-145). Alm disso, diversas outras linhagens celulares so permissivas replicao do EAV. O ciclo de replicao relativamente curto e ttulos superiores a 108 DICC50 (dose infectiva para 50% dos cultivos celulares) so facilmente observados no sobrenadante de clulas infectadas com o EAV e com o SHFV. O
efeito citoptico durante a infeco de clulas de cultivo caracteriza-se por arredondamento celular e desprendimento das clulas infectadas da superfcie dos frascos de cultivo. As principais etapas do ciclo replicativo esto representadas na Figura 25.3.
4.1 Adsoro e penetrao

A replicao dos arterivrus ocorre na regio perinuclear do citoplasma das clulas hospedeiras. In vivo, os principais alvos de replicao so clulas da linhagem macrofgica. In vitro, repli-
mudana de fase de leitura

5 1a 3 2 1b 3 4 5 6 7
mRNA1
traduo do genoma
M
poliprotena replicase 1a poliprotena replicase 1ab processamento da replicase
2
GS
GL
GN
mRNA 2
3
mRNA 3
4
protenas no-estruturais
traduo dos mRNA subgenmicos
mRNA 4
5 6
mRNA 5 mRNA 6
7
replicao do genoma
transcrio dos mRNAs subgenmicos
mRNA 7
RNA genmico
protenas estruturais
morfognese e egresso
Adaptado de Snijder & Meulenberg (2001).
Figura 25.3. Etapas da expresso gnica e replicao do genoma dos arterivrus (EAV). Aps a penetrao e desnudamento, a primeira etapa a traduo direta das ORFs 1a e 1b, resultando na produo de duas poliprotenas (replicase 1a e replicase 1ab), que sero clivadas originando as enzimas do complexo replicase (protenas NS). Essas enzimas realizam a transcrio integral do genoma, originando uma cpia de sentido antigenmico (polaridade negativa). Utilizando esta molcula como molde, o complexo replicase transcreve regies prximas extremidade 3', resultando na produo de vrios mRNAsg que codificam as protenas estruturais. A transcrio integral da cpia antigenmica resulta na produo de RNAs com a extenso genmica, que, juntamente com as protenas estruturais, iro participar da morfognese da prognie viral. Note que para o EAV, os produtos das ORFs 2a e 2b denominam-se protenas E e GS, respectivamente, enquanto a ORF5 codifica a GL ou gp5.
644
Captulo 25
cao produtiva em linhagens celulares no-susceptveis infeco natural pode ser produzida por transfeco do RNA genmico. A adsoro dos vrions superfcie das clulas hospedeiras ocorre provavelmente pela interao da glicoprotena 5 (gp5) ou do dmero gp5/M com uma protena de 210 kDa, localizada na membrana plasmtica de macrfagos alveolares. Em clulas MARC-145, uma molcula de superfcie, com caractersticas similares heparina, poderia servir de receptor para o PRRSV. A penetrao do vrus na clula hospedeira ocorre por endocitose mediada por receptor, e a fuso do envelope com a membrana plasmtica dependente da reduo de pH que ocorre nos endossomos.
o das molculas de sentido antigenmico, pela produo dos mRNAsg e pela sntese das cpias de sentido genmico. As enzimas do complexo replicase so produzidas em etapas iniciais do ciclo, pela traduo direta das ORFs 1a e 1b. Com exceo de pequenas seqncias notraduzidas, localizadas prximas s extremidades 5 (156 a 221 nucleotdeos) e 3 (59 a 117 nt), que provavelmente contm sinais importantes para a replicao e traduo do genoma viral, as demais regies genmicas so codicantes.
4.3 Produo de RNAs mensageiros subgenmicos

A expresso dos genes presentes no tero 3 do genoma ocorre pela traduo de um grupo de RNA mensageiros subgenmicos (mRNAsg). Este mecanismo se constitui em uma caracterstica nica do ciclo replicativo dos membros da ordem Nidovirales. Os mRNAsg so sintetizados por um mecanismo de transcrio muito similar ao que foi proposto para os coronavrus. Os modelos propostos para a sntese de mRNAsg esto apresentados na Figura 25.4. Todos os mRNAsg possuem uma seqncia leader na extremidade 5

A replicao do genoma dos arterivrus ocorre integralmente no citoplasma e envolve a sntese de uma molcula de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa). Essa molcula serve de molde para a sntese de mRNAsg para a produo das protenas estruturais e para a sntese de cpias de extenso e sentido genmico. O complexo replicase responsvel pela produ-
A
genoma
(+) 5 (-) 3 (+) 5
(+) 5
(-) 3 (+) 5
mRNA subgenmico
B
( - ) 3 (+) 5 (+) 5 (-) 3
genoma
(+) 5 mRNA subgenmico
( - ) 3
(+) 5
Adaptado de Snijder & Meulenberg (2001).
Figura 25.4. Modelos propostos para a sntese de RNAs mensageiros subgenmicos (mRNAsg). A) Transcrio a partir da molcula de RNA antigenmico (sentido negativo); B) Transcrio a partir do RNA genmico (sentido positivo), originando RNAsg subgenmicos que serviriam de molde para a sntese dos mRNAsg correspondentes.
Arteriviridae
645
derivada da extremidade equivalente do genoma viral fusionada ao RNA mensageiro atravs de um mecanismo de transcrio descontnua, alm de pequenas seqncias conservadas envolvidas na regulao da transcrio (TRS) na extremidade 3. Atualmente, evidncias indicam que o modelo de transcrio mais consistente seria a gerao de mRNAsg, atravs de um mecanismo de sntese descontnua a partir do RNA genmico. De acordo com este modelo, poderia ocorrer tanto a gerao de mRNAsg de sentido negativo (sntese descontnua), como de RNA antigenmico (sntese contnua). Em uma etapa subseqente, os RNAsg de sentido negativo seriam transcritos em molculas de sentido positivo (mRNAsg), que seriam, posteriormente, traduzidas em protenas estruturais, enquanto o RNA antigenmico (sentido negativo) serviria de molde para a sntese de RNA genmico.
4.4 Traduo e processamento das protenas

As protenas que formam o complexo replicase so produzidas pela traduo direta do RNA genmico a partir das ORFs 1a e 1b (Figura 25.3). A traduo da ORF1b envolve um mecanismo denominado -1 ribosomal frameshift, ou seja, em um determinado ponto, ao nal da traduo da ORF1a, os ribossomos mudam de fase de leitura (voltam 1 nucleotdeo) e passam a traduzir a ORF1b em uma diferente fase. A ORF1a traduzida em uma poliprotena que , posteriormente, clivada, originando oito polipeptdeos no-estruturais (Nsp1 a Nsp8). No EAV, a Nsp1, Nsp2 e Nsp4 possuem atividade proteoltica, sendo responsveis pelo processamento de outras Nsps. Tambm foi demonstrada a presena de, pelo menos, uma protease adicional para o LDEV e PRRSV e, possivelmente, duas para o SHFV. A clivagem proteoltica da poliprotena resultante da traduo da ORF1b resulta nos polipeptdeos Nsp10 a Nsp12. Um pequeno segmento N-terminal da Nsp9 codicado por cdons nais da ORF1a, enquanto grande parte desta protena codicada pela proximal da ORF1b. As regies com atividade de RNA polimerase e NTPase/RNA helicase que formam o complexo replicase esto associadas com a Nsp9 e Nsp10, respectivamente.
De um modo geral, os arterivrus possuem seis ou sete protenas componentes do envelope viral. O genoma do SHFV pode conter uma duplicao ou insero na extremidade proximal 3, resultando em ORFs adicionais que codicam outras glicoprotenas. As trs principais protenas estruturais, produtos das ORFs 5, 6 e 7 (PRRSV, EAV e LDV), so codicadas a partir de mRNAsg transcritos a partir da regio 3 do genoma. A protena M (produto da ORF6) uma protena integral de membrana, no glicosilada, sendo a protena estrutural mais conservada dos arterivrus. Aps a sua sntese, a protena M acumula-se no retculo endoplasmtico das clulas infectadas, onde interage com a principal glicoprotena do envelope viral (gp5), formando heterodmeros. Estes heterodmeros iro se localizar no envelope e so essenciais para a infectividade viral. A protena N pequena (12-15 kDa), interage com o RNA genmico durante a formao do nucleocapsdeo e constitui aproximadamente 20 a 40% da massa protica dos vrions. O produto das ORFs 2, 3 e 4 so protenas integrais de membrana clssicas do tipo I e possuem uma importncia relativamente menor em comparao com as outras protenas estruturais. Alm disso, no existe um consenso sobre a presena da gp3 como componente dos vrions em cepas norte-americanas do PRRSV. Embora as funes especcas de cada uma das protenas estruturais dos arterivrus no tenham sido completamente elucidadas, evidncias indicam que, aparentemente, todas as protenas exercem funes essenciais para a replicao e produo de prognie viral vivel.

A primeira etapa da morfognese envolve a associao do genoma RNA com mltiplas cpias da protena N, formando o nucleocapsdeo. A etapa seguinte envolve a interao dos nucleocapsdeos com as caudas das glicoprotenas do envelope e a conseqente aquisio do envelope. Os arterivrus adquirem o envelope pelo brotamento de nucleocapsdeos pr-formados para o interior do retculo endoplasmtico liso ou do complexo de Golgi. Aps a sua sntese, as protenas estruturais que participam da forma-
646
Captulo 25
o do envelope viral encontram-se retidas em membranas intracelulares. As partculas vricas, formadas pelo brotamento dos nucleocapsdeos em membranas do retculo endoplasmtico ou do Golgi, acumulam-se em vesculas intracelulares, no interior das quais so transportados at a membrana plasmtica. A liberao da prognie viral para o espao extracelular ocorre por exocitose, pela fuso dessas vesculas com a membrana plasmtica.
5.1.1 Epidemiologia
O primeiro isolamento do EAV foi realizado, em 1953, nos Estados Unidos, a partir do pulmo de um feto abortado no estado de Ohio. A partir de ento, a infeco tem sido detectada em populaes eqinas de todo o mundo, demonstrando a ampla disseminao do agente. Nos ltimos 10 a 15 anos, tem sido observado um aumento no nmero de surtos de EVA nos Estados Unidos e na Europa. O isolamento recente do vrus na Argentina e a deteco de sorologia positiva nos estados de So Paulo (18,2%) e Rio Grande do Sul (2,2%) conrmam a circulao do vrus na Amrica do Sul. O aumento do comrcio internacional de animais e smen eqino podem ter contribudo para a disseminao do EAV na populao eqina desses pases. A transmisso do EAV pode ocorrer por secrees e excrees de animais infectados ou ainda por aerossis, fmites, gua e alimentos contaminados. A excreo do vrus nas secrees e excrees de animais na fase aguda da infeco ocorre por um perodo curto, que geralmente no excede 16 dias. A transmisso por aerossis constitui-se na principal forma de disseminao do EAV, tanto nas propriedades destinadas reproduo como em locais com grande aglomerao e contato entre os animais. Outra via importante de transmisso do vrus a venrea. Trata-se de uma forma muito efetiva de transmisso, pois cerca de 85 a 100% das guas cobertas por garanhes portadores ou inseminadas com smen contaminado se infectam. A transmisso congnita tambm pode ocorrer, resultando em abortamento ou no nascimento de potros infectados. Nesses casos, os tecidos fetais e a placenta so considerados importantes fontes da infeco, pois contm grande quantidade de vrus. A transmisso pelo smen possui grande importncia epidemiolgica. Estima-se que entre 30 e 60% dos garanhes infectados tornam-se persistentemente infectados e excretam o vrus por longos perodos. O vrus pode persistir no garanho por semanas, meses ou anos e, em alguns casos, at por toda a vida. Entretanto, uma
5 Arterivrus de importncia veterinria

5.1 Vrus da arterite eqina
A arterite viral eqina (EVA) uma doena infecto-contagiosa de eqinos, causada por um membro da famlia Arteriviridae, denominado vrus da arterite eqina (equine arteritis virus, EAV). A denominao da doena se deve caracterstica inamatria das leses produzidas pelo vrus no endotlio dos vasos sangneos, especialmente nas arterolas. A infeco pelo EAV freqentemente se manifesta de forma subclnica ou com sinais leves, mas tambm pode resultar em sinais respiratrios em eqinos adultos, abortamento em guas e em pneumonia intersticial em neonatos. Apesar da existncia de diferenas antignicas entre isolados de campo, apenas um sorotipo do EAV reconhecido. A infeco pelo EAV pode ocasionar grandes prejuzos econmicos para a eqideocultura, tanto pelas perdas reprodutivas como pela reduo na performance de animais de esporte e competio. Os prejuzos geralmente se devem a: a) surtos de aborto e/ou morte de potros neonatos; b) reduo no valor comercial de garanhes infectados e na demanda reprodutiva desses animais; c) recusa do mercado internacional a garanhes e smen de garanhes portadores, e no caso de alguns pases, de qualquer animal soropositivo; e d) alteraes nos programas de treinamento e reduo ou cancelamento de corridas em casos de surtos de EVA em hipdromos.
Arteriviridae
647
porcentagem varivel de garanhes portadores erradica o vrus espontaneamente do seu trato reprodutivo. O estabelecimento e a manuteno da persistncia viral parecem ser dependentes de testosterona. Assim, machos castrados conseguem erradicar completamente o agente dos tecidos cerca de 2 a 3 semanas aps a infeco.

A patogenia da infeco pelo EAV foi estudada com base na deteco de antgenos virais e na distribuio das leses produzidas pelo agente. A penetrao do vrus geralmente ocorre pela via respiratria ou oral. Inicialmente o vrus replica no epitlio respiratrio e em macrfagos alveolares. Aps a replicao inicial, o vrus atinge os linfonodos regionais, especialmente os bronquiais. Por volta do terceiro dia aps a infeco, o vrus replica nos linfonodos bronco-pulmonares, no endotlio dos vasos pulmonares e em moncitos circulantes, tendo acesso circulao sangnea, atravs da qual se dissemina pelo organismo. Subseqentemente, ocorre a replicao no endotlio de um grande nmero de vasos sangneos. Passados aproximadamente 10 dias de infeco, a deteco de antgenos virais bastante reduzida na maioria dos tecidos previamente afetados, com exceo da tnica mdia das arterolas musculares. Aparentemente, o ltimo stio de invaso viral o epitlio tubular renal, onde o vrus pode persistir por um perodo adicional de duas semanas. As manifestaes clnicas da enfermidade so decorrentes das leses produzidas nos endotlios vasculares e do aumento da permeabilidade vascular, por causa da liberao de citoquinas vasoativas e mediadores inamatrios. Alm das alteraes inamatrias, os danos ao endotlio podem induzir anxia ou trombose. A patogenia da forma abortiva da enfermidade ainda no est completamente elucidada. Especula-se que o aborto ocorra devido a uma miometrite provocada pela replicao viral. A compresso dos vasos sangneos pelo edema endometrial e/ou alteraes no tnus vascular pela liberao de mediadores inamatrios promovem uma reduo no uxo sangneo para o feto. Alm disso, h uma reduo dos nveis de
progesterona entre 6 e 48 horas que antecedem o aborto. Esta reduo, combinada com a liberao local de prostaglandinas, pode levar ao descolamento da membrana corinica e expulso do feto. A maioria das infeces naturais pelo EAV so subclnicas e passam, portanto, despercebidas. No entanto, alguns animais desenvolvem sinais clnicos, tais como: descarga nasal mucopurulenta, lacrimejamento, conjuntivite, edema palpebral, escrotal e da glndula mamria, e, em quadros mais graves, edema pulmonar. Alm disso, em alguns casos, podem ser evidenciados sinais inespeccos, como: tosse, apatia, anorexia, diarria e clicas. Em geral, a severidade da EVA maior em animais jovens ou muito velhos; em animais debilitados e naqueles sob estresse fsico muito grande. importante salientar que, com poucas excees, a maioria dos animais afetados se recupera espontaneamente da enfermidade. Portanto, a mortalidade muito baixa e, na maioria das vezes, ocorre somente em neonatos infectados intra-uterinamente. Esses neonatos geralmente vo a bito devido a quadros fulminantes de pneumonia intersticial, que se manifestam entre 48 e 96 horas aps o nascimento. Apesar da ocorrncia de doena respiratria, os maiores prejuzos causados pela infeco devem-se principalmente s perdas reprodutivas. Os abortamentos ocorrem geralmente por causa de uma miometrite necrotizante grave, sem infeco fetal concomitante, mas com a presena de grande quantidade de vrus. Os abortamentos podem ocorrer com ou sem sinais respiratrios e/ou vasculares prvios. Geralmente os abortos ocorrem entre 7 a 14 dias aps o incio dos sinais clnicos, diferindo de abortamentos em fases tardias, como aqueles que ocorrem na rinopneumonite eqina. As guas que abortam parecem no sofrer nenhum efeito adverso com relao fertilidade. Em contraste, garanhes afetados pela EVA podem passar por um perodo curto de reduo de fertilidade. Acredita-se que este quadro transitrio deva-se ao aumento da temperatura testicular, que associado com a resposta inamatria local. Alm disso, os garanhes afetados freqentemente apresentam diminuio da libido, da
648
Captulo 25
concentrao e da motilidade espermtica, alm de apresentarem patologia espermtica elevada. Essas alteraes podem persistir por perodos de at 17 semanas. A persistncia do vrus no trato reprodutivo de animais cronicamente infectados no parece provocar essas alteraes e estes animais so portadores assintomticos do agente.
5.1.3 Patologia
Os isolados do EAV diferem na virulncia, na capacidade de induzir leses e na severidade das leses. As leses macroscpicas so o resultado das alteraes vasculares provocadas pela replicao viral. Edema, congesto e hemorragias do tecido subcutneo nos linfonodos e vsceras so os achados mais freqentes. As cavidades corporais podem conter quantidade moderada ou abundante de exsudato amarelado; e os pulmes, especialmente dos neonatos, encontramse edemaciados e contm grande quantidade de lquido. Em alguns casos, reas multifocais ou difusas de colorao avermelhada podem ser observadas nos pulmes, por causa de congesto e hemorragia. O endomtrio de guas que abortaram pode se apresentar edemaciado, congesto e, algumas vezes, com hemorragias. As alteraes histolgicas so observadas em vrios sistemas, porm a parede dos vasos so os locais mais afetados. As leses mais brandas incluem edema vascular e perivascular, com hipertroa das clulas endoteliais. Nos casos mais severos, observa-se vasculite e necrose brinide da tnica mdia, inltrado linfoctico abundante, freqente perda do endotlio e formao de trombos. Os pulmes podem apresentar pneumonia intersticial de grau leve a severo, caracterizada por inltrao alveolar de macrfagos, em menor nmero de neutrlos e formao de membrana hialina. Alm disso, ocorre hipertroa e hiperplasia dos pneumcitos, arterite e ebite nos vasos pulmonares. As leses renais, que podem ser severas, ocorrem em fases avanadas da infeco e se caracterizam por necrose tubular, nefrite intersticial, desorganizao glomerular e hipercelularidade. As leses no epitlio do trato reprodutivo
de guas que abortaram incluem edema, inltrao de macrfagos e neutrlos, presena de grandes fagolisossomos contendo material denso. O miomtrio pode conter micitos necrticos com aglomerao de ribossomos, macrfagos e edema. No trato reprodutivo do macho, as leses so caracterizadas por vasculite necrosante envolvendo os testculos, o epiddimo, os ductos deferentes, as ampolas, a prstata, as glndulas vesiculares e bulbouretrais.
5.1.4 Imunidade
Infeces naturais ou experimentais com o EAV resultam em imunidade duradoura contra reinfeces com diferentes cepas do vrus. Anticorpos com atividade neutralizante podem ser detectados entre 7 e 14 dias ps-infeco (dpi), coincidindo com o desaparecimento do vrus da circulao sangnea. Altos ttulos neutralizantes so geralmente detectados em animais com infeco persistente. A excreo viral pelo smen ocorre mesmo na presena de ttulos altos de anticorpos neutralizantes, indicando que a imunidade humoral no suciente para prevenir a replicao viral no trato reprodutivo dos machos. Os potros nascidos de fmeas imunes so protegidos da doena clnica nas primeiras semanas de vida devido transferncia passiva de anticorpos pelo colostro.
5.1.5 Diagnstico
O diagnstico da infeco pelo EAV pode ser realizado pela deteco direta do agente, de antgenos ou do RNA viral em tecidos ou em secrees provenientes de animais infectados. A deteco de anticorpos especcos tambm pode ser utilizada. O isolamento do vrus pode ser realizado em clulas das linhagens RK-13, Vero ou, ainda, em cultivos primrios de clulas pulmonares de eqinos. As amostras a serem enviadas ao laboratrio para o isolamento do vrus incluem suabes nasais e da nasofaringe ou amostras de sangue com anticoagulante. Para aumentar a probabilidade de deteco do vrus, as amostras devem ser coletadas no incio da fase febril. Em
Arteriviridae
649
casos de aborto, o isolamento viral pode ser tentado a partir da placenta, dos uidos fetais, pulmes, fgado e tecidos linforreticulares do feto abortado. Alm do isolamento do vrus, a deteco de antgenos pela tcnica de imunohistoqumica e a caracterizao das leses vasculares por exames histolgicos tambm podem auxiliar na conrmao da etiologia. Tcnicas moleculares, como a RT-PCR, tambm tm sido utilizadas para identicar a presena do vrus, especialmente em amostras de smen. A infeco pelo EAV freqentemente conrmada sorologicamente pela demonstrao de aumento signicativo (quatro vezes ou mais) nos ttulos de anticorpos contra o vrus. O teste de microneutralizao na presena de complemento amplamente utilizado, sendo um mtodo convel na identicao da infeco causada pelo EAV. Outros testes, como ELISA, soroneutralizao e imunodifuso, tambm podem ser utilizados para o diagnstico sorolgico da infeco. As manifestaes clnicas reprodutivas e respiratrias causadas pelo EAV devem ser diferenciadas daquelas causadas pelos herpesvrus eqino (EHV-1 e 4), adenovrus eqino e inuenza eqina. Infeces bacterianas e causas noinfecciosas de abortamento tambm devem ser consideradas no diagnstico diferencial.

Vacinas para a arterite viral eqina ainda no esto disponveis no mercado nacional. Apesar de a doena estar comprovadamente presente no Brasil, a vacina s poder ser registrada e comercializada quando a doena for ocialmente reconhecida pelas autoridades sanitrias. Nos Estados Unidos e Canad, uma vacina atenuada por passagens sucessivas em cultivo celular est disponvel comercialmente, sendo recomendada para minimizar a difuso do vrus e as perdas econmicas decorrentes da infeco. Vacinas inativadas tambm esto comercialmente disponveis em diversos pases europeus. No entanto, apesar das atuais vacinas serem consideradas seguras e ecazes, a incapacidade de diferenciao sorolgica entre animais vacinados e infectados se constitui em um dos principais obstculos aos
programas de vigilncia e controle. Entretanto, importante salientar que os garanhes podem ser protegidos do estabelecimento da infeco persistente pela vacinao, e que os testes de diagnstico disponveis para a deteco do vrus no smen so capazes de detectar portadores com um alto grau de segurana. A maioria das medidas de controle direcionada para prevenir ou restringir a disseminao do EAV em criaes de reprodutores na tentativa de minimizar os riscos de abortamentos, de mortalidade neonatal e o estabelecimento da infeco persistente nos garanhes. Tais medidas devem priorizar a identicao dos animais portadores e a vacinao dos reprodutores no-infectados. Os garanhes identicados como portadores devem ser manejados separadamente para evitar a transmisso do vrus para outros animais. Outro fator a ser considerado nos programas de controle o risco a introduo do agente em rebanhos pelo smen contaminado. Nesse sentido, recomendase a utilizao de smen proveniente de propriedades sabidamente livres do agente. Alternativamente, pode-se testar o smen para a presena do EAV antes de ser utilizado. Em virtude da importncia econmica da eqideocultura e da constante transferncia internacional de animais e de smen, a Organizao Mundial de Sade Animal (OIE) impe algumas regulamentaes ao comrcio internacional de eqinos e smen eqino, para prevenir a disseminao do EAV entre pases. Resumidamente, as normas recomendam que todos os animais a serem comercializados e os doadores de smen devem possuir um certicado internacional negativo para o EAV e apregoa, ainda, a vacinao regular desde os seis meses de idade.
5.2 Vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos

No nal da dcada de 1980, surtos de uma doena at ento desconhecida foram relatados simultaneamente em granjas de sunos nos estados da Carolina do Norte, Indiana, Minessota e Iowa, nos Estados Unidos. A sndrome consistia em perdas reprodutivas, pneumonia ps-desmame em leites, retardo no crescimento e aumen-
650
Captulo 25
to nas taxas de mortalidade. Surtos, com caractersticas clnicas semelhantes, foram relatados na Europa e sia no incio da dcada de 1990. A enfermidade foi inicialmente denominada doena misteriosa dos sunos e sndrome respiratria e infertilidade suna. A etiologia viral foi denida em 1991, e a doena cou posteriormente conhecida como a sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRS). Atualmente, a infeco pelo PRRSV est associada com perdas econmicas signicativas para a suinocultura comercial de vrios pases. Nos Estados Unidos, estima-se que a infeco pelo PRRSV resulte em prejuzos anuais de 560 milhes de dlares indstria suincola. No Brasil, um estudo sorolgico e virolgico, realizado entre 2003 e 2005, no demonstrou a presena da infeco pelo PRRSV em granjas de sunos. No entanto, tendo em vista a importncia da suinocultura brasileira no agronegcio nacional e internacional, indispensvel um monitoramento constante dos rebanhos, assim como de animais e material gentico introduzidos no pas.
5.2.1 Epidemiologia
A origem do PRRSV ainda permanece indenida. Especula-se que esse vrus possa ter se originado na Europa a partir do LDEV um arterivrus de camundongos e que sunos selvagens teriam servido como hospedeiros intermedirios antes de o vrus adquirir a capacidade de infectar sunos domsticos. Assim, o vrus teria sido transferido para a Amrica do Norte pela importao desses animais em 1912. Essa hiptese poderia explicar o longo perodo de evoluo independente do vrus nos dois continentes e estaria de acordo com o momento de divergncia gentica a partir de um ancestral comum, estimado ter ocorrido ao redor de 1880. Entretanto, apesar de diversos estudos investigando a origem do PRRSV, ainda no existem explicaes satisfatrias para a emergncia quase simultnea do vrus na Amrica do Norte e Europa. Atualmente, acredita-se que a infeco pelo PRRSV seja endmica na maioria dos pases produtores de sunos. Evidncias sorolgicas indi-
cam que o PRRSV j circulava em populaes sunas vrios anos antes de a doena se tornar evidente e economicamente importante. Um estudo sorolgico retrospectivo, em amostras coletadas no nal da dcada de 1970 e nos anos 1980, provenientes do Canad, Coria, Japo e Alemanha, demonstrou a presena de anticorpos especcos contra o PRRSV. Alguns pases europeus (Sucia, Sua, Noruega, Finlndia), alm de Nova Zelndia, Austrlia, Brasil, Argentina e algumas reas do Caribe, so considerados livres da infeco. Uma anlise gentica de cepas de referncia isoladas nos Estados Unidos e Europa demonstrou que a identidade de aminocidos entre as seqncias analisadas inferior a 60%. Com base nessas diferenas, os isolados de PRRSV foram divididos em dois gentipos: tipo I (europeu) e tipo II (norte-americano). De um modo geral, os isolados do gentipo I so restritos ao continente Europeu, enquanto os isolados do gentipo II so encontrados nos Estados Unidos, Canad, Mxico e tambm em pases asiticos. Entretanto, isolados do gentipo II j foram identicados na Europa, apresentando um alto grau de homologia com uma vacina atenuada norte-americana introduzida no continente em 1995. Por outro lado, isolados do tipo I tambm j foram identicados nos Estados Unidos, porm a sua origem ainda no foi determinada. Aparentemente, os sunos domsticos e selvagens so as nicas espcies naturalmente susceptveis a infeco pelo PRRSV. Embora os sunos no sejam igualmente susceptveis por todas as vias, a infeco pode ser estabelecida aps inoculao por via oral, intranasal, intramuscular, intravaginal e intrauterina. Os animais infectados excretam o vrus na saliva, em secrees nasais, urina, smen e, possivelmente, pelas fezes. A excreo pode ocorrer simultaneamente por diferentes vias em baixos nveis ou, ainda, de forma intermitente. A difuso da enfermidade atravs da inseminao articial de grande interesse epidemiolgico, pois o vrus pode ser detectado no smen de machos infectados mesmo na presenca de anticorpos neutralizantes e na ausncia de viremia. Excreo viral em secrees mamrias de fmeas gestantes foi tambm demonstrada em estudos experimentais. Alm disso, tambm exis-
Arteriviridae
651
te a possibilidade de transmisso do vrus atravs de fmites, vetores mecnicos etc. O perodo que segue a exposio de animais susceptveis ao PRRSV caracterizado por replicao viral abundante em macrfagos alveolares e teciduais. Em fases tardias da infeco, freqente a ocorrncia de persistncia viral, caracterizada por nveis baixos de replicao, principalmente em tecidos linfides. J foi possvel se isolar o vrus de tecidos de animais experimentalmente infectados aos 157 dpi e demonstrar a presena de RNA viral em tonsilas aos 257 dpi. Dessa forma, animais com infeces persistentes assintomticas podem se constituir em fontes de infeco para outros animais. Eventualmente o vrus parece ser completamente erradicado pelo sistema imunolgico do animal persistentemente infectado e, na maioria dos casos, isso pode levar vrios meses. J foi demonstrada a presena de vrus ou de RNA viral vrios meses aps a infeco. Os estudos que investigaram a viremia (apesar de diferenas entre cepas do tipo europeu e norteamericano ou entre cepas/isolados do mesmo gentipo) demonstraram viremia detectvel at quatro semanas pi em animais infectados. No entanto, aps esse perodo, as amostras podem continuar sendo positivas por PCR. Alm disso, a deteco de animais carreadores pode ser problemtica. Um estudo demonstrou que 54/191 suabes da orofaringe de fmeas de um rebanho foram positivas por PCR. No entanto, todas as amostras de soro dos mesmos animais foram negativas por PCR e isolamento viral. Em um outro estudo similar, foi isolado o vrus de 4/11 amostras positivas por PCR, demonstrando que replicao viral pode ocorrer na ausncia de viremia, uma vez que 11/11 das amostras de soro foram negativas por PCR e isolamento. Na grande maioria dos casos, a infeco aguda em machos clinicamente inaparente. Nesses animais, a viremia normalmente est presente em 100% dos animais nos primeiros 10 dias pi sendo, no entanto, detectvel at 3-4 semanas pi. A presena de vrus no smen j foi detectada at 92 dpi. Resultados de diferentes estudos ainda sugerem que a infeco persistente em sunos adul-
tos ocorre por um perodo mais curto quando comparado com a infeco em animais jovens.

Aps a penetrao, a replicao viral ocorre primariamente em macrfagos locais, de onde o vrus se dissemina e atinge rgos linfides, pulmes e, menos consistentemente, outros tecidos. A viremia geralmente detectvel 24 horas pi, e o vrus atinge ttulos mximos no sangue, nos linfonodos e pulmes entre os dias 7 e 14 pi. As manifestaes da PRRS podem variar desde infeces subclnicas at a ocorrncia de altas taxas de mortalidade nos rebanhos afetados. A ocorrncia e severidade da doena clnica dependem de vrios fatores, tais como a cepa viral e suscetibilidade do hospedeiro, alm de infeces concomitantes e/ou secundrias. freqente a ocorrncia de infeces mistas com o circovrus suino tipo 2 (PCV-2), cujas leses resultantes so muito semelhantes. A associao entre PRRSV e PCV-2 tambm pode resultar em pneumonia viral mais severa, decorrente da infeco pelo PRRSV, alm de uma replicao mais eciente e, conseqentemente, leses mais graves associadas ao PCV-2. Sinais freqentemente observados incluem anorexia, letargia, hiperemia cutnea e cianose das extremidades. Infeces ps-natais, com cepas virulentas, geralmente resultam em aumento de volume dos linfonodos e em pneumonia intersticial, que podem ocorrer em sunos de todas as idades. O parnquima afetado apresenta-se ligeiramente rme e mosqueado, com colorao acinzentada e aspecto mido. Leses mais severas podem estar difusamente distribudas. Microscopicamente, o septo alveolar encontra-se expandido por inltrao de macrfagos, linfcitos e plasmcitos e pode estar demarcado por pneumcitos tipo II hiperplsicos. Macrfagos necrticos, debris celulares e quantidade abundante de uido seroso podem ser encontrados nos alvolos pulmonares. A distribuio e severidade das leses variam de acordo com a virulncia da cepa. Deve-se levar em considerao que essas leses no so patognomnicas, pois outras infeces virais e/ou bacterianas podem produzir leses similares.
652
Captulo 25
A infeco de fmeas em idade reprodutiva ou em gestao pode resultar em abortamentos, retornos ao cio, natimortalidade e fetos parcialmente ou totalmente mumicados. Machos infectados apresentam perda de libido e reduo na qualidade do smen devido a defeitos no acrossoma e um decrscimo na motilidade espermtica. Embora os sinais clnicos variem amplamente em freqncia e severidade, a infeco de neonatos freqentemente resulta em sinais respiratrios graves e elevadas taxas de mortalidade. Na maioria das infeces causadas por PRRSV, os sinais clnicos associados a perdas reprodutivas no so especcos para uma determinada fase de gestao. Inicialmente, as perdas reprodutivas foram associadas com abortamentos em fases tardias. No entanto, em estudos subseqentes, foram observados abortamentos nas diferentes fases de gestao, tanto em surtos da doena como em condies experimentais.
5.2.3 Imunidade
Diversos estudos em animais tm demonstrado uma produo reduzida de interferon alfa e citoquinas inamatrias em resposta infeco pelo PRRSV. Essa resposta inata de magnitude fraca poderia ser um dos fatores responsveis pelo aumento da ocorrncia de infeces secundrias concomitantes. A resposta imune humoral desempenha um importante papel na preveno de reinfeces e na reduo da excreo viral por animais infectados. A transferncia passiva de anticorpos pelo colostro tambm confere completa proteo aos leites nas primeiras semanas de vida. Nveis altos de proteo so geralmente observados contra reinfeces com cepas homlogas, porm proteo apenas parcial obtida frente a cepas heterlogas. Imunoglobulinas especcas da classe IgM podem ser detectadas entre 5 e 7 dias aps a infeco (dpi), e IgG entre os dias 7 e 10 pi. Anticorpos contra as protenas estruturais e tambm contra algumas protenas no-estruturais (principalmente Nsp2) j foram detectados no soro de animais convalescentes. Uma resposta humoral de grande magnitude contra a protena do nucleo-
capsdeo (N) geralmente observada e tem sido utilizada para o diagnstico da infeco. Anticorpos com atividade neutralizante, geralmente em baixos ttulos, so detectveis somente cerca de 3 a 4 semanas aps a infeco. A deteco de viremia, mesmo na presena desses anticorpos, um indicativo de que os nveis induzidos podem no ser sucientes para controlar a replicao viral. Alm disso, concentraes baixas de anticorpos neutralizantes podem estar associadas com uma exacerbao da infeco, possivelmente atravs de um mecanismo conhecido como antibody-dependent enhancement (ADE). Diferentes protenas do PRRSV podem induzir nveis variados de resposta imune celular, que pode ser detectada entre a segunda e oitava semanas aps a infeco. Os mecanismos responsveis pela persistncia do PRRSV ainda no esto completamente elucidados. No entanto, a incapacidade do sistema imunolgico do hospedeiro em desenvolver uma resposta imune efetiva contra o vrus parece ser um dos principais fatores responsveis pela persistncia viral em animais convalescentes. Alm disso, um retardo signicativo na produo de interferon gama, bem como na produo de anticorpos neutralizantes tem sido observados. Esses eventos podem ser um reexo de mecanismos virais de evaso do sistema imunolgico.
5.2.4 Diagnstico
A suspeita de infeco pelo PRRSV deve ser considerada em rebanhos sunos que apresentem problemas reprodutivos e doena respiratria em animais de qualquer idade. Como outras infeces vricas e bacterianas podem causar manifestaes clnico-patolgicas semelhantes, o diagnstico requer necessariamente a realizao de testes laboratoriais. Em casos de doena clnica ou perdas reprodutivas (abortos, natimortalidade etc.), o mtodo diagnsitco mais indicado o isolamento do vrus a partir de tecidos ou secrees de animais afetados. O isolamento pode ser realizado a partir do soro ou de tecidos (pulmes, tonsilas e linfonodos), pela inoculao do material suspeito em
Arteriviridae
653
macrfagos alveolares cultivados in vitro ou em clulas MARC-145. No obstante, a inoculao de homogenados de tecidos suspeitos em sunos jovens (bioensaio) consiste no mtodo mais sensvel para a deteco do PRRSV nesses materiais. O PRRSV produz efeito citoptico caracterstico em clulas de cultivo, e a identidade do agente pode ser comprovada por imunouorescncia (IFA) ou por neutralizao com soro imune especco. A tcnica de PCR em tempo real tambm tem sido usada rotineiramente para o diagnstico direto da infeco, possibilitando a identicao de quantidades mnimas de RNA viral em amostras clnicas. Em condies experimentais, a IFA em tecidos e/ou rgos pode ser usada. No entanto, no rotineiramente usada para o diagnstico. Testes sorolgicos so rotineiramente utilizados para o monitoramento de rebanhos e podem tambm ser teis para diagnosticar eventos de doena, pelo teste de soros pareados. Atualmente, um teste comercial de ELISA tem sido amplamente utilizado para o diagnstico sorolgico das infeces causadas pelo PRRSV. A tcnica possui alta sensibilidade e especicidade, sendo possvel a deteco de anticorpos especcos contra a protena N j aos 7-10 dias ps-infeco (dpi). A deteco de anticorpos atravs da tcnica de soroneutralizao (SN) tambm tem sido utilizada. Entretanto, importante ressaltar que anticorpos com atividade neutralizante somente so detectveis apenas em fases tardias da infeco (30-60 dpi), fazendo com que o teste seja utilizado, sobretudo com outras nalidades. Os resultados de sorologia devem ser cuidadosamente analisados, uma vez que testes sorolgicos convencionais no so capazes de diferenciar anticorpos vacinais daqueles produzidos em resposta a infeces naturais. Informaes acerca do histrico clnico-epidemiolgico do rebanho, dados de produo, sinais clnicos, alm de leses macro e microscpicas, podem auxiliar no diagnstico da enfermidade. O diagnstico diferencial deve incluir outras enfermidades, como circovirose, parvovirose, doena de Aujeszky, inuenza, peste suna clssica, encefalomielite hemaglutinante e leptospirose. Devido possibilidade de infeces secundrias com outros vrus e bactrias, o diag-
nstico denitivo requer a deteco do agente, de antgenos virais ou de anticorpos especcos para o PRRSV nos animais infectados.

Medidas bsicas de prolaxia devem ser tomadas no sentido de prevenir a introduo do agente em propriedades ou reas livres e tambm de evitar a reintroduo de novas cepas em rebanhos j infectados. importante lembrar-se de que animais infectados e smen contaminado constituem-se nas principais fontes de infeco. Porm, outros fatores, como insetos, gua, rao, proximidade das granjas, movimento e transporte de animais, so epidemiologicamente importantes e devem ser considerados em programas de controle. Assim, medidas gerais de biossegurana so essenciais para a prolaxia e controle da enfermidade. Nos Estados Unidos, vrias estratgias, como a depopulao parcial ou completa de granjas, identicao e remoo de animais infectados e manejo preventivo de rebanhos fechados, tem sido utilizadas visando ao controle e erradicao da infeco. Vacinas atenuadas e inativadas esto comercialmente disponveis nos Estados Unidos e na Europa. Em geral, essas vacinas induzem imunidade protetora satisfatria contra o vrus homlogo, mas produzem nveis variveis de proteo contra vrus heterlogos. Alm da eccia discutvel, as vacinas atenuadas apresentam um problema de segurana. A persistncia do vrus vacinal em animais imunizados, em nveis semelhantes aos de amostras virulentas, e transmisso a animais soronegativos j foram demonstrados. Tambm se observou a transmisso do vrus vacinal pelo smen, bem como a ocorrncia de infeces congnitas. Vacinas diferenciais, isto , que permitam a distino da resposta vacinal daquela induzida pela infeco natural tambm no se encontram disponveis. Esses dados demonstram a evidente necessidade da elaborao de uma nova gerao de vacinas para serem utilizadas no controle, prolaxia e eventual erradicao da enfermidade, principalmente em pases onde a infeco endmica.
654
Captulo 25
Apesar da ausncia de atividade viral e sorologia positiva em sunos domsticos no Brasil, uma legislao estabelece critrios em relao importao e exportao de animais, alm de transporte, coleta de material para diagnstico, quarentena e testes de diagnstico, a m de manter o rebanho suno nacional livre da infeco pelo PRRSV.
CASTILLO-OLIVARES, J. et al. Generation of a candidate live marker vaccine for equine arteritis virus by deletion of the major virus neutralization domain. Journal of Virology, v.77, p.84708480, 2003. CIACCI-ZANELLA, J.R. et al. Lack of evidence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in domestic swine in Brazil. Cincia Rural, v.34, p.449-445, 2004. COLLINS, J.E. et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.4, p.117-126, 1992. DEA, S. et al. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates. Archives of Virology, v.145, p.659-688, 2000. DEL PIERO, F. Equine viral arteritis. Veterinary Pathology, v.37, p.287-296, 2000. DELLPUTE, P.L.; NAUWYNCK, H.J. Porcine arterivirus infection of alveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus. Journal of Virology, v.78, p.8094-8101, 2004. DIEL, D. et al. Prevalncia de anticorpos para os vrus da inuenza, arterite viral e herpesvrus em eqinos das regies norte e noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Cincia Rural, v.36, p.1467-1473, 2006. GOYAL, S.M. Porcine reproductive and respiratory syndrome. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.5, p.656-664, 1993. HANADA, K. et al. The origin and evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. Molecular Biology and Evolution, v.22, p.1024-1031, 2005. LARA, M.C.C.S.H. et al. Prevalncia de anticorpos antivrus da arterite dos eqinos em cavalos criados no estado de So Paulo. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v.54, p.223-227, 2002. LOPEZ, O.J.; OSORIO, F.A. Role of neutralizing antibodies in PRRSV protective immunity. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.102, p.155-163, 2004. MEULENBERG, J.J. et al. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology, v.192, p.62-72, 1993. MEULENBERG, J.J. PRRSV, the virus. Veterinary Resesarch, v.31, p.11-21, 2000. MINKE, J.M.; AUDONNET, J.C; FISCHER, L. Equine viral vaccines: the past, present and future. Veterinary Research, v.35, p.425-443, 2004.
6 Perspectivas
Apesar dos esforos direcionados ao controle e prolaxia das infeces causadas pelo PRRSV desde a sua identicao no incio dos anos 1990, o vrus ainda continua a causar perdas econmicas signicativas para suinocultura mundial. A diculdade na obteno de vacinas mais ecazes e seguras demonstra que muitos aspectos relacionados com a biologia dos arterivrus ainda no esto completamente elucidados. Nesse sentido, um grande avano foi alcanado com a obteno de clones infecciosos para o EAV e PRRSV, por meio da tecnologia de gentica reversa. Com o uso dessa metodologia, tem sido possvel a realizao de modicaes predenidas no genoma viral (delees, inseres e/ou substituies de nucleotdeos), possibilitando, assim, estudos dos mecanismos moleculares relacionados com replicao, patogenia, persistncia e imunidade. Alm disso, a tecnologia de gentica reversa permite, ainda, a manipulao genmica, visando ao desenvolvimento de cepas vacinais atenuadas ou com alteraes em protenas virais para serem utilizadas na prolaxia e controle das infeces causadas pelos arterivrus.
ALLENDE, R. et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: description of persistence in individual pigs upon experimental infection. Journal of Virology, v.74, p.1083410837, 2000. BALASURIYA, U.B.R; MACLACHLAN, N.J. The immune response to equine arteritis virus: potential lessons for other arteriviruses. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.102, p.107-129, 2004. BLAHA, T. The colorful epidemiology of PRRSV. Veterinary Research, v.31, p.77-83, 2000.
Arteriviridae
655
STADEJEK, T. et al. Genetic diversity of equine arteritis virus. The Journal of General Virology, v.80, p.691-699, 1999. TAKADA, A.; KAWAOKA, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology, v.13, p.387-398, 2003. WANG, X.C.; SMITH, S.L.; GODENY, E.K. Organization of the simian hemorrhagic fever virus genome and identication of the sgRNA junction sequences. Advances in Experimental Medicine and Biology, v.440, p.281-287, 1998. WENSVOORT, G. et al. Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.4, 134-138, 1992. WU, W.H. et al. A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b. Virology, v.287, p.183-191, 2001. YOO, D. et al. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.102, p.143-54, 2004. ZIMMERMAN, J. et al. PRRS virus (Porcine Arterivirus). In: STRAW, B.E. et al. (eds). Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1999. p.387-417. ZIMMERMAN, J.; YOON, K. (eds). PRRSV Compendium: A comprehensive reference on PRRS for pork producers, veterinary practitioners, and researchers. 2.ed. Des Moines, IA: National Pork Board, 2003. 294p.
MURPHY, F.A. et al. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. MURTAUGH, M.; XIAO, Z.; ZUCKERMANN, F. Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Viral Immunology, v.15, p.533-547, 2002. NELSEN, C.J.; MURTAUGH, M.P.; FAABERG, K.S. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. Journal of Virology, v.73, p.270-280, 1999. NEUMANN, E.J. et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.227, p.385-392, 2005. OLEKSIEWICZ, M.B. et al. Epitope mapping porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display: the nsp2 fragment of the replicase polyprotein contains a cluster of B-cell epitopes. Journal of Virology, v.75, p.3277-3290, 2001. PLAGEMANN, P.G.W. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: origin hypothesis. Emerging Infectious Diseases, v.9, p 903-908, 2003. PRIETO, C.; CASTRO, J.M. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review. Theriogenology, v.63, p.1-16, 2005. ROOP, S. et al. Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States. Journal of Virology, v.78, p.3684-3703, 2004. SNIJDER, E.J.; MEULENBERG, J.M. Arteriviruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields Virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.37, p.1205-1220.
PARAMYXOVIRIDAE
Clarice Weis Arns, Fernando R. Spilki & Renata Servan de Almeida1 n
26
659 659
659 659
1 Introduo 2 Classicao
2.1 Paramyxovirinae 2.2 Pneumovirinae
3 Replicao 4 Propriedades fsico-qumicas 5 Estrutura dos vrions 6 O genoma 7 O ciclo replicativo 8 Paramixovrus de interesse veterinrio
8.1 Vrus respiratrio sincicial bovino 8.1.1 Epidemiologia 8.1.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.1.3 Imunidade 8.1.4 Diagnstico 8.1.5 Controle e prolaxia 8.2 Vrus da parainuenza bovina tipo 3 8.2.1 Epidemiologia 8.2.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.2.3 Imunidade 8.2.4 Diagnstico 8.2.5 Controle e prolaxia 8.3 Vrus da peste bovina 8.4 Vrus da peste dos pequenos ruminantes
659 659 661 664 664 666

667 667 668 669 670 670 670 671 671 672 672 672 672 673
Renata Dezengrini foi a responsvel pelas sees Peste Bovina e Vrus da Peste dos Pequenos Ruminantes.
8.5 Vrus da cinomose 8.5.1 Epidemiologia 8.5.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.5.3 Imunidade 8.5.4 Diagnstico 8.5.5 Controle e prolaxia 8.6 Vrus da parainuenza canina tipo 2 8.6.1 Epidemiologia 8.6.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.6.3 Imunidade 8.6.4 Diagnstico 8.6.5 Preveno e controle 8.7 Metapneumovrus avirios 8.7.1 Epidemiologia 8.7.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.7.3 Imunidade 8.7.4 Diagnstico 8.7.5 Controle e prolaxia 8.8 Vrus da doena de Newcastle 8.8.1 O agente 8.8.2 Histrico e epidemiologia 8.8.3 Patogenia, sinais clnicos e patologia 8.8.4 Diagnstico 8.8.5 Controle e prolaxia
674 674 675 676 676 677 678 678 678 679 679 679 679 680 680 681 682 682 683 683 683 684 685 686
686
1 Introduo
Os vrus da famlia Paramyxoviridae incluem importantes patgenos do trato respiratrio de animais e humanos. A famlia formada por vrus envelopados, em sua maioria esfricos, com projees glicoproticas de superfcie. Os vrions possuem um nucleocapsdeo helicoidal que envolve o genoma de RNA ta simples e polaridade negativa. Os paramixovrus so responsveis por algumas doenas de grande relevncia em Medicina Veterinria, tanto por sua prevalncia como pelo impacto econmico na produo animal. Dentre os paramixovrus de importncia veterinria, destacam-se aqueles amplamente conhecidos, como o vrus respiratrio sincicial bovino (BRSV), o vrus da parainuenza bovina tipo 3 (bPIV-3), o vrus da cinomose canina (CDV), o vrus da peste bovina (Rinderpest virus, RPV) e o vrus da doena de Newcastle (NDV). A famlia agrega ainda outros vrus recentemente identicados, muito importantes devido ao seu potencial zoontico, como os vrus Hendra e Nipah. Esta famlia tambm abrange alguns vrus de grande importncia para a sade humana, como o vrus respiratrio sincicial humano (HRSV) e o vrus do sarampo (MV), dentre outros.
Avulavirus: vrus da doena de Newcastle; Virus TPMV-like: vrus Tupaia.
2.2 Pneumovirinae
Esta subfamlia possui dois gneros: Pneumovirus: vrus respiratrio sincicial humano; Metapneumovirus: vrus da rinotraquete dos perus.
3 Replicao
Os paramixovrus podem infectar uma ampla gama de hospedeiros, tanto naturalmente quanto sob condies experimentais, e a infeco assintomtica em muitas espcies. No entanto, as infeces de relevncia clnica so restritas a algumas delas. A replicao desses vrus in vitro ocorre em vrios tipos de clulas primrias e de linhagem, principalmente de origem pulmonar e renal, homlogas espcie de origem do vrus. necessria a adaptao dos paramixovrus ao cultivo por vrias passagens. A infeco por esses vrus citoltica, e uma caracterstica a fuso entre clulas, formando clulas gigantes multinucleadas (sinccios). A replicao ocorre no citoplasma das clulas hospedeiras, porm os morbilivrus podem produzir incluses intranucleares acidoflicas. Os vrus da parainuenza e alguns morbilivrus possuem, ainda, a propriedade de hemadsoro.
2 Classicao
A famlia Paramyxoviridae classicada na ordem Mononegavirales, que inclui ainda as famlias Rhabdoviridae e Filoviridae. Na famlia Paramyxoviridae, esto includas duas subfamlias: Paramyxovirinae e Pneumovirinae. A classicao taxonmica atual dessa famlia est apresentada na Tabela 26.1.
4 Propriedades fsico-qumicas
Os paramixovrus so sensveis a pH cido e ao aquecimento a 56C por 30 minutos. A exposio a solventes lipdicos, detergentes no-inicos, formaldedo e agentes oxidantes destri a infectividade viral. Os vrions so extremamente lbeis, mas permanecem viveis a temperaturas de -50C ou menos por muitos meses, porm episdios de congelamento e descongelamento podem inativar a infectividade. Os vrions apresentam uma densidade de 1,18 a 1,23 g/mL, determinada por centrifugao em gradiente de sacarose.
2.1 Paramyxovirinae
Esta subfamlia possui seis gneros, listados abaixo, juntamente com o vrus prottipo de cada gnero: Respirovirus: vrus Sendai; Morbillivirus: vrus do sarampo; Rubulavirus: vrus da caxumba; Henipavirus: vrus Hendra;
660
Captulo 26
Tabela 26.1. Classificao dos membros da famlia Paramyxoviridae e seus respectivos hospedeiros. Os hospedeiros naturais esto em negrito, e os secundrios esto entre parnteses.
Subfamlia
Gnero
Espcie
Vrus da parainfluenza bovina 3 (bPIV-3) Vrus Sendai (SeV) ou vrus da parainfluenza murina 1 Vrus smio tipo 10 (SV-10) Paramixovrus do salmo do Atlntico Vrus da parainfluenza humana 1 e 3 (hPIV-1 e 3)
Hospedeiros
bovinos (e ovinos) camundongos (sunos, ratos, hamsters e cobaias)
Respirovirus
primatas Salmes
humanos (outros primatas, hamsters, cobaias, fures, ratos cauda de algodo) caninos (lees, fures, guaxinins, pandas, entre outros) bovinos (ovinos, caprinos e sunos) ovinos, caprinos (alguns ruminantes selvagens)
Vrus da cinomose (CDV) Vrus da peste bovina (RPV)
Paramyxovirinae
Vrus da peste dos pequenos ruminantes (PPRV) Morbillivirus Vrus da peste das focas (PDV) Morbilivrus dos cetceos (CeMV) Vrus do sarampo (MV) Vrus da parainfluenza suna Rubulavrus suno (PoRV) ou vrus La-Piedad-Michoacan-Mexico Vrus da parainfluenza simia 5 e 41 (SV-5 e 41) Vrus da caxumba (MuV) Vrus da parainfluenza humana 2, 4a e 4b (HPIV-2, 4a e 4b) Vrus Mapuera (MPRV) Yucaipa vrus
espcies de foca espcies de baleias, golfinhos e focas humanos sunos sunos
Rubulavirus
primatas (caninos, felinos, sunos, hamsters, cobaias) humanos
humanos morcegos (Sturnira kikium) galinhas
Paramyxoviridae
661
Tabela 26.1. Continuao
Subfamlia
Gnero
Henipavirus
Espcie
Vrus Hendra (HeV)
Hospedeiro
morcegos (eqinos, humanos) morcegos (sunos, humanos, caninos e felinos) galinhas, patos, gansos, perus, aves silvestres e aquticas, humanos
Paramyxoviridae
Vrus Nipah Vrus da doena de Newcastle (NDV) ou paramixovrus 1 avirio (APMV-1) Avulavirus Paramixovrus avirios 2 a 9 (APMV-2 a 9) Vrus TPMV-like Vrus Tupaia (TPMV) Vrus respiratrio sincicial bovino (BRSV) Vrus respiratrio sincicial ovino (ORSV) Vrus da pneumonia murina (MPV) Vrus respiratrio sincicial humano (hRSV) Vrus da rinotraquete dos perus (TRTV) ou pneumovrus avirio (PVA) Metapneumovrus humano (hMPV)
galinhas, perus, aves silvestres Tupaia belangeri bovinos (ovinos)
Pneumovirus
ovinos (bovinos) camundongos humanos
Pneumovirinae
galinhas e perus
Metapneumovirus
humanos

Os paramixovrus possuem uma arquitetura complexa, que consiste basicamente de um envelope lipoprotico, um nucleocapsdeo e uma protena matriz. As partculas vricas so envelopadas, aproximadamente esfricas ou pleomrcas, com 150 a 300 nm de dimetro. Partculas lamentosas so relativamente freqentes e podem ter entre 1.000 e 10.000 nm de extenso. Nos vrions intactos, a nica estrutura visvel por microscopia eletrnica (ME) o envelope, com 7 a 15 nm de espessura, recoberto por projees de 8 a 20 nm de extenso, constitudas pelas glicoprotenas de superfcie. Os paramixovrus contm duas glicoprotenas de envelope; alguns rubulavrus, e todos os pneumovrus contm uma terceira protena integral de membrana. Uma delas (HN, H ou G, dependendo do gnero) est envolvida na ligao aos receptores, e a glicoprotena F responsvel pela fuso do envelope viral com a
membrana plasmtica celular durante o processo de penetrao. A Figura 26.1 apresenta uma fotograa de ME e uma representao esquemtica de um vrion dessa famlia. O nucleocapsdeo possui simetria helicoidal, apresenta entre 13 e 18 nm de dimetro por 600 a 1.000 nm de extenso. O nucleocapsdeo formado por um complexo formado pelo genoma RNA, conjugado com aproximadamente 2.500 cpias da protena N (ou NP), ao qual esto associadas 300 cpias da protena P e 50 molculas da protena L. O complexo ribonucleoprotena (RNA +N) se constitui no substrato para a sntese de RNA durante a transcrio e replicao do genoma, ou seja, esses mecanismos ocorrem no genoma recoberto pelas protenas N. Alm das glicoprotenas do envelope e das protenas do nucleocapsdeo, os vrions contm mltiplas cpias da protena matriz (M) que preenchem o espao entre o nucleocapsdeo e o envelope (Figura 26.1). As protenas codicadas pelos paramixovrus e as suas
662
Captulo 26
Glicoprotena F Glicoprotena (HN,H ou G) Protena SH Camada lipdica Protena M RNA
Nucleocapsdeo Protena P
Protena L
Protena N
Fonte: A) Dra. Linda Stannard,www.uct.ac.za.
Figura 26.1. Vrions da famlia Paramyxoviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de um paramixovrus humano. Nota-se o nucleocapsdeo helicoidal enovelado no interior da partcula; B) Ilustrao esquemtica de uma partcula vrica e seus componentes.
principais atividades biolgicas esto apresentadas a seguir. A glicoprotena H, HN ou G (dependendo do vrus) responsvel pela adsoro dos vrions superfcie das clulas hospedeiras. Essas glicoprotenas esto localizadas no envelope viral e projetam-se externamente como espculas a partir da superfcie dos vrions. Cada espcie de vrus contm uma delas (H, HN ou G). A glicoprotena H (respirovrus e morbilivrus) possui a atividade de hemaglutinao. Essa atividade utilizada na identicao de isolados e tambm em diagnstico. A glicoprotena HN (rubulovrus) apresenta atividade hemaglutinante e de neuraminidase. Esta ltima refere-se capacidade de clivar o receptor celular (cido silico), prevenindo que partculas virais se liguem em clulas j infectadas ou quem retidas na membrana celular durante o egresso de vrions recm-formados. Para muitos paramixovrus, a co-expresso de HN (H para morbilivrus), juntamente com a protena F, necessria para a formao de sinccios, sugerindo que as glicoprotenas HN ou H possuem participao na atividade fusognica. Para os paramixovrus que no possuem as glicoprotenas HN ou H, a ligao aos receptores pode ser realizada pela glicoprotena G, porm acredita-se que esta protena no seja essencial para essa funo. Nesses vrus, a protena F pode participar da ligao dos vrions aos receptores.
A glicoprotena de fuso (F) responsvel pela fuso do envelope viral com a membrana celular, permitindo a penetrao do nucleocapsdeo na clula hospedeira, que sintetizada como um precursor (F0), que se torna ativo pela clivagem em F1 e F2. Esta clivagem essencial para a infectividade dos paramixovrus e exerce um papel determinante na patogenicidade viral. A clivagem ocorre nos estgios nais do ciclo replicativo, no interior de vesculas do complexo de Golgi, durante o transporte das protenas virais para a membrana plasmtica. Cepas que clivam a F0 com mais ecincia tendem a ser mais virulentas, em contraste com cepas decientes na clivagem. Uma das caractersticas dos membros da famlia Paramyxoviridae o no requerimento de pH baixo para a atividade fusognica, ou seja, a fuso do envelope com a membrana plasmtica e a conseqente penetrao do nucleocapsdeo ocorre na superfcie celular, em pH neutro. Por isso so chamados vrus pH independentes. A protena M a mais abundante dos vrions, preenchendo o espao entre o nucleocapsdeo e o envelope. A sua funo ainda no foi completamente elucidada, mas sabe-se que essa protena exerce um importante papel na interao entre o nucleocapsdeo viral e a membrana da clula hospedeira durante o processo de morfognese, maturao e brotamento dos vrions. Portanto, a protena M considerada essencial na
Paramyxoviridae
663
morfognese viral, interagindo simultaneamente com as caudas citoplasmticas das glicoprotenas inseridas na membrana (F, HN ou G) e com o nucleocapsdeo. Essas interaes induzem o brotamento das novas partculas na superfcie da clula hospedeira. A protena N (ou NP) abundante nos vrions e se associa intimamente ao genoma viral, formando o nucleocapsdeo, sendo responsvel pela proteo do genoma contra a digesto por nucleases. Essa protena permanece associada com o genoma mesmo durante a transcrio e replicao. Alm da N, as protenas P-L tambm esto associadas com o genoma durante esses processos. A protena N tambm participa da morfognese das novas partculas virais, pela interao com a protena M. A concentrao intracelular de protena N parece ser o principal fator que controla a transio entre transcrio (no incio da infeco) e replicao do genoma (em etapas tardias do ciclo replicativo). Aproximadamente 80% da seqncia da protena N so muito conservadas entre os paramixovrus. A protena L a menos abundante dos vrions (~50 cpias por vrion) e representa a subunidade cataltica da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). A seqncia de nucleotdeos do gene da protena L muito conservada entre os membros de uma mesma subfamlia, o que no se observa entre vrus de subfamlias diferentes. Existem cinco seqncias curtas localizadas prximo ao centro do gene que apresentam uma alta homologia, tambm com RNA polimerases de outras famlias virais. Essas seqncias parecem codicar domnios proticos que so essenciais para a atividade da RpRd. A protena L exerce a sua atividade somente quando formado um complexo com a protena P e ambas so necessrias para a atividade de polimerizao do RNA a partir de moldes de RNA conjugados com a protena N. A protena P um componente essencial do complexo replicase. Embora toda a atividade cataltica da transcriptase viral seja atribuda protena L, esta somente se liga ao complexo RNA:N (denominado ribonucleoprotena; RNP) na presena da protena P. O stio de ligao da protena P ao complexo RNA:N, chamado de
P-carboxi (localizado na poro C-terminal da protena), relativamente conservado entre os membros da subfamlia Paramyxovirinae. Um mecanismo, conhecido como edio de RNA (RNA editing), permite que vrias protenas diferentes sejam produzidas a partir do gene P. Uma protena no-estrutural menor, chamada V, produzida pelo mesmo RNA mensageiro (mRNA) por todos os membros da subfamlia Paramyxovirinae. Os gneros Respirovirus e Morbillivirus produzem uma protena no-estrutural adicional, denominada C, a partir de uma segunda fase aberta de leitura (ORF) do mRNA do gene P. Protenas adicionais, denominadas W (respirovrus, henipavrus e morbilivrus), D (respirovrus), I (rubulavrus) entre outras, podem ser formadas pela edio do mRNA do gene P, pela adio de 1 ou 2 nucleotdeos (nt), alterando a fase de leitura do mRNA e resultando em uma seqncia diferente de aminocidos. Essas protenas, embora no essenciais replicao viral, auxiliam na sobrevivncia do vrus in vitro e so importantes determinantes da virulncia. A protena P, juntamente com a protena N, parece estar envolvida na mudana do processo de transcrio (sntese de mRNA) para o de replicao (sntese de RNA genmico a partir de RNA antigenmico). Uma regulao da sntese do RNA genmico viral tambm exercida pela protena C. As protenas V, W e C tambm possuem participao na evaso da resposta imune inata pelo vrus. Juntamente com a protena N, a protena P forma agregados citoplasmticos conhecidos como corpsculos de incluso nas clulas infectadas. O gene M2 contm duas ORFs, que codicam dois polipeptdeos, denominados M2-1 e M2-2. Ambos esto associados ao complexo do nucleocapsdeo dos pneumovrus e metapneumovrus e parecem no possuir homlogos em outros vrus RNA de polaridade negativa nosegmentados. A protena M2-1 est envolvida na elongao da transcrio e participa da induo da resposta inamatria do hospedeiro e exacerbao dos sinais clnicos da infeco viral. A protena M2-2 no essencial para a multiplicao do vrus em cultivo celular, porm, a sua deleo provoca uma reduo na ecincia de replicao. provvel que tambm possua participao na
664
Captulo 26
mudana de replicao para morfognese viral, que precedem o egresso dos vrions. A protena SH (ou A) uma protena integral de membrana com a poro C-terminal, localizada na regio extracelular. Apesar de ser expressa na supercie da clula hospedeira, baixos nveis da protena SH so detectados nos vrions. A SH pode apresentar-se sob diversas formas, dependendo de seu estado de glicosilao. Embora a sua funo ainda no tenha sido totalmente esclarecida e no seja uma protena absolutamente essencial s funes de adsoro, infectividade e montagem das partculas virais, parece aumentar a ecincia de fuso promovida pela protena F, contribuindo para a formao de sinccios. Essa protena no essencial para a multiplicao viral em cultivo celular, porm a deleo de seu gene resulta em reduo substancial nessas atividades. Existem indcios tambm de sua participao na evaso resposta imune do hospedeiro. Os vrus respiratrios sinciciais so os nicos paramixovrus que possuem dois genes que codicam as protenas no-estruturais (NS), precedendo o gene da nucleoprotena. A protena NS1 atua como um potente inibidor da transcrio e replicao do RNA viral. Esta protena tambm pode interagir com as protenas M e P, porm ainda no foi denido o signicado biolgico dessa interao. A NS2 uma protena no-essencial para a replicao do vrus in vitro. Ambas participam da evaso viral a respostas celulares antivirais induzidas pela produo de interferons e .
A organizao genmica e o nmero de genes dos paramixovrus variam de acordo com a subfamlia, com pequenas variaes tambm dentro dos gneros. Em geral, os genomas possuem entre seis e dez genes (Figura 26.2). Os vrus da subfamlia Paramyxovirinae possuem seis (NP, P/C/V, M, F, H e L) ou sete genes (o vrus da caxumba possui um gene adicional, o SH). Os vrus da subfamlia Pneumovirinae possuem dez (vrus respiratrio sincicial, vrus da pneumonia murina) ou oito genes (pneumovrus avirio). A maioria dos mRNA contm apenas uma ORF e traduzida em uma protena, porm, em alguns vrus, os mRNA possuem mais de uma ORF, resultando na produo de mais de um produto. Os mRNA dos diferentes genes so transcritos individualmente a partir do RNA genmico. Cada gene contm sinais para o incio e trmino da transcrio, presentes nas regies intergnicas, que possuem entre 1 e 56 nt.
Os paramixovrus so agrupados na classe V, conforme a classicao de Baltimore (1971) com relao s estratgias de replicao. De forma similar aos outros vrus dessa classe, todos os processos relacionados com a replicao viral ocorrem no citoplasma da clula hospedeira. Em cultivos celulares, o ciclo replicativo geralmente se completa em 14 a 30 horas, mas pode ter durao inferior. Cepas virulentas do NDV podem completar o ciclo replicativo em aproximadamente 10 horas. Os vrions ligam-se a receptores celulares especcos (CD46 e CD150 para o vrus do sarampo, provavelmente glicosaminoglicanos ou molculas semelhantes a heparina para os pneumovrus, cido silico para os demais) e penetram na clula por fuso do envelope viral com a membrana plasmtica na superfcie celular, em condies de pH neutro. Para que a protena precursora F0 exera sua funo fusognica, necessria a sua prvia clivagem em F1 e F2 por proteases celulares. Clulas infectadas podem se fusionar, formando sinccios ou clulas gigantes multinucleadas caractersticas, que podem produzir necrose tecidual in vivo. Uma vez no citoplasma, o nucleocapsdeo (RNA:N) transcrito
6 O genoma
O genoma dos paramixovrus constitudo por uma molcula de RNA linear de ta simples, polaridade negativa, com 15 a 19 quilobases (kb). Por possuir polaridade negativa, o genoma desnudo no infeccioso quando introduzido em clulas permissivas. Os vrions podem conter, ocasionalmente, uma cpia simples de RNA de polaridade positiva (RNA antigenmico). O genoma contm seqncias no-codicantes na extremidade 3 (chamada leader), com aproximadamente 50 nt, e, na extremidade 5, com 50 a 160 nt (Figura 26.2). Essas regies so importantes para a transcrio e replicao do genoma.
Paramyxoviridae
665
Gnero Morbillivirus
NP 3' P/C/V M F H L
vrus do sarampo
5
Subfamlia Paramyxovirinae
Gnero Respirovirus
NP 3' P/C/V M F HN
vrus da parainfluenza 3
L 5
Gnero Rubulavirus
NP 3' P/V M F SH HN L
vrus da caxumba
Gnero Pneumovirus
NS1 NS2
vrus respiratrio sincicial

P M SH G F M2 L 5
3'
Subfamlia Pneumovirinae
Gnero Pneumovirus
NS1 NS2
vrus da pneumonia murina

P M SH G F M2 L 5
3'
Gnero Metapneumovirus
N 3' P M F M2 SH G L
pneumovrus avirio
5
Figura 26.2. Estrutura e organizao genmica dos vrus da famlia Paramyxoviridae. As linhas finas representam o RNA genmico; os retngulos representam os genes individuais. M) protena da matriz; H) hemaglutinina; F) protena de fuso; L) polimerase; NP) nucleoprotena; HN) hemaglutinina-neuraminidase; P) fosfoprotena; C/V) produtos do gene P; SH) protena pequena hidrofbica; G) glicoprotena do envelope; NS1 e NS2) protenas noestruturais; M2) protena associada ao envelope.
progressivamente a partir da extremidade 3 pelo complexo polimerase viral (protenas L e P). A transcrio dos genes dos vrus RNA de polaridade negativa no-segmentados ocorre de forma individual, ou seja, cada gene possui sinais para a iniciao e trmino da transcrio. Com isso, cada gene transcrito e resulta em um mRNA individual. Os mRNAs contm 5 cap na extremidade e so poliadenilados, sendo traduzidos em protenas pelos ribossomos celulares. As etapas de transcrio e traduo prosseguem at que ocorra o acmulo das protenas virais no citoplasma das clulas infectadas. Em um determinado momento, por mecanismos ainda no identicados, o complexo polimerase cessa a produo de mRNAs individuais e passa a transcrever o genoma em toda a sua extenso, produzindo
cpias de RNA de sentido antigenmico (polaridade positiva). As protenas N e P parecem desempenhar um papel importante nessa transio entre transcrio e replicao, fazendo com que o complexo replicase no reconhea os sinais de terminao existentes nas regies intergnicas e realize a transcrio integral do genoma e sntese da cpia antigenmica (RNA +). Esta cpia antigenmica serve de molde para a produo de molculas de RNA de sentido genmico (RNA -). medida que so sintetizadas, as molculas de RNA de sentido negativo se associam com molculas da protena N, formando nucleocapsdeos helicoidais exveis que, posteriormente, se associam com as protenas P e L. A montagem dos nucleocapsdeos ocorre concomitantemente com a sntese do RNA antigenmico e genmico, e os
666
Captulo 26
RE
Golgi
Traduo
A ED HN G SH
(-)
A A
3
A
Transcrio
A A A A A
4
N P L C V M
Traduo
(+)
Sntese RNA genmico
7 8
(-)
Figura 26.3. Ilustrao esquemtica do ciclo replicativo da familia Paramyxoviridae. 1) Ligao aos receptores; 2) Penetrao por fuso do envelope viral com a membrana plasmtica; 3) Transcrio dos mRNA pelo complexo polimerase; 4) Traduo das protenas virais pelos ribossomos celulares; 5) Sntese de RNA antigenmico e replicao do RNA genmico pelo complexo polimerase; 6) Processamento e transporte das protenas do envelope e insero na membrana plasmtica; 7) Morfognese; 8) Egresso.
RNAs virais somente so encontrados como nucleocapsdeos no interior da clula. A primeira etapa da morfognese envolve a associao entre as protenas N e o genoma, seguido da adio do complexo L-P. A segunda etapa da montagem ocorre na membrana plasmtica. As glicoprotenas HN (ou as equivalentes nos outros vrus) e F (tambm a SH) produzidas no retculo endoplasmtico (RE) e modicadas no complexo de Golgi so transportadas em vesculas trans-Golgi at a membrana plasmtica, onde so inseridas. Durante este transporte, a protena precursora F0 clivada em F1 e F2, evento essencial para a infectividade da prognie viral. As etapas seguintes da morfognese so pouco conhecidas. Acredita-se que mltiplas cpias da protena M sejam transportadas at a membrana
plasmtica, onde se associariam com as caudas citoplasmticas das glicoprotenas ali inseridas. Os nucleocapsdeos, ento, interagiriam atravs da protena N com as molculas da protena M, resultando na sua protuso e brotamento na membrana plasmtica e no egresso dos vrions. A Figura 26.3 representa um esquema do ciclo replicativo dos paramixovrus.
8 Paramixovrus de interesse veterinrio

As duas subfamlias dos paramixovrus abrigam vrus associados com doenas importantes em animais. Esses vrus e as doenas que eles causam sero abordados a seguir.
Paramyxoviridae
667
8.1 Vrus respiratrio sincicial bovino

Os vrus respiratrios sinciciais (RSV) foram descritos, pela primeira vez, em 1955, durante um episdio de doena respiratria em chimpanzs de um laboratrio em Washington (USA). O agente viral isolado nessa ocasio e, inicialmente, denominado chimpanzee coryza agent, foi, posteriormente, renomeado como respiratory syncytial virus (RSV), baseado no seu efeito citoptico caracterstico em cultivo celular. Diversos estudos subseqentes levaram ao estabelecimento da importncia do RSV como agente de doena respiratria em crianas no mundo inteiro, e o agente passou a ser conhecido com vrus respiratrio sincicial humano (human respiratory syncytial virus, HRSV). Mais de uma dcada aps, um vrus estreitamente relacionado ao HRSV foi isolado de bovinos em um episdio de doena respiratria severa na Sua e no Japo, sendo denominado vrus respiratrio sincicial bovino (bovine respiratory syncytial virus, BRSV). Atualmente, o BRSV possui distribuio mundial e est associado com doena respiratria severa em bovinos jovens, caracterizada por bronquiolite e pneumonia intersticial. um dos agentes envolvidos no complexo respiratrio bovino, responsvel por grandes perdas econmicas, principalmente em bezerros com idade inferior a um ano. Outros agentes virais, como o herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1), vrus da parainuenza bovina (bPI-3) e vrus da diarria viral bovina (BVDV), e bacterianos (Pasteurella sp.) tambm so freqentemente associados com este complexo respiratrio. O BRSV pertence famlia Paramyxoviridae, subfamlia Pneumovirinae, gnero Pneumovirus, e possui relao antignica com o HRSV e com os vrus respiratrios sinciciais ovino e caprino (ORSV e CRSV). O BRSV possui vrias similaridades com o HRSV, especialmente no que se refere estrutura e morfologia dos vrions, organizao genmica e propriedades antignicas. Os membros da subfamlia Pneumovirinae diferem dos demais paramixovrus pela ausncia das protenas neuraminidase e hemaglutinina no envelope viral; em certas dimenses das projees de superfcie e no dimetro do nucleocapsdeo. Os vrions do BRSV so pleomrcos, enve-
lopados e com dimenses variveis. As partculas esfricas medem entre 80 e 350 nm de dimetro, e as partculas lamentosas medem entre 60 e 100 nm. Os vrions so muito sensveis a pH cido e so facilmente inativados pelo aquecimento a 56C por 30 minutos. A exposio a dietilter, clorofrmio e outros solventes apolares tambm destri a infectividade viral. O vrus extremamente lbil sob condies ambientais com temperatura elevada, mas permanece estvel sob temperaturas de -50C ou menos por muitos meses. Episdios de congelamento e descongelamento tambm so deletrios para a infectividade viral. O genoma do BRSV possui aproximadamente 15.000 nt, que codicam 10 polipeptdeos. As duas principais glicoprotenas do envelope so: a protena G (responsvel pela ligao aos receptores celulares) e a protena F (responsvel pela fuso e penetrao do vrus na clula e pela formao de sinccios). Outra protena de superfcie a protena hidrofbica pequena (small hydrophobic protein, SH). A estrutura e funo das protenas M, N, fosfoprotena P, protenas M2 e L parecem ser semelhantes s descritas para o restante da famlia. As diferenas antignicas entre os isolados de BRSV, detectadas pelo uso de anticorpos monoclonais, levaram classicao antignica dessas amostras em subgrupos, denominados A, AB (ou intermedirio) e B. No entanto, alguns isolados no se enquadram em nenhum desses grupos. As implicaes prticas dessa diversidade quanto patogenicidade e imunoprolaxia ainda no foram devidamente estudadas.
8.1.1 Epidemiologia
O BRSV possui distribuio mundial, mas uma estimativa precisa da ocorrncia da infeco difcil, uma vez que outros patgenos virais e bacterianos podem estar envolvidos nos casos de doena respiratria. A diculdade de isolamento do agente tambm diculta o diagnstico, bem como a ocorrncia de infeces subclnicas. Em regies endmicas, surtos de doena respiratria ocorrem, muitas vezes, esporadicamente, envolvendo apenas grupos de animais mais suscetveis. Em surtos naturais, a doena clnica raramente observada em animais com idade inferior
668
Captulo 26
a duas semanas, sendo mais severa em bezerros entre um e cinco meses de idade. A doena incomum entre animais com idade superior a nove meses, mas pode, ocasionalmente, ocorrer em animais adultos. No Brasil, o vrus foi detectado pela primeira vez por Gonalves et al. (1993), em amostras de pulmes de bezerros do estado do Rio Grande do Sul (RS). O isolamento e a identicao viral foram realizados por Arns et al. (2003), a partir de amostras de secrees naso-traqueais de animais com sinais respiratrios procedentes do RS. Em um estudo mais abrangente, foram isoladas e caracterizadas cinco amostras do BRSV oriundas de rebanhos leiteiros e de corte dos estados do RS e Minas Gerais. Todas as amostras analisadas pertencem ao subgrupo B. Embora a forma de transmisso do BRSV durante a infeco natural no seja completamente denida, sugere-se que seja necessrio o contato prximo entre animais. Dados experimentais demonstraram que a transmisso por aerossis pode ocorrer a curtas distncias. Animais expostos experimentalmente a aerossis contendo o vrus e aps inoculao intratraqueal apresentam leses muito semelhantes s observadas a campo, o que sugere que a inoculao por aerossol simule a forma natural da infeco. Em climas temperados, a maioria dos surtos associados ao BRSV ocorre no incio do inverno, embora episdios severos da doena j tenham sido relatados no vero. No se sabe como o BRSV se mantm entre os surtos, e possvel que o vrus permanea circulante em baixos nveis entre os animais soropositivos. O reaparecimento do vrus em rebanhos fechados pode tambm ser explicado pela persistncia do agente em animais infectados, uma vez que a aplicao de corticosterides em animais soropositivos resulta em um aumento de quatro vezes nos ttulos de anticorpos. Alteraes climticas podem aumentar a incidncia da infeco, principalmente o clima mido e a presena de vento, assim como fatores que afetam a atividade mucociliar, como nveis elevados de amnia no ambiente. Embora boas condies e manejo adequado dos animais reduzam a incidncia de infeces pelo BRSV, rebanhos em excelentes condies nesses aspectos tambm podem apresentar surtos severos. Isto
sugere que o BRSV pode causar doena sem a ocorrncia de fatores ambientais predisponentes. A morbidade da infeco pode atingir 80 a 100% dos animais. No entanto, a taxa de mortalidade raramente excede 5 a 10%, dependendo das condies sanitrias do rebanho.

Embora a patogenia das infeces pelo BRSV no tenha sido totalmente esclarecida, diversas evidncias indicam a importante participao de mecanismos imunomediados. A infeco pelo BRSV aumenta a aderncia e colonizao bacteriana e altera os mecanismos especcos e inespeccos de defesa do trato respiratrio. Por essas razes, estima-se que muitas pneumonias bacterianas se desenvolvam aps infeces virais. Aps a penetrao pela via respiratria, o BRSV replica nas clulas epiteliais da mucosa nasal, faringe, traquia e pulmes. O vrus aparentemente no produz viremia e raramente foi detectado fora do sistema respiratrio. Antgenos virais podem ser detectados na mucosa da nasofaringe dois dias aps infeco experimental, bem como nos linfonodos traqueobronquiais. As clulas pulmonares somente aparecem infectadas entre 4 e 13 dias aps a infeco. As clulas epiteliais dos bronquolos so as primeiras a serem infectadas, seguidas pelas clulas alveolares. Antgenos virais podem tambm ser detectados em macrfagos alveolares, embora o papel dessas clulas na patogenia seja controverso. provvel que pelo menos um subgrupo de macrfagos alveolares possam ser permissivos replicao viral e, portanto, possam contribuir para a patognese da infeco. Alm disso, os macrfagos ativados liberam citocinas que potencialmente contribuem para as leses. O pico de excreo viral em secrees nasais ou pulmonares e em clulas pulmonares ocorre entre quatro e oito dias aps a infeco. Em bovinos infectados experimentalmente, o vrus foi isolado de secrees nasais 24 horas ps-infeco, e o RNA viral foi detectado em secrees nasais pela reao em cadeia da polimerase acoplado transcrio reversa (RT-PCR) at 17 dias ps-infeco. O vrus pode ser detectado em clulas oriundas de lavado pulmonar aos dois
Paramyxoviridae
669
dias aps a infeco. Nos tecidos traqueais, o vrus foi detectado precocemente s 24 horas aps a infeco, foi isolado no dia quatro e continuou sendo detectado alm dos 10 dias subseqentes. Os sinais clnicos aps a infeco natural incluem pirexia (>39,5C), descarga nasal, tosse, taquipnia, respirao bucal e abdominal, ensema pulmonar e subcutneo e ocasionalmente morte. Infeces bacterianas secundrias, especialmente por Pasteurella multocida, Streptococcus pneumoniae e Mycoplasma bovis, so freqentemente detectadas em surtos de BRSV. Quando no ocorrem infeces bacterianas secundrias, os animais se recuperam em duas a trs semanas aps a infeco. Os achados de necropsia incluem pneumonia intersticial multifocal, ensema alveolar disseminado com focos de atelectasia, e ensema intersticial em graus moderados. Uma caracterstica marcante da doena o espessamento dos septos interlobulares. Pequenas franjas conjuntivas so evidenciadas nos bordos do pulmo e do um aspecto fosco a essas regies. Alguns relatos descrevem uma hipertroa marcante do miocrdio do ventrculo direito. As mucosas da cavidade nasal, traquia e brnquios dos animais infectados podem apresentar-se hipermicas, especialmente nos estgios iniciais da infeco. O septo interlobular muitas vezes aparece espessado, devido ao edema pronunciado causado por obstruo dos brnquios, que pode levar dispnia severa. As pores dorsal e crnio-dorsal dos pulmes podem se apresentar normais em muitos casos, mas podem tambm estar marcadamente distendidas, devido ao edema e ensema intersticial e alveolar severos. Os linfonodos regionais do trato respiratrio podem estar aumentados e edematosos. No exame histopatolgico, possvel se observar clulas sinciciais em grande quantidade, localizadas principalmente nos bordos dos lbulos pulmonares, nos alvolos, bronquolos e, por vezes, em vasos linfticos. As clulas sinciciais apresentam um nmero varivel de ncleos dispostos centralmente. H presena de ensema alveolar crnico com bordos de septos alveolares rompidos em forma de clava, por vezes intercalados com reas de atelectasia, hipertroa
da camada muscular peribronquiolar e focos de metaplasia escamosa do epitlio bronquial e bronquiolar. So observadas ainda alteraes inamatrias mononucleares com reas focais de inltrado eosinoflico. Bronquite, peribronquite e bronquiolite so igualmente achados histolgicos caractersticos aps a infeco natural pelo BRSV. Outras importantes alteraes histopatolgicas incluem o espessamento da parede alveolar, proliferao do epitlio bronquiolar com perda de clios, epitelizao alveolar, formao de membranas hialinas, edema e exsudato nos espaos alveolares, bronquiais e bronquiolares, colapso de alvolos, inltrao de neutrlos, linfcitos e eosinlos.
8.1.3 Imunidade
A protena F considerada a mais imunognica do BRSV, superando a protena G na induo de anticorpos neutralizantes e na imunidade mediada por linfcitos T citotxicos. A protena F ainda induz a produo de anticorpos inibidores da fuso, que esto relacionados com proteo frente infeco. A imunizao de animais com as protenas F, G e N expressas separadamente no vrus vaccinia conferiu proteo contra o desao com o BRSV. Um estudo realizado em animais experimentalmente infectados demonstrou que a imunidade humoral contra a protena F mais duradoura e de maior intensidade do que a induzida pela protena G. Anticorpos contra as protenas P, M e M2 tambm esto presentes em infeces naturais. Os anticorpos maternos contra as protenas F, G e N presentes no soro de bezerros no conferem proteo frente infeco pelo BRSV, mas podem reduzir a severidade da doena. Esses anticorpos causam um decrscimo na replicao viral nos pulmes aps o desao. A sua presena ainda suprime a resposta imune humoral local e sistmica infeco. Desse modo, a vacinao de animais jovens pode ser prejudicada pela presena de anticorpos maternos. Estudos em bovinos tm demonstrado que a infeco pelo BRSV induz uma resposta imunolgica predominantemente de linfcitos T auxiliares do tipo Th2, que so caracterizadas pela
670
Captulo 26
produo de interleucinas (IL) 4 e 10. Estas IL estimulam a produo de anticorpos, incluindo a classe IgE, que, por sua vez, estimulam o recrutamento de eosinlos para o parnquima pulmonar. O quadro de intensa bronquiolite evidenciado nas infeces pelo BRSV pode ser parcialmente explicado pela resposta eosinoflica.
8.1.4 Diagnstico
O diagnstico da infeco pelo BRSV deve se basear na deteco de antgenos virais em amostras clnicas, alm da sorologia. Os mtodos de escolha para a deteco de antgenos do BRSV em amostras de pulmo so as tcnicas de imunouorescncia (IFA) e imunoperoxidase (IPX). O exame de secrees nasais pode se constituir em uma alternativa para o diagnstico no animal vivo. O lavado broncoalveolar pode ser mais indicado do que os suabes nasais para a demonstrao de antgenos. A fragilidade dos vrions do BRSV torna o isolamento em cultivo celular trabalhoso e freqentemente infrutfero, requerendo repetidas passagens at o aparecimento de efeito citoptico. Cuidados especiais na conservao de amostras, incluindo a coleta estril, manuteno dos espcimes sob refrigerao (evitar o congelamento a -20C) e envio imediato ao laboratrio aumentam as chances de isolamento do vrus. Tambm recomendvel a coleta de suabes nasais ou lavados broncoalveolares de diferentes animais do rebanho. Em casos de necropsia, a coleta de reas pulmonares adjacentes s reas mais afetadas e de reas com aspecto saudvel tambm aumentam a probabilidade de deteco do vrus. Para o diagnstico sorolgico, as tcnicas de ensaio imunoenzimtico (ELISA) e soroneutralizao (SN) tm sido amplamente utilizadas. O diagnstico tambm pode ser realizado pela deteco do RNA viral em amostras clnicas por RT-PCR.
controle do trnsito de animais e na utilizao de vacinas. Existe uma grande carncia de vacinas protetoras contra o BRSV. Vacinas apropriadas devem ser capazes de conferir proteo mesmo na presena de anticorpos maternais, proteger contra todos os subtipos e prevenir as manifestaes clnicas. Vrias vacinas inativadas e atenuadas esto disponveis comercialmente. No entanto, o desao experimental e a campo tm demonstrado resultados inconclusivos quanto sua eccia. Recentemente, uma vacina, utilizando o BoHV-1 como vetor para a protena G do BRSV, reduziu os sinais clnicos e a excreo viral aps o desao. A protena G, como antgeno alvo de uma vacina de DNA, tambm apresentou sucesso frente ao desao. O desenvolvimento de vacinas contra as infeces pelo BRSV e HRSV foi, em parte, prejudicado por um fato inusitado ocorrido na dcada de 1960. O uso de uma vacina contra o HRSV, inativada pela formalina, exacerbou a enfermidade induzida pelo vrus de campo e causou mortes em um grande nmero de crianas. A interao com a formalina provocou alteraes conformacionais nos antgenos vacinais, levando formao de imunocomplexos que resultaram no desencadeamento de uma reao de hipersensibilidade do tipo III. Alm desses problemas, a imunidade de curta durao, conferida aps a infeco natural, deixa dvidas sobre a durabilidade da proteo conferida pelas vacinas. Outra exigncia de difcil resoluo a necessidade de que a vacina induza imunidade protetora contra as diferentes variantes antignicas encontradas a campo.
8.2 Vrus da parainuenza bovina tipo 3

O bPIV-3 um membro da famlia Paramyxoviridae, subfamlia Paramyxovirinae, gnero Respirovirus, responsvel por infeces respiratrias em bovinos e ovinos. O vrus foi isolado pela primeira vez nos EUA, em 1959, a partir de secrees nasais de bovinos com sinais clnicos do quadro denominado febre do transporte. Os vrions possuem sete protenas, codicadas pelo genoma RNA de ta simples e polaridade negativa, constitudo por, aproximadamente,

O controle da enfermidade depende de conhecimentos sobre a prevalncia e epidemiologia do vrus. Os programas de controle so baseados em melhorias de manejo, biossegurana, no
Paramyxoviridae
671
15.000 nt. A glicoprotena HN (hemaglutininaneuraminidase) est envolvida na ligao aos receptores e egresso do vrus, conferindo-lhe a propriedade de aglutinar hemcias de bovinos, cobaias, sunos, humanos e aves. A protena F est envolvida na penetrao e transmisso do vrus entre clulas. As protenas HN e F esto associadas com a patogenia da infeco e so responsveis pela formao de sinccios em clulas de cultivo, o que constitui o efeito citoptico do vrus. Essas protenas so importantes para a induo de anticorpos neutralizantes e inibidores da hemaglutinao. Alm de bovinos, o vrus pode infectar naturalmente outras espcies, incluindo ces, eqinos, macacos e humanos. O bPIV-3 estreitamente relacionado com o vrus da parainuenza humana tipo 3 (HPIV-3), apresentando semelhanas genticas e antignicas importantes. Estudos de proteo demonstraram aproximadamente 25% de neutralizao cruzada entre esses vrus.
infeco, atuando como disseminadores do vrus para os bovinos. A doena caracterizada por baixa morbidade; a mortalidade rara. Taxas mais altas de morbidade e mortalidade podem ocorrer em casos de co-infeces com agentes virais ou bacterianos. A faixa etria mais afetada a de dois a seis meses de idade, acompanhando o declnio da imunidade passiva. No entanto, j foram relatados casos em animais mais jovens.

Aps a penetrao pelas vias areas superiores, o vrus replica no epitlio nasal, farngeo e traqueal. Durante a infeco do trato respiratrio inferior, o vrus pode infectar pneumcitos do tipo II, causando leses nos alvolos pulmonares. Em infeces naturais, os sinais clnicos mais freqentemente observados so: dispnia, tosse, descarga nasal serosa ou mucopurulenta, lacrimejamento, conjuntivite, inapetncia e temperatura elevada. Esses sinais so tpicos da febre do transporte. Em bezerros infectados experimentalmente, a doena caracterizada por febre, hipertermia, lacrimejamento, descarga nasal serosa abundante, depresso, dispnia e tosse. Muitos animais apresentam sinais brandos, recuperando-se em poucos dias, porm a infeco pode resultar em pneumonia intersticial, afetando geralmente os lobos pulmonares anteriores. Sons de crepitao em lobos pulmonares diafragmticos podem ser auscultados em casos mais graves, com presena de ensema. A doena geralmente evolui para a cura espontnea. No entanto, um tratamento de suporte para possveis infeces secundrias, incluindo antibiticos, pode ser necessrio em casos mais graves. O aborto uma conseqncia espordica da infeco em vacas gestantes. Os achados de necropsia incluem pneumonia exsudativa, que atinge preferencialmente as pores craniais e ventrais dos lobos pulmonares. Bronquite e bronquiolite com inltrado plasmocitrio esto presentes ao exame histopatolgico. Hiperplasia e necrose do epitlio bronquiolar
8.2.1 Epidemiologia
A distribuio do bPIV-3 mundial e a prevalncia de anticorpos especcos alta na populao bovina. No Brasil, a infeco endmica com altas taxas de soropositividade nos rebanhos. Estudos realizados no RS indicam uma prevalncia de anticorpos superior a 80% em gado de leite e corte, demonstrando a ampla disseminao do agente. Apesar das evidncias sorolgicas da presena do vrus no Brasil, raramente tem sido relatado o isolamento do agente. O vrus foi isolado de um animal com doena respiratria no RS e de um surto de abortos em bovinos no estado de Gois. A prevalncia alta da infeco, associada aos raros relatos de doena respiratria nos rebanhos, sugere que a maioria das infeces inaparente. A disseminao do vrus no rebanho ocorre aparentemente por contato direto e indireto. Fatores predisponentes para a infeco incluem o estresse (vacinao, desmame, transporte), excesso de lotao e ventilao inadequada, especialmente em rebanhos leiteiros estabulados. Os ovinos tambm so susceptveis infeco e, possivelmente, participam da epidemiologia da
672
Captulo 26
tambm podem ser observadas. A infeco provavelmente induz uma imunossupresso localizada, o que favorece a instalao de infeces bacterianas secundrias.

A preveno da enfermidade deve se basear em medidas de higiene, manejo, controle do trnsito de animais, quarentena e vacinao. Vacinas vivas e inativadas esto disponveis para o controle das infeces pelo bPIV-3. Essas vacinas geralmente contm outros agentes virais e bacterianos associados com doena respiratria em bovinos. A relao custo-benefcio do seu uso em situaes epidemiolgicas em que a doena rara, como no Brasil, deve ser considerada. Atividades de manejo que evitem a superlotao, cuidados com mudanas bruscas de temperatura e administrao adequada de colostro podem auxiliar na preveno da doena.
8.2.3 Imunidade
Anticorpos com atividade neutralizante, especialmente da classe IgG2, e anticorpos inibidores da hemaglutinao so detectveis no soro de animais convalescentes. A proteo contra o aparecimento de sinais clnicos induzidos por reinfeces pelo bPIV-3 est associada com altos ttulos de anticorpos neutralizantes e presena de resposta imune celular de memria. A imunidade de mucosas, especialmente aquela mediada por IgA, parece ser importante na proteo contra reinfeces. No entanto, a imunidade geralmente passageira, e os animais podem se tornar susceptveis reinfeco aps alguns meses.
8.3 Vrus da peste bovina

A peste bovina (rinderpest) foi descrita pela primeira vez na sia, no sculo IV. A doena causada por um Morbillivirus que, nos sculos XVIII, XIX e XX, causou epidemias devastadoras na Europa e na frica subsaariana. Um surto ocorrido, em 1920, na Europa, motivou a criao da OIE (Ofce International des Epizooties) em Paris. Casos da doena foram relatados em regies da frica, do Oriente e da sia, no entanto est em processo de erradicao nesses locais. Acredita-se que outros morbilivrus, como o CDV e o vrus do sarampo, tenham se originado a partir do vrus da peste bovina h mais de 5.000 anos. Os vrions so sensveis a maioria dos desinfetantes (fenol, hidrxido de sdio, solventes lipdicos, entre outros), mantm a viabilidade por longos perodos em tecidos congelados e so estveis sob pH 4 a 10. Esse vrus pode infectar todas as espcies da ordem Artiodactyla, incluindo ovinos, caprinos, sunos, cervdeos, camelos, antlope africano, hipoptamos e outros animais selvagens. Os bovinos e bfalos esto envolvidos com maior freqncia nos surtos da doena febril e fatal, mas a doena menos severa nas outras espcies. Em sunos, a infeco pode ser assintomtica e, em reas endmicas, pode-se observar doena mais branda em bovinos e bfalos. A morbidade em
8.2.4 Diagnstico
O bPIV-3 deve ser considerado em casos de doena respiratria em bovinos jovens. A suspeita clnica deve ser conrmada por testes laboratoriais. O diagnstico laboratorial baseia-se no isolamento do vrus em cultivo celular, a partir de secrees nasais de animais doentes. O vrus pode ser recuperado de secreo nasal de 7 a 9 dias ps-infeco. O vrus produz citomegalia, arredondamento celular e formao de sinccios em clulas primrias ou de linhagem bovina, efeito caracterstico dos membros da famlia Paramyxoviridae. A identicao do vrus pode ser realizada por IFA de clulas inoculadas com o material suspeito. O mtodo clssico de identicao a hemaglutinao (HA) com eritrcitos de cobaias, seguida de inibio da hemaglutinao (HI) com anti-soro especco. Outro mtodo clssico de diagnstico a reao de hemadsoro em cultivo celular. As tcnicas moleculares (RT-PCR) tm sido utilizadas para a deteco do agente e seus produtos. A sorologia pareada tambm pode auxiliar o diagnstico da infeco aguda. As tcnicas de eleio para a sorologia so a HI com eritrcitos de cobaias, a SN e ELISA.
Paramyxoviridae
673
populaes susceptveis de aproximadamente 100%, e a mortalidade pode atingir 90 a 100%. A transmisso do vrus d-se pela ingesto e/ou contato com gua e alimentos contaminados com excrees e secrees de animais infectados. O agente penetra no hospedeiro provavelmente pela via oral e/ou nasal. Dois dias antes de apresentar sinais clnicos, os animais j excretam o vrus em grande quantidade. O vrus replica inicialmente em linfonodos farngeos, mandibulares e tonsilas, disseminando-se pelo organismo por viremia. Aps um perodo de incubao de trs a cinco dias, os animais apresentam hipertermia. A fase de leses nas mucosas ocorre em seguida, com inamao e eroses na mucosa dos tratos digestivo e respiratrio, descarga nasal mucopurulenta e diarria aquosa, s vezes, com sangue. So observados, ainda, arqueamento do posterior e rpida perda de peso, leucopenia e imunossupresso. Fmeas prenhes podem abortar. Durante a necropsia, observa-se necrose das placas de Peyer, congesto e hemorragias no epitlio intestinal, aumento e edema nos linfonodos e eroses nas mucosas oral e nasal. O diagnstico laboratorial pode ser realizado a partir de urina, sangue, secrees nasais, orais e fezes coletadas de animais doentes; ou de linfonodos e bao coletados de animais recentemente mortos. Em reas endmicas, o diagnstico freqentemente realizado pelos sinais clnicos severos. O isolamento e identicao do vrus podem ser realizados pela inoculao do material suspeito em clulas primrias ou de linhagem de origem bovina, ovina, suna e tambm em clulas Vero. A inoculao de ovos embrionados ou de animais de laboratrio (coelhos, camundongos e cobaias) tambm pode ser realizada. A deteco de antgenos por IFA, IPX, imunoeletroforese ou imunodifuso em gel de gar (IDGA) tambm indicada. A deteco do RNA viral por RT-PCR representa uma alternativa rpida e sensvel de diagnstico. Tcnicas sorolgicas (ELISA, SN) podem ser empregadas no soro de animais que sobreviveram por um perodo suciente para produzir anticorpos. Em pases livres, a preveno e o controle da doena so direcionados para evitar a intro-
duo do agente. Quarentena, o abate de animais suspeitos e proibio da importao de produtos de origem animal no-cozidos de reas de risco so as medidas adotadas em reas livres. A peste bovina uma doena de noticao obrigatria, segundo a OIE. Vacinas atenuadas so aplicadas em animais nas reas em que a doena endmica, e a imunidade pode permanecer por vrios anos.
8.4 Vrus da peste dos pequenos ruminantes

A peste dos pequenos ruminantes (pest ds petit ruminants) uma doena sistmica e contagiosa de ovinos e caprinos, clinicamente semelhante peste bovina. A doena causada por um Morbillivirus (PPRV) relacionado antigenicamente com o vrus da peste bovina. No entanto, ao contrrio da peste bovina, grande parte das infeces por este vrus subclnica. A infeco tem sido descrita no oeste da frica, na Pennsula Arbica, Oriente Mdio e na ndia. Alm dos ovinos e caprinos, espcies de ungulados selvagens e uma espcie de cervdeo (Odocoileus virginianus) so susceptveis ao vrus. Os bovinos e sunos geralmente desenvolvem infeces inaparentes. Em reas endmicas, a peste dos pequenos ruminantes uma importante causa de impacto econmico. A transmisso do vrus ocorre por contato direto ou indireto com excrees e secrees de animais infectados, pelas vias oral e/ou nasal. Durante um perodo de incubao de trs a dez dias, o vrus replica nos linfonodos regionais e produz viremia. Na viremia, que dura dois ou trs dias, o vrus se dissemina para o bao, medula ssea, trato gastrintestinal e respiratrio, alm dos tecidos linfides. Os sinais clnicos incluem hipertermia, anorexia, letargia, gengivite, estomatite, conjuntivite, diarria e desidratao. Abortos podem ocorrer em fmeas prenhes. Broncopneumonia, com infeces secundrias, tambm pode ser observada. Na necropsia, observa-se estomatite erosiva necrosante na mucosa oral, conjuntivite catarral profusa, reas de necrose na mucosa nasal, eroses e hemorragias no intestino, necrose e ulcerao nas placas de
674
Captulo 26
Peyer, congesto e aumento de volume no bao e nos linfonodos. Vulvovaginite erosiva, pleurite e hidrotrax tambm tm sido descritos. O diagnstico laboratorial da infeco pode ser realizado a partir de secrees (oral, nasal e ocular), sangue, linfonodos mesentricos, bao, pulmes e linfonodos bronquiais. Para a deteco de antgenos virais, utilizam-se as tcnicas de IDGA, imunoeletroforese, IFA, ELISA e IPX. O isolamento viral pode ser realizado em clulas primrias de rim bovino e na linhagem Vero. A deteco de partculas virais por ME e a amplicao de RNA por RT-PCR tambm podem ser utilizadas, alm de testes sorolgicos como a SN, ELISA e IDGA. Algumas vacinas tm sido utilizadas para limitar a disseminao da infeco. O controle baseado em medidas para impedir a introduo de animais infectados em reas livres.
tambm apresentam variaes de patogenicidade e virulncia nos hospedeiros.
8.5.1 Epidemiologia
A infeco pelo CDV enzotica no mundo inteiro, com a doena ocorrendo com maior freqncia em ces jovens no-vacinados. Falhas vacinais, associadas com esquemas de vacinao inadequados ou mesmo com vacinas comerciais de baixa qualidade, podem resultar na ocorrncia de doena mesmo em ces vacinados. Em outros pases a situao semelhante. Pases desenvolvidos que reduziram a incidncia da doena pela vacinao massiva ainda apresentam surtos espordicos de cinomose. O contato direto com as secrees nasais, orais e urina de animais infectados se constitui na principal forma de transmisso do CDV. A disseminao do vrus a curtas distncias por aerossis tambm parece ocorrer com certa freqncia. A transmisso por fmites e no ambiente nosocomial tambm tem sido descrita. Aps a infeco, os animais excretam o vrus nos uidos corporais por perodos prolongados. Grande parcela dos ces infectados no desenvolve a forma clnica da infeco. Entretanto, existem amostras de CDV com vrios nveis de patogenicidade. Este fato, associado com fatores do hospedeiro, como idade, status imunolgico e infeces secundrias, podem inuenciar na manifestao das diferentes formas clnicas da doena. Outro aspecto importante da biologia do CDV a gama crescente de espcies de mamferos que se infectam naturalmente. Os danos ecolgicos associados com essas infeces puderam ser observados nos surtos de cinomose com elevadas taxas de mortalidade em lees e hienas no Parque Nacional do Serengueti (Tanznia, continente africano). A infeco pelo CDV fatal tambm para outros animais domsticos, como os fures. A infeco de gatos domsticos parece no ser patognica, embora o CDV possa causar doena grave em grandes felinos selvagens. O controle desse vrus se torna difcil pelo grande nmero de espcies selvagens que podem ser infectadas, incluindo animais da famlia Canidae (lobos, ra-
8.5 Vrus da cinomose

A infeco pelo vrus da cinomose (CDV) ocorre em candeos domsticos e selvagens, alm de outros mamferos das famlias Felidae, Mustelidae, Procyonidae e Viverridae. Porm, a sua maior importncia na rotina veterinria est relacionada com as manifestaes clnicas em ces domsticos. O CDV um membro do gnero Morbillivirus e antigenicamente relacionado com o vrus do sarampo, com o vrus da peste dos pequenos ruminantes e com o vrus da peste bovina, estes dois ltimos ainda no relatados no Brasil. A cinomose apresenta sinais clnicos sistmicos, que podem ser acompanhados de sinais neurolgicos. Os vrions do CDV possuem as protenas F e H no envelope, e a protena H a responsvel pelo tropismo do vrus no organismo, possuindo funo importante na sua neuroinvasividade. O envelope lipoprotico viral facilmente destrudo por desinfetantes, e o vrus muito sensvel s condies ambientais de temperatura e radiao solar. Somente um sorotipo do CDV tem sido descrito, porm tem sido demonstrado que os isolados de campo apresentam uma variabilidade antignica considervel. Os isolados do CDV
Paramyxoviridae
675
posas, coiotes, dingo e chacal), Procyonidae (mopelada, coati e panda), Mustelidae (ferret, marta, texugo, cangamb e lontra), Viverridae (civet) e da famlia Felidae (leopardo, lees, tigres e guepardos). Surtos de enfermidade com alta mortalidade em focas e outros mamferos marinhos tm sido descritos no mar Mediterrneo e atribudos ao CDV e a outros vrus relacionados.

Aps a inalao das partculas vricas, o CDV replica no epitlio e em macrfagos do trato respiratrio superior e, a seguir, alcana os linfonodos regionais. Em um perodo de at uma semana aps a infeco, o vrus carreado por linfcitos e se dissemina pelos rgos linfides. Essa fase denominada viremia primria, e responsvel pelo primeiro pico febril. A progresso da infeco depende da resposta imune do animal. A maioria dos ces desenvolve uma resposta imune celular e humoral ecaz e no manifesta sinais clnicos da doena. Os ces infectados que no conseguem montar uma resposta eciente acabam por apresentar a doena em diferentes nveis de gravidade, em at trs semanas aps a infeco. Nestes animais, o vrus carreado por linfcitos e moncitos, produzindo a viremia secundria (segundo pico de febre) e se disseminando para a pele e para os tratos digestivo, respiratrio, urogenital e sistema nervoso. As manifestaes clnicas apresentam correlao com os rgos e/ou tecidos afetados. A patogenia da infeco pelo CDV est ilustrada na Figura 26.4. Clulas mononucleares carreiam o CDV para o SNC, por diferentes vias: atravs da barreira hematoenceflica, pelo uido cefalorraquidiano e/ou pelo epndima dos ventrculos. A grande variedade de sinais neurolgicos da cinomose est relacionada com as leses multifocais no SNC. Os stios de predileo do vrus so: a substncia branca do cerebelo, periventricular e ao redor do quarto ventrculo, a medula ssea e a via ptica. Geralmente, a desmielinizao a leso predominante, decorrente da replicao viral na substncia branca. Alguns estudos de-
monstram que, inicialmente, a infeco pelo CDV promove uma disfuno metablica nas clulas que produzem a mielina. No entanto, durante a inamao crnica, as leses so decorrentes do processo inamatrio, com a destruio dessas clulas por macrfagos e por anticorpos. A infeco do sistema reticuloendotelial e de linfonodos caracterizada pela hiperplasia e formao de clulas gigantes multinucleadas nesses rgos. No SNC, ocorre encefalite nosupurativa. No sistema respiratrio, pode ser observada pneumonia intersticial. A deteco de corpsculos de incluso eosinoflicos intracitoplasmticos e intranucleares, denominados corpsculos de Lenz, pode ser realizada nos tecidos em que ocorreu a replicao viral. Essas incluses so detectadas com maior freqncia em clulas sangneas, astrcitos, neurnios e no epitlio da bexiga, associadas com desmielinizao e altera-
Fonte: adaptada do site: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.
Figura 26.4. Patogenia da cinomose canina. O CDV penetra geralmente pela via oronasal e replica inicialmente nos epitlios e em macrfagos das vias areas superiores, faringe e tonsilas. A replicao primria seguida de viremia que permite a disseminao sistmica do vrus e infeco de uma variedade de linfonodos e acmulos linfides, levando a um quadro de imunossupresso. Em ces que no conseguem montar uma resposta imune eficiente, o vrus produz uma viremia secundria, dissemina-se e replica em vrios tecidos, incluindo clulas epiteliais da pele, dos tratos digestivo, respiratrio e urinrio, no sistema nervoso central (SNC) e no sistema retculoendotelial. Esses animais podem apresentar uma variedade de manifestaes clnicas, relacionadas com os rgos e tecidos afetados. A incapacidade de erradicar o vrus pode resultar em persistncia viral no SNC.
676
Captulo 26
es em astrcitos no sistema nervoso. Inltrado mononuclear perivascular pode ser observado na substncia cinzenta do SNC. Na necropsia, o crebro apresenta malcia e, ao exame microscpico, o cerebelo e pores mais basais do encfalo apresentam leses de necrose; raramente o crtex atingido. A forma aguda da doena mais comum em animais com idade entre quatro e seis meses, pela perda da imunidade passiva. Observa-se apatia, secreo nasal e ocular serosa a seromucosa e imunossupresso. A infeco na pele produz pstulas abdominais e, no tegumento, resulta em hiperqueratose do focinho e das almofadas plantares, causada pela infeco das clulas basais do epitlio. A replicao viral no sistema respiratrio inferior, quando associada com infeces bacterianas secundrias, pode causar pneumonia intersticial. Conjuntivite purulenta outro achado freqente. Diarria com fezes amolecidas observada pela infeco do trato digestrio. A doena hiperaguda se manifesta com sinais graves de ataxia e alteraes do comportamento em ces jovens, sendo associada com a vacinao com patgenos imunossupressores, como o parvovrus canino (CPV-2), ou mesmo pela reverso da vacina atenuada virulncia. O CDV pode produzir uma infeco grave do SNC, caracterizada por encefalite e desmielinizao. Essa patologia pode estar associada ou no com as manifestaes sistmicas e caracteriza-se por inamao da substncia cinzenta no crebro e cerebelo. Alm da forma aguda, uma forma crnica progressiva da enfermidade reconhecida em ces adultos (trs a oito anos de idade). Nestes casos, as alteraes so restritas ao SNC. Os sinais neurolgicos, tambm presentes na forma aguda, incluem hipersalivao, mioclonias, tremores, incoordenao, diminuio dos reexos pupilares, paresia do posterior, que pode evoluir para tetraplegia. Outros sinais mais graves podem ocorrer, incluindo epilepsia, delrio e vocalizaes, estupor e coma. Outra forma de apresentao da cinomose a encefalite do co velho, que geralmente acomete ces com idade superior a oito anos. Manchas marrom-escuras circundando o esmalte dos dentes de animais infectados ainda lhotes tambm so achados relativamente freqentes. Essa alterao resultante da infeco
das clulas que produzem o esmalte e denominada hiperplasia de esmalte. A infeco de cadelas prenhes pode resultar em transmisso transplacentria do vrus, podendo causar abortos, natimortos, nascimento de lhotes fracos e imunossuprimidos.
8.5.3 Imunidade
A sobrevivncia do animal depende fundamentalmente do desenvolvimento de uma resposta imune celular efetiva. A resposta imune humoral tambm importante, pois ces com ttulos medianos de anticorpos (entre 16 e 64) parecem estar protegidos contra a doena aguda. Ttulos de anticorpos inferiores a 16 no protegem os ces, porm interferem com o sucesso da vacinao. A imunidade passiva declina entre a 8a e 14a semanas de vida dos lhotes, deixandoos susceptveis infeco. Antes disso, a imunidade passiva pode comprometer o sucesso da vacinao, pela inativao do vrus vacinal pelos anticorpos. Diferenas antignicas entre isolados de campo e cepas vacinais tm sido implicadas como causa de falhas vacinais. Essas falhas resultam na ocorrncia de cinomose mesmo em ces vacinados.
8.5.4 Diagnstico
A ocorrncia de leses cutneas e doena respiratria em ces jovens, associadas ou no com sinais neurolgicos, so sugestivos de cinomose. Uma linfopenia pode estar presente no hemograma de animais doentes. O diagnstico laboratorial pode ser realizado pela deteco de antgenos do CDV em esfregaos de clulas da conjuntiva ou de fossas nasais, na capa ogstica e no sedimento urinrio pelas tcnicas de IFA e IPX ou, ainda, pela deteco do genoma viral nessas amostras por RT-PCR. O isolamento viral no muito utilizado para o diagnstico, pois o CDV necessita de adaptao aos cultivos celulares por vrias passagens. O vrus replica em clulas primrias e de linhagem de origem canina, como a MDCK, e de fures (ferrets). Outras clulas susceptveis incluem a linhagem Vero e broblastos de embrio de galinha.
Paramyxoviridae
677
Partculas virais podem ser detectadas nas fezes por microscopia eletrnica. O diagnstico post-mortem pode incluir as tcnicas descritas acima, para a deteco de antgenos virais nos tecidos, e ainda a histopatologia. O diagnstico sorolgico em um nico teste no possui signicado clnico. Este apenas ter importncia se realizado em amostras pareadas de soro. Kits de ELISA, para deteco de IgM, tm sido utilizados em clnicas, e o resultado positivo indicativo de infeco presente ou recente.

A vacinao com cepas atenuadas do CDV, em formulaes mono ou polivalentes, a estratgia mais utilizada no combate a cinomose. Em
geral, as vacinas inativadas no induzem resposta satisfatria; porm novos testes realizados com adjuvantes tm surtido resultados promissores. Vacinas vivas, contendo o vrus atenuado do sarampo, so utilizadas com relativo sucesso em pases da Europa. Essas vacinas no sofrem a interferncia da imunidade passiva. Vacinas com vrus vivo modicado e vacinas recombinantes, utilizando um poxvrus avirio como vetor do DNA complementar (cDNA) dos genes das protenas H e F do CDV, esto disponveis comercialmente (Figura 26.5). Recomenda-se a primovacinao aos 60 dias de idade, trs reforos mensais e revacinao anual. Para lhotes oriundos de mes sabidamente no-imunizadas e tambm em situaes de risco (canis, colnias, pet shops), pode-se antecipar a primovacinao. O
Vrus da cinomose (CDV)
Poxvrus do canrio
Genes da protenas HeF
Sntese de cDNA cDNA
Y Y YY Y Y
|| || || || |
Multiplicao
||
||
||
||
||
||
||
||
||
Imunizao
Figura 26.5. Vacina recombinante contra o vrus da cinomose (CDV). Os genes das glicoprotenas H e F so sintetizados como cDNA e inseridos no genoma do poxvrus do canrio. Este vrus vetor amplificado em cultivo celular e, ento, utilizado para imunizar os ces, nos quais expressa as protenas heterlogas. Os ces imunizados desenvolvem resposta imunolgica contra as protenas do vrus vetor e contra as glicoprotenas H e F, conferindo proteo contra o CDV.
678
Captulo 26
sucesso das vacinas disponveis depende da variabilidade antignica existente entre isolados do CDV, alm da qualidade dos imungenos e da resposta dos indivduos vacinados. A induo de encefalite aps a vacinao com as vacinas vivas disponveis est associada com a imunossupresso. Os sinais neurolgicos geralmente ocorrem entre 7 e 14 dias aps a administrao da vacina, porm o grau de imunossupresso e a presena de outras infeces podem agravar o quadro, tornando-o sistmico. Deve-se evitar a vacinao de fmeas lactantes em contato com seus lhotes no-imunizados, especialmente aquelas sem histrico de vacinao. Deve-se tambm evitar o contato de lhotes com outros ces at a segunda imunizao. Alguns estudos tm demonstrado que as revacinaes poderiam ser realizadas em intervalos maiores que um ano, pois os ces vacinados apresentam ttulos duradouros contra o vrus homlogo. As pessoas envolvidas nos cuidados ambulatoriais com animais doentes devem utilizar medidas de proteo (luvas descartveis, esterilizao e descarte de fmites, higiene pessoal e do ambiente com desinfetantes), associadas com o isolamento dos animais, prevenindo a disseminao da enfermidade no ambiente residencial e nosocomial. Diversos protocolos teraputicos, incluindo a suplementao com vitamina B, aplicao de corticosterides, soro hiperimune, drogas antivirais e outros medicamentos tm sido utilizados para minimizar os efeitos da infeco neurolgica. Porm, nenhum desses protocolos demonstrou ecincia comprovada sobre o desfecho da enfermidade. A cinomose permanece sendo uma doena de prognstico desfavorvel, com altas taxas de mortalidade, dependendo da cepa viral e da idade dos ces. Muitos animais que se recuperam da doena aguda permanecem com seqelas neurolgicas graves.
xumba. O CPIV-2 possui relao antignica com o vrus dos smios tipo 5 (SV-5) e com o HPIV-2. Em associao com outros agentes, como a Bordetella bronchiseptica, o adenovrus canino tipo 2 (CAV-2), o herpesvrus canino (CHV-1), o reovrus canino (CRV) e o Mycoplasma sp., o CPIV-2 tem sido envolvido na etiologia da doena conhecida como traqueobronquite infecciosa canina ou tosse dos canis. O CPIV-2 foi isolado pela primeira vez, em 1967, nos Estados Unidos, a partir de amostras clnicas de ces com essa doena.
8.6.1 Epidemiologia
Estima-se que 70% dos ces urbanos possuam anticorpos contra o CPIV-2. Esse vrus, assim como os outros agentes da traqueobronquite infecciosa canina, dissemina-se por via area e pelo contato direto ou indireto. A transmisso ocorre principalmente em ambientes de convvio entre ces, com superpopulao e estresse. Reinfeces com ou sem sinais clnicos podem ocorrer com freqncia. A infeco apresenta distribuio mundial. No existem dados publicados sobre a prevalncia de anticorpos ou isolamento do vrus no Brasil. No entanto, doena com sinais clnicos semelhantes aos da tosse dos canis so freqentes na rotina clnica, principalmente no inverno e afetando ces com idade entre seis meses e um ano.

Aps a transmisso, o vrus replica no epitlio da nasofaringe e se dissemina pelo trato respiratrio, infectando o epitlio pseudo-estraticado da traquia, onde se desencadeia um processo inamatrio. Nesse perodo, entre um e seis dias aps a infeco, iniciam os sinais clnicos. Os sinais mais freqentes incluem tosse seca e ruidosa, engasgos, letargia, apatia, conjuntivite e tonsilite. A recuperao geralmente ocorre entre 7 e 14 dias. Em casos mais severos, pode ocorrer hipertermia, apatia e perda do apetite, com pneumonia e tosse produtiva, decorrentes de infeces bacterianas secundrias. Na presena de infeco
8.6 Vrus da parainuenza canina tipo 2

O vrus da parainuenza canina tipo 2 (CPIV-2) um membro da famlia Paramyxoviridae, subfamlia Paramyxovirinae, classicado no gnero Rubulavirus, assim como o vrus da ca-
Paramyxoviridae
679
secundria por Bordetella sp., o quadro clnico pode persistir por at 30 dias. A encefalite pelo CPIV-2 em caninos e outros animais, tais como ferrets, geralmente desconsiderada na prtica clnica. No entanto, existem evidncias do envolvimento deste agente em doena com sinais neurolgicos indistinguveis aos da cinomose.
8.6.3 Imunidade
A infeco induz a rpida produo de anticorpos neutralizantes e inibidores da hemaglutinao. Imunidade humoral de mucosas (mediada por IgA secretria), alm da celular, so importantes para minimizar os sinais da infeco pelo CPIV-2, protegendo contra novas exposies ao agente.
Vacinas vivas e inativadas contra o CPIV-2 e outros agentes da tosse dos canis so comercializadas, para aplicao intranasal e parenteral, respectivamente. As vacinas atenuadas conferem imunidade de mucosas, porm o co pode apresentar sinais clnicos brandos da doena aps a vacinao. A primovacinao deve ser realizada aos 60 dias de idade, seguida por trs reforos mensais. Uma dose anual de reforo recomendada. A vacinao no previne a infeco nem os sinais clnicos, mas a doena em animais vacinados geralmente mais branda. A ventilao adequada de canis, higienizao adequada e a preveno de superpopulao so importantes na preveno da disseminao da infeco.
8.7 Metapneumovrus avirios

Os metapneumovrus avirios (AmPVs), como o pneumovrus avirio (APV) e o vrus da rinotraquete dos perus (turkey rhinotracheitis virus, TRV) esto associados com infeces agudas do trato respiratrio superior de perus e com doena respiratria e a sndrome da cabea inchada em galinhas. O APV, que anteriormente era classicado no gnero Pneumovirus, foi reclassicado dentro do gnero Metapneumovirus por apresentar o genoma com oito genes organizados em uma ordem diferente dos outros 10 gneros de pneumovrus de mamferos. Esses vrus no apresentam atividade hemaglutinante e de neuraminidase, sendo incapazes de aglutinar eritrcitos de mamferos e aves. So sensveis ao ter, clorofrmio e so inativados a 56C por 30 minutos. As glicoprotenas F e G do APV so as mais imunognicas. A glicoprotena G a protena mais varivel dos vrions, e estudos da sua seqncia em diferentes isolados evidenciam a existncia de subgrupos distintos. As protenas N e F so essenciais para a replicao do vrus e so altamente conservadas entre os diferentes isolados e entre os diferentes subgrupos de PVA. Inicialmente, acreditava-se que havia apenas um sorotipo de PVA, contendo dois subgrupos (A e B) que podiam ser diferenciados pela anlise da seqncia de nucleotdeos ou por anticorpos mo-
8.6.4 Diagnstico
O diagnstico clnico baseia-se nos sinais clnicos e deve ser conrmado por exames complementares, como a radiograa torcica (espessamento da traquia e de brnquios), hemograma e bioqumica srica. O diagnstico laboratorial especco pode ser realizado pelo isolamento do vrus a partir de secrees de animais doentes em clulas de linhagem caninas. A presena de antgenos virais em secrees nasais pode ser evidenciada pela tcnica de IFA. Como a traqueobronquite uma doena multicausal, deve-se tambm investigar a presena de outros agentes concomitantes, determinando-se ainda o prognstico da doena.

O uso de antiinamatrios no-esteroidais e xaropes auxiliam na recuperao do animal. A administrao de antibiticos ecazes contra Bordetella spp., tais como sulfas e quinolonas, minimizam as infeces secundrias. Outras medidas de suporte, como alimentao adequada, repouso e evitar a exposio ao frio tambm so importantes na recuperao.
680
Captulo 26
noclonais. Posteriormente foram identicados quatro subgrupos distintos (A, B, C e D), sendo os tipos A e B os mais prevalentes. O subgrupo C foi identicado apenas nos Estados Unidos da Amrica; e o subgrupo D surgiu isoladamente em um surto de rinotraquete em perus na Frana. Os primeiros relatos da doena causada pelo APV em produes avcolas datam do nal dos anos 70, na frica do Sul, associados com rinotraquete em perus. Esse quadro, popularmente conhecido na frica do Sul como Dikkop (cara inchada), foi denominado posteriormente de sndrome da cabea inchada (SHS). No incio da dcada de 1980, a ocorrncia concomitante de um surto de doena respiratria em perus e de SHS em galinhas de propriedades prximas levou a suspeita de que a rinotraquete dos perus e a SHS possuam a mesma etiologia. O APV possui distribuio mundial e surtos e sorologia positiva j foram relatados em vrios pases, tanto em perus como em galinhas de corte e poedeiras.
8.7.1 Epidemiologia
A origem do APV ainda obscura, embora os primeiros relatos da doena na frica do Sul sugiram que o vrus possa ser um patgeno natural de aves silvestres daquele pas. Estudos realizados no Brasil, em 1992, indicaram uma prevalncia de 65-70%. Estudos posteriores detectaram anticorpos para o APV em frangos de corte, matrizes e poedeiras nas regies Sul, Sudeste e Nordeste, demonstrando a ampla distribuio da infeco no pas. O isolamento do APV foi realizado a partir de perus e galinhas comerciais com sinais respiratrios; e os isolados foram identicados como pertencentes ao subgrupo A. As perdas econmicas devido a SHS em frangos de corte situam-se em torno de 1 a 3% em condies favorveis; e de 20 a 30% quando ocorrem complicaes respiratrias ou infeces bacterianas secundrias. A transmisso do APV ocorre por contato direto e indireto entre aves, por aerossis e atravs de rao, gua e cama contaminados. A transmisso geralmente associada ao contato ntimo com superfcies contaminadas bem como a fato-
res ambientais favorveis. Em condies de baixa umidade, m ventilao, calor intenso e poeira, a disseminao da doena entre galinhas criadas em cama rpida (cerca de 24 horas). No caso de aves criadas em gaiolas, em boxes ou galpes separados, a disseminao da doena pode ser lenta (cerca de 1 a 2 semanas). As aves mais susceptveis so os perus jovens e as matrizes pesadas, principalmente na primeira semana de produo, seguido de frangos de corte e poedeiras. O curso da SHS em galinhas varia de cinco a dez dias, sendo no mximo de seis semanas, com morbidade extremamente varivel (1% a 90%). A morbidade e mortalidade variam de acordo com a presena e o tipo de agente secundrio, sistema de criao, manejo e condies ambientais. No caso de frangos de corte, dependendo do agente secundrio, a mortalidade pode atingir 20% do plantel. J entre matrizes, a mortalidade varia de 1 a 5% e se restringe quelas que apresentam a cara inchada. Em perus, o perodo de incubao de aproximadamente trs a cinco dias. A disseminao do APV em plantis de perus ocorre de forma rpida, sendo que, em 24 a 48 horas, todo o plantel pode estar contaminado, e poucos animais so poupados da infeco. A infeco pode durar de sete a dez dias, observando-se um abrandamento gradativo dos sinais clnicos. A rinotraquete dos perus apresenta-se de forma aguda e muito contagiosa. A morbidade em perus elevada, podendo chegar a 100%. A mortalidade varivel, dependendo da presena de infeces bacterianas secundrias.

O vrus replica inicialmente nas clulas epiteliais ciliadas que revestem a mucosa dos condutos nasais, laringe e traquia. Com a infeco, as clulas perdem a atividade ciliar. Em perus, podem-se observar incluses citoplasmticas eosinoflicas nessas clulas. O vrus j est presente no trato respiratrio entre quatro e seis dias antes do aparecimento dos sinais clnicos. O APV alcana o oviduto atravs da corrente circulatria, aps a replicao
Paramyxoviridae
681
primria no trato respiratrio, e replica no epitlio do trato reprodutivo. Os sinais clnicos provavelmente so reexos dos danos provocados pela multiplicao do vrus no epitlio ciliado, tanto na traquia como no trato reprodutivo. Acredita-se que a maioria das infeces seja assintomtica ou restrita a sinais clnicos leves (aumento de secrees e espirros devido a um processo de hiperplasia glandular). Isto se deve ao fato de que, em condies normais, h uma reposio eciente das clulas que revestem as mucosas. Fatores que comprometem a habilidade de reparao epitelial ou que contribuem para um aumento da atividade secretria, como o estresse, poeira, concentrao de gases ambientais, deprimem as defesas locais ou o sistema BALT (tecido linfide associado aos brnquios), permitindo a instalao de agentes bacterianos secundrios. Isto leva a um processo inamatrio intenso, principalmente nos condutos naso-lacrimais, nos quais se observa secreo muco-catarral, lacrimejamento e blefarite. A persistncia de colonizao bacteriana leva ao acometimento do tecido subcutneo da regio submandibular do tecido sseo do crnio e, ao nal, afeco das meninges, que a fase que caracteriza a SHS. As principais alteraes histopatolgicas demonstram inicialmente uma injria do epitlio respiratrio, com reduo da atividade ciliar, e, nalmente, uma perda progressiva dos clios, congestionamento subepitelial e hiperplasia das clulas epiteliais. Nas clulas ciliadas, so observados corpsculos citoplasmticos acidlos. Freqentemente so observadas celulite, periostite e osteomielite dos ossos da cabea. Em muitos casos, ocorrem tambm otite externa e interna e meningite. No crebro, observam-se gliose, hiperemia, concentrao perivascular de leuccitos e em menor grau, hemorragias. Alteraes degenerativas podem ser observadas somente nas clulas de Purkinje do cerebelo. Tambm so observados hiperemia renal e glomerulonefrite. As aves infectadas apresentam uma degenerao marcante dos folculos ovarianos mais desenvolvidos e dos vulos maduros. Os sinais clnicos iniciais em frangos de corte incluem corrimento nasal, tosse ou espirros dis-
cretos, tumefao periocular e reduo de apetite. O quadro evolui para um hiperemia da conjuntiva, com edema da glndula lacrimal. Aps 12 a 24 horas, as aves apresentam um edema subcutneo na cabea, que se inicia ao redor dos olhos, aumentando sobre toda a cabea e descendo para o tecido submandibular e nuca. Aps 72 horas, os animais apresentam sinais neurolgicos caracterizados por apatia, leve torcicolo e movimentos repentinos na cabea. Esse quadro pode se agravar durante os dias subseqentes, podendo ocorrer diculdades motoras. Em matrizes, os primeiros sinais so falhas respiratrias brandas, rinite e conjuntivite, seguidas por incoordenao motora, torcicolo e opisttono, edema facial uni e bilateral atingindo toda a cabea. Durante os primeiros estdios da doena, as galinhas arranham a face com o p, o que leva ao aparecimento de um prurido localizado. A queda na produo de ovos tambm tem sido associada com a SHS. As aves mais susceptveis so os perus jovens e matrizes pesadas, principalmente na primeira semana de produo. Do ponto de vista clnico, a doena pode se manifestar sob as formas aguda e subaguda, acometendo geralmente o trato respiratrio superior, principalmente os cornetos nasais e traquia. Na forma aguda inicial, as aves apresentam uma prostrao profunda, aspecto comatoso ou estado de apatia (as aves cam paradas durante 3 a 5 horas sem ingerir alimentos ou gua), indo a bito por inanio ou desidratao.
8.7.3 Imunidade
Tanto as infeces naturais como experimentais induzem a formao de anticorpos, detectveis aproximadamente trs semanas aps a inoculao/infeco. Os anticorpos neutralizantes alcanam seu nvel mximo em cinco a seis semanas ps-infeco. Anticorpos so detectados em vrias categorias de animais, sem associao com doena clnica, reforando a hiptese de que a maioria das infeces so subclnicas. A exposio do trato respiratrio a patgenos resulta na produo de anticorpos locais das classes IgA e IgG, que so responsveis pela neutralizao do agente. Os anticorpos podem ser
682
Captulo 26
detectados a partir de cinco dias aps o aparecimento dos sinais clnicos, pelo uso de tcnicas como o ELISA, SN e a imunouorescncia indireta (IFI). Em infeco experimental de pintos livres de patgenos especcos (specic pathogen free, SPF) foi possvel detectar anticorpos a partir do 15o dia ps-inoculao, e os nveis persistiram at quatro semanas. A ativao do sistema imune local e a produo de anticorpos circulantes so mecanismos importantes para a proteo aps o desao viral, mas a imunidade celular apresenta uma importncia maior na defesa contra o APV.
8.7.4 Diagnstico
O quadro clnico pode apresentar variaes, dependendo das condies ambientais e das infeces secundrias, e no existem sinais patognomnicos. Portanto, necessrio que seja realizado o diagnstico laboratorial. A conrmao da infeco pelo APV depende da demonstrao do vrus ou antgenos virais; ou de anticorpos especcos no soro. Mtodos sorolgicos, como a SN, IFA e ELISA, so os mtodos de escolha para diagnstico da infeco. Em geral, o vrus mais dicilmente isolado de frangos do que de perus. Acredita-se que este fato possa se dar em razo do curto tempo de replicao do agente nos tecidos alvo, no estando mais presente por ocasio do aparecimento dos sinais clnicos. O isolamento viral raramente bem-sucedido em aves com sinais clnicos severos, provavelmente devido a infeces secundrias. A replicao viral nos tecidos alvo tambm pode no estar no pico no momento da coleta. O isolamento pode ser realizado em cultivos primrios de embrio de galinha, em ovos embrionados, em cultivos de anel de traquia (TOC) e em linhagens celulares (principalmente Vero e CER [chicken embryo related]). As clulas inoculadas apresentam efeito citoptico (ECP) com formao de sinccios. Nos anis de traquia, observada uma ciliostase (reduo dos movimentos ciliares). O sucesso do isolamento viral depende da quantidade de partculas virais viveis presentes na amostra enviada ao laboratrio e da utilizao de tcnicas adequadas. O uso da RT-PCR na deteco do APV em perus e galinhas apresenta como vantagem a ca-
pacidade de detectar pequenas quantidades de vrus, sem a necessidade de testes preliminares ou conrmatrios. Por ser altamente especca, a reao em cadeia da polimerase (PCR) no afetada pela presena de outros patgenos. Essa tcnica pode ser de suma importncia para a caracterizao molecular de isolados virais e em estudos epidemiolgicos. As tcnicas de RT-PCR, nested-PCR e PCR em tempo real apresentam uma sensibilidade pelo menos 100 vezes maior do que o isolamento viral. O material para o diagnstico (traquia, pulmo, cabea e ou swab naso-traqueal) deve ser enviado refrigerado, o mais rpido possvel para o laboratrio, no sendo necessrio o pr-congelamento.

As boas prticas de manejo e biossegurana so fundamentais para o controle de surtos causados pelo APV, especialmente em perus. Fatores, como: o sistema de criao, idade das aves, infeces bacterianas ou virais secundrias, m ventilao, contaminao ambiental, poeira, alta densidade populacional e oscilaes de temperatura, devem ser observados para o controle e preveno dessas enfermidades. Uma boa ventilao e troca de cama favorecem a reduo dos nveis de amnia. A amnia pode contribuir para a replicao rpida do vrus, pois pode propiciar injria no epitlio ciliar, facilitando a replicao e disseminao do vrus para outros tecidos. As vacinas inicialmente foram desenvolvidas para uso em perus, mas tambm provaram ser teis no controle da infeco pelo APV em galinhas. Os programas de vacinao tm sido rotineiramente utilizados em pases onde o APV est presente em criaes de perus e galinhas. A prtica de vacinao de aves comerciais tem auxiliado na reduo das perdas econmicas por minimizar a doena clnica, mortalidade e as perdas por queda na postura. Vacinas com o vrus atenuado ou inativado quimicamente tm sido utilizadas. Vacinas com o vrus vivo atenuado dos subtipos A e/ou B tm sido aplicadas em perus e em galinhas, isoladamente ou combinada com outras vacinas. A
Paramyxoviridae
683
recomendao de um programa de vacinao depende de cada empresa e da situao particular de cada granja. Entretanto, de modo geral, recomenda-se a primovacinao com vacinas vivas atenuadas, para estimular clones de clulas de memria, obtendo, assim, uma resposta mais efetiva. A revacinao deve ser realizada com uma vacina inativada. Embora a vacina no proteja completamente os animais, os sinais respiratrios sero mais brandos em caso de infeco.
8.8 Vrus da doena de Newcastle

A doena de Newcastle (ND) uma importante doena de aves causada pelo paramixovrus avirio sorotipo 1 (APMV-1), tambm conhecido como vrus da doena de Newcastle (NDV). Pela sua importncia sanitria estratgica, a ocorrncia de um surto da ND pode resultar na interrupo da exportao regional ou nacional da carne de frango, causando grandes perdas econmicas para a regio ou pas afetado. Vrias espcies de aves silvestres e domsticas podem servir de reservatrios do NDV e parecem se constituir em fontes dos diferentes tipos de vrus que, freqentemente, so encontrados nas outras espcies. A ND um dos principais problemas sanitrios da avicultura industrial. uma enfermidade viral aguda, altamente contagiosa, que acomete aves comerciais e outras espcies avirias, produzindo sinais respiratrios freqentemente acompanhados de manifestaes nervosas, diarria e edema da cabea. As manifestaes clnicas e a mortalidade variam de acordo com a virulncia da amostra viral envolvida.
desinfetantes contendo formol e/ou fenol, porm podem sobreviver por longos perodos a temperatura ambiente, especialmente nas fezes. A variao antignica do NDV pode ser detectada pelos testes de HI. Uma das variaes mais notveis tem ocorrido no vrus responsvel pela panzootia em pombos. Este vrus, citado como pigeon APMV-1 (PPMV-1), diferente do vrus padro nos testes de HI, mas no difere substancialmente dos vrus utilizados nas vacinas convencionais no-protetoras. Nos ltimos anos, as amplas variaes antignicas e genticas do vrus evidenciaram a grande diculdade em compreender a epidemiologia da ND. Os isolados do NDV so classicados de acordo com a sua patogenicidade. As amostras velognicas apresentam alta virulncia; as amostras mesognicas possuem virulncia moderada e as lentognicas so pouco ou nada virulentas. Os mtodos disponveis para essa classicao permitem a distino entre amostras com diferena acentuada no potencial patognico, porm podem produzir resultados discrepantes com amostras de virulncia semelhante. As amostras de NDV usadas em vacinas atenuadas so lentognicas e apresentam variaes individuais de virulncia para o trato respiratrio da galinha.
8.8.2 Histrico e epidemiologia

Os primeiros surtos da ND ocorreram em aves domsticas no ano de 1926, em Java, na Indonsia, e em Newcastle-upon-Tyne na Inglaterra (1927). Entretanto, relatos mais antigos indicam que esta doena j ocorria na Europa pelo menos desde 1912. No Brasil, a primeira descrio da doena foi realizada em 1953, quando foi realizado o isolamento da amostra M33 na cidade de Macap, Amap. A origem do surto foi provavelmente a importao de carcaas congeladas de frango dos Estados Unidos. A partir desta data, a doena passou a ser relatada em todo o territrio nacional, ocasionando graves perdas econmicas para a avicultura do pas. Desde 2002, o Ministrio da Agricultura e a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) vm realizando inquritos epidemiolgicos sistemticos em aves silvestres e migratrias, nos
8.8.1 O agente
O NDV pertence ao gnero Avulavirus, espcie paramixovrus avirio sorotipo 1 (APMV-1). No gnero Avulavirus, existem ainda outros oito sorotipos virais designados de 2 a 9. Os vrions do NDV so pleomrcos e, muitas vezes, esfricos, com o dimetro de aproximadamente 180 nm. O NDV inativado aps trs horas a 56C ou 30 minutos a 60C, e por ao de pH cido. Os vrions so sensveis ao ter e so inativados por
684
Captulo 26
quais foram isoladas amostras altamente patognicas do NDV nas regies Norte, Nordeste e Sul. No pantanal mato-grossense, foram isoladas amostras patognicas de NDV de diferentes aves silvestres, muitas delas vivendo em estrito contato com aves domsticas e comerciais. Aps cinco anos sem registros de focos, o Brasil voltou a registrar surtos da ND em criaes comerciais, em 2006, no Rio Grande do Sul. A eventual ocorrncia da doena no pas acarreta a imediata suspenso das exportaes de produtos avcolas, com graves prejuzos para a avicultura nacional. No Brasil, a ND controlada pela vacinao, mas existem reas declaradas livres, nas quais a vacinao no mais praticada. Surtos da ND so noticados esporadicamente no Brasil, principalmente em criaes domsticas de fundo de quintal ou em galinhas criadas de forma semiintensiva e no comercial. A ND endmica em muitos pases, mas muito difcil de se avaliar a sua real prevalncia no mundo. Em alguns pases onde a doena ocorre, no h dados sobre a sua distribuio e abrangncia, nem se ocorre somente em criaes domsticas ou tambm em criaes comerciais. Mesmo em aves com nalidade comercial, a estimativa da distribuio geogrca do NDV tornase confusa devido ao uso de vacinas vivas, contendo cepas virais consideradas virulentas em outros pases. Mesmo em pases livres da doena por muito tempo, o monitoramento sistemtico ocasionalmente revela infeces com sinais leves, provocadas por amostras no-virulentas, propagadas presumivelmente por aves silvestres. A forma altamente patognica da ND representa um problema srio para a avicultura comercial, tanto por ser considerada uma doena enzotica em vrios pases, quanto por ser a causa de epizootias freqentes na frica, sia, Amrica Central e em regies da Amrica do Sul. Na Europa, a ocorrncia da doena parece ser espordica, a despeito dos programas de vacinao. Aves domsticas e silvestres so susceptveis ao NDV, as galinhas (Gallus gallus) esto entre as mais susceptveis e as aves aquticas esto entre as menos suscetveis. O NDV j foi isolado em mais de 241 espcies, abrangendo 27 das 50 ordens de aves existentes. Algumas espcies
(psitacdeos e aves selvagens) parecem possuir o potencial de portadoras, podendo excretar cepas virulentas do NDV. Os mamferos podem atuar como vetores mecnicos do vrus. Alm de poder carrear mecanicamente o agente, o homem pode apresentar a doena sob a forma de conjuntivite branda. A principal via de transmisso do vrus por contato direto ou indireto, por aerossis ou por transmisso area; por pessoas, equipamentos, gua e vacinas contaminadas. O vrus excretado durante a fase de incubao, na fase clnica e na convalescena da doena e est presente no ar expirado, nas secrees respiratrias, nas fezes, nos ovos e em vrios tecidos das aves doentes.

A patogenia da infeco pelo NDV pode ser dividida de acordo com a virulncia da amostra viral envolvida e com os sinais clnicos. Os vrus patognicos produzem a forma lentognica, que se caracteriza por infeco subclnica ou sinais respiratrios moderados; a forma mesognica apresenta sinais respiratrios e ocasionalmente neurolgicos; e a forma velognica a forma mais severa e est associada com mortalidade elevada. Esta forma dividida em neurotrpica (sinais respiratrios e neurolgicos) e viscerotrpica (leses hemorrgicas no intestino). Portanto, as cepas do NDV que so realmente importantes do ponto de vista clnico-patolgico e epidemiolgico so as velognicas viscerotrpicas e/ou neurotrpicas. A patogenia desse vrus est associada com o seu tropismo pelos diferentes tecidos do hospedeiro e com a virulncia da cepa. A base molecular da virulncia do NDV determinada principalmente pela seqncia de aminocidos no stio de clivagem da glicoprotena F, e pela presena de proteases celulares necessrias para a ativao do precursor (F0) desta protena. A protena F sintetizada como uma precursora (F0), que clivada em F1 e F2 por proteases celulares. Essa clivagem necessria para a infectividade dos vrions e ocorre com mais ecincia em molculas de F0 que possuem vrios aminocidos bsicos no stio de clivagem. Cepas
Paramyxoviridae
685
virais contendo esta caracterstica podem ter a sua F0 clivada em uma variedade de tecidos e, por isso, so mais virulentas. Ao contrrio, nos vrus lentognicos, a clivagem ocorre somente com a protease reconhecendo uma simples arginina (protease do tipo tripsina). Por isso os vrus lentognicos esto restritos a determinados tecidos do hospedeiro, nos quais enzimas tipo tripsina esto presentes, como no trato digestivo e respiratrio. J, os vrus patognicos, podem replicar em uma variedade de tecidos e rgos, resultando em infeco sistmica. Os sinais clnicos observados na ND no so patognomnicos, e a infeco pode variar de subclnica at doena com mortalidade de 100%. Em termos gerais, a doena caracterizada por depresso, anorexia, diarria, prostrao, edema de cabea e barbela; sinais neurolgicos como paralisia, tremores, torcicolo e opisttono; alm de sinais respiratrios como tosse e espirros. Aves de postura podem apresentar reduo da produo de ovos. Os variantes virulentos do NDV podem replicar em aves vacinadas, mas os sinais clnicos so bastante reduzidos, de acordo com o nvel de anticorpos presentes. Da mesma forma, nenhuma leso macro ou microscpica pode ser considerada patognomnica para todas as formas da ND. As carcaas de aves que morrem em conseqncia da doena por cepas virulentas esto geralmente desidratadas, e as leses macroscpicas variam com o vrus. Os vrus virulentos panzoticos da ND produzem leses hemorrgicas no trato intestinal. Alguns autores tm relatado leses no pr-ventrculo, enquanto outros relatam um envolvimento mais proeminente do duodeno, jejuno e leo. Em casos de envolvimento respiratrio, as leses esto geralmente presentes no trato respiratrio e os achados incluem congesto e leses hemorrgicas, alm de aerossaculite. As leses inamatrias mais freqentes na traquia incluem tumefao da mucosa, hiperemia, edema e inltrado de linfcitos; e a sua intensidade est associada com a virulncia das amostras. As leses microscpicas no tm signicado diagnstico. Na maioria dos tecidos e rgos afetados, observam-se: hiperemia, necrose, inltrado celular e
edema. Leses macroscpicas no sistema nervoso central so pouco freqentes mesmo em aves que desenvolvem sinais neurolgicos. Quando ocorrem, essas alteraes so de uma encefalomielite no-purulenta. Surtos com amostras velognicas viscerotrpicas iniciam com apatia, sinais respiratrios e debilidade, nalizando com prostrao e morte. Edema na cabea e ao redor dos olhos podem ser observados, e a mortalidade pode atingir 100% em aves no-vacinadas. Aves acometidas por vrus velognicos neutrotrpicos apresentam doena respiratria severa acompanhada de sinais neurolgicos. Dessa forma, a infeco pelo NDV em aves domsticas varia desde inaparente at formas mais severas, sendo as ltimas caracterizadas por sinais respiratrios, digestivos e neurolgicos. A produo de ovos reduz-se drasticamente em aves adultas, podendo estender-se por semanas. A morbidade pode chegar a 100%, mas a mortalidade atinge at 50% em aves adultas e at 90% em aves jovens. Amostras de patogenicidade mdia geralmente causam doena respiratria, com rara ocorrncia de envolvimento neurolgico. Nesses casos, a mortalidade geralmente baixa, exceto em aves muito susceptveis ou com infeces concomitantes.
8.8.4 Diagnstico
O carter estratgico do NDV, determinado pela OIE, requer um diagnstico rpido e conclusivo da enfermidade. Em casos suspeitos e visando reduzir o risco de disseminao e difuso do vrus, recomenda-se a realizao de necropsia por um prossional no prprio local, com colheita e remessa de material para o laboratrio ocial. O material a ser enviado deve incluir fezes, suabes traqueais ou cloacais e tecidos de animais necropsiados, devendo-se eleger aqueles com alteraes aparentes. Esse material deve ser conservado refrigerado se o processamento for realizado dentro de 48 horas, ou congelado se a realizao dos testes for demorar mais. O diagnstico denitivo da infeco obtido pelo isolamento e identicao do vrus em ovos embrionados a partir de suabes traqueais ou cloacais, ou de macerados de rgos. Ovos SPF com
686
Captulo 26
embries de nove dias so inoculados com 0,1 mL da suspenso na cavidade alantide e, aps cinco a sete dias, o lquido colhido e testado pela tcnica de HA com eritrcitos de galinha. O agente hemaglutinante detectado , ento, identicado por HI com anti-soro especco, que ainda permite diferenci-lo da inuenza aviria. Esse mtodo demonstra a presena do agente, mas no indica se o vrus patognico ou no. O diagnstico completo da doena requer a determinao da virulncia do vrus, que pode ser obtida pelo seqenciamento de genes ou por testes in vivo. Dentre os testes in vivo, recomendase o que determina o ndice de patogenicidade intracerebral (IPIC). Este teste se baseia na inoculao do lquido alantide fresco no crebro de 10 pintinhos SPF de um dia. Cada ave examinada a intervalos de 24 horas, durante oito dias, e classicada em diferentes graus: zero (se normal), 1 (se doente) e 2 (se morta). Os vrus mais virulentos chegam CPI mxima de 2.0, enquanto os vrus lentognicos resultam em valores prximos a zero. Alm do isolamento em ovo embrionado, o diagnstico da infeco pelo NDV pode ser realizado por RT-PCR a partir de RNA extrado das amostras clnicas enviadas para o laboratrio. Vrias viroses avirias devem ser consideradas no diagnstico diferencial: como clera, inuenza, metaneumovrus, vrus da bronquite infecciosa; vrus da laringotraquete aviria, entre outras. Doenas de origem bacteriana a serem consideradas incluem a micoplasmose, psitacose, pasteurelose, entre outras.

A avicultura industrial investe considervel esforo na preveno da ND pelo uso sistemtico de vacinas, biosseguridade e aplicao de legislao especca. Apesar disso, a doena continua se constituindo em uma ameaa concreta para a avicultura, pois vrias espcies animais novacinadas podem servir de reservatrios para o agente. Por isso, necessrio um monitoramento sistemtico e contnuo para avaliar a condio sanitria dos plantis avcolas. Esse tipo de monitoramento tem permitido que a ND, alm de
outras doenas, seja prontamente identicada e controlada. A vacinao contra a ND protege as aves das conseqncias clnicas da doena, mas no impede a replicao e excreo viral. Dessa forma, o controle efetivo da infeco deve incluir tambm boas prticas de manejo e medidas de biosseguridade. A ocorrncia de focos da doena exige o isolamento completo das propriedades afetadas, limpeza e desinfeco das instalaes, controle de trfego humano, entre outras medidas. Atualmente, as empresas brasileiras, na maioria das regies, utilizam a vacinao sistemtica contra a ND. Os esquemas de vacinao utilizados em reprodutoras e em aves de postura so variados e dependem de cada empresa. Geralmente so aplicadas vacinas atenuadas na recria, seguido de uma revacinao com uma vacina inativada algumas semanas antes da transferncia para a produo. Algumas empresas ainda realizam um reforo com vacinas atenuadas durante a fase de produo (40, 50 e 60 semanas). Em relao vacinao em frangos de corte, no existe um consenso entre as empresas avcolas. As amostras lentognicas utilizadas na formulao vacinal no Brasil so a La Sota (LS), Ulster (UL) e VG-GA (VG). As amostras vacinais so preparadas em ovos embrionados de galinhas SPF. A aplicao das vacinas atenuadas pode ser feita por instilao nasal ou ocular, com o auxlio de um conta-gotas, ou pela via oral atravs da gua de bebida. Pintos de sete a 10 dias de idade recebem 100 L em uma das narinas ou no olho; ou duas gotas, uma em cada narina ou olho. Como medida de reforo, recomenda-se revacinar as aves periodicamente, com intervalos de trs a quatro meses. A vacina produz imunidade somente aps 21 dias, e a durao da imunidade varia de acordo com a idade das aves e o nmero de vacinaes.
ALEXANDER, D.J. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. In: SAIF, Y.M. et al. Disease of Poultry. 11.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 2003. p.63-95.
Paramyxoviridae
687
of Newcastle disease viruses showing variation in antigenicity and pathogenicity. Archives of Virology, v.128, p.363-370, 1993. COLLINS, M.S.; McINTOSH. K.; CHANOCK, R.M. Respiratory syncytial virus. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields Virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.44, p.1313-1351. COOK, J.K.; CAVANAGH, D. Detection and differentiation of avian pneumovirus (metapneumoviuses). Avian Pathology, v.31, p.117-132, 2002. COSWIG, L.T. Presena de anticorpos contra Pneumovrus avirio nas regies Sul e Sudeste do Brasil. 1998. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 1998. CUNHA, R.G.; SILVA, R.A. Isolamento e identicao do vrus da Doena de Newcastle no Brasil. Sociedade Brasileira de Medicina Veterinria, v.23, p.17-33, 1955. DARCE, R.C. et al. Subtyping of new Brazilian avian metapneumovirus isolates from chickens and turkeys by reverse transcriptase-nested-polymerase chain reaction. Avian Pathology, v.334, p.133-136, 2005. DANI, M.A.; DURIGON, E.L.; ARNS, C.W. Molecular characterization of Brazilian avian pneumovirus isolates: comparison between immunochemiluminescent Southern blot and nested PCR. Journal of Virological Methods, v.79, p.23741, 1999. DRIEMEIER, D. et al. Manifestao clnico-patolgica de infeco natural pelo vrus respiratrio sincicial bovino (BRSV) em bovinos de criao extensiva no Rio Grande do Sul, Brasil. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.17, p.77-81, 1997. FLORES, E.F. et al. A retrospective search for bovine respiratory syncytial virus (BRSV) antigens in histological specimens by immunouorescence and immunohistochemistry. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.20, p.139-143, 2000. GONALVES, D.A. et al. Isolamento do vrus Parainuenza bovino tipo 3 no Rio Grande do Sul, Brasil. Cincia. Rural, v.33, p.953-956, 2003. GONALVES, I.P.D. et al. Detection of bovine respiratory syncytial virus in calves of Rio Grande do Sul, Brazil. Cincia Rural, v.23, p.389-390, 1993. HENRICKSON, K.J. Parainuenza viruses. Microbiology Reviews, v.16, p.242-264, 2003. Clinical
ALEXANDER, D.J.; BELL, J.G.; ALDERS, R.G. A technology review: Newcastle disease. Rome: FAO Animal Production and Health Papers - 161, 2004. Disponvel em: http://www.fao.org. Acesso em: 26 fev. 2007. ALEXANDER, D.J.; MANVELL, R.J.; PARSONS, G. Newcastle disease virus (strain Herts 33/56) in tissues and organs of chickens infected experimentally. Avian Pathology, v.35, p.99101, 2006. ALMEIDA, R.S. et al. Bovine respiratory syncytial virus subgroup B is circulating in Brazil. The Veterinary Record, v.158, p.632634, 2006. APPEL, M.G.J.; SUMMERS, B.A. Canine distemper: current status. In: CARMICHAEL, L.E. (Ed). Recent Advances in Canine Infectious Diseases. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: http://www.ivis.org. Acesso em: 16 out. 2006. ARNS C.W. et al. Characterization of bovine respiratory syncytial virus isolated in Brazil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.36, p.541, 2003. ARNS, C.W.; HAFEZ, H.M. Swollen head syndrome in poultry ocks in Brazil. Proceedings of the 41st Western Poultry Diseases Conference, v.41, p.81-84, 1992. BAUMGRTNER, W.; KRAKOWKA, S.;GORHAMB, J.R. Canine parainuenza virus-induced encephalitis in ferrets. Journal of Comparative Pathology, v.100, p. 67-76, 1989. BAYON-AUBOYER, M.H. et al Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (PVA) reveal a novel PVA subgroup. The Journal of General Virology, v.8, p. 2723-2733, 2000. BHM, M. et al. Serum antibody titres to canine parvovirus, adenovirus and distemper virus in dogs in the UK which had not been vaccinated for at least three years. The Veterinary Record, v.154, p.457-463, 2004. BRASIL Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Programa Nacional de Sanidade Avcola. Portaria 182 de 8 de novembro de 1994. Disponvel em: http://www.agricultura.gov.br.Acesso em: 12 fev. 2007. CARBREY E.A. et al. Recommended standard laboratory techniques for diagnosing infectious bovine rhinotracheitis, bovine diarrhea virus and shipping fever (Parainuenza 3). Proceedings of the United States Animal Health Association, v.75, p.629-648, 1971. CARTER, G.R.; WISE, D.J.; FLORES, E.F. Paramyxoviridae. In: ___. (Eds). A concise review of veterinary virology. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: http://www.ivis.org. Acesso em: 05 out. 2006. COLLINS, M.S.; BASHIRUDDIN, J.B.; ALEXANDER, D.J. Deduced amino acid sequences at the fusion protein cleavage site
HIRSH, D.C.; ZEE, Y.C. Veterinary Microbiology. Malden, MA: Blackwell Science, 1999. 479p. INABA, Y. et al. Isolation of bovine respiratory syncytial virus. The Japanese Journal of Experimental Medicine, v.40, p.473474, 1970. JUHASZ, K.; EASTON, A.J. Extensive sequence variation in the attacchment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence
for two distinct subgroups. The Journal of General Virology, v.75, p.2873-2880, 1994. KOMMERS, G.D. et al. Pathogenesis of chicken-passaged Newcastle disease viruses isolated from chickens, wild, and exotic birds. Avian Disease, v.47, p.319-329, 2003. KOMMERS, G.D. et al. Virulence of pigeon-origin isolates of Newcastle disease for domestic chickens. Avian Disease, v.45, p.906-921, 2001. LARSEN, L.E. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV): a review. Acta Veterinaria Scandinavica, v.41, p.1-24, 2000. MCGAVIN, M.; CARLTON, W.; ZACHARY, J. Thomsons Special Veterinary Pathology. 3.ed. New York: Mosby, 2001. 768p. MUNIR S.; KAPUR V. Regulation of the host cell transcriptional physiology by the avian pneumovirus provides key insights into host pathogen intercations. Journal of Virology, v.77, p.48994910, 2003. MURPHY, F.A. et al. Veterinary Virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. OIE. Newcastle disease. In: ___. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 2004. Disponvel em: http:// www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00038.htm. Acesso em: 15 mar. 2007.
PACCAUD, M.F.; JACQUIER, C. A respiratory syncytial virus of bovine origin. Archiv fur die Gesamte Virusforschung, v.30, p.327-342, 1970. QUAN S.F. et al. Canine parainuenza type 2 and Bordetella bronchiseptica infection produces increased bronchoalveolar lavage thromboxane concentrations in beagle puppies. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, v.44, p.171-175, 1991. RANDHAWA, J.S. et al. Rescue of synthetic minireplications establishes the absence of NS1 e NS2 from avian pneumoviruses. Journal of Virology, v.71, p.9849-54, 1997. REISINGER, R.C.; HEDDLESTON, K.L.; MANTHEI, C.A. A myxovirus (SF-4) associated with shipping fever of cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.135, p.147152, 1959. SCHRIJVER, R.S. Immunobiology of bovine respiratory syncytial virus infections. Tijdschrift voon Diergeneeskunde, v.123, p.658-662, 1998. VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. Demyelination in canine distemper virus infection: a review. Acta Neuropathologica, v.109, p.56-68, 2005.
RHABDOVIRIDAE
Luis L. Rodriguez1, Paulo Michel Roehe, Helena Batista & Gael Kurath1
27
691 691 692 693 695
695 696 699 699 700 700 700 701 702 703 704 705 708 709 711 711 713 713 714 715 716 717 717
1 Introduo 2 Classicao e taxonomia 3 Estrutura do vrion e do genoma 4 O ciclo replicativo 5 Rabdovrus de interesse veterinrio
5.1 Vrus da estomatite vesicular 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia e sinais clnicos 5.1.3 Imunidade 5.1.4 Diagnstico 5.1.5 Controle e prolaxia 5.2 Vrus da raiva e lissavrus relacionados 5.2.1 O agente 5.2.2 Estrutura do vrion 5.2.3 Replicao viral 5.2.4 Variaes antignicas 5.2.5 Epidemiologia 5.2.6 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.2.7 Diagnstico 5.2.8 Preveno e controle 5.2.9 Tratamento 5.3 Rabdovrus de peixes 5.3.1 Histrico e classicao 5.3.2 Epidemiologia 5.3.3 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.3.4 Imunidade 5.3.5 Diagnstico 5.3.6 Controle e prolaxia
1
718
Seo geral da famlia e VSV (LLR); raiva (PMR e HB); rabdovrus de peixes (GK). Traduo da parte geral, VSV e rabdovrus de peixes: Renata Dezengrini.
1 Introduo
A famlia Rhabdoviridae (ordem Mononegavirales) abriga vrus que infectam uma grande variedade de espcies, incluindo artrpodes, plantas e vertebrados. Dentre os vrus de vertebrados, existem rabdovrus que infectam mamferos, aves e peixes. A famlia possui alguns vrus de grande importncia para a sade humana e animal. O vrus da raiva (RabV) causa uma das doenas mais temidas e fatais de todos os tempos, e o vrus da estomatite vesicular (VSV) est associado com surtos de repercusso econmica importante em eqinos e em animais de produo. Os primeiros relatos da raiva ocorreram h mais de 2.700 anos, quando j era descrita como uma doena grave, caracterizada por hipersalivao, alteraes no comportamento e morte inevitvel. A raiva tem tambm um impacto importante em medicina veterinria, tanto pela sua ocorrncia urbana em ces, como pela sua ocorrncia em espcies silvestres, como o mo-pelada (Procyon cancryvorus), esquilos, candeos silvestres, morcegos, mangostas (Cynictis penicillata), os quais representam um risco iminente de infeco para humanos. Os morcegos hematfagos, como o Desmodus rotundus, tambm carreiam o vrus da raiva, podendo transmiti-lo a animais domsticos e, ocasionalmente, para humanos. Em certas regies, relativamente freqente a ocorrncia de casos espordicos ou de surtos de propores variveis em animais de criao, principalmente em bovinos. Outra doena relevante em medicina veterinria a estomatite vesicular (VS), que afeta os bovinos, sunos e eqinos. Em bovinos e sunos, a VS apresenta caractersticas clnicas muito semelhantes febre aftosa (FMD). Portanto, os surtos de VS resultam em signicativas perdas econmicas conseqentes da interdio e quarentena, at que se proceda ao diagnstico diferencial para descartar a FMD. Devido sua ampla distribuio na natureza e capacidade de infectar vrias espcies de mamferos, peixes e plantas, existem muitos rabdovrus com potencial patognico ainda desconhecido. Alguns rabdovrus tm sido identicados como patgenos emergentes em humanos e
animais, como o Australian bat lyssavirus e o vrus Chandipura, um vrus reemergente causador de encefalite em crianas na ndia. Outros rabdovrus provavelmente sero descobertos no futuro, adicionando-se, assim, mais patgenos nesta importante famlia viral. Este captulo abordar as caractersticas gerais da famlia Rhabdoviridae, a sua taxonomia, estrutura e organizao genmica e estratgia de replicao. Alm disso, sero abordadas com mais detalhes as doenas por rabdovrus mais relevantes para a medicina veterinria: a raiva, a estomatite vesicular e as produzidas por rabdovrus de peixes.
2 Classicao e taxonomia
Os rabdovrus so classicados em seis gneros e dois deles contm apenas vrus de plantas (Tabela 27.1). Como os outros membros da ordem Mononegavirales, os rabdovrus possuem como genoma uma molcula de RNA linear de sentido negativo, que possui pelo menos cinco genes,
Ephemerovirus BEFV
Chandipura
Isfahan
COCV VSAV IN98COE Vesiculovirus
NJ95COB
SVCV Lyssavirus Raiva
Figura 27.1. Relao filogentica entre os vrus pertencentes aos trs gneros da famlia Rhabdoviridae associados com doenas em mamferos.
692
Captulo 27
Tabela 27.1. Classificao taxonmica dos membros da famlia Rhabdoviridae, com espcies hospedeiras e doenas de importncia veterinria. Gnero Vesiculovirus Lyssavirus Ephemerovirus Espcie/tipo Vrus da estomatite vesicular (VSV) Vrus da raiva (RabV) Vrus da febre efmera dos bovinos (BEFV) Vrus da necrose hematopoitica (IHNV)
Vrus da necrose amarela da alface
Hospedeiro(s) Mamferos, peixes, insetos Mamferos, insetos Mamferos, insetos
Doena de importncia veterinria Estomatite vesicular, viremia primaveril das carpas etc. Raiva, lissavrus dos morcegos australianos. Febre efmera de bovinos, doena do rio Adelaide. Necrose hematopoitica, septicemia hemorrgica.
Novirhabdovirus
Peixes
Cytorhabdovirus
Plantas Plantas
Nenhuma. Nenhuma.
Nucleorhabdovirus
Vrus do tomate ano
na ordem 3-N-P-M-G-L-5. Cada gene anqueado por seqncias conservadas de iniciao e terminao da transcrio, compostas de aproximadamente 10 nucleotdeos (nt). A organizao genmica, a estrutura e morfologia dos vrions, juntamente com a estratgia de replicao e as relaes sorolgicas se constituem nas bases para a sua classicao. A Figura 27.1 apresenta a relao logentica entre os vrus dos trs gneros que infectam mamferos. A Tabela 27.1 apresenta a classicao taxonmica resumida da famlia.

As partculas dos rabdovrus possuem um formato de basto (do grego, rhabdus = basto), com dimenses entre 100 e 430 nm de extenso por 40 a 100 nm de dimetro (Figura 27.2A, B). Os vrions so compostos por uma estrutura helical interna (ribonucleoprotena, RNP), que contm o genoma. A protena do nucleocapsdeo (N), a fosfoprotena (P) e a polimerase viral (L) envolvem o RNA genmico e constituem o ribonucleocapsdeo. A protena da matriz (M) est associada intimamente com a RNP, constituindo-se na base estrutural que confere aos vrions o formato de
projtil. Uma membrana lipdica derivada da clula hospedeira, contendo trmeros da glicoprotena de superfcie (G), forma o envelope viral. O genoma dos rabdovrus consiste de uma molcula de RNA de ta simples linear de polaridade negativa, com 11.000 a 15.000 nt (Figura 27.2C). A organizao do genoma e a ordem dos genes so muito conservadas. O genoma possui uma pequena seqncia leader no-traduzida com 40 a 50 nt na extremidade 3, seguida por um sinal conservado de iniciao da transcrio; e pelos genes N, P, M, G e L. Esses genes so separados por regies intergnicas conservadas. Prximo a extremidade 5 existe uma seqncia trailer de 40 a 50 nt, parcialmente complementar regio 3 leader. As regies leader, trailer e as seqncias intergnicas possuem funes importantes na regulao da transcrio e replicao viral. Alguns rabdovrus possuem genes adicionais, como alguns vrus de plantas, que possuem um gene extra entre os genes P e M; e alguns rabdovrus de peixes possuem genes adicionais entre duas regies do genoma, P-M e G-L. Alguns vesiculovrus e lissavrus codicam ainda algumas protenas no-estruturais, pequenas e bsicas, em uma segunda seqncia aberta de leitura (ORF) do gene da protena P.
Rhabdoviridae
693
B
Glicoprotena (G)
Protena matriz (M)
Ribonucleocapsdeo (RNP)
Fosfoprotena (P)
RNA
Polimerase (L)
C
leader
Nucleoprotena (N) trailer
5
kb
10
11
Fonte:- A) Dr David Sander, ICTVdB.
Figura 27.2. Estrutura dos vrions e do genoma dos membros da famlia Rhabdoviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica do vrus da estomatite vesicular, VSV; B) Estrutura de uma partcula vrica e seus componentes; C) Estrutura e organizao do genoma.
A infectividade dos rabdovrus razoavelmente estvel sob condies ambientais, especialmente sob pH alcalino. No entanto, os vrions so termolbeis e sensveis radiao solar e ultravioleta (UV). Na prtica, o VSV pode ser facilmente inativado por desinfetantes baseados em detergentes.
O ciclo replicativo descrito a seguir baseiase no vrus da estomatite vesicular (VSV), o prottipo da famlia. O ciclo inicia com a interao da glicoprotena G do envelope viral com recep-
tores na superfcie celular (fosfatidil-serina, por exemplo). Essa interao resulta na adsoro e penetrao dos vrions por endocitose (Figura 27.3). No interior da vescula endoctica, sob pH cido, a protena G promove a fuso do envelope viral com a membrana do endossomo. O complexo ribonucleoprotena (RNA+N+L+P) liberado no citoplasma e a ta simples de RNA negativo transcrita pelo complexo polimerase que est presente no vrion. As protenas do nucleocapsdeo devem estar intimamente associadas com o RNA para que ocorra a transcrio e a replicao. O complexo polimerase ativo requer a associao de trs unidades da fosfoprotena (P) com uma unidade da protena L (large).
694
Captulo 27
11 1 2 3 9 10
7
4
N
5 6
L G P M Ncleo
Citoplasma
Figura 27.3. Ilustrao esquemtica do ciclo replicativo do vrus da estomatite vesicular (VSV), prottipo da famlia Rhabdoviridae. Aps a ligao aos receptores especficos (1), os vrions so internalizados por endocitose (2), que seguida de fuso do envelope com a membrana endossomal, sob pH baixo, e da liberao do nucleocapsdeo no citosol (3). Segue-se a transcrio individual dos genes (4) e traduo (5), resultando na produo das protenas virais N, P, M, G e L (6). A polimerase viral (L), com a participao da protena P, realiza a sntese da molcula de RNA complementar (7) e, a seguir, a sntese de cpias genmicas (8), que permanecem associadas com as protenas que compem a ribonucleoprotena (RNP). Os nucleocapsdeos (RNA+protenas) recm-formados so transportados at a membrana plasmtica (9), onde interagem com a protena M e com as caudas da glicoprotena G (10), resultando no brotamento e egresso da prognie viral (11).
A transcrio do genoma dos rabdovrus regulada por um mecanismo simples e eciente, em que o nvel de expresso de cada gene determinado pela sua distncia em relao ao promotor nico, localizado prximo extremidade 3. Esse mecanismo denominado de atenuao da transcrio, e o gradiente de produo de transcritos ser na ordem N>P>M>G>L. Portanto, a protena do nucleocapsdeo (N) a protena mais abundante e a polimerase (L) a menos abundante. Cada RNA mensageiro (mRNA) monocistrnico (codica apenas uma protena) e possui uma estrutura cap na extremidade 5 e uma cauda poliA na extremidade 3. O gene P de alguns vrus
uma exceo, pois codica duas protenas bsicas pequenas em uma segunda ORF (Figura 27.3). Seqncias conservadas das regies intergnicas contm sinais para a terminao da transcrio, adio de cap e poliadenilao. Uma seqncia de 40 a 50 nt na extremidade 3 transcrita, mas no recebe cap ou poli-A. Esse transcrito, denominado RNA leader, produzido em grande quantidade e transportado para o ncleo da clula, onde inibe a transcrio dos genes celulares. O transcrito leader seguido pelo mRNA da protena N, que recebe o cap pelo complexo polimerase do vrion. Na extremidade nal do gene N e de todos os cinco genes, encontra-se a seqn-
Rhabdoviridae
695
cia 5-AGUUUUUUUCAUA -3, que sinaliza o nal da transcrio e a poliadenilao do mRNA. A cauda poli-A , provavelmente, sintetizada pela polimerase viral, que utiliza a seqncia de sete bases Uracil como molde para iniciar a polimerizao da seqncia de Adeninas. A sntese dos quatro mRNA subseqentes ocorre de forma idntica. A traduo dos mRNA est associada com o processo de transcrio, e a quantidade de cada protena reete a abundncia relativa de cada mRNA. Aps a traduo das protenas virais pelos ribossomos, o complexo polimerase realiza a transio do modo de transcrio para o modo de replicao do genoma, sintetizando cadeias completas do RNA com sentido positivo. Essas cpias de RNA conjugam-se com a protena N e servem de molde para a sntese de cpias de RNA de sentido genmico. Os mecanismos envolvidos na troca da transcrio para a replicao no esto completamente elucidados, mas a quantidade de protena N parece desempenhar uma funo importante. Aps a sntese de cpias negativas do RNA, essas podem servir para transcrio e replicao ou podem, ainda, ser encapsidadas nas partculas virais, pela interao da protena N com a protena da matriz (M). O brotamento na membrana plasmtica mediado pela interao da M com a glicoprotena G (gG). A gG sintetizada no retculo endoplasmtico, transportada pelo complexo de Golgi e inserida na membrana plasmtica na forma de trmeros. Aps a insero, esses trmeros interagem com os ribonucleocapsdeos recm-formados para formar vrions maduros, que brotam da superfcie celular adquirindo o envelope lipoprotico. A Figura 3 apresenta de forma esquemtica e simplicada o ciclo replicativo do VSV. In vitro, o VSV replica em uma variedade de clulas primrias e de linhagem de vrias espcies animais, incluindo invertebrados e vertebrados. A maioria das linhagens celulares de mamferos suporta a replicao do VSV, mas a susceptibilidade varia amplamente entre diferentes linhagens. Em geral, as clulas BHK-21 so utilizadas para se obter altos ttulos virais, enquanto as clu-
las Vero so utilizadas para isolamento do vrus. Clulas de origem aviria, como clulas de embrio de galinha, tambm so susceptveis e produzem altos ttulos do VSV. Este vrus tambm replica em cultivos de clulas de peixes e rpteis. Da mesma forma, o vrus capaz de replicar em vrias linhagens celulares derivadas de insetos, como do Aedes aegypti. Em geral, a replicao na maioria das clulas de insetos no-citoltica, contrastando com a replicao rpida e altamente ltica observada em clulas de mamferos.
5 Rabdovrus de interesse veterinrio

Este captulo descreve em maiores detalhes trs grupos de rabdovrus que so relevantes para a sade animal: o vrus da estomatite vesicular (VSV), o vrus da raiva e lissavrus relacionados, alm dos rabdovrus que infectam peixes.
5.1 Vrus da estomatite vesicular

A estomatite vesicular (VS) uma enfermidade caracterizada pelo desenvolvimento de leses vesiculares na boca, lngua, tetos e na banda coronria dos cascos de bovinos, eqinos e sunos. O vrus da estomatite vesicular (VSV) encontra-se amplamente distribudo nas Amricas. Em bovinos e sunos, a doena clinicamente indistinguvel da febre aftosa, uma das doenas animais de maior importncia econmica. Por isso, os surtos de VS resultam em perdas vultosas, principalmente pelas quarentenas exigidas at que se realize o diagnstico laboratorial e se descarte a febre aftosa. As primeiras descries de doena vesicular em eqinos (provavelmente a VS) ocorreram no sculo XIX, no sudeste dos EUA e na Amrica Central. Em 1862, foi relatada a ocorrncia de uma doena vesicular e febril em eqinos do exrcito americano durante a guerra civil. A primeira grande epizootia de VS, descrita em detalhes nos EUA, ocorreu em 1916, acometendo um grande nmero de eqinos, mulas e bovinos. Epizootias de VS continuaram a ocorrer no Sudoeste dos EUA, com intervalos de aproximadamente 10 anos. Porm o agente etiolgico foi descrito pela
696
Captulo 27
IN2 RANCHARIA IN2 SALTO IN2 MAIPU IN2 COCAL
5.1.1 Epidemiologia Distribuio geogrca

O VSIV e o VSNJV so endmicos do Norte e Oeste da Amrica do Sul (Bolvia, Colmbia, Equador, Peru e Venezuela), na Amrica Central at o Sul do Mxico, com surtos descritos nessas regies praticamente a cada ano. A maioria dos surtos (80%) causada pelo VSNJV, mas o VSIV circula nessas reas e, ocasionalmente, os dois sorotipos podem ser encontrados simultaneamente. No Norte do Mxico e Sul dos EUA, a ocorrncia da VS espordica, com surtos descritos no sudoeste americano a intervalos de oito a 10 anos, com durao de um a dois anos. No Brasil, esses dois vrus no foram detectados, mas surtos de estomatite vesicular tm sido descritos e so causados por vrus relacionados sorologicamente ao VSIV. Esses vrus foram classicados como Indiana 2 (VSIV-2), com o prottipo vrus Cocal (COCV); e Indiana 3 (VSIV-3), que possui como prottipo a cepa Alagoas (VSAV). A maioria dos casos no Brasil causada pelo VSIV-3, enquanto o VSIV-2 ocorre apenas esporadicamente, e mais ao Sul do Pas. O VSIV-2 tem sido descrito ocasionalmente na Argentina, onde o ltimo surto foi relatado em 1986. A Figura 27.4 apresenta a relao logentica entre diferentes isolados e tipos do VSV obtidos de diferentes localizaes geogrcas.
IN-1 IN198COE IN 85CLB IN194GUB IN2 MARAB NJ88CRB NJ89GAS NJ95NME Piry PMG Raiva
100 substituies
Figura 27.4. Relao filogentica entre diferentes isolados e tipos do VSV obtidos de diferentes locais nas Amricas.
Espectro de hospedeiros e ciclo natural

Como outros vesiculovrus, o VSV pode infectar vrias espcies de hospedeiros, incluindo insetos, pssaros e mamferos. Existem evidncias sorolgicas da infeco de mamferos silvestres, como os ratos-de-algodo (Sigmodon ssp), ratos-de-arroz (Oryzomis ssp) e camundongos-de-campo (Peromyscus ssp e Reithrodontomys ssp); alm de mamferos como morcegos (vrias espcies), macacos (Alloata palliatta); veados-da cauda-branca (Odocoileus virginianus) e sunos
VSNJV
VSIV
VSIV-2
primeira vez em Indiana, em 1926, recebendo o nome de vrus da estomatite vesicular de Indiana (VSIV). No ano seguinte, um agente sorologicamente relacionado ao VSIV foi isolado de bovinos em Nova Jersey, sendo denominado vrus da estomatite vesicular de Nova Jersey (VSNJV). Estudos subseqentes demonstraram que esses vrus so sorologicamente distintos, sendo, assim, classicados em sorotipos separados.
IN3 MINAS GERAIS IN3 ESPINOSA IN3 ANEGRAS
IN2 SCAT970 In2 PARAN IN2 SCAT969
VSIV-3
IN3 ALAGOAS
Rhabdoviridae
697
selvagens (Sus scrofa). A infeco de animais silvestres parece ser assintomtica, no entanto, leses vesiculares pequenas tm sido descritas em sunos selvagens. Em contraste, animais domsticos, como os bovinos (Bos taurus e Bos indicus), eqdeos (cavalos, mulas e burros), sunos, ocasionalmente cameldeos (Lama glama), ovinos e caprinos infectados, freqentemente apresentam sinais clnicos. A ocorrncia de doena vesicular em eqinos um importante achado para a sua diferenciao de febre aftosa. Existem evidncias consistentes de que o VSV um arbovrus, ou seja, que transmitido por insetos. Vrias espcies de insetos podem ser infectados pelos VSVs, e essa infeco tem sido detectada especialmente durante os surtos. Trs espcies de insetos: as moscas-de-areia (Lutzomyia ssp), as moscas-pretas (Simulium sp) e os pernilongos (Culicoides sp) so considerados vetores biolgicos do vrus, pois so capazes de replicar e transmitir o VSV a espcies susceptveis, tais
como: camundongos, sunos, bovinos e eqinos. No entanto, ao contrrio dos outros arbovrus, o VSV parece no produzir viremia em seus hospedeiros naturais (sunos, bovinos, cavalos, veados e sunos selvagens) aps infeco experimental. Recentemente foi demonstrado que pode ocorrer transmisso do VSV entre moscas infectadas e no-infectadas ao se alimentarem em um mesmo animal no-virmico. Esse mecanismo poderia explicar a transmisso do VSV durante os surtos, mesmo na ausncia de hospedeiros mamferos virmicos. Uma ilustrao simplicada da histria natural do VSV com os provveis hospedeiros naturais e acidentais est apresentada na Figura 27.5.
Ocorrncia em reas endmicas

Em reas endmicas, localizadas em regies tropicais e subtropicais das Amricas, os intervalos entre os surtos so inferiores a um ano.
Hospedeiros naturais?
Espcies naturalmente infectadas Cervdeos Sunos silvestres Pssaros Lagartos Roedores Morcegos
?
Bovinos, sunos, eqinos (sem viremia) Hospedeiros terminais?
Figura 27.5. Provvel ciclo natural do vrus da estomatite vesicular (VSV).
698
Captulo 27
Vrios estudos realizados em reas endmicas da Costa Rica demonstram que o pico dos sinais clnicos ocorre nas estaes chuvosas ou secas, dependendo da zona ecolgica. Os casos clnicos ocorreram com maior freqncia em vacas em lactao, causados pelo VSNJV (90%) e pelo VSIV (10%). A maioria dos animais adultos, principalmente aqueles que desenvolveram a doena clnica, apresentou ttulos altos de anticorpos neutralizantes contra o VSNJV (93%) e contra o VSIV (25%). No foram detectadas evidncias de mutaes que alterassem o perl antignico da glicoprotena viral, embora alguns animais afetados possussem altos ttulos de anticorpos neutralizantes contra o vrus homlogo previamente aos sinais clnicos. Nessas reas endmicas, muitos animais tornam-se soropositivos durante os perodos de atividade viral sem manifestarem sinais clnicos da doena. Por isso, acredita-se que a circulao do vrus nessas reas pode ocorrer na completa ausncia de sinais clnicos nos animais de criao. Animais silvestres, como veados, primatas, sunos, morcegos e pssaros residentes nessas reas, freqentemente possuem anticorpos neutralizantes contra o VSV, porm o papel desses animais no ciclo natural do vrus ainda no foi esclarecido. Uma endemia da infeco pelo VSV ocorre na ilha inabitada de Ossabaw, na costa da Gergia, USA. Nessa ilha no existem bovinos ou eqinos, mas uma grande populao de sunos silvestres, que possui anticorpos contra o VSV e que, ocasionalmente, apresenta leses vesiculares tpicas de VS. Estudos entomolgicos demonstraram que moscas-da-areia que habitam essa rea carreiam o mesmo VSNJV que infecta os sunos silvestres. Alm disso, a poca de soroconverso desses animais ao vrus geralmente coincide com os picos populacionais desses insetos.
Oeste dos EUA, com grandes epizootias a cada 10 anos. Destacam-se as de 1916, 1925, 1937, 1945, 1956, 1965, 1972, 1982, 1995 e 2004, algumas dessas se estendendo por at dois anos. Os surtos tpicos iniciam no Sudoeste dos EUA, nos estados do Texas, Arizona ou Novo Mxico na primavera (abril a maio), progredindo na direo norte, seguindo rios e vales, atingindo estados do Noroeste, como Utah, Colorado, Wyoming, Nebraska e Montana no vero (agosto) e desaparecendo com as primeiras geadas (outubro a novembro). Esse padro de ocorrncia, aliado presena do vrus em insetos hematfagos, como as moscas-pretas (Simulium sp) e pernilongos (Culicoides sp), sugere que as picadas de insetos so a principal forma de transmisso. No entanto, em 1982, um surto de grandes propores, no Oeste dos EUA, persistiu durante os meses de inverno at 1983. Esse surto foi associado com a movimentao de animais infectados para leiles, demonstrando a necessidade de estabelecimento de quarentenas em eventos futuros. A exemplo do restante das Amricas, a maioria dos surtos nos EUA tem sido associada com o VSNJV. No entanto, o VSIV ressurgiu, em 1997, aps 30 anos de aparente ausncia.
Epidemiologia molecular
Os surtos de VS em reas endmicas so estacionais e ocorrem virtualmente todos os anos. A anlise logentica dos vrus associados com esses eventos demonstrou que vrias linhagens virais causam surtos simultaneamente, em diferentes regies endmicas. Ao contrrio, as epizootias em reas no-endmicas so causadas geralmente por uma nica linhagem viral, com pouca ou nenhuma variao gentica ao longo do surto, e cada surto , geralmente, causado por uma linhagem diferente. Esses padres de ocorrncia sugerem que os surtos em reas noendmicas resultam da introduo de linhagens virais nicas a partir de reas endmicas, que se disseminam durante o surto e se tornam posteriormente extintas. O VSV muito varivel e a sua diversidade gentica pode ser observada entre os isolados de
Ocorrncia em reas no-endmicas

Em reas no-endmicas, surtos da doena ocorrem em ciclos de um a dois anos com intervalos de oito a dez anos. A ocorrncia no-endmica da VS mais bem caracterizada acontece no
Rhabdoviridae
699
campo em toda a sua distribuio geogrca. O gene mais conservado o da protena do nucleocapsdeo (N), enquanto o mais divergente o da fosfoprotena (P), com 40 e 70% de divergncia de nucleotdeos entre sorotipos, respectivamente. A evoluo do VSV na natureza parece ser relacionada com a sua localizao geogrca, pois diferentes grupos genticos do vrus esto associados com diferentes regies. Existem evidncias de que fatores ecolgicos presentes nesses locais inuenciam a evoluo do vrus. Em reas endmicas, algumas linhagens do VSV parecem ser mantidas por longos perodos de tempo em zonas ecolgicas especcas. Apesar da presena de altos ttulos de anticorpos neutralizantes nas populaes que vivem em reas endmicas, alteraes antignicas relevantes (antigenic drift) no tm sido relatadas para o VSV.

Em animais de criao, a maioria das infeces naturais pelo VSV parecem ser assintomticas, pois grande parte dos animais apresenta soroconverso sem manifestar sinais de doena. Estudos epidemiolgicos tm demonstrado que o estado siolgico (ex. gestao, lactao, idade) pode inuenciar o desenvolvimento de sinais clnicos. Nesse caso, os fatores do hospedeiro provavelmente determinariam as conseqncias clnicas da infeco. A transmisso pela picada de insetos parece resultar em doena mais grave quando comparada com a transmisso iatrognica. As glndulas salivares dos insetos contm substncias que regulam negativamente a resposta imune do hospedeiro, principalmente a resposta inata. Alm disso, extratos de glndulas salivares de insetos potencializam a multiplicao viral em cultivos celulares e em camundongos inoculados. A VS em bovinos, eqinos e sunos caracterizada por leses vesiculares na boca (lngua, lbios, gengivas), nos tetos e epitlio da banda coronria dos cascos, que surgem dois a quatro dias aps a inoculao do vrus. Os bovinos e eqinos raramente apresentam leses em mais de um local, enquanto os sunos freqentemente desenvolvem vesculas em vrios stios. Depres-
so, febre, laminite e salivao excessiva so freqentemente observadas antes da formao das vesculas. Em vacas leiteiras, a produo de leite pode reduzir signicativamente ou at mesmo cessar. Em gado de corte com leses graves na boca, a perda de peso pode atingir 140 quilos. A mastite uma conseqncia comum da infeco, devido reteno de leite (pela dor durante a ordenha) e por infeco bacteriana secundria. Na maioria dos casos, h remisso das leses dentro de sete a dez dias. Durante um surto ocorrido no estado do Colorado, EUA, em 1982, foram estudados 13 rebanhos leiteiros, nos quais foram afetados 378 de um total de 2.400 animais. As leses foram assim distribudas: somente leses orais (263 animais ou 69,3%); leses somente nos tetos (87 animais ou 23%); leses orais e nos tetos (22 animais ou 5,8%) e leses apenas nos cascos (7 animais; 1,9%). Em humanos, a infeco pelo VSV semelhante gripe, com um perodo de incubao de 24 a 48 horas. Na maioria dos casos, h letargia, mialgia, cefalia, fotofobia e sintomas de resfriado. A recuperao clnica ocorre dentro de uma a duas semanas. Em reas endmicas, uma parcela da populao rural pode apresentar anticorpos contra o vrus sem manifestar sinais clnicos compatveis com a doena. Alguns estudos tm identicado genes virais determinantes de virulncia in vitro e in vivo. Por exemplo, a protena M parece modular a resposta imune inata em clulas infectadas e tem sido associada com o aumento da virulncia de isolados em camundongos de laboratrio. Os sorotipos VSNJV e VSIV apresentam diferenas importantes de virulncia; o tipo Indiana produz doena mais grave e se dissemina com maior rapidez por contato entre sunos, e a gG parece ser um importante determinante da virulncia.
5.1.3 Imunidade
Trs principais componentes da resposta imune atuam na proteo contra o VSV: a imunidade no-especca ou inata (interferon e xido ntrico, por exemplo), a imunidade humoral (anticorpos) e a imunidade celular (linfcitos citotxicos). O interferon parece desempenhar um
700
Captulo 27
papel importante na sobrevivncia de camundongos inoculados com o VSV. Aliado ao fato de que a protena de matriz inibe a ao do interferon, esses dados sugerem que essa substncia represente um importante mecanismo de defesa contra a infeco viral. Anticorpos neutralizantes contra a glicoprotena do VSV so produzidos rapidamente e em altos ttulos aps a infeco natural ou experimental e, provavelmente, desempenhem um papel importante na proteo contra o VSV. O mecanismo exato da proteo conferida pelos anticorpos no est completamente elucidado, pois complexos de vrus e anticorpos mantm a capacidade de ligao clula-alvo, porm no so infecciosos. A maioria dos bovinos, eqinos e sunos de regies endmicas possui anticorpos neutralizantes anti-VSV. No entanto, parece que a presena de anticorpos neutralizantes no suciente para prevenir a doena clnica. A replicao viral, que ocorre predominantemente nos epitlios, poderia ser uma explicao para esse fato. Experimentos em bovinos e sunos tm demonstrado a proliferao de clulas mononucleares do sangue perifrico em resposta a antgenos do VSV. Essa resposta pode ser detectada trs semanas aps a inoculao em sunos ou ps-vacinao em bovinos; e pode durar at seis meses. No entanto, o papel da resposta imune celular na proteo contra o VSV questionvel, pois os animais de laboratrio, desprovidos de resposta citotxica direta ou indireta, mas capazes de montar resposta humoral, sobrevivem infeco.
PCR em tempo real. Amostras de epitlio e uido vesicular so as indicadas para o diagnstico. Alternativamente, quando as leses vesiculares esto ulceradas ou erosivas, pode-se coletar suabes. O meio de transporte deve conter pH neutro, enviando-se as amostras em gelo, evitando-se congel-las.

Em rebanhos ou reas de ocorrncia da VS, a interdio e quarentena devem ser estabelecidas para evitar a disseminao da infeco. Nos rebanhos atingidos, as medidas prolticas incluem o controle de insetos, limpeza e desinfeco dos recipientes de alimentos e gua, equipamentos de ordenha e utenslios que podem veicular o vrus entre os animais. Como a escaricao da pele parece ter inuncia na penetrao do vrus, pastagens altas e feno grosseiro devem ser evitados. Vrias vacinas inativadas, contendo os dois sorotipos (NJ e IN1), tm sido utilizadas na Amrica Central e do Sul. Apesar da eccia dessas vacinas no ter sido testada, as vacinas bivalentes, contendo adjuvante oleoso, aplicadas a cada seis meses, tm reduzido signicativamente a incidncia da doena. Outros imungenos, como vacinas de subunidade e vacinas com o vrus vaccinia como vetor da glicoprotena G, tm apresentado sucesso limitado em triagens laboratoriais, porm no tm sido testadas a campo.
5.2 Vrus da raiva e lissavrus relacionados

A raiva, palavra derivada do snscrito, que signica fazer violncia, uma das doenas mais documentadas na histria. A doena j era reconhecida h pelo menos 4.000 anos, e muitos dos primeiros registros relacionavam a infeco a mitos e crenas religiosas. Na obra Ilada, Homero referiu-se provavelmente raiva quando mencionou que Sirius, a estrela mais brilhante do co da constelao de Orion, exercia uma inuncia maligna sobre a sade das pessoas. Demcrito registrou pela primeira vez a raiva canina, cerca de 500 anos a.C. Aristteles mencionou a loucura dos ces, mas acreditava que a enfermidade no
5.1.4 Diagnstico
O diagnstico diferencial extremamente importante, principalmente para distinguir a VS da febre aftosa. Os mtodos de diagnstico utilizados incluem o isolamento viral, a deteco de antgenos por ELISA, a xao do complemento e a imunouorescncia (IFA). Alm desses, a deteco de anticorpos por soroneutralizao (SN) e determinao de IgM por ELISA so tambm utilizados. A deteco de IgM em nveis altos indica infeco recente. Outros mtodos de deteco viral incluem a RT-PCR (transcrio reversa e reao da polimerase em cadeia), alm do RT-
Rhabdoviridae
701
fosse transmitida ao homem. A infecciosidade da saliva de ces raivosos foi documentada pelo escritor romano Cardanus. Este e outros escritores romanos descreveram o material infeccioso presente na saliva como um veneno, cuja palavra correspondente em latim vrus; porm, o conceito contemporneo do termo vrus vai muito alm do sentido em que foi utilizado naqueles tempos. Somente no sculo 19 foi demonstrado que a raiva era uma doena contagiosa, quando Zinke (1804) provou que a saliva de um co infectado, colocada sobre uma ferida aberta de um co normal, era capaz de transmitir a doena. As descobertas de Louis Pasteur representaram um marco importante em vrios aspectos da microbiologia, especialmente para o estudo da raiva. Entre 1881 e 1885 ele desenvolveu o mtodo de passagens do vrus da raiva em coelhos, originando o que foi denominado vrus xo, ou seja, uma amostra que, quando inoculada, apresentava um perodo de incubao xo (7-8 dias) e causava morte dos coelhos ao 11-12 dia. Essa amostra foi a base para que Pasteur e seus colaboradores desenvolvessem a primeira vacina contra a raiva. Para tanto, buscando inativar o agente pelo calor brando, Pasteur mantinha medulas de coelhos dessecando em estufa a 37C. Aps 9 a 10 dias de incubao, a patogenicidade do agente era reduzida. Pasteur elaborou, ento, um esquema de vacinao, no qual o co a ser vacinado era inoculado com suspenses de tecido gradativamente menos dessecadas. A srie de injees iniciava com suspenses de medulas dessecadas por 910 dias e, assim, progressivamente com material dessecado por 8, 7, 6, 5, 4, 3 e 2 dias. Esse procedimento foi, em 1885, aplicado no menino Joseph Meister, que sobreviveu a uma agresso de um co raivoso (o menino apresentava mordidas em vrias partes do corpo, inclusive na cabea). Os procedimentos criados por Pasteur foram adotados por muitos anos e, apesar das inmeras modicaes ao longo dos anos, serviram de base para muitos processos de atenuao e vacinao ainda hoje amplamente utilizados. Em 1903, Adelchi Negri descreveu os corpsculos de incluso intracitoplasmticos caractersticos em neurnios, os quais eram quase sem-
pre detectados em animais infectados pelo vrus da raiva. Na verdade, o dr. Negri acreditava que as incluses fossem o agente causador da raiva, que ele imaginava tratar-se de um protozorio. Ele descreveu o achado de incluses redondas ou ovais, que denominou Negri body, ou corpsculos de Negri, com tamanho variando entre 0.25 a 27 m, encontradas freqentemente nas clulas piramidais dos cornos de Amon e nas clulas de Purkinje do cerebelo, podendo ser encontradas em clulas da medula e outros gnglios nervosos. As incluses podem ser visualizadas por coloraes de Mann, Giemsa ou pelo mtodo de Seller, onde aparecem com uma colorao carmim ou magenta, contendo em seu interior grnulos mais escuros, basoflicos. A identicao desses corpsculos foi, por muitos anos, at o advento da imunouorescncia, a principal ferramenta utilizada no diagnstico rpido da raiva. A partir dos anos 1960, a imunouorescncia direta tornou-se, em funo de sua grande sensibilidade e especicidade, o principal mtodo de diagnstico rpido de raiva, assim permanecendo at o presente.
5.2.1 O agente
O vrus da raiva (RabV) pertence a ordem Mononegavirales, a qual compreende todos os vrus que possuem genoma formado por uma nica molcula de RNA, de polaridade negativa (ICTVdB, 2007). Dentro dessa ordem, o RabV classicado na famlia Rhabdoviridae, no gnero Lyssavirus (ICTVdB, 2007), juntamente com outros vrus denominados vrus relacionados raiva, os quais apresentam semelhanas antignicas com o RabV. Posteriormente, pelo uso de mtodos de anlise logentica, o gnero Lyssavirus foi subdividido em seis gentipos distintos, sendo o RabV classicado como gentipo 1 e prottipo do gnero. Os demais lissavrus so classicados em outros seis gentipos distintos. Os gentipos 5 e 6, correspondentes aos lissavrus de morcegos europeus, foram subdivididos em subtipos. Alm desses, outros quatro novos gentipos foram propostos, representados pelos vrus Aravan, Khujand, Irkut e West Caucasian, todos isolados de morcegos. Os membros do gnero Lyssavirus esto listados na Tabela 27.2. Em
702
Captulo 27
Tabela 27.2. Membros do gnero Lyssavirus: classificao genotpica e distribuio geogrfica.
Gentipo
Gentipo 1 Gentipo 2 Gentipo 3 Gentipo 4 Gentipo 5 Gentipo 6 Gentipo 7
Nomenclatura
Vrus da raiva (RabV) Lagos bat Mokola Duvenhage
Lissavrus europeu de morcegos 1 (EBL) 1) Lissavrus europeu de morcegos 2 (EBL) 2) Lissavrus australiano de morcegos (ABL)
Distribuio geogrfica
Mundial frica frica frica Europa Europa Austrlia
Novos gentipos propostos
Arayan Khujand Irkut West Caucasian (Morcegos)
sia Central
relao patogenicidade e imunogenicidade, o gnero foi subdividido em dois logrupos: o logrupo I compreende todos os vrus que causam encefalites fatais semelhantes raiva em humanos; o logrupo II formado pelos vrus Mokola e Lagos bat, que so menos patognicos para humanos, embora o Mokola j tenha sido detectado em casos de encefalite. O RabV envelopado e, como tal, sensvel a detergentes e solventes lipdicos. Sua resistncia fora do hospedeiro baixa, e rapidamente inativado a temperaturas altas, sendo destrudo a 50C durante 15 minutos. sensvel ao dessecamento, luz solar, radiao ultravioleta, hipoclorito de sdio, soda custica a 2%, solventes de gorduras (ter, clorofrmio) e formalina. O vrus se mantm estvel por longos perodos a 4C, porm se conservado a -20C em tecidos mergulhados em glicerina tamponada (pH 7,2-7,6), o vrus se mantm por vrios anos. A -70C ou temperaturas mais baixas, o vrus se mantm vivel indenidamente. A multiplicao do RabV em cultivos celulares representou um grande avano nas pesquisas e no desenvolvimento de vacinas. Uma grande variedade de cultivos de clulas neurais e noneurais, incluindo pelo menos duas dezenas de cultivos primrios e outras tantas linhagens hete-
roplides, so utilizadas. As clulas de linhagem de rim de hamster BHK-21 (de baby hamster kidney) so freqentemente utilizadas para o cultivo do RabV com diversas nalidades, sendo usadas inclusive para a produo de vacinas para animais. As clulas de rim de macaco-verde africano (VERO) e as linhas de clulas diplides humanas WI-38 e MRC-5 so usadas para produo de vacinas para uso humano. As clulas de linhagem derivadas de neuroblastomas tm sido freqentemente utilizadas para diagnstico e isolamento de amostras de campo. Uma linhagem de glioma de rato, denominada C6, tem sido utilizada por pesquisadores brasileiros. O RabV no causa efeito citoptico quando cultivado em clulas in vitro, o que torna necessrio algum tipo de teste complementar para o acompanhamento da evoluo da infeco nas clulas. Isso geralmente feito por testes que dependem de anticorpos ligados a substncias uorescentes ou a enzimas, como a peroxidase.
5.2.2 Estrutura do vrion

Os vrions apresentam a forma caracterstica da famlia, que lembra um projtil de revlver, com cerca de 75 nm de dimetro e comprimento entre 100 e 300 nm. A partcula apresenta-se
Rhabdoviridae
703
como um denso cilindro formado pelo genoma disposto em formato de mola e envolto em uma protena denominada nucleoprotena (N). Este conjunto forma, junto com molculas de outras trs protenas estruturais (P, M e L), o nucleocapsdeo, que apresenta simetria helicoidal. O nucleocapsdeo, por sua vez, envolto em um envelope, que deriva das membranas celulares. Nesse envelope, esto inseridos trmeros de molculas da glicoprotena G, que atravessa o envelope e projeta suas espculas para a parte externa do vrion. O genoma viral uma cadeia de RNA de ta simples, com um tamanho aproximado de 12 kb e com uma massa molecular de 4,6 x 106 kDa. O genoma codica cinco protenas, na seguinte ordem: a nucleoprotena (N), a fosfoprotena (P, previamente denominada M1), a protena da matriz (M, previamente denominada M2), a glicoprotena (G) e a RNA polimerase dependente de RNA (L). O gene conta ainda com duas regies intergnicas no-codicantes, situadas entre os genes que codicam M e G e entre os genes que codicam G e L. Esta ltima foi previamente chama da pseudogene, mas trata-se de uma regio no-codicante, indicativa de relaes evolutivas com outros vrus de genoma de RNA no-segmentado de polaridade negativa, como os membros da famlia Paramyxoviridae. A glicoprotena G (525 aminocidos, 65-70 kDa) responsvel pela adsoro do vrus clula hospedeira e pela fuso do envelope viral membrana citoplasmtica, alm de participar do processo de brotamento de novos vrions. Alm disso, a gG a maior responsvel pela induo de anticorpos neutralizantes, principalmente por sua poro externa do envelope, denominada domnio antignico ou ectodomnio. A gG tambm capaz de estimular, em conjunto com as protenas N e P, clulas T auxiliares e citotxicas, gerando uma resposta imune celular. Alguns stios de G so relacionados com a patogenicidade de amostras de vrus. A protena N (450 aminocidos, 58-62 kDa) tambm capaz de induzir anticorpos neutralizantes, apresentando ainda eptopos importantes para o reconhecimento de linfcitos T. A protena N a mais conservada dentre as protenas dos lissavrus, est intimamente associada ao RNA viral, protegendo-o da
ao de ribonucleases. A N desempenha outras atividades importantes: fundamental na regulao da transcrio do RNA viral, participando ativamente na encapsidao de novas molculas de RNA genmico sintetizadas e no transporte axoplsmico intraneuronal. A protena L (2128 aminocidos, 190 KDa), uma subunidade da RNA polimerase viral, que complementada com P e N para formar o complexo que transcreve o genoma. Alm dessa atividade, a L detm ainda vrias outras atividades enzimticas, como a formao do cap, metilao, poliadenilao e atividade de protena quinase, alm de estar envolvida na inicializao da cadeia de RNA. A protena L ativada pela interao com P (298 aminocidos, 35-40 KDa). Esta, por sua vez, a menos conservada entre os lissavrus. A protena P liga-se dinena intracitoplasmtica e est envolvida no transporte axonal do vrus. A protena M (203 aminocidos, 22-25 KDa), por sua vez, preenche o espao entre o ribonucleocapsdeo e o envelope, e promove a montagem das partculas, aproximando membranas, RNP e G, exercendo um papel ativo no brotamento dos novos vrions.
5.2.3 Replicao viral

A adsoro do vrus clula hospedeira mediada pelos trmeros da gG, que interagem com os receptores celulares e promovem a fuso e internalizao dos vrions. No descrito um receptor especco para o RabV e, possivelmente, diferentes receptores so utilizados em diferentes clulas para ocorrer a penetrao do vrus. Alguns estudos evidenciaram a adsoro aos receptores de acetilcolina; outros observaram que oligossacardeos e lipoprotenas, como o cido silico de gangliosdeos, podem tambm ter participao na adsoro. As molculas de adeso neurais (neural cell adhesion molecules ou NCAM), assim como a protena denominada receptor de neurotronas p75 (p75NTR) foram tambm apontadas como possveis receptores para o RabV. Aps a adsoro clula hospedeira, o vrion penetra na clula por fagocitose, sendo englobado por uma vescula formada pela membrana celular. Essas vesculas so ricas em uma protena denominada clatrina. Eventualmente, a vescula contendo o vrion
704
Captulo 27
funde-se com lisossomos, liberando a RNP no citoplasma celular e permitindo que seja iniciado o processo de transcrio e replicao viral. Uma vez no interior da clula, o genoma de polaridade negativa inicialmente transcrito e ocorre a produo de protenas. Para tanto, a RNA polimerase viral transcreve o genoma em um RNA lder e cinco mRNAs, todos os cinco com cap e poli-adenilados, tal como os mRNA celulares. A transcrio diminui sua ecincia em cerca de 30% nas junes dos genes N-NS, NSM e M-G, resultando em um efeito cumulativo na expresso gnica, ou seja, a expresso mais eciente na extremidade 3 do genoma. Como descrito anteriormente, esse processo denominado atenuao da transcrio. Os mensageiros so traduzidos nas protenas N, P, M, G e L em ribossomos livres no citoplasma. A protena G, que requer glicosilao, recebe carboidratos no retculo endoplasmtico rugoso e transportada via complexo de Golgi para a membrana citoplsmtiica. A replicao do genoma viral ocorre somente aps a traduo dos mRNAs. A proporo entre a quantidade de RNA e da protena N no interior do citoplasma regula o processo de troca do processo de transcrio para replicao. O primeiro passo na replicao a sntese de cpias de polaridade positiva (ou antigenmica) de todo o genoma viral. Para que estas sejam geradas, os sinais de transcrio representados por cdons de parada e continuao de leitura so ignorados; a RNA polimerase reconhece a extremidade 3 e sintetiza uma cpia complementar com a extenso do genoma. Essas cpias positivas serviro de molde para a sntese de novos genomas (de polaridade negativa) que iro fazer parte dos novos vrions. Durante a montagem, um complexo formado pelas protenas N, P e L promove a encapsidao dos novos genomas. A protena M envolve a RNP; esse complexo vai para uma rea da membrana citoplasmtica (ou vesculas membranosas internas) e M inicia o enovelamento da partcula, conferindo-lhe o formato de mola, que caracteriza a disposio helicoidal da RNP. A seguir, as partculas ligam-se membrana celular em regies onde foram inseridos trmeros da gG, originando o envelope viral. Esse processo no
produz lise das clulas infectadas; em cultivos in vitro, as clulas infectadas podem permanecer por longos perodos viveis e liberando novos vrions por brotamento.
5.2.4 Variaes antignicas

O RabV tem sido considerado como um vrus bastante estvel. Algumas das amostras de vrus vacinais ainda hoje utilizadas so derivadas do vrus isolado por Pasteur no nal do sculo XIX. Uma amostra do RabV de Pasteur foi submetida a 3.080 passagens em coelhos at 1953, e foram evidenciadas poucas alteraes em sua patogenicidade. No obstante, essa estabilidade no absoluta. Os mtodos ento disponveis baseados essencialmente na inoculao de animais de experimentao eram muito pouco sensveis para a deteco de variaes mais sutis. Apesar disso, j na dcada de 1950, os estudos de Fuenzalida e Palcios (1955) apontavam para diferenas antignicas signicativas entre amostras do RabV. Nos anos 1980, com a aplicao de anticorpos monoclonais (AcMs) para o estudo do RabV, as variaes antignicas tornaram-se mais evidentes. Esses estudos revelaram que amostras de vrus originrias de diferentes espcies hospedeiras naturais apresentavam variantes com caractersticas antignicas particulares, sugerindo a ocorrncia de adaptaes de amostras do vrus a um determinado hospedeiro. Essas variantes so bastante estveis, pois a passagem de amostras em um hospedeiro terminal no modica suas caractersticas antignicas (por exemplo, amostras de RabV isoladas de bovino geralmente apresentam perl de amostras isoladas em morcegos hematfagos). A caracterizao antignica de amostras do RabV realizada por testes de imunouorescncia indireta, nos quais a reatividade dessas amostras (multiplicadas em camundongos ou cultivos celulares) determinada frente a painis de AcMs contra antgenos da protena N. No Brasil, dois painis de AcMs tm sido utilizados. Um deles constitudo por oito AcMs preparados contra diversas amostras de RabV, fornecido pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, USA, e preestabelecido pela OPAS para o estu-
Rhabdoviridae
705
do de amostras isoladas nas Amricas. Com esse painel, foram identicadas, no Brasil, as variantes 2 (principalmente em ces, com perl tpico de amostras de raiva urbana), 3 (identicada em morcegos Desmodus rotundus), 4 (de morcegos insetvoros Tadarida brasiliensis), 5 (de morcegos hematfagos da Venezuela, isolada de uma raposa ou cachorro-do-mato Cerdocyon thous no Brasil) e 6 (isolada de um morcego insetvoro Lasiurus cinereus), alm de algumas amostras com pers atpicos que no puderam ser enquadradas nessa classicao. O outro painel composto por 14 AcMs anti-N preparados contra antgenos de diferentes lissavrus (Labos bat, Mokola, Duvenhage e Danish bat), por King (1991), no Central Veterinary Laboratory (hoje denominado Central Veterinary Agency), Weybridge, Gr-Bretanha. O mesmo foi ampliado pela incluso de outros dois AcMs preparados no Brasil contra antgenos da amostra CVS de RabV. Quatro AcMs desse painel permitiram a diferenciao entre variantes de morcegos hematfagos, morcegos no-hematfagos, ces, e um outro grupo incluindo uma amostra de co, um isolado de um caso humano e uma amostra padro do RabV, denominada PV. Estudos sobre variantes antignicas tm sido complementados por anlises genmicas, possibilitando a identicao de variantes genotpicas do RabV. Esses estudos tm conduzido a uma profunda reavaliao do conhecimento a respeito da epidemiologia da infeco e da distribuio do vrus na natureza.
de outras espcies. Os hospedeiros naturais so os principais vetores da infeco, sendo capazes de transmitir o vrus entre indivduos da mesma espcie e tambm a outras espcies envolvidas. Essas, quando eventualmente infectadas, geralmente so hospedeiros nais ou terminais da infeco, pois o ciclo terminado por ocasio da morte do hospedeiro, usualmente sem haver chance para nova transmisso.
Ciclos da raiva
Na natureza, o RabV mantido por ciclos ocasionalmente inter-relacionados, denominados ciclos urbano e silvestre, areo e rural. Ciclo urbano refere-se raiva em ces e gatos domsticos; ciclo areo refere-se raiva em morcegos, sendo os demais ciclos denominados ciclos terrestres. Ciclo rural refere-se raiva dos herbvoros, que envolve principalmente os bovinos e eqinos, e na qual o principal vetor o morcego hematfago. O termo silvestre refere-se raiva associada a espcies silvestres, e pode englobar o ciclo areo. O ciclo urbano tem sido controlado por meio de vacinao de animais de companhia de vrias regies do Brasil. Porm os ciclos silvestre e rural ocorrem em diversas regies. No ciclo silvestre, o vrus pode utilizar diferentes espcies como reservatrio, que podem variar em funo da fauna da regio geogrca considerada. Assim, na Europa, o principal reservatrio natural do vrus em seu ciclo silvestre a raposa-vermelha (Vulpes vulpes); na Amrica do Norte, so as raposas-vermelhas, os gambs (Mephitis mephitis) e guaxinins (Procyon lotor), que so tambm hospedeiros naturais do vrus. Na Amrica Latina, os morcegos hematfagos Desmodus rotundus so os principais hospedeiros silvestres do vrus (Tabela 27.3). Em funo de seus hbitos alimentares, os morcegos hematfagos so os principais transmissores da infeco a bovinos. No obstante, na indisponibilidade de bovinos para sua alimentao, os morcegos D. rotundus podem atacar outras espcies na busca de alimento, inclusive humanos. Em um episdio, morcegos hematfagos foram responsveis por uma epidemia de raiva humana, entre pessoas com o costume de dormir ao ar livre em redes, tornando-se presas
5.2.5 Epidemiologia
O RabV est presente em todos os continentes, com exceo da Austrlia e Antrtica. Alguns pases (Inglaterra, Irlanda, Japo e pases escandinavos) obtiveram sucesso na erradicao da doena. J os lissavrus de outros gentipos, apresentam distribuio geogrca bem mais limitada (Tabela 27.2). At o presente, nas Amricas, todas as amostras do gnero Lyssavirus isoladas pertencem ao gentipo 1, que compreende a totalidade das amostras clssicas do vrus. O hospedeiro natural ou reservatrio natural a espcie na qual o vrus capaz de se perpetuar sem a necessidade da sua reintroduo a partir
706
Captulo 27
Tabela 27.3. Principais reservatrios da raiva silvestre e distribuio geogrfica. Regio

Europa Estados Unidos
Reservatrios
Raposa vermelha (Vulpes vulpes) Coiote (Canis latrans), texugo (Meles meles), guaxinim (Procyon lotor.), gamb (Mephitis mephitis) Morcego hematfago (Desmodus rotundus), raposa (Dusicyon vetulus), jaritatacas (Conepatus sp.), guaxinins (Procyon cancrivorous), sagis (Calithrix sp.), diversas espcies de morcegos no-hematfagos e candeos selvagens
Amrica Latina
fceis para morcegos hematfagos. As duas outras espcies de morcegos hematfagos conhecidas, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi, alimentam-se geralmente de sangue de aves, embora D. ecaudata j tenha sido observado alimentando-se de sangue humano. Ambas as espcies podem ser contaminadas pelo RabV, mas a sua participao na manuteno da infeco no ciclo silvestre da raiva no signicativa. A epidemiologia da raiva vem sendo examinada, e animais soropositivos de vrias espcies, sem a presena de sinais clnicos, tm sido identicados. Esses estudos tm includo mangostas, morcegos hematfagos e insetvoros, guaxinins, gambs, raposas, hienas, chacais e ces selvagens e domsticos na Etipia. Slvio Torres e Queiroz de Lima (1936) e Pawan (1936) j haviam registrado a possibilidade de morcegos hematfagos tornarem-se portadores da infeco; porm, em funo dos mtodos disponveis poca, as evidncias apresentadas deixaram margem a dvidas. No obstante, mais recentemente, na Etipia, isolou-se repetidamente vrus infeccioso de ces assintomticos, assim como na Nigria, adicionando ainda mais evidncias possibilidade de ocorrncia de infeces no-fatais. O RNA viral foi detectado em hienas na frica, sugerindo a ocorrncia de amostras de baixa patogenicidade nesta espcie. Assim, apesar de ainda no estar completamente esclarecida a interao do vrus com seus hospedeiros, em algumas espcies animais, o vrus capaz de perpetuar-se, seja por causar infeces no-fatais, seja por manter-se no hospedeiro tempo sucien-
te para permitir que o animal infectado transmita a infeco a outros hospedeiros em sua comunidade, antes de sua morte. A maioria das infeces pelo vrus da raiva ocorre por transmisso percutnea, atravs da mordedura de animais infectados. A transmisso por via area pode ocorrer raramente, mas no tem signicncia epidemiolgica para o ciclo da infeco. O contato com ferimentos abertos e membranas mucosas pode, ocasionalmente, levar transmisso do vrus, assim como procedimentos mdicos, como transplantes de crneas e outros rgos (transmisso iatrognica). Foram relatados casos de raiva humana na Europa e EUA, onde a infeco ocorreu pelo transplante de rgos slidos (rins, pulmes, fgado e pncreas) provenientes de doadores com encefalite de origem desconhecida. Esse fato salienta a importncia da incluso de testes especcos para o diagnstico de raiva em potenciais doadores de rgos, particularmente se apresentaram sinais de comprometimento neurolgico.
5.2.5.1 Situao da raiva no Brasil Raiva urbana

A raiva, no Brasil, apresenta-se em nveis distintos nas diferentes regies do pas. Na regio Sul, a raiva urbana tem sido controlada. Os ltimos casos em humanos nos estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina ocorreram em 1981. No Paran, o ltimo caso humano foi registrado em 1987. Porm, casos de raiva urbana associados com outras fontes de transmisso tm ocorrido na regio Sul ocasionalmente. Em 2001, no Rio Grande do Sul, um felino foi infectado por uma variante de origem de morcegos no-hematfagos. Em 2007, um caso de raiva foi relatado em um co infectado com uma variante freqentemente detectada em morcegos insetvoros. No obstante, apesar desses episdios isolados de contaminao com amostras originrias de outros hospedeiros naturais, as variantes do RabV que tem como hospedeiro natural o co, no tm sido detectadas em populaes caninas na regio Sul.
Rhabdoviridae
707
As demais regies do pas ainda apresentam casos de raiva urbana, porm o nmero est em declnio. Ocorreu um decrscimo nos casos noticados de raiva entre caninos e felinos no Brasil entre 1997-2006 (Tabela 27.4). At 2003, os ces eram os principais vetores da raiva para humanos, porm, a partir deste ano, os casos em humanos causados por ces foram suplantados pelas infeces transmitidas por morcegos (Tabela 27.5). Observa-se no perodo uma signicativa reduo dos casos de raiva urbana provocados por ces e gatos. At 2003, os ces foram responsveis pela transmisso de 119 (84%) de 141 casos humanos.
Em 2004 e 2005, os casos noticados de raiva humana transmitida por morcegos hematfagos apresentaram um incremento importante em decorrncia de surtos ocorridos na regio Amaznica, e esses morcegos tornaram-se os principais transmissores da infeco a humanos. Como conseqncia, em 2005, observou-se o maior nmero de casos de raiva humana registrados no decnio. Dos 80 casos noticados no trinio 2004-2006, morcegos hematfagos foram implicados em 66 (82,5%) ao passo que ces estiveram envolvidos somente em 12 episdios (15%).
Tabela 27.4. Casos notificados de raiva em animais no Brasil no decnio 1997-2006 (no computados os registros de raiva bovina) 1997
Caninos Gatos Morcegos hematfagos Morcegos no-hemat. Morcegos no-ident. Animais Silvestres 945 65 0 0 0 36
1998
1746 165 0 0 0 36
1999
970 93 4 0 6 37
2000
761 69 8 20 2 61
2001
657 27 72 27 2 144
2002
617 67 12 2 55 89
2003
289 21 11 8 94 155
2004
104 10 19 30 38 124
2005
93 10 60 136 0 251
2006
97 7 50 25 0 208
Tabela 27.5. Casos de raiva em humanos e espcie de animal transmissor no Brasil (1997-2006)
Espcie transmissora Bovino Co Gato Morcegos hematfagos Morcegos nohematfagos
1997
17 3 -
1998
19 2 4 3
1999
21 2 -
2000
24 1 1
2001
18 1 2
2002
6 3 -
2003
14 3 -
2004
1 5 1 22 -
2005
1 42 1
2006
1 6 2 -
TOTAL
2 131 8 72 6 1 7
Morcegos espcie indeterminada Guaxinim (Procyon sp.) Macaco 1 -
708
Captulo 27
Raiva em morcegos e animais silvestres terrestres

A noticao dos casos de raiva em morcegos aumentou signicativamente nos ltimos anos, no perodo de 1997-2006 (Tabelas 27.4 e 27.5). Aumentaram ainda os registros de casos em animais silvestres terrestres nesse perodo. Particularmente preocupantes so os registros de casos em morcegos no-hematfagos, pois sua adaptao ao ambiente urbano pode dar margem a infeces humanas. Apesar disso, at o presente ainda no foi registrado no Brasil nenhum caso de raiva humana transmitida por morcegos nohematfagos (Tabela 27.5).
ovinos e caprinos representam uma parcela signicativa dos casos de raiva em herbvoros.

O perodo de incubao da raiva muito varivel aps infeces naturais. Muitos fatores podem estar associados a um perodo de incubao mais ou menos prolongado, tais como a amostra de vrus envolvida, o local da mordedura (quanto mais prximo do sistema nervoso central, mais rpido o transporte do vrus), a carga viral inoculada, a suscetibilidade da espcie exposta e imunidade do animal agredido. Geralmente, o perodo de incubao de 14 dias a 12 semanas, porm perodos superiores a um ano j foram relatados. No hospedeiro infectado, o vrus pode replicar nas clulas musculares, prximas ao local da inoculao, antes de invadir o sistema nervoso central (SNC). Esta multiplicao importante para a posterior invaso do SNC, porm, ocasionalmente, pode ocorrer o transporte direto do vrus sem a replicao prvia no local de entrada. O vrus pode utilizar uma combinao de sistemas para atingir o SNC, envolvendo o uxo axoplsmico retrgrado (provavelmente utilizando o sistema motor celular envolvendo a dinena, passagem clula-clula via junes sinpticas e passagem direta do vrus atravs de conexes intercelulares). No SNC, o vrus replica e se dissemina via nervos perifricos, de forma centrfuga, para os tecidos no-neurais do organismo. An-
Raiva dos herbvoros

Alm dos problemas causados sade pblica, a raiva traz srios prejuzos econmicos pecuria nacional, e tem sido responsvel, nos ltimos dez anos, por mais de 23.000 casos noticados em herbvoros. Salienta-se que a subnoticao de casos de raiva em herbvoros uma realidade, de forma que praticamente impossvel determinar o nmero preciso de perdas associadas doena. Os casos noticados de raiva dos herbvoros no Brasil no decnio 1997-2006, reportados aos rgos ociais, so apresentados na Tabela 27.6. Na regio Sudeste, ocorreu um aumento nos casos de raiva noticados em herbvoros, provavelmente em funo de uma maior eccia na noticao. Na regio Nordeste, os casos em
Tabela 27.6. Casos de raiva dos herbvoros notificados no Brasil, por regio, no decnio 1997-2006. Regies
Norte Nordeste Sul Sudeste Nordeste Centro-Oeste
1997
68 406 48 2335 406 94
1998
74 269 81 2360 269 240
1999
61 374 52 2666 374 254
2000
2676 302 77 2835 302 409
2001
235 198 60 1324 198 697
2002
346 226 193 1201 226 824
2003
662 226 140 863 226 761
2004
185 257 147 512 257 725
2005
138 309 158 500 309 806
2006
nd* nd nd nd nd nd
TOTAL
4445 2567 956 14596 2567 4810
TOTAL
2951
3024
3407
6299
2514
2790
2652
1826
1911
961**
27374
nd* : no disponvel, ** total de casos registrados em 2006 (SIEPI, 2007).
Rhabdoviridae
709
tgenos podem ser detectados em praticamente todos os tecidos de animais infectados. O vrus replica nas glndulas salivares, e a excreo pela saliva o principal mecanismo de disseminao e perpetuao do mesmo na natureza, permitindo a inoculao pela barreira cutnea e a introduo do RabV nos tecidos do novo hospedeiro aps a mordedura. A apresentao clnica da raiva pode ser muito varivel, pois os sinais de comprometimento neurolgico podem se apresentar de forma distinta. As apresentaes clssicas da doena so as formas furiosa e/ou paraltica. A forma furiosa mais freqente em caninos, que apresentam alteraes de comportamento como inquietao (hiperexcitabilidade, agressividade), fotofobia, salivao, insnia e ocasionalmente febre. Na forma paraltica, o animal apresenta diculdade de deglutio, pela paralisia muscular; podendo haver alterao do tom de voz do animal. Com o progresso da doena, os membros posteriores tambm podem car paralisados. Ocorre a evoluo do quadro em quatro a cinco dias, com desfecho fatal. A paralisia do maxilar inferior promove a impossibilidade de deglutio, e a salivao tpica da forma paraltica da doena. Pode-se observar ainda um aumento do limiar de sensibilidade a tranqilizantes e sedativos e, se anestesiados, os ces podem apresentar alucinaes e convulses no perodo ps-anestsico. A morte sbita do animal tambm relatada, sem que ocorra a manifestao de qualquer sinal clnico. Em bovinos, a forma paraltica a apresentao mais comum. A paralisia aguda, progressiva, cida, manifestada inicialmente nos membros posteriores, o sinal mais aparente. Podem ocorrer ainda sinais indicativos de comprometimento dos nervos lombares e sacrais, como constipao, tenesmo, paramose em machos e gotejamento de urina. Em eqinos, relatada a leso no local de inoculao do vrus; hiperexcitabilidade e paralisia da faringe, esfago e dos membros posteriores. Durante vrios anos, acreditou-se que a infeco com o RabV em morcegos era freqentemente subclnica. Entretanto, na dcada de 1980, foi evidenciado que os morcegos, assim como outros mamferos, desenvolvem sinais clnicos tpicos da raiva, com perodo de incubao va-
rivel, apresentando como desfecho a morte. A constatao de morcegos soropositivos sem sinais clnicos aparentes sugere que deve haver outros tipos de interao vrus-hospedeiro que no conduzam invariavelmente a morte. Entretanto, a ocorrncia de portadores ou infeces subclnicas em quirpteros , ainda, questo de debate. O perodo de incubao da raiva em morcegos extremamente mutvel, variando de semanas a perodos maiores que um ano. Os principais sinais da doena em morcegos hematfagos so: atividade alimentar diurna, hiperexcitabilidade e agressividade, incoordenao motora, tremores musculares, paralisia e morte. Nos morcegos no-hematfagos, ocorre geralmente paralisia sem agressividade e excitabilidade, e os espcimes so encontrados em locais no-habituais. Nestas espcies, em infeces experimentais, o perodo de incubao pode variar entre duas a 25 semanas. O exame histopatolgico do encfalo de animais que morrem devido infeco pelo RabV revela meningite e encefalomielite no-supurativa. Podem ainda ser detectados os corpsculos de Negri, considerados patognomnicos da infeco. As alteraes patolgicas so mais facilmente observadas quando os tecidos so colhidos aps a morte do animal em conseqncia da infeco. Se o animal for sacricado em estgios precoces da enfermidade, as leses e os corpsculos de Negri podem no ser evidentes. As seces do encfalo mais indicadas para o exame histopatolgico incluem os cornos de Amon, crtex cerebral, tronco cerebral, cerebelo e medula espinhal.
5.2.7 Diagnstico
O diagnstico da raiva no deve ser baseado apenas em observaes clnicas, especialmente porque outras enfermidades podem originar sinais semelhantes. Paralelamente ao exame clnico, fundamental a anlise da situao epidemiolgica, a histria da infeco na regio, a presena de possveis vetores contaminados e a possibilidade da introduo de animais oriundos de reas endmicas. A associao desses dados permitir um diagnstico presuntivo, que deve ser conrmado por testes laboratoriais.
710
Captulo 27
Diagnstico virolgico
O tecido de eleio para o diagnstico de raiva o encfalo dos animais suspeitos. Em eqinos, alm do encfalo, recomenda-se enviar ao laboratrio fragmentos de medula. As regies do encfalo, preferencialmente submetidas para diagnstico, incluem pores do cerebelo, crtex e circunvolues do hipocampo (ou cornos de Amon). Animais pequenos (p. ex.: morcegos, gambs, sagis) devem ser remetidos inteiros ao laboratrio. A cabea do animal suspeito tambm pode ser remetida ao laboratrio. As amostras devero ser remetidas sob refrigerao. Em locais em que no h condies de manter o espcime refrigerado, recomenda-se a imerso de fragmentos de tecido em Lquido de Valle (glicerina 50% tamponada com tampo fosfato: KH2PO4 1,80 g; K2H2PO4 2,30 g; glicerina neutra, 50%; H2O q.s.p. 1000 mL; pH 7,4-7,8). Nesse lquido, o vrus pode ser detectado se mantido por alguns dias. O diagnstico de raiva na primeira metade do sculo 20 baseou-se fundamentalmente na pesquisa das incluses ou corpsculos de Negri no encfalo de animais infectados. Essa prova apresenta sensibilidade e especicidade baixas, pois as incluses so detectadas em mdia em 60 a 70% (amplitude de 40 a 90%) dos casos positivos. A variao na sensibilidade para a deteco de incluses tambm ocorre em relao espcie, como para os eqinos, em que a eccia da deteco de corpsculos de Negri menor. Em 1958, a tcnica de imunouorescncia direta (IFD) foi adaptada para a deteco de antgenos do RabV. A IFD realizada em impresses de tecido fresco sobre lminas de microscopia e permite a obteno do resultado em poucas horas. A IFD chega a atingir sensibilidade e especicidade prximas a 100% em relao inoculao em camundongos. Essas qualidades, aliadas rapidez na obteno dos resultados, tornaram a IFD a tcnica de eleio para o diagnstico rpido de raiva. Para assegurar sua preciso, a IFD acompanhada por um teste de conrmao biolgica, no qual o material suspeito inoculado por via intracerebral em camundongos lactentes. Os camundongos inoculados desenvolvem sinais neurolgicos e morrem entre 8 e 23 dias aps a
inoculao. A conrmao da causa mortis feita atravs de nova IFD no tecido enceflico dos camundongos inoculados. Para reduzir a utilizao de animais, h uma tendncia para a substituio da inoculao de camundongos pela inoculao em cultivos celulares. Diversas linhagens celulares so suscetveis ao RabV, sendo as clulas de origem de rim de hamster (baby hamster kidney, BHK) e clulas de linhagens de neuroblastoma (NA ou N2A) as mais utilizadas para ns de diagnstico. Mtodos moleculares vm conquistando espao no diagnstico e caracterizao do RabV. A maioria deles baseia-se na transcrio reversa de determinado segmento do genoma viral, seguida de amplicao pela reao da polimerase em cadeia (RT-PCR). Os amplicons podem ter sua especicidade conrmada com a aplicao de sondas. Os fragmentos de DNA assim gerados (amplicons) podem ser clivados com enzimas de restrio, clonados ou, ainda, seqenciados para estudos mais detalhados, como a caracterizao genmica das amostras isoladas.
Diagnstico sorolgico
O diagnstico sorolgico, ou seja, baseado na identicao de anticorpos especcos antiRabV, pode ser utilizado com vrios objetivos. Freqentemente tem sido empregado para avaliar a capacidade imunognica de vacinas anti-rbicas, bem como para avaliar o status sorolgico de populaes submetidas vacinao. A elevao dos ttulos de anticorpos no lquido cefalorraquidiano considerada diagnstica em casos suspeitos e muito utilizada para o diagnstico intra vitam em humanos. Testes sorolgicos igualmente tm sido utilizados para buscar evidncias de circulao do vrus em populaes no-vacinadas. Assim, entre muitas aplicaes, os testes sorolgicos tm tambm contribudo para que muitos dos conceitos sobre a epidemiologia da raiva sejam reavaliados. A tcnica de eleio para a deteco de anticorpos contra o RabV a soro-neutralizao (SN). Nessa prova, uma quantidade determinada de vrus homogeneizada com diluies do soro a ser testado. Se este possuir anticorpos espec-
Rhabdoviridae
711
cos, o vrus ser neutralizado. Para evidenciar a multiplicao viral, camundongos ou cultivos celulares so inoculados com as misturas vrus/ diluies de soro. A SN utilizada tambm para vericar os ttulos de anticorpos neutralizantes em humanos submetidos vacinao pr-exposio. Por comparao com um soro de referncia, possvel determinar quantas unidades internacionais (UI) de anticorpos neutralizantes uma determinada amostra de soro apresenta. Outra prova sorolgica similar bastante utilizada o teste rpido de inibio de focos uorescentes (RFFIT, de rapid uorescent focus inhibition test). Nessa prova, a neutralizao do vrus pelo soro revelada pelo bloqueio da reao de um conjugado uorescente (igual ao utilizado na prova de IFD descrita acima). Ensaios imunoenzimticos do tipo ELISA tambm tem sido empregados na deteco de anticorpos contra o RabV. Entretanto, esses testes freqentemente apresentam problemas de especicidade. Alm dos mencionados acima, uma grande variedade de testes sorolgicos foi ou vem sendo avaliada para a deteco de anticorpos contra o RabV, incluindo a contra-imunoeletroforese, a inibio da imunoperoxidase e a citometria de uxo. Entretanto, at o presente, nenhum deles foi capaz de suplantar em eccia a SN, que permanece como teste sorolgico de eleio.

A preveno da raiva baseia-se na vacinao de hospedeiros e no controle de reservatrios. As principais medidas de controle do ciclo urbano da raiva so a vacinao de caninos e felinos e a captura e eliminao de ces errantes. O nmero de casos de raiva canina no pas tem diminudo signicativamente, o que aumenta a importncia das aes de vigilncia epidemiolgica, a m de prevenir a reintroduo da doena, pois estes animais constituem uma das principais fontes de vrus para humanos. Caso sejam identicados novos focos, o controle desses tem sido baseado na vacinao em massa, focal e perifocal, com vacinas inativadas. Em municpios onde a raiva est controlada, o servio de vigilncia deve ser mantido, o que inclui o exame anual de casos sus-
peitos de raiva canina em um nmero equivalente a 0,2% da populao canina total do municpio, permitindo, assim, uma avaliao da manuteno do status de rea indene. A raiva dos herbvoros controlada pela vacinao de animais em reas endmicas e pelo controle das populaes de morcegos hematfagos. Para a vacinao, utiliza-se vacinas inativadas, que representam atualmente 95% das vacinas para bovinos comercializadas no Brasil (estimativa de mais de 100 milhes de doses/ano). Para o controle das populaes de morcegos hematfagos, so geralmente empregados mtodos baseados na aplicao tpica de uma pasta contendo uma substncia anticoagulante, em morcegos capturados e, posteriormente, liberados para retornar a sua colnia. Como morcegos tm o hbito de higienizao pela lambedura mtua, o anticoagulante aplicado pode levar eliminao de vrios indivduos da mesma colnia. Outros mtodos incluem a aplicao de pastas com anticoagulante em bovinos, em feridas de mordeduras de morcegos, por via intramuscular ou intraruminal, porm no so rotineiramente utilizados. O controle da raiva em quirpteros em regies sinantrpicas tem se tornado alvo da preocupao dos rgos de vigilncia sanitria. As estratgias propostas para o combate raiva em quirpteros urbanos foram recentemente discutidas no II Seminrio de Manejo de Quirpteros em reas Urbanas, em So Paulo. Dentre as vrias propostas elaboradas, destacam-se as seguintes, que pretendem promover: a) a interao entre rgos de vigilncia e de controle ambiental; b) pesquisa em quirpteros; c) capacitao para o trabalho com morcegos; d) formao de uma rede de laboratrios regionais habilitados prtica com quirpteros; e) incrementar estudos sobre a quiropterofauna; e f) conscientizao da populao sobre o problema.
5.2.9 Tratamento Em humanos

O tratamento da raiva apresenta uma peculiaridade: a vacinao, na maioria dos casos, no aplicada preventivamente (com exceo de prossionais de risco) e sim terapeuticamente. Isso
712
Captulo 27
possvel em funo da lenta evoluo da infeco, ou seja, pelo perodo de incubao prolongado, que permite que o hospedeiro desenvolva uma resposta imune protetora quando vacinado aps a exposio ao RabV. Conforme a gravidade da leso e o histrico do animal agressor, diferentes medidas devem ser tomadas com o intuito de que a pessoa exposta no desenvolva a doena (Tabela 27.7).
A Organizao Mundial de Sade recomenda que o tratamento mais ecaz contra a raiva lavar e enxaguar a ferida ou ponto de contato com bastante gua e sabo e, aps, colocar etanol, tintura ou soluo aquosa de iodo sobre o ferimento. A vacina contra a raiva deve ser aplicada em caso de exposies de nvel 2 ou 3. Soro anti-rbico (imunoglobulina anti-rbica) deve ser administrado a todos aqueles que sofreram expo-
Tabela 27.7. Indicaes para o tratamento anti-rbico no homem. Recomendaes da Organizao Mundial da Sade Natureza da exposio
Sem leso, contato indireto Lambedura a) sem leso cutnea b) com pele esfolada ou arranhada, ou com mucosas intactas Agressivo Sadio ____ Sinais clnicos de raiva ou diagnstico de raiva confirmado Sadio Nenhum. Iniciar a vacinao aos primeiros sinais de raiva no animal.
Condio do animal agressor

No momento da agresso Agressivo Durante um perodo de 10 dias de observao ____
Tratamento recomendado (alm do tratamento local)

Nenhum.
Sinais clnicos de raiva
Iniciar a vacinao imediatamente, suspender o tratamento caso o animal estiver sadio cinco dias aps a exposio. Iniciar a vacinao imediatamente.
Agressivo, fugido, ou no se conhece
____
Mordeduras a) superficiais a) Sadio Sinais clnicos de raiva ou diagnstico de raiva comprovado Iniciar a vacinao aos primeiros sinais de raiva no animal agressor.
b) Sinais clnicos de raiva
Sadio
Iniciar a vacinao imediatamente, suspender o tratamento caso o animal estiver sadio cinco dias aps a exposio. Iniciar a vacinao imediatamente.
c) Agressivo, fugiu, foi morto ou no se conhece d) Silvestre
____
____
Soro, imediatamente seguido de vacinao.
b) graves (mltiplas ou na face, cabea, pescoo ou dedo)
A) Sadio
Soro, deve-se injetar no mnimo 40 unidades internacionais por kg de peso corporal em dose nica.
b) Sinais clnicos de raiva
Sinais clnicos de raiva ou diagnstico de raiva comprovado
c) Raivoso, fugiu foi morto ou no se conhece
Tambm pode ser infiltrado 5 ml de soro no tecido afetado, seguido de completa limpeza do ferimento. Imediatamente iniciar a vacinao ao primeiro sinal clnico de raiva no animal agressor. Soro, imediatamente seguido de vacinao. A vacina pode ser interrompida se o animal estiver normal cinco dias aps a exposio.
d) Silvestre
Rhabdoviridae
713
sio de nvel 3, assim como para exposies de nvel 2 em pacientes imunodeprimidos. O fechamento da ferida (sutura) deve ser evitado, mas, se necessrio, deve-se administrar soro anti-rbico previamente, alm de tratamento para ttano e outros antimicrobianos que possam ser necessrios. Em caso de exposio a animais suspeitos, deve-se buscar imediatamente identicar, capturar ou matar o animal envolvido. No caso de uma exposio de nvel 3, o tratamento ps-exposio deve ser iniciado imediatamente, podendo ser interrompido se o animal for um co ou gato e permanecer sadio aps 10 dias de observao. Amostras de tecidos devem ser coletadas dos animais mortos e enviados ao laboratrio competente para diagnstico. Os gastos orados para tratamento anti-rbico nos pases da Amrica Latina excluindo o Brasil foram da ordem de 11 a 22 milhes de dlares. No Brasil, somente em 2004, foram gastos cerca de 28 milhes de dlares em vacinas de animais de estimao e humanas, soro anti-rbico, diagnstico, pessoal, treinamento de pessoal e campanhas de vacinao de ces. Nessas estimativas, no foram computados os dados referentes raiva bovina que, segundo levantamento realizado em 1985, foi responsvel por perdas estimadas em 100.000 cabeas de gado, com um custo de 30 milhes de dlares. Uma paciente se recuperou aps o desenvolvimento dos sinais clnicos de raiva em Wisconsin, EUA, cerca de um ms aps ter sido mordida por um morcego no-hematfago. No havia a suspeita inicial de raiva, a paciente no recebeu nenhum tipo de tratamento especco ps-exposio, porm desenvolveu ttulos crescentes de anticorpos no soro e lquido cefalorraquidiano; em nenhum momento foi isolado vrus nem foi possvel identicar a presena genoma viral por mtodos moleculares. O tratamento da paciente consistiu em terapia de suporte e medidas neuroprotetivas, com a induo de coma e respirao forada. Ribavirina foi administrada por via intravenosa. Durante sete dias de coma induzido, a paciente apresentou um aumento gradativo nos ttulos de anticorpos anti-rbicos, embora sem conrmao virolgica. Acredita-se que este seja o sexto caso humano de recuperao da raiva sem que o paciente tenha recebido nenhum tipo
de tratamento ps-exposio, porm desenvolvendo uma resposta imune especca. O prognstico, neste caso, reservado, pois somente um dos demais cinco pacientes que se recuperaram da raiva sem tratamento ps-exposio no apresentou seqelas.
Tratamento de animais suspeitos

O tratamento de animais suspeitos de raiva contra-indicado em funo do risco que representam para a transmisso do vrus a humanos. Animais suspeitos de raiva devem ser isolados e mantidos em observao em local seguro por um perodo prolongado.
5.3 Rabdovrus de peixes

Dentre as doenas vricas mais importantes de peixes, vrias so causadas por membros da famlia Rhabdoviridae. A comisso de doenas de peixes da OIE (Ofce International des pizooties) lista trs espcies de rabdovrus de noticao obrigatria, que exigem comunicao em 24 horas aps a conrmao do diagnstico. Essas espcies incluem o vrus da necrose hematopoitica infecciosa (IHNV), vrus da septicemia hemorrgica (VHSV) e vrus da viremia primaveril das carpas (SVCV). Esses vrus causam infeces agudas com alta mortalidade em peixes encontrados na natureza ou em criatrios. Outros rabdovrus de peixes incluem o Rhabdovirus hirame (HIRRV) e outros que tm sido isolados de infeces crnicas ou assintomticas. Neste captulo, so revisadas as quatro espcies de rabdovrus de peixes mais estudadas e relevantes, ilustrando aspectos importantes sobre os rabdovrus como patgenos veterinrios em ecossistemas aquticos.
5.3.1 Histrico e classicao

A primeira descrio de uma doena severa, chamada de infectious dropsy of carp, foi publicada em 1930, porm surtos de doena semelhante haviam sido descritos no incio do sculo em carpas cultivadas em lagoas e, possivelmente, a infeco j ocorria em 1727. Pesquisas realizadas nos anos 1980 demonstraram que o agente etiolgico dessa enfermidade o SVCV. Epidemias em sal-
714
Captulo 27
mondeos, cuja etiologia atualmente atribuda ao IHNV e VHSV, foram descritas inicialmente entre 1940 e 1950. Porm, especula-se que epidemias da doena produzida por esses agentes j ocorriam no incio do sculo. Devido contnua ocorrncia e importncia econmica dessas epidemias, o SVCV, IHNV e VHSV tm sido estudados em nvel biolgico e molecular. J o HIRRV foi descrito inicialmente em 1984, e muito pouco se conhece sobre esse vrus. O estabelecimento de linhagens celulares de tecidos de peixes que amplicam ecientemente esses vrus, a partir de 1960, permitiu avanos importantes, facilitando a pesquisa em Virologia de peixes nos ltimos 50 anos. Taxonomicamente, os rabdovrus de peixes so classicados em um de dois grupos antignicos, baseados nas propriedades das protenas e em anlises logenticas de seqncias de genes. O gnero Novirhabdovirus abriga o IHNV, o VHSV e o HIRRV, alm de outros rabdovrus de peixes menos caracterizados. O segundo grupo inclui o SVCV e vrios rabdovrus emergentes de peixes que so muito relacionados aos rabdovrus de mamferos, e pertencem ao gnero Vesiculovirus.
Tabela 27.8. Principais rabdovrus de peixes com a sua distribuio geogrfica e espcies susceptveis Gnero Novirhabdovirus
Vrus
IHNV VHSV
Local
Hospedeiros
Amrica do Norte, Vrios gneros da Europa e sia famlia Salmonidae Amrica do Norte, Salmonidae (trutas) Europa e Japo Gadidae (bacalhaus) Clupeidae (arengues) Esocidae (lcios) Pluronectidae Japo Plecoglossidae (ayus) Pleuronectidae Bothidae (flounders)
HIRRV
Vrus semelhantes aos do gnero Vesiculovirus
Local Vrus SVCV e vrus Amrica do emergentes Norte, Europa semelhantes e sia aos vesiculovrus
Hospedeiros Cyprinidae (carpas) Esocidae (lcios) Salmonidae (trutas) Percidae (perches)
5.3.2 Epidemiologia Distribuio geogrca e espectro de hospedeiros

Como grupo, os rabdovrus de peixes possuem uma ampla distribuio geogrca e uma ampla gama de hospedeiros (Tabela 27.8). A infeco por esses vrus descrita na maioria dos pases em que a criao de peixes realizada em larga escala, incluindo a sia, Europa, Amrica do Norte, Rssia e Austrlia. Atualmente existem poucas evidncias da presena dos rabdovrus em peixes nas Amricas Central e do Sul e na frica. No entanto, o desenvolvimento das criaes de peixes nessas regies provavelmente ser acompanhado do surgimento ou relato desses agentes. Historicamente, a infeco pelo IHNV era limitada aos salmondeos, incluindo espcies de truta e salmo do pacco, encontradas na costa oeste da Amrica do Norte. Porm, esse vrus foi introduzido acidentalmente no Japo nos anos 60
e na Europa nos anos 80 pelo transporte de ovas e de alevinos infectados. Essa transferncia intercontinental permitiu o estabelecimento da infeco pelo IHNV como endmica e epidmica no Japo, na Europa e Amrica do Norte. O VHSV foi originalmente descrito como um patgeno de trutas arco-ris de gua fresca (Oncorhynchus mykiss) em criaes do oeste europeu, porm, aps os anos 1990, esse vrus tem sido descrito em uma ampla variedade de espcies de peixes marinhos nos oceanos Atlntico Norte e Pacco Norte. Um pequeno nmero de casos tambm tem sido descrito em criatrios de peixes no Japo. Ao longo do sculo 20, o SVCV foi descrito somente em peixes ciprindeos, como carpas cultivadas (Cyprinus carpio) na Europa, sia e em vrios outros pases da Europa Oriental. Em 2002, o primeiro diagnstico conrmado de infeco pelo SVCV na Amrica do Norte ocorreu em uma fazenda de peixes koi. Essa doena foi descrita posteriormente em vrios estados dos EUA. O momento e a rota de introduo do SVCV na Amrica do Norte no so conhecidos, porm possvel que tenha ocorrido pelo comrcio de peixes ornamentais. A distribuio do HIRRV restrita ao Japo, sendo descrito em peixes achatados, como o linguado-oliva (Paralichthys olivaceous) e o ayu (Plecoglossus altivelis).
Rhabdoviridae
715
Ciclo natural de infeco

Os surtos de doenas pelos rabdovrus so mais graves em peixes jovens, e a maioria das espcies hospedeiras torna-se mais resistente doena clnica com a idade. Porm, peixes maiores e inclusive adultos em desova podem ser infectados e atuar como carreadores do vrus. Os rabdovrus de peixes podem ser transmitidos horizontalmente entre peixes, pela gua contaminada; e verticalmente, dos adultos para a prognie, com o vrus associado s ovas. A importncia relativa dessas duas vias de transmisso permanece obscura, mas acredita-se que a transmisso vertical seja rara, e que a transmisso horizontal pela gua seja a principal forma de disseminao dos vrus. Surtos de doena ocorrem com maior freqncia em criatrios do que em peixes de vida livre, provavelmente pela densidade elevada, o que favorece uma maior ecincia de transmisso. No entanto, alguns surtos de infeco pelo IHNV, VHSV e SVCV tm sido descritos em populaes de vida livre. Os peixes que sobrevivem infeco podem ser carreadores do vrus por longos perodos ou erradicar o agente do organismo. Para o VHSV, a existncia de um grande nmero de reservatrios (peixes marinhos), tem sido documentada, porm, at ento, no foram descritos possveis reservatrios e vetores para os outros rabdovrus de peixes. A temperatura um importante fator para a ocorrncia de surtos. Os surtos da infeco pelo SVCV possuem sazonalidade, ocorrendo geralmente quando a temperatura da gua atinge entre 10 e 16C na primavera, no ocorrendo em temperaturas acima de 18C. As epidemias causadas pelo IHNV e pelo VHSV ocorrem em temperaturas mais frias, entre 10 e 12C, no ocorrendo acima de 15C. Partculas vricas livres na gua podem persistir viveis por dias a semanas, com maior viabilidade sob temperaturas baixas e alta salinidade.
l das protenas virais, reaes sorolgicas com anticorpos monoclonais e policlonais e por tipicao gentica. A anlise logentica e tipicao gentica parcial das seqncias dos genes G e N do IHNV, VHSV e SVCV permitiu a denio de genogrupos distintos dentro de cada espcie. Em concordncia com estudos anteriores, essas anlises demonstram que a relao entre os isolados correlacionada com a origem geogrca. O IHNV possui trs genogrupos, cada um com uma distribuio geogrca diferente na Costa Oeste dos EUA. Esses genogrupos possuem, ainda, alguma correlao com a espcie hospedeira entre os salmondeos. O VHSV possui trs genogrupos principais na Europa e um quarto na Amrica do Norte, existindo alguma correlao entre os genogrupos e a origem marinha ou de gua doce dos seus hospedeiros. Tanto o IHNV quanto o VHSV demonstram evidncias de evoluo viral especca dentro da piscicultura intensiva. A anlise de vrios isolados de SVCV permitiu a formao de quatro subgrupos, e a anlise conjunta com outros rabdovrus de peixes semelhantes aos vesiculovrus demonstrou a existncia de trs outros subgrupos, correlacionados com a localizao geogrca e a espcie hospedeira. Para cada uma dessas espcies de vrus, a alta resoluo conferida pelo seqenciamento de genes permitiu a criao de marcadores genticos, que podem ser utilizados para a investigao de trajetrias migratrias, a fonte do vrus em surtos e o seu padro de evoluo ao longo do tempo.

As doenas causadas pelos rabdovrus de peixes so caracterizadas por septicemia hemorrgica aguda, com degenerao tecidual e necrose em vrios rgos. O vrus penetra no peixe pelas brnquias, pele ou cavidade oral, replica de forma transitria nas clulas endoteliais e atinge a circulao sangnea, disseminando-se pelo organismo. Exames histopatolgicos demonstram leses extensivas e necrose em rgos hematopoiticos, incluindo os rins, o fgado, bao e, com menor freqncia, o corao. A necrose dos rins produz insucincia, perda da regulao osmti-
Epidemiologia molecular
Variaes entre isolados dos rabdovrus de peixes tm sido caracterizadas com base no per-
716
Captulo 27
ca e freqentemente morte. Durante a infeco, o vrus excretado pela urina e pelo material fecal na gua circundante. Alm disso, o VHSV pode ser tambm excretado por lceras de pele. Os sinais clnicos da doena aguda podem incluir o escurecimento da pele, exoftalmia, petquias na pele da base das nadadeiras, edema abdominal e fezes mucides de colorao clara. Porm, muitos peixes morrem sem a apresentao de sinais externos visveis e, por isso, freqentemente, a primeira indicao de uma epidemia o aumento sbito na mortalidade de peixes. Os sinais internos incluem anemia, edema, hemorragias petequiais disseminadas nos rgos, no tecido adiposo e na musculatura. Os peixes infectados podem apresentar letargia e anorexia, comportamento natatrio anormal e incapacidade de manter a posio vertical do seu eixo menor. A forma aguda da doena observada com maior freqncia em lhotes (alevinos); os peixes maiores podem apresentar a infeco crnica sem sinais aparentes ou mortalidade. A infeco pelo IHNV e pelo VHSV apresenta ainda uma forma nervosa, quando a infeco atinge o encfalo e causa um comportamento errtico hiperativo. Em infeces experimentais, a mortalidade inicia aproximadamente cinco a sete dias aps a exposio gua contaminada, persistindo por trs a quatro semanas. A ocorrncia, durao e severidade dos surtos de doena dependem da combinao de fatores virais, do hospedeiro e do ambiente, incluindo a temperatura, a idade e o tamanho dos peixes, a densidade e o nvel de estresse. As infeces por rabdovrus podem predispor os peixes a infeces bacterianas secundrias, que podem contribuir para a morbidade e mortalidade.
5.3.4 Imunidade
A resposta imunolgica dos peixes contra as infeces por rabdovrus envolve mecanismos inespeccos e, subseqentemente, a resposta imune adaptiva, com o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes. Existem indicaes ainda do envolvimento de resposta imune celular, no entanto, a funo potencial de linfcitos citotxicos no conhecida. Isso se deve principalmente
falta de anticorpos marcadores e linhagens celulares necessrios para a investigao da imunidade celular. Aps a exposio aos rabdovrus, a primeira linha de defesa do organismo a imunidade inata, envolvendo o interferon (IFN) e genes induzidos pelo IFN, anlogos aos conhecidos em mamferos. Sabe-se, desde os anos 1970, que a infeco pelo VHSV em peixes estimula a sntese de IFN, que apresenta um pico trs dias aps a infeco, e esse IFN possui uma ampla atividade antiviral. Os peixes possuem, ainda, outros componentes da imunidade inata, incluindo o complemento, receptores toll e genes induzidos por vrus que so especcos de peixes. Esses genes so induzidos rapidamente aps a infeco viral ou vacinao. A secreo mucosa de peixes possui atividade antiviral natural, que pode ser evidenciada previamente induo de anticorpos. O desenvolvimento de nveis detectveis de anticorpos sricos e de mucosas ocorre aps trs a dez semanas, e o pico ocorre em alguns meses. O tempo para o desenvolvimento inuenciado pela temperatura, com o desenvolvimento mais rpido em temperaturas mais altas. Os peixes geralmente possuem um subtipo principal de imunoglobulina e o soro contm mais anticorpos ligantes do que neutralizantes. A neutralizao viral necessita de componentes do sistema complemento; anticorpos especcos para a glicoprotena G demonstraram ser necessrios e sucientes para uma imunidade protetora. A importncia dos anticorpos neutralizantes para a imunidade contra os rabdovrus de peixes tem sido demonstrada pela transferncia passiva de soro de peixes convalescentes para peixes susceptveis e soronegativos, conferindo imunidade frente ao desao com doses letais de vrus. Peixes sobreviventes de epidemias de infeces por rhabdovrus desenvolvem imunidade protetora contra a exposio subseqente, possuindo ttulos de anticorpos especcos que declinam lentamente com o tempo. A temperatura ambiental possui funo importante na interao entre os rabdovrus de peixes e os hospedeiros. A ocorrncia de epidemias dessas infeces em temperaturas baixas se deve, em parte, supresso da resposta imune, enquanto o contrrio acontece em temperaturas mais elevadas, nas quais o sistema imune
Rhabdoviridae
717
estimulado e a mesma infeco viral pode ser controlada pelo hospedeiro.
de anticorpos no soro incluem a neutralizao viral (dependente de complemento) e ELISA.
5.3.5 Diagnstico
O diagnstico das infeces pelos rabdovrus de peixes deve iniciar com a coleta de amostras clnicas para os exames virolgicos de rotina. Os tecidos para a coleta dependem do tamanho do peixe: para alevinos e peixes pequenos, coletase todo o animal, enquanto para peixes adultos, coleta-se os rins, bao e uido reprodutivo, principalmente. Pode-se fazer um pool de amostras de at cinco peixes ou, ainda, examinar-se amostras individuais. Essas amostras devem ser transportadas a 4C em gelo, no-congeladas, e devem ser processadas em 48 a 72 horas. Diluies de homogeneizados de tecidos, smen ou uido ovariano so inoculadas em monocamadas de linhagens celulares susceptveis, e o vrus detectado pelo efeito citoptico caracterstico aps dois a cinco dias, podendo levar duas semanas. O IHNV, o VHSV e o HIRRV so incubados a 15C, e o SVCV incubado entre 22 e 25C. O efeito citoptico caracterstico de cada um dos vrus e resulta na formao de agregados em forma de cachos de uva por clulas arredondadas, formao de placas e, eventualmente, a destruio da monocamada. Aps a deteco do efeito citoptico, a identicao do agente pode ser realizada por neutralizao com soro policlonal ou monoclonal especco. Esse mtodo convel, sensvel e preciso, porm demorado, necessitando de duas a oito semanas para o diagnstico nal. Para a identicao rpida, mtodos alternativos, como a IFA, PCR ou RT-PCR, tm sido utilizados. Outros mtodos de deteco e identicao dos rhabdovrus incluem testes sorolgicos, como ELISA, immunoblots, imunohistoqumica (IHQ) e RT-PCR, em tecidos includos em parana. Para o IHNV, VHSV e SVCV, o exame de vrios isolados por mtodos sorolgicos tem demonstrado que cada espcie constituda por um sorotipo nico, portanto, anticorpos policlonais podem detectar todos os isolados na maioria dos mtodos. A deteco de anticorpos especcos no soro tambm pode ser til como um indicativo de exposio prvia ao vrus. Tcnicas para deteco

At o presente no existe tratamento para as infeces causadas pelos rabdovrus de peixes. A preveno deve se basear na aplicao de medidas rgidas de biossegurana nos criatrios, evitando a introduo do agente. Essas medidas incluem o uso de ovas ou estoques de peixes certicados como livres de patgenos, e a criao de peixes jovens em gua livre de contaminao por vrus, como gua de poos, gua tratada com luz ultravioleta, clorada/desclorada ou tratada com oznio. Os rabdovrus de peixes so inativados por esses tratamentos e tambm por compostos contendo iodo (iodforos) ou hipoclorito (alvejante). Solues de iodforos so utilizadas com freqncia em fazendas de peixes e em incubatrios para desinfetar redes, equipamentos, botas, luvas e outros. A desinfeco de ovas de peixes com iodforos (100 mg.Lt-1) efetiva, inativando aproximadamente 99,98% do IHNV. Portanto, a desinfeco de ovas com iodo uma prtica padro e que, se aplicada de forma apropriada, apresenta sucesso na eliminao da transmisso vertical em estabelecimentos de cultura de peixes. Outras prticas, tais como: evitar a mistura de ovas de vrias fmeas durante a postura e a distribuio de estoques de peixes em pequenas lagoas, no mantendo todos em uma mesma lagoa, so alternativas que evitam perdas em larga escala devido a epidemias. A seleo de peixes resistentes aos rabdovrus tem sido conduzida com algum progresso, demonstrando que existem bases genticas de resistncia infeco. Finalmente, em escala global, o reconhecimento da disseminao acidental dos rabdovrus de peixes para outros continentes, no sculo passado, permitiu a aceitao de regulamentaes internacionais, requerendo a inspeo sanitria dos peixes para prevenir o transporte de patgenos atravs de peixes cultivados. Porm o transporte de peixes ornamentais permanece sem regulamentao e representa uma importante fonte para a disseminao desses vrus.
718
Captulo 27
Atualmente no existe nenhuma vacina comercial para uso em larga escala na preveno da infeco pelos rabdovrus de peixes. No entanto, o desenvolvimento de vacinas de DNA tem se demonstrado rpido e promissor. Vacinas tradicionais atenuadas ou inativadas tm sido testadas por dcadas para esses vrus. Vacinas ecazes foram desenvolvidas, porm o seu uso foi limitado pelo custo, eccia inconsistente ou pela incerteza quanto segurana. Com a aplicao da biologia molecular, vacinas de subunidades proticas e de peptdeos foram desenvolvidas, mas a eccia foi inconsistente, impedindo a comercializao em larga escala. Em 1995, a primeira descrio de uma vacina de DNA, expressando a glicoprotena G do IHNV, abriu novas perspectivas para a vacinologia de vrus de peixes. Desde ento, vacinas de DNA contra o IHNV, o VHSV e o HIRRV tm demonstrado ser excepcionalmente ecazes, garantindo proteo de 80 a 100% dos peixes contra o desao com doses letais sob vrias condies ambientais. Essas vacinas consistem de plasmdeos, molculas simples de DNA circular, que contm somente um gene viral, portanto, so seguras e estveis, alm de ecazes. Uma vacina de DNA contra o IHNV foi licenciada, em 2005, no Canad, e outros pases devem liberar o comrcio medida que esta vacina encontre maior aceitao. Limitaes atuais aplicao dessas vacinas na aqicultura so os requerimentos regulatrios de licenciamento e a necessidade do desenvolvimento de mtodos mais ecientes de introduo do DNA nos animais. Alm das vacinas de DNA, tem ressurgido o interesse em melhoria das vacinas inativadas.
BAER, G.M. Rabies in Nonhematophagous bats In: ___. The natural history of rabies. 2. ed. Boca Raton, FL: CRC Press, 1975. p.79-97. BALL, L.A.; WHITE, C.N. Order of transcription of genes of vesicular stomatitis virus. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v.73, p.442-446, 1976. BETTS, A.M. et al. Emerging vesiculo-type virus infections of freshwater sh in Europe. Diseases of Aquatic Organisms, v.57, p.201-212, 2003. BINGHAM, J. Canine Rabies Ecology in Southern Africa. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1337-1342, 2005. BOOTLAND, L.M.; LEONG, J.C. Infectious hematopoietic necrosis virus. In: WOO, P.T.K.; BRUNO, D.W. (eds). Fish diseases and disorders: Volume 3: Viral, bacterial and fungal infections. New York: CAB International, 1999. p.57-121. BOURHY, H.; KISSI, B.; TORDO, N. Taxonomy and evolutionary studies on lyssavirues with special reference to Africa. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v.60, p.277-282, 1993. CHARLTON, K.M. The pathogenesis of rabies and other lyssaviral infections: recent studies. In. RUPPRECHT, C.E.; DIETZSCHOLD, B.; KOPROWSKI, H. (eds). Lyssaviruses. Berlin: Springer-Verlag, 1994. p.95-119. CUNHA, E.M. et al. Isolation of rabies virus in Artibeus mbriatus bat in State of Sao Paulo, Revista de Sade Pblica, v.39, p.683-684, 2005. EINER-JENSEN, K. et al. Evolution of the sh rhabdovirus viral hemorrhagic septicaemia virus. The Journal of General Virology, v.85, p.1167-1179, 2004. FAUQUET, C.M. et al. (eds). Virus Taxonomy VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego, CA: Academic Press, 2005. 1162p. FAUQUET, C.M.; FARGETTE, D. International Committee on Taxonomy of Viruses and the 3,142 unassigned species. Virology Journal, v.2, p.64, 2005. FEDERER, K.E.; BURROWS, R.; BROOKSBY, J.B. Vesicular stomatitis virus--the relationship between some strains of the Indiana serotype. Research in Veterinary Science, v.8, p.103117, 1967. FRASER, G.C. et al. Encephalytis caused by a lyssavirus in fruit bats in Australia. Emerging Infectious Diseases, v.2, p.327-330, 1996. GONALVES, M.A.S.; NETO, R.S.; BRAZIL, T. K Outbreak of aggressions and transmission of rabies in human beings by vampire bats in northeastern Brazil. Revista Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v 35, p.461-464, 2002.
AFS. Suggested procedures for the detection an identication of certain nsh and shellsh pathogens. Alpharetta, GA: Fish Health Section, American Fisheries Society, 2005. AHNE, W. et al. Spring viremia of carp (SVC). Diseases of Aquatic Organisms, v.52, p.261-272, 2002. AMENGUAL, B. et al. Evolution of european bat lyssavirus. The Journal of General Virology, v.78, p.2319-2328, 1997. BAER, G.M. (ed). The natural history of rabies. 2. ed. Boca Raton, FL: CRC Press, 1991. 620p.
Rhabdoviridae
719
RODRIGUEZ, L.L. Emergence and re-emergence of vesicular stomatitis in the United States. Virus Research, v.85, p.211-219, 2002. RODRIGUEZ, L.L. et al. Full-length genome analysis of natural isolates of vesicular stomatitis virus (Indiana 1 serotype) from North, Central and South America. The Journal of General Virology, v.83, p.2475-2483, 2002. ROSE, J.K.; WHITT, M.A. Rhabdoviridae: the viruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.38, p.1241-1244. SCHAEFER, R. et al. Studies on antigenic and genomic properties of Brazilian rabies virus isolates. Veterinary Microbiology, v.107, p.161-170, 2005. SMAIL, D.A. Viral haemorrhagic septicaemia In: WOO, P.T.K.; BRUNO, D.W. (eds). Fish diseases and disorders: Volume 3: Viral, bacterial and fungal infections. New York: CAB International, 1999. p.123-147. SNOW, M. et al. Genetic population structure of marine viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV). Diseases of Aquatic Organisms, v.61, p.11-21, 2004. SPIROPOULOU, C.F.; NICHOL, S.T. A small highly basic protein is encoded in overlapping frame within the P gene of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology, v.67, p.3103-3110, 1993. STONE, D.M. et al. Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of putative spring viraemia of carp viruses and pike fry rhabdovirus isolates reveals four distinct piscine vesiculovirus genogroups. Diseases of Aquatic Organisms, v.53, p.203-210, 2002. WAGNER, R.R.; ROSE, J.K. Rhabdoviridae: The Viruses and Their Replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: LippincottRaven, 1996. Cap.37, p.1121-1135. WANDELER, A.I. et al. Rabies epidemiology: some ecological and evolutionary perspectives. In. RUPPRECHT, C.E.; DIETZSCHOLD, B.; KOPROWSKI, H. (eds). Lyssaviruses. Berlin: Springer-Verlag, 1994. p.297-324. WOLF, K. Fish viruses and sh viral diseases. Ithaca: Cornell University Press, 1988. 476p.
HELLENBRAND, W. et al. Cases of rabies in Germany following organ transplantation. Euro surveillance: bulletin europen sur les maladies transmissibles, v.10, E050224.6, 2005. JOHNSON, N.; PHILLPOTTS, R.; FOOKS, A.R. Airbone transmission of lyssavirus. Journal of Medical Microbiology, v.55, p.785-790, 2006. KIM, D.H. et al. Complete nucleotide sequence of the hirame rhabdovirus, a pathogen of marine sh. Virus Research, v.107, p.1-9, 2005. KING, A.A.; TURNER, G.S.; Rabies, A review. Journal of Comparative Pathology, v.108, p.1-39, 1993. KOPROWISKI, H. (Ed). Laboratory techniques in rabies. 4.ed. Geneva: World Health Organization, 1996. p.200-207. KURATH, G. et al. Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America. The Journal of General Virology, v.84, p.803-814, 2003. KURATH, G. Overview of recent DNA vaccine development for sh. Developments in Biologicals, v.121, p.201-213, 2005. KURATH, G.; HIGMAN, K.H.; BJORKLUND, H.V. Distribution and variation of NV genes in sh rhabdoviruses. Anonymous. The Journal of General Virology, v.78, p.113-117, 1997. LEONG, J.C.; FRYER, J.L. Viral vaccines for aquaculture. Annual Review of Fish Diseases, v.3, p.225-240, 1993. LUMLERTDACHA, B. et al. Bat Nipah Virus, Thailand. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.1949-1951, 2005. McWILLIAM, S.M. et al. Genome organization and transcription strategy in the complex GNS-L intergenic region of bovine ephemeral fever rhabdovirus. The Journal of General Virology, v.78, p.1309-1317, 1997. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. OIE. Manual of diagnostic tests for aquatic animals 2006. Paris, France: OIE, 2006. Disponvel em: http://www.oie.int/eng/ normes/fmanual/A_summry.htm. Acesso em: 18 nov. 2006. RAO, B.L. et al. A large outbreak of acute encephalitis with high fatality rate in children in Andhra Pradesh, India, in 2003, associated with Chandipura virus. Lancet, v.364, p.869-874, 2004.
ORTHOMYXOVIRIDAE
Eduardo Furtado Flores, Luciane T. Lovato, Mariana S e Silva, Renata Dezengrini & Diego G. Diel
28
723 724 725
725 725 725 727 727

3.1 Propriedades gerais 3.2 O envelope 3.2.1 O genoma 3.3 Os nucleocapdeos 3.3.1 O genoma
4 Replicao
4.1 Adsoro e penetrao 4.2 Transcrio 4.3 Replicao do genoma 4.4 Morfognese e egresso
728
729 729 731 731
5 Gentica dos vrus da inuenza 6 Infeces de importncia em veterinria causadas por ortomixovrus
6.1 Inuenza eqina 6.1.1 Epidemiologia 6.1.2 Patogenia, patologia e sinais clnicos 6.1.3 Imunidade 6.1.4 Diagnstico 6.1.5 Prolaxia e controle 6.2 Inuenza suna 6.2.1 Caractersticas do vrus 6.2.2 Epidemiologia 6.2.3 Patogenia, sinais clnicos e patologia 6.2.4 Imunidade 6.2.5 Diagnstico 6.2.6 Prolaxia e controle
733 735
735 735 736 737 737 738 738 739 739 740 741 741 742
6.3 Inuenza aviria 6.3.1 Caractersticas do vrus 6.3.2 Epidemiologia 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.3.6 Patogenia, sinais clnicos e patologia Imunidade Diagnstico Controle e prolaxia
742 742 743 744 744 745 746 748 749 750 751 751 752 752
6.4 Inuenza em aves silvestres 6.5 Vrus da inuenza H5N1 6.6 Inuenza em ces, felinos e outros mamferos 6.6.1 Epidemiologia 6.6.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 6.6.3 Diagnstico 6.6.4 Controle e preveno
753
1 Introduo
A famlia Orthomyxoviridae abriga importantes patgenos humanos e animais, associados essencialmente com infeces respiratrias. A denominao da famlia deriva do latim e reete uma importante caracterstica biolgica desses vrus, pois myxo signica muco, e ortho signica verdadeiro. Ou seja, so os verdadeiros vrus do muco, em uma referncia sua propriedade de penetrar atravs do muco e infectar clulas do epitlio respiratrio. Essa denominao foi utilizada para diferenci-los de outra famlia de vrus associados com infeces respiratrias, a Paramyxoviridae. Essas famlias compartilham algumas propriedades biolgicas, mas so diferentes do ponto de vista estrutural e gentico. Os ortomixovrus causam as infeces respiratrias de pessoas e animais conhecidas como gripe ou inuenza. Assim, so conhecidos como vrus da inuenza ou vrus da gripe. A inuenza a principal doena respiratria humana e um dos principais problemas de sade pblica no mundo inteiro, alm de ser uma importante causa de perdas econmicas em animais de produo. Historicamente os vrus da inuenza tm sido envolvidos em epidemias de grandes propores que ceifaram a vida de milhes de pessoas. Pela sua constante evoluo gentica e antignica, esses vrus so considerados uma das principais ameaas sade pblica mundial. Os vrions dos ortomixovrus so grandes, pleomrcos, com envelope e contm sete ou oito molculas de RNA de polaridade negativa como genoma. A natureza segmentada do genoma proporciona condies para a ocorrncia de recombinaes do tipo ressortimento. Nesses eventos, ocorre a redistribuio de segmentos genmicos entre duas cepas virais originando outro vrus, com gentipo e fentipo mistos. Esse mecanismo gentico permite aos vrus da inuenza evoluir rapidamente, e tem sido responsabilizado pelo surgimento de cepas altamente virulentas associadas com doena severa e alta mortalidade, principalmente em humanos. Outra caracterstica marcante dos vrus da inuenza a alta variabilidade antignica das glicoprotenas de superfcie. Essa variabilidade per-
mite ao vrus persistir indenidamente na populao, atravs de mutaes e seleo de variantes, que no so neutralizadas pelos anticorpos produzidos pelo hospedeiro. A grande variabilidade antignica, principalmente dos vrus humanos, constitui-se em um obstculo quase intransponvel para a produo de vacinas permanentes e de uso universal. Os hospedeiros naturais dos vrus da inuenza so aves aquticas e migratrias de vrias espcies. Nesses animais, o vrus replica no intestino sem produzir sinais clnicos e excretado em altos ttulos nas fezes. Curiosamente, o vrus se mantm muito estvel geneticamente nesses hospedeiros, provavelmente por ausncia de presso imunolgica seletiva. No entanto, a ocorrncia ocasional de ressortimento de segmentos genmicos entre cepas diferentes ou de outras mutaes pode resultar em alteraes marcantes no fentipo viral, com o surgimento de variantes capazes de infectar humanos e outros mamferos. Aps a sua transferncia para novos hospedeiros, esses vrus geralmente apresentam uma rpida evoluo gentica atravs de mutaes. Esses variantes podem tambm apresentar virulncia aumentada para os seus hospedeiros naturais e para aves domsticas. Acredita-se que os vrus da inuenza que infectam humanos e animais domsticos provavelmente se originaram de ancestrais oriundos de aves aquticas e migratrias, em um passado recente ou remoto. Ou seja, os vrus da gripe so potencialmente zoonticos, ao contrrio do que era historicamente considerado. Por essa razo, considera-se que as aves aquticas se constituem em um imenso reservatrio de vrus da inuenza, podendo transmiti-los a pessoas, mamferos e aves domsticas. Um exemplo recente foi o surgimento de variantes avirias do gentipo H5N1 altamente patognicas para humanos e para outros mamferos. Outro exemplo da habilidade desses vrus de cruzar a barreira de espcies o vrus H3N8, que foi transmitido de eqinos para ces, nos quais produz doena severa. Aps a adaptao aos seus novos hospedeiros, os vrus se tornam relativamente espcie-especcos e apresentam uma capacidade restrita de infectar espcies heterlogas. Essa barreira in-
724
Captulo 28
terespcies, no entanto, parece ser tnue e temporria, e os vrus podem, ocasionalmente, evoluir e se tornar capazes de cruzar a barreira de espcies e infectar outros hospedeiros. Esses exemplos ilustram a contnua evoluo desses agentes, o que torna a sua biologia e epidemiologia fascinantes, ao mesmo tempo em que impe barreiras enormes para o seu controle. Este captulo abordar as caractersticas gerais da famlia e os vrus de interesse veterinrio. Grande parte dos conhecimentos adquiridos sobre essa famlia foi obtida de estudos com os vrus da inuenza A humana. Por isso, a parte geral deste captulo utilizar informaes obtidas a partir desses estudos. Ao nal do captulo, ser abordada, resumidamente, a infeco pelo vrus H5N1, que adquiriu virulncia mesmo para as aves e, ocasionalmente, transmitido para pessoas, quando causa doena severa e freqentemente fatal. A possibilidade da disseminao desse vrus na populao humana representa um risco real para a sade pblica mundial.
2 Classicao
De acordo com o ICTV (Comit Internacional para a Taxonomia de Vrus), a famlia Orthomyxoviridae dividida em quatro gneros: Inuenza A: abriga vrus que infectam uma variedade de espcies de aves, de mamferos e humanos. So os principais componentes desta famlia, pela sua distribuio e importncia sanitria. Possuem oito segmentos genmicos e duas glicoprotenas principais de superfcie: HA (hemaglutinina) e NA (neuraminidase). Essas glicoprotenas apresentam uma notvel variabilidade antignica; Inuenza B: vrus que infectam apenas humanos. Tambm possuem oito segmentos genmicos e duas glicoprotenas principais (HA e NA). Essas glicoprotenas, no entanto, apresentam pouca variabilidade antignica quando comparadas com o gnero anterior; Inuenza C: abriga vrus que tradicionalmente s eram identicados em humanos, porm a infeco natural j foi demonstrada tambm em sunos. Esses vrus raramente esto associados com doena nos seus hospedeiros. Possuem sete
segmentos genmicos e apenas uma glicoprotena multifuncional no envelope (HEF); Thogotovirus: abrange vrus encontrados em carrapatos, sem envolvimento com doena em vertebrados at o presente. Os vrus dos gneros A, B e C podem ser diferenciados entre si de acordo com as propriedades antignicas das protenas do nucleocapsdeo (NP) e da matriz (M1). Os vrus da inuenza A apresentam uma grande variabilidade antignica e podem ser classicados em subtipos de acordo com a reatividade sorolgica das glicoprotenas HA e NA. At o presente, j foram identicados 16 diferentes tipos de HA e nove tipos de NA, que permitem a formao de centenas de possveis subtipos H/N. No entanto, apenas alguns subtipos j foram reconhecidos como patognicos para cada espcie. Dentre esses, destacam-se os tipos H1N1, H2N2 e H3N2 em humanos; H7N7 e H3N8 em eqinos; H1N1 e H3N2 em sunos. As aves aquticas abrigam um repertrio inumervel de possveis combinaes H/N. Os subtipos H5N2 e H7N1 so os principais vrus encontrados nos surtos de doena em aves domsticas. Recentemente, alguns vrus do subtipo avirio H5N1 se tornaram virulentos, inclusive para algumas espcies de aves silvestres. Esses vrus foram transmitidos para aves domsticas e para humanos, causando centenas de mortes, principalmente na sia. Esse vrus tambm foi transmitido para outros animais domsticos, como felinos. Vrus avirios dos subtipos H9N2 (China e Hong Kong, 1999) e H7N7 (Holanda, 2003) tambm foram recentemente transmitidos para humanos e aves domsticas, porm com conseqncias menos graves. A nomenclatura dos isolados e cepas dos vrus da inuenza segue um padro universal, considerando o tipo de vrus (A, B e C), hospedeiro de origem (quando no for de humanos), origem geogrca, nmero da cepa, ano de isolamento e o subtipo da HA e NA (entre parnteses). Exemplos: inuenzavrus A/Hong Kong/1/68 (H3N2) vrus isolado de humanos durante a pandemia de 1968; ou inuenzavrus suno A/ swine/Iowa/15/30 (H1N1) cepa de referncia do vrus da inuenza suna.
Orthomyxoviridae
725

3.1 Propriedades gerais
Os ortomixovrus apresentam vrions grandes, envelopados e pleomrcos. As partculas vricas podem apresentar formas esfricas com contorno pouco regular (80-120 nm de dimetro), formas lamentosas (20-50 x 200-300 nm) ou forma de rim (Figura 28.1). Os vrions obtidos aps mltiplas passagens em ovos embrionados ou em cultivo celular apresentam uma morfologia mais homognea e medem entre 80 e 120 nm; enquanto os isolados recentes apresentam um polimorsmo marcante. Os vrions so sensveis a temperaturas elevadas, apresentando curta viabilidade em condies ambientais. A infectividade inativada em 30 minutos a 56C ou sob pH 3; e so sensveis a solventes lipdicos (ter/clorofrmio) e detergentes.
3.2 O envelope
O envelope lipdico apresenta aproximadamente 500 projees (espculas) de 10 a 14 nm, formadas pelas glicoprotenas HA e NA. As projees so formadas por homotrmeros da HA e homotetrmeros da NA, na proporo de 4:1 ou 5:1. As projees formadas pela HA so mais longas do que as formadas pela NA, que apresentam
uma aparncia de cogumelo. As glicoprotenas HA e NA so tpicas protenas integrais de membrana, apresentando uma regio externa grande, uma regio transmembrana hidrofbica e uma pequena cauda interna. A orientao dessas glicoprotenas, no entanto, inversa: a HA apresenta a extremidade amino orientada para o exterior, enquanto a NA possui essa extremidade orientada para o interior do vrion. Outro componente do envelope a protena com atividade de canal de ons (M2), que est presente em um nmero pequeno de cpias (Figura 28.1). A HA uma protena multifuncional, responsvel pela ligao dos vrions aos receptores celulares (cido silico) e pela fuso do envelope com a membrana endossomal, permitindo a penetrao dos nucleocapsdeos no citoplasma. Possui, ainda, a propriedade de aglutinar eritrcitos de animais (atividade hemaglutinante) e contm os principais epitopos que so alvos de anticorpos neutralizantes. Essa variabilidade antignica, juntamente com a variao observada na NA, responsvel pela habilidade do vrus persistir na populao apesar da resposta imunolgica montada pelos hospedeiros. A variabilidade antignica da HA tambm utilizada para classicar os isolados de campo em subtipos, ou seja, os subtipos so denidos de acordo com a reatividade da sua HA com anti-soro especco de cada subtipo.
726
Captulo 28
A HA sintetizada como um polipeptdeo nico (HA0), que clivado durante o transporte das glicoprotenas para a membrana plasmtica no nal do ciclo replicativo. Essa clivagem, que essencial para a infectividade dos vrions, origina dois polipeptdeos (HA1 e HA2), que permanecem unidos por pontes dissulfeto, formando a protena funcional HA. Nessa molcula, a HA1 abrange a regio globular externa, que possui os stios de ligao aos receptores e os principais epitopos alvos de anticorpos neutralizantes (Figura 28.2). As variaes nesses epitopos so as responsveis pela grande variabilidade antignica do vrus da inuenza A. A HA2 possui a forma de haste e localiza-se logo abaixo da HA1. Esse polipeptdeo apresenta uma regio transmembrana e uma regio intermediria, que contm o peptdeo fusognico. Esse peptdeo responsvel pela fuso do envelope com a membrana celular. A fuso do envelope viral com a membrana do endossomo se constitui em uma etapa essencial para a penetrao do vrus na clula e precedida por alteraes conformacionais drsticas na HA, induzidas pelo pH baixo nos endossomos.
A NA se organiza em tetrmeros e est presente no envelope em menor abundncia do que a HA. A neuraminidase se constitui na segunda protena responsvel pela classicao do vrus em subtipos. Essa protena tambm possui uma regio alongada (haste), cuja extremidade est associada com a membrana, e uma regio globular que responsvel pela sua atividade biolgica (Figura 28.2). A NA responsvel pela clivagem do cido silico das glicoprotenas celulares, mas o signicado biolgico dessa atividade no ciclo replicativo do vrus ainda no bem conhecido. Essa atividade poderia facilitar a penetrao dos vrions atravs da camada de muco presente sobre a mucosa respiratria at alcanar o epitlio. Tambm tem sido sugerido que essa atividade importante para a liberao dos vrions da superfcie celular durante o egresso, sem a qual os vrions cariam agregados na membrana. A NA tambm contm determinantes antignicos sujeitos a variaes freqentes, o que contribui para a variabilidade antignica desses vrus. A M2 uma protena integral de membrana presente em poucas cpias no envelope viral.
Orthomyxoviridae
727
Essa protena est presente em arranjos tetramricos que ultrapassam toda a espessura da membrana, formando uma espcie de canal que permite a comunicao entre os compartimentos interno e externo (Figura 28.2). De fato, a M2 funciona como um canal de ons que possui um papel importante em duas etapas distintas do ciclo, durante a penetrao e, posteriormente, durante a maturao dos vrions. A primeira funo exercida durante a internalizao dos vrions, no interior de endossomos acidicados. A estrutura da M2 se abre e permite a penetrao de ons H+ para o interior dos vrions. A acidicao interna do pH favorece a dissociao dos ribonucleocapsdeos da protena da matriz, facilitando, assim, o desnudamento. A segunda atividade da M2 ocorre na fase nal do ciclo, durante o transporte das glicoprotenas em vesculas do aparelho de Golgi para a membrana plasmtica, onde ocorrer o brotamento dos nucleocapsdeos. Nessa etapa, o canal formado pela M2 (que est inserida na membrana das vesculas) se abre e permite a sada de ons H+ das vesculas para o citoplasma. Assim, o pH no interior dessas vesculas se mantm alto, prevenindo a ocorrncia prematura das alteraes conformacionais da HA. A M1 o componente mais abundante dos vrions, apresentando aproximadamente 3.000 cpias por vrion. A camada formada por essa protena est intimamente associada com a face interna do envelope e medeia as interaes entre o envelope e os nucleocapsdeos. A M1 desempenha um papel estrutural importante, conferindo certa rigidez estrutura dos vrions e tambm importante durante o processo de morfognese.
3.3 Os nucleocapsdeos
No interior dos vrions, so encontrados oito nucleocapsdeos, que se apresentam como bastes helicoidais exveis, provavelmente exionados e enrolados sobre si mesmos (ver Figura 28.1). Cada nucleocapsdeo contm um segmento de RNA conjugado com mltiplas cpias da protena NP (uma molcula da NP para cada 20 nucleotdeos, nt). O complexo RNA + NP denominado ribonucleoprotena (RNP) e relativamente estvel, permanecendo razoavelmente associado durante os processos de transcrio e replicao do genoma. Associadas s RNPs encontram-se trs protenas menos abundantes (30-60 cpias por vrion), que so componentes do complexo polimerase (transcriptase/replicase). Esse complexo formado por trs protenas principais: PB1 (polimerase bsica 1); PB2 (polimerase bsica 2) e PA (polimerase cida).
3.3.1 O genoma
O genoma dos vrus da inuenza A constitudo por oito molculas lineares de RNA de sentido negativo, numerados de 1 a 8. Os segmentos 1 a 6 codicam uma protena cada; os segmentos 7 e 8 codicam duas protenas cada. Os segmentos genmicos apresentam a mesma organizao geral: possuem um gene na regio central, anqueado por seqncias no-codicantes altamente conservadas nas extremidades 3 (12 nt) e 5 (13 nt) (Figura 28.3). Essas seqncias so parcialmente complementares e permitem a formao das estruturas que lembram cabos de panela (pa-
RNA genmico (-)

Gene 3-UCGCUUUCGUCC 12 nucleotdeos
GGAACAAAGAUGA-5
13 nucleotdeos
Figura 28.3. Organizao dos segmentos de RNA que compem o genoma dos vrus da influenza A (famlia Orthomyxoviridae).
728
Captulo 28
Tabela 28.1. Organizao do genoma e produtos codificados pelo vrus da influenza A (famlia Orthomyxoviridae).
Segmento
Gene (ORF)
Protena/funo
PB2 = 2277nt
Polimerase bsica 2 componente do complexo replicase. Reconhece e cliva oligonucleotdeos de mRNA celulares.
PB1 = 2271nt
Polimerase bsica 1 componente do complexo replicase. Possui atividade de de polimerase. a replicase viral. Polimerase cida componente do complexo replicase. Funo desconhecida. Hemaglutinina principal glicoprotena do envelope. Media a ligao aos receptores e fuso/penetrao. Altamente varivel.
PA = 2148nt
3 4
HA = 1698nt
5 6
NP = 1494nt
Nucleoprotena conjugada com o genoma, forma o nucleocapsdeo. Muito abundante.
NA = 1362nt
Neuraminidase glicoprotena do envelope. Cliva a ligao com o cido silico. M1 protena da matriz. Protena mais abundante dos vrions. Media a interao entre o envelope e os nucleocapsdeos. Participa da morfognese. M2 protena integral do envelope. Canal de ons. Essencial para o desnudamento. NS1 protena no-estrutural. Inibe o splicing de mRNA celulares.
M1=756nt
?=27 M2=291nt
NS1 = 690
NS2 = 363nt
NS2 protena no-estrutural. Interage com a M1. Envolvida com a exportao de RNPs do ncleo.
nhandles) durante a transcrio e replicao. As regies terminais tambm possuem sinais para o incio da transcrio e replicao. Cada segmento genmico encontra-se recoberto por mltiplas cpias da protena NP e est associado com algumas cpias das protenas que formam o complexo transcriptase/replicase. Os segmentos genmicos dos vrus da inuenza, com os respectivos genes e as provveis funes de seus produtos, esto apresentados na Tabela 28.1.
4 Replicao
Os ortomixovrus se constituem em excees entre os vrus RNA, pois a replicao do ge-
noma ocorre no ncleo da clula hospedeira. Os nucleocapsdeos contm as enzimas necessrias para a transcrio e replicao do genoma (complexo polimerase PA+PB1+PB2). No entanto, o vrus necessita subtrair componentes celulares (oligonucleotdeos com cap) para a produo de seus RNA mensageiros (mRNA). Durante o ciclo, as protenas no-estruturais (PA+PB1+PB2) e algumas estruturais (NP, M1), produzidas no citoplasma, so importadas para o ncleo, onde participam de ciclos adicionais de transcrio e replicao e, tardiamente, participam da formao dos nucleocapsdeos. Os vrus da inuenza se multiplicam com ecincia em embries de galinha e podem ser adaptados a replicar em broblastos de pinto e
Orthomyxoviridae
729
em linhagens celulares de mamferos (p. ex.: clulas MDCK, de origem canina). A replicao em cultivo celular, principalmente de isolados recentes, pode no produzir efeito citoptico evidente. Assim, o vrus pode ser detectado e quanticado no sobrenadante dos cultivos (ou no lquido amnitico dos ovos embrionados) pela tcnica de hemaglutinao (HA); e pode ser identicado/ tipicado por inibio de hemaglutinao (HI) com um soro tipo ou subtipo especco.
4.1 Adsoro e penetrao

Os vrus da inuenza utilizam molculas de cido silico (AS) como receptores. Essas molculas esto presentes em uma variedade de glicoprotenas e glicolipdios de membrana. A ligao dos vrions a estes componentes mediada pela glicoprotena HA. A ligao qumica que mantm o AS associado s glicoprotenas pode ser de dois tipos principais: 2,3 e 2,6. O tipo de ligao do AS responsvel pela especicidade de espcie e de tropismo tecidual dos vrus da inuenza. A HA de alguns vrus somente capaz de se ligar ao AS na ligao 2,3, enquanto outros se ligam a molculas com a conformao 2,6. A traquia humana contm AS predominantemente com ligao do tipo 2,6, enquanto o intestino das aves contm ligaes do tipo 2,3. J o trato respiratrio dos sunos possui o AS com os dois tipos de ligao: 2,3 e 2,6. A especicidade da HA por ligaes 2,3 ou 2,6 um fator fundamental para a capacidade desses vrus infectar a sua espcie hospedeira e outras espcies. Assim, os vrus avirios que adquirem a capacidade de se ligar ao AS na conformao 2,6 podem infectar humanos. J os sunos podem ser ocasionalmente infectados com vrus avirios e humanos, pois possuem o AS com os dois tipos de ligao. A ligao de uma nica molcula de HA a uma molcula de AS de baixa anidade e, assim, so requeridas mltiplas (dezenas ou centenas) interaes simultneas para permitir a adsoro e posterior penetrao dos vrions. Imediatamente aps a adsoro, os vrions so internalizados por endocitose mediada por clatrina e se localizam em vesculas endocticas que se dirigem para o interior do citoplasma.
Durante o trnsito, as vesculas so acidicadas gradativamente pela ao de ATPases, que bombeiam prtons H+ para o seu interior. Atravs das aberturas mediadas pela M2, os prtons H+ penetram tambm no interior dos vrions. A acidicao dos endossomos resulta em dois efeitos para a penetrao do vrus. Primeiro: provoca alteraes conformacionais na HA, que resultam na exposio do peptdeo fusognico e fuso do envelope com a membrana endoctica. Segundo: o pH baixo no interior dos vrions facilita a dissociao entre as RNPs e a protena M1, promovendo o desnudamento parcial e permitindo a liberao das RNPs no interior do citoplasma. A droga amantadina utilizada como teraputico antiviral inibe a ao da M2, resultando em penetrao e desnudamento inecientes do vrus. Drogas que previnem a acidicao dos endossomos (monensina, cloroquina, cloreto de amnio) tambm previnem a penetrao dos vrus da inuenza em clulas de cultivo. Uma vez dissociados da M1 e liberados no interior do citoplasma, as RNPs so transportadas para o ncleo, onde penetram ativamente pelos poros nucleares. As protenas que compem o complexo RNP contm sinais de localizao nuclear que promovem a sua importao para o ncleo celular.
4.2 Transcrio
A transcrio dos RNA genmicos realizada pelo complexo transcriptase/replicase, que est associado com as RNPs, e cada protena deste complexo desempenha funes diferentes. A PB1 possui atividade endonuclease, necessria para a subtrao de oligonucleotdeos celulares que servem de primers para o incio da transcrio. A PB2 possui atividade polimerase e se constitui na replicase viral, realizando as funes de transcrio e replicao do genoma. A funo exata da PA no conhecida, mas esta protena um componente essencial do complexo. A transcrio se inicia logo aps a penetrao das RNPs no ncleo, e cada segmento genmico transcrito individualmente, originando mRNA com cap e poliA. A transcrio precedida pela clivagem e subtrao de segmentos de mRNAs
730
Captulo 28
celulares. Os oligonucleotdeos subtrados correspondem aos primeiros 8 a 13 nt dos mRNA e possuem cap na extremidade 5. Essa atividade atribuda PB1, que possui atividade endonuclease, ou seja, essa enzima literalmente furta segmentos de mRNAs celulares para benefcio do vrus. Os oligonucleotdeos subtrados pareiam com uma pequena seqncia prxima a extremidade 3 do RNA genmico e servem de primers para o incio da transcrio. Como resultado da polimerizao a partir da extremidade 3 desses primers, os mRNA virais sintetizados possuem a estrutura cap, que necessria para a sua traduo. A transcrio termina 15 a 22 nt antes da extremidade 5 de cada segmento, e seguida pela adio de uma cauda de poliA. Os mRNAs virais
no so, portanto, exatamente complementares aos RNAs genmicos: possuem uma extenso de 8 a 13 nt em sua regio 5 e no possuem os 15-22 nt terminais, sendo substitudos por uma cauda poliA (Figura 28.4). Os transcritos produzidos a partir dos segmentos 7 e 8 sofrem processamento por splicing e originam mRNAs que so traduzidos em mais de uma protena. No segmento 7, so gerados trs mRNAs: um codica a protena M1 (dois teros anteriores do mRNA), outro codica a protena M2 (tero nal do gene) e um terceiro contm uma ORF de 27 nt cuja traduo incerta. O segmento 8 origina um transcrito que resulta em dois mRNAs aps o splicing: um codica a protena no-estrutural NS1 e o outro traduzido na protena NS2 (ver Tabela 28.1).
Traduo
B. mRNA
Cap-5---------GAGCGAAAGCAGG
8-13nt
AAA(n)-3
15-22nt
Transcrio (1) Cap-5---------GA 3-UCGCUUUCGUCC

A. RNA genmico (-)
8-13nt
GGAACAAAGAUGA-5 2 Replicao 3
5-AGCGAAAGCAGG
C. RNA antigenmico (+)
CCUUGUUUCUACU-3
Figura 28.4. Estrutura dos RNAs produzidos durante a replicao do vrus da influenza. (A) RNA genmico (vRNA); (B) mRNA; (C) RNA antigenmico. A transcrio para a sntese de mRNA utiliza nucleotdeos com cap subtrados dos mRNA celulares (1). Os mRNA apresentam uma extenso de 8-13 nt (com cap) em relao ao vRNA e os 15-22 nucleotdeos terminais so substitudos por uma cauda poliA. A primeira etapa da replicao do genoma envolve a sntese do RNA de sentido antigenmico que exatamente complementar ao vRNA (2). A segunda etapa da replicao envolve a sntese do vRNA a partir do RNA antigenmico (3). Note que os mRNAs diferem dos RNA antigenmicos, pela presena de 8-13 nt adicionais com cap e cauda poliA.
Orthomyxoviridae
731

A replicao dos RNA genmicos (vRNA) ocorre em duas etapas: sntese do RNA antigenmico ou complementar e sntese de vRNA utilizando o RNA antigenmico como molde. A sntese do RNA antigenmico no envolve a subtrao de oligonucleotdeos de mRNA celulares; inicia-se exatamente na extremidade 3 do genoma e termina exatamente na extremidade 5. Dessa forma, os RNAs antigenmicos so exatamente complementares aos vRNAs (Figura 28.4). Os dois tipos de transcrio observados durante a replicao desses vrus, ou seja, a transcrio dependente dos oligonucleotdeos com cap (para a produo de mRNA) e a transcrio independente de primer (para a produo de RNA antigenmico) parecem envolver complexos transcriptase/replicase diferentes. A antiterminao, que permite ao complexo transcriptase seguir transcrevendo at o nal do segmento e produzir a cpia antigenmica completa parece ser dependente do acmulo da protena NP. Dessa forma, o acmulo desta protena e alteraes especcas na composio do complexo polimerase seriam os responsveis pela transio entre transcrio e replicao. Essa transio ocorre em fases avanadas do ciclo e culmina com a produo dos RNAs genmicos (tambm chamados de vRNAs) para serem incorporados nos vrions. Em todas as etapas da replicao, os RNAs de sentido antigenmico e genmico so rapidamente conjugados com mltiplas cpias da protena NP. As RNPs, contendo os RNA antigenmicos, permanecem no ncleo para servirem de molde para a sntese de mais cpias de RNA genmico. Em contraste, as RNPs que contm os RNA genmicos so ecientemente exportadas para o citoplasma, principalmente em fases tardias do ciclo.

Os ortomixovrus completam a sua morfognese e so liberados das clulas hospedeiras pelo brotamento dos nucleocapsdeos na membrana plasmtica. Nesse processo, o envelope que contm as glicoprotenas virais passa a se
constituir no envoltrio externo dos vrions. O processo de morfognese depende da sntese e direcionamento especcos das diferentes protenas virais. As protenas NP, PA, PB1 e PB2 so produzidas em ribossomos livres no citoplasma e importadas para o ncleo. Em fases iniciais do ciclo, essas protenas participam da transcrio e replicao. Em fases tardias, associam-se com o RNA genmico, formando as RNPs, que so exportadas para o citoplasma e transportadas para a membrana plasmtica. A M1 se conjuga com as RNPs e participa da sua exportao para o citoplasma e tambm transportada para a face interna da membrana plasmtica. As glicoprotenas HA e NA e a protena M2 so produzidas em ribossomos associados ao retculo endoplasmtico (RE). Durante a sua sntese, essas protenas cam inseridas na membrana do RE, com as regies externas orientadas para o lmen. Nesta organela, as protenas sofrem modicaes ps-traduo (mais notavelmente glicosilao) e so transportadas at o aparelho de Golgi, onde sofrem processamentos adicionais. As glicoprotenas so transportadas at a membrana plasmtica em vesculas derivadas do aparelho de Golgi. Durante o transporte, a molcula precursora da HA (HA0) sofre clivagem proteoltica, originando a HA1 e HA2. Esses dois polipeptdeos permanecem unidos por pontes dissulfeto e formam a estrutura madura da HA. Nessa etapa, a M2 impede a acidicao excessiva dessas vesculas, permitindo a sada de prtons H+ para o citoplasma. Isso evita que a HA sofra precocemente as alteraes conformacionais necessrias infectividade viral. Acredita-se que a trimerizao das molculas de HA e a tetramerizao da NA ocorram durante o transporte ou imediatamente aps a fuso das vesculas com a membrana celular. As vesculas contendo as glicoprotenas e a M2, eventualmente, fusionam com a membrana e, assim, as protenas virais do envelope tornamse inseridas na membrana plasmtica. Tem sido observado que os trmeros de HA se distribuem uniformemente, em determinadas reas da superfcie celular, enquanto os tetrmeros da NA e M2 se concentram em determinados locais. O brotamento inicia com a interao das RNPs com as caudas das glicoprotenas, provavelmente mediado pela protena M1 que reveste
732
Captulo 28
internamente a membrana nesses locais ou est associada com as RNPs. A seguir, os complexos contendo as oito RNPs se inserem na membrana, adquirindo o envelope e sendo liberados da clula hospedeira. Acredita-se que a atividade neuraminidase da NA impea que os vrions egressos quem aderidos membrana, devido ligao da HA com molculas de cido silico. A produo de partculas vricas infecciosas depende da incluso de, pelo menos, uma cpia de cada RNA genmico por vrion. possvel que o empacotamento dos segmentos genmicos ocorra ao acaso, sem qualquer tipo de seleo. Partculas vricas, contendo mais ou menos de oito segmentos, podem facilmente ser detectadas, o que compatvel com o empacotamento ao
acaso. Assim, se oito segmentos forem incorporados em cada novo vrion, um em cada 400 vrions conteria o conjunto completo de segmentos. Este nmero situa-se dentro da relao entre o total de partculas e o nmero de partculas infecciosas observada em preparaes do vrus, ou seja, uma proporo muito grande de partculas produzidas no infecciosa, provavelmente por no conter o conjunto completo de RNAs genmicos. Por outro lado, evidncias indicam que pode haver algum tipo de seleo que favorece a incluso consistente de alguns segmentos genmicos, principalmente o segmento 1. Neste caso, o empacotamento dos segmentos no seria totalmente ao acaso. O ciclo replicativo dos ortomixovrus est ilustrado esquematicamente na Figura 28.5.
Orthomyxoviridae
733
5 Gentica dos vrus da inuenza

Em seus hospedeiros naturais as aves aquticas e migratrias os vrus da inuenza so geneticamente estveis e apresentam taxas mnimas de mutao e evoluo ao longo do tempo. Isso indica uma relao ancestral e reete uma perfeita adaptao do vrus com os seus hospedeiros. No entanto, quando so transmitidos para outras espcies (mamferos ou aves), esses vrus iniciam um processo de rpida evoluo gentica, sobretudo devido a mutaes em ponto nos genes que codicam as glicoprotenas de superfcie. A evoluo dos vrus da inuenza deve-se a dois mecanismos genticos principais: mutaes em ponto e ressortimento. As mutaes em ponto surgem ao acaso durante a replicao do genoma e devem-se baixa delidade da polimerase viral, que introduz nucleotdeos incorretos durante a sntese das novas molculas de RNA. Quando ocorrem nos genes das glicoprotenas HA e NA, essas mutaes podem resultar em alteraes dos stios reconhecidos por anticorpos neutralizantes. Isso representa uma vantagem evolutiva para os vrus mutantes, que podem escapar da neutralizao e serem transmitidos a novos hospedeiros. As alteraes antignicas nas glicoprotenas de superfcie (principalmente a HA), causadas pelo acmulo gradual de mutaes em ponto, so denominadas antigenic drift. Essas alteraes so responsveis pelos variantes que surgem continuamente e que permitem ao vrus da inuenza humana se perpetuar na populao, apesar da resposta imunolgica dos hospedeiros. Esse tipo de evoluo parece ser mais freqente e efetivo nos vrus da inuenza A. A natureza segmentada do genoma desses vrus permite a produo ocasional de recombinantes que possuem segmentos de dois vrus parentais. Esse tipo de recombinao, denominada ressortimento, pode ocorrer em infeces mistas por vrus de um mesmo tipo (A, B ou C), e no entre vrus de tipos diferentes (Figura 28.6). O ressortimento permite uma evoluo rpida desses vrus e tem sido associado com variantes responsveis por pandemias de grandes dimenses em humanos, como as de 1957 e 1968.
Figura 28.6. Ilustrao demonstrando o ressortimento entre dois vrus da influenza. No exemplo, um suno infectado simultaneamente com um vrus avirio e outro humano. A co-infeco resulta no ressortimento entre esses dois vrus, com o qual o vrus de humano adquire o gene da hemaglutinina (HA) do vrus avirio. Esse recombinante possui propriedades antignicas e patognicas diferentes dos dois vrus parentais, e pode, potencialmente, infectar aves domsticas e selvagens, e tambm humanos. Os sunos se constituem na principal espcie em que ocorrem esses eventos, pois podem ser infectados tanto por vrus de mamferos como avirios.
Os recombinantes podem resultar do ressortimento entre vrus da mesma espcie ou de espcies diferentes. O surgimento de vrus recombinantes que possuem as glicoprotenas HA e/ou NA adquiridas de um vrus de outra
734
Captulo 28
espcie apresenta especial interesse, pois altera drasticamente as caractersticas antignicas do vrus, evento denominado antigenic shift. O ressortimento entre vrus da inuenza tem sido responsabilizado pelo surgimento de novas cepas, altamente patognicas e capazes de produzir epidemias de grandes propores, pois as populaes afetadas no possuem imunidade contra os novos tipos de HA e NA presentes nesses novos vrus. Nas epidemias de 1957 e 1968, um vrus avirio realizou ressortimento com um vrus humano preexistente, gerando um terceiro vrus, responsvel pelas epidemias (ver Figura 28.7). A
espcie suna mais propensa a abrigar eventos de ressortimento entre vrus avirios e de mamferos, pois possui o AS nas conformaes 2,3 e 2,6, utilizadas por vrus de aves e de mamferos, respectivamente. Conrmando essa hiptese, recombinantes derivados de ressortimento entre vrus avirios e humanos em sunos foram, subseqentemente, isolados de crianas na Holanda. Alm disso, vrus contendo segmentos genmicos de vrus avirios, humanos e sunos tm sido isolados de sunos nos Estados Unidos desde 1998. Outros exemplos de ressortimento em infeces naturais
Gripe Espanhola 1918
Influenza Asitica 1957
Influenza Hong-Kong 1968
Nova Influenza Pandmica
Influenza H1N1
Influenza H2N2
Influenza H3N2
Vrus avirio (?)

ou
H1N1 humano
H2N2 avirio
Vrus avirio
H3N2 humano
Transmisso do vrus avirio H1N1 para humanos
H2N2 humano
H3 avirio
Ressortimento
Ressortimento
Ressortimento
?
Os oito segmentos se originaram de um vrus avirio
Novos HA, NA e PB1 avirios + cinco segmentos de RNA do vrus de 1918 Novos HA e PB1 avirios + cinco segmentos de RNA do vrus de 1918 Oito segmentos novos ou mais uma derivao do vrus de 1918
Adaptado de Webster et al. (2006)
Figura 28.7. Mecanismos responsveis pelo surgimento de vrus pandmicos da influenza A em humanos. O vrus que causou a gripe espanhola de 1918 (H1N1) era um vrus avirio que se adaptou a humanos (continha os oito segmentos genmicos de vrus avirio). Os vrus associados com as pandemias de 1957 e 1968 foram originados pelo ressortimento entre os vrus humanos ento circulantes (H1N1 e H2N2, respectivamente) e vrus avirios. Antecipase que cepas capazes de causar grandes epidemias podem ser originadas por qualquer destes mecanismos. O vrus H5N1 um dos candidatos a causar uma pandemia em humanos, caso adquira a capacidade de ser transmitido entre pessoas.
Orthomyxoviridae
735
incluem um vrus suno H1N1, que foi isolado de pessoas, e um H3N2, tambm suno, isolado de perus nos EUA. Independentemente de ressortimento, vrus de determinadas espcies podem, ocasionalmente, adaptar-se, infectar e se tornar patognicos para outras espcies animais. Exemplos desses eventos so abundantes na literatura. O vrus que causou a gripe espanhola, em 1918, originou-se de aves, e todos os segmentos genmicos tiveram origem em um vrus avirio (Figura 28.7). Esse vrus foi inicialmente transmitido para humanos ou sunos, e depois se disseminou na populao humana. Vrus da inuenza A de sunos freqentemente so transmitidos para humanos, com conseqncias que variam desde infeces subclnicas at doena fatal. Desde 1974, pelo menos dez desses eventos foram bem documentados nos Estados Unidos, Europa e Nova Zelndia. Da mesma forma, vrus humanos podem ser transmitidos para sunos, podendo disseminar-se, proporcionando condies para a ocorrncia de ressortimento com vrus dessa espcie. Recentemente, os casos de infeco de ces com o H3N8 eqino e de diversas espcies com o H5N1 avirio demonstram que a barreira entre espcies pode ser ultrapassada, mesmo sem a ocorrncia de ressortimento entre diferentes vrus. Em resumo, os vrus da inuenza A apresentam uma especicidade de hospedeiro relativa e podem, ocasionalmente, via ressortimento ou mutaes em determinados genes, adaptar-se e ser transmitidos a outras espcies.
enfermidade tem sido alvo de intensos estudos nas ltimas dcadas. Os maiores avanos nos conhecimentos sobre a inuenza eqina incluem o reconhecimento de uma contnua variao antignica do subtipo A/equi/2 (H3N8), a emergncia de um novo vrus H3N8 a partir de um pool de genes de vrus avirios na China, e a recente ocorrncia da infeco cruzada de ces com o subtipo H3N8 nos Estados Unidos. O vrus da inuenza eqina (EIV) classicado no gnero inuenzavirus A, juntamente com os inuenzavrus que infectam humanos, sunos e aves. Os inuenzavrus do tipo A so divididos em subtipos de acordo com diferenas antignicas nas glicoprotenas do envelope, HA e NA. Nesse sentido, dois subtipos do EIV foram identicados como causadores da enfermidade em eqinos, o subtipo H7N7 ou equi-1; e o subtipo H3N8 ou equi-2. O subtipo H3N8 tem sido identicado em todos os surtos recentes, enquanto o H7N7 foi descrito, pela ltima vez, em 1979. Mutaes em ponto nos genes das glicoprotenas HA e NA do subtipo H3N8 permitem ao vrus escapar da vigilncia imunolgica do hospedeiro e, conseqentemente, disseminar-se na populao.
6.1.1 Epidemiologia
Os EIVs se constituem nos principais agentes de doena respiratria em eqinos em vrios pases. A enfermidade passou a ser diferenciada das demais viroses respiratrias de eqdeos a partir de 1956, quando o vrus A/equi/Prague/1/56 (H7N7) foi isolado, pela primeira vez, durante uma epizootia na Europa Central. Posteriormente, em 1963, um segundo vrus foi isolado nos Estados Unidos e foi classicado como H3N8 (A/ equi/Miami/2/63). Desde ento, vrios surtos relacionados ao EIV, principalmente ao subtipo H3N8, tm sido descritos em cavalos, mulas e asnos em diversas regies, com exceo de alguns pases, como Austrlia, Nova Zelndia e Islndia, que permanecem livres da enfermidade. As evidncias dos casos de inuenza eqina, nos ltimos 20 anos, indicam que o subtipo H7N7 est presente na populao em nveis muito baixos ou pode at mesmo ter sido extinto. No entanto, a maioria dos pases continua inserindo este subtipo na formulao das vacinas, uma vez
6 Infeces de importncia em veterinria causadas por ortomixovrus

6.1 Inuenza eqina
A inuenza ou gripe eqina uma enfermidade que afeta as vias areas superiores dos eqinos e se caracteriza pela disseminao rpida entre animais susceptveis. A doena ocorre geralmente sob a forma de epizootia. A gripe eqina trata-se de uma das enfermidades respiratrias mais importantes dessa espcie devido aos prejuzos econmicos causados, principalmente em animais de competio. Por essas razes, a
736
Captulo 28
que variantes antignicas do vrus poderiam ocasionar epizootias de grandes propores. A introduo e o uso extensivo de vacinas inativadas na Amrica do Norte e na Europa, no nal da dcada de 1960, reduziram a morbidade e severidade da doena. Entretanto, a infeco no foi controlada com sucesso. Quando uma nova variante antignica originada, epizootias graves ocorrem e so caracterizadas pela rpida disseminao e por surtos explosivos, envolvendo at 98% dos animais susceptveis expostos. Eqinos de todas as idades so susceptveis infeco pelo EIV, principalmente aqueles que no tenham sofrido exposio prvia ao agente ou que no tenham sido vacinados. No entanto, a enfermidade tem maior prevalncia em animais com idade inferior a dois anos. Alm disso, a enfermidade aparece com maior freqncia em animais que so transportados por longas distncias ou connados em locais pouco ventilados. O transporte e a aglomerao dos animais em locais escuros, com pouca ventilao, favorecem a ocorrncia da enfermidade. A enfermidade caracteriza-se pela alta morbidade e baixa mortalidade. A transmisso do vrus ocorre pelo contato direto ou indireto entre animais ou por meio de aerossis contendo partculas vricas infecciosas. Eqinos em fase de convalescena continuam excretando o vrus nas secrees nasais por um perodo de at 10 dias. As epizootias surgem quando um ou mais animais em fase subclnica (ou de incubao) ou convalescente so introduzidos em uma populao susceptvel. A severidade do surto depende das caractersticas antignicas do vrus circulante e do estado imunolgico da populao no momento da exposio. Os surtos de inuenza podem ocorrer em qualquer poca do ano, mas so mais comuns no outono, inverno e primavera, devido mistura, connamento e concentrao de animais jovens para treinamentos, exposies ou para a venda. O estresse induzido por essas atividades pode aumentar a susceptibilidade infeco, bem como, freqentemente, propicia ambientes escuros e pouco ventilados que favorecem a transmisso do vrus. A enfermidade encontra-se amplamente disseminada na populao eqina do Brasil. As
evidncias da disseminao da infeco pelo EIV no rebanho eqino brasileiro incluem o isolamento e a deteco de anticorpos contra o vrus. O EIV j foi isolado de eqinos com doena respiratria em vrios estados brasileiros, incluindo So Paulo, Rio de Janeiro, Mato Grosso do Sul e Rio Grande do Sul. A caracterizao desses isolados demonstrou que todos pertencem ao subtipo Equi-2 ou H3N8. Alm de isolamentos, evidncias sorolgicas da infeco conrmam a ampla disseminao do agente no rebanho eqino brasileiro. Estudos sorolgicos realizados no Rio Grande do Sul, no Par e no Rio de Janeiro demonstram prevalncias de 65,7, 35,79 e 42,06%, respectivamente. Alm disso, um estudo sorolgico, realizado com amostras provenientes das regies Norte, Nordeste, Sudeste e Sul, demonstrou altos ndices de soropositividade em todas as regies amostradas.

A infeco natural pelo EIV ocorre pela inalao de partculas vricas presentes em aerossis, por contato direto ou indireto. A maioria das partculas inaladas deposita-se sobre a camada de muco que recobre as vias areas superiores. No entanto, algumas partculas conseguem penetrar mais profundamente e atingem as vias areas inferiores. A infeco das clulas do epitlio ciliar e a replicao viral nessas clulas levam sua destruio e conseqente liberao de partculas vricas infecciosas. A prognie viral se dissemina pelo trato respiratrio superior, incluindo os seios nasais, a nasofaringe, a faringe e a traquia. A superfcie epitelial dessas regies torna-se descamada e sem clios. Conseqentemente, alguns receptores so estimulados, causando a hipersecreo das glndulas serosas presentes na submucosa, prejudicando a funo de proteo do epitlio muco-ciliar. Essas alteraes permitem a invaso por patgenos oportunistas, como o Streptococcus zooepidemicus ou Pasteurella spp, e, conseqentemente, a complicao da enfermidade. A infeco das clulas do epitlio respiratrio leva hiperemia, edema, necrose, descamao e eroses focais no epitlio. Alm disso, ocorre pro-
Orthomyxoviridae
737
duo de um exsudato rico em protenas nas vias areas e nos alvolos. A interrupo da proteo muco-ciliar resulta em falha nos mecanismos de limpeza e, conseqentemente, no acmulo de secrees. A funo macrofgica alveolar tambm ca prejudicada. A regenerao do epitlio respiratrio leva pelo menos trs semanas, mesmo na ausncia de infeces bacterianas secundrias. A severidade e a durao dos sinais clnicos dependem da dose e virulncia da cepa viral, das condies ambientais e de manejo, e das defesas do hospedeiro, principalmente da imunidade prvia. O perodo de incubao geralmente de um a trs dias, podendo variar de 18 horas a sete dias. O aparecimento dos sinais sbito, sendo a hipertermia (39,1-41,7C) o primeiro sinal clnico a ser evidenciado. Essa febre pode ser bifsica, com durao de um a cinco dias em casos no-complicados. A fase febril freqentemente acompanhada por letargia, fraqueza, anorexia, secreo nasal serosa e tosse seca. Alm disso, so descritos secreo lacrimal, aumento de volume dos linfonodos da cabea, edema dos membros, laminite e pneumonia. Animais com infeces no-complicadas geralmente recuperam-se em duas a trs semanas. A recuperao dos animais est diretamente relacionada com o grau de contaminao secundria e com o tipo de repouso ao qual o animal submetido durante a enfermidade.
Tem sido demonstrado que a infeco pelo EIV induz resposta celular por linfcitos T citotxicos (CTL) e resposta humoral no trato respiratrio de forma semelhante observada na inuenza humana.
6.1.4 Diagnstico
Surtos de doena respiratria em eqinos podem ser causados por vrios agentes infecciosos, incluindo o vrus da arterite, os herpesvrus, rinovrus, adenovrus, alm de bactrias como Streptococcus equi, S. zooepidemicus ou S. pneumoniae. O diagnstico presuntivo da inuenza eqina, com base nos sinais clnicos e na rpida disseminao, deve ser conrmado pelo isolamento do vrus ou por de testes sorolgicos. Tradicionalmente, a conrmao laboratorial de uma suspeita clnica de inuenza tem sido realizada pelo isolamento do vrus a partir de secrees nasais ou por testes sorolgicos. Atualmente existe uma ampla variedade de testes laboratoriais de deteco de antgenos, cido nuclico e clulas infectadas, que permitem a obteno do diagnstico mais rapidamente. O isolamento do EIV realizado pela inoculao das amostras de secreo nasal na cavidade alantide ou amnitica de ovos embrionados de galinha. O vrus pode ser adaptado para replicar em cultivos de clulas, incluindo de origem canina (MDCK), mas o isolamento inicial geralmente feito em ovos embionados. Nos ovos inoculados, a presena do vrus demonstrada pela prova de hemaglutinao, utilizando-se eritrcitos de galinha. Para a conrmao da etiologia e caracterizao do vrus isolado, realiza-se a prova de HI, utilizando-se um soro imune especco. Testes imunoenzimticos (ELISA) de captura tm sido utilizados no diagnstico da inuenza humana e esto sendo padronizados para a deteco rpida de antgenos do vrus A/equi/2 em suabes nasais de animais suspeitos. A tcnica de IFA tambm tem sido empregada para a deteco de antgenos do EIV em clulas do trato respiratrio, obtidas por raspado nasal ou lavado traqueal. Alm desses mtodos de deteco de antgenos, a reao em cadeia da polimerase (PCR) tambm vem sendo utilizada para a deteco do cido nuclico viral.
6.1.3 Imunidade
Uma caracterstica importante do EIV ausncia de proteo cruzada entre os dois subtipos, H7N7 e H3N8. Essa caracterstica torna necessria a incluso dos dois subtipos na formulao de vacinas. A durao da imunidade protetora conferida pela vacinao de trs a quatro meses, dependendo do histrico prvio de vacinao e da dose do desao. No entanto, mesmo animais que tenham sido regular e recentemente vacinados podem se infectar e excretar o vrus. As variaes antignicas dos vrus de campo podem reduzir a qualidade e a durabilidade da imunidade conferida pela infeco natural ou pela vacinao, pois anticorpos cruzados neutralizam o vrus menos ecientemente do que anticorpos contra o vrus homlogo.
738
Captulo 28
Os mtodos sorolgicos tambm so muito usados para a conrmao do diagnstico de inuenza. No entanto, a necessidade de coleta de soro pareado com intervalos de 14 a 21 dias, constitui-se em uma das principais limitaes para a sua utilizao. Os testes utilizados para a deteco de anticorpos contra o EIV incluem a HI, xao do complemento (CF), soro neutralizao (SN) e ELISA. O teste de HI o teste padro para a deteco de anticorpos contra o EIV e permite a diferenciao entre os dois subtipos do vrus, uma vez que os anticorpos inibidores da hemaglutinao so especcos para cada subtipo do vrus.
6.1.5 Prolaxia e controle

A natureza altamente infecciosa e contagiosa do EIV requer a realizao de quarentena de todos os animais com sinais respiratrios por pelo menos sete semanas para prevenir uma maior disseminao da infeco. Particular ateno deve ser dada aos potros e animais jovens, que devem ser mantidos afastados dos animais doentes. Alm disso, necessrio que os equipamentos utilizados para a manipulao dos animais doentes no sejam utilizados nos animais sadios. Os tratadores e veterinrios devem realizar o tratamento e a manipulao dos animais doentes aps terem manejado os animais sadios, evitando o contato com os eqinos saudveis aps terem entrado em contato com os animais doentes. A preveno tambm pode ser feita pela vacinao com vacinas inativadas. No entanto, a imunidade conferida de curta durao e reforos freqentes so necessrios. Alguns estudos demonstram que, no mnimo, 70% de uma populao precisa ser vacinada para que epidemias da enfermidade sejam prevenidas. Tipicamente, a gerao de vacinas que est disponvel atualmente consiste de vacinas com vrus inativado, contendo adjuvantes para potencializar a imunogenicidade. Usualmente a mistura de vrus inclui uma cepa viral do subtipo equi-1 (H7N7) e outra do subtipo equi-2 (H3N8). A razo para incluir mltiplas cepas na formulao das vacinas a possibilidade de mutaes nas cepas circulantes, resultando em variantes antignicas.
Os programas de vacinao para a inuenza eqina consistem em uma primeira vacinao, seguida por uma segunda dose com trs a seis semanas de intervalo. Alm disso, so necessrios reforos semestrais ou anuais, dependendo das recomendaes do fabricante. Os surtos de inuenza eqina no so sazonais, como na inuenza humana, mas so freqentemente associados a feiras e competies. Por isso, a revacinao dos animais antes desses eventos recomendada. As guas gestantes devem ser vacinadas um ms antes do parto, e os potros devero receber a primeira dose da vacina aps o decrscimo da imunidade colostral, por volta dos quatro a seis meses de idade. Novas tecnologias esto sendo desenvolvidas para resolver o problema da curta durao da imunidade conferida pelas vacinas inativadas. Na Europa, vacinas contendo complexos imunoestimulantes (ISCOMs) foram desenvolvidas, mas, aps quatro anos de uso e testes a campo, no foi demonstrada a sua superioridade em relao s vacinas convencionais. Vacinas vivas atenuadas, algumas obtidas por recombinao gentica, tambm esto em fase de pesquisa e testes.
6.2 Inuenza suna

A inuenza suna (swine inuenza, SI) uma enfermidade respiratria, infecciosa e aguda, causada pelo vrus da inuenza suno tipo A (SIV). Os sinais clnicos caractersticos so: tosse, dispnia, febre, anorexia e prostrao, seguidos de rpida recuperao. A gravidade da infeco varia de acordo com a cepa viral, idade do animal, condio imunolgica e presena de infeces concomitantes. Os sinais clnicos e leses geralmente apresentam rpida regresso, mas casos de pneumonia fatal podem ocorrer ocasionalmente. A primeira descrio da doena data de 1918, no Meio-Oeste dos Estados Unidos, na mesma poca em que ocorria a maior pandemia de inuenza humana, responsvel pela morte de mais de 20 milhes de pessoas. A doena em sunos apresentava muitas semelhanas clnicas e patolgicas com a inuenza humana. O isolamento do agente foi realizado em 1930 e, nos anos seguintes, foram realizados vrios estudos
Orthomyxoviridae
739
sobre imunidade, transmisso, hospedeiros, relaes antignicas com os outros vrus da inuenza, formas de manuteno na natureza, entre outros. At 1975 existiam poucos relatos da doena em outros pases alm dos Estados Unidos, mas a partir dessa poca, vrios casos de doena clnica e rebanhos com sorologia positiva foram descritos em diferentes pases.
como 2,6, e, por isso, podem potencialmente ser infectados por vrus avirios e humanos. Por essa caracterstica, a espcie suna considerada o recipiente de ressortimento entre vrus avirios e de mamferos.
6.2.2 Epidemiologia
O isolamento do vrus H1N1 (A/swine/ Iowa/15/30) e estudos sorolgicos retrospectivos em humanos sugerem que o vrus de sunos antigenicamente semelhante ao vrus de humanos, responsvel pela pandemia de 1918. Estudos recentes indicam que esse vrus se originou de um vrus avirio, pois todos os seus oito segmentos genmicos so muito semelhantes aos encontrados em vrus de aves. A dvida que permanece a de quais hospedeiros foram infectados primeiro: sunos ou humanos? Desde 1918 o agente permanece circulante na populao suna e responsvel por doena em rebanhos sunos na Amrica do Norte. O vrus circula na populao suna ao longo do ano, mas os surtos so mais freqentes no nal do outono e inverno. O aparecimento da doena est associado principalmente com a movimentao de animais e introduo de animais nos rebanhos. A principal forma de transmisso a direta, pela via nasofarngea, por contato com secrees nasais de animais na fase febril da infeco. Em regies com alta densidade de sunos, a disseminao aergena pode ser importante, especialmente nas populaes sem imunidade. A morbidade pode chegar a 100%, mas a mortalidade baixa (1% ou menos). O H1N1 clssico o subtipo mais comumente identicado e estima-se que 25% da populao de sunos do mundo possua sorologia positiva para este agente. Nos Estados Unidos, 30% dos sunos apresentam sorologia positiva para o subtipo H1N1 e, na regio Centro-Norte daquele pas, 51% dos sunos so positivos. Na Blgica, entre 2001 e 2003, foram identicadas matrizes com anticorpos para dois (48%) ou trs subtipos virais (31%) de inuenza suna. Outros subtipos j relatados em sunos incluem o H9N2, H1N2 (derivado de vrus de aves), H1N7 (derivado de vrus de humanos e eqinos) e H4N6. O H1N1
6.2.1 Caractersticas do vrus

Os sunos so susceptveis infeco com diferentes variantes do SIV, incluindo os vrus H1N1, clssicos de inuenza suna circulantes nos Estados Unidos desde o incio do sculo XX. A espcie suna tambm susceptvel ao H1N1 recombinante (ressortante), que contm glicoprotenas de superfcie do vrus clssico e protenas internas de vrus mais recentes como o H3N2 ou H1N2. Outros subtipos isolados de sunos incluem o H1N7 e H9N2. A imunidade contra o H1N1 no protege contra o H3N2 e caractersticas antignicas do H1N1 clssico e das variantes de H1N1 de aves indicam que esses vrus permanecem conservados desde sua introduo na populao suna. Os H3N2 so vrus menos estveis, e isolados mais recentes apresentaram algumas variaes antignicas quando comparados ao prottipo. O gene da HA do SIV no apresenta muita variao antignica e uma das hipteses para esse fato a falta de presso de seleo, j que existem sempre muitos sunos sem imunidade prvia ao agente na populao susceptvel. A regio globular da HA do vrus responsvel pela ligao aos receptores celulares AS ou acetil-neuramnico. O tipo de ligao do AS com a galactose na molcula de glicolipdio difere entre os hospedeiros dos vrus da inuenza, e o tipo de ligao o maior determinante de especicidade desses vrus. Em aves, o AS est ligado cadeia de acar na posio 2,3, e os vrus isolados de aves possuem uma HA com alta anidade para este tipo de ligao. Na traquia de humanos, a ligao encontrada do tipo 2,6, e os vrus que infectam humanos tm preferncia por esse tipo de ligao. Os sunos possuem, em seu trato respiratrio, molculas de AS tanto em ligao 2,3
740
Captulo 28
foi isolado de sunos no Japo em 1978; na Frana, em 1987 e 1988, e na Gr-Bretanha, em 1994. O H3N1 e H1N7 foram isolados na Gr-Bretanha em 1990. No Brasil, at o momento, no existem casos conrmados de inuenza suna. A infeco de sunos com o H3N2 de humanos tambm tem sido demonstrada. O vrus A/ Hong Kong/68 foi isolado de sunos no Taiwan, logo aps seu aparecimento na populao humana. A origem dos isolados de sunos difere entre os continentes. O H1N1, predominante na Europa, teve origem em vrus de aves e foi introduzido por patos selvagens na populao suna em 1979. As diferenas entre os vrus tm implicaes prticas para a realizao do diagnstico e controle, e, portanto, as cepas utilizadas para diagnstico na Europa e nos Estados Unidos so diferentes. Em geral, os vrus de inuenza de sunos no infectam humanos. No entanto, j foram relatados alguns casos de infeco de pessoas que trabalhavam diretamente com esses animais. J foram descritos aproximadamente 14 episdios de inuenza por vrus sunos em humanos, com seis mortes por pneumonia. A maioria dos casos foi de pessoas que se infectaram aps contato prximo com sunos. Em 1976, durante um surto em Nova Jersey, EUA, 500 pessoas adoeceram com o vrus H1N1, o mesmo identicado em sunos na poca. No entanto, nunca foi realmente provado que os sunos serviram de fonte de vrus para humanos. Anticorpos contra o SIV foram identicados em diversos pases, em pessoas que mantinham contato prximo com sunos, mas a ocorrncia de doena clnica no freqente. Em um surto em Wisconsin, EUA, em 1988, foram identicados casos de humanos infectados e evidncias sorolgicas da transmisso de pacientes para funcionrios da rea de sade que tiveram em contato com as pessoas infectadas. Como os sunos so susceptveis tanto aos vrus avirios quanto aos vrus humanos, esto freqentemente envolvidos na transmisso interespcies. Os vrus da inuenza aviria no replicam de forma eciente em clulas de humanos e primatas, e os vrus de humanos no replicam bem em clulas de aves. Entretanto, os vrus de aves e de humanos replicam de forma eciente
em clulas de sunos, por isso a recombinao pode ocorrer nas clulas da traquia de sunos. Com a replicao contnua em sunos, alguns subtipos avirios podem passar a reconhecer os receptores de clulas humanas. Uma recente descoberta demonstrou que no apenas os sunos, mas tambm os humanos possuem clulas com os dois diferentes tipos de ligao (2,3 e 2,6). A ligao 2,6 est presente no trato respiratrio superior; e a 2,3, no trato respiratrio inferior. Essa nova descoberta sugere que a transmisso direta de vrus da inuenza de aves para humanos pode ocorrer sem a utilizao do suno como intermedirio do ressortimento gentico. Vrios fatores podem potencialmente limitar a transmisso do SIV de uma espcie para outra, mas esses fatores no so completamente conhecidos. As barreiras impostas pela preferncia de receptores especcos so importantes, entretanto os mecanismos virais ainda so pouco conhecidos.

Os animais se infectam pela inalao de aerossis ou pelo contato direto ou indireto com animais ou secrees contaminadas. A infeco geralmente limitada ao trato respiratrio e viremia raramente detectada. A replicao viral j foi demonstrada na mucosa nasal, tonsilas, traquia, linfonodos traqueobronquiais e pulmes. Clulas positivas para antgenos virais so encontradas no epitlio bronquial aps duas horas de infeco, e, aps 16 horas, podem ser observadas grandes reas infectadas no epitlio bronquial. Antgenos virais tambm podem ser detectados nos septos alveolares aps quatro horas de infeco, e, aps 24 horas, aparecem numerosos focos de infeco nas clulas dos alvolos e ductos. Pouco se sabe sobre a patogenia da inuenza suna, mas estudos sugerem que a produo de citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF-), interferon- (IFN-), e as interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) contribuam para os efeitos inamatrios observados nos pulmes. Os sinais de febre, anorexia e de inamao pulmonar so mais evidentes aps 24 horas de infeco, pero-
Orthomyxoviridae
741
do que coincide com o pico de replicao viral e produo de citocinas. Estudos de hibridizao in-situ demonstram que o vrus H1N2 pode ser detectado nos mesmos tecidos que apresentam leses. Os pulmes so, provavelmente, os principais stios de replicao do SIV. O RNA viral pode ser detectado nas clulas epiteliais dos brnquios, bronquolos, pneumcitos e macrfagos alveolares e intersticiais, e a distribuio varia com o curso e fase da infeco. A deteco do H1N2 no epitlio dos brnquios e bronquolos sugere que as clulas epiteliais desses locais representem os stios iniciais de infeco, e que a replicao viral induz leso nesses tecidos, impedindo a ao dos mecanismos de defesa muco-ciliar. A associao de patgenos, como o vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos (PRRSV), Micoplasma hyopneumoniae, Haemophilus spp e Pasteurella multocida, produz doena respiratria associada com alta mortalidade. Os sinais clnicos observados na inuenza suna incluem anorexia, prostrao e febre. Tambm so observados animais com dispnia e hesitao em se movimentar. A movimentao dos animais pode ser acompanhada de tosse grave. A perda de peso pode ser elevada, mas a mortalidade geralmente baixa, exceto em casos de infeces concomitantes. Os animais se recuperam aps cinco a sete dias, e os sinais clnicos geralmente desaparecem de forma sbita. Alm dos sinais clnicos tpicos, podem ocorrer infeces subclnicas. Fatores como imunidade, idade, presso de infeco, infeces intercorrentes e condies climticas podem determinar a severidade clnica da infeco. No existem evidncias de diferentes graus de virulncia em infeces com diferentes subtipos virais. As leses macroscpicas da forma no-complicada da doena so geralmente de pneumonia viral. As alteraes geralmente so limitadas aos lobos apical e cardaco dos pulmes, entretanto, em casos graves, mais de 50% dos pulmes podem ser afetados. Pode ser evidenciado edema interlobular, e as vias areas podem estar preenchidas por exsudato brinoso tingido de sangue. Pode, ainda, ocorrer aumento de volume dos linfonodos mediastnicos e bronquiais.
As alteraes histolgicas mais freqentes so degenerao e necrose das clulas epiteliais dos brnquios e bronquolos, que podem estar preenchidos por exsudato. Tambm pode ocorrer hiperemia e dilatao dos capilares, com inltrado inamatrio linfoistioplasmocitrio intersticial. Essas leses so mais acentuadas com a variante H1N1.
6.2.4 Imunidade
Nveis elevados de anticorpos tm sido detectados at seis meses aps a infeco. A relao entre a quantidade de anticorpos no soro ou nas vias respiratrias e a resistncia infeco no bem estabelecida, ocorrendo muitas variaes individuais dos sunos aps a exposio. Os anticorpos maternos contra o vrus persistem por dois a quatro meses, variando de acordo com o nvel inicial. Sunos lactentes com anticorpos maternos podem se infectar e excretar o vrus, mas a gravidade dos sinais clnicos e a taxa de excreo viral so inversamente proporcionais ao nvel de anticorpos maternos. Aps a queda na taxa de anticorpos maternos, os sunos podem se infectar novamente, eliminar o vrus e apresentar sinais clnicos da doena.
6.2.5 Diagnstico
Surtos de doena respiratria aguda em sunos, envolvendo um nmero elevado de animais, devem ser necessariamente investigados para inuenza. O diagnstico denitivo requer o isolamento e identicao do vrus ou deteco de anticorpos especcos contra o SIV. O isolamento viral pode ser realizado a partir de suabes, coletados do muco nasal ou do muco da faringe. A fase ideal para a coleta dos suabes o perodo febril, pela maior possibilidade de deteco do vrus. Os suabes devem ser acondicionados em tubos e enviados ao laboratrio no mximo 48 horas aps a coleta, em meio de transporte apropriado. O vrus tambm pode ser isolado do pulmo de animais que morreram ou foram submetidos eutansia na fase aguda da doena.
742
Captulo 28
Ovos de galinha embrionados com 10 dias so muito utilizados para o isolamento de inuenza tipo A. O vrus geralmente no mata o embrio, e o lquido alantide deve ser coletado aps 72 horas de incubao e testado para a presena de atividade hemaglutinante com eritrcitos de galinha. O subtipo pode ser identicado pela tcnica de HI. Podem ainda ser utilizadas a imunouorescncia direta (IFD) para tecidos pulmonares, imunouorescncia indireta (IFI) em clulas do epitlio nasal, imunoistoqumica em tecido xados (IHQ), ELISA e reao em cadeia da polimerase acoplado transcrio reversa (RT-PCR) em tecidos e/ou clulas descamativas do epitlio. Testes sorolgicos para diagnstico de infeco pelo SIV consistem em sorologia pareada pela tcnica de HI, com uma coleta durante a fase aguda e a segunda trs a quatro semanas aps, para investigar o aumento do nvel de anticorpos.
6.3 Inuenza aviria

O primeiro relato da inuenza aviria data de 1878, na Itlia, mas o vrus s foi identicado em 1955. As manifestaes clnicas induzidas pela infeco so principalmente respiratrias e gastrintestinais. No entanto, o vrus pode produzir desde infeco assintomtica at uma enfermidade sistmica ou neurolgica, que pode resultar em taxas de mortalidade de at 100%. No incio, apenas surtos da forma severa da doena eram registrados, mas, posteriormente, observou-se que poderia ocorrer uma forma mais leve da doena causada pelo mesmo vrus. Atualmente sabe-se que existem cepas com dois graus distintos de patogenicidade. As cepas conhecidas como inuenza aviria altamente patognicas (IAAP) so responsveis pela forma severa da doena, que importante na avicultura comercial de todo o mundo. Os vrus de patogenicidade mdia (IAMP) causam infeces que variam desde assintomticas at doena respiratria e gastrentrica. Na literatura cientca, os IAMP so freqentemente denominados como de baixa patogenicidade. No entanto, neste captulo, ser utilizado o termo ocialmente utilizado pela OIE, isto , inuenza aviria de patogenicidade mdia. Os vrus da inuenza aviria so agentes infecciosos de grande interesse tambm para a sade pblica por originarem vrus de alta virulncia para humanos. A seguir, sero descritos alguns aspectos relacionados com vrus da inuenza aviria e da enfermidade em aves.

No existe tratamento especco para a doena. Recomenda-se manter os animais em local limpo e seco e no os transportar durante a fase aguda da enfermidade. Expectorantes e antimicrobianos podem ser utilizados para a preveno de infeces bacterianas secundrias. As medidas de biossegurana auxiliam na preveno da introduo do SIV na populao suna. Como a transmisso do vrus pode ocorrer entre diferentes espcies, as medidas de biossegurana incluem evitar o contato com outras espcies, especialmente aves. Existe uma grande variao na resposta de anticorpos e na proteo de sunos aps a vacinao. Existem vacinas inativadas com os vrus H1N1 e H3N2 nos Estados Unidos e Europa, onde a vacinao contra o SIV uma prtica comum. Os sunos devem ser vacinados aps os 10 meses de idade, pois, nos primeiros meses de vida, pode ocorrer a interferncia de anticorpos maternos, caso a matriz tenha sido vacinada ou infectada previamente.
6.3.1 Caractersticas do vrus

O vrus da inuenza das aves pertence ao gnero Inuenza A. Como os demais vrus desse gnero, possuem vrions pleomrcos, envelopados e RNA segmentado como material gentico. As diferenas estruturais observadas entre as cepas de alta e mdia patogenicidade esto concentradas principalmente na HA. As cepas de alta
Orthomyxoviridae
743
patogenicidade apresentam um nmero maior de aminocidos bsicos na regio de clivagem da HA0 em HA1 e HA2. Outra diferena que pode ter conseqncias na patogenicidade das cepas a ausncia de stios de glicosilao de aminocidos, que so geralmente encontrados nessa regio em cepas de patogenicidade mdia.
6.3.2 Epidemiologia
Os vrus da inuenza aviria que infectam aves domsticas so, em grande parte, remotamente originrios de aves silvestres. O vrus j foi detectado em 100 espcies, pertencentes a 26 diferentes famlias e pelo menos 12 ordens. As aves silvestres aquticas classicadas na famlia Anatidae, ordem Anseriformes, so citadas como os principais reservatrios do vrus na natureza. A transmisso provavelmente ocorra pela transferncia do vrus presente em fezes contaminadas das aves silvestres para aves domsticas, mecanicamente, atravs de outros animais, humanos, alimentos ou gua. Outras fontes de infeco so sunos infectados, aves de estimao ou aves domsticas endemicamente infectadas. O vrus excretado em grandes quantidades nas fezes e nas secrees respiratrias das aves infectadas durante o perodo clnico e por um tempo varivel aps a recuperao. Em galinhas, este perodo pode se estender por at 36 dias aps a infeco. A transmisso horizontal a forma mais comum de transmisso, ocorrendo de aves infectadas para aves susceptveis atravs de fmites ou por via aergena. O contato com equipamentos, roupas ou sapatos contaminados com fezes tambm so importantes fontes de infeco. A transmisso por via aergena ocorre entre animais da mesma criao ou, possivelmente, entre avirios prximos, embora esta via no seja considerada a mais importante. Os 16 subtipos de HA e os nove subtipos de neuraminidase (NA) j foram identicados em aves silvestres ou domsticas em diferentes combinaes. Os isolados mais recentes que causaram doena em aves domsticas foram: H5N2, H7N1, H7N3, H7N7, H9N2 e H5N1. At o momento, apenas os subtipos H5 e H7 esto associa-
dos com o surgimento de cepas de alta patogenicidade, enquanto os demais subtipos so isolados de surtos da doena causados por cepas de mdia patogenicidade. No entanto, deve-se ressaltar que os subtipos H5 e H7 podem tambm estar envolvidos em surtos de mdia patogenicidade. Alguns surtos causados por vrus desses dois subtipos foram inicialmente de mdia patogenicidade e, aps a circulao por algum tempo na populao, o vrus sofreu modicaes genticas e passou a apresentar alta patogenicidade. Vinte e quatro surtos da forma altamente patognica da doena foram descritos desde 1959 em todo o mundo, sendo que 11 tiveram, como agente etiolgico, um vrus do subtipo H5, e 13 foram causados por um subtipo H7. Dentre os vrus de mdia patogenicidade, o H9N2 merece considerao especial por estar circulando de forma endmica em vrios pases desde a metade dos anos 1990. Entre os anos de 1994 e 2004, este vrus foi detectado na Alemanha, Itlia, Irlanda, frica do Sul, Estados Unidos e Coria. Recentemente surtos de inuenza pelo H9N2 foram descritos em galinhas no Oriente Mdio, envolvendo o Ir, Arbia Saudita, Israel, Jordnia, Kuwait, Lbia, Lbano, Iraque e outros pases da sia, como China, Coria e Paquisto. As cepas do vrus da inuenza que circulam entre aves silvestres so de mdia patogenicidade. A transformao de uma cepa de mdia patogenicidade em cepa de alta patogenicidade parece ocorrer nas aves domsticas logo aps a sua introduo a partir de espcies silvestres. Os mecanismos que induzem esta transformao so complexos e no totalmente esclarecidos, mas esto ligados a alteraes observadas na HA aps a aquisio de mltiplos aminocidos bsicos e perda de stios de glicosilao. Eventos de mutao ou recombinao parecem estar associados com essas modicaes e, possivelmente, mais de um mecanismo possa contribuir para esta alterao de patogenicidade. No Brasil, no h registro recente de diagnstico clnico ou laboratorial da inuenza em aves comerciais. O subtipo H3 foi recentemente isolado de aves silvestres nos estados do Amazonas e Rio Grande do Norte, entretanto no existem evidncias de transmisso desse vrus para aves domsticas.
744
Captulo 28

A patogenia da inuenza aviria mais conhecida em aves de produo, como galinhas e perus. A inuenza das aves conhecida como tipicamente de manifestaes clnicas respiratrias e gastrintestinais. Entretanto, os sinais clnicos podem variar amplamente, dependendo da cepa infectante. A patogenicidade de cada isolado do vrus da inuenza tambm pode variar de acordo com a espcie infectada. J foram descritos isolados de campo que no causaram doena em galinhas, mas causaram doena grave em perus. A infeco ocorre por inalao ou ingesto de material contaminado, e o perodo de incubao de um a trs dias. Aps a penetrao, a replicao das cepas de mdia patogenicidade restrita s clulas dos tratos respiratrio e intestinal. As leses causadas pelo vrus podem facilitar infeces bacterianas secundrias. Esta predisposio pode estar ligada a uma depresso nas funes dos macrfagos, induzida pela replicao viral. As aves afetadas manifestam leses inamatrias no trato respiratrio, principalmente nos seios nasais, edema e congesto na mucosa traqueal com exsudato seroso ou caseoso e, eventualmente, hemorragias. Pode ocorrer tambm aero-saculite e, se houver infeco bacteriana secundria, o quadro pode evoluir para uma broncopneumonia brinopurulenta. Outras leses possveis incluem enterite, leses inamatrias nos ovidutos e regresso dos ovrios. A infeco por cepas altamente patognicas cursa com a disseminao sistmica do vrus e sua replicao em vrios rgos, com conseqente aparecimento de leses disseminadas. A presena de mltiplos resduos bsicos na regio da clivagem da HA das cepas altamente patognicas permite que a clivagem seja realizada por enzimas encontradas em vrios tecidos. Isso facilita a propagao dessas cepas por diversos rgos e tecidos, enquanto a enzima necessria para a clivagem da HA nas cepas de mdia patogenicidade somente encontrada nos tratos respiratrio e intestinal. As leses causadas pelas cepas altamente patognicas podem apresentar variaes, mas
edema da cabea e pescoo, necrose na crista e barbela, hemorragias e focos de necrose em mltiplos rgos viscerais so freqentemente descritos. Aves que apresentam a forma superaguda da doena podem morrer mesmo antes de apresentar leses. A infeco de aves domsticas com cepas de baixa virulncia pode causar desde infeces assintomticas, at manifestaes severas de doena, afetando os tratos respiratrio, intestinal e urinrio. Nas aves doentes, pode-se observar tosse, espirro, estertores, lacrimao excessiva, queda na produo de ovos, perda do apetite e diarria. Os sinais clnicos podem ser mais severos se houver infeco secundria com outros vrus ou bactrias. As cepas de alta virulncia (HPAI) podem causar morte de galinhas e perus sem outras manifestaes clnicas. Nas aves que sobrevivem por algum tempo, podem ser observados diferentes quadros clnicos. Entre esses, pode-se citar a perda do apetite, a queda de postura, espirros, tosse, estertores, diarria, distrbios de origem nervosa (como tremores da cabea e pescoo), torcicolo e opisttono, edema da cabea e pescoo e cianose da pele nas regies sem penas.
6.3.4 Imunidade
O principal mecanismo efetor envolvido na proteo das aves contra o vrus da inuenza representado pelos anticorpos neutralizantes. Os anticorpos so produzidos contra vrias protenas estruturais e no-estruturais, mas apenas os anticorpos contra as protenas externas do vrus, HA, NA e M2 possuem atividade neutralizante. A resposta humoral de aves contra o vrus da inuenza ocorre de forma similar ao que ocorre com outros vrus nesta espcie e com o mesmo vrus em outras espcies. Aproximadamente cinco dias aps a infeco, pode-se detectar anticorpos especcos da classe IgM no soro e, posteriormente, ocorre o aparecimento de IgG (IgY). A resposta humoral ocorre tambm nas mucosas, mas pouco tem sido estudado sobre este mecanismo. O principal alvo da resposta imune humoral a HA, em cuja estrutura foram identicados pelo menos cinco determinantes antignicos neutralizantes. Uma boa resposta de anticorpos
Orthomyxoviridae
745
contra a HA parece ser suciente para a proteo contra a doena, embora a presena simultnea de anticorpos contra a HA e NA aparentemente induz uma melhor proteo. A infeco ou vacinao com um subtipo de HA ou NA induz neutralizao de outros vrus do mesmo subtipo, mas no induzem neutralizao ou proteo contra outros subtipos. Portanto, a proteo especca para o subtipo. Anticorpos produzidos contra a nucleoprotena (NP) e a protena M1 tambm podem ser detectados no soro de aves vacinadas ou infectadas. Esses anticorpos so utilizados em testes diagnsticos para a determinao do tipo de vrus inuenza, mas, por serem direcionados contra protenas internas, no parecem possuir papel importante na proteo contra o vrus. Informaes sobre a resposta imune celular contra o vrus da inuenza em aves so raras. Apesar disso, evidncias indiretas demonstram que este ramo da resposta imune tambm participa na proteo contra o vrus. A transferncia de linfcitos T CD8+ de galinhas inoculadas com o vrus H9N2 e desaadas com o H5N1 protegeu os animais contra o desao, indicando que a resposta imune celular importante.
6.3.5 Diagnstico
O diagnstico denitivo de inuenza aviria obrigatoriamente realizado por um laboratrio de referncia do Ministrio da Agricultura ou rgo equivalente em cada pas. No Brasil, existem vrios laboratrios ociais do Ministrio habilitados para realizar o diagnstico. O diagnstico laboratorial realizado pela deteco direta do vrus ou pelo isolamento e identicao viral a partir do material enviado para o laboratrio. As amostras preferenciais para o diagnstico so secrees traqueais e cloacais coletadas com o auxlio de suabes. Os suabes devem ser transportados em meio estril, acrescido de antibiticos. As amostras podem ser conservadas a 4C se processadas em at 48 horas aps a coleta. Aps esse perodo, recomendado que as amostras sejam estocadas a -70C. As vsceras de animais mortos tambm devem ser coletadas, principalmente se houver a suspeita de infeco
com as cepas altamente patognicas. Nesses casos, traquia, pulmo, sacos areos, intestino, rim, fgado, corao, sangue, bao e crebro so os rgos de eleio. A inoculao do material suspeito em ovos embrionados de galinha, com posterior identicao por tcnicas sorolgicas, o mtodo de diagnstico mais comumente utilizado. Com este objetivo, embries de nove a onze dias de incubao so inoculados na cavidade alantide. Setenta e duas horas aps a inoculao, os ovos embrionados so resfriados a 4C por algumas horas. O lquido alantide coletado, e a presena do vrus nesse material determinada pela deteco de atividade hemaglutinante pelo teste de hemaglutinao (HA). Aps a determinao da atividade hemaglutinante, o vrus deve ser identicado com relao ao seu tipo e subtipo. A identicao do tipo viral (A, B, C) pode ser realizada atravs do teste de imunodifuso ou ELISA, ou, ainda, pela deteco de antgenos virais na membrana crio-alantide do embrio, atravs das tcnicas de IFA ou IPX. Para a realizao desses testes, so utilizados anticorpos direcionados para a protena matriz (M) ou nucleoprotena (NP). A identicao do vrus em subtipos realizada pelas tcnicas de inibio da hemaglutinao (HI) ou inibio da neuraminidase (NI) com a utilizao de anticorpos especcos para cada um dos tipos de HA e NA. Testes sorolgicos podem ser tambm utilizados para a deteco de anticorpos no soro de aves que foram potencialmente infectadas. Nesse caso, os testes so aplicados em programas de vigilncia e determinao de prevalncia do vrus em populaes especcas, e no como diagnstico de surtos. Nesses casos, os testes recomendados so a imunodifuso, ELISA, HI e NI. Recentemente, a tcnica de transcrio reversa acoplada reao de polimerase em cadeia (RT-PCR) tem sido utilizada para a deteco do genoma viral em amostras clnicas. A presena do vrus da inuenza tipo A pode ser conrmada utilizando-se oligonucleotdeos nucleoprotena ou matriz-especcos. A presena dos subtipos H5 e H7 tambm pode ser conrmada atravs de oligonucleotdeos H5-
746
Captulo 28
ou H7 especcos. Por meio dessa tcnica e com posterior seqenciamento dos fragmentos amplicados, possvel diferenciar as cepas de alta e mdia patogenicidade. A presena de mltiplos aminocidos bsicos na regio de clivagem da HA caracteriza as cepas de alta patogenicidade. Aps o isolamento, os isolados identicados como vrus da inuenza devem ser testados para a determinao da sua patogenicidade. A patogenicidade determinada de acordo com protocolos utilizados internacionalmente e descritos pela OIE. Os isolados virais sero considerados de alta virulncia se: a) induzirem a morte em 75% de oito aves com idade entre 4-8 semanas; b) induzirem a morte de 75% das aves, mas forem dos subtipos H5 ou H7 e apresentarem os mltiplos aminocidos bsicos na regio de clivagem da hemaglutinina; e c) induzirem a morte de uma a cinco aves e replicarem em cultivo celular sem a adio de tripsina.

As medidas de controle e prolaxia adotadas frente a surtos de inuenza aviria variam de acordo com a legislao de cada pas. Medidas diferenciadas tambm podem ser aplicadas considerando-se a patogenicidade da cepa infectante. Os procedimentos frente a surtos com cepas de mdia ou alta patogenicidade podem ser distintos. Nos pases que enfrentaram essa situao em perodos recentes, o direcionamento geral tem sido a eliminao das aves infectadas e tambm de outras aves em contato. No entanto, em alguns casos, optou-se pelo controle pelo uso de vacinao emergencial. A Organizao Internacional de Epizootias (OIE), Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e Alimentao (FAO) e Organizao Mundial da Sade (OMS WHO) apresentam medidas de preveno e controle da inuenza aviria internacionalmente nos seus respectivos endereos eletrnicos. Estudos epidemiolgicos tm demonstrado que as principais fontes do vrus para as aves domsticas so as aves silvestres e, num segundo momento, as prprias aves domsticas. Portanto, os pontos principais a serem observados para o controle dessa enfermidade so: primeiro, evitar a transmisso do vrus de aves silvestres para
aves domsticas e, segundo, evitar a propagao do vrus entre aves domsticas caso ocorra a introduo da infeco. De acordo com as recomendaes tcnicas, o controle deve ser realizado principalmente pelo uso de medidas rigorosas de biossegurana. As aves infectadas excretam grande quantidade de vrus pelas fezes e secrees respiratrias. A transmisso ocorre principalmente pela exposio ao material orgnico contaminado, em equipamentos, gua, alimento, cama, veculos, roupas e calados de pessoas que esto em contato com os animais. A primeira etapa para evitar a transmisso do vrus evitar o transporte de aves infectadas e de material orgnico potencialmente contaminado. Em caso de surtos, a interdio da propriedade contaminada um procedimento compulsrio. Especialistas chamam a ateno para a rpida adoo de medidas de controle de focos causados por vrus de mdia patogenicidade como um dos procedimentos mais importantes para evitar o surgimento de cepas de alta patogenicidade. Como j mencionado, quanto maior for a circulao do vrus na populao avcola, maiores sero as chances de ocorrerem alteraes na patogenicidade desses vrus. A vacinao contra a inuenza aviria tem sido realizada em situaes especcas em alguns pases, mas a sua aplicao ainda um ponto muito polmico. O maior argumento contra a vacinao comum a outras doenas de animais, ou seja, a impossibilidade de diferenciao entre animais vacinados e animais infectados pelo vrus de campo. Outro forte argumento contra a vacinao de aves o de que algumas vacinas protegem contra os sinais clnicos, mas no protegem contra a infeco e excreo viral. Neste caso, os vrus poderiam seguir circulando e propiciar o surgimento de cepas altamente patognicas. A proteo vacinal contra o vrus da inuenza especca para o subtipo, e qualquer subtipo pode infectar as aves. Como seria muito difcil prever o subtipo que ir infectar determinada populao avcola, a escolha do subtipo a ser includo na vacina mais um problema que restringe o uso da vacinao. Existe uma poro signicativa da comunidade tcnico-cientca que totalmen-
Orthomyxoviridae
747
te contra a vacinao de aves, seja pelo risco que isto poderia representar para humanos, como pela diculdade de controle dessas medidas. O uso de vacinao tem sido considerado como uma alternativa sob duas condies: a vacinao proltica e vacinao emergencial. Segundo alguns especialistas, a vacinao proltica poderia ser realizada em reas que apresentam alto risco de infeco pelos subtipos H5 e H7 ou, ento, em regies que esto sob risco de infeco com um subtipo conhecido. Em todos os casos, a vacinao deve ser considerada como um instrumento a mais a ser aplicado em conjunto com medidas de biossegurana e com o monitoramento da evoluo da infeco. Para erradicar o vrus da inuenza, o sistema de vacinao deve permitir a deteco do vrus de campo em um lote vacinado, caso ele esteja presente. Isso pode ser atingido utilizando-se tanto vacinas inativadas convencionais quanto vacinas recombinantes. As vacinas inativadas, com o mesmo subtipo do vrus de campo, permitem a deteco do vrus de campo atravs da introduo de aves sentinelas, no-vacinadas, dentro do lote vacinado. Estas aves so testadas regularmente para a deteco de uma eventual soroconverso, o que indicaria a circulao do vrus de campo naquela populao. Esse sistema aplicvel no campo, mas um pouco impraticvel, uma vez que as aves sentinelas devem ser marcadas e facilmente reconhecidas. Esse mtodo foi utilizado na Itlia e utilizado, atualmente, na vigilncia da populao de gansos vacinados e de patos na Frana. Um sistema um pouco mais encorajador baseado na deteco de anticorpos anti-NS1, que foi recentemente desenvolvido e pode ser utilizado com todas as vacinas inativadas. Esse sistema baseado no fato de que a protena NS1 sintetizada apenas durante a replicao viral ativa e, por isso, raramente presente em vacinas inativadas. As aves vacinadas com essas vacinas iro desenvolver anticorpos apenas depois da exposio ao vrus de campo. Testes em campo esto em andamento em diferentes circunstncias, e os resultados precisam ser validados antes desse sistema ser recomendado.
At agora, o nico sistema que permite a deteco do vrus de campo na populao vacinada que resulta na erradicao baseia-se na vacinao heterloga e conhecido como DIVA (differentiating infected from vaccinated animals). Esse sistema foi desenvolvido para os programas de erradicao das diferentes cepas de vrus de mdia patogenicidade do subtipo H7. A vacina utilizada contm o vrus com a mesma HA, porm com uma NA diferente, como o vrus de campo. Essa estratgia de vacinao permite a deteco dos anticorpos da neuraminidase especcos contra o vrus de campo. Por exemplo, se a cepa do vrus de campo em circulao um H7N1, a vacina utilizada dever ser um H7N3 ou uma das outras sete combinaes possveis de NA. O monitoramento sorolgico baseado na protena N3 conrmar que o lote foi vacinado, e o baseado na protena N1 conrmar que a ave foi infectada com o vrus de campo. As aves que formam vacinadas e depois infectadas tambm so detectadas. A vacinao contra o vrus da inuenza aviria j foi utilizada em pases diferentes com sucesso varivel. Vacinas inativadas e recombinantes foram usadas no Mxico, na Itlia, no Paquisto e nos EUA para controlar o vrus da inuenza de mdia patogenicidade. Antes do surto causado pelo vrus de alta patogenicidade H5N1 na sia sudeste, algumas tentativas foram relatadas para controlar surtos causados por vrus de alta patogenicidade atravs da vacinao: surto por H5N2 no Mxico (1994); H7N1 na Itlia (2000), H7N3 no Paquisto (2003). As prticas inadequadas de biossegurana ou de vacinao podem conduzir transmisso viral entre lotes e a seleo de variantes que exibem a antigenic drift. Os vrus H5N2 circulantes no Mxico apresentaram antigenic drift resultando uma baixa identidade com as cepas vacinais. O uso intenso de vacinas no Mxico resultou na emergncia de variantes antignicas, que escapam da resposta imune induzida pela vacina. O Mxico tem vacinado as aves comerciais desde o surto de alta patogenicidade, em 1994, sem nunca aplicar o princpio DIVA. Embora nenhum vrus de alta patogenicidade tenha sido relatado desde
748
Captulo 28
o incio da campanha de vacinao, os vrus de mdia patogenicidade continuam em circulao. Por outro lado, em Hong Kong, diversas campanhas de vacinao foram realizadas aps o surto de H5N1 (1997), conseguindo diminuir signicativamente a ocorrncia do vrus da inuenza. A vacinao sistemtica das aves importadas, assim como outras medidas de biossegurana, so importantes para evitar novos surtos. No Brasil, a inuenza aviria uma doena considerada extica, e o procedimento determinado pelo Ministrio da Agricultura, no caso de focos, a erradicao do vrus pela destruio das aves infectadas. Os casos suspeitos da doena devem ser comunicados aos rgos de vigilncia ociais (Inspetorias Veterinrias), que enviaro mdicos veterinrios para realizar a coleta de material de animais suspeitos. Esse material ser enviado para um laboratrio credenciado pelo Ministrio para realizar o diagnstico (LARA Campinas; EMBRAPA Sunos e Aves). No caso da conrmao do resultado positivo, sero tomadas as medidas descritas no manual do Programa Nacional de Sanidade Avcola (Disponvel em: http://www.agricultura.gov.br/).
6.4 Inuenza em aves silvestres

Aparentemente as aves silvestres, principalmente as aquticas e migratrias, so os principais reservatrios dos vrus da inuenza aviria circulantes no mundo. Cepas de mdia patogenicidade j foram isoladas de, aproximadamente, 100 espcies de aves. Nessas espcies, vrus com os 16 tipos de HA e com os nove possveis tipos de NA circulam em aparente equilbrio com os seus hospedeiros. As aves aquticas pertencentes s ordens Anseriforme e Chradriiforme representam o maior reservatrio natural desses vrus. O vrus j foi isolado tambm de aves terrestres, mas essas espcies parecem no possuir um papel maior na manuteno do vrus na natureza. Na maioria dos casos, o vrus inuenza infecta e se perpetua nessas espcies sem causar doena, ou seja, produz infeces predominantemente subclnicas. Outro aspecto interessante na infeco pelo vrus da inuenza nessas espcies que o vrus permanece geneticamente estvel, com poucas mutaes, por longos perodos de tempo.
Isso indica que o vrus atingiu um equilbrio com o seu hospedeiro natural. Os patos, gansos e cisnes esto classicados dentro da ordem Anseriforme, enquanto gaivotas, andorinhas-do-mar e aves pernaltas esto classicados na ordem Chradriiforme. Outras aves silvestres das quais o vrus j foi isolado so: faises e perdizes (Galliformes), falces (Falconiformes), garas e bis (Ciconiiformes), tentilhes e weaverbirds (Passeriformes), cormoro (Pelicaniformes), pombos (Columbiformes), pica-paus (Piciformes), mergulhes (Podicipediformes). A infeco pelo vrus da inuenza j foi descrita tambm em algumas espcies silvestres que so criadas como animais de estimao, como os papagaios, cacatuas e periquitos (Psitaciformes). Alm disso, espcies silvestres, atualmente criadas como animais de produo, como emas (Rheiformes) e avestruzes (Struthioniformes), tambm podem ser infectadas naturalmente. O primeiro caso de isolamento do vrus da inuenza de aves silvestres foi realizado na frica do Sul, no ano de 1961. Nesse caso, uma cepa de alta virulncia causou doena e morte em um grande nmero de andorinhas-do-mar naquele pas. Apesar deste isolamento inicial, as evidncias sugerem que cepas de alta patogenicidade no circulam geralmente entre as aves silvestres, uma vez que os demais isolamentos realizados a partir de aves silvestres resultaram na deteco das cepas de patogenicidade mdia. Com a exceo de alguns casos, em que provavelmente aves silvestres se infectaram a partir de aves domsticas, as cepas altamente patognicas somente foram novamente detectadas causando doena em aves silvestres no ano de 2002, em gansos na China (cepa H5N1 que atualmente est causando epidemia na Eursia). Alm de ser patognica para aves domsticas, humanos e outras espcies de mamferos, o vrus H5N1 tambm so patognicos para algumas espcies silvestres. Vrias espcies de aves das quais o vrus H5N1 foi isolado pertencem a espcies que realizam longas migraes em diferentes pocas do ano, principalmente no perodo de inverno, nas regies localizadas no Hemisfrio Norte. As rotas de migrao podem diferir entre as espcies, compreendendo desde curtos movimentos locais at migraes intercontinentais. Essas rotas
Orthomyxoviridae
749
migratrias no esto totalmente elucidadas, e um dos aspectos preocupantes a possibilidade de pontos comuns de parada existentes para as espcies, o que permitiria um contato entre um grande nmero de aves da mesma e de diferentes espcies. Este contato poderia facilitar ao vrus ser carreado a regies novas onde ainda no circula. Estudos realizados em patos silvestres no Canad demonstraram que a perpetuao do vrus inuenza nessas aves relaciona-se com a passagem do vrus de aves adultas para aves jovens em lagos, antes da migrao. Um dos aspectos relevantes a grande quantidade de vrus que excretado nas fezes das aves. Essas fezes contaminam principalmente a gua de lagos e lagoas, onde um grande nmero dessas aves permanece, facilitando a transmisso pela rota fecal/oral ou fecal/cloacal na superfcie da gua. Ficou determinado que o vrus permanece vivel por um perodo de 4 dias a 22C e pelo perodo de 30 dias a 0C.
6.5 Vrus da inuenza H5N1

A grande maioria dos vrus da inuenza A que circulam nas populaes silvestres de aves aquticas e migratrias apatognica e permanece razoavelmente estvel geneticamente ao longo do tempo nessas espcies. Mesmo os subtipos H5 e H7 eram considerados benignos para os seus hospedeiros naturais at h pouco tempo. No entanto, a transmisso desses vrus para outros hospedeiros mamferos ou aves domsticas, por exemplo seguida de rpida evoluo gentica e freqentemente por aumento na patogenicidade e virulncia. O vrus da inuenza aviria pode, ocasionalmente, tornar-se patognico para humanos mediante dois mecanismos genticos principais: ressortimento, que se caracteriza pela troca de segmentos genmicos (genes) entre dois vrus durante uma infeco mista, ou atravs de mutaes nos diferentes genes internos que permitam a infeco de clulas humanas. As grandes pandemias de inuenza humana, ocorridas no sculo XX, tiveram o envolvimento de vrus de origem avcola (ver Figura 28.7). Esses vrus sofreram
ressortimento ao infectar clulas de outro mamfero (geralmente suno), concomitantemente com vrus de origem humana nas pandemias de 1957 e 1968. Estudos recentes de Biologia Molecular indicam que a pandemia de inuenza de 1918, conhecida como gripe espanhola, foi causada por um vrus avirio que teria sofrido algumas mutaes e se adaptado ao organismo humano, sem o processo de ressortimento. At 1997, no havia evidncia de que vrus do subtipo H5 poderiam infectar e causar doena grave em pessoas. At ento, apenas trs casos de transmisso direta de vrus avirios para humanos haviam sido relatados, todos eles envolvendo vrus do subtipo H7. Por isso, no se considerava que os vrus da inuenza aviria poderiam representar risco sade pblica. Acreditava-se que a diferena de especicidade de receptores para os vrus avirios e humanos se constitua em uma eciente barreira que limitava a transmisso de vrus entre aves e pessoas. Este conceito sofreu uma mudana drstica com o surgimento dos vrus H5N1, que foram transmitidos diretamente de aves para humanos, em 1997, em Hong Kong, resultando na morte de seis das 18 pessoas infectadas. A origem desses vrus ocorreu poucos anos antes, quando surgiram os primeiros vrus desse subtipo que foram capazes de, inicialmente, causar doena e mortalidade em gansos e, posteriormente, serem transmitidos a humanos. Esses vrus de gansos adquiriram segmentos genmicos de protenas internas e no-estruturais de vrus de perdizes, e o gene da NA de um vrus de marrecos/patos e, posteriormente, disseminaram-se nos mercados de aves em Hong Kong. A erradicao de toda a populao de galinhas domsticas de Hong Kong foi capaz de conter a epidemia. No entanto, outros vrus resultantes de ressortimento continuaram a ser gerados e disseminados a partir das populaes de gansos e marrecos/patos silvestres, contendo a mesma H5 e diferentes combinaes de genes/protenas internas. Os vrus H5N1 continuaram a evoluir e, em 2002, um subtipo nico, denominado gentipo Z, foi responsvel por grande mortalidade de aves aquticas domsticas e silvestres em Hong Kong.
750
Captulo 28
Este vrus continuou a circular de forma endmica no Sul da China, principalmente em patos e marrecos domsticos. No nal de 2003 e incio de 2004, foram relatados surtos de infeces pelo H5N1 simultaneamente em vrios pases asiticos. O vrus foi detectado no Vietn, Tailndia, Indonsia, Camboja, Laos, Coria, Japo e China. Os surtos foram aparentemente controlados, mas, em agosto de 2004, o vrus foi detectado na Malsia. Vrios estudos moleculares do vrus H5N1 foram realizados no perodo de 2000-2004 de isolados humanos e de aves nos pases asiticos. O seqenciamento desses isolados demonstrou que uma srie de ressortimentos, envolvendo o vrus inicialmente detectado em gansos, deu origem a um gentipo de H5N1 dominante (gentipo Z) entre galinhas e perus. A evoluo do vrus H5N1 potencializou sua virulncia e sua expanso entre hospedeiros susceptveis. Foi observado um aumento da virulncia para espcies silvestres e tambm uma maior letalidade em camundongos e fures infectados experimentalmente. O vrus tornou-se infeccioso para mamferos, causando mortes e sendo transmitido entre felinos selvagens como tigres e leopardos, e tambm entre gatos domsticos. Surtos do H5N1 foram relatados em aves migratrias na China e na Monglia em 2005, e o vrus foi detectado principalmente em aves oriundas do Lago Qinghai, localizado no Oeste da China. A propagao do vrus atravs dessas aves para outras regies a oeste e sul considerada uma possibilidade. Nesse mesmo ano, o vrus foi isolado de cisnes na Crocia e, posteriormente, em 2006, no Ir, Azerbaijo, Casaquisto, Gergia e em outros 20 pases europeus. O vrus propagou-se da sia para a Europa e frica, causando a enfermidade e levando destruio de mais de 200 milhes de aves em vrios pases. At abril de 2007, a presena do H5N1 j havia sido relatada em quarenta pases desses trs continentes. Ainda de acordo com o relato da Organizao Mundial de Sade (OMSWHO) de abril de 2007, 291 j foram infectadas pelo H5N1 e ocorreram 172 bitos com comprovao laboratorial da etiologia.
At incio de 2007, apesar das centenas de casos humanos registrados e dos freqentes registros de doena causada por vrus H5N1 em aves silvestres e domsticas de vrios pases asiticos, frica, Oriente Mdio e Europa Oriental, no havia evidncia de transmisso do vrus entre pessoas. Ou seja, os casos de infeco humana foram originados da exposio direta ou indireta de pessoas a aves infectadas. Isto explicava porque os casos humanos se restringiam a poucas pessoas, geralmente membros de uma mesma famlia. A capacidade dos vrus avirios serem transmitidos entre pessoas e de replicar ecientemente no trato respiratrio de humanos est associada com duas protenas e funes principais: HA e PB2. Alteraes na HA permitem ao vrus se ligar em receptores que contm cido silico com ligao 2,6, que esto presentes no epitlio do trato respiratrio superior e, assim, iniciar a infeco. Mutaes especcas na PB2 (E para K na posio 627) aumentam a capacidade do vrus replicar em clulas de mamferos e conferem uma vantagem para a replicao sob as temperaturas mais baixas do trato respiratrio superior. Essas duas alteraes so provavelmente necessrias, porm insucientes para a gerao de vrus H5N1 pandmicos. A grande preocupao de autoridades sanitrias de todo o mundo a de que este vrus eventualmente adquira a capacidade de ser transmitido entre pessoas como ocorre com os vrus da inuenza A humanos podendo, ento, disseminar-se rapidamente na populao humana e causar uma pandemia mundial. Esta preocupao reveste-se de especial signicado pela severidade da doena causada pelo H5N1 em humanos.
6.6 Inuenza em ces, felinos e outros mamferos

A constante evoluo do vrus da inuenza, por mutaes, delees e ressortimento, tem permitido a adaptao a novos hospedeiros e a produo de doena severa em animais e humanos. A primeira descrio da infeco pelo vrus da inuenza em ces (H3N2) data de 1975-1976,
Orthomyxoviridae
751
sem a produo de sinais clnicos severos. Porm, em 2005, foi relatada a infeco de ces pelo vrus da inuenza eqina H3N8, ocorrendo casos fatais da doena nos EUA. Em felinos domsticos, a infeco experimental com o H3N2 de humanos, H7N3 de perus e H7N7 de focas (Phoc vitulina) foi demonstrada nos anos 1970 e 1980, observandose somente hipertermia e excreo de vrus. No entanto, entre 2003 e 2007, foram relatados casos de infeco pelo H5N1 em felinos domsticos e selvagens, resultando em mortalidade. At h pouco tempo acreditava-se que os ces e gatos eram resistentes doena causada pelos vrus da inuenza tipo A. Porm, feldeos e candeos tm sido, repetidas vezes, demonstrados susceptveis infeco com esses vrus.
6.6.1 Epidemiologia
As primeiras descries de infeco pelo H5N1 em gatos domsticos foram realizadas na Tailndia, Alemanha, ustria, China, Iraque e Indonsia, durante surtos de inuenza aviria. Felinos selvagens tambm so susceptveis infeco. Dois tigres (Panthera tigris) e dois leopardos (P. pardus) morreram aps contrarem a infeco por ingesto de carne crua de aves contaminadas. Em um zoolgico da Tailndia, 147 tigres morreram ou foram abatidos aps apresentarem sinais clnicos de inuenza, e foi possvel demonstrar a transmisso horizontal do vrus entre os tigres. Em 2005, trs gatos civets morreram no Vietn aps a infeco com o H5N1. Fures tambm so susceptveis infeco experimental e podem servir de modelo para estudos com o H5N1. Estes animais desenvolvem sinais clnicos de infeco respiratria e excretam o vrus em secrees nasais. O H3N2 tambm pode replicar em fures, porm apresenta menor patogenicidade. Felinos e fures podem transmitir horizontalmente o H5N1. Essas espcies so criadas como animais domsticos e possuem contato direto com pessoas, podendo servir como uma fonte eventual de vrus para humanos. A infeco pelo H5N1 possui importncia pelas taxas elevadas de mortalidade e letalidade em animais, alm de possuir potencial zoontico. Um estudo sorolgico, realizado em Bangkok,
demonstrou 160 ces e oito gatos soropositivos para o H5N1, indicando que esses animais foram infectados naturalmente. Um caso fatal de H5N1 em um co que ingeriu a carcaa de um pato infectado na Tailndia foi relatado em 2006. As mutaes e ressortimentos so comuns nos vrus da inuenza tipo A, alertando para a possvel transmisso entre espcies. Alm do H5N1, os ces so susceptveis infeco pelos vrus H3N2 de humanos e o H3N8 de eqinos. Crawford et al. (2005) demonstraram a ocorrncia de doena respiratria aguda severa em ces de corrida da raa greyhound na Flrida, EUA. Estudos retrospectivos com amostras de soro coletadas de ces de corrida entre 2000 e 2003 demonstraram que a infeco j ocorria naquele perodo. Amostras de soro coletadas de ces em hospitais veterinrios e canis em outras regies do pas comprovaram a disseminao do agente, a expanso geogrca e a persistncia do vrus durante anos nessa espcie. A eciente transmisso e adaptao do vrus aos ces sugerem que este agente pode se tornar enzotico nessa espcie. A infeco pelos vrus da inuenza tipo A em candeos e feldeos pode ocorrer por contato direto com aves infectadas ou, ainda, por contato indireto com uma fonte comum, contaminada com fezes de aves (H5N1), ou com secreo nasal de eqinos (H3N8). A transmisso por carne crua de aves relatada principalmente para felinos. Nos felinos infectados, o H5N1 encontrado na saliva, urina e/ou fezes. A evidncia de infeco pelos vrus da inuenza tipo A em animais domsticos, que possuem amplo contato com humanos, motivo de preocupao para a sade pblica, pela possibilidade desses animais servirem como uma fonte adicional de vrus, permitindo a transmisso a outros mamferos e aumentando o risco de uma pandemia de inuenza humana.

O perodo de incubao que se segue infeco geralmente curto, entre dois e cinco dias em ces, tigres e gatos domsticos. As vias de in-
752
Captulo 28
feco so os tratos respiratrio e digestrio, e a replicao inicial ocorre nos pneumcitos tipo II nos alvolos pulmonares. Eventualmente, o vrus atinge os rins, fgado, corao, encfalo, intestino grosso, glndula adrenal, bao e pncreas de felinos, o que demonstra a ocorrncia de viremia. A excreo de vrus inicia no terceiro dia aps a infeco e permanece por mais de sete dias nos animais que sobrevivem. As mortes geralmente devem-se hemorragia e necrose multifocal em diferentes rgos, associada com leses pulmonares. Os sinais clnicos relatados em gatos e tigres aps a infeco com o H5N1 so de hipertermia, depresso, protuso da terceira plpebra, conjuntivite, diculdade respiratria, descarga nasal serosanguinolenta e ictercia em casos de hemorragia difusa. Sinais neurolgicos, incluindo convulses e ataxia, so consistentes com leses no encfalo. A morte ocorre dois dias aps o incio dos sinais em casos severos, porm infeces subclnicas tambm so relatadas. As infeces por outros vrus da inuenza tipo A em gatos produz hipertermia e sinais brandos de infeco respiratria, com excreo de vrus pela secreo nasal. Ces infectados com o H3N8 podem apresentar doena respiratria aguda, caracterizada por sinais brandos, como hipertermia e tosse por 10 a 14 dias, ou morte hiperaguda associada com hemorragias no trato respiratrio. A taxa de mortalidade foi de 36% em um surto de H3N8 em ces de corrida nos EUA. J o H5N1 pode ser detectado em amostras de pulmo, fgado e rins de ces infectados, demonstrando que esse vrus pode se disseminar sistemicamente nessa espcie. Na necropsia, tigres e gatos domsticos infectados com o H5N1 apresentam congesto e hemorragias petequiais nos pulmes, exsudato serosanguinolento na traquia e nos brnquios, efuso pleural, congesto no encfalo, conjuntivite, congesto renal e hemorragia intestinal. Microscopicamente, observam-se meningoencefalite no-supurativa, gliose, vasculite e congesto no encfalo, necrose multifocal no fgado, tubulonefrite, depleo linfide no bao, edema e hemorragia severa nos pulmes e outros rgos. H, ainda, perda do epitlio alveolar e bronquiolar com inltrado de clulas inamatrias.
Os ces que morrem aps a infeco aguda pelo H3N8 apresentam traquete, bronquite e bronquiolite, inltrado de clulas inamatrias e broncopneumonia supurativa. Um co infectado pelo H5N1 apresentava congesto e edema pulmonar, congesto no bao, fgado e rins; e, na microscopia pneumonia intersticial, inltrado de clulas inamatrias, necrose heptica, nefrite e degenerao tubular.
6.6.3 Diagnstico
A suspeita clnica de infeco pelo vrus da inuenza pode ser conrmada pela inoculao de secrees nasais, orofarngeas, amostras fecais ou suspenses de tecidos suspeitos em clulas MDCK ou, ainda, no saco alantide de ovos embrionados de 10 dias. Clinicamente, a infeco em ces muito semelhante aos sinais observados na tosse dos canis, porm a ocorrncia de hemorragias e sinais mais severos pode diferenciar a etiologia da doena. Felinos com inuenza apresentam sinais semelhantes aos apresentados na sndrome do trato respiratrio superior. A conrmao laboratorial da infeco pelos vrus da inuenza pode ser realizada por IHQ, hemaglutinao associada com HI e RT-PCR em tempo real. Testes sorolgicos como HI e soroneutralizao (SN) tambm podem ser utilizados.
6.6.4 Controle e preveno

A principal forma de prevenir a doena evitar o contato de ces e gatos com aves e fezes de animais contaminados (no caso do H5N1) ou com eqinos e/ou utenslios e instalaes (no caso do H3N8), nas regies onde ocorrem surtos de inuenza aviria ou eqina. A Organizao Mundial para Alimentos e Agricultura (FAO) organizou uma srie de recomendaes para os proprietrios de animais de companhia em reas onde ocorrem surtos de gripe aviria. Em zoolgicos, felinos selvagens devem ser alimentados com carne de aves sabidamente negativas para o vrus. Outros animais selvagens e marinhos, musteldeos, sunos e gatos civets tambm podem ser infectados pelo H5N1 e servir como fonte de transmisso.
Orthomyxoviridae
753
CRAWFORD, P.C. et al. Transmission of equine inuenza virus to dogs. Science, v.310, p.482-485, 2005. CUNHA, R.G. Isolamento de amostras do vrus da inuenza eqina A/Equi 2 no Estado da Guanabara. Revista Brasileira de Biologia, v.30, p.491-498, 1970. CUNHA, R.G.; PAGANO, M.C.C. Comparao antignica de trs amostras de vrus da inuenza eqina A/Equi 2, isoladas no Brasil. Pesquisa Veterinria Brasileira, v.13, p.41-44, 1993. DE JONG, M.D.; HIEN, T.T. Avian inuenza A (H5N1). Journal of Clinical Virology, v.35, p.2-13, 2006. EASTERDAY, B.C.; VAN REETH, K. Swine Inuenza. In: STRAW, B.E. et al. (Eds). Diseases of swine. 8. ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 1999. Cap.22, p.277-290. ENSERINK, M.; KAISER, J. Avian u nds new mammal hosts. Science, v.305, p.1385, 2004. FAO. H5N1 in cats 8 March 2006. Disponvel em: http:// www.fao.org/ag/againfo/subjects/en/health/diseases-cards/ avian_cats.html. Acesso em: 31 jan. 2007. GAO, Y.W. et al. Construction and experimental immunity of recombinant replication-competent canine adenovirus type 2 expressing hemagglutinin gene of H5N1 subtype tiger inuenza virus. Wei Sheng Wu Xue Bao, v.46, p.297-300, 2006. HINSHAW, V.S.; WEBSTER, R.G.; TURNER, B. The perpetuation of orthomyxoviruses and paramyxoviruses in Canadian waterfowl. Canadian Journal of Microbiology, v.26, p.622-629, 1980. JUNG, K.; HA, Y.; CHAE, C. Pathogenesis of swine inuenza virus subtype H1N2 infection in pigs. Journal of Comparative Pathology, v.132, p.179-184, 2005. KARACA, K. et al. Evaluation of the ability of canarypox-vectored equine inuenza virus vaccines to induce humoral immune responses against canine inuenza viruses in dogs. American Journal of Veterinary Research, v.68, p.208-212, 2007. KEAWCHAROEN, J. et al. Avian inuenza H5N1 in tigers and leopards. Emerging Infectious Diseases, v.10, p.2189-2191, 2004. KODIHALLI, S. et al. Effect of avian inuenza virus infection on the phagocytic function of systemic phagocytes and pulmonary macrophages of turkeys. Avian Diseases, v.38, p.93-102, 1994. KUIKEN, T. et al. Avian H5N1 inuenza in cats. Science, v.306, p.241, 2004. LAUDERT, E. et al. Biological and molecular characterization of H13N2 inuenza type A viruses isolated from turkeys and surface water. Avian Diseases, v.37, p.793-799, 1993. MA, W. et al. Isolation and genetic characterization of new reassortant H3N1 swine inuenza viru from pigs in the midwesterns United states. Journal of Virology, v.80, p.50925096, 2006.
As vacinas contra o H3N8 utilizadas em eqinos podem ser adaptadas para o uso em ces. Uma vacina recombinante, contendo o poxvrus do canrio como vetor e expressando a HA do vrus, foi testada e induziu ttulos mdios a altos de anticorpos em ces, protegendo esses animais contra a doena causada pelo H3N8. Uma vacina recombinante, com a insero do DNA complementar (cDNA) do gene da HA do H5N1 em um adenovrus canino tipo 2 foi desenvolvida e testada na China. Ttulos de anticorpos inibidores de hemaglutinao de 8 e 16 foram produzidos aps a imunizao experimental de felinos selvagens e domsticos, abrindo perspectivas para o desenvolvimento de uma vacina contra o vrus da inuenza aviria H5N1 em animais domsticos e selvagens.
ALEXANDER, D.J. A review of avian inuenza in different bird species. Veterinary Microbiology, v.74, p.3-13, 2000. ALEXANDER, D.J. An overview of the epidemiology of avian inuenza. Vaccine, in press, 2006. BECKER, W.B. The isolation and classication of Tern virus: inuenza A-Tern South Africa--1961. The Journal of Hygiene, v.64, p.309-320, 1966. BELSHE, R.B. The origins of pandemic inuenza--lessons from the 1918 virus. The New England Journal of Medicine, v.353, p.2209-2211, 2005. CAPUA, I.; CATOLI, G.; MARANGON, S. DIVA--a vaccination strategy enabling the detection of eld exposure to avian inuenza. Developments in Biologicals, v.119, p.229-233, 2004. CAPUA, I.; MARANGON, S. Control of avian inuenza in poultry. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.1319-1324, 2006. CARTER, G.R.; WISE, D.J.; FLORES, E.F. Orthomyxoviridae. In: CARTER, G.R., WISE, D.J.; FLORES; E.F. (Eds). A concise review of veterinary virology. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: http://www.ivis.org. Acesso em: 12 nov. 2006. CDC. Key facts about swine inuenza (swine u). Disponvel em: http://www.cdc.gov/u/swine/. Acesso em: 31 jan. 2007. CHAMBERS, T.M.; HOLLAND JR, R.E.; LAI, A.C.K. Equine inuenza: current veterinary perspectives, part 1. Equine Practice, v.17, p.19-30, 1995. CHEN, H. et al. Avian u: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl. Nature, v.436, p.191-192, 2005.
754
MURPHY, F.A. et al. Orthomyxoviridae. In: ___. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. Cap.30, p.459-468. NEWTON, J.R.; DALY, J.M.; WOOD, J.L.N. Immune Response to Inuenza and Implications for Vaccines Development. In: AINSWORTH, D.M. et al. (Eds). Third World Equine Symposium. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: Internet http://www.ivis.org. Acesso em: 12 nov. 2006. OLSEN, B. et al. Global patterns of inuenza a virus in wild birds. Science, v.312, p.384-388, 2006. OLSEN, C.W. The emergence of novel swine inuenza viruses in North America. Virus Research, v.85, p.199-210, 2002. PAGANO, M.C.; PASSOS, W.S.; CUNHA, R.G. Anticorpos inibidores de hemoaglutinao para os vrus de inuenza eqina em soros de eqideos de vrias regies do Brasil. Revista Brasileira de Medicina Veterinria, v.7, p.194-198, 1985. PENA, L.J. et al. Levantamento soro-epidemiolgico da infeco pelo vrus da anemia infecciosa eqina, da inuenza eqina-2 e do herpesvrus equino-1 em rebanhos do sul do Estado do Par, Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research, v.43, p.537542, 2006. PERDUE, M.L.; SUAREZ, D.L. Structural features of the avian inuenza virus hemagglutinin that inuence virulence. Veterinary Microbiology, v.74, p.77-86, 2000. PEREZ, D.R.; SORRELL, E.M.; DONIS, R.O. Avian inuenza: an omnipresent pandemic threat. The Pediatric Infectious Disease Journal, v.24, p.208-216, 2005. PERKINS, L.E.; SWAYNE, D.E. Pathobiology of A/chicken/ Hong Kong/220/97 (H5N1) avian inuenza virus in seven gallinaceous species. Veterinary Pathology, v.38, p.149-164, 2001. SCHAEFER, R.; BRENTANO, L. Inuenza suna: o papel epidemiolgico dos sunos nas infeces causadas pelo vrus Inuenza. Concrdia, SC: Embrapa Sunos e Aves, 2005. 21p. SEO, S.H.; WEBSTER, R.G. Cross-reactive, cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 inuenza virus infection in Hong Kong poultry markets. Journal of Virology, v.75, p.2516-2525, 2001. SONGSERM, T. et al. Avian inuenza H5N1 in naturally infected domestic cat. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.681-683, 2006. SONGSERM, T. et al. Fatal avian inuenza A H5N1 in a dog. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.1744-1747, 2006. STALLKNECHT, D.E. Ecology and epidemiology of avian inuenza viruses in wild bird populations. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON AVIAN INFLUENZA, 4th 1998, Athens, GA. Proceedings... Athens, GA: US Animal Health Association, 1998. p.61-69.
Captulo 28
STALLKNECHT, D.E.; SHANE, S.M. Host range of avian inuenza virus in free-living birds. Veterinary Research Communications, v.12, p.125-141, 1988. SUAREZ, D.L.; SCHULTZ-CHERRY, S. Immunology of avian inuenza virus: a review. Developmental and Comparative Immunology, v.24, p.269-283, 2000. SWAYNE, D.E.; SENNE, D.A.; BEARD, C.W. Avian Inuenza. In: SWAYNE, D.E. et al (Eds). A laboratory manual for the isolation and identication of avian pathogens. Kennett Square, PA: American Association of Avian Pathologists, 1998. Cap.29, p.150-155. TAUBENBERGER, J.K. et al. Characterization of the 1918 inuenza virus polymerase genes. Nature, v.437, p.889-893, 2005. THANAWONGMUWECH, R. et al. Probable tiger-to-tiger transmission of avian inuenza H5N1. Emerging Infectious Diseases, v.11, p.699-701, 2005. THIRY, E. et al. Highly pathogenic avian inuenza H5N1 virus in cats and other carnivores. Veterinary Microbiology, v.122, p.25-31, 2007. TOLLIS, M.; DI TRANI, L. Recent developments in avian inuenza research: epidemiology and immunoprophylaxis. Veterinary Journal, v.164, p.202-215, 2002. TUMPEY, T.M. et al. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish inuenza pandemic virus. Science, v.310, p.77-80, 2005. VAN REETH, K. Avian and swine inuenza viruses: our current understanding of the zoonotic risk. Veterinary Research, v.38, p.243-260, 2007. WEBSTER, R.G. et al. H5N1 outbreaks and enzootic inuenza. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.3-8, 2006. WEBSTER, R.G. et al. Intestinal inuenza: replication and characterization of inuenza viruses in ducks. Virology, v.84, p.268-278, 1978. WEIBLEN, R. Inuenza Eqina. In: RIET-CORREA, F. et al. Doenas de ruminantes e eqinos. 2. ed. So Paulo: Varela, 2001. p.120-125. WILEY, D.C.; WILSON, I.A; SKEHEL, J.J. Structural identication of the antibody-binding sites of Hong Kong inuenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature, v.289, p.373-378, 1981. WILSON, W.D. Equine Inuenza. The Veterinary Clinics of North America. Equine Practice, v.9, p.257-282, 1993. YATES, P.; MUMFORD, J.A. Equine inuenza vaccine efcacy: the signicance of antigenic variation. Veterinary Microbiology, v.74, p.173-177, 2000. ZITZOW, L.A. et al. Pathogenesis of avian inuenza A (H5N1) viruses in ferrets. Journal of Virology, v.76, p.4420-4429, 2002.
BUNYAVIRIDAE
Fernanda S. F. Vogel1
29
757 757 757 759
759 760

4.1 O ciclo replicativo 4.2 Expresso gnica e replicao do genoma
5 Biologia e patogenia 6 Buniavrus de interesse veterinrio

6.1 Vrus da febre do vale Rift 6.1.1 Epidemiologia 6.1.2 Patogenia e sinais clnicos 6.1.3 Diagnstico 6.1.4 Tratamento 6.1.5 Controle e prolaxia 6.2 6.3 6.4 6.5 Vrus da doena de Akabane Hantavrus Vrus da doena das ovelhas de Nairobi Febre hemorrgica da Crimia-Congo
762 762
762 762 764 765 765 765 765 767 769 770
771
Mariana S e Silva colaborou com a seo 6.2 (Hantavrus), e Eduardo Furtado Flores com as sees 6.4 (Doena das ovelhas de Nairobi) e 6.5 (Febre hemorrgica da Crimia-Congo).
1 Introduo
A famlia Bunyaviridae contm o maior nmero de vrus animais, abrigando centenas de espcies virais isoladas principalmente de insetos. Os vrions so grandes, envelopados e possuem como genoma trs molculas de RNA de polaridade negativa. A maioria desses vrus foi isolada de insetos ou de animais silvestres, sem estarem necessariamente associados com doena. Alguns buniavrus causam doena severa em humanos e vrios deles so zoonticos. Dos cinco gneros da famlia, apenas os membros do gnero Hantavirus no so transmitidos por insetos, os demais so arbovrus. Este gnero abriga o hantavrus, um vrus zoontico cujos hospedeiros naturais so roedores silvestres. Em humanos, a hantavirose se manifesta sob duas formas, por apresentar caractersticas epidemiolgicas e clnicas distintas. No sudeste asitico, a doena endmica e manifesta-se primariamente por insucincia renal aguda, com alta morbidade e baixa mortalidade. Nas Amricas, a doena apresenta ocorrncia espordica e se manifesta por insucincia respiratria aguda, com altos ndices de letalidade. No Brasil, j foram isoladas dezenas de vrus da famlia Bunyaviridae. Do ponto de vista clnico e epidemiolgico, o mais importante o vrus Oropouche, que est associado com epidemias na regio amaznica. Esse vrus infecta primariamente humanos e, nessa regio, o nmero de casos noticados superado somente pela dengue, reforando a sua importncia. A enfermidade conhecida como febre do Oropouche e caracterizada por febre, cefalia, mialgias, artralgias, anorexia, tonturas, calafrios e fotofobia. Menos freqentemente, a infeco pode cursar com sinais neurolgicos. Este vrus se mantm na natureza atravs de dois ciclos: um urbano e outro silvestre. Embora no Brasil o mais importante vrus dessa famlia seja o Oropouche, deve-se salientar que, para os animais, o mais importante e patognico membro da Bunyaviridae o vrus da febre do vale Rift (RVFV), agente restrito praticamente ao continente africano.
2 Classicao
A famlia Bunyaviridae compreende mais de 300 vrus agrupados em cinco gneros: Orthobunyavirus, Phlebovirus, Hantavirus, Nairovirus e Tospovirus. Vrios membros dessa famlia esto associados com doenas hemorrgicas severas, como o vrus da febre do vale Rift (Phlebovirus), vrus da febre hemorrgica da Crimia-Congo (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, um Nairovirus), Hantaan, Sin Nombre e outros vrus relacionados (Hantavirus) e, mais recentemente, a Garissa, cujo agente identicado o vrus Ngari (Orthobunyavirus). O gnero Tospovirus abriga somente vrus de plantas. Cada gnero da famlia Bunyaviridae inclui mltiplos sorotipos. Com exceo dos hantavrus, os vrus dos outros quatro gneros so arbovrus, ou seja, so transmitidos por vetores (mosquitos, ebtomos ou carrapatos). Os hantavrus infectam naturalmente roedores silvestres e so transmitidos por contato direto ou indireto, ou, ainda, pela inalao de aerossis oriundos das excrees destes animais.

Os vrions dessa famlia so, aproximadamente, esfricos e envelopados, com 80 a 120 nm de dimetro. A superfcie do envelope possui projees de 5 a 10 nm, formadas pelas glicoprotenas G1 e G2. O interior dos vrions contm trs nucleocapsdeos de simetria helicoidal, cada um deles composto por um segmento de RNA conjugado com protenas (protena N + polimerase L) (Figura 29.1). A composio qumica dos vrus foi estimada em 2% de RNA, 58% de protenas, 33% de lipdios e 7% de carboidratos. Os buniavrus possuem um genoma segmentado, composto por trs molculas de RNA de ta simples e polaridade negativa. Em dois gneros (Phlebovirus e Tospovirus), um desses segmentos possui a estratgia ambissense de expresso. A extenso dos trs segmentos varia entre os diferentes gneros. Os dois segmentos de polaridade negativa so denominados L (large =
758
Captulo 29
grande), com 6.875 nucleotdeos (nt) e M (medium = mdio), com 4.458 nt (estes nmeros se referem ao vrus bunyawera). O terceiro segmento, ambissense em alguns gneros, denominado S (small = pequeno) e possui 961 nt. Seqncias de nucleotdeos complementares entre si esto localizadas nas extremidades 5 e 3 dos RNA genmicos. Essa complementaridade permite o pareamento entre bases e a formao de ligaes estveis no covalentes, conferindo a esses segmentos a topologia circular (Figura 29.1). Deve-se ressaltar que esses segmentos no so contnuos e, portanto, no se constituem em genomas verdadeiramente circulares apenas adotam essa topologia pelo pareamento das extremidades. Seqncias localizadas prximas s extremidades dos RNA genmicos tambm servem como stios de reconhe-
cimento para a polimerase viral (replicase) nos processos de transcrio e replicao. Os vrions contm algumas cpias da replicase viral (polimerase de RNA dependente de RNA), denominada L, que possui massa de 240 a 260 kDa e codicada pelo segmento genmico de mesmo nome (L). As protenas estruturais dos vrions so a ribonucleoprotena N (26,5 kDa), codicada no segmento S, e as glicoprotenas G1 e G2 do envelope, codicadas no segmento M. Os RNAs genmicos esto associados com mltiplas cpias da protena N e com algumas cpias da protena L (RNA polimerase viral). As molculas da protena L interagem com as extremidades dos segmentos de RNA genmicos e com as molculas da protena N que recobrem o genoma, formando os nucleocapsdeos (Figura 29.1).
B
G1+G2
L
M S
Membrana lipdica Nucleocapsdeos

RNA N P
C
3-
Segmento L
L (polimerase)
- 5
Segmento M
3-
G1/G2
G1/G2
- 5
Segmento S
NS
3-
- 5
Fonte: A) Dra Linda Stannard; www.uct.ac.za
Figura 29.1. Vrions e genoma da famlia Bunyaviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de vrus do gnero Phlebovirus (vrus da febre do Vale Rift); B) Representao esquemtica de uma partcula vrica e seus componentes; C) Estrutura do genoma. Segmentos L (grande); M (mdio) e S (pequeno). No diagrama, est representada a organizao genmica de um phlebovrus.
Bunyaviridae
759
4 Replicao
As centenas de vrus da famlia Bunyaviridae apresentam vrias propriedades biolgicas em comum; porm, por constiturem uma populao heterognea, tambm apresentam muitas propriedades diferentes. Com exceo dos hantavrus, os vrus dos outros gneros so capazes de replicar tanto em clulas de vertebrados (ou plantas, no caso dos tospovrus) como de artrpodes. Os efeitos da replicao nas clulas hospedeiras variam com o vrus e com o tipo de clula. Em geral, a replicao em clulas de mamferos (e plantas) citoltica; enquanto a replicao em clulas de artrpodes, geralmente, resulta em citopatologia discreta ou ausente.

A infeco se inicia pela ligao dos vrions com receptores na membrana celular por meio das glicoprotenas G1/G2. Nesse processo, a G1 parece desempenhar um papel mais importante em clulas de vertebrados; e a glicoprotena G2, nas clulas de artrpodes. Aps a ligao, os vrions so internalizados por endocitose e se localizam no interior de vesculas endocticas. A fuso e penetrao dependem de pH cido, que determina alteraes conformacionais na G1 e/ou G2, fuso do envelope com a membrana endoctica e liberao dos nucleocapsdeos no citoplasma. Durante a transcrio e replicao, os segmentos de RNA genmicos nunca so completamente desnudos, permanecendo associados com mltiplas cpias da protena N. A primeira etapa aps o desnudamento parcial do genoma envolve a transcrio dos segmentos genmicos de RNA negativo, originando os RNA mensageiros (mRNA) que iro ser traduzidos em protenas. Estes mRNA contm 5 cap e parecem no ser poliadenilados. A traduo dos mRNAs dos segmentos L e S ocorre em ribossomos livres. As protenas N e NSs dos Phlebovirus
esto presentes no citoplasma da clula infectada duas horas aps a infeco. Algumas protenas sofrem modicaes aps a traduo. A traduo dos mRNAs do segmento M realizada em ribossomos associados ao retculo endoplasmtico rugoso (RER). A poliprotena codicada pelo segmento M (precursora das glicoprotenas) clivada, originando a G1 e G2 que, a seguir, sero glicosiladas e modicadas no aparelho de Golgi. Posteriormente, a transcrio completa do genoma ir resultar na produo de RNAs de sentido antigenmico, denominados cRNA (RNA complementar). Esses cRNAs no contm cap e, portanto, no podem ser traduzidos. Os RNAs servem apenas de molde para a sntese de cpias de RNA genmico. Todos esses processos so realizados pelo complexo replicase (RNA polimerase viral + enzimas auxiliares). Etapas adicionais de transcrio e traduo ocorrem aps a replicao do genoma, amplicando a quantidade de RNA e protenas virais. Durante o processo de replicao, tanto as molculas de cRNA como o RNA genmico permanecem associadas com mltiplas cpias da protena N. A morfognese dos vrions ocorre em etapas: inicialmente os RNAs genmicos recm-sintetizados so conjugados com cpias mltiplas da protena N, formando os nucleocapsdeos, aos quais se juntam algumas cpias da protena L (polimerase). A prxima etapa envolve a interao dos nucleocapsdeos com as caudas citoplasmticas das glicoprotenas, que esto localizadas nas membranas do aparelho de Golgi. Essa interao resulta no brotamento dos nucleocapsdeos para o lmen do Golgi, processo pelo qual os vrions adquirem o envelope. Os vrions j formados so transportados no interior de vesculas do transGolgi at a membrana plasmtica, onde so liberados para o meio extracelular por exocitose, sem a necessidade de lise celular. No ciclo replicativo de alguns buniavrus, os vrions podem realizar o brotamento diretamente na membrana plasmtica. O ciclo replicativo dos buniavrus est ilustrado de forma esquemtica na Figura 29.2.
760
Captulo 29
1 11
10 5a
3
5b
L
M S
7 6 8 9
Golgi
5c
RER
Ncleo
Figura 29.2. Ciclo replicativo dos buniavrus. 1) Ligao aos receptores celulares; 2) Internalizao por endocitose, seguida de penetrao por fuso do envelope com a membrana endoctica; 3) Desnudamento; 4) Transcrio dos segmentos de polaridade negativa e produo de mRNAs; 5a) Traduo dos mRNAs e produo de protenas envolvidas na replicao do genoma e de protenas estruturais (5b, 5c); 6) Replicao do genoma; 7) Formao dos nucleocapsdeos; 8) Transporte das glicoprotenas do envelope para o aparelho de Golgi; 9) Brotamento dos nucleocapsdeos para o interior do Golgi; 10) Transporte dos vrions em vesculas para a superfcie celular; 11) Egresso por exocitose.
4.2 Expresso gnica e replicao do genoma

Os segmentos L de todos os gneros e M (com exceo dos tospovrus) possuem sentido negativo, e a sua expresso e replicao segue os princpios gerais dos vrus RNA de polaridade negativa (Figura 29.3A). A polimerase viral transcreve o segmento de RNA genmico, produzindo um mRNA com cap que ser traduzido em protena. A extremidade 5 dos mRNAs formada por segmentos de mRNAs com cap subtrados de mRNAs celulares, a exemplo do que ocorre com os ortomixovrus. Em etapas subseqentes,
a polimerase/replicase altera o modo de sntese e produz uma cpia de cRNA que no possui cap. Essas molculas servem de molde para a replicao, resultando na sntese de cpias de RNA com o sentido genmico (Figura 29.3A). A estratgia de expresso do segmento S (ambissense) apresenta diferenas importantes em relao expresso dos outros segmentos e do restante da famlia (Figura 29.3B). Nos phlebovrus, a ORF (open reading frame) do gene da nucleoprotena N est localizada na metade do segmento S, prxima extremidade 3, e o gene da protena NSs est localizado na outra metade. Esta protena no-estrutural NSs (7,4 kDa) pos-
Bunyaviridae
761
sui funo pouco conhecida. A primeira etapa a transcrio da primeira metade do gene, originando um mRNA que codica a protena N. Este mRNA ser traduzido em protena. A seguir, este segmento genmico replicado em toda a sua extenso pela RNA polimerase, originando um RNA de sentido antigenmico (sentido positivo). Este RNA possui duas funes: a) serve de molde para a sntese de uma cpia de RNA de sentido genmico (replicao) e b) a metade prxima extremidade 5 transcrita, originando um RNA que corresponde ao gene da protena NS. Por ser transcrito a partir de um RNA de sentido positivo (antigenmico), esse RNA possui o mesmo sentido do genoma (sentido negativo). No entanto, este RNA serve de mRNA e traduzido na protena NS, ou seja, o segmento S codica uma
protena (N) no sentido do mRNA de sentido positivo clssico; e a protena NSs codicada por um RNA com o sentido do genoma. Essa estratgia ambissense observada no segmento S dos phlebovrus e tospovrus e no segmento M dos tospovrus. Neste ltimo caso, os genes das protenas G1 e G2 esto localizados na metade 3 do genoma e as protenas so codicadas pela estratgia usual dos vrus RNA de sentido negativo (semelhante protena N do segmento S). O gene da protena Nsm est localizado na regio prxima extremidade 5 do genoma e expresso a partir de um RNA complementar, produzido pela transcrio da regio correspondente do RNA antigenmico. Os arenavrus tambm utilizam a estratgia ambissense para expressar as suas protenas.
A
RNA complementar (+)
5- 3
B
Protena NSs
Traduo
Replicao
RNA genmico (-)

3-
3- 5
mRNA -5'
cRNA (+)
N 5-
Transcrio (3)
mRNA (+)
5
Transcrio
- 3 NSs
Replicao (2)
- 3
Traduo
RNA genmico
N 3NSs - 5
Transcrio (1)
Protenas
mRNA
5-
N - 3
Traduo
Protena N
Figura 29.3. Estratgia de expresso gnica e replicao do genoma dos membros da famlia Bunyaviridae. A) Estratgia de expresso do segmento L nos membros dos quatro gneros; e do segmento M para os membros dos gneros Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus e Phlebovirus; B) Estratgia ambissense de expresso gnica, que ocorre no segmento M dos tospovrus e no segmento S dos tospovrus e phlebovrus. No diagrama, est representada a expresso do segmento S dos phlebovrus.
762
Captulo 29
5 Biologia e patogenia
Os buniavrus utilizam uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo diferentes espcies de mamferos (e plantas no caso dos tospovrus) e gneros de artrpodes. Uma vez que os buniavrus replicam em insetos, pode ocorrer a transmisso transovariana nesses vetores, o que permite a manuteno do agente durante estaes frias. A patogenia dos buniavrus variada, uma vez que existem diferentes grupos de vrus dentro da mesma famlia, mas geralmente a inoculao do agente pela picada do inseto vetor determina uma viremia transiente, e a replicao e amplicao do vrus ocorre nos rgos-alvo, que varia conforme os diferentes buniavrus. A patogenicidade e virulncia tambm variam de acordo com o vrus. As infeces de vertebrados pelos buniavrus variam em severidade, incluindo desde infeces inaparentes at doenas severas e mesmo fatais.
6 Buniavrus de interesse veterinrio

Embora vrios membros da famlia Bunyaviridae sejam capazes de infectar e causar doena em hospedeiros vertebrados, a infeco de animais domsticos , na maioria das vezes, acidental e no possui importncia na manuteno desses vrus na natureza. Alguns buniavrus possuem importncia apenas regional e no sero tratados neste texto. A seguir, sero apresentadas as doenas causadas por dois vrus que possuem alguma repercusso como patgenos animais: o vrus da febre do vale Rift (RVFV) e o vrus Akabane. O RVFV um vrus zoontico, o que no tem sido relatado para o Akabane at o presente. Ao nal, ser apresentado o hantavrus, um vrus zoontico de roedores silvestres que tem sido associado com doena humana de grande importncia em vrios continentes.
animais de produo podem levar a importantes perdas econmicas. O vrus (Rift Valley fever virus, RVFV) transmitido para os mamferos pela picada de insetos e, por isso, considerado um arbovrus. A infeco nos ruminantes caracterizada por altas taxas de abortos, alta mortalidade em neonatos e hepatite necrtica. Essa enfermidade tambm conhecida como hepatite enzotica de ovinos e caprinos. O agente etiolgico foi isolado inicialmente, em 1931, de uma ovelha infectada no vale Rift, do Qunia, da a sua denominao. O RVFV pertence ao gnero Phlebovirus. Aparentemente, os isolados de campo no apresentam variaes antignicas marcantes, e a deteco de diferenas entre isolados pode exigir a anlise gentica. O vrus sensvel a desinfetantes, solventes lipdicos e a pH baixo. Sob pH neutro ou levemente alcalino, e na presena de protenas (no soro, por exemplo), o vrus preserva a infectividade durante vrias semanas. Em aerossis, a vida mdia de infectividade de, aproximadamente, 90 minutos a 25C. Embora a principal forma de transmisso seja atravs de picadas de insetos, pessoas j foram infectadas por aerossis produzidos durante o abate, pela manipulao de fetos abortados, durante necropsias e procedimentos laboratoriais.
6.1.1 Epidemiologia
O RVFV apresenta algumas peculiaridades epidemiolgicas que favorecem a sua manuteno e disseminao na natureza. Esse vrus pode ser transmitido por diferentes gneros de mosquitos e tambm por ebotomdeos, alm de ser um vrus RNA e, como tal, propenso a altas taxas de mutao. As mutaes podem ter repercusso antignica pequena (drifts) ou grande (shifts) e podem determinar um fentipo de variabilidade antignica e, assim, representar uma estratgia de evaso do sistema imune. A febre do vale Rift (RVF) uma zoonose viral de grande importncia na frica. Esta enfermidade permaneceu restrita ao sul do Saara at 1977, quando um grande surto ocorreu no Egito. Um dos fatores incriminados como responsvel pela disseminao do agente foi a fonte de gua abundante nos canais construdos para grandes
6.1 Vrus da febre do vale Rift

A febre do vale Rift (RVF) uma enfermidade que afeta primariamente ruminantes, mas tambm afeta humanos, podendo ser severa nessas espcies. A morbidade e mortalidade em
Bunyaviridae
763
represas. Embora a doena estivesse restrita apenas ao continente africano, em 2000, o vrus se disseminou pela Pennsula Arbica, produzindo dois surtos simultneos na Arbia Saudita e no Imen. Historicamente, os surtos de RVF ocorrem em diferentes regies da frica em intervalos de 5 a 15 anos. O longo intervalo de ocorrncia desses eventos provavelmente deve-se reduo gradativa na susceptibilidade da populao com o decorrer do tempo. Por muitos anos, o reservatrio do vrus durante os perodos interepidmicos foi desconhecido. Esse desconhecimento perdurou at que pesquisadores descobriram que ovos do mosquito Aedes lineatopinnis, presentes no solo dos dambos, continham o RVFV. Os dambos so depresses no solo que alternam perodos de plenitude hdrica em pocas de chuvas, com perodos de ausncia de gua em pocas de seca. Quando essas depresses se enchem de gua, os ovos eclodem, e as larvas infectadas se tornam mosquitos que contm e podem transmitir o vrus. Por isso, esses dambos so considerados os reservatrios de mosquitos (e do vrus). Ao realizarem o repasto sangneo em ruminantes, os mosquitos inoculam o vrus, que , posteriormente, amplicado no animal. Esse animal serve, ento, de fonte de infeco para vetores de diferentes gneros, que contribuem para uma rpida disseminao do agente. Se a rea que possui os mosquitos infectados apresenta animais susceptveis, provvel a ocorrncia de casos clnicos. Por outro lado, em muitas regies da frica, a presena dos mosquitos e do vrus enzotica e, assim, casos clnicos dicilmente so observados. Nessas regies, a circulao do vrus tem sido monitorada pelo uso de animais sentinelas. Nos vetores, o vrus transmitido pela via transovariana entre geraes. Uma caracterstica peculiar que o vrus pode permanecer latente nos ovos dos mosquitos durante estaes secas (perodos interepizoticos). Quando os ovos infectados pela via transovariana eclodirem, daro origem aos mosquitos transmissores do RVFV. Na frica, os principais vetores do RVFV so os mosquitos dos gneros Aedes, Anopheles,
Culex, Eretmapoites e Mansonia. Na Amrica do Norte, foi demonstrado que os gneros Aedes, Anopheles e Culex so capazes de transmitir o RVFV experimentalmente. Tambm foi demonstrado que o Cullex pipiens, um importante inseto existente no Egito e que se alimenta preferencialmente de animais febris, pode transmitir o vrus, o que aumenta a probabilidade de transmisso do agente. Os casos clnicos so observados apenas quando existem condies propcias presena dos vetores, aliado com a presena de hospedeiros susceptveis. Os surtos da enfermidade no vale Rift, no Qunia, apresentam uma associao estreita com a variabilidade climtica interanual observada nessa regio. A susceptibilidade infeco est relacionada com a raa, idade e com o status imunitrio do animal. Os ovinos e os bovinos so as espcies preferencialmente infectadas pelo RVFV e so considerados os grandes amplicadores dos vrus. A doena severa mais freqentemente observada em animais jovens, em ovelhas exticas e em certas raas cruzadas de bovinos. Os cordeiros e os bezerros so altamente susceptveis, e altas taxas de mortalidade so observadas nesses animais. Os humanos so altamente susceptveis a infeco pelo RVFV, e o vrus transmitido para pessoas por meio de insetos e de aerossis. Embora os humanos no sejam a espcie hospedeira natural, a viremia produzida suciente para transmitir o vrus aos vetores. Assim, os humanos podem se constituir em potenciais disseminadores da infeco em reas livres. Surtos de RVF esto geralmente associados com chuvas, que favorecem a multiplicao dos insetos vetores. Chuvas localizadas so sucientes para criar condies necessrias ao desenvolvimento de um surto. A transmisso transovariana do vrus em mosquitos infectados e a amplicao do vrus em vertebrados asseguram a manuteno da epidemia. Embora os ovinos e bovinos sejam as espcies de animais domsticos mais freqentemente afetadas, o RVFV pode infectar uma variedade de espcies, com conseqncias clnico-patolgicas variveis (Tabela 29.1).
764
Captulo 29
Tabela 29.1. Espectro e hospedeiros e conseqncias da infeco de diferentes espcies animais pelo RVFV.
Mortalidade ap. 100%

Cordeiros Bezerros Cabritos Filhotes de co Filhotes de gato Camundongos Hamsters
Doena severa abortos mortalidade

Ovelhas Bovinos Cabras Bfalos Humanos
Doena severa, viremia, abortos

Macacos Camelos Ratos Esquilos
Infeco viremia
Eqinos Gatos Ces Macacos
Refratrios infeco
Cobaios Coelhos Sunos Tartarugas Sapos/rs Galinhas Canrios Pombas Periquitos
Camundongos silvestres

A infeco pelo RVFV em animais no-prenhes freqentemente inaparente. Surtos de aborto e de mortalidade neonatal so freqentemente observados quando o vrus infecta animais prenhes. Em animais idosos, pode-se observar hepatite, e a evoluo da enfermidade freqentemente resulta em morte. Em humanos, a infeco pode causar encefalite, cegueira, febre hemorrgica. A taxa de mortalidade pode chegar a 10%. O perodo de incubao em animais recmnascidos de, aproximadamente, 12 horas. Em animais adultos, o perodo de incubao pode ser de mais de trs dias. Em humanos, o perodo entre a infeco e o incio dos sinais clnicos de 4 a 6 dias. Os sinais clnicos da infeco dependem da espcie infectada, assim como de condies siolgicas, como a idade e gestao. Cordeiros podem apresentar hipertermia entre 40 e 42C, acompanhada de anorexia. A taxa de mortalidade em cordeiros de at uma semana de idade pode ser superior a 90%. Em cordeiros com mais de uma semana, a taxa de mortalidade situa-se ao redor de 20%. Ovinos adultos desenvolvem febre (40-41C) com descarga nasal mucopurulenta.
Em ovelhas prenhes, os sinais mais comumente observados so os abortos. A taxa de mortalidade entre as ovelhas que abortam pode chegar a 20-30%. Os bezerros infectados pelo RVFV apresentam febre (40-41C) e cam apticos. A taxa de mortalidade pode chegar a 70%. Os bovinos adultos desenvolvem febre, sialorria, anorexia e fraqueza. Alguns animais podem apresentar diarria ftida. Nessa faixa etria, a taxa de mortalidade raramente excede 10%. Em vacas prenhes, o sinal mais evidente da infeco tambm o aborto. Em humanos, os sintomas so semelhantes gripe, com febre (37,8-40C), cefalia, dores musculares, fraqueza, nuseas e fotofobia. A maioria das pessoas se recupera em 4 a 7 dias. No entanto, em algumas pessoas so observadas complicaes, como sndrome hemorrgica, ictercia e hematemese, melena e petquias nas mucosas. Em 2 a 4 dias aps a infeco, essas pessoas se tornam febris e geralmente morrem. Alguns indivduos desenvolvem uma forma clnica de meningoencefalite. Outro sinal de complicao que pode ser observado uma retinopatia, que pode ser detectada de 5 a 15 dias aps o pico febril. Essas pessoas freqentemente iro apresentar decincias visuais.
Bunyaviridae
765
6.1.3 Diagnstico
Em reas endmicas ou de risco, deve-se suspeitar de RVF quando so observados os seguintes eventos: a) altas taxas de aborto em ovelhas e vacas (pode atingir 100%); b) altas taxas de mortalidade em cordeiros e em bezerros com menos de sete dias de idade; c) fetos abortados e neonatos com leses no fgado; d) enfermidade semelhante gripe em humanos, particularmente naqueles com contato com animais; e) ocorrncia de enfermidade durante perodo de ocorrncia dos vetores; e) disseminao rpida. O diagnstico da infeco baseado na deteco de antgenos virais e na pesquisa de anticorpos em exames histopatolgicos. Deve-se ter o mximo cuidado na manipulao das amostras, uma vez que o RVFV pode infectar humanos e casos de infeco humana adquirida durante necropsias e procedimentos laboratoriais j foram descritos. Amostras de vrus para o isolamento podem ser coletadas de fetos abortados ou de animais febris. As amostras a serem coletadas incluem o fgado, bao, sangue, crebro e soro. Essas amostras podem ser submetidas ao isolamento viral, a RT-PCR por extenso ou, ainda, imunoistoqumica. Para a conrmao sorolgica da enfermidade, pode-se realizar a sorologia pareada, pelo uso do teste de soroneutralizao (SN). Para pesquisa de anticorpos, a tcnica de ELISA pode ser utilizada, tanto para deteco de IgM como de IgG.
6.1.4 Tratamento
No existe tratamento para a RVF. No entanto, estudos em macacos e em outros animais tm demonstrado que a ribavirina uma droga antiviral promissora para utilizao futura em humanos. Outros estudos sugerem que o interferon, imunomoduladores e plasma sangneo de fase convalescente podem auxiliar no tratamento de pacientes com a RVF.
feco. A movimentao de animais dessas reas para reas livres durante os perodos de atividade dos vetores deve ser restringida para prevenir epizootias. O controle dos vetores em reas epizoticas seria uma medida lgica, mas possui pouca praticidade para reas muito extensas. Durante as epizootias, todos os animais domsticos susceptveis devem ser vacinados para prevenir a amplicao do vrus e a conseqente reinfeco dos vetores. As vacinas disponveis comercialmente apresentam problemas de segurana e de eccia. As vacinas atenuadas tm produzido abortos ou efeitos teratognicos em fetos, alm de no conferirem boa proteo adequada. Esses vrus vacinais so tambm patognicos para humanos. As vacinas inativadas so seguras, mas no conferem proteo adequada. Recentemente, um mutante atenuado, produzido por passagem em clulas Vero, est sendo testado para utilizao em humanos. Esse vrus vacinal j foi testado em ovinos e bovinos, e no causou efeitos adversos em cordeiros recm-nascidos, em bezerros e em animais prenhes. Quando o vrus atenuado inoculado em fetos de bovinos atravs de laparoscopia, esses fetos continuam o desenvolvimento normal e nascem soropositivos. As vacinas atenuadas induzem a formao de anticorpos neutralizantes de maior magnitude e durao do que aqueles induzidos por vacinas inativadas. Tanto as pessoas como os animais imunizados com vacinas inativadas necessitam de revacinaes anuais para a manuteno dos ttulos de anticorpos. Ttulos de anticorpos neutralizantes de magnitude superior a 20 so considerados protetores.
6.2 Vrus da doena de Akabane

A Akabane uma doena vrica de ruminantes que determina importantes perdas econmicas em rebanhos reprodutores. As infeces, que so geralmente subclnicas em animais adultos, podem resultar em perdas reprodutivas graves quando ocorrem em fmeas prenhes. Essas perdas incluem abortos, nascimento de bezerros fracos e inviveis, alm de malformaes congnitas. O agente da doena Akabane um ar-

Em reas enzoticas, a vacinao o nico mtodo de prevenir as perdas causadas pela in-
766
Captulo 29
bovrus pertencente ao grupo Simbu, do gnero Orthobunyavirus (vrus Akabane, AkV). Todos os isolados do AkV apresentam alguma reatividade sorolgica cruzada, de forma que no existem diferentes sorotipos. Outros vrus relacionados com o vrus Akabane Aino, Peaton, Tinaroo e Douglas tambm esto associados com perdas reprodutivas. Nos EUA, uma sndrome similar em ruminantes causada pelo vrus do vale Cach, outro buniavrus, mas que no pertence ao grupo Simbu. A doena de Akabane comum nos trpicos e subtrpicos entre as latitudes 35N e 35S. endmica no Norte da Austrlia e surtos ocasionais ocorrem no Sul desse pas quando existem condies para o vrus se disseminar. A enfermidade ocorre tambm no Japo, na Coria, em Israel, no Zimbabwe e em outros pases da frica. Evidncias sorolgicas da infeco tm sido encontradas em vrios pases da frica, sia e em vrias regies da Austrlia. O vetor artrpode do AkV ainda no foi denitivamente identicado, mas evidncias epidemiolgicas indicam que o vrus seja disseminado por mosquitos. O vrus j foi isolado de vrias espcies de mosquitos: Aedes vexans, Culex e Culicoides oxystoma no Japo; Anopheles funestus no Qunia; Culicoides milnei e Culicoides imicola na frica; Culicoides brevitarsis e Culicoides wadei na Austrlia. O principal vetor parece ser o Culicoides brevitarsis. O vrus Akabane no transmitido por contato, nem por tecidos infectados, por exsudatos ou por fmites. Alm disso, o vrus parece produzir uma infeco aguda em ruminantes, sem a gerao do estado de portador. O AkV capaz de infectar naturalmente vrias espcies de ruminantes, mas as perdas reprodutivas so observadas apenas em bovinos, ovinos e caprinos. Em ruminantes selvagens, embora existam relatos de sorologia positiva, alteraes congnitas ainda no foram observadas. No entanto, acredita-se que, assim como em ruminantes domsticos, o vrus possa causar perdas reprodutivas nas espcies silvestres. Anticorpos contra o AkV j foram detectados em espcies domsticas no-ruminantes, como eqinos e caninos. At o presente, anticorpos antivrus Akabane no foram detectados em humanos.
A infeco de ruminantes adultos geralmente subclnica. A viremia que se segue infeco geralmente ocorre entre os dias um e seis e persiste por um a nove dias. Os sinais da infeco so observados apenas quando animais prenhes so infectados. Nestes, so observados sinais de doena reprodutiva, tais como: abortos, nascimento de bezerros fracos e inviveis, malformaes congnitas e distocias. O achado mais freqente e que mais chama a ateno o nascimento de animais com malformaes. Os fetos infectados durante o primeiro trimestre de gestao geralmente so viosos e alertas, mas no caminham. Embora alguns possam se desenvolver com assistncia, so incoordenados, apresentam ataxia e podem apresentar paralisia em um ou mais membros. Atroa muscular, exoftalmia, rotao de membro, produo excessiva de lgrima so alguns dos sinais que podem ser observados. Os fetos infectados no segundo tero gestacional normalmente apresentam artrogripose. As articulaes so rgidas e no fazem exo, e os msculos podem estar atroados. Torcicolo, escoliose e cifose tambm so freqentemente observados. Alguns recm-nascidos podem apresentar anormalidades neurolgicas alm da artrogripose. Os animais nascidos muito fracos geralmente foram infectados tardiamente na gestao. Estes animais podem se manter de p e caminhar, mas apresentam anormalidades comportamentais como: reexo de suco fraco ou ausente, depresso, torpor, hiperexcitabilidade peridica, surdez, nistagmo, incoordenao e cegueira. Deformidades no crnio so freqentes. A maioria dos animais que nascem assim morrem ou so sacricados pouco tempo aps o nascimento. Em animais que nascem com sinais mais leves, estes se acentuam gradativamente e os animais geralmente morrem antes dos seis meses de idade. As malformaes congnitas ocorrem mais freqentemente quando os fetos so infectados durante o primeiro tero gestacional. Em ovelhas, essas alteraes ocorrem quando os fetos so infectados entre o 30 e 50 dia, dependendo da virulncia da cepa. Em vacas, malformaes congnitas so evidenciadas quando a infeco fetal ocorre entre os 62 e 92 dias de gestao. Em
Bunyaviridae
767
cabras, quando a infeco fetal ocorre ao redor do 40 dia de gestao. A maioria dos animais presentes em reas endmicas desenvolve uma resposta imune protetora contra o vrus. Os surtos de distrbios reprodutivos normalmente ocorrem em reas de instabilidade, quando existem condies favorveis para a disseminao do vrus entre os animais susceptveis. Fmeas prenhes, quando introduzidas em reas endmicas, so muito susceptveis. Aps a infeco inicial, no entanto, adquirem imunidade e esto protegidas nas prximas gestaes. Alm disso, vacinas so disponveis em alguns pases, reduzindo o risco de infeco em fmeas gestantes introduzidas em reas endmicas. O diagnstico da infeco comumente realizado por testes sorolgicos. Anticorpos podem ser detectados no soro do feto ou dos bezerros antes da ingesto do colostro. Outros uidos corporais, como o liquor, tambm podem ser utilizados para a pesquisa de anticorpos. Devese salientar que a ausncia de anticorpos no soro fetal ou de recm-nascidos no descarta a infeco pelo vrus Akabane. Em adultos, a sorologia importante em reas onde o vrus no endmico. A ausncia de anticorpos na me descarta a infeco no feto ou no neonato. Entre os testes sorolgicos utilizados para o diagnstico da infeco, destacam-se: a SN, a imunodifuso em gel de gar (IDGA) e a inibio da hemaglutinao (HI). O isolamento do vrus Akabane pode ser realizado pela inoculao de macerados de tecidos em camundongos lactentes, em embries de galinha com quatro dias ou em uma variedade de cultivos celulares. O vrus identicado, posteriormente, atravs de imunouorescncia (IFA) ou por neutralizao com anti-soro especco. No entanto, o vrus dicilmente isolado da placenta e dos tecidos dos fetos abortados. A chance de isolamento aumenta quanto menor for a imunidade do feto abortado. A partir de tecidos maternos, o isolamento do vrus Akabane mais difcil, porque as conseqncias da replicao viral s so evidenciadas um longo perodo aps a infeco.
A Akabane uma enfermidade de noticao obrigatria. Uma vez detectada a infeco em uma propriedade, esta entra em quarentena para desinfeco. Como o vrus Akabane no parece ser transmitido diretamente entre os animais, o controle baseado no combate a vetores que possuam potencial para atuarem como transmissores do vrus. As medidas recomendadas incluem o uso de pesticidas e procedimentos para minimizar o contato de insetos com os animais. Se a desinfeco for necessria, utilizam-se desinfetantes como o hipoclorito detergentes, compostos base de cloro, lcool, fenol e desinfetantes comerciais. Para prevenir a infeco de fmeas prenhes, as fmeas do rebanho devem ser vacinadas anualmente antes da estao de monta. Diferentes vacinas so disponveis nos pases que apresentam a infeco. No Japo, uma vacina inativada e outra atenuada esto disponveis comercialmente. Na Austrlia, est sendo desenvolvida uma vacina inativada com resultados promissores. No entanto, ainda no est disponvel comercialmente. A vacinao deve ser utilizada anteriormente ao potencial contato com os vetores infectados, com o intuito de aumentar o nvel de anticorpos circulantes e, com isso, prevenir a infeco fetal.
6.3 Hantavrus
A hantavirose uma enfermidade infecciosa grave que afeta humanos, cujo agente possui roedores silvestres e domsticos como hospedeiros naturais e reservatrios. A enfermidade apresenta duas formas clnicas: a febre hemorrgica com sndrome renal (HFRS) e a sndrome pulmonar por hantavrus (HPS), tambm conhecida como sndrome cardiopulmonar por hantavrus (CPSH). A HFRS foi descrita na dcada de 1950, na Coria e Rssia, e foi chamada inicialmente de febre hemorrgica da Coria. Os sinais clnicos eram inicialmente semelhantes aos da gripe, seguidos de hipotenso, trombocitopenia e falncia renal. Em 1993, na regio de Four Corners (Novo Mxico, Arizona, Colorado e Utah), nos Estados Unidos, foi descrita uma enfermidade com sinais semelhantes aos da gripe e com comprometimen-
768
Captulo 29
to respiratrio grave, com mortalidade de at 50%, denominada HPS. O vrus envolvido com a nova enfermidade foi classicado no gnero Hantavirus e denominado Sin nombre. O agente etiolgico da enfermidade um vrus do gnero Hantavirus. O gnero possui grande diversidade gentica, razo pela qual isolados com caractersticas diferentes tm sido responsabilizados pelos surtos ocorridos em todo o mundo. Os principais causadores da HFRS so os vrus Hantaan, Seoul, Puumala e Dobrava. No Brasil, a HPS foi diagnosticada, pela primeira vez, em 1993, no municpio de Juquitiba, estado de So Paulo. A enfermidade de noticao compulsria, e at 2005 j haviam sido noticados 664 casos de hantavirose em humanos, com 270 mortes, a maior parte dos casos ocorridos na regio Sul do pas. At o momento no existem relatos da HFRS no Brasil. Na Europa e sia, os roedores das subfamlias Murinae e Arvicolinae so os principais transmissores das hantaviroses, principalmente os gneros Apodemus e Clethionomys. Nas Amricas, os transmissores pertencem subfamlia Sigmodontinae. No Brasil, os roedores da espcie Bolomys lasiurus so responsveis pela transmisso nos estados de So Paulo, Minas Gerais, Bahia, Gois, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, enquanto os roedores da espcie Oligoryzomis nigripes so os responsveis nos estados do Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Os roedores eliminam o vrus pela urina, fezes e saliva. A transmisso para humanos ocorre principalmente pela inalao de partculas dessecadas das fezes dos roedores contaminados. A mordedura dos roedores infectados tambm pode transmitir o vrus para humanos. A transmisso entre humanos no freqente, embora j tenha sido relatada em um surto da HPS causado pelo vrus Andes, na Argentina, em 1996. Entre os roedores, a infeco caracterizada pela ausncia de sinais clnicos, e os animais estabelecem uma infeco persistente que se mantm por meses ou anos. Entre os roedores, o vrus transmitido de forma horizontal, principalmente por arranhes e mordidas e tambm pela inalao de aerossis com partculas virais. Estudos de prevalncia em roedores demonstram que os machos so os prin-
cipais portadores e disseminadores da enfermidade. Apesar da ausncia de sinais clnicos, infeces experimentais em roedores indicam que a viremia ps-infeco pode durar duas semanas, quando h disseminao do vrus pelos tecidos do hospedeiro. A patogenia tanto da HPS quanto da HFRS caracterizada por uma resposta imune exacerbada, que leva liberao de citocinas envolvidas no aumento de permeabilidade vascular. Os vrus possuem capacidade de se ligar em plaquetas por receptores, levando essas plaquetas a serem retiradas da circulao, provocando a trombocitopenia observada nas duas apresentaes clnicas da hantavirose. Na HPS, ocorre ainda destruio de antgenos nas clulas endoteliais do corao e tecidos linfides. Os pulmes apresentam inltrados de linfcitos T/CD8, que produzem citocinas, estimulando os macrfagos a produzir TNF, IL-1, IFN gama, que aumentam a permeabilidade vascular, levando formao de edema pulmonar. Aps a inalao do agente, os sinais se iniciam entre 15 e 20 dias. Os sintomas da forma cardiopulmonar so febre, mialgias, cefalia, alm de tosse seca e edema pulmonar. A HFRS apresenta sinais de trombocitopenia, ditese hemorrgica e insucincia renal. O diagnstico laboratorial realizado pela deteco de anticorpos especcos, principalmente pela tcnica de ELISA, para deteco de IgM, e por imunouorescncia indireta (IFA). O isolamento viral no muito utilizado em razo da diculdade de propagao do vrus em cultivo celular. O tratamento para hantavirose de suporte, e a letalidade depende do vrus envolvido, do tempo de incio do tratamento e de fatores individuais, como idade e imunidade do paciente. Algumas vacinas inativadas contra a HFRS so utilizadas para os vrus Seoul e Hantaan, na sia, e, aparentemente, no promovem proteo contra os hantavrus. Estudos so realizados para o desenvolvimento de vacinas efetivas contra a forma cardiopulmonar e para a produo de vacinas de DNA. O controle da enfermidade deve ser realizado principalmente com medidas de saneamento bsico, controle de roedores e preveno de contato com esses animais.
Bunyaviridae
769
6.4 Vrus da doena das ovelhas de Nairobi

A doena das ovelhas de Nairobi (Nairobi sheep disease, NSD) uma doena viral no-contagiosa de ovinos e caprinos, caracterizada por gastrenterite hemorrgica e alta mortalidade. O agente, um vrus classicado no gnero Nairovirus, da famlia Bunyaviridae, transmitido primariamente por carrapatos Rhipicephalus appendiculatus. O vrus causador da NSD (NSDv) antigenicamente distinto dos outros membros da Bunyaviridae, sendo mais relacionado com o vrus Ganjam, que afeta caprinos na ndia, e com o vrus Dugbe, isolado de bovinos no Oeste da frica. Os vrus desses trs grupos compem o gnero Nairovirus. A infeco pelo NSDV restrita primariamente ao Leste da frica (Knia, Uganda, Tanznia, Somlia), onde se encontram os habitats do carrapato vetor. No entanto, sorologia positiva para vrus antigenicamente relacionados, alm de casos clnicos semelhantes, tambm foram relatados em ovinos no Congo e Etipia. Dentre as espcies domsticas, o NSDV infecta naturalmente apenas ovinos e caprinos, e tentativas de reproduzir a infeco em animais de produo e de laboratrio falharam. Acreditase que uma espcie de rato africano, o Arvicatus abysinicus nubilans, seja o hospedeiro natural do agente. Existem algumas evidncias de infeco em humanos com sinais clnicos semelhantes gripe, embora o seu carter zoontico no tenha sido bem documentado. De qualquer maneira, prossionais e pessoas envolvidas com o manejo e cuidados de animais doentes devem adotar medidas de biossegurana para evitar a exposio a aerossis e outros materiais contaminados. Na natureza, o vrus transmitido principalmente por carrapatos do gnero Rhipicephalus appendiculatus, embora outros carrapatos tambm possam transmiti-lo. Nos carrapatos, o vrus transmitido de forma transestadial, e os adultos podem abrigar o vrus por mais de dois anos. Aps a inoculao de vertebrados durante o repasto sangneo, a infeco apresenta um perodo de incubao de 4 a 15 dias. Em ovinos e caprinos inoculados experimentalmente, o perodo de incubao inferior, entre 1 e 3 dias.
A enfermidade caracterizada por gastrenterite hemorrgica aguda, que inicia com febre alta e se segue com depresso, declnio da temperatura corporal e diarria. Corrimento nasal mucopurulento e diculdade respiratria so freqentemente observados. As fezes so inicialmente liquefeitas, mas passam a conter muco e sangue com a evoluo da doena. Casos subagudos, em que os animais apresentam fraqueza e quadros recorrentes de diarria; e casos superagudos, em que os animais apresentam apenas febre alta seguida de colapso e morte sbita, tambm tm sido relatados. Abortos tambm podem ocorrer associados com os surtos. Os achados patolgicos incluem hiperemia e petquias da mucosa do abomaso, enterite hemorrgica no ceco e poro anterior do clon. A mucosa do intestino grosso pode estar recoberta com petquias e com contedo sanguinolento. Hiperplasia generalizada nos rgos linfides tambm um achado comum. Fmeas prenhes podem apresentar hiperemia no trato genital, edema e hemorragias nas membranas fetais. Fetos abortados apresentam petquias e sufuses em vrios rgos. Em reas endmicas, a maioria da populao de ovinos e caprinos imune ao vrus, e a enfermidade acomete principalmente animais introduzidos a partir de reas livres. De fato, os surtos esto quase sempre associados com movimento de animais susceptveis para reas de ocorrncia dos carrapatos vetores. pocas de chuvas tambm favorecem a ocorrncia da doena, pela maior populao dos vetores. O diagnstico laboratorial pode ser realizado pelo isolamento do vrus a partir de plasma ou sangue com anticoagulante, coletado durante a fase aguda da doena. O vrus pode ser identicado por imunouorescncia (IFA) realizada em cultivos celulares previamente inoculados com o material suspeito. O vrus replica bem em cultivos celulares de origem ovina, caprina e tambm de hamster. A inoculao intracerebral de camundongos lactentes um mtodo alternativo de diagnstico, e o vrus pode ser identicado por IFA ou xao de complemento. O diagnstico diferencial deve considerar doenas como a febre do vale Rift, antrax e algu-
770
Captulo 29
mas intoxicaes, peste dos pequenos ruminantes e coccidiose. Animais que se recuperam da infeco desenvolvem imunidade slida, que dura, provavelmente, por toda a vida. Cordeiros e cabritos recm-nascidos parecem adquirir imunidade das mes pelo colostro, o que os protege durante as primeiras semanas de vida. Vacinas atenuadas, obtidas pela passagem do vrus em cultivos celulares ou por passagens em crebros de camundongos tm sido utilizadas, mas o seu uso tem sido matria de debate. A maior restrio ao seu uso extensivo deve-se variabilidade de resposta ao vrus vacinal entre raas diferentes de animais. O controle da enfermidade baseia-se no combate aos carrapatos, pelo uso de carrapaticidas, e nos cuidados com animais susceptveis introduzidos em reas endmicas. Nestes animais, pode-se proceder a vacinao para evitar a ocorrncia da doena. Os animais de reas endmicas geralmente possuem imunidade conferida pela infeco natural e so pouco susceptveis enfermidade.
6.5 Febre hemorrgica da Crimia-Congo

A febre hemorrgica da Crimia-Congo (CCHF) uma enfermidade zoontica causada por um vrus do gnero Nairovirus e transmitida por carrapatos. A enfermidade foi identicada inicialmente na Crimia, em 1944, e, posteriormente, no Congo, em 1956, derivando da a sua denominao. A doena endmica em vrios pases da frica e sia e tem sido descrita tambm em vrios pases da Europa Oriental e Oriente Mdio. Evidncias sorolgicas limitadas tm indicado a sua presena tambm em Portugal, Frana, Turquia, Egito e ndia. Em humanos, a infeco se caracteriza por febre, sinais semelhantes gripe, prurido, freqentemente seguidos de eventos hemorrgicos e hepatite necrosante. Embora classicamente considerada uma zoonose, casos de CCHF em pessoas tm sido muito mais espordicos do que a sua ocorrncia em animais. Na natureza, o vrus infecta vrias espcies de animais e causa febre e viremia em bovinos,
ovinos e pequenos mamferos, como lebres e coelhos silvestres. Sorologia positiva para o vrus tem sido detectada em vrias espcies animais de mamferos silvestres e cativos do Sudeste e Sul da frica, indicando a sua ampla distribuio. Dentre as espcies soropositivas, incluem-se bovinos, ovinos, caprinos, eqinos, ces, mamferos silvestres (74 espcies), alm de algumas espcies de aves. Acredita-se que, na maioria, seno em todas essas espcies, a infeco cause apenas febre transitria e, muitas vezes, pode ser absolutamente subclnica. A doena causada por um vrus pertencente ao gnero Nairovirus, classicado em um dos seis sorogrupos que formam o gnero. Vrus relacionados j foram identicados no Oriente Mdio, sia e antiga Unio Sovitica. O vrus replica em uma variedade de clulas primrias e de linhagem, incluindo Vero, BHK-21 e CER, nas quais produz citopatologia discreta e de difcil percepo. O isolamento e titulao do vrus geralmente so realizados pela inoculao intracerebral de camundongos lactentes. O carter zoontico e a possibilidade de transmisso por contato coloca o agente no nvel de biossegurana 4 (BSL-4) dentre os agentes patognicos manipulveis em laboratrio. A exemplo de outros vrus do gnero, o agente da CCHF transmitido entre animais por carrapatos pertencentes a vrios gneros. O vrus j foi isolado de aproximadamente 30 espcies de carrapatos. No entanto, os carrapatos do gnero Hyalomma parecem ser os principais envolvidos na transmisso e manuteno do vrus em reas endmicas, podendo ser transmitido de forma transestadial nesses invertebrados. A distribuio geogrca da enfermidade segue fundamentalmente a distribuio desses vetores. O vrus persiste nos vetores em todos os estdios de seu desenvolvimento e transmitido aos animais atravs da inoculao de saliva contaminada. Mamferos infectados geralmente desenvolvem altos ttulos de viremia durante aproximadamente uma semana, perodo no qual o vrus pode ser transmitido. Pessoas podem ser infectadas por contato direto com sangue, tecidos ou secrees desses animais ou, eventualmente, atravs da picada de carrapatos. A maioria dos casos hu-
Bunyaviridae
771
manos relatados foi ocupacional, ou seja, afetou indivduos envolvidos com atividades ligadas a pecuria ou a matadouros. A reduzida incidncia da doena humana, mesmo em reas endmicas e em indivduos com alto risco de exposio, sugere que a maioria das infeces assintomtica. Em pessoas, o perodo de incubao varia de acordo com a forma de transmisso. Em indivduos infectados pela picada de carrapatos, este perodo varia entre um e trs dias; aps contato com sangue ou tecidos contaminados, o perodo varia entre cinco e seis dias, atingindo um mximo de 13 dias. Os sinais iniciais so tpicos de viroses como a gripe, com cefalia, mialgia, febre, dor nos olhos, fotofobia. Nuseas, vmitos e faringite so observados com freqncia. Alteraes de comportamento, como agressividade e confuso mental, tambm tm sido relatados. Aps dois ou trs dias, esses sinais podem ser substitudos por depresso, sonolncia e dor abdominal, causada por hepatomegalia. Casos agudos graves podem incluir eventos hemorrgicos, como petquias e sufuses em mucosas, melena, hematria, epistaxe e sangramento das gengivas. Nestes casos, geralmente ocorre envolvimento heptico e renal, acompanhado de insucincia respiratria aps o quinto ou sexto dia da doena. A mortalidade atinge 30% dos infectados e ocorre geralmente durante a segunda semana da doena; indivduos que conseguem debelar a infeco se recuperam a partir do nono ou dcimo dia. Para o diagnstico, a enfermidade deve ser considerada em reas endmicas sempre que ocorrerem sinais semelhante gripe, com aparecimento sbito e curta durao, em pessoas potencialmente expostas a material animal contaminado ou a carrapatos. O prurido, que freqentemente ocorre, direciona o diagnstico, assim como as petquias e hematemese. O diagnstico laboratorial realizado pelo isolamento e identicao do vrus aps inoculao de plasma ou sangue em clulas de cultivo e deteco de antgenos virais por IFA. O controle deve se basear no combate aos carrapatos e na preveno da exposio humana a animais, sangue e tecidos potencialmente contaminados. Indivduos constantemente em contato com animais e subprodutos devem utilizar pro-
teo pessoal para minimizar o risco de contgio. Vacinas inativadas de uso humano, obtidas pela passagem do vrus em crebro de camundongos, j foram utilizadas em reas endmicas na antiga Unio Sovitica, mas no se encontram disponveis para uso em larga escala.
CHARLES, J.A. Akabane virus. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, v.10, p.525-546, 1994. DIXON, K.E. et al. Oropouche virus: Epidemiological observations during an epidemic in Santarm, Par, Brazil in 1975. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.30, p.161-164, 1981. DROSTEN, C. et al. Rapid detection and quantication of RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Rift Valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p.2323-2330, 2002. GEORGE, T.D.S.; STANDFAST, H.A. Diseases caused by Akabane and related Simbu-group viruses. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (eds.) Infectious diseases of livestock. Cape Town, South Africa: Oxford, 1994. Cap.70, p.681-687. GONZALEZ-SCARANO, F.; NATHANSON, N. Bunyaviridae. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields Virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.48, p.1473-1504. HARTLEY, W.J. et al. Serological evidence for the association of Akabane virus with epizootic bovine congenital arthrogryposis and hydranencephaly syndromes in New South Wales. Australian Veterinary Journal, v.51, p.103-104, 1975. HIJELLE, B.; GLASS, G.E. Outbreak of hantavirus infection in the Four Corners region of the United States in the wake of the 1997-1998 El Nino-southern oscilation. The Journal of Infectious Diseases, v.181, p.1569-1573, 2000. HUI, E.K. Reasons for the increase in emerging and re-emerging viral infectious diseases. Microbes and Infection, v.8, p.905-916, 2006. HUNT, A.R.; CALISHER, C.H. Relationships of Bunyamwera group viruses by neutralization. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.28, p.740-749, 1979. ICTVdb. Bunyaviridae. Disponvel em: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm.Acesso em: 15 jan. 2007. KIRKLAND, P.D. et al. The development of Akabane virusinduced congenital abnormalities in cattle. The Veterinary Record, v.122, p.582-586, 1988.
772
KONNO, S.; MORIWAKI, M.; NAKAGAWA, M. Akabane disease in cattle: congenital abnormalities caused by viral infection. Spontaneous disease. Veterinary Pathology, v.19, p.246-266, 1982. LEE, J.K. et al. Encephalomyelitis associated with akabane virus infection in adult cows. Veterinary Pathology, v.39, p.269-273, 2002. MERTZ, G.J. Bunyaviridae: bunyaviruses, phleboviruses, nairoviruses, and hantaviruses. In: RICHMAN, D.D.; WHITLEY, R.J.; HAYDEN, F.G. (eds). Clinical virology. New York: Churchill-Livingstone, 1997. p.943-972. PETERS, C.J. et al. Pathogenesis of viral hemorrhagic fevers: Rift Valley fever and Lassa fever contrasted. Reviews of Infectious Diseases, v.11, p.S473-479, 1989. PETERS, C.J. HPS in the Americas. In: SCHELD, W.M.; CRAIG, W.A.; HUGHES, J.M. (eds). Emerging Infectious Diseases 2. Washington, DC: ASM Press, 1998. p.17-64. SCHMALJOHN, C.S. Bunyaviridae: The Viruses and their replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.47, p.1447-1471. SCHMALJOHN, C.S. Bunyaviridae: the viruses and their replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fundamental virology. Philadelphia, PA: LippincottRaven, 1996. p.649-673.
Captulo 29
SCHMALJOHN, C.S.; HJELLE, B. Hantaviruses: a global disease problem. Emerging Infectious Diseases, v.3, p.95-104, 1997. SWANEPOEL, R.; COETZER, J.A.W. Rift Valley fever. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (eds.) Infectious diseases of livestock. Cape Town, South Africa: Oxford, 1994. Cap.71, p.688-717. SWANEPOEL, R. Crimean-Congo haemorrhagic fever. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (eds.) Infectious diseases of livestock. Cape Town, South Africa: Oxford, 1994. Cap.73, p.724-729. TERPSTRA, C. Nairobi sheep disease. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (eds.) Infectious diseases of livestock. Cape Town, South Africa: Oxford, 1994. Cap.72, p.718721. VASCONCELOS, P.F.C. et al. Primeiro registro de epidemias causadas pelo vrus Oropouche nos Estados do Maranho e Gois, Brasil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v.31, p.271-278, 1989. WELLS, R.M.; ESTANI, S.S.; YADON, Z.E. An unusual outbreak in southern Argentina: person-to-person transmission? Emerging Infectious Diseases, v.3, p.171-174, 1997. WILSON, M.L. Rift Valley fever virus ecology and the epidemiology of disease emergence. Annals of the New York Academy of Sciences, v.740, p.169-180, 1994.
REOVIRIDAE
Amauri A. Aleri, Alice F. Aleri, Elisabete Takiuchi & Zlia Ins Portela Lobato
30
775 775 777
777 778 779 779
1 Introduo 2 Classicao 3 Gnero Orthoreovirus

3.1 Caractersticas do vrion e do genoma 3.2 Propriedades gerais 3.3 Orthoreovirus de mamferos 3.4 Orthoreovirus avirios
4 Gnero Rotavirus
4.1 Classicao 4.2 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica 4.3 Replicao 4.4 Enfermidades causadas por rotavrus 4.4.1 Patogenia e sinais clnicos 4.4.2 Imunidade 4.4.3 Diagnstico 4.4.4 Controle e prolaxia
780
781 782 786 788 790 790 791 792
5 Gnero Orbivirus
5.1 Propriedades gerais 5.2 O vrion, o genoma e as protenas virais 5.3 Replicao 5.4 Patogenia 5.5 Vrus da lngua azul 5.5.1 Epidemiologia 5.5.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.5.3 Diagnstico 5.5.4 Controle e prolaxia 5.6 Vrus da doena hemorrgica epizotica dos cervdeos 5.6.1 Epidemiologia
793
793 794 796 797 798 798 800 802 802 803 803
5.6.2 Patogenia, sinais clnicos e patologia 5.6.3 Diagnstico 5.6.4 Controle e prolaxia
804 804 805
805
1 Introduo
A famlia Reoviridae composta por vrus que infectam uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo invertebrados, plantas e vertebrados. As infeces de vertebrados afetam principalmente os tratos gastrintestinal e respiratrio. A denominao Reovirus derivada das palavras Respiratory, Enteric e Orphan, sendo esta ltima denominao (rfos) referente a vrus que no puderam ser associados com nenhuma doena conhecida. Embora vrios desses vrus j tenham sido relacionados recentemente com algumas doenas, o nome ainda persiste. Os vrus que compem essa famlia compartilham as seguintes caractersticas: a) vrions com simetria icosadrica; b) ausncia de envelope glicoprotico; c) genoma constitudo por RNA ta dupla (dsRNA) segmentado; d) RNA genmico infeccioso somente quando associado com as protenas virais; e) transcriptase presente nos vrions; e f) replicao no citoplasma da clula hospedeira. O tipo e organizao do genoma so as principais caractersticas em comum dos vrus includos na famlia Reoviridae. O genoma desses vrus constitudo por 10, 11 ou 12 molculas de dsRNA, ou seja, possuem o genoma segmentado. Em geral, cada segmento genmico codica uma protena viral, mas h casos em que duas ou at trs protenas so codicadas pelo mesmo segmento. Vrus com o genoma constitudo por dsRNA tambm podem ser encontrados em outras cinco famlias virais. No entanto, somente duas (Reoviridae e Birnaviridae) possuem vrus que infectam vertebrados. Destas, apenas os vrus da famlia Reoviridae produzem infeces em mamferos. Os vrions dos membros da Reoviridae possuem uma arquitetura complexa: so desprovidos de envelope, possuem 60 a 85 nm de dimetro, simetria icosadrica e capsdeo duplo. A exemplo da maioria dos vrus RNA, esses vrus realizam o seu ciclo replicativo no citoplasma da clula hospedeira. A famlia Reoviridae bastante complexa com relao s suas caractersticas biolgicas e moleculares. A famlia composta por 11 gneros, porm apenas cinco esto associados com doen-
a em vertebrados. Destes, apenas os orbivrus e rotavrus possuem importncia em medicina veterinria. No obstante, os vrus do gnero Orthoreovirus tambm possuem alguma importncia veterinria e sero abordados resumidamente. Embora compartilhem vrias propriedades estruturais, genticas e biolgicas, os diferentes gneros que compem a famlia Reoviridae tambm apresentam diferenas importantes entre si. Por essa razo, os gneros Orthoreovirus, Rotavirus e Orbivirus sero abordados separadamente.
2 Classicao
A famlia Reoviridae composta por 11 gneros, dos quais apenas cinco infectam vertebrados (Orthoreovirus, Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus e Aquareovirus). Destes, apenas os gneros Orbivirus e Rotavirus ocasionam infeces que, por suas caractersticas epidemiolgicas e pela gravidade dos sinais clnicos, so consideradas importantes em mamferos. Alguns ortoreovrus tambm produzem infeces de alguma importncia clnica em humanos e animais (Tabela 30.1). Fotograas de microscopia eletrnica de vrions representativos dos ortoreovrus, rotavrus e orbivrus esto apresentados na Figura 30.1. O gnero Aquareovirus contm diversos vrus que j foram isolados de vrias espcies de peixes de gua doce e salgada, ostras e outros moluscos. Com base em tcnicas de hibridizao (RNA-RNA), so descritas seis espcies de aquareovrus, denominadas de A a F. Esses vrus apresentam uma grande especicidade de hospedeiro, de acordo com a espcie viral. Tanto o potencial patognico quanto o impacto econmico da maioria das infeces ocasionadas pelos aquareovrus ainda no esto claramente denidos. O vrus da febre do carrapato do Colorado (Colorado tick fever virus, CTFV) o prottipo do gnero Coltivirus. O CTFV tem sido isolado de carrapatos, roedores e de seres humanos na Amrica do Norte. Um outro vrus, denominado Eyach, tambm isolado de carrapatos e, possivelmente, de seres humanos na Europa (Alemanha e Frana), apresenta reao cruzada em testes
776
Captulo 30
de neutralizao com o CTFV. Esses dois vrus, que so facilmente distinguveis, foram relatados como sorotipos distintos e includos no subgrupo A dos coltivrus.
Mais recentemente, vericou-se que vrios isolados de coltivrus, provenientes da Indonsia e da China, eram sorologicamente distintos dos coltivrus do subgrupo A. Em 2001, foi propos-
Tabela 30.1. Principais vrus da famlia Reoviridae associados com doenas em animais.
Gnero
Orthoreovirus
Vrus
Reovrus de mamferos 1-3 Reovrus avirios 1-11
Espcies afetadas
Isolado de vrios mamferos Galinhas, perus e gansos
Doena
Hepatoencefalomielite em camundongos Artrite, nefrose, enterite, doena respiratria crnica, miocardite Enterite
Rotavirus
Rotavrus: vrios, geralmente espcie-especficos Vrus da lngua azul 1-25 Vrus da peste eqina 1-9
Virtualmente todas as espcies Ovinos, bovinos e cervdeos Eqinos, asnos, burros e zebras Eqinos
Orbivirus
Lngua azul Peste eqina
Vrus da encefalose eqina 1-5 Vrus da doena epizotica hemorrgica dos cervos 1-7 Vrus Ibaraki
Aborto e encefalite
Cervos
Doena epizotica hemorrgica Doena febril aguda, similar a lngua azul Aborto, malformaes congnitas
Bovinos
Vrus Palyam 1-6
Bovinos
Fonte: A) Dr. Stewart McNulty; qub.ac.uk; B) Dr C. Bchen-Osmond, ICTVdB; C) www.usask.ca
Figura 30.1. Fotografias de microscopia eletrnica de vrions representativos dos gneros Orthoreovirus (A), Rotavirus (B), e Orbivirus (C).
Reoviridae
777
to que fosse criado um novo gnero na famlia Reoviridae para esses isolados asiticos: Seadornavirus. Ento, somente os vrus com caractersticas antignicas do subgrupo A permaneceram no gnero Coltivirus. Nesse novo gnero, ainda no foram descritos isolamentos em animais. A febre do carrapato do Colorado uma zoonose que ocorre em uma regio geogrca bem denida na Amrica do Norte (Montanhas Rochosas, estado do Colorado). Carrapatos do gnero Dermatocentor andersoni atuam como vetores biolgicos do CTFV, e pequenos roedores so os reservatrios do vrus. Em seres humanos, a doena manifesta-se sob duas formas clnicas distintas: uma forma branda, caracterizada por sinais clnicos inespeccos, como febre, cefalia, mialgia e leucopenia; e outra mais grave (5% dos casos), na qual podem ser observadas meningoencefalite e febre hemorrgica.
a 11). Com base em anlises de seqncias genmicas e de protenas, novas espcies de Orthoreovirus tm sido subseqentemente descritas. Atualmente so consideradas quatro espcies, alm de outras cepas virais em processo de reconhecimento como novas espcies. Algumas das novas espcies, como o reovrus de babuno, encontram-se logeneticamente em uma posio intermediria entre os reovrus de mamferos e os avirios. Como o conhecimento acumulado sobre essas novas espcies e cepas virais ainda escasso e, principalmente, devido ao impacto ainda no avaliado desses vrus na sade animal, neste captulo sero apenas consideradas as duas espcies clssicas de ortoreovrus: mamferos e avirios.
3.1 Caractersticas do vrion e do genoma

As partculas virais dos reovrus de mamferos e de aves compartilham vrias caractersticas em comum. Os vrions no-envelopados de simetria icosadrica apresentam aproximadamente 85 nm de dimetro (ver Figura 30.1). O genoma dsRNA, com aproximadamente 23.500 pares de bases (bp), constitudo por 10 segmentos que podem ser agrupados em trs classes denominadas L (large), M (medium) e S (small), de acordo com a respectiva massa molecular. possvel a separao dos segmentos genmicos por eletroforese em gel de poliacrilamida, de acordo com a massa. Na classe L, encontram-se os segmentos genmicos 1, 2 e 3 (L1, L2 e L3); na classe M, os segmentos 4, 5 e 6 (M1, M2 e M3) e, na classe S, os segmentos 7, 8, 9 e 10 (S1, S2, S3 e S4). O genoma dos reovrus codica 12 protenas, e oito segmentos codicam apenas uma protena e dois segmentos codicam duas protenas cada. Dessas, oito protenas so estruturais (fazem parte da estrutura do vrion) e quatro so no-estruturais. As protenas estruturais constituem o capsdeo interno (n = 4) e externo (n = 4), e as protenas no-estruturais, presentes apenas nas clulas infectadas, desempenham importantes funes enzimticas e regulatrias durante a replicao viral. As protenas dos reovrus so identicadas por letras gregas, de acordo com a
3 Gnero Orthoreovirus
Os primeiros vrus dsRNA isolados dos tratos respiratrio e entrico de seres humanos e animais, alguns mesmo sem vnculo com doenas conhecidas, foram denominados genericamente reovrus. Posteriormente, foram isolados e caracterizados outros vrus com genoma dsRNA segmentado, com caractersticas antignicas, moleculares e clnicas distintas dos reovrus originais (p. ex.: rotavrus e orbivrus) e que, por suas caractersticas semelhantes, tambm foram includos na famlia Reoviridae. Com o objetivo de diferenciar os isolados primrios (reovrus) dos novos vrus isolados, foi adicionado o suxo ortho aos isolados iniciais de reovrus, que constituram, ento, o gnero Orthoreovirus. Os membros deste gnero so comumente chamados de reovrus e assim sero tratados neste texto. Ou seja, a denominao vernacular reovrus se refere aos membros do gnero e no aos membros da famlia Reoviridae em geral. Classicamente, o gnero Orthoreovirus subdividido em duas espcies: ortoreovrus (reovrus) de mamferos e ortoreovrus (reovrus) avirios. Dentre os reovrus de mamferos so descritos trs sorotipos (1 a 3), e 11 sorotipos j foram identicados entre os reovrus avirios (1
778
Captulo 30
Tabela 30.2. Vrus do gnero Orthoreovirus: segmentos genmicos, protenas codificadas e sua localizao nos vrions.
Genoma
Protena
Segmento
1 2
Classe
L1 L2
Nucleotdeos
3854 3916
Denominao Aminocidos
3 2 1267 1289
Localizao/funo
Capsdeo interno, polimerase de RNA dependente de RNA Capsdeo externo, guanililtransferase, metiltransferase? Capsdeo interno, protena de ligao ao RNA, metaloproteina Capsdeo interno, funo desconhecida Capsdeo externo, funo na penetrao e ativao da transcriptase No-estrutural, liga-se ao RNA, ativa a transcrio secundria No-estrutural Capsdeo externo, liga ao receptor, hemaglutinina, determinante de sorotipo No-estrutural, funo desconhecida Capsdeo interno, liga-se ao RNA No-estrutural, liga-se no RNA Capsdeo externo, liga-se ao RNA, atua na traduo
L3
3901
1275
4 5
M1 M2
2304 2203
736 708
M3
2241
NS+ NSC
721 681 455
S1
1416
s1 s1S
120
8 9 10
S2 S3 S4
1331 1198 1196
s2 sNS s3
418 366 365
classe de segmentos genmicos e, conseqentemente, de suas respectivas massas moleculares, como (lambda) para as protenas da classe L; (mi) para a classe M e (sigma) para a classe S (Tabela 30.2).

Algumas caractersticas das partculas virais, como a ausncia de envelope lipoprotico e a presena de capsdeo duplo, fazem com que os vrions sejam muito estveis s condies do meio ambiente. Os vrions so estveis em uma ampla faixa de pH e resistentes a solventes de lipdios, como o ter e o clorofrmio. Tambm devido
relativa resistncia das partculas virais, desinfetantes comuns, como a formalina, lisol, derivados fenlicos e perxido de hidrognio, devem ser utilizados com cautela, pois, dependendo da concentrao e do tempo de exposio, os reovrus podem manter a sua viabilidade. O hipoclorito de sdio e o etanol a 95% so os desinfetantes de eleio. Nos processos de desinfeco de instalaes e equipamentos, deve-se sempre considerar que os reovrus so primariamente vrus respiratrios e entricos, e que secrees e excrees so as fontes primrias de contaminao do ambiente, gua e alimentos. Os vrions so sensveis ao da luz ultravioleta, e essa caracterstica deve ser considerada para o manejo de vazio sanitrio em ambientes com incidncia de luz solar direta.
Reoviridae
779
Os reovrus podem ser amplicados em uma srie de cultivos celulares, tanto de clulas primrias quanto de linhagem. A maioria dos isolados produz efeito citoptico, porm alguns podem ser no-citopticos. A utilizao de enzimas proteolticas (p. ex.: tripsina) no meio de cultivo aumenta a infectividade das partculas vricas. Os reovrus de mamferos exibem atividade hemaglutinante, propriedade que ausente nos reovrus avirios. A presena ou ausncia desta propriedade biolgica muito utilizada como indicador nas etapas iniciais de identicao de isolados virais obtidos a partir de casos clnicos.
3.3 Orthoreovirus de mamferos

As infeces por reovrus de mamferos so muito freqentes, independentemente de regio geogrca e do sorotipo viral. Inquritos soroepidemiolgicos em vrias espcies animais e tambm em humanos demonstraram que a taxa de adultos soropositivos alta (60-85%). Entretanto, os relatos de doena clnica associada com esses vrus so espordicos. Com isso, presume-se que a grande maioria das infeces inaparente ou subclnica. Em humanos, a infeco por reovrus tem sido relacionada com doenas respiratrias e entricas sem gravidade, tanto em crianas como em adultos e idosos. Os sinais clnicos mais freqentemente relatados incluem cefalia, mal-estar, rinite, faringite, tosse, espirro e diarria. Os reovrus de mamferos j foram, ainda, de forma muito espordica, implicados em infeces infantis no relacionadas aos sistemas respiratrio e digestivo, como atresia biliar extra-heptica neonatal, meningite assptica, exantema e adenopatia cervical. Anticorpos anti-reovrus j foram relatados em uma grande variedade de mamferos domsticos e selvagens. Sinais clnicos so esporadicamente relatados em animais jovens. Em eqinos, a infeco tem sido relacionada com sinais clnicos de infeco respiratria, como laringite, rinite e tosse. Conjuntivite tambm tem sido esporadicamente relatada. Em bovinos, ovinos, sunos, ces e gatos, alm de relatos de distrbios respiratrios, quase sempre secundrios, a infec-
o tambm tem sido relacionada com ocorrncia de diarria. Em animais, a infeco mais importante por esses vrus ocorre em camundongos e, por isso, essa espcie muito utilizada em estudos experimentais. Sinais clnicos variados, como diarria, oleosidade de pele e plos, sinais neurolgicos (ataxia), hepatite, ictercia, miocardite e pancreatite, so descritos em camundongos natural e/ou experimentalmente infectados com reovrus. Tanto em animais quanto em seres humanos, infeces bacterianas secundrias e condies imunolgicas desfavorveis, como imunodepresso por qualquer origem, podem complicar o quadro clnico produzido pelas infeces por reovrus, principalmente em hospedeiros jovens e senis.
3.4 Orthoreovirus avirios

Os reovrus avirios caracterizam-se pela especicidade de hospedeiro, diversidade antignica e pela ausncia de atividade hemaglutinante na grande maioria dos isolados, o que contrasta com a caracterstica hemaglutinante dos reovrus dos mamferos. Dentre os reovrus avirios, so descritos 11 sorotipos distintos que, de acordo com a procedncia (distribuio geogrca, espcie aviria e material clnico de origem), podem apresentar considervel reatividade sorolgica cruzada devido presena de antgenos comuns. O isolamento dos reovrus avirios pode ser obtido com relativa facilidade, pois o vrus adaptase a uma srie de sistemas, como ovos embrionados de galinha. Nesse sistema, o material deve ser inoculado no saco da gema ou na membrana crio-alantide. Leses macro e microscpicas, acompanhadas de morte, caracterizam a infeco dos embries. Os reovrus avirios podem ser isolados tambm em cultivo primrio de clulas originadas de embrio de galinha, como broblastos, rim, fgado e pulmo. O isolamento viral pode ser monitorado pelo efeito citoptico, que se caracteriza pela formao de sinccios, degenerao celular e produo de incluses intracitoplasmticas. Clulas de linhagem contnua (ou estabelecida) de mamferos tambm podem ser utilizadas para o isolamento de reovrus avirios,
780
Captulo 30
destacando-se as linhagens derivadas de tecido renal Vero, BHK-21 (clulas renais de hamster), GBK (clula de rim bovino), CRFK (clulas de rim felino) e PK (clulas de rim suno). Vrias espcies de aves domsticas e silvestres so susceptveis a esses vrus, porm a infeco assume especial importncia em galinhas e perus. Vrias condies intercorrentes so necessrias para denir o curso de uma infeco. A presena ou a ausncia de sinais clnicos e mesmo o nmero de aves acometidas esto relacionados com vrios fatores, que incluem: a) gentica e idade do hospedeiro; b) sorotipo viral e via de infeco; c) infeces bacterianas, parasitrias e virais intercorrentes, incluindo aquelas com caractersticas imunodepressoras; d) manejo zootcnico inadequado, acarretando em desconforto e estresse; e) qualidade da rao (composio, presena de micotoxinas); f) falhas no manejo sanitrio, entre outros. Essas condies, tanto de forma isolada quanto em associao, podem denir o conceito de doenas ou sndromes multifatoriais e multietiolgicas que contribuem com a emergncia de novas doenas ou mesmo a reemergncia de doenas conhecidas. Os reovrus avirios tm sido isolados, com maior freqncia, de uma variedade de tecidos e rgos de aves acometidas por vrias doenas no-relacionadas, como artrite/tenosinovite, sndrome da refugagem, sndrome da m-absoro, alm de aves com problemas respiratrios e entricos. Em outras condies menos freqentes, tambm h relatos do isolamento dos reovrus avirios, como associados com ruptura do tendo do gastrocnmio, osteoporose, pericardite, miocardite, hidropericrdio, empastamento da cloaca, mortalidade de pintinhos. Vrias dessas condies clnicas podem ocorrer concomitantemente, como as sndromes da refugagem e da mabsoro, empastamento da cloaca e aumento da taxa de mortalidade de pintinhos. Em contraste, os reovrus avirios tambm podem ser isolados a partir de aves clinicamente sadias. A entidade clnica mais bem denida e classicamente atribuda ao reovrus avirio em galinhas e perus a artrite viral. A infeco natural ocorre usualmente em aves jovens (4 a 6 semanas de idade), mas tambm pode ser observada em
faixas etrias mais avanadas. A taxa de morbidade pode ser de 100%, mas a taxa de mortalidade relativamente baixa (em mdia 5%). A evoluo pode ser aguda ou crnica, e as aves comprometidas apresentam dor articular, claudicao com conseqentes diculdades de locomoo e alimentao. Devido perda da condio corporal e refugagem, muitas aves so eliminadas do lote. A intensidade dos sinais clnicos e o nmero de aves comprometidas esto relacionados com a idade da ave e com o sorotipo viral envolvido. Fatores intercorrentes, como infeces mistas com Mycoplasma synoviae e falhas nos manejos zootcnico, nutricional e sanitrio, tambm podem agravar a infeco. Os prejuzos econmicos ocasionados pela reovirose aviria em criaes comerciais de frangos de corte e de perus devem-se incapacidade e denhamento de aves com quadro clnico de artrite/tenosinovite, ao aumento da taxa de mortalidade e reduo da performance geral, incluindo ganho de peso e converso alimentar. Essas condies ocasionam um aumento da refugagem e perda da aceitao das aves no mercado.
4 Gnero Rotavirus
Os rotavrus membros do gnero Rotavirus so considerados em todo o mundo como um dos principais vrus entricos tanto para humanos quanto para animais. A maioria das infeces agudas pelos rotavrus caracteriza-se por sua gravidade, sendo, com freqncia, acompanhadas de diarria, desidratao, desequilbrio eletroltico e acidose. Os rotavrus esto amplamente disseminados na natureza, e uma gama de hospedeiros susceptvel infeco, incluindo mamferos domsticos e silvestres e tambm as aves. A infeco, quando acomete animais jovens, geralmente acompanhada de sinais clnicos. Em adultos, infeco com freqncia assintomtica, porm esses indivduos podem ser portadores e transmissores do vrus para indivduos jovens da mesma espcie. Na dependncia da virulncia da cepa viral infectante e em hospedeiros com potencial de resposta imunolgica comprometido, tanto por infeces imunodepressoras recorrentes quanto pela idade avanada, algumas infec-
Reoviridae
781
es em adultos podem ser acompanhadas por sinais clnicos de diarria. Os rotavrus so predominantemente espcie-especcos, porm infeces heterlogas tambm so relatadas com grande freqncia. As infeces heterlogas so caracterizadas pela infeco de uma determinada espcie animal por um rotavrus de outra espcie, como as infeces humanas causadas por sorotipos e/ou gentipos de rotavrus de sunos e bovinos, e vice-versa. A primeira situao exemplica o carter zoontico da infeco que, at recentemente, no era considerado. Em animais de produo, a infeco pelos rotavrus assume especial importncia epidemiolgica e, conseqentemente, econmica na criao de bovinos, sunos e frangos de corte. O rotavrus o principal agente etiolgico do complexo diarria neonatal bovina e suna, de etiologia multifatorial e multietiolgica, envolvendo fatores relacionados ao manejo zootcnico e sanitrio, alm de microorganismos, como bactrias, protozorios e vrus. A diarria neonatal em bovinos e sunos o principal problema sanitrio nessa fase da criao. Nos episdios de diarria neonatal, com alta taxa de morbidade, as principais conseqncias da infeco pelo rotavrus, alm dos sinais clnicos, concentram-se em alteraes signicativas nas taxas de converso alimentar e ganho de peso e em aumento nos custos de produo e da taxa de mortalidade. A rotavirose est amplamente disseminada nos rebanhos e/ou plantis de bovinos, sunos e frangos de corte brasileiros. Nessas trs espcies, a infeco mais freqente na faixa etria entre a segunda e terceira semanas de vida. Em bovinos, a infeco constitui-se em srio problema sanitrio para animais com aptido para a produo de leite ou para carne, incluindo tanto aqueles rebanhos manejados de forma intensiva quanto extensiva. Com isso, a infeco assume especial importncia para a medicina veterinria.
4.1 Classicao
De acordo com as diferenas antignicas detectadas na VP6, que a protena mais abundante dos vrions, os rotavrus podem ser classi-
cados em sete sorogrupos distintos, designados pelas letras A a G. Os grupos A, B e C tm sido encontrados tanto em humanos quanto em outras espcies animais; enquanto os grupos D a G foram identicados exclusivamente em animais. Dos sete sorogrupos dos rotavrus, somente os grupos A, B e C produzem infeces, que, pela sua freqncia, podem ser consideradas de importncia clnica e epidemiolgica para humanos e animais. A grande maioria dos episdios de diarria, e mesmo as infeces subclnicas nessas espcies, est associada com os rotavrus do grupo A. A infeco pelo rotavrus grupo B menos freqente e, alm do homem, j foi relatada em bovinos, sunos, ovinos e roedores. O grupo C de rotavrus tem sido identicado em vrias partes do mundo como causador de diarria em humanos e animais, principalmente sunos. Em bovinos, a identicao do rotavrus grupo C em fezes de animais com diarria um evento raro. Da mesma forma que a classicao em grupos sorolgicos, o perl de migrao dos 11 segmentos genmicos de dsRNA em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) tambm possibilita a classicao dos rotavrus em sete grupos distintos (A-G), denominados eletroferogrupos. As variaes observadas no perl eletrofortico das cepas ou isolados de rotavrus classicadas em um mesmo eletroferogrupo so denominadas eletroferotipos. O padro eletrofortico de migrao dos 11 segmentos genmicos dos rotavrus do grupo A, de acordo com a massa molecular de cada segmento, distribudo em classes constitudas pelos segmentos 1 a 4 (Classe I); 5 e 6 (Classe II); 7, 8, e 9 (Classe III) e os segmentos 10 e 11 (Classe IV). Essa disposio freqentemente representada como 4-2-3-2, indicando o nmero de segmentos genmicos encontrados em cada classe do grupo A. Uma importante caracterstica eletrofortica do rotavrus do grupo A a migrao dos segmentos genmicos 7, 8 e 9 em forma de trinca, uma vez que as suas respectivas massas moleculares so muito prximas, podendo em muitas circunstncias co-migrarem em gel de poliacrilamida (Figura 30.2). Por outro lado, os rotavrus dos grupos B a G, denominados atpicos, no apresentam essa distribuio caracterstica em forma de trinca.
782
Captulo 30
Contudo, o perl genmico obtido por meio da migrao em PAGE (eletroferotipo) no deve ser utilizado como nico mtodo de classicao dos rotavrus, pois alteraes no genoma viral, como rearranjos e delees, podem resultar em alteraes no padro de migrao dos segmentos. Alm da classicao dos rotavrus em sorogrupos (de acordo com a reatividade sorolgica com a VP6), as protenas do capsdeo externo VP4 e VP7 ou os segmentos genmicos que as codicam permitem a caracterizao das amostras de rotavrus em sorotipos e/ou gentipos. Dessa forma, os rotavrus possuem um sistema binrio de classicao, constitudo por tipos de VP4 (P tipos protease sensvel) e tipos de VP7 (G tipo glicoprotena). Atualmente, por meio de tcnicas sorolgicas e/ou moleculares, so descritos mais
de 27 diferentes tipos de P (VP4) e 15 tipos de G (VP7). Entre as mais de 405 combinaes possveis entre os diferentes gentipos P (27) e G (15), algumas so mais freqentes.
4.2 Propriedades dos vrions, estrutura e organizao genmica

Os vrions medem aproximadamente 85 nm de dimetro e no possuem envelope. A denominao Rotavirus surgiu da palavra de origem latina rota, que signica roda, devido aparncia das partculas virais quando observadas sob microscopia eletrnica (ME) (Figura 30.1). O capsdeo viral formado por trs camadas proticas concntricas de simetria icosadrica, denominadas capsdeo externo, intermedirio e interno
Rotavrus grupo A Tpicos humanos humanos bovinos sunos B
Outros grupos Atpicos C D E
-1
2 3 4 5 6 7 8 9
< <
10
11
<
<
a
<
b c d d
<
e
<
e
longo curto
Fonte: Alfieri et al. (1996).
Figura 30.2. Ilustrao esquemtica do padro de migrao dos segmentos genmicos dos rotavrus pertencentes aos eletroferogrupos A a E, aps eletroforese em gel de poliacrilamida.
Reoviridae
783
(Figura 30.3). De acordo com a sua composio protica e estrutura, trs tipos de partculas vricas podem ser visualizadas sob ME. As partculas completas apresentam todo o conjunto de protenas estruturais, distribudas em trs camadas proticas (Figura 30.3A). Partculas contendo apenas duas camadas proticas, que podem ser obtidas experimentalmente pela remoo da VP4 e VP7 por mtodos qumicos, tambm so observadas, porm no so infecciosas (Figura 30.3B). A remoo da VP6, que tambm pode ser obtida in vitro, resulta em partculas menores, no-infecciosas, compostas apenas pelo ncleo ou core (Figura 30.3C). No interior do ncleo, encontra-se o genoma viral, constitudo por 11 molculas de dsRNA. Cada um dos 11 segmentos genmicos codica pelo menos uma protena viral, totalizando seis protenas estruturais e seis protenas no-estruturais. Estudos com a estirpe SA11 do rotavrus smio identicaram uma sexta protena no-estrutural, codicada pelo segmento 11 do genoma, sendo este o nico segmento que codica mais de uma protena. A Figura 30.4 apresenta a estrutura esquemtica do vrion, os segmentos genmicos e as protenas codicadas por cada segmento. Os vrions contm a atividade de RNA polimerase dependente de RNA e as demais fun-
es enzimticas necessrias para a replicao viral. As protenas estruturais so designadas VP (viral protein), seguidas por nmero seqencial na ordem decrescente da massa molecular. No core ou ncleo, esto presentes as protenas VP1 (125kDa), VP2 (94kDa) e VP3 (88kDa); no capsdeo intermedirio, a VP6 (46kDa); e, no capsdeo externo, as protenas VP4 (88kDa) e VP7 (38kDa). As protenas no-estruturais, encontradas nas partculas virais maduras, recebem a denominao NSP (non-structural protein). No core ou ncleo viral, as protenas VP1 e VP3 esto diretamente associadas com o genoma. A protena VP2, com 120 molculas por vrion, a mais abundante do ncleo. A protena VP1 possui atividade de RNA polimerase RNA-dependente, e a protena VP3 possui atividade de guanililtransferase, estando envolvida na adio da estrutura 5-cap aos RNAs mensageiros (mRNAs). O capsdeo intermedirio formado por 780 molculas da protena estrutural VP6, organizadas em 260 unidades trimricas. O capsdeo externo composto por duas classes de protenas, VP4 e VP7, que so responsveis pelas interaes iniciais do vrus com a clula hospedeira. A superfcie externa do vrus apresenta 780 cpias da glicoprotena VP7, em arranjos trimricos, e 120 cpias da protena VP4, que formam 60 estrutu-
Partcula com capsdeo triplo VP4, VP7
Partcula com capsdeo duplo VP6
Core ou ncleo
Agentes quelantes
(10mM EDTA)
Agentes caotrpicos
(1,5M CaCl2)
Protenas: VP1, 2, 3, 4, 6, 7 Infecciosa
Protenas: VP1, 2, 3, 6 No-infecciosa
Protenas: VP1, 2, 3 No-infecciosa
Fonte: adaptado de Estes (2001).
Figura 30.3. Ilustrao esquemtica da estrutura dos trs tipos de partculas vricas dos rotavrus que podem ser visualizadas sob ME.
784
Captulo 30
1 2 3 4
VP1 VP2 VP3 VP4
5 6
NSP1 VP6
7 8 9
NSP2 NSP3 VP7
10 11
NSP4 NSP5 NSP6
Segmentos genmicos
Protenas
Figura 30.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida, mostrando os segmentos genmicos (dsRNA) dos rotavrus (esquerda); as protenas codificadas por cada segmento (centro) e uma ilustrao simplificada de uma partcula vrica e os seus componentes (direita). Os segmentos esto numerados com base na migrao do genoma do rotavrus grupo A da cepa Sa11.
ras dimricas semelhantes a espculas. A protena VP4 contm um stio de clivagem pela tripsina e, quando submetida ao tratamento in vitro com protease, gera dois produtos: as protenas VP5 e VP8, que aumentam a infectividade do vrus. Os genes dos rotavrus, com os seus respectivos produtos e funes, esto apresentados na Tabela 30.3. Os rotavrus so os nicos vrus conhecidos de mamferos e aves que possuem 11 segmentos de dsRNA como genoma. A extenso de cada um dos 11 segmentos genmicos varia entre 600 e 3.000 pb, e o genoma completo apresenta aproximadamente 18.600 pb. essa diferena de tamanho que possibilita que os segmentos genmicos apresentem um perl de migrao caracterstico e nico para os rotavrus quando separados por PAGE.
O prottipo smio SA11 foi o primeiro rotavrus a ter o genoma completamente seqenciado. As extremidades 5 das tas genmicas de polaridade positiva possuem uma estrutura cap, mas diferentemente da maioria dos mRNA celulares, no possuem as extremidades 3 poliadeniladas. Todos os genes dos rotavrus esto anqueados por regies traduzidas de extenso varivel prximo as extremidades 5 e 3. Em todos os segmentos, essas seqncias no-traduzidas anqueiam uma nica seqncia aberta de leitura (open reading frame, ORF), com exceo do segmento 11, que possui duas ORFs. Quase todos os mRNA terminam com a seqncia consenso 5-UGUGACC-3, sugerindo que se constituam em sinais importantes para a transcrio, transporte do RNA e replicao e/ou encapsidao dos segmentos genmicos.
Reoviridae
785
Tabela 30.3. Caractersticas dos segmentos genmicos e protenas codificadas pelo genoma segmentado dos rotavrus
Gene
1 2 3 4
Protena
Massa (Da)
Localizao nas partculas
Nmero de cpias
Funes
VP1 VP2 VP3 VP4
125.005 102.431 98.120 86.782 60.000 28.000
Nucleocapsdeo Nucleocapsdeo Nucleocapsdeo Capsdeo Produto da clivagem de VP4 Produto da clivagem de VP4
12 120 12 120
RNA polimerase RNA-dependente. Unio ao RNA; forma o nucleocapsdeo. Guanililtransferase; metiltransferase; protena bsica. Protena de unio clula; interage com VP6; antgeno neutralizante P-tipo. Infectividade aumenta aps clivagem pela tripsina, formando as protenas Vp5 e VP8. Associa-se ao citoesqueleto; interage com fator 3 regulatrio de IFN. Protena estrutural do capsdeo intermedirio; antgeno de subgrupo. Envolvida na regulao da traduo. Acumula-se em viroplasmas; atividade NTPase; liga-se NSP5 e Vp1. Glicoprotena estrutural do capsdeo externo; antgeno neutralizante G-tipo. Enterotoxina; receptor para partculas.
5 6 7 8 9 10 11
NSP1 VP6 NSP3 NSP2 VP7 NSP4 NSP5 NSP6
58.654 48.16 34.600 34.700 7.368 20.290 21.725 11.012
Protena no-estrutural Capsdeo Protena no-estrutural Protena no-estrutural Capsdeo externo Protena no-estrutural Protena no-estrutural Protena no-estrutural
0 780 0 0 780 0 0 0
Possvel cinase autocaltica; interage com VP2, NSP2 e NSP6. Produto do ORF2 do gene 11; interage com NSP5; localizada em viroplasmas.
O ressortimento (reassortment) uma forma de recombinao gentica dos rotavrus pode ocorrer quando uma clula co-infectada por duas cepas virais distintas, de forma que a prognie viral ser constituda por uma populao contendo diferentes combinaes dos genes parentais. A ocorrncia desse fenmeno de variabilidade gentica permitida pela homologia da seqncia consenso (5-UGUGACC-3) entre todos os segmentos do genoma viral. Os rotavrus so relativamente estveis em condies ambientais, mantendo a sua infectividade na faixa de pH entre 3 e 9. Amostras virais isoladas de bezerros permaneceram infectivas durante vrios meses a 4C ou mesmo a -20C quando estabilizadas em 1,5 mM CaCl2. A ausncia de lipdeos na estrutura dos vrions justica a resistncia desses vrus aos solventes orgnicos, tais como: ter, clorofrmio ou fren. Pelos efeitos
deletrios que ocasionam na camada externa do vrion, a formalina, o cloro, a betapropiolactona, o etanol a 95% e o glutaraldedo so considerados desinfetantes ecientes para esses vrus. A complexidade molecular e antignica dos rotavrus decorrente da diversidade genmica gerada por trs mecanismos genticos bsicos: mutaes pontuais, ressortimento e rearranjos genmicos. As mutaes pontuais consistem em alteraes na seqncia de nucleotdeos que ocorrem durante a replicao do genoma e que acarretam substituies de aminocidos das protenas. Essas mutaes podem alterar os stios antignicos, resultando em cepas resistentes aos anticorpos neutralizantes produzidos contra as cepas parentais. O ressortimento uma forma de recombinao que ocorre em vrus com o genoma segmentado, decorrentes da troca de segmentos genmicos por cepas diferentes por ocasio de
786
Captulo 30
uma co-infeco de uma clula. Por meio desse mecanismo, novas cepas virais podem surgir rapidamente. A co-infeco celular por cepas geneticamente prximas pode promover naturalmente o mesmo fenmeno de forma mais eciente. As alteraes na seqncia de nucleotdeos, identicadas em pores importantes de um segmento genmico, muitas vezes na forma de delees ou duplicaes, so denominadas de rearranjo. Tais alteraes determinam modicaes na massa molecular dos segmentos de dsRNA, resultando em um perl eletrofortico ou eletroferotipo, distinto da cepa original.
4.3 Replicao
O mecanismo de replicao dos rotavrus tem sido elucidado a partir de estudos realizados em clulas da linhagem contnua MA-104 (clulas renais de macaco rhesus). Esta linhagem celular uma das mais permissivas infeco pelos rotavrus e tem sido amplamente utilizada para a caracterizao desses vrus. O monitoramento dos estgios iniciais da replicao viral por ME revela que somente as partculas com o capsdeo triplo, contendo a VP4 ntegra, so capazes de penetrar produtivamente nas clulas hospedeiras. A adsoro viral superfcie celular mediada pela VP4 ou por seu produto de clivagem (VP5). Alguns estudos apontam tambm a participao da VP7 nas ligaes vrion-clula. Entretanto, a penetrao dos rotavrus nas clulas hospedeiras parece iniciar com um processo complexo, que necessita da interao dessas duas protenas (VP4 e VP7) para estabelecer a ligao inicial. A infeco in vivo pelo rotavrus est restrita a clulas do topo das vilosidades do intestino delgado, o que sugere a existncia de receptores especcos nessas clulas. A infeco in vitro tambm limitada a linhagens celulares epiteliais de origem intestinal e renal. Embora grandes avanos no conhecimento da biologia molecular e estrutural dos rotavrus j tenham sido obtidos, pouco conhecido sobre os seus provveis receptores. A infectividade de algumas cepas de rotavrus de origem animal depende da presena de cido silico (AS) na superfcie celular. Entretanto, esta interao parece no ser essencial, uma
vez que j foram identicadas molculas na superfcie celular resistentes a neuraminidase (ASindependentes), que interagem com a maioria das cepas de rotavrus de origem humana e algumas de origem animal. Portanto, tem sido proposto que existam, pelo menos, dois receptores para o rotavrus: os AS-dependentes (gangliosdeos) e os AS-independentes (integrinas). Estudos recentes sugerem uma interao inicial dos vrions com o receptor AS-dependente, seguida por uma segunda interao com um receptor AS-independente. Aparentemente a ligao com o segundo receptor mais especca. A interao inicial dependente de concentraes de sdio e ocorre na faixa de pH compreendida entre 5,5 e 8. Aps a interao do vrion com os receptores celulares, a partcula viral penetra no citoplasma celular por um mecanismo ainda no completamente conhecido. Entre os mecanismos propostos, destacam-se a penetrao direta atravs da membrana plasmtica aps a clivagem proteoltica de VP4 e exposio do peptdeo de fuso VP5; e a penetrao aps internalizao por endocitose (Figura 30.5). Estudos realizados com a cepa OSU do rotavrus suno conrmam a internalizao dos vrions por endocitose, mediada por receptor especco, e sugerem que o desnudamento pode ocorrer pela ao de enzimas lisossomais. A endocitose constitui um modelo de entrada clciodependente, sendo que a ligao aos receptores celulares induz a formao de uma vescula endoctica que isola a partcula de capsdeo triplo em um compartimento intracelular. A reduo da concentrao de clcio no interior da vescula endossomal ocorre por meio de difuso simples e pode provocar alteraes conformacionais no capsdeo, com a solubilizao das protenas do capsdeo externo. Com a liberao dos peptdeos do capsdeo externo, ocorre o rompimento da membrana lisossomal, permitindo a penetrao da partcula subviral, isenta do capsdeo externo, no citoplasma (Figura 30.5). Nesse momento, ocorre a ativao da transcriptase viral, dando incio transcrio dos segmentos genmicos. O ciclo replicativo ocorre integralmente no citoplasma, independente de estruturas e mecanismos nucleares. A sntese dos mRNA virais modulada pela enzima viral RNA polimerase
Reoviridae
787
Membrana plasmtica
Citoplasma 1
2 3 4 5
Fonte: adaptado de Ruiz et al. (2000).
Figura 30.5. Modelo para a penetrao dos rotavrus em clulas susceptveis, por meio de endocitose clciodependente. 1) Internalizao por endocitose; 2) Efluxo de ons clcio do interior das vesculas; 3) Baixa na concentrao de Ca++ e acidificao das vesculas; 4) Solubilizao do capsdeo externo (VP5, 7 e 8); 5) Permeabilizao da membrana, lise da vescula endoctica, liberao das partculas com duplo capsdeo no citosol.
RNA-dependente (VP1). Os mRNA recm-transcritos cumprem basicamente duas funes: atuam como mensageiros para a traduo das protenas virais e atuam como molde para a sntese do dsRNA que constituir o genoma da prognie viral. A transcrio assimtrica: todos os transcritos sintetizados so tas de polaridade positiva que utilizam como molde as tas negativas dos RNAs genmicos. medida que se processa a sntese e o acmulo das protenas virais (VPs e NSPs), grandes incluses citoplasmticas, denominadas viroplasmas, so formadas no citoplasma das clulas infectadas. Tem sido sugerido que todo o processo de replicao do genoma e a formao das partculas subvirais com duplo capsdeo, formadas pela VP2 e VP6, ocorra no interior dos viroplasmas. Embora grande parte da traduo dos mRNA ocorra nos ribossomos livres, as glicoprotenas VP7 (capsdeo externo) e NSP4 so sintetizadas nos ribossomos associados membrana do re-
tculo endoplasmtico rugoso (RER), onde so processadas e inseridas na membrana. Dessa forma, todas as protenas se acumulam no viroplasma, com exceo da VP7 e NSP4 que se localizam no RER, e das protenas no-estruturais NSP1 e NSP3, que se encontram distribudas no citoplasma, em associao com as bras do citoesqueleto. A morfognese das partculas vricas um processo complexo que ocorre de forma coordenada com a replicao. Nesse processo, ocorre a formao de pelo menos trs estgios intermedirios de replicao, que so os precursores das partculas de duplo capsdeo. Aps a formao das partculas com duplo capsdeo, elas passam do viroplasma para o interior do RER adjacente. A maturao nal dependente de altas concentraes de clcio para promover a estabilizao das protenas do capsdeo externo. Durante a passagem pelo RER as partculas virais adquirem uma bicamada lipdica temporria. O envelope
788
Captulo 30
?
1
12
13
Viroplasma
cap cap cap AAAA AAAA
(-)
10 11
2 6
(-) (-)
AAAA
?
3
cap
4
cap AAAA AAAA AAAA
7
cap AAAA cap AAAA
5
cap
cap
cap AAAA
AAAA
VP7
RER
Citoplasma
Ncleo
Figura 30.6. Ciclo replicativo dos rotavrus. A internalizao ocorre por endocitose mediada por receptor (1), e a penetrao ocorre aps a desestabilizao da partcula vrica e permeabilizao da membrana endoctica desencadeadas pelo efluxo de clcio (2). A penetrao direta atravs da membrana tambm tem sido proposta (3). A transcrio primria ocorre ainda no interior de partculas semi-ntegras (4) e resulta na produo de mRNA para a sntese protica (5) e para a replicao do genoma (6). A replicao do genoma (6, 7) e os estgios iniciais da morfognese (8) ocorrem no interior de estruturas denominadas viroplasmas, que contm RNAs e protenas virais e partculas vricas em formao. As partculas com duplo capsdeo formadas no viroplasma adquirem um envelope lipdico temporrio ao penetrarem no RER (9). A remoo do envelope (10) seguida da adio da VP7, formando o capsdeo externo e estabilizando as partculas (11). Acredita-se que os vrions maduros sejam liberados por lise celular (12), embora outros mecanismos j tenham sido propostos (13).
lipdico removido no interior do RER por ao coordenada da NSP4. Em seguida, a VP7 (capsdeo externo) adicionada para formar a partcula viral madura (triplo capsdeo). Estudos por ME tm demonstrado que, ao nal do ciclo replicativo, a prognie viral liberada por lise celular. A Figura 30.6 apresenta uma ilustrao esquemtica do ciclo replicativo dos rotavrus.
4.4 Enfermidades causadas por rotavrus

A primeira descrio dos rotavrus em animais foi realizada, em 1969, por Mebus e colaboradores, que demonstraram a presena de partculas virais em fezes de bezerros com diarria. Woode, Jones e Bridger (1975) realizaram o
Reoviridae
789
primeiro relato de rotavrus em fezes diarricas de leites. Desde ento, os rotavrus tm sido identicados como uma das principais etiologias virais de diarria em animais jovens de diversas espcies de mamferos e aves. Em medicina veterinria, importncia especial atribuda aos animais de interesse econmico, principalmente os sunos, bovinos, ovinos e eqinos. Os animais de companhia e/ou laboratrio, como ces, gatos, coelhos, ratos e camundongos, tambm so susceptveis infeco pelo rotavrus. As rotaviroses tambm representam um problema sanitrio em aves comerciais, principalmente em frangos de corte e perus. As taxas de morbidade e mortalidade e os prejuzos econmicos ocasionados pelas rotaviroses em espcies de importncia veterinria so variveis. Em bovinos, a diarria causada pelos rotavrus reconhecidamente uma das principais causas de perdas econmicas no perodo entre o nascimento e o desmame. Estudos epidemiolgicos, realizados no Brasil, Estados Unidos, Canad, ndia, Austrlia e pases europeus, indicam que as infeces por rotavrus apresentam morbidade com taxas de 8 a 36%, e a mortalidade pode atingir de 3 a 6% dos animais jovens. Bezerros na segunda ou terceira semanas de vida so os mais susceptveis. Em leites, as diarrias constituem o principal problema de ordem sanitria que ocorre tanto em animais lactentes (maternidade) quanto em recm-desmamados (creche). Em todos os pases onde a suinocultura explorada de forma intensiva, os rotavrus so identicados como um dos mais importantes agentes infecciosos causadores de diarria nos perodos do pr e ps-desmame. O primeiro ms de vida dos animais tem sido apontado como o perodo mais crtico para a ocorrncia das rotaviroses. Aps esse perodo, a freqncia de episdios de diarria por esses vrus declina vertiginosamente. A maior susceptibilidade dos animais neonatos explicada pelo fato de que a reposio do epitlio apical das vilosidades ocorre de forma mais lenta, facilitando o desenvolvimento completo do ciclo replicativo e a produo de prognie viral. Os animais adultos tornam-se resistentes doena porque a re-
posio dos entercitos mais intensa e compete com a replicao viral, de forma que somente as cepas virais muito virulentas podem causar diarria em bezerros com idade superior a seis semanas. A doena clnica tambm no freqente durante a primeira semana de vida do animal, provavelmente devido transmisso passiva dos anticorpos maternos e conseqente neutralizao do vrus. Diferentemente de outras infeces entricas, em especial as bacterianas e parasitrias, as medidas de carter higinico-sanitrio adotadas isoladamente no so capazes de reduzir signicativamente o nmero de casos clnicos de rotaviroses. Algumas caractersticas peculiares dos rotavrus fazem com que as rotaviroses se manifestem de forma diferente de outras doenas entricas, determinando um grande impacto na sanidade animal, at mesmo em rebanhos de propriedades altamente tecnicadas. Dentre essas caractersticas, destacam-se: a) resistncia dos vrions s condies ambientais e aos produtos qumicos utilizados em desinfeco; b) alta concentrao de partculas virais excretadas no perodo agudo da doena (1011 partculas por grama de fezes); c) presena de infeces subclnicas e de adultos portadores assintomticos; d) grande variedade de hospedeiros; e) possibilidade de transmisso entre espcies (infeces heterlogas); e f) carter endmico da infeco. Medidas relativas aos aspectos nutricionais e de carter higinico-sanitrio no foram capazes de reduzir signicativamente a incidncia e a gravidade das infeces por rotavrus. As infeces por rotavrus so amplamente disseminadas nas populaes humanas e animais susceptveis. A distribuio dos sorotipos e/ou eletroferotipos de cada espcie viral, no entanto, pode apresentar variaes, de modo que determinadas regies apresentem determinados sorotipos em contraste com outras regies que podem apresentar a circulao de sorotipos diferentes. Os altos ttulos em que o vrus excretado, o perodo de excreo, a existncia de portadores e a alta resistncia dos vrions no ambiente contribuem para essa ampla disseminao.
790
Captulo 30

A transmisso dos rotavrus ocorre principalmente pela via fecal-oral, por meio de partculas virais encontradas no ambiente, na gua e nos alimentos contaminados pelas fezes. Aps a ingesto, as partculas virais alcanam a luz intestinal. Os rotavrus possuem tropismo marcante pelas clulas do intestino delgado. Os vrions penetram nos entercitos maduros, localizados na regio apical das vilosidades intestinais. Alm da capacidade absortiva, os entercitos maduros ou do pice das vilosidades desempenham tambm funo digestiva com a secreo da enzima lactase. A partir desse momento, iniciado o ciclo replicativo no interior dos entercitos, culminando com a lise e descamao do epitlio intestinal. Os vrions liberados, aps a descamao celular, iro infectar novos entercitos, contribuindo para a propagao da infeco. O vrus excretado nas fezes por at sete dias ps-infeco. Em decorrncia da grande injria tecidual, a reposio celular feita por clulas cubides, imaturas do ponto de vista estrutural e funcional, provenientes das criptas intestinais que no so afetadas diretamente pela infeco. Embora as clulas imaturas sejam refratrias infeco viral, o que confere infeco a caracterstica autolimitante, elas perdem a capacidade absortiva e digestiva. Com base nos mecanismos siopatolgicos, a diarria ocasionada pelo rotavrus tambm conhecida como diarria por m absoro. Por decincia da enzima lactase, ocorre falha na digesto da lactose. Associada com a m absoro, a lactose no digerida entra em fermentao por ao de bactrias, intensicando a diarria devido ao aumento da presso osmtica na luz intestinal. Por esses eventos, as infeces pelos rotavrus so freqentemente denominadas curso branco, devido presena de leite no digerido nas fezes diarricas. Em conseqncia das leses no epitlio, os mediadores da reao inamatria comprometem tambm as clulas das criptas; e a motilidade intestinal pode estar inibida durante a maioria dos casos de diarria. Quando o nmero de entercitos infectados excede o da reposio celular,
as vilosidades atroam-se, podendo fusionar-se nos casos mais graves. Aps o perodo mdio de incubao de 16 a 24 horas, surgem os primeiros sinais de diarria. Alm da diarria, outros sinais clnicos no-especcos das sndromes diarricas incluem: depresso, anorexia, vmito, desidratao, plo eriado e sinais inerentes acidose metablica. Animais jovens podem morrer em conseqncia da desidratao ou da infeco bacteriana secundria, mas a maioria se recupera em trs a quatro dias. Estudos realizados em camundongos demonstraram que a protena no-estrutural NSP4 pode atuar como uma enterotoxina e induzir diarria quando administrada pela via intraperitoneal ou intraluminal. Nesse caso, o mecanismo siopatolgico envolvido na evoluo do quadro diarrico ocorreria de forma semelhante a enterotoxina da Escherichia coli. A NSP4 interage com um receptor celular do epitlio intestinal, ativando uma via sinalizadora da traduo, que aumenta os nveis de Ca2+ intracelular. O Ca2+ induz o aumento da permeabilidade da membrana plasmtica ao cloro, que , ento, secretado. Esses eventos caracterizam um quadro de diarria por hipersecreo. A protena NSP4 pode, ainda, participar da ativao do sistema nervoso entrico, que estimula e aumenta a secreo de gua pelas clulas intestinais. Apesar dos rotavrus serem espcie-especcos, a transmisso interespcies tambm possvel. Vrios estudos tm encontrado evidncias antignicas e moleculares de recombinao (ressortimento) in vivo de diferentes cepas de rotavrus do grupo A provenientes de humanos e de animais. Cepas virais que so geneticamente muito relacionadas com rotavrus de origem bovina, suna, canina, felina e inclusive aviria, tm sido isoladas de crianas com infeces sintomticas ou assintomticas e nosocomiais. Reciprocamente, combinaes genotpicas, comumente associadas com cepas de rotavrus do grupo A de origem humana, esto sendo identicadas em animais.
4.4.2 Imunidade
Os mecanismos imunolgicos envolvidos na resposta s infeces pelos rotavrus ainda no esto totalmente esclarecidos. A imunidade
Reoviridae
791
de mucosas, mediada por imunoglobulinas da classe A (IgA secretora), parece constituir a principal defesa orgnica contra as infeces intestinais causadas por esses vrus. As protenas do capsdeo intermedirio (VP6) e externo (VP4 e VP7) e a protena no-estrutural NSP4 induzem a formao de anticorpos neutralizantes, principalmente IgG. Entretanto, a funo especca desse isotipo de imunoglobulina na proteo contra a infeco ainda no est claramente denida. Experimentos conduzidos em cordeiros neonatos gnotobiticos sugeriram que os anticorpos presentes na luz do intestino delgado foram os determinantes primrios da resistncia infeco pelo rotavrus, enquanto os anticorpos circulantes falharam na proteo. Tambm foi observada a participao efetiva de IgG neutralizantes de origem materna na proteo de animais neonatos contra a doena clnica. A importncia da imunidade celular na resposta imunolgica contra a infeco pelo rotavrus tem sido amplamente estudada em camundongos, utilizados como modelos experimentais. Nesses animais, tem sido demonstrado que: a) anticorpos rotavrus-especcos so de importncia primria na proteo contra a reinfeco; b) cepas homlogas de rotavrus so muito mais potentes na induo de resposta imune humoral local do que cepas heterlogas; c) os linfcitos T CD8+ desempenham funo principal na resoluo da enfermidade, embora, de forma menos efetiva, tambm seja demonstrada a participao de linfcitos T CD4+; d) citocinas e clulas NK (natural killer) tambm esto envolvidos na eliminao do vrus. Em sntese, a imunidade celular pode estar muito mais relacionada com a recuperao da enfermidade do que com a preveno da reinfeco. Em paralelo demonstrao que a protena no-estrutural NSP4 pode atuar como enterotoxina viral e ocasionar diarria em ratos experimentalmente inoculados, tambm foi observado que essa protena estimula as respostas humoral e celular, com a participao de linfcitos T citotxicos. Embora existam evidncias de que a resposta imunolgica induzida pela NSP4 no seja fundamental para o controle da infeco, as novas descobertas nesse campo so fundamentais para
o entendimento dos fatores imunolgicos envolvidos, bem como para a denio das diretrizes para o desenvolvimento de vacinas ecazes.
4.4.3 Diagnstico
Devido semelhana com os sinais clnicos de infeces entricas causadas por outros enteropatgenos, como bactrias, protozorios e vrus, o diagnstico denitivo das rotaviroses depende essencialmente da realizao de testes laboratoriais. A ME muito eciente na deteco do vrus, uma vez que a morfologia tpica dos rotavrus permite a sua identicao sem a necessidade do uso de soro hiperimune (imunomicroscopia eletrnica). A ME tambm freqentemente utilizada com o objetivo de solucionar os resultados discrepantes de outros mtodos de diagnstico. Entretanto, essa tcnica mostra-se invivel quando o diagnstico envolve um grande nmero de amostras a serem analisadas. O isolamento viral em cultivo celular tem pouco valor prtico para o diagnstico, particularmente por ser uma tcnica laboriosa, demorada e exigir a manuteno de linhagens celulares, que torna o procedimento oneroso. As linhagens celulares rotineiramente empregadas para o isolamento do rotavrus incluem a MA-104b e HT 29 (clula de tumor retal humano). Embora no seja utilizada como tcnica de diagnstico de rotina, o cultivo do rotavrus um mtodo indispensvel para o desenvolvimento de estudos relacionados s caractersticas antignicas e moleculares das cepas virais e para a produo de antgenos empregados no diagnstico e na elaborao de vacinas. Outros mtodos tambm j foram padronizados para a deteco do rotavrus, como a xao de complemento, imunouorescncia (IFA), radioimunoensaio (RIA), hemaglutinao (HA) e aglutinao em ltex. Os testes imunoenzimticos (ELISA) constituem um dos mtodos mais difundidos no diagnstico da rotavirose animal devido ao seu limiar de deteco, facilidade de execuo, baixo custo e rapidez na obteno dos resultados. Vrios testes de ELISA com anticorpos de captura foram desenvolvidos para o diagnstico do rotavrus grupo A. Kits de ELISA, em
792
Captulo 30
escala comercial, esto disponveis. Embora a tcnica de ELISA seja altamente sensvel, de fcil execuo e apropriada para o processamento de um grande nmero de amostras, o sucesso do diagnstico diretamente dependente da qualidade dos anticorpos empregados. O genoma segmentado, caracterstico dos rotavrus, permite a aplicao da tcnica de PAGE para a identicao desse vrus. Contudo, apesar de ser eciente na denio do grupo ou do eletroferogrupo, a PAGE no possibilita a denio do sorotipo viral. Cepas de rotavrus de um mesmo sorotipo podem apresentar pers eletroforticos distintos, e cepas do mesmo eletroferotipo podem pertencer a diferentes sorotipos. Os grupos B e E, encontrados em sunos, por exemplo, apresentam eletroferotipos com a mesma distribuio e so antigenicamente diferentes. Dessa forma, a eletroferotipagem no deve ser o nico critrio para a classicao dos grupos de rotavrus. Os mtodos moleculares, tais como a hibridizao e a amplicao gnica por RT-PCR esto sendo aplicados para a genotipagem de cepas de rotavrus grupo A. Devido boa correlao com a especicidade antignica, relacionada aos sorotipos, a genotipagem passou a ser utilizada como uma tcnica alternativa sorotipagem. Alm da genotipagem, que possibilita a caracterizao dos genotipos G e P das cepas de rotavrus do grupo A circulantes em uma regio ou perodo, a RTPCR pode ser tambm utilizada com muita ecincia para o diagnstico das infeces ocasionadas pelos rotavrus grupos B e C. A utilizao de RT-PCR multiplex permite, ainda, a identicao de infeces mistas, como aquelas ocasionadas por cepas de rotavrus pertencentes a diferentes gentipos, e tambm de infeces heterlogas, ocasionadas por recombinao gentica, nas quais so identicadas associaes de gentipos G e P no caractersticas da espcie em estudo. Os mtodos mais tradicionais de determinao do sorotipo da cepa viral infectante, como a soroneutralizao (SN) e diferentes sistemas de ELISA, tambm so comumente empregados nas rotaviroses. Infeces mistas, bem como a presena de variantes antignicas, dicultam a clas-
sicao sorolgica de muitas cepas de rotavrus grupo A por meio de sistemas de ELISA que utilizam painis de anticorpos monoclonais. O uso apenas do ELISA para a sorotipagem de cepas de rotavrus grupo A apresenta tambm limitaes em razo da indisponibilidade comercial de anticorpos monoclonais neutralizantes para a identicao de alguns sorotipos G (VP7) e da maioria dos sorotipos P (VP4). Devido alta prevalncia da infeco na maioria dos rebanhos de animais de produo, no comum a realizao do diagnstico sorolgico. Animais adultos podem apresentar taxas superiores a 90% de soropositividade.

A prolaxia das rotaviroses no se restringe apenas adoo de medidas de carter higinicosanitrio, visto que a infeco se estabelece inclusive em rebanhos de propriedades altamente tecnicadas e com bom manejo sanitrio. Medidas gerais de prolaxia da infeco podem incluir: a) isolamento dos animais infectados com o objetivo de reduzir a transmisso do vrus aos animais susceptveis; b) criao de animais de faixas etrias uniformes; c) desinfeco de instalaes; d) rodzio de piquetes de paries em rebanhos bovinos de criao extensiva; e) vazio sanitrio. Nos mamferos domsticos, os anticorpos rotavrus-especcos presentes no colostro so particularmente importantes na proteo dos animais neonatos. Embora a maior parte dos anticorpos colostrais seja absorvida pelos animais recm-nascidos, altos ttulos de anticorpos sricos parecem no ser ecazes na proteo contra a infeco. Porm, as imunoglobulinas presentes na luz intestinal participam efetivamente na proteo contra os rotavrus. Dessa forma, a ingesto de colostro de boa qualidade pode prevenir a incidncia da doena nos neonatos ou reduzir a gravidade da diarria. Com esse propsito, preconiza-se a vacinao das fmeas gestantes com vacinas inativadas para garantir altos ttulos de anticorpos especcos no colostro. Contudo, tambm no campo imunoproltico, as rotaviroses representam um desao para a elaborao de imungenos capazes de induzir
Reoviridae
793
resposta imunolgica plena e duradoura. A variabilidade antignica e molecular dos rotavrus, gerada pelas caractersticas prprias de seu genoma e expressas nos vrios grupos sorolgicos, sorotipos e mesmo variantes de sorotipos circulantes representa um grande obstculo para a obteno de vacinas efetivas. Devido complexidade e diversidade genmica dos rotavrus, ca evidente que o prvio conhecimento dos gentipos P e G das cepas virais circulantes em uma regio, bem como a sua distribuio temporal, fundamental para o planejamento de qualquer programa de vacinao.
rogrupos, nmero de sorotipos, principais vetores e hospedeiros desses vrus esto listados na Tabela 30.4. Dentre as espcies de orbivrus importantes na medicina veterinria, incluem-se o vrus da lngua azul (bluetongue virus, BTV) que possui 24 sorotipos conhecidos; o vrus da doena hemorrgica epizotica dos cervdeos (EHDV), com dez sorotipos; o vrus da peste eqina (african horse sickness virus, AHSV), com nove sorotipos; o vrus da encefalose eqina (EEV), com sete sorotipos, e o vrus Palyam. Estas trs ltimas enfermidades so exticas no Brasil e encontram-se basicamente restritas aos continentes africano e asitico.
5 Gnero Orbivirus
Os orbivrus constituem um dos 11 gneros da famlia Reoviridae. Os vrus desse gnero infectam uma variedade de vertebrados, incluindo ruminantes domsticos e selvagens, eqdeos, roedores, morcegos, primatas, marsupiais e aves. Esses vrus infectam e so primariamente transmitidos por artrpodes vetores como mosquitos e carrapatos, mas a infeco nestas espcies no apresenta efeitos deletrios evidentes. Com base em reatividade sorolgica, 19 espcies de orbivrus, abrangendo pelo menos 130 sorotipos, j foram denidas. Ainda assim, existem vrios isolados no-classicados. Os soOs vrions maduros medem entre 60 e 85 nm de dimetro, no apresentam envelope lipdico, e as protenas que formam a partcula viral esto dispostas em camadas concntricas que, geralmente, conferem uma simetria icosadrica. Os vrions apresentam coeciente de sedimentao de 55 S e densidade de utuao em CsCl2 de 1,36 1,38 g/cm3. Esses vrions so resistentes a solventes lipdicos, sensveis a desinfetantes base de iodoforos e fenis. So estveis sob pH entre 6,5 e 8 e quando armazenados a temperatura de 4C, principalmente na presena de matria orgnica.
Tabela 30.4. Principais membros do gnero Orbivirus associados com doenas em animais.
Sorogrupo
Peste eqina
Sorotipos
1 a 10
Hospedeiros
Eqideos, zebras, ces
Doena
Doena cardiopulmonar, febre
Distribuio geogrfica
Vetor
frica, Oriente Mdio, Culicoides sia e Europa frica,sia, Austrlia, Amricas Amricas, Austrlia, frica Culicoides
Lngua azul
1 a 24
Rinite, estomatite, Ovinos, bovinos, caprinos, cervdeos laminite Cervdeos Similar a lngua azul
Doena epizotica hemorrgica
EHDV (vrios sorotipos) Ibakari Kawanabe
Culicoides
Bovinos
Doena febril semelhante sia, Austrlia, a lngua azul, encefalite Japo Abortos frica do Sul
Culicoides
Palyam
Kasba Chuzan
Bovinos Bovinos
Culicoides Culicoides
Malformaes congnitas Japo
794
Captulo 30
O congelamento pode reduzir at 90% a infectividade viral, porm a infectividade preservada quando mantidos a -70C. O genoma desses vrus composto por 10 segmentos de dsRNA, cada um deles codicando uma, duas ou trs protenas (geralmente uma). O padro de migrao desses segmentos pode ser usado para diferenciar sorogrupos dos orbivrus, assim como diferenci-los de outros gneros da famlia Reoviridae. Devido natureza dos genomas segmentados e, dependendo da compatibilidade gentica, os orbivrus podem sofrer ressortimento de seus genes durante infeces mistas. Esses eventos podem envolver vrus de um mesmo sorotipo ou diferentes sorotipos. Uma alta freqncia de ressortimentos genmicos entre orbivrus relacionados j foi demonstrada em hospedeiros vertebrados e invertebrados, bem como em cultivos celulares. Aparentemente, a freqncia de ressortimento mais observada nos vetores artrpodes. Esse fenmeno um dos responsveis pela diversidade gentica da populao dos orbivrus na natureza. Mltiplos sorotipos de um mesmo ou de diferentes sorogrupos tm sido identicados no mesmo inseto, indicando que vrus geneticamente distintos podem estar presentes em um nico hospedeiro. Tambm tm sido reportadas variaes genticas dentro de isolados do mesmo sorotipo ao longo de um mesmo ano em diferentes regies, indicando que mutaes e evoluo ocorrem tambm dentro de cada sorotipo. Assim, os sorotipos atualmente existentes nos diversos continentes reetem provavelmente uma combinao de mutaes, rearranjos e coevolues de um pool de genes de vrus de vrias localidades. Essa evoluo ocorre atravs dos tempos e resulta em uma diversidade gentica com conseqncias epidemiolgicas e clnico-patolgicas ainda pouco conhecidas. Da mesma forma, o impacto dos rearranjos dos segmentos sobre o fentipo viral, viremia e transmissibilidade, presso seletiva na resposta imune do hospedeiro, virulncia e conseqncias do uso de vacinas vivas multivalentes so ainda pouco conhecidos. As duas protenas externas do capsdeo (VP5 e VP2) so as mais variveis dentro dos so-
rotipos e entre as diferentes espcies do gnero, enquanto as protenas no-estruturais NS1 e NS2 so altamente conservadas. Estudos baseados na seqncia de aminocidos da protena estrutural VP3, que altamente conservada, tm sido utilizados para agrupar cepas isoladas de diferentes regies, como Amrica, frica do Sul e Austrlia, em sorotipos e sorogrupos. Por outro lado, estudos baseados na seqncia da VP5 fornecem informaes sobre o sorotipo viral. De fato, uma comparao entre as seqncias das protenas do BTV, EHDV e AHSV indicou que a VP3 a protena mais conservada e a VP2 a mais varivel.
5.2 O vrion, o genoma e as protenas virais

Grande parte dos conhecimentos sobre a estrutura das partculas vricas, biologia molecular e replicao dos orbivrus foi obtida a partir de estudos do prottipo do gnero, o BTV. O genoma do BTV consiste de 10 segmentos de dsRNA, divididos em trs segmentos grandes (L1 a L3), trs mdios (M4 a M6) e quatro pequenos (S7 a S10). O conjunto de segmentos genmicos codica sete protenas estruturais (VP1 a VP7) e trs protenas no-estruturais (NS1 a NS3). As duas tas de RNA que compem cada segmento genmico so exatamente complementares, embora a extremidade 5 da ta codicante (polaridade positiva) de cada duplex possua a estrutura cap, enquanto a cadeia complementar no possui esta modicao em sua extremidade. A seqncia completa de nucleotdeos de todos os segmentos de vrios sorotipos do BTV e de alguns representantes dos grupos da EHDV e AHSV j foi estabelecida. As caractersticas de cada segmento, a(s) protena(s) codicada(s), sua localizao e provveis funes esto apresentadas na Tabela 30.5. Os vrions do BTV medem entre 65 a 75 nm de dimetro, no apresentam envelope lipdico, e as protenas que formam a partcula viral esto dispostas em camadas concntricas que conferem a ela uma simetria icosadrica (Figura 30.7). A camada interna ou ncleo (54-58 nm de dimetro) contm cinco protenas (VP1, VP3, VP4, VP6 e VP7). Dentre estas, a VP7 (antgeno determinante do sorogrupo) e a VP3 so as mais abundantes. A
Reoviridae
795
Tabela 30.5. Caractersticas dos segmentos genmicos e das protenas codificadas pelo genoma dos orbivrus.
Segmento N de do genoma bases

L1 3.954
Protena Massa (Da) Localizao na partcula viral codificada

VP1 149.588 Ncleo interno
Principais funes
RNA polimerase
Ligao aos receptores celulares e penetrao nas clulas de mamferos; hemaglutinina; determinao do sorotipo, principais epitopos neutralizantes.
L2
2.926
VP2
111.112
Capsdeo externo
L3
2.772
VP3
103.344
Subncleo
Formao de estrutura para deposio dos trmeros de Vp7. Funo enzimtica de guanililtransferase e metiltransferase. Penetrao viral. Formao dos tbulos. Determinao do sorogrupo, penetrao em clulas de insetos. Formao de corpsculos de incluso, ligao a RNA de fita simples. Ligao ssRNA, dsRNA, helicase e ATPase. Auxlio no egresso das partculas vricas.
M4 M5 M6 S7
2.011 1.639 1.770 1.156
VP4 VP5 NS1 VP7
76.433 59.163 64.445 38.548
Ncleo interno Capsdeo externo No-estrutural Subncleo
S8
1.124
NS2
40.999
No-estrutural
S9
1.046
VP6 NS3 NS3A
35.750 25.572 24.020
Ncleo interno
S10
822
No-estrutural
VP3 forma uma estrutura central ou subncleo, no qual 260 trmeros da VP7 esto ancorados. Por isso exerce uma importante funo na integridade estrutural do ncleo viral. A seqncia de nucleotdeos que codica a VP3 altamente conservada entre os diferentes sorotipos do vrus e tambm muito semelhante a VP3 do EHDV e ASFV. A VP7 a protena mais abundante que compe o ncleo e contm os principais determinantes antignicos especcos de grupo. Apesar de fazer parte do ncleo, sabe-se que esta protena est exposta em algumas regies da superfcie viral e capaz de estimular a produo de anticorpos. Localizadas no interior do subncleo, as protenas VP1, VP4 e VP6 esto presentes em pequenas quantidades e parecem no desempenhar um papel importante na estrutura do ncleo. A VP1 a protena com maior massa do BTV e, com base em sua massa, localizao, concentrao molar
no ncleo e seqncia de aminocidos, acreditase que seja a RNA polimerase viral. Essa protena seria a responsvel pela transcrio e replicao do genoma durante a replicao viral nas clulas hospedeiras. O ncleo icosadrico do BTV circundado pela camada externa ou capsdeo, que composto pelas protenas VP2 e VP5. Estas protenas so as menos conservadas entre os diferentes sorotipos do vrus. A VP2 o principal determinante do sorotipo e responsvel pelo estmulo para a produo de anticorpos neutralizantes. Alm disso, apresenta atividade de hemaglutinao e hemadsoro. A segunda protena do capsdeo externo a VP5, que possui 526 aminocidos. Esta protena mais varivel do que as outras protenas do ncleo, mas mais conservada do que a VP2. A VP5 possui uma funo importante na penetrao do vrus na membrana do endossomo, sendo responsvel pela liberao do ncleo viral no ci-
796
Captulo 30
B
VP2 VP5 VP7 dsRNA VP1 VP3 VP4 VP6
Fonte: A) Dr Peter Mertens, www.iah.bbsrc.ac.uk; B) Adaptado de Roy (2001).
Figura 30.7. Partculas vricas dos orbivrus. A) Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion; B) Ilustrao esquemtica da estrutura de uma partcula vrica indicando os elementos constituintes.
toplasma celular. A sua conformao estrutural indica que capaz de induzir a permeabilizao e desestabilizao de membranas. Trs protenas no-estruturais (NS1, NS2 e NS3) so produzidas durante a replicao do BTV. A NS1 e NS2 so sintetizadas abundantemente, enquanto NS3 de difcil deteco. A seqncia dessas protenas altamente conservada entre os sorotipos, o que indica a sua importncia para a replicao desses vrus. A sntese da NS1 e NS2 coincide, respectivamente, com o aparecimento de duas estruturas vrus-especcas: os tbulos e os corpsculos de incluso. Presume-se que essas estruturas estejam envolvidas na replicao e no processo de transporte das partculas virais para a membrana celular ou na preveno da mitose em clulas infectadas. A NS3 a protena menos abundante do BTV e a sua funo ainda no est totalmente esclarecida, mas sabese que essencial para o egresso das partculas vricas da clula.
5.3 Replicao
A adsoro dos vrions do BTV s clulas hospedeiras parece envolver uma interao rpida e especca de algumas regies da VP2 com componentes da membrana celular, sendo esta
protena a principal responsvel pela penetrao do vrus nas clulas de mamferos. Acredita-se que a VP7, localizada no core, esteja envolvida em um mecanismo equivalente nas clulas dos insetos vetores Culicoides. A natureza dos receptores celulares que medeiam este evento ainda est sendo esclarecida, porm sabe-se que a VP2 possui a caracterstica de se ligar a uma sialoglicoprotena presente em eritrcitos de vrias espcies animais. Aps a ligao aos receptores por meio da VP2, os vrions so internalizados por endocitose. Poucos minutos aps, os vrions podem ser encontrados no interior de vesculas nas proximidades do ncleo. Aproximadamente uma hora ps-infeco, as partculas perdem as protenas VP2 e VP5 do capsdeo, provavelmente pela ao do baixo pH e pela concentrao de ctions no interior dos endossomos. Este mecanismo essencial para que a transcriptase viral (RNA polimerase) se torne ativa, o que ocorre pelo acesso de nucleotdeos trifosfato ao genoma viral atravs de canais localizados nas camadas que delimitam o ncleo viral. No citoplasma, as partculas virais semi-desintegradas se ligam a bras do citoesqueleto e, aps o incio da transcrio do genoma viral, a sntese das protenas da clula hospedeira rapi-
Reoviridae
797
damente reprimida. O primeiro polipeptdeo viral detectado duas a quatro horas ps-infeco, e a sntese protica viral atinge o pico entre nove e 11 horas aps, diminuindo progressivamente at a morte celular. A protena VP6 possui funo de helicase e desenrola os componentes do duplex de RNA genmico, enquanto a VP1 inicia a sntese de molculas de RNA de sentido positivo, para serem utilizadas como mRNA para a sntese protica. Uma vez sintetizadas, essas molculas so modicadas pela atividade enzimtica da VP4, sendo metiladas na extremidade 5. Os mRNA, assim sintetizados, so exportados dos capsdeos semi-ntegros para o citoplasma, para o incio da traduo. A ta de RNA de polaridade negativa sintetizada tambm pela ao da VP1, iniciando a partir da extremidade 3 das tas positivas. Em geral, os segmentos genmicos menores so transcritos com maior freqncia, porm o fragmento que codica a protena NS1 o mais abundantemente transcrito. A condensao dos RNAs recm-produzidos pela transcrio e as protenas recm-produzidas pela traduo formam os corpsculos de incluso, onde os vrions so montados gradativamente, desde ncleo at partcula viral completa, e, subseqentemente, liberados para o citoplasma. A VP2 e a VP5 so adicionadas aos vrions na periferia dos corpsculos. Os corpsculos de incluso podem ser granulares ou brilares, so encontrados dispersos pela clula e correspondem aos stios de morfognese das partculas virais. Esses corpsculos so compostos por ssRNA, dsRNA, ncleos e subncleos virais, algumas protenas estruturais (VP3, VP7 e VP5) e, principalmente, a NS2. Esta protena pode ligar-se ao RNA viral, facilitando, assim, o seu encapsidamento no interior dos ncleos virais. Protenas estruturais e partculas virais completas so observadas em maior concentrao na periferia dos corpsculos. A NS1 produzida em grandes quantidades, formando os tbulos que esto presentes em grande abundncia, predominantemente ao redor ou nas proximidades do ncleo da clula hospedeira. Essas estruturas so caractersticas da infeco por orbivrus e apresentam diferen-
as em relao a sua espessura e extenso, variando para cada espcie viral, o que sugere que possuem uma funo especca para cada grupo viral. Os corpsculos, os tbulos e as partculas virais recm-formadas so associadas com redes de lamentos intermedirios no citoesqueleto celular. No processo de morfognese das partculas, ocorre inicialmente a formao do subncleo, que composto pela VP3, VP4, VP1 e VP6. Em seguida, so montados e adicionados os trmeros de VP7, formando o ncleo viral. Acredita-se que a NS2, com a sua capacidade de ligao ao RNA, facilita o empacotamento dos segmentos genmicos no ncleo viral. A seguir, as protenas VP2 e VP5 se associam atravs da interao com a VP7. Vrios estudos da morfognese do BTV tm sido conduzidos, utilizando a expresso de protenas individuais no sistema de baculovrus. Nesses estudos, observou-se que as protenas estruturais possuem a capacidade de se associarem entre si, na ausncia do genoma, formando partculas chamadas de CLP (core like particles) ou VLP (virus like particles), dependendo da combinao das protenas produzidas. Aps a formao do capsdeo pela adio da VP2 e VP5 ao ncleo viral, as partculas virais esto prontas para o seu egresso das clulas infectadas. Nas fases iniciais da infeco, os vrions podem ser liberados por brotamento atravs da membrana plasmtica, onde adquirem um envelope temporrio. Quando j h desestruturao da membrana celular, grupos de partculas virais se movem atravs de membrana plasmtica rompida e so, assim, liberados. A protena no-estrutural NS3 tem sido identicada nesses stios, sugerindo um papel importante, provavelmente mediando a liberao das partculas por exocitose.
5.4 Patogenia
Os orbivrus so transmitidos para os hospedeiros vertebrados por insetos hematfagos. Aps a replicao primria nos linfonodos regionais, os vrions se disseminam para o bao, timo e outros linfonodos associados s clulas
798
Captulo 30
sangneas. O BTV se liga a glicoforinas na superfcie dos eritrcitos de bovinos e ovinos, onde persiste em invaginaes da membrana. Nesses locais, os vrions permanecem protegidos dos anticorpos circulantes por longo perodo, resultando em viremia prolongada. Essa viremia de longa durao proporciona uma contnua oportunidade para a transmisso do agente. A maioria dos orbivrus so neurovirulentos e alguns so neuroinvasivos quando inoculados em camundongos ou hamsters, e os fetos so particularmente susceptveis a infeco. Uma caracterstica marcante da patogenia da infeco por esses vrus a sua capacidade de replicar e destruir clulas endoteliais em diferentes rgos. A lise dessas clulas leva injria vascular, resultando em leso dos capilares, hemorragias e coagulao intravascular disseminada. Clinicamente, observa-se edema generalizado, hidrotrax, hidropericrdio, hemorragias generalizadas, hipotenso e choque. A capacidade de atravessar a placenta e infectar os fetos outra propriedade importante dos orbivrus. A infeco de ovelhas e vacas, com o BTV, e de bovinos, com o vrus de Ibaraki ou o vrus Kasba do grupo Palyam, pode resultar em abortos e no nascimento de produtos com anormalidades, incluindo hidrocefalia, artrogripose, prognatismo, cegueira e surdez.
O maior impacto da doena causada pelo BTV observado na indstria ovina, j que nesta espcie que as manifestaes clnicas da doena ocorrem com maior freqncia e severidade. As perdas por mortalidade podem chegar a 40%, e perdas indiretas por queda de produo no perodo de convalescena so especialmente importantes. Para pases que produzem l de alta qualidade, a quebra da l pode ocorrer como conseqncia da doena, causando srios prejuzos. Nos bovinos, a doena clnica rara e, apesar de perdas diretas ocorrerem, principalmente em casos de epidemias, as maiores perdas so causadas pelas restries de mercado. De fato, as restries ao comrcio de animais e subprodutos provavelmente so responsveis pelas maiores perdas econmicas associadas com a infeco pelo BTV. Por muitos anos, a infeco pelo BTV foi considerada uma das principais barreiras para a exportao de ruminantes dos EUA para outros pases, sobretudo para a Austrlia, Nova Zelndia e Comunidade Europia.
5.5.1 Epidemiologia
O BTV capaz de infectar naturalmente uma variedade de ruminantes domsticos e selvagens, incluindo ovinos, caprinos, bovinos, bubalinos, camelos, cervdeos e outros herbvoros, como os elefantes. A doena clnica mais comum nos ovinos e cervdeos. Embora a infeco nos bovinos seja de grande importncia epidemiolgica, a infeco nesta espcie geralmente subclnica. Em 1994, nos Estados Unidos, foi demonstrada uma associao entre a administrao de vacinas contaminadas com o BTV e morte fulminante em ces com problemas cardacos e respiratrios. A importncia desses achados desconhecida. O vrus transmitido por mosquitos do gnero Culicoides, que possuem grande variao de hbitos alimentares, preferncia por hospedeiros e competncia na transmisso da infeco. No Brasil, os mosquitos Culicoides sp. so denominados maruim, mosquitos-plvora ou mosquitos-do-mangue. Apesar de existirem poucos estudos sobre esses vetores no Pas, vrias espcies competentes na transmisso da doena, como o Culicoides insignis, j foram descritas.
5.5 Vrus da lngua azul

Dentre os membros do gnero orbivrus, o vrus da lngua azul (BTV) o que possui maior relevncia em medicina veterinria e ser abordado com detalhes. A lngua azul (BT) uma enfermidade infecciosa, no-contagiosa, associada com a infeco pelo BTV, transmitida por insetos vetores e caracterizada por inamao das mucosas, hemorragia e edema generalizados. A enfermidade tem sido tambm denominada febre catarral do carneiro. Os isolados do BTV podem ser agrupados em 24 sorotipos, de acordo com a sua reatividade sorolgica. Variaes de patogenicidade e virulncia tm sido observadas entre isolados de campo, assim como diferentes padres de tropismo tecidual e fetal.
Reoviridae
799
Os mosquitos adquirem o vrus quando ingerem sangue de um hospedeiro virmico. Apenas as fmeas so hematfagas e requerem pelo menos um repasto sangneo para a concluso de um ciclo ovariano. Por isso o pico de atividade desses insetos est relacionado com o seu ciclo reprodutivo. Estaes quentes e midas favorecem o aparecimento dos Culicoides e, conseqentemente, a maior transmisso do vrus. A populao desses insetos tende a diminuir no outono e inverno, quando a temperatura mais baixa. Aps a ingesto e adsoro na parede do intestino mdio do mosquito, o vrus se multiplica em tecidos intestinais e em outros tecidos do inseto, incluindo as glndulas salivares. Assim, pode ser transmitido a um novo hospedeiro ao se alimentar novamente. A viremia que ocorre nos hospedeiros essencial para a transmisso do vrus, uma vez que, nessa fase, o vrus encontra-se associado s clulas sangneas (principalmente moncitos, linfcitos e eritrcitos). Nos ovinos e caprinos, a viremia dura em mdia 50 e 28-41 dias, respectivamente. Nos bovinos, a viremia pode persistir por mais de 100 dias, sendo estes animais considerados de grande importncia epidemiolgica por servirem como reservatrios do vrus por perodos prolongados. Durante esse perodo, o vrus circula intimamente associado com a membrana dos eritrcitos, cando protegido dos anticorpos neutralizantes. Vrias espcies de Culicoides competentes na transmisso do BTV se alimentam preferencialmente nos bovinos, mesmo quando ovinos e caprinos esto presentes. A infeco pelo BTV est distribuda nas reas tropicais e subtropicais em todos os continentes, entre as latitudes 40N e 35S, onde est concentrado aproximadamente 70,7% do rebanho ovino mundial. Essa rea inclui as Amricas, frica, parte da Europa, sia e Oriente Mdio. Muitos pases localizados em reas tropicais, como a sia, Caribe e Amrica do Sul, apresentam evidncias sorolgicas da presena do BTV em ovinos e outros ruminantes, porm sem relatos da ocorrncia de doena. A distribuio geogrca da BT pode ser dividida em trs reas epidemiolgicas, com o objetivo de facilitar a anlise da epidemiologia da doena:
a) reas endmicas: onde a infeco comum, mas a ocorrncia da doena clnica rara devido presena de grande nmero de animais soropositivos. Nessas reas, o vrus pode ser isolado, com freqncia, de insetos vetores ou de animais virmicos. A doena pode ocorrer aps a introduo de animais virmicos infectados com sorotipos exticos para a rea ou quando animais susceptveis, oriundos de zonas livres da doena, so introduzidos nessas reas; b) reas epiendmicas: onde o nmero de animais soropositivos varia e a ocorrncia da doena geralmente localizada em reas especcas. Casos de doena podem ocorrer em formas de surtos espordicos, dependendo principalmente de variaes climticas, como temperatura, umidade do ar, velocidade e direo dos ventos; c) reas livres: onde no h animais soropositivos, geralmente pela impossibilidade de sobrevivncia dos insetos vetores. Vrios fatores podem alterar a distribuio do vrus dentro dessas reas, como alteraes climticas em regies limtrofes, movimento de animais, mudanas nas caractersticas da estao chuvosa e, principalmente, movimento dos ventos, que podem trazer os vetores Culicoides de regies distantes. O movimento dos hospedeiros para reas endemicamente infectadas em busca de alimentos ou de climas mais amenos tambm pode levar ao aparecimento de surtos localizados. Assim, essas zonas so dinmicas e representam o resultado da interao entre o vrus, o meio ambiente e os hospedeiros. No passado, o BTV j havia sido esporadicamente detectado em alguns pases da costa do mar Mediterrneo, mas, nas ltimas dcadas, parecia estar ausente do continente. No entanto, em 2006, foi reintroduzido em vrios pases europeus (Holanda, Blgica e Alemanha), provavelmente a partir da frica, onde permanece endmico. A reintroduo do vrus na Europa causou uma grande repercusso, pelas possveis conseqncias sanitrias e comerciais e tambm pelo receio de a infeco se tornar endmica em algumas regies com condies climticas propcias para a sobrevivncia dos vetores. Os inquritos sorolgicos, realizados no territrio brasileiro, em bovinos, caprinos, ovinos e bubalinos por meio da tcnica de imunodifuso
800
Captulo 30
em gel de gar (IDGA), indicam que a infeco est amplamente distribuda em todas as regies. Pelos dados sorolgicos obtidos associados com a falta de relatos clnicos, acredita-se o BTV perpetue-se de forma inaparente nos rebanhos brasileiros. Os casos clnicos que ocorrem parecem ser brandos ou de menor importncia do ponto de vista econmico e, muitas vezes, passam despercebidos. As possveis explicaes para este fato so: baixa virulncia das cepas circulantes no pas, maior resistncia de algumas raas contra a infeco ou a caracterstica endmica que a infeco assume na maior parte do pas, onde as condies de temperatura e umidade favorecem a multiplicao e manuteno dos vetores. O estado do Rio Grande do Sul apresenta as menores taxas de prevalncia, provavelmente devido ao clima, que no favorece a sobrevivncia dos vetores, porm se mostra como rea de risco, com um grande nmero de animais susceptveis. Nos estados da regio Nordeste, onde se encontra o principal efetivo dos rebanhos ovinos e caprinos, assim como os estados da regio Sudeste, que esto entre os lderes na produo de carne e leite no Brasil, observa-se a presena dos fatores necessrios para a ocorrncia da doena: vrus circulando, vetores e animais susceptveis. Em Minas Gerais, estudos recentes mostraram uma soroprevalncia de 45 e 54% em caprinos e ovinos, respectivamente. At o presente, apenas dois sorotipos do BTV foram identicados inequivocamente no Brasil. O sorotipo 4 foi isolado, em 1980, nos EUA, de animais que haviam sido exportados para aquele pas. O sorotipo 12 foi identicado em 2001, no Paran, onde caprinos, ovinos e bovinos foram acometidos. No entanto, investigaes realizadas em laboratrios internacionais de referncia, utilizando a tcnica de SN, indicam que outros sorotipos podem tambm estar presentes no Brasil. O risco de se introduzir o BTV pela importao de animais considerado muito maior do que a introduo por smen ou embries contaminados. Embora a transmisso venrea, por meio de smen contaminado e transmisso congnita do vrus possam ocorrer, a restrio geogrca da doena indica que esses mecanismos no so importantes para a perpetuao da infeco a longo
prazo, ou seja, a principal forma de disseminao do vrus por meio de insetos vetores. O risco de transmisso por transferncia de embries muito baixo, desde que as recomendaes tcnicas sejam seguidas. Da mesma forma, existem poucos relatos na literatura descrevendo o isolamento do BTV a partir de outras secrees que no o smen. Portanto, no se sabe se o vrus estaria presente em outras secrees ou se poderia ser transmitido por via iatrognica. De qualquer forma, esses possveis mecanismos de transmisso provavelmente possuam importncia epidemiolgica limitada.

A replicao inicial do vrus ocorre no stio da picada do inseto vetor, sobretudo, nas clulas endoteliais do sistema vascular e em clulas do sistema linforreticular. A replicao primria seguida por viremia associada s clulas sangneas (eritrcitos, leuccitos e plaquetas) e disseminao do vrus para outros linfonodos, bao, medula ssea e outros tecidos. Nesses tecidos, o vrus se replica no sistema microvascular, resultando nas alteraes patolgicas caractersticas da doena. A maior concentrao de vrus se encontra nos endotlios da microvascularizao do epitlio bucal. Uma grande variedade de rgos pode ser afetada, incluindo pulmes, bao, corao, rim e bexiga. Acredita-se que o vrus interaja de forma distinta com os receptores das clulas endoteliais das diferentes espcies animais, resultando em diferenas marcantes na patologia vascular. Isso poderia explicar as manifestaes clnicas distintas observadas entre as espcies de ruminantes afetadas. Algumas hipteses propem que as manifestaes clnicas nos bovinos podem estar associadas com uma reao de hipersensibilidade retardada, mediada por imunoglobulinas da classe E (IgE), devida as vrias e constantes reinfeces pelo vrus. Em ovinos, o perodo de incubao varia entre cinco e dez dias. Os sinais clnicos iniciamse por uma elevao da temperatura corporal, que coincide com o aumento da freqncia res-
Reoviridae
801
piratria. As manifestaes clnicas podem estar ausentes ou se manifestarem de forma aguda. Em reas endmicas, a doena rara, apresentando-se geralmente em animais vindos de reas livres. Como regra, o primeiro sinal o aumento da temperatura corporal de 41 a 42C, seis a sete dias ps-infeco. A hipertermia persiste, em mdia, seis a sete dias, mas este perodo pode ser to curto quanto dois dias ou to longo quanto 11 dias. A ocorrncia de um segundo pico febril nos dias 10-11 ps-infeco pode ser observada em alguns casos. Os primeiros sinais observados so: hiperemia no focinho, lbios e mucosa oral, que tornase evidente entre dois a trs dias aps a febre. A hiperemia pode se estender para a pele, levando quebra de l. Edema generalizado na face e mandbula desenvolve-se 10-12 dias aps a infeco. Descarga nasal serosa e mucopurulenta pode ocorrer. A presena de exsudado seroso ou serossanguinolento, evoluindo a mucopurulento, de forma a bloquear a abertura das narinas e forar a respirao pela boca, pode ser observada. A lngua pode estar edemaciada e estendida para fora da boca, mas raramente se torna ciantica, apesar deste sinal ter sido o responsvel pela denominao da doena. Ulceraes na lngua e em mucosas podem propiciar infeces secundrias e necrose, principalmente na regio superior do esfago e faringe, causando vmito e aspirao do contedo ruminal, levando pneumonia debilitante. A inamao da banda coronria imediatamente acima do casco, geralmente resultando em laminite, outro achado comum, principalmente nas fases nais de infeco. Prostao e diculdade de locomoo so geralmente observadas em conseqncia das leses musculares e nos cascos. Fraqueza muscular e, em casos extremos, torcicolo irreversvel e morte, podem ocorrer. Ovelhas prenhes podem abortar em qualquer fase da gestao. A infeco dos fetos com 40 a 80 dias de idade geralmente apresenta, como conseqncia, o nascimento de cordeiros com hidrocefalia e outras alteraes no crebro, displasia da retina e outras alteraes teratognicas. A infeco pelo BTV em bovinos muito comum, mas a ocorrncia de manifestaes clnicas considerada rara nessa espcie. A severidade da
infeco e da doena pode ser inuenciada pelo sorotipo, dose infectante, siologia do hospedeiro, raa e outros fatores externos. Os surtos so espordicos, e a morbidade varivel, situandose geralmente em torno de 5%. Provavelmente menos de 1% dos bovinos infectados apresentem sinais clnicos em decorrncia da infeco. Esses sinais so caracterizados por febre transitria, seguida de hiperemia e leses ulcerativas na lngua, palato, gengiva, mucosa oral e lbios. O focinho apresenta uma aparncia ressecada, com a pele quebradia. Com o progresso da doena, os animais podem apresentar claudicao devido a inamao da regio da coroa do casco. lceras nos tetos podem se desenvolver, com uma subseqente reduo na produo de leite. Em casos crnicos, a patologia mais pronunciada na pele, na qual se observam edema e inltrao eosinoflica na derme. A infeco de vacas prenhes na primeira metade da gestao (at 150 dias) pode resultar em morte embrionria ou fetal ou no nascimento de bezerros com malformaes neurolgicas, como hidrocefalia e cegueira. Fetos infectados em fases posteriores nascem normais ou podem apresentar viremia prolongada. No entanto, ainda no foi comprovada a ocorrncia de animais imunotolerantes ao vrus. Existem evidncias de que algumas amostras do BTV ou mesmo alguns sorotipos possuem predileo pelo tero grvido e, conseqentemente, produzem infeco do concepto. A infeco de caprinos geralmente branda ou inaparente, manifestando-se apenas por febre ocasional, viremia em nveis baixos e curta durao, leucopenia e hiperemia leve da conjuntiva e mucosa nasal. Em alguns ruminantes silvestres sobretudo cervdeos , o BTV pode produzir manifestaes clnicas semelhantes s observadas na infeco aguda em ovinos. Os achados patolgicos da enfermidade causada pelo BTV esto relacionados com as leses no endotlio vascular, que resultam na sua fragilizao e em alteraes na permeabilidade vascular. Essas alteraes resultam em edema, congesto, hemorragias, inamao e necrose. Em ovinos, a face e as orelhas se apresentam edematosas, e as narinas podem conter exsudato. As bandas coronrias freqentemente se encon-
802
Captulo 30
tram hipermicas. Petquias, lceras e eroses so comuns na cavidade oral. As mucosas nasal e oral podem estar congestas, necrosadas e cianticas. Hiperemia e eroses podem ser encontradas no retculo e omaso. Petquias, equimoses e focos necrticos podem ser observados no corao. Hemorragia na base da artria pulmonar um achado particular da doena em ovinos. Hiperemia, hemorragia, edema em vrios rgos, hemorragias focais e necrose nos msculos esquelticos podem tambm ser observados. Nos cervdeos, as leses mais evidentes so petquias e equimoses disseminadas por vrios rgos e tecidos. Animais com lceras necrticas na cavidade oral e leses nos cascos podem ser encontrados em casos em que o curso da doena mais prolongado. O exame microscpico das leses das mucosas demonstra inltrao de clulas mononucleares, degenerao e necrose das clulas epiteliais. Os msculos afetados apresentam edema, hemorragia, degenerao hialina e necrose. Inltrao de neutrlos, macrfagos e linfcitos esto presentes em casos agudos.
5.5.3 Diagnstico
Deve-se suspeitar de lngua azul quando os sinais clnicos caractersticos da doena forem observados em ovinos e bovinos, principalmente nas estaes de maior atividade dos vetores ou quando animais provenientes de outras regies so introduzidos em reas endmicas. Para o diagnstico laboratorial, amostras de sangue total e de soro devem ser coletadas de vrios animais do rebanho. Bao, medula, corao e linfonodos mesentricos so os tecidos de escolha a serem coletados em animais submetidos necropsia. Sangue, soro, bao e tecido nervoso devem ser coletados de cordeiros ou bezerros com problemas congnitos. O material deve ser enviado refrigerado, o mais rpido possvel, para o laboratrio. O diagnstico sorolgico da infeco pelo BTV baseado principalmente nas tcnicas de IDGA e ELISA, que identicam a exposio dos animais a vrus do sorogrupo BTV. Esses testes
tm sido extensivamente utilizados na vigilncia epidemiolgica e para emisso de certicados de trnsito, cujos rebanhos so destinados exportao. Para a deteco do vrus em amostras de sangue e tecidos, o teste in vitro mais sensvel a inoculao intravenosa em ovos embrionados, seguida do cultivo em clulas BHK. A identicao do grupo BTV geralmente realizada pela tcnica de imunouorescncia direta (IFD) e a tipicao sorolgica por meio da tcnica de SN, utilizando-se uma bateria de soros dos 24 sorotipos existentes. O isolamento do vrus em cultivo celular, a partir de amostras clnicas, particularmente difcil, o que diculta sobremaneira o diagnstico da infeco. Mtodos alternativos, como a RT-PCR, tm sido utilizados para detectar a presena do vrus ou do cido nuclico viral em amostras clnicas (sangue) e em vetores. As principais enfermidades consideradas no diagnstico diferencial so o ectima contagioso, febre aftosa, fotossensibilizao, diarria viral bovina/doena das mucosas, rinotraquete infecciosa bovina, estomatite vesicular, febre catarral maligna e enfermidade hemorrgica epizotica dos cervos.

Em reas livres, o controle da infeco pelo BTV deve ser focado principalmente no controle do movimento de animais, em regras rgidas de importao e quarentena, geralmente acompanhadas de dois a trs testes sorolgicos. Uma vez que a infeco se instale em regio livre, o diagnstico rpido, associado ao sacrifcio dos animais, desinfeco rigorosa e controle de vetores so as medidas a serem adotadas. Porm, como a infeco pelo BTV pode ocorrer sem evidncias clnicas, sobretudo em bovinos, a infeco pode se disseminar despercebida. Uma vez estabelecida de forma endmica, a possibilidade de erradicao da infeco praticamente nula. Assim, as medidas a serem adotadas objetivam minimizar os prejuzos causados pela doena clnica. Nesses casos, o controle pode ser realizado de duas maneiras: interrompendo o ciclo
Reoviridae
803
de transmisso, por meio do controle de vetores; ou reduzindo o nmero de hospedeiros susceptveis, pela vacinao. A separao de ovinos e bovinos pode reduzir a possibilidade dos vetores disseminarem a infeco entre essas espcies. Abrigar os ovinos em reas protegidas de mosquitos durante a noite, perodo de maior atividade dos vetores ou para algumas espcies de Culicoides, e manejar as ovelhas em reas de altitude elevada so outras medidas que podem ser adotadas. A reduo na populao dos vetores pode ser obtida com uso de inseticidas, que podem ser aplicados diretamente nos animais de forma local ou sistmica, ou na fase aqutica do ciclo dos vetores, visando destruio das larvas. Embora o uso de pesticidas possa ser efetivo em reas restritas, a tentativa de controlar Culicoides sp. desta maneira no se mostra prtica para uso rotineiro, podendo resultar em problemas ambientais, alm de ser muito dispendiosa e economicamente invivel. Alm disso, depende dos conhecimentos do ciclo biolgico, populao e dinmica dos mosquitos da regio e aplicao em poca certa e com condies climticas adequadas. O uso da vacinao nas reas onde a BT se constitui em problema sanitrio importante a medida mais freqentemente adotada. Embora a infeco de bovinos seja comum e curse com nveis altos de viremia, em todos os pases onde as vacinas so utilizadas, apenas os ovinos tm sido vacinados. As vacinas comercialmente disponveis so atenuadas e geralmente polivalentes, contendo os sorotipos prevalentes em cada rea. A vacinao adotada rotineiramente em pases como a frica do Sul, Israel e alguns estados dos EUA, onde a doena causa prejuzos para criadores de ovinos. No Brasil, no existem vacinas disponveis, pois alm da incerteza quanto a distribuio e o impacto econmico da infeco, os sorotipos prevalentes no pas no so conhecidos.
silvestres, principalmente os cervdeos. A doena caracterizada pela ocorrncia de alteraes hemorrgicas em vrios rgos e sistemas. A doena causada pelo EHDV, um membro do gnero Orbivirus da famlia Reoviridae. J foram identicados nove sorotipos deste vrus (sorotipos 1-9) e, ainda, o vrus Ibaraki (IV), que classicado como um vrus distinto pertencente ao grupo do EHDV. Alguns autores acreditam que o IV e o EHDV sorotipo 2 australiano pertenam ao mesmo sopotipo. Apesar de no ser uma doena de importncia econmica, a EHD apresenta um importante signicado pela alta mortalidade que causa nos cervdeos, podendo reduzir drasticamente a populao desses animais em determinadas reas. A doena de Ibaraki possui importncia econmica restrita s reas de sua ocorrncia, pois, alm de problemas reprodutivos, pode levar mortalidade at 10% dos bovinos acometidos.
5.6.1 Epidemiologia
O EHDV pode infectar uma grande variedade de ruminantes silvestres e domsticos, mas os sinais clnicos so observados principalmente em cervdeos. Nos bovinos, a infeco raramente acompanhada de sinais clnicos. J a doena de Ibaraki freqentemente afeta essa espcie. Os ovinos podem ser infectados experimentalmente, mas raramente desenvolvem sinais clnicos; e os caprinos parecem no ser susceptveis infeco. A infeco pelo EHDV est presente na Austrlia, sia e pases africanos. Na Amrica do Norte, a infeco considerada, junto com a lngua azul, a doena mais importante dos cervdeos. Animais soropositivos para o vrus j foram identicados tambm na Amrica do Sul. A doena de Ibaraki est restrita ao Japo, Coria e Tailndia, apesar de bovinos soropositivos terem sido identicados tambm na Austrlia e Indonsia. No Brasil, poucos estudos tm sido feitos em relao ao EHDV. Apesar de o vrus no ter sido isolado e tipicado, existem evidncias sorolgicas da sua ocorrncia em cervdeos de vida livre nos estados de So Paulo e Mato Grosso. Atravs de testes sorolgicos, realizados em 81 cervdeos
5.6 Vrus da doena hemorrgica epizotica dos cervdeos

A doena hemorrgica epizotica dos cervdeos (EHD) uma doena viral aguda, freqentemente fatal, que afeta alguns ruminantes
804
Captulo 30
capturados, detectou-se 88% positivos o BTV, 74% positivos para o EHDV e 60% positivos para os dois vrus, indicando a circulao desses vrus no Pas. Os vrus do sorogrupo do EHDV so transmitidos por mosquitos do gnero Culicoides, que atuam como vetores biolgicos. Nos Estados Unidos, onde a doena ocorre freqentemente em cervdeos, o principal vetor o C. variipennis. Surtos das doenas causadas pelo EHDV so descritos principalmente no nal do vero e incio do outono, pocas da maior populao dos vetores. Cervdeos infectados podem permanecer virmicos por at dois meses, atuando nesse perodo como reservatrios e fontes de infeco.

O perodo de incubao da EHD de cinco a dez dias. Nos cervdeos, os sinais clnicos so semelhantes aos da BT, mas trs formas clnicas da doena podem ser observadas: a) doena hiperaguda: caracterizada por febre alta, anorexia, fraqueza, aumento da freqncia respiratria e edema acentuado na cabea, pescoo e lngua. Nesta forma da doena, os animais geralmente morrem em 8 a 36 horas e alguns so encontrados mortos sem a observao prvia de sinais clnicos; b) forma aguda: os sinais mencionados so acompanhados por extensiva hemorragia em vrios tecidos, incluindo a pele, corao e trato gastrintestinal. Geralmente observa-se salivao excessiva e descarga nasal, que pode ser sanguinolenta. Eroses na lngua, gengiva, palato, rmen e omaso podem ser observadas. As formas hiperaguda e aguda apresentam altas taxas de mortalidade; c) forma crnica: o animal ca doente por vrias semanas, mas se recupera gradualmente, quando podem ser observados anis nos cascos, causados pela interrupo do seu crescimento. Nesta forma da doena, os animais podem tambm apresentar lceras e eroses no rmen. Em ovinos, geralmente no so observados sinais clnicos relevantes. A EHD raramente observada nos bovinos, porm o sorotipo Ibaraki tem sido associado com
surtos espordicos de uma doena severa no Japo. Os sinais clnicos consistem de febre, leses erosivas e ulcerativas na cavidade oral e na mucosa esofgica e edema na pele. A mortalidade pode atingir 10% do rebanho. Leses degenerativas na musculatura so encontradas no esfago, laringe, lngua e musculatura esqueltica. Laminite e problemas de casco podem tambm ser observados. Nos animais gestantes, pode ocorrer morte fetal e, se a infeco ocorrer entre os dias 70 e 120 de gestao, pode ocorrer o nascimento de animais com hidrocefalia, malformaes fetais e distrbios neurolgicos. Os achados macroscpicos e microscpicos da EHD so caracterizados por hemorragias, que vo desde petquias a equimoses, e envolvem diferentes tecidos e rgos, sendo mais freqente o envolvimento do corao, fgado, bao, rim, pulmo e trato gastrintestinal. Edema generalizado e aumento do uido pericrdico so achados freqentes. As alteraes encontradas so conseqncias da degenerao das clulas endoteliais dos vasos sangneos e da interferncia no processo de coagulao.
5.6.3 Diagnstico
Uma combinao do histrico, epidemiologia, caractersticas clnicas e achados macroscpicos podem levar suspeita da EHD. No entanto, pelas similaridades com outras enfermidades, o isolamento e identicao do vrus so essenciais para o diagnstico conclusivo. A ocorrncia sazonal e o quadro de hemorragias generalizadas so caractersticas que fortalecem a suspeita clnica. No diagnstico diferencial, devem ser consideradas a BT, febre aftosa, fotossensibilizao e febre catarral maligna. Na doena em cervdeos, os melhores tecidos para o isolamento e/ou identicao do agente ou seus produtos so bao e linfonodos, seguidos de fgado, pulmo e corao. O sangue total, coletado com anticoagulantes, a amostra indicada para a pesquisa do EHDV e do vrus Ibaraki. O material deve ser enviado sob refrigerao ao laboratrio. Tecidos xados em formol, para anlise histopatolgica, tambm podem ser coletados. O soro, principalmente nos casos de doena crnica, pode ser til, e, se possvel,
Reoviridae
805
CLAVIJO, A. et al. Isolation of bluetongue virus serotype 12 from an outbreak of the disease in South America. The Veterinary Record, v.151, p.301-302, 2002. CONNER, M.E.; MATSON, D.O.; ESTES, M.K. Rotavirus vaccines and vaccination potential. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.185, p.285-337, 1994. COSTA, J.R.R. et al. Prevalncia de anticorpos contra o vrus da lngua azul em bovinos e ovinos do sudoeste e sudeste do Rio Grande do Sul. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v.58, p.273-275, 2006. ESTES, M.K. Rotaviruses and their replication. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.54, p.1747-1785. ESTES, M.K.; COHEN, J. Rotavirus gene structure and function. Microbiological Reviews, v.53, p.410-449, 1989. FUKUDOME, K.; YOSHIE, O.; KONNO, T. Comparison of human, simian, and bovine rotaviruses for requeriment of sialic acid in hemagglutination and cell adsorption. Virology, v.172, p.196-205, 1989. GALLEGOS, C.O.; PATTON, J.T. Characterization of rotavirus replication intermediates: a model for the assembly of singleshelled particles. Virology, v.172, p. 616-627, 1989. GENTSCH, J.R. et al. Review of G and P typing results from a global collection of strains: Implications for vaccine development. The Journal of Infectious Diseases, v.174, p.30-36, 1996. GERNA, G. et al. lsolation and characterization of two distinct human rotavirus strains G6 specicity. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.9-l6, 1992. GIBBS, E.P.J; GREINER, E.C. The epidemiology of bluetongue. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.17, p.207-220, 1994. GONZALES, R.A. et al. Relative localization of viroplasmic and endoplasmic reticulum-resident rotavirus proteins in infected cells. Archives of Virology, v.145, p.1963-1973, 2000. GONZALEZ, S.A. et al. Structure of rearranged genome segment 11 in two different rotavirus strains generated by a similar mechanism. The Journal of General Virology, v.70, p.1329-1336, 1989. GOUVEA, V.; SANTOS, N.; TIMENETSKY, M.C. VP4 typing of bovine and porcine group A rotaviruses by PCR. Journal of Clinical Microbiology, v.32, p.l333.-l337, 1994. GOUVEA, V; SANTOS, N.; TIMENETSKY. Identication of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. Journal of Clinical Microbiology, v.32, p.l338-l340, 1994. GOUVEIA, A.M.G. et al. Lngua Azul em ovinos e caprinos em Minas Gerais. In: CONGRESSO LATINO AMERICANO DE BUIATRIA, 11.; CONGRESSO BRASILEIRO DE BUIATRIA,
o soro pareado deve ser coletado. O diagnstico denitivo baseia-se no isolamento e identicao do agente. Dentre os mtodos mais sensveis, utilizados para o isolamento, esto a inoculao intravenosa em ovos embrionados seguida da inoculao em cultivo celular.

No existe tratamento efetivo e no h vacinas disponveis para a doena causada pelo EHDV. No Japo, est disponvel uma vacina viva atenuada contra a doena de Ibaraki. Existem poucas medidas prticas para prevenir a infeco, entretanto, o controle de vetores atravs de alteraes nas condies ambientais que desfavoream a multiplicao dos Culicoides e o uso de inseticidas e larvicidas so medidas que, teoricamente, reduzem o risco da infeco.
ALFIERI, A.A. et al. Characterization of human rotavirus genotype P[8],G5 from Brazil by probe-hybridization and sequence. Archives of Virology, v.141, p.2353-2364, 1996. ALFIERI, A.A. et al. Evidncias do envolvimento de rotavrus na diarria do pr e ps-desmame dos sunos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v.43, p.291-300, 1991. ALFIERI, A.A. et al. Frequency of group A rotavirus in diarrhoeic calves in Brazilian cattle herds, 1998-2002. Tropical Animal Health and Production, v.38, p.521-526, 2006. ALFIERI, A.F. et al. G and P genotypes of group A rotavirus strains circulating in calves in Brazil, 1996-1998. Veterinary Microbiology, v.99, p.167-173, 2004. ALTENBURG, B.C.; GRAHAM, D.Y.; ESTES, M.K. Ultrastructural study of rotavirus replication in cultured cells. The Journal of General Virology, v.46, p.75-85, 1980. BARREIROS, M.A.B. et al. An outbreak of diarrhoea in one week-old piglets caused by group A rotavirus genotype P[7],G3 and P[7],G5. Veterinary Research Communications, v.27, p.505512, 2003. BARREIROS, M.A.B. et al. G and P genotipes of group A rotavirus from diarrheic calves Born to cows vaccinated against the NCDV (P[1],G6) rotavirus strains. Journal of Veterinary Medicine Series B, v.51, p.104-109, 2004. BAYLIS, M. The reemergence of bluetongue. Veterinary Journal, v.164, p.5-6, 2002.
806
5., 2003; CONGRESSO NORDESTINO DE BUIATRIA, 3., 2003, Salvador, BA. Anais... Salvador: [s.n.], 2003. p.51-52. GROOCOCK, C.M.; CAMPBELL, C.H. Isolation of an exotic serotype of bluetongue virus from imported cattle in quarantine. Canadian Journal of Comparative Medicine, v.46, p.160-164, 1982. HUANG, J.A. et al. Molecular and serological analyses of two rotaviruses (B-11 and B-60) causing calf scours in Australia. Journal of Clinical Microbiology, v.30, p.85-92, 1992. HUSSEIN, H.A. et al. Detection of rotavirus serotypes G1, G2, G3, and G11 in feces of diarrheic calves by using polymerase chain reaction-derived cDNA probes. Journal of Clinical Microbiology, v.31, p.249l-2496, 1993. JOHNSON, M.W. et al. The six most common pathogens responsible for diarrhea in newborn pigs. Veterinary Medicine, v.87, p.382-386, 1992. KAPIKIAN, A.Z.; HOSHINO, Y.; CHANOCK, R.M. Rotaviruses. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.55, p.1787-1833. LAENDER, J.O. et al. Levantamento das espcies de Culicoides Latreille, 1809 (Diptera: Ceratopogonidae) encontradas nas mesorregies norte de Minas, Jequitinhonha e Vale do Mucuri, Minas Gerais, Brasil. Entomologia y Vectores, v.11, p.145-157, 2004. LAENDER, J.O. Lngua azul em rebanhos de ovinos e caprinos em trs mesorregies de Minas Gerais: anlise da evidncia clnica e sorolgica e identicao de Culicoides sp. 2002. 92f. Dissertao (Mestrado em Medicina Veterinria) - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2002. LAGER, I.A. Bluetongue virus in South America: overview of viruses, vectors, surveillance and unique features. Veterinaria Italiana, v.40, p.89-93, 2004. LIPRANDI, F. et al. Characterization of rotaviruses isolated from pigs with diarrhoea in Venezuela. Veterinary Microbiology, v.13, p.37-45, 1987. LOBATO, Z.I.P. Lngua azul: a doena nos bovinos. Revista Brasileira de Reproduo Animal, v.23, p.515-523, 1999. LUCCHELLI, A. et al. Prevalence of bovine group A rotavirus shedding among dairy calves in Ohio. American Journal of Veterinary Research, v.53, p.169-174, 1992. LUNDGREN, O.; SVENSSON, L. Pathogenesis of rotavirus diarrhea. Microbes and Infection, v.3, p.1145-1156, 2001. MATTION, N.M. et al. Expression of rotavirus proteins encoded by alternative open reading frames of genome segment 11. Virology, v.181, p.295-304, 1991. McNULTY, M.S.; CURRAN, W.L.; McFERRAN, J.B. The morphogenesis of a cytophatic bovine rotavirus in Madin-Darby
Captulo 30
bovine kidney cells. The Journal of General Virology, v.33, p.503-508, 1976. MEBUS, C. et al. Calf diarrhea (scours): reproduced with a virus from a eld outbreak. University of Nebraska Research Bulletin, v.23, p.30-35, 1969. MELLOR, P.S. Culicoides: vectors, climate change and disease risk. Veterinary Bulletin, v.66, p.301-306, 1996. MOORE, D. Symposium on neonatal calf diarrhea. Veterinary Medicine, v.84, p.793, 1989. MURPHY, F.A. et al. Reoviridae. In:__Veterinary Virology, 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. p.391. MURRAY, P.K.; EATON, B.T. Vaccines for bluetongue. Australian Veterinary Journal, v.73, p.207-210, 2006. NAKAGOMI, O.; NAKAGOMI, T. Interspecies transmission of rotaviruses studies from the perspective of genogroup. Microbiology and Immunology, v.37, p.337-348, 1993. NAKAGOMI, O.; NAKAGOMI, T. Genetic diversity and similarity among mammalian rotaviruses in relation to interspecies transmission ofrotavirus. Archives of Virology, v.120, p.43-55, 1991. OIE. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. 4.ed. Paris, France: OIE, 2000. Disponvel em: html://www.oie. int/esp/normes/mcode/E_summry.htm. Acesso em: 10 out. 2002. OSBURN, B.I. Bluetongue virus. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, v.10, p.547-560, 1994a. OSBURN, B.I. The impact of bluetongue virus on reproduction. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v.17, p.189-196, 1994b. PARSONSON, I.M. Overview of bluetongue infection of sheep. In: WALTON, T.E.; OSBURN, B.I. (eds). Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbivirus. Boca Raton: CRC Press, 1992. p.713-724. PATTON, J. T.; SPENCER, E. Genome replication and packaging of segmented-double stranded RNA viruses. Virology, v.277, p.2147-225, 2000. PAUL, P.S.; LYOO, Y.S. Immunogens of rotaviruses. Veterinary Microbiology, v.37, p.299-317, 1993. PEREIRA, H.G. et al. An atypical rotavirus detected in a child with gastroenteritis in Rio de Janeiro, Brazil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v.78, p.245-250, 1983. PESAVENTO, J.B.; ESTES, M.K.; PRASAD, B.V.V. Structural organization of the genome in rotavirus. In: DESSELBERGER, U.; GRAY, J. (Eds). Viral gastroenteritis, v.9. Amsterdam: Elsiever Science, 2003. p.115-128. PRASAD, B.V.V.; ESTES, M.K. Molecular basis of rotavirus replication. In: CHIU, W.; BURNETT, R.M.; GARCEA, R.L (Eds).
Reoviridae
807
SUZUKI, Y.et al. Relative frequencies of G (VP7) and P (VP4) serotypes determined by polymerase chain reaction assays among japanese bovine rotavirus isolated in cell culture. Journal of Clinical Microbiology, v.31, p.3046-3049, 1993. TAMEHIRO, C.Y. et al. Segmented double-stranded genomic RNA viruses in fecal samples from broiler chicken. Brazilian Journal of Microbiology, v.34, p.349-353, 2003. TANIGUCHI, K.; URASAWA, S. Diversity in rotavirus genomes. Virology, v.6, p.123-131, 1995. TOMICH, R.G.P. et al. Epidemiologia do Vrus da Lngua Azul em Rebanhos Bovinos. Corumb: EMBRAPA PANTANAL, 2006. Doc 85. Disponvel em: www.cpap.embrapa.br/publicacoes/ online/DOC85. Acesso em: 18 nov. 2006. WARD, M.P.; CARPENTER, T.E.; OSBURN, B.I. Host factors affecting seroprevalence of bluetongue virus infections of cattle. American Journal of Veterinarian Research, v.55, p.916-920, 1994. WENTZ, M.J.; PATTON, J.T.; RAMIG R.F. The 3 terminal consensus sequence of rotavirus mRNA is the minimal promoter of negative-strand RNA synthesis. Journal of Virology, v.70, p.7833-7841, 1996. WOODE, G.N. et al. Antigenic relationships among some rotavirus:serum neutralization and cross-protection in gnotobiotic calves. Journal CIinical of Microbiology, v.18, p.358-364, 1983. WRATHALL, A.E.; SIMMONS, H.A.; VAN SOOM, A. Evaluation of risks of viral transmission to recipients of bovine embryos arising from fertilization with virus infected semen. Theriogenology, v.65, p.247-274, 2006. ZABEREZHNY, A.A.; LYOO, Y.S.; PAUL, P.S. Prevalence of P types among porcine rotaviruses using subgenomic VP4 gene probes. Veterinary Microbiology, v.39, p.97-110, 1994.
Structural biology of viruses, Oxford: Oxford University Press, 1997. p.239-268. PRASAD, G. et al. Trends in bluetongue virus diagnostics: A review. Indian Journal of Animal Science, v.70, p.103-109, 2000. REINHARDT, G. et al. Diarrea neonatal. Infeccion por rotavirus em bovinos y porcinos. Archivos de Medicina Veterinaria, v.18, p.23-27, 1986. ROY, P. Orbivirus. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.56, p.1835-1869. RUIZ, M.C; COHEN, J.; MICHELANGELI, F. Role of Ca2+ in the replication and pathogenesis of rotavirus and other viral infectious. Cell Calcium, v.28, p.137-149, 2000. RUSSEL, H. et al. Comparative effects of bluetongue virus infection of ovine and bovine endothelial cells. Veterinary Pathology, v.33, p.319-331, 1996. SAIF, L.J. Nongroup A rotaviruses. In: SAIF, L. J.; THEIL, K.W. (Eds). Viral diarrheas of man and animals. Boca Raton: CRC Press, 1990. p.73-95. SAIF, L.J.; JIANG, B. Nongroup A rotaviruses of Humans an Animals. Current Topics in Microbiology and Immunology, v.185, p.339-371, 1994. SATO, K. et al. Hemagglutination by calf diarrhea coronavirus. Veterinary Microbiology, v.2, p.83-87, 1977. SATO, M.; AKASHI, H. Detection of bovine coronavirus by enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. The Journal of Veterinary Medical Science, v.55, p.771-774, 1993. SNODGRASS, D.R. et al. Rotavirus serotypes 6 and 10 predominate in cattle. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.504-507, 1990.
RETROVIRIDAE
Ana Paula Ravazzolo & Ubirajara Maciel da Costa
31
811 811 811
812

3.1 O genoma
4 Replicao 5 Retrovrus de interesse veterinrio

5.1 Vrus da leucose bovina 5.1.1 Epidemiologia 5.1.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.1.3 Diagnstico 5.1.4 Prolaxia e controle 5.2 Vrus da imunodecincia bovina 5.2.1 Epidemiologia 5.2.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.2.3 Diagnstico e controle 5.3 Vrus da pneumonia progressiva dos ovinos (Maedi-Visna) 5.3.1 Epidemiologia 5.3.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.3.3 Diagnstico e controle 5.4 Vrus da artrite-encefalite caprina 5.4.1 Epidemiologia 5.4.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.4.3 Diagnstico e controle 5.5 Vrus da adenomatose pulmonar dos ovinos 5.5.1 Epidemiologia 5.5.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.5.3 Diagnstico e controle
815 819
819 819 820 821 822 823 823 824 824 824 824 825 825 826 826 827 827 828 828 828 829
5.6 Vrus da anemia infecciosa eqina 5.6.1 Epidemiologia 5.6.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.6.3 Diagnstico e controle 5.7 Vrus da leucemia felina 5.7.1 Epidemiologia 5.7.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.7.3 Diagnstico e controle 5.8 Vrus da imunodecincia felina 5.8.1 Epidemiologia 5.8.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.8.3 Diagnstico 5.8.4 Controle e prolaxia 5.9 Vrus da leucose aviria 5.9.1 Epidemiologia 5.9.2 Patogenia, sinais clnicos, patologia e imunidade 5.9.3 Diagnstico e controle
829 829 830 830 831 831 832 832 833 833 834 834 835 835 835 836 836
836
1 Introduo
A famlia Retroviridae composta por um grande nmero de vrus que podem ser encontrados em, virtualmente, todos os vertebrados. Os retrovrus possuem vrions envelopados e apresentam duas molculas idnticas de RNA de ta simples linear como genoma. Os membros dessa famlia so assim denominados por possurem uma enzima capaz de sintetizar uma molcula de DNA pela transcrio do seu genoma, mecanismo chamado de transcrio reversa. A enzima que cataliza esta reao a transcriptase reversa (RT) um componente dos vrions e possui, ainda, outras atividades essenciais para a replicao viral. A etapa de transcrio reversa se constitui no evento central da multiplicao dos retrovrus. O ciclo replicativo dos retrovrus envolve tambm uma etapa de integrao da cpia DNA do seu cido nuclico no genoma da clula hospedeira, etapa essencial para a expresso gnica e para a produo de prognie viral. Esse evento faz com que as infeces pelos retrovrus assumam um carter persistente, ou seja, uma vez infectados, os hospedeiros se tornam portadores do agente pelo resto da vida. Alguns retrovrus tambm tm sido descritos como indutores de tumores em humanos e animais. Os retrovrus foram responsveis por dois marcos importantes nas Cincias Biolgicas, ambos relacionados com a descrio da enzima RT DNA polimerase dependente de RNA por Howard Temin, em 1970, que lhe valeu o prmio Nobel. O primeiro refere-se quebra de um paradigma: at ento se acreditava que a transcrio s ocorria de DNA para RNA. O segundo, baseado justamente nesta caracterstica, proporcionou grandes avanos na Biologia Molecular, pela utilizao de enzimas com essa propriedade na obteno de DNA complementar (cDNA) aos RNA mensageiros (mRNA). Os retrovrus podem ser encontrados em praticamente todas as espcies de animais domsticos, com signicado clnico e sanitrio variveis. Dentre os retrovrus de importncia veterinria, destacam-se o vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), o vrus da leucose bovina (BLV), o Maedi-Visna de ovinos, o vrus da artrite e en-
cefalite caprina (CAEV), os vrus da leucemia (FeLV) e imunodecincia felina (FIV) e o vrus da leucose aviria (ALV), entre outros. Nas duas ltimas dcadas, um nmero expressivo de pesquisas relacionadas aos retrovrus foi publicado, pesquisas essas motivadas a partir da identicao e da importncia adquirida pelo vrus da imunodecincia humana (HIV). Esse vrus foi classicado no gnero Lentivirus, em funo de sua similaridade com o vrus MaediVisna. Alm de sua importncia como patgenos de animais, vrios lentivrus tm sido tambm estudados como modelos para o HIV, em estudos de patogenia e na pesquisa e desenvolvimento de drogas antivirais e vacinas. O BLV, que um Deltaretrovirus, tambm tem sido utilizado como modelo para o vrus da leucemia dos linfcitos T de humanos (HTLV). Neste captulo, sero abordados aspectos relacionados aos principais retrovrus de animais domsticos, com nfase naqueles de maior importncia em nosso meio.
2 Classicao
Segundo o Comit Internacional de Taxonomia Viral (International Comittee of Viral Taxonomy ICTV), a famlia Retroviridae est dividida em duas subfamlias, sendo cada subfamlia dividida em gneros (Tabela 31.1). A diviso em subfamlias baseia-se mais em propriedades patognicas do que em critrios moleculares. A anlise de homologia de nucleotdeos, estrutura e organizao genmica permite a diviso em grupos. A maioria dos retrovrus de importncia em veterinria est classicada na subfamlia Orthoretrovirinae; na subfamlia Spumaretrovirinae, os Spumavirus ainda no foram associados com doenas.

Os vrions dos retrovrus contm duas molculas idnticas de RNA de ta simples, polaridade positiva, com aproximadamente 10 kb cada. Nesse sentido, so os nicos vrus animais a possurem duas cpias do genoma nos vrions e, por isso, so ditos diplides. O genoma viral encontra-
812
Captulo 31
Tabela 31.1. Vrus da famlia Retroviridae de importncia em Medicina Veterinria.
Subfamlia
Gnero
Alpharetrovirus Betaretrovirus Gamaretrovirus Deltaretrovirus Epsilonretrovirus
Espcie viral
Vrus da leucose aviria (ALV) Jaagsiekte (JSRV; adenocarcinoma ovino) Vrus da leucemia felina (FeLV) Vrus da leucose bovina (BLV) Nenhum associado com doena animal Vrus da imunodeficincia bovina (BIV) Vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV)
Orthoretrovirinae
Lentivirus
Vrus da imunodeficincia felina (FIV) Vrus da artrite encefalite caprina (CAEV) Vrus Maedi Visna dos ovinos (MVV)
Spumaretrovirinae
Spumavirus
Nenhum associado com doena animal
se altamente condensado e associado com mltiplas cpias da nucleoprotena (NC), formando o ncleo ou core. Neste ncleo tambm esto presentes algumas protenas que desempenham funes catalticas durante a replicao: a protease (PR), a RT e a integrase (IN). Esse complexo est contido em um capsdeo de forma esfrica ou cnica, formado pela associao de cpias mltiplas da protena do capsdeo (CA). O nucleocapsdeo (core + capsdeo) revestido externamente por uma camada formada por centenas ou milhares de cpias da protena da matriz (MA). Essa camada recoberta por um envelope lipoprotico, no qual se encontram as duas glicoprotenas virais, a transmembrana (TM) e a de superfcie (SU). A TM uma protena integral de membrana, ou seja, apresenta uma regio transmembrana; a SU est localizada externamente no vrion, associada de forma no-covalente com a regio externa da TM. As partculas vricas dos retrovrus so liberadas das clulas infectadas ainda imaturas. A maturao ocorre no meio extracelular, pela clivagem dos precursores proticos e rearranjos estruturais nas estruturas vricas internas, o que resulta em mudanas na aparncia dos vrions sob microscopia eletrnica. As partculas madu-
ras dos retrovrus so, aproximadamente, esfricas e possuem um dimetro que varia entre 80 e 120 nm para os diferentes vrus. A Figura 31.1 apresenta uma fotograa de microscopia eletrnica e uma ilustrao esquemtica de partculas vricas dos retrovrus.
3.1 O genoma
O genoma RNA dos membros da famlia Retroviridae possui entre sete e 13 kb, dependendo do vrus, e contm trs genes principais: gag, pol e env. O gene do antgeno especco de grupo (group antigen gag) codica as protenas MA, a NC e a CA. O gene pol codica as enzimas RT, IN e PR. O gene env codica as protenas do envelope (TM e SU). As protenas Gag, Pol e Env so sintetizadas como poliprotenas precursoras e so clivadas somente na fase nal do ciclo, durante o egresso e mesmo aps, dando origem s protenas individuais. A Figura 31.2 apresenta uma ilustrao da estrutura e organizao do genoma dos lentivrus de pequenos ruminantes (SRLV), e a Figura 31.3 apresenta uma comparao da estrutura e organizao genmica (provrus) de diferentes retrovrus.
Retroviridae
813
B
NC
SU TM
ENV
MA IN RNA RT CA PR
Fonte: A) Dept. Microbiologia, University of Otaga, Nova Zelndia. ICTVdB.
Figura 31.1. Vrions da famlia Retroviridae. A) Fotografia de microscopia eletrnica de partculas do HIV; B) Ilustrao esquemtica de um vrion mostrando os seus componentes. RNA: genoma; NC: protena do nucleocapsdeo; CA: capsdeo; MA: matriz; IN: integrase; RT: transcriptase reversa; PR: protease; TM: glicoprotena transmembrana; SU: glicoprotena de superfcie, ENV: envelope.
Cap
AAAA
gag pol
tat vif
rev
LTR
P55 Gag .Gag-pol
env
gp160 Env
LTR
MA p16
CA p25
NC p14
PR p12
RT p66/p51
IN p29
SU gp 135
TM gp 45
Figura 31.2. Organizao do genoma e do provrus DNA dos lentivrus de pequenos ruminantes (SRLV ou CAEV e MVV), com as protenas codificadas. LTR: regio repetida terminal. Genes: gag (antgenos especficos de grupo); pro (protease); pol (polimerase); env (envelope). Protenas: MA: protena da matriz; CA: protena do capsdeo; NC: protena do nucleocapsdeo; RT: transcriptase reversa; IN: integrase; PR: protease; TM: protena transmembrana; SU: glicoprotena de superfcie. Os produtos dos genes tat, vif e rev so protenas acessrias com funes regulatrias. Os nmeros abaixo de cada protena referem-se respectiva massa molecular.
814
Captulo 31
LTR
LTR
gag
pro pol env
ALV
LTR
LTR
gag pro
pol env .tax .rex
BLV
LTR
LTR
gag
pol env
FeLV
LTR
vif gag pol tat
rev env
LTR
CAEV
LTR
tat pol gag S2
env
LTR
EIAV
rev
LTR
pol gag w Vif y
env rev .tat
LTR
BIV
LTR
gag
Vif
A env
LTR
FIV
pol
rev
Figura 31.3 Estrutura comparativa do genoma de diferentes retrovrus de animais domsticos. ALV: vrus da leucose aviria; BLV: vrus da leucose bovina; FeLV: vrus da leucemia felina; CAEV: vrus da artrite-encefalite caprina; EIAV: vrus da anemia infecciosa eqina; BIV: vrus da imunodeficincia bovina; FIV: vrus da imunodeficincia felina; LTR: regio repetida terminal. Genes gag (antgenos especficos de grupo); pro (protease); pol (polimerase); env (envelope). Genes acessrios: tax, rex, rev, vif, tat etc.
Retroviridae
815
O RNA genmico produzido pela transcrio do provrus integrado no cromossomo da clula hospedeira, reao que catalisada pela maquinaria celular de transcrio. Por isso, o genoma viral contm uma estrutura cap em sua extremidade 5 e uma cauda poli-A na extremidade 3. O genoma possui seqncias envolvidas na expresso gnica e na replicao, localizadas prximas s extremidades: as regies R (de repetida) e U5 (nica da extremidade 5) esto prximas extremidade 5; as seqncias R e U3 se localizam prximas extremidade 3. O processo de transcrio reversa resulta na duplicao das regies nicas (U5 e U3), o que faz com que a molcula de DNA resultante denominada provrus contenha seqncias idnticas nas duas extremidades, as regies longas terminais (Long Terminal Repeat, LTR). Cada LTR apresenta as seguintes seqncias, nesta ordem: U3-R-U5. Na regio U3, esto localizadas as principais seqncias de ligao para os fatores de transcrio, enquanto o incio da regio R corresponde ao incio da transcrio. Essas seqncias so necessrias para a transcrio do provrus, que somente ocorre aps a sua integrao ao genoma da clula hospedeira. Alguns retrovrus, incluindo os lentivrus, possuem genes adicionais, denominados acessrios ou auxiliares. Esses vrus so denominados retrovrus complexos, enquanto aqueles que no possuem estes genes so denominados retrovrus simples. Os produtos desses genes participam da regulao de diversas etapas da replicao viral. O HIV parece conter o maior nmero de genes acessrios. Trs desses genes foram igualmente descritos em lentivrus de animais: os genes tat, rev e vif. O gene tat no parece ser essencial, enquanto a deleo do gene rev impede a produo de prognie viral. A funo da protena Rev consiste em facilitar a exportao de determinados mRNA virais do ncleo para o citoplasma, onde sero traduzidos. Esses mRNAs contm uma seqncia para a ligao da Rev (RRE rev responsive element) localizada na regio central do gene env.
4 Replicao
O ciclo replicativo dos retrovrus pode ser dividido em duas fases. A primeira fase, que ocor-
re aps a penetrao e desnudamento, envolve a sntese de uma cpia DNA (provrus) a partir do genoma RNA, transporte do provrus at o interior do ncleo e a sua integrao no cromossomo da clula hospedeira. Uma parte dessas etapas ocorre no citoplasma; e a outra parte, no ncleo, e so mediadas por protenas presentes nos vrions (RT, IN). A segunda fase envolve a sntese e processamento de mRNAs e sntese das protenas virais. Essas etapas utilizam a maquinaria celular de transcrio e processamento de mRNAs e de sntese protica, respectivamente. A morfognese inicia pelo encapsidamento do genoma, juntamente com as enzimas virais, por precursores das protenas estruturais. A morfognese completada pelo brotamento do nucleocapsdeo na membrana plasmtica. O processamento nal dos precursores proticos, dando origem s protenas estruturais maduras, ocorre j no interior dos vrions extracelulares. A infeco inicia pelo reconhecimento e ligao dos vrions superfcie das clulas-alvo. Este evento mediado pela glicoprotena SU do envelope, que interage com receptores especcos da membrana plasmtica. Vrios receptores para retrovrus j foram identicados, incluindo os receptores para o FIV, FeLV e BLV. A maioria dos retrovrus infecta clulas do sistema imunolgico, como as clulas da linhagem monoctica/ macrofgica e/ou linfoctica. A etapa seguinte consiste na fuso do envelope viral com a membrana plasmtica, processo que envolve interaes da protena TM com componentes da membrana e que resulta na liberao do nucleocapsdeo no citoplasma. Essa fuso independe da reduo de pH e ocorre na superfcie da clula. Alm do genoma e das protenas NC e CA, o nucleocapsdeo contm algumas molculas das enzimas RT, IN e PR. A primeira etapa aps a penetrao e desnudamento do genoma a sntese do DNA proviral mecanismo denominado de transcrio reversa. O processo se inicia em uma seqncia denominada de stio de ligao do primer (primer binding site, PBS), localizada prxima da regio U5, onde ocorre a ligao de um RNA transportador (tRNA celular que est presente nos vrions). Inicialmente sintetizada a ta de DNA complementar (cDNA), iniciando pela sntese das regies U5 e R. O DNA de ta
816
Captulo 31
simples recm-sintetizado desloca-se, ento, para a extremidade 3 (primeiro salto), ocorrendo o pareamento com a regio R, e a sntese prossegue at a seqncia PBS. medida que a transcrio avana, a ta de RNA degradada pela atividade da ribonuclease H (RNAse H) da enzima RT, a qual igualmente responsvel pela liberao do primer de RNA, que possibilita a sntese da ta complementar do DNA proviral. A seguir, ocorre um segundo salto, com o pareamento da regio PBS entre as duas tas, que culmina com a formao da molcula de DNA de ta dupla, denominada provrus. A atividade da enzima RT parcialmente responsvel pela variabilidade observada no genoma dos retrovrus. Essa enzima comete erros ao transcrever o RNA genmico em DNA, com uma freqncia de um em cada 103-104 nucleotdeos incorporados. Isso equivale a uma mutao em cada novo genoma produzido, considerandose que o genoma dos retrovrus apresenta aproximadamente 10.000 nt. Esta taxa de mutao signicativamente maior, comparando-se com as enzimas de replicao do DNA celular, cuja freqncia de erros estimada em um em cada 109. O provrus DNA de ta dupla , ento, transportado para o ncleo da clula, onde inserido no cromossomo celular pela atividade da IN. Essa enzima possui tambm atividade endonuclease, que necessria para clivar o DNA celular para a integrao do provrus. A etapa de insero resulta na incorporao denitiva de uma cpia do genoma viral (na forma de DNA) no cromossomo do hospedeiro e se constitui em uma etapa essencial para o prosseguimento do ciclo replicativo e produo de prognie viral. Aps ser integrado no cromossomo da clula hospedeira, o provrus DNA transcrito pela RNA polimerase II e fatores de transcrio celulares para a sntese de mRNAs destinados produo das protenas virais. Os transcritos primrios originam duas classes de mRNA: mRNA subgenmicos e mRNAs com a extenso total do genoma. Os mRNA subgenmicos foram submetidos a processamento por splicing, exportados para o citoplasma, onde sero traduzidos nas protenas do envelope (Env, que, aps clivagem,
dar origem s protenas TM e SU) e nas protenas acessrias (nos retrovrus que as possuem). Os mRNA com a extenso do genoma sero traduzidos nas protenas gag e pol (precursoras das protenas MA, NC e CA; e RT, IN e PR, respectivamente), e tambm sero encapsidados em nucleocapsdeos pela NC e CA. Ambas as classes de mRNAs possuem cap na extremidade 5 e so poliadeniladas na extremidade 3. As etapas da replicao do genoma e a estrutura das molculas intermedirias (provrus) esto apresentadas na Figura 31.4. As etapas tardias do ciclo, com o destino dos diferentes RNA transcritos a partir do
Genoma
Cap
U5
.gag
pol
env
U3
AAAA
RNA
Transcrio reversa (1) Provrus

.gag pol env
U3
U5
U3
U5 DNA
Integrao (2) Provrus Integrado

DNA celular
DNA
.gag pol env
U3
U5
U3
U5
DNA celular
Transcrio (3) Genoma

Cap
U5
.gag
pol
env
U3
AAAA
RNA
Figura 31.4. Etapas da replicao do genoma dos retrovrus e estrutura das molculas intermedirias. O genoma constitudo por duas molculas idnticas de RNA de fita simples com 5' cap e poliA. Prximo s extremidades, o genoma possui duas regies repetidas R (5' e 3') e duas regies nicas (U5 e U3). Entre essas regies, localizam-se as seqncias codificantes: genes gag, pol e env. A primeira etapa da replicao sntese do provrus DNA (molcula de DNA de fita dupla correspondente ao genoma) pela enzima viral transcriptase reversa (1). O provrus contm as regies U3 e U5 duplicadas nas extremidades opostas e integrado aos cromossomos celulares pela ao da enzima viral integrase (2). Aps a integrao, o provrus transcrito pela RNA polimerase II celular (3), originando mRNAs idnticos ao genoma. Esses mRNAs servem para a traduo em protenas e tambm constituem o RNA genmico para serem encapsidados na prognie viral.
Retroviridae
817
provrus integrado e a morfognese dos vrions esto apresentadas na Figura 31.5. A transcrio do genoma dos retrovrus que possuem genes acessrios (p. ex., os lentivrus), ocorre em duas fases: uma fase precoce, quando
so transcritos os mRNA que codicam as protenas envolvidas na regulao da replicao viral; uma fase tardia, em que ocorre a exportao do ncleo para o citoplasma mRNAs que sero traduzidos nas protenas estruturais.
Ncleo
LTR LTR
Transcrio
Cap gag pol env AAAAA
Sem splicing Citoplasma
Splicing
env AAA
gag
pol
env AA
Exportao
env
Traduo
AAAAA
Traduo
Gag (MA, CA, NC) Pol (PR, RT, IN)
Env (SU+TM)
Figura 31.5. Etapas tardias da replicao dos retrovrus. O provrus DNA integrado ao cromossomo celular transcrito pela RNA pol II celular em toda a sua extenso, gerando transcritos com cap e poli-A. Uma parte desses transcritos exportada do ncleo sem sofrer splicing e serve de mRNA para a sntese da poliprotena do gene gag e das protenas do gene pol . A outra parte destes mRNAs, que no sofre processamento, exportada do ncleo e servir de RNA genmico. Em fases tardias do ciclo, uma populao de transcritos sofre splicing e serve de mRNA para a traduo em uma poliprotena (Env) que originar as glicoprotenas do envelope. Esta poliprotena transportada para a membrana plasmtica, onde as protenas TM e SU so geradas por clivagem e ficam associadas membrana que dar origem ao envelope viral. As poliprotenas dos genes gag e pol so transportadas para a membrana plasmtica, onde interagem com o RNA genmico e com as caudas das glicoprotenas, membrana, resultando na formao do nucleocapsdeo e brotamento das partculas vricas. A maturao completa das protenas precursoras ocorre em partculas vricas extracelulares.
818
Captulo 31
A morfognese uma etapa pouco conhecida do ciclo replicativo dos retrovrus e parece apresentar algumas diferenas entre os vrus. Para a maioria dos vrus, as etapas de montagem do nucleocapsdeo (interaes RNA + NC + CA) e brotamento na membrana parecem ocorrer simultaneamente. Em outros, os nucleocapsdeos so inicialmente montados no citoplasma e transportados at a membrana plasmtica, onde interagem com a protena MA e com as caudas das glicoprotenas, resultando no brotamento e egresso. De qualquer forma, estes eventos ocorrem no citoplasma, e as partculas vricas so liberadas sem a necessidade de lise celular. Durante a morfognese, so includas algumas molculas das enzimas virais RT, IN e PR nas partculas recmformadas. O ciclo replicativo dos retrovrus est ilustrado esquematicamente na Figura 31.6. O estudo da replicao dos retrovrus pode ser realizado in vitro, em diferentes tipos celula-
res. Por outro lado, a infeco de cada retrovrus in vivo parece estar restrita a um determinado hospedeiro e a poucos tipos celulares, restrio principalmente relacionada com a presena dos receptores virais. Apesar de serem considerados predominantemente espcie-especcos, alguns retrovrus podem infectar mais de uma espcie animal. A infeco cruzada de caprinos e ovinos pelo CAEV e MVV foi descrita por vrios autores, que sugeriram a denominao lentivrus de pequenos ruminantes (SLRV small ruminant lentivirus) para esses vrus. Provavelmente, a proximidade logentica entre essas espcies favorea a infeco cruzada. Por outro lado, estudos recentes demonstraram que o CAEV capaz de infectar bovinos igualmente ruminante experimentalmente, apesar de a infeco no persistir. A replicao de vrios lentivrus em clulas de cultivo resulta na produo de efeito citop-
Brotamento
Ligao aos receptores
Maturao
2 Penetrao
Formao do capsdeo
Transcrio reversa
Traduo
AAAAA
Traduo
AAAAA
AAAAA
RER
Provrus
AAAAA
AAAAA
Transcrio Integrao
Provrus integrado
Figura 31.6. Ilustrao simplificada do ciclo replicativo dos retrovrus.
Retroviridae
819
tico, caracterizado pela formao de clulas gigantes multinucleadas ou sinccios. A replicao in vitro de outros retrovrus pode levar morte da clula devido ao acmulo de partculas virais (superinfeco). Isso tem sido observado com algumas cepas do ALV e em variantes do FeLV.
5.1.1 Epidemiologia
O BLV est distribudo mundialmente, com exceo de alguns pases europeus que erradicaram a infeco a partir da dcada de 1980. No Brasil, a infeco est amplamente difundida, com nveis variveis de prevalncia entre os rebanhos. Estudos sorolgicos j foram realizados em praticamente todas as regies do pas, indicando a ampla distribuio da infeco, com ndices de prevalncia geralmente maiores em gado leiteiro. Na Serra de Botucatu, SP, foi detectada prevalncia de 52% entre animais e de 10 a 67% das propriedades eram positivas. No Rio de Janeiro, 17,3% de 734 animais testados foram positivos. Em um estudo envolvendo aproximadamente 10.000 amostras no Rio Grande do Sul, detectou-se uma prevalncia de 8% de animais soropositivos. Em condies naturais, o vrus pode infectar bovinos, zebunos, bfalos e capivaras. Infeces experimentais j demonstraram a susceptibilidade de ovinos, caprinos e coelhos. Os coelhos podem desenvolver tumores ou imunodecincia aps um tempo varivel de incubao. Assim como os outros retrovrus, o BLV apresenta uma baixa transmissibilidade, ou seja, no facilmente transmitido. A transmisso ocorre predominantemente entre animais do mesmo rebanho, e incomum ocorrer entre rebanhos vizinhos. comum a existncia de regies onde rebanhos positivos e negativos vizinhos coexistam por longos perodos, sem a disseminao do vrus para os rebanhos livres. Essas observaes indicam que um contato mais prximo entre os animais necessrio para a transmisso. A transmisso iatrognica, pela aplicao de vacinas, uso compartilhado de agulhas hipodrmicas, administrao de medicamentos e aps o toque retal contribui de forma importante para a disseminao da infeco dentro dos rebanhos. O vrus est presente no sangue dos animais infectados e transmitido por procedimentos que envolvam a transferncia de clulas sangneas entre animais. Cabe lembrar que os animais infectados tornam-se portadores pelo resto da vida e possuem o vrus no sangue, sobretudo em
5 Retrovrus de interesse veterinrio

O nmero de retrovrus que infecta animais muito grande e, por isso, de difcil enumerao e abordagem em um livro texto como este. Portanto, ser dada nfase aos principais retrovrus que causam doenas em animais de companhia e de produo. A ordem de apresentao ser de acordo com a espcie animal.
5.1 Vrus da leucose bovina

O BLV (bovine leukemia virus), agente etiolgico da leucose enzotica bovina, classicado como um Deltaretrovirus e apresenta muitas similaridades estruturais, genmicas e de patogenicidade com o HTLV-1 e o HTLV-2 (human T lymphotropic viruses 1 and 2). Esse vrus foi descrito, pela primeira vez, em 1871, na Litunia, em um bovino com hipertroa de linfonodos superciais e esplenomegalia. Depois disso, outros casos semelhantes tambm foram descritos e, em 1917, Kenneth demonstrou que a doena era causada por um agente infeccioso. Em 1976, Kettmann e colaboradores demonstraram que as partculas virais possuam RNA exgeno e que continham a enzima RT, permitindo sua classicao como um retrovrus oncognico. O BLV um retrovrus complexo e, assim como os HTLV-1 e 2, contm genes que codicam produtos acessrios como Tax e Rex, cuja funo est relacionada com a regulao da expresso gnica desses vrus. A variabilidade genmica do BLV no parece ser grande entre isolados, provavelmente devido taxa de mutao de sua RT ser inferior a de outros retrovrus. Comparativamente, o BLV teria um comportamento similar ao HTLV, em que isolados do Japo, Caribe e frica apresentam at 99% de homologia.
820
Captulo 31
linfcitos B. Aproximadamente 1 microlitro de sangue de um animal com linfocitose persistente j pode ser suciente para transmitir o vrus para outro animal. Assim sendo, a forma iatrognica parece contribuir de forma importante para a transmisso do vrus. Animais submetidos a procedimentos cirrgicos ou teraputicos, como castrao, descorna, tatuao, vacinaes, pequenas cirurgias, palpao retal, injees ou colocao de brincos, sem os devidos cuidados de prolaxia, esto propensos a adquirirem a infeco pelo BLV. A transmisso pela picada de insetos, como os tabandeos, j foi relatada e parece possuir alguma importncia em regies com alta infestao desses insetos. A presena do vrus j foi descrita na glndula mamria, associada aos linfcitos, bem como no leite, indicando a possibilidade de transmisso atravs do leite. Embora o vrus possa ser ocasionalmente encontrado no smen de touros, a inseminao articial no parece ser um meio importante de disseminao do vrus. No obstante, centrais de coleta de smen so desaconselhadas a manter touros positivos. A transmisso pela monta natural pode ocorrer, representando uma forma de disseminao do vrus de touros infectados para fmeas. Vacas positivas prenhes podem transmitir o vrus para o feto; entretanto, menos de 10% dos animais nascidos dessas fmeas so portadores do vrus ao nascer. Em outros trabalhos, que analisam a transferncia de embries a partir de doadoras infectadas pelo BLV, no foi detectada transmisso para os embries ou para as receptoras. Em pases cujos sistemas criatrios mantm registros detalhados de produtividade, como os EUA, Canad, Japo e Austrlia, estima-se que os efeitos do BLV podem atingir uma reduo de at 10% na produo leiteira.

O BLV infecta principalmente linfcitos B, nos quais produz uma infeco persistente, embora tambm possa infectar linfcitos T. A exem-
plo das infeces pelos outros retrovrus, uma vez infectados os animais tornam-se portadores do agente pelo resto da vida. Na maioria das vezes, a infeco pelo BLV assintomtica, e o reconhecimento dos animais positivos somente possvel pela realizao de testes sorolgicos. Entre os animais infectados, aproximadamente 30% desenvolvem uma linfocitose persistente, sem a manifestao de quaisquer sinais clnicos. Estima-se que entre 1 e 5% dos animais infectados persistentemente iro desenvolver a forma clnica da doena em algum momento de suas vidas. A enfermidade (denominada leucose) caracteriza-se pela produo de tumores de origem linfide, como linfossarcomas ou linfomas malignos, em diversos rgos. A patogenia dos tumores no est relacionada a oncogenes presentes no genoma viral, mas a protena viral Tax parece ter um papel importante na sua produo. Os sinais clnicos so variveis e esto relacionados com os rgos e tecidos afetados pelos tumores. Assim, tumores que se desenvolvem no trato gastrintestinal podem ocasionar obstrues ou provocar lceras, que podem resultar em disfunes digestivas, anorexia e perda de peso. Tumores que atingem a medula espinhal podem resultar em distrbios neurolgicos com manifestaes diversas. Alguns sinais clnicos observados em dois grupos de animais com linfossarcoma esto descritos na Tabela 31.2. Aproximadamente dois teros dos animais com tumores apresentam tambm linfocitose persistente. A forma tumoral do BLV afeta geralmente animais acima de dois anos de idade, com um pico de incidncia entre os 5 e 8 anos. Esses tumores devem ser distinguidos da leucose espordica bovina, que afeta animais com idade inferior a um ano e no est relacionada infeco pelo BLV. Os tumores podem afetar um ou vrios linfonodos, superciais ou profundos. Algumas vezes, o infartamento de linfonodos superciais o primeiro indicador clnico da ocorrncia de linfossarcoma. A partir do reconhecimento clnico, o linfossarcoma possui um curso de tempo varivel, mas virtualmente sempre fatal.
Retroviridae
821
Tabela 31.2. Sinais clnicos associados com a infeco pelo vrus da leucose bovina (BLV).
Sinais clnicos
Perda de peso Agalactia Linfoadenopatia (aumento de volume) Anorexia Paralisia/paresia do posterior Febre Exoftalmia Dificuldade respiratria Obstruo intestinal Anormalidade no miocrdio Linfcitos anormais
a b
Grupo 1b (%)
58 62 16 9 19 64 63
Grupo 2c (%)
80 77 58 52 41 23 20 14 9 7 -
Fonte: adaptado de: The Compendium Collection, Infectious Disease in Food and Animal Practice, 1993. Dados de 298 animais hospitalizados. c Dados de 1.100 animais de campo.
A viremia detectvel somente nas duas primeiras semanas aps a infeco e, tardiamente, a deteco de antgenos virais no sangue difcil. Alguns trabalhos indicam que, aps a infeco inicial, a permanncia do vrus no organismo seria mantida principalmente pela diviso celular da clula contendo o provrus e no pela replicao do genoma viral via RT. Isso, de certa forma, tambm ajudaria a explicar a menor variabilidade genmica do BLV, quando comparado com outros retrovrus (p. ex., EIAV), cuja taxa de replicao maior no curso da infeco. Os animais infectados desenvolvem uma resposta sorolgica entre duas a oito semanas ps-infeco. Os anticorpos so direcionados principalmente contra as glicoprotenas do envelope (TM, SU) e contra as protenas do capsdeo. Os anticorpos so persistentes, porm os nveis presentes podem variar de acordo com a condio siolgica e imunolgica do animal. Um estudo recente estimou o tempo mdio de soroconverso em 47 dias (infeco experimental) e 57 dias (dados de infeco experimental e natural).
O provrus integrado detectado em, aproximadamente, 30% dos linfcitos circulantes. A expanso da populao linfocitria ocorre a partir da proliferao policlonal de linfcitos B, com citologia e caritipo normais. Os achados de necropsia incluem aumento generalizado dos linfonodos, tanto superciais como internos. Ao corte, os linfonodos apresentam uma superfcie branco-amarelada, sem distino entre a cortical e medular. Massas tumorais com o mesmo aspecto podem ser encontradas no corao, rins, intestinos, abomaso, medula espinhal e tero. Histologicamente observa-se proliferao das clulas da linhagem linfoctica e inltrao macia dessas clulas nos rgos afetados.
5.1.3 Diagnstico
Duas condies distintas devem ser consideradas no diagnstico do BLV: o diagnstico da enfermidade (leucose ou linfossarcoma) e o diagnstico da infeco. A suspeita da doena clnica,
822
Captulo 31
pela observao dos sinais mencionados, deve ser conrmada por exames histopatolgicos e sorolgicos; a infeco pode ser diagnosticada por testes sorolgicos. Dentre os sinais que mais chamam a ateno e levam o veterinrio a suspeitar de leucose bovina, esto o infartamento de linfonodos superciais, distrbios digestivos persistentes com anorexia e perda de peso, presena de massas tumorais no intestino e paralisia dos membros posteriores. Como nenhum desses sinais patognomnico, o diagnstico requer a realizao de testes sorolgicos e/ou histopatolgicos. Os testes sorolgicos so realizados principalmente para a identicao de portadores e para triagem de rebanhos. Em animais com suspeita clnica, um teste sorolgico positivo refora a hiptese diagnstica, mas no capaz de fornecer o resultado denitivo. O diagnstico denitivo de linfossarcoma no animal vivo pode ser obtido por exames histopatolgicos de linfonodos superciais obtidos por bipsia. No animal morto, os achados patolgicos macro e microscpicos podem conrmar o diagnstico. Os testes sorolgicos so utilizados para detectar a condio de portador. O primeiro teste sorolgico empregado para diagnstico da infeco pelo BLV foi a imunodifuso em gel de gar (IDGA), utilizando a protena do capsdeo (p24) como antgeno. O uso da glicoprotena principal do envelope (gp51), entretanto, permitiu o aumento da sensibilidade desse teste. Desta forma, os testes de IDGA atuais utilizam a glicoprotena gp51 ou uma combinao de gp51 e p24 como antgeno. A simplicidade, praticidade e custo baixo zeram com que o teste de IDGA fosse aceito rapidamente em todo o mundo, tornando-se o teste ocial para deteco de anticorpos anti-BLV. Como os animais infectados pelo BLV permanecem como portadores permanentes, todos os animais positivos, com idade superior a seis meses, devem ser considerados portadores e potenciais fontes de infeco para outros animais. A imunidade passiva pode inuenciar as provas sorolgicas para o BLV, gerando resultados falso-positivos. Sorologia positiva em animais com idade inferior a seis meses pode ocorrer em razo da infeco ou dos anticorpos maternos ad-
quiridos passivamente pelo colostro. Os anticorpos passivos tendem a desaparecer at os 6 ou 7 meses de idade, e o teste de IDGA nesses animais deve tornar-se negativo aps este perodo. Resultados falso-negativos tambm podem ocorrer, sobretudo, em fmeas prenhes nas proximidades do parto, devido ao seqestro de anticorpos para o colostro. O ensaio imunoenzimtico (ELISA) tambm tem sido utilizado para deteco de anticorpos anti-BLV e apresenta vantagens como a maior sensibilidade e facilidade de automao. Apesar de apresentar uma grande variao de resultados entre diferentes laboratrios, o teste da reao em cadeia da polimerase (PCR), que detecta o DNA proviral, tem se mostrado til como mtodo complementar aos testes de IDGA e ELISA. Essa variao de resultados ocorre em funo da variabilidade gentica do genoma viral. O teste de PCR realizado com DNA extrado de leuccitos em amostras de sangue coletadas com anticoagulante. Amostras negativas no IDGA ou no ELISA ou de animais que receberam colostro de mes positivas podem ser testadas por PCR. A tcnica de PCR, no entanto, no muito utilizada na rotina e possui aplicao apenas em situaes especiais.

Considerando-se as formas de transmisso do BLV, possvel erradicar a infeco de rebanhos e populaes maiores pela adoo de prticas de manejo associadas com o uso de medidas sanitrias prolticas. A etapa inicial do programa envolve a realizao de testes sorolgicos e a identicao dos animais soropositivos. Os animais positivos devem ser preferencialmente descartados, mas podem ser mantidos no rebanho desde que separados dos demais e submetidos a prticas que minimizem o risco de transmisso. Os animais positivos devem ser distinguidos dos outros para serem facilmente reconhecidos e, assim, manejados com cuidados especiais para evitar a transmisso iatrognica do vrus. Bezerros nascidos de mes positivas devem ser isolados e testados, s podendo ser introduzidos no rebanho negativo se mantiverem a condio soronegativa at os 6-8 meses, ocasio do desaparecimento dos
Retroviridae
823
anticorpos passivos. A condio sorolgica dos animais deve ser monitorada a cada seis meses, com a qual se avalia a eccia das medidas adotadas. Como medidas de controle em rebanhos que possuem animais positivos, citam-se: utilizao de agulhas estreis individuais para procedimentos prolticos, clnicos e teraputicos (aplicao de vacinas, antiparasitrios, outros medicamentos, anestsicos e coleta de sangue); utilizao de luvas de palpao individuais para cada animal; lavagem e desinfeco de instrumentos cirrgicos ou de procedimentos potencialmente contaminados com sangue de animal infectado; adoo de um programa de controle de insetos hematfagos nas regies em que h necessidade; uso de inseminao articial, evitando transmisso de linfcitos infectados atravs da monta natural; separao dos bezerros lhos de mes positivas, no permitindo que entrem em contato com animais negativos at que sua condio sorolgica para BLV possa ser denida. Pode-se coletar uma amostra de sangue do animal logo aps o nascimento, antes de mamar o colostro. Caso a amostra seja positiva, considera-se que o animal foi infectado in utero e portador do vrus; separao dos animais em grupos de positivos e negativos, o que favorece o manejo, pois os animais negativos devem ser manejados antes. As propriedades livres do vrus devem adotar medidas para evitar a sua introduo. Para isso, todos os animais adquiridos devem ser previamente testados para o BLV. Se oriundos de rebanhos sabidamente negativos, podem ser incorporados ao rebanho; se oriundos de propriedades de situao sorolgica desconhecida, devem ser mantidos separados por oito semanas e, ento, submetidos a um novo teste sorolgico. A adoo de medidas de controle para evitar a disseminao do vrus dentro do rebanho tem surtido efeito e tem sido possvel manter animais positivos no rebanho, com risco mnimo de transmisso aos outros animais. Essa estratgia somente deve ser adotada quando os animais
positivos possuem um alto valor gentico e econmico; do contrrio, devem ser identicados e eliminados do rebanho. Atualmente no existem vacinas disponveis contra o BLV.
5.2 Vrus da imunodecincia bovina

O BIV (bovine immunodeciency virus) foi isolado, pela primeira vez, por Van der Maaten e colaboradores, em 1972, a partir de um bovino com suspeita de linfossarcoma. Durante aproximadamente 15 anos, pouca importncia foi dada ao BIV, pois esse vrus aparentemente no estava relacionado com nenhuma enfermidade. Com a descoberta de que a sndrome da imunodecincia humana adquirida (AIDS) era causada por um lentivrus, o BIV e outros vrus pertencentes a este gnero assumiram grande importncia em estudos de evoluo e de caractersticas biolgicas e moleculares. O BIV foi classicado como um lentivrus por possuir similaridades moleculares, genticas, antignicas e estruturais com o HIV.
5.2.1 Epidemiologia
A presena do BIV j foi relatada em vrios pases, como o Canad, Costa Rica, Estados Unidos, Frana e Itlia. Nos Estados Unidos, a soroprevalncia da infeco bastante varivel. Alguns estudos identicaram uma prevalncia de anticorpos em 40% de animais de carne e em 60% de animais de leite no estado da Louisiana. Embora os dados de prevalncia sejam escassos, acredita-se que o BIV esteja amplamente difundido na populao bovina de diferentes pases. No Brasil, von Groll et al. (1997) relataram, pela primeira vez, a presena do BIV pela deteco de animais sorologicamente positivos entre animais clinicamente sadios. A transmisso experimental pode ser obtida pela administrao de sangue total de um animal infectado. Dessa forma, o uso de agulhas e instrumental cirrgico contaminados, ingesto de colostro de fmeas infectadas e a higienizao deciente de instrumentos utilizados em prticas invasivas, como castraes e descornas, podem estar envolvidos na transmisso do BIV. J foi de-
824
Captulo 31
monstrada a presena do provrus do BIV em um grande nmero de amostras de smen, podendo essa secreo se constituir em um veculo para a transmisso. A transmisso pela via transplacentria tambm j foi demonstrada experimentalmente. O BIV infecta naturalmente os bovinos e pode infectar experimentalmente ovinos, caprinos e coelhos.

Ainda no foi demonstrado que o BIV seja capaz de, agindo isoladamente, produzir manifestaes clnico-patolgicas especcas, nem que o vrus torne os animais infectados susceptveis a outros agentes infecciosos. No entanto, existe uma correlao positiva entre soropositividade para o vrus (e a condio de portador) e reduo na produo de leite. Uma das primeiras descries da infeco pelo BIV relata um bovino da raa holandesa, de oito anos, com um aumento no nmero de leuccitos e perda de condio corporal. Aps a morte desse animal, no foram observados tumores, como inicialmente suspeito. Histologicamente foi relatada uma hiperplasia folicular dos linfonodos e leses no sistema nervoso central. Assim como outros lentivrus, o BIV apresenta tropismo por subpopulaes especcas de leuccitos. J foi identicada a presena de DNA proviral do BIV e a produo de partculas infecciosas em clulas B, T e em moncitos durante os estgios agudos da infeco. O BIV pode ser propagado em vrios tipos de cultivos celulares de origem bovina, e a replicao em clulas de bao e pulmo mais indicada, pois o vrus capaz de replicar em altos ttulos.
a infeco, e persistem por mais de dois anos em animais inoculados experimentalmente. Pela prova de Western blot, anticorpos contra a protena do capsdeo p26 so os primeiros a serem detectados, demonstrando que esta protena imunodominante. A deteco do provrus e do RNA genmico, em clulas infectadas, pode ser realizada pelo uso das tcnicas de PCR e transcrio reversa seguida de PCR(RT-PCR), respectivamente. Considerando-se que o vrus infecta leuccitos, a medida mais indicada para prevenir a transmisso evitar a transferncia de sangue de animais contaminados para animais sadios. Alm disso, recomendado aquecer (56C 30 min) o leite de vacas soropositivas antes de fornec-lo aos bezerros.
5.3 Vrus da pneumonia progressiva dos ovinos (Maedi-Visna)

O vrus Maedi-Visna (MVV) ou vrus da peneumonia progressiva dos ovnos (OPPV) foi caracterizado nos anos 1960, na Islndia, em ovinos que apresentavam pneumonia progressiva e encefalite degenerativa. A presena da doena havia sido descrita inicialmente nos anos 1930, quando mais de 100.000 animais morreram em decorrncia da infeco. Os termos islandeses Maedi e Visna correspondem, respectivamente, aos sinais clnicos observados nos animais doentes: dispnia e denhamento. A denominao doenas causadas por vrus lentos (slow virus diseases) foi atribuda, pela primeira vez, por Sigurdsson (1954), que identicou a presena de um agente viral associado a casos de Maedi-Visna. O agente da Maedi-Visna classicado no gnero Lentivirus e tem sido denominado, juntamente com o vrus da artrite-encefalite caprina, como lentivrus de pequenos ruminantes (SRLV small ruminant lentivirus) em funo da similaridade genmica, antignica e de apresentao da doena em caprinos e ovinos.
5.2.3 Diagnstico e controle

O diagnstico da infeco pelo BIV pode ser realizado pela deteco de anticorpos, com o uso de tcnicas como imunouorescncia (IFA) e Western blot. Anticorpos para o BIV podem ser detectados pelo teste de IFA, trs semanas aps
5.3.1 Epidemiologia
Com exceo da Islndia, de onde a doena foi erradicada aps o sacrifcio de milhares
Retroviridae
825
de animais, a presena do MVV j foi detectada em diversos pases da Europa e das Amricas. A Austrlia e Nova Zelndia so consideradas livres da doena. No Brasil, a situao epidemiolgica da enfermidade desconhecida, no entanto, j foram realizados alguns estudos e o seqenciamento e anlise logentica de pelo menos um isolado do Sul do pas. O MVV foi, inicialmente, associado com infeco de ovinos, embora, atualmente, se aceite que possa ocorrer infeco cruzada entre ovinos e caprinos. Diversos estudos logenticos indicam para essa disseminao interespcies, principalmente em pases em que as duas espcies so criadas juntas. O vrus excretado em secrees como partculas livres ou associado com clulas como os moncitos e macrfagos. A transmisso pode ocorrer por contato direto ou indireto e atravs de materiais e equipamentos compartilhados. Para o recm-nascido, a principal fonte de contaminao o colostro. O leite contaminado tambm pode permitir propagao do vrus entre animais que compartilhem o uso de ordenhadeiras e na prtica de se utilizar um banco de colostro. Parece que a maioria das infeces ocorre pela ingesto de colostro ou leite de fmeas soropositivas. O contato prolongado entre animais parece ser menos eciente na transmisso do agente. Considerando-se o comprometimento do trato respiratrio, uma vez que o pulmo o principal rgo de replicao do MVV, os aerossis podem ser importantes na disseminao do vrus. A transmisso horizontal favorecida em animais criados em regime de connamento. A transmisso intra-uterina no foi demonstrada claramente e, mesmo que ela ocorra, no parece desempenhar um papel epidemiolgico importante. O mesmo se aplica transmisso pelo smen contaminado.

As doenas associadas aos lentivrus apresentam uma evoluo lenta e progressiva, caracterizadas por um longo perodo de incubao at o aparecimento dos sinais clnicos. Na maioria
das vezes, os animais desenvolvem uma resposta humoral com ttulos de anticorpos detectveis por testes sorolgicos, mas que no resultam na erradicao do vrus do organismo. A exemplo dos outros retrovrus, uma vez infectado, o animal torna-se portador e fonte de contaminao para o rebanho durante toda a sua vida. Vrios fatores so responsveis pela persistncia do vrus no organismo do hospedeiro. No caso dos SRLV, foi demonstrada a importncia da diferenciao/ativao dos macrfagos no incremento da produo de partculas virais. A restrio da replicao viral estaria relacionada com a ausncia e/ou quantidades insucientes de fatores de transcrio, capazes de levar sntese dos mRNA virais codicadores das protenas estruturais do vrion. As patologias pulmonares esto associadas com a formao de folculos linfides que, atravs da secreo de citocinas, contribuiriam para o desenvolvimento da pneumonia intersticial devido a uma resposta inamatria exacerbada. Alm do pulmo, a glndula mamria pode igualmente apresentar a formao de folculos linfides e o conseqente desenvolvimento de mastite. As manifestaes de origem neurolgica, por encefalite, so raras e foram descritas principalmente na epidemia que atingiu a Islndia e que levou morte um grande nmero de animais. Comprometimentos articulares (artrites) foram igualmente descritos, mas com menor freqncia do que os quadros respiratrios. Em funo dos diferentes rgos atingidos pelo vrus, as manifestaes clnicas podem variar desde diculdade respiratria, mastite acompanhada de endurecimento da glndula mamria, artrite, ataxia dos membros posteriores e incoordenao. Os sinais clnicos podem levar meses ou anos para se manifestarem; e apenas uma parcela dos animais infectados desenvolve a sintomatologia. Estima-se que apenas 30% dos animais sorologicamente positivos manifestem sinais clnicos da infeco, e as manifestaes respiratrias apresentam maior incidncia.

Em regies endmicas, o diagnstico presuntivo pode ser realizado pelo quadro clnico, embora apenas uma parcela dos animais apre-
826
Captulo 31
sente sinais clnicos. As principais manifestaes clnicas em ovinos infectados pelo MVV so os sinais respiratrios. O quadro pode progredir, levando caquexia e morte. As fmeas podem igualmente apresentar endurecimento do bere devido formao de ndulos linfides. A suspeita clnica deve ser necessariamente conrmada por exames laboratoriais para a deteco de anticorpos ou de antgenos e RNA viral. O controle principalmente baseado na identicao e segregao dos animais infectados. Diversos testes sorolgicos so utilizados para identicar os animais infectados, como a IDGA, ELISA, Western blot e radioimunoprecipitao (RIP). No existe, atualmente, um teste que seja considerado padro (gold standard) para determinar a sensibilidade e especicidade dos testes disponveis. No entanto, de consenso que a utilizao de um teste sorolgico associado a medidas de controle permite reduzir a prevalncia da infeco, reduzindo a disseminao do agente no rebanho. O isolamento viral realizado a partir de co-cultivo de moncitos do sangue perifrico ou de macrfagos alveolares com broblastos de origem fetal, clulas de plexo coride ou mesmo com cultivos primrios de membrana sinovial. Observa-se, na maioria das vezes, a formao de sinccios, caracterizada pela presena de clulas gigantes multinucleadas. A replicao do vrus em cultivo lenta, e os resultados podem levar vrios dias ou semanas. As tcnicas de imunohistoqumica e hibridizao in situ podem ser utilizadas para demonstrar antgenos ou cidos nuclicos virais nos cultivos e em amostras de tecidos destinadas histopatologia. Ainda, para deteco do provrus ou do genoma viral, podem ser utilizadas a PCR e a RT-PCR. A variabilidade gentica e antignica existente entre os isolados do SRLV indica que a deteco de anticorpos ou do cido nuclico viral por PCR deve considerar as caractersticas das cepas circulantes na populao estudada. As principais medidas de controle relacionam-se com a identicao dos animais infectados e a sua separao dos no-infectados, pois no existem vacinas para os SRLV. Uma das me-
didas mais importantes consiste na separao do recm-nascido da fmea infectada, impedindo a ingesto do colostro. Neste caso, pode-se proceder inativao do vrus, aquecendo o colostro a 56C por 1 hora ou fornecer colostro de origem bovina. A remoo gradativa de animais sorologicamente positivos associada com a reposio com animais negativos, separando-se os rebanhos positivos dos negativos, vem sendo utilizada em diversos pases. O que determina o sucesso dos programas de controle , em grande parte, a escolha do teste diagnstico mais adequado regio, levando-se em considerao as cepas circulantes. Testes mais sensveis que o IDGA devem ser adotados quando a prevalncia de animais soropositivos diminui no rebanho.
5.4 Vrus da artrite-encefalite caprina

O vrus da artrite-encefalite caprina (CAEV) foi descrito, pela primeira vez, em 1980, por Crawford e colaboradores, como sendo um retrovrus causador de artrite, embora a etiologia viral de encefalite em caprinos jovens j tenha sido descrita anos antes por Cork (1974). Das duas manifestaes clnicas inicialmente descritas, a artrite a forma mais comum de apresentao da doena. A classicao do CAEV a mesma do MVV, assim como diversos aspectos de patogenia e transmisso. Assim, somente os aspectos que diferenciam os dois vrus sero abordados com maior nfase, a seguir.
5.4.1 Epidemiologia
O vrus j foi detectado em diversos pases, inclusive no Brasil, pelo isolamento do agente ou pela deteco de anticorpos. A infeco j foi detectada em caprinos nos estados de Minas Gerais, Pernambuco e So Paulo. Um inqurito sorolgico, no Cear, demonstrou 1% de prevalncia entre 4.019 animais e, no Rio de Janeiro, 32,1% dos rebanhos testados possuam animais positivos. O CAEV transmitido principalmente atravs do colostro e leite, durante as primeiras mamadas dos recm-nascidos. A transmisso por sangue contaminado, pelo uso de agulhas hipo-
Retroviridae
827
drmicas e de material cirrgico contaminado, alm de feridas abertas, considerada a segunda principal forma de transmisso. A transmisso por contato entre animais adultos considerada pouco importante.

A patologia mais freqente a artrite, que se desenvolve lentamente e acomete geralmente animais adultos, com mais de dois anos de idade. A artrite afeta principalmente as articulaes do carpo (joelhos), determinando um aumento de volume localizado, o que determinou a terminologia big knee (joelho grande). Os animais afetados apresentam diculdade de locomoo e perda de peso. A inamao crnica das articulaes parece ser mediada por deposio de imunocomplexos (complexos antgeno-anticorpos), pois foi evidenciada uma relao direta entre o ttulo de anticorpos contra a protena do envelope viral e a severidade das leses articulares. Quanto maior o ttulo de anticorpos no soro e/ou no lquido sinovial, mais abundantes e severas so as leses. A encefalite tem sido descrita principalmente em animais com idade inferior a seis meses, embora animais adultos tambm possam ser alvos da forma neurolgica. Observa-se uma desmielinizao, aumento no nmero de leuccitos no lquido cfalo-raquidiano, inltrao de clulas mononucleares e astrocitose na medula e no crebro. Alteraes na glndula mamria e pneumonia intersticial tambm so manifestaes da infeco pelo CAEV. Observa-se o endurecimento da glndula mamria, provavelmente associado com a formao de folculos linfides, sendo denominada em ingls hard udder (bere duro). Na pneumonia intersticial, observa-se uma proliferao de pneumcitos do tipo II e uma epitelizao dos alvolos. Assim como no caso do MVV, a presena de anticorpos no signica uma resposta imune protetora. A resposta imune humoral em caprinos infectados pode ser detectada tardiamente aps a infeco, e a presena de anticorpos no teste de
ELISA pode ocorrer de forma intermitente durante a vida do animal. Alm disso, j foi demonstrada a resistncia doena em animais portadores de certos hapltipos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). A doena se manifesta principalmente em rebanhos com alta soroprevalncia, sendo pouco signicativa em rebanhos com baixa prevalncia de animais soropositivos. Essa observao favorece a hiptese de que no existiriam fatores de virulncia relacionados s cepas de SRLV, uma vez que se consegue eliminar a ocorrncia da doena com a reduo dos animais soropositivos no rebanho.

Os mtodos de diagnstico e as medidas de controle so basicamente as mesmas preconizadas para os ovinos infectados pelo MVV. Alm dos testes sorolgicos descritos para o MVV (IDGA, ELISA, Western blot) pode-se usar tambm a IFA indireta para deteco de anticorpos. Nesses testes, clulas infectadas com o vrus servem de antgeno para a captura dos anticorpos no soro-teste. Os antgenos dos testes sorolgicos podem ser empregados indiscriminadamente para os SRLV. No entanto, alguns trabalhos demonstraram que o uso de antgenos de CAEV para deteco de anticorpos em caprinos aumenta a sensibilidade do teste quando comparado com antgenos de MVV. O resultado positivo no teste sorolgico indica que o animal portador do CAEV e pode transmitir o agente a outros animais, principalmente durante a lactao atravs do colostro. A ausncia de sinais clnicos irrelevante do ponto de vista de controle, pois acima de 90% dos animais portadores podem no apresentar manifestaes clnicas. Se o teste for realizado em animais com idade inferior a seis meses, possvel que o resultado positivo se deva a anticorpos maternos adquiridos pelo colostro. Nesses casos, recomenda-se avaliar o animal novamente aps os seis meses de idade. Nesse perodo, devem-se minimizar as chances de transmisso do agente a partir desse animal, que deve ser considerado suspeito.
828
Captulo 31
Um aspecto importante a salientar o fato de que, em funo das evidncias de infeco cruzada entre ovinos e caprinos, as medidas de controle a serem implementadas em uma propriedade ou regio devem considerar as duas espcies. No entanto, na Austrlia e na Nova Zelndia, foi demonstrada somente a ocorrncia de infeco por CAEV em caprinos, sem evidncias de infeco por lentivrus em ovinos.
5.5 Vrus da adenomatose pulmonar dos ovinos

A adenomatose pulmonar dos ovinos (SPA, para sheep pulmonary adenomatosis) causada pelo retrovrus de ovinos Jaagsiekte (JSRV), pertencente ao gnero Betaretrovirus. A denominao Jaagsiekte foi atribuda na primeira descrio do vrus, na frica do Sul, em 1825. A palavra Jaagziekte, de origem holandesa, foi proferida por um fazendeiro para se referir a duas manifestaes observadas em ovinos afetados: jaag signica caar, e siekte signica doena. Os animais doentes apresentavam-se como se tivessem sido perseguidos ou caados, devido diculdade respiratria. Outra denominao da doena carcinoma pulmonar de ovinos (OPC, para ovine pulmonary carcinoma), sendo considerada como modelo para o carcinoma brnquio-alveolar de humanos pelas semelhanas clnicas, macroscpicas e histopatolgicas dos dois tumores.
demonstrado que o JSRV, produzido a partir de um clone infeccioso, foi capaz de reproduzir a doena. A transmisso, embora ainda no totalmente elucidada, parece ocorrer atravs de contato direto e indireto com secrees do trato respiratrio e tambm pela saliva. Os animais infectados provavelmente excretem o vrus em secrees respiratrias mesmo alguns dias antes do incio dos sinais clnicos. As secrees podem formar aerossis e aumentar o alcance da disseminao. Tem sido demonstrado que os caprinos podem se infectar naturalmente pelo JSRV, com freqncia semelhante aos ovinos. O signicado epidemiolgico e patolgico desses achados, no entanto, so desconhecidos.

Os animais infectados apresentam uma infeco silenciosa, aparentemente sem a induo de resposta imune humoral. Nveis baixos de RNA e DNA proviral esto presentes, e podem ser detectados pelo uso de tcnicas de deteco de cidos nuclicos altamente sensveis, como a nested PCR. As clulas envolvidas na disseminao do vrus no organismo do hospedeiro seriam principalmente as da linhagem linfide, como os linfcitos B, e da linhagem mielide, como moncitos e macrfagos. A formao dos tumores est relacionada com a transformao neoplsica de clulas epiteliais do pulmo. O vrus replica ativamente nas clulas epiteliais tumorais, originadas a partir dos pneumcitos tipo II e das clulas clava bronquiolares. Antgenos virais podem ser detectados nas clulas tumorais, embora o mecanismo de transformao neoplsica pelo vrus ainda no seja conhecido. Os tumores associados com a infeco so classicados como adenomas e adenocarcinomas. Recentemente, foi demonstrada a capacidade da protena do envelope viral em induzir a transformao em diferentes tipos celulares, e a formao de tumores em camundongos e ovinos recm-nascidos. O perodo at a manifestao de sinais clnicos pode variar de um a trs anos, sendo mais curto em animais jovens. A sintomatologia clnica
5.5.1 Epidemiologia
O JSRV apresenta distribuio mundial, com exceo da Austrlia, onde a doena ainda no foi descrita, e da Islndia, de onde a doena foi erradicada. A doena ocorre de forma espordica, podendo atingir at 25% de incidncia em alguns rebanhos de alto risco em pases como o Reino Unido, frica do Sul e Espanha. A doena tambm j foi descrita no Chile, no Peru e no Brasil, onde considerada enfermidade de noticao obrigatria. No genoma dos ovinos, estima-se que existam entre 15 e 20 cpias do genoma de retrovrus endgenos relacionados ao JSRV, alguns deles apresentando transcrio ativa. No entanto, foi
Retroviridae
829
est relacionada com a produo de muco pelas clulas tumorais, observando-se tosse e descargas nasais abundantes. Pode ocorrer a obstruo das vias respiratrias e morte por anoxia e pneumonia por infeces secundrias.
5.6.1 Epidemiologia
A infeco pelo EIAV apresenta distribuio mundial, com maior ocorrncia em reas tropicais ou subtropicais pantanosas e que apresentam populaes numerosas de vetores artrpodes moscas, tabandeos e mosquitos. Em reas endmicas, a prevalncia pode atingir 70% dos animais adultos. Estudos sorolgicos em vrios estados brasileiros, como o Par, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Gois e Rio Grande do Sul, demonstram a presena do EIAV na populao eqina do pas. Em geral, os nveis de prevalncia so moderados a altos em regies com populaes numerosas e permanentes dos insetos vetores. Os hospedeiros naturais so os eqdeos e, at o presente, no foi demonstrada infeco natural de outras espcies. A principal forma de transmisso pela picada de insetos hematfagos sobretudo tabandeos que exercem o papel de vetores mecnicos, carreando o vrus na probscide. A transmisso mais freqente em reas de grande infestao de insetos e com grande concentrao de animais. A picada dos insetos estimula um reexo defensivo dos animais, o que freqentemente resulta na interrupo do repasto sangneo. Esses insetos procuram reiniciar o repasto com a maior brevidade, freqentemente o fazendo em animais que se encontram nas proximidades e, com isso, transmitindo o agente. A transmisso do EIAV por insetos depende da populao e hbitos dos insetos, da densidade dos animais, do nmero de picadas no animal e em animais das proximidades, da quantidade de sangue transferida entre animais, e do nvel de vrus no sangue do animal infectado que serve de fonte de infeco. Mosquitos e moscas tambm podem transmitir a infeco entre animais. Acredita-se que o homem tambm possa desempenhar um papel epidemiolgico na transmisso do EIAV entre animais, pela utilizao de agulhas, seringas e materiais cirrgicos no-descartveis. Embora possua papel epidemiolgico secundrio, a transmisso pela ingesto de leite ou pela inseminao articial com o smen contaminado tambm pode ocorrer.

Devido ausncia de resposta humoral detectvel, o diagnstico da infeco deve basear-se principalmente nos sinais clnicos nas fases avanadas da doena. Nessa fase, freqentemente observa-se secreo nasal abundante, acompanhada de dispnia em graus variveis. Os achados macroscpicos e histopatolgicos devem ser considerados para a conrmao da suspeita clnica. A deteco de cidos nuclicos virais nos tumores por hibridizao in situ ou por PCR podem ser tambm utilizados. Aps a conrmao do diagnstico, o controle da infeco pode ser estabelecido pelo isolamento dos animais doentes, reduzindo a incidncia da doena no rebanho. Em alguns pases, o descarte dos animais positivos (e erradicao dos animais do rebanho) a medida indicada.
5.6 Vrus da anemia infecciosa eqina

A anemia infecciosa eqina (EIA) uma doena infecciosa potencialmente fatal que afeta os eqdeos. O EIAV (equine infectious anemia virus) mais um membro do gnero Lentivirus. Assim como os SRLV, o EIAV tambm apresenta algumas caractersticas que o relacionam ao HIV. Foram reaes sorolgicas cruzadas, observadas entre o soro de eqinos infectados e a protena do capsdeo do HIV, que levaram Montagnier e colaboradores a relacionar o vrus que havia sido recentemente isolado com os lentivrus. A anemia infecciosa eqina foi inicialmente descrita em 1843, na Frana, e sua etiologia viral foi determinada em 1904, por Valle e Carr. A enfermidade facilmente confundvel com outras infeces que cursem com febre, como a inuenza e as encefalites eqinas.
830
Captulo 31

O curso clnico da infeco varivel e est relacionado com a susceptibilidade do hospedeiro, dose e virulncia da cepa do EIAV envolvida. Nos dias que se seguem infeco, os animais desenvolvem uma viremia inicial, que cursa com hipertermia, anemia e trombocitopenia. Essas manifestaes so geralmente observadas entre uma a duas semanas aps infeco, e esto relacionadas com a resposta imunolgica. A anemia resultante de hemlise e fagocitose, mediada pela presena de eritrcitos recobertos pelas protenas do complemento (C3) e, concomitantemente, pela reduo da eritropoiese. A trombocitopenia parece estar associada com um aumento dos nveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-), que um regulador negativo da produo de plaquetas no plasma dos animais infectados. A hipertermia deve-se aos nveis aumentados de TNF- e tambm pela produo de interleucina 1 (IL-1) por clulas da linhagem monoctica-macrofgica. Acredita-se que a maioria dos animais infectados apresente uma infeco subclnica, tornando-se portadores assintomticos do agente. Esses animais geralmente apresentam nveis mais baixos de viremia do que aqueles que desenvolvem a infeco ativa sintomtica. A forma inaparente ou subclnica da infeco pode se transformar em forma clnica aguda ou crnica devido a fatores como estresse, trabalho pesado ou a ocorrncia concomitante de outras doenas. Em cavalos infectados experimentalmente, observa-se o estabelecimento de uma infeco persistente, geralmente acompanhada por episdios de viremia, febre e anemia. Alm das manifestaes supracitadas, os animais podem apresentar glomerulonefrite, linfoadenopatia e inltrao de macrfagos e linfcitos no fgado e em outros rgos. A exemplo dos outros retrovrus, a infeco pelo EIAV persistente, ou seja, os animais infectados tornam-se portadores do agente por toda a vida. A diferena entre a infeco pelo EIAV daquelas causadas por outros lentivrus o fato de o EIAV desencadear picos de viremia, que no so observados em infeces pelo CAEV, MVV ou FIV.
Aps a viremia primria, diferentes quadros podem se desenvolver nos animais infectados pelo EIAV: a) anemia profunda e morte (forma aguda); b) recuperao e recidivas coincidentes com novas viremias (forma crnica) ou, ainda, c) o animal pode tornar-se um portador, mas sem recidivas ou manifestaes clnicas aparentes (forma inaparente). As recidivas e novas viremias esto associadas com o surgimento de variantes virais e, medida que o sistema imune reage infeco pela produo de anticorpos e pela resposta celular, ocorre reduo da carga viral no sangue, correspondendo aos perodos assintomticos. Na forma crnica, os episdios de febre podem ocorrer a intervalos variveis, entre os quais a temperatura volta a valores normais. Quadros recorrentes de depresso e letargia, petquias nas mucosas, emagrecimento progressivo, edema nas partes baixas e anemia esto freqentemente associados com a infeco crnica. A resposta mediada por linfcitos T citotxicos especcos para epitopos das protenas do capsdeo e das glicoprotenas do envelope viral seria a principal responsvel pela manuteno do estado assintomtico em animais portadores. O perodo entre uma recidiva e outra varivel, podendo ser inferior a 30 dias. A replicao contnua do vrus nas clulasalvo os moncitos/macrfagos responsvel pela carga viral presente na corrente sangnea. Embora ocorra uma reduo de at 700 vezes nos ttulos virais no sangue de animais assintomticos quando comparados com animais virmicos, estima-se que a replicao viral continue nesses perodos, nos macrfagos de diferentes rgos, como o fgado, linfonodos e bao.

As manifestaes clnicas de hipertermia, anemia, depresso e letargia recorrentes, em reas endmicas para o agente so sugestivas da infeco pelo EIAV e devem ser investigadas. A deteco de anticorpos o mtodo laboratorial mais empregado para o diagnstico da anemia infecciosa eqina. O teste sorolgico mais utilizado e considerado o teste-padro a IDGA, tambm
Retroviridae
831
conhecido como teste de Coggins. Esse o teste recomendado pelo Ministrio da Agricultura de vrios pases. A suspeita clnica tambm pode ser conrmada por outros testes laboratoriais, como xao do complemento, inibio da hemaglutinao (HI), IFA e ELISA. O teste de IDGA se constitui em um teste simples, com boa especicidade (baixa sensibilidade), que pode ser utilizado para a conrmao da suspeita clnica, mas que possui aplicao mais importante no monitoramento de rebanhos e da condio sanitria de animais submetidos a transporte, comrcio, importao/exportao. No Brasil, laboratrios e tcnicos interessados em realizar o teste devem ser cadastrados no Ministrio da Agricultura e ser submetidos a treinamento especco. Somente tcnicos e laboratrios cadastrados so legalmente licenciados para a realizao do teste e emisso do laudo. O EIAV replica em macrfagos dos eqinos infectados, mas o isolamento viral no uma tcnica empregada na rotina diagnstica, embora existam cepas laboratoriais adaptadas em cultivo de broblastos. O vrus no induz efeito citoptico, e a conrmao da infeco pode ser feita por IFA ou pela deteco de RNA viral ou DNA proviral por RT-PCR ou PCR, respectivamente. No existem vacinas comerciais disponveis contra o EIAV. O controle da infeco baseia-se na identicao e restrio ao trnsito e comrcio de animais positivos. Animais destinados a comrcio, trnsito, participao em competies, feiras e exposies devem ser necessariamente testados e apresentar resultado negativo no teste de IDGA. No Brasil, os animais positivos nesse teste devem ser sacricados, conforme estabelecido no Programa Nacional de Sanidade dos Eqinos do Ministrio da Agricultura. Outras medidas de controle recomendadas so: a) isolamento dos animais positivos at o sacrifcio; b) no compartilhar seringas e outros utenslios que possam ser veculo de clulas infectadas; c) combate a insetos vetores em reas endmicas (invivel em grandes reas ou em reas de grande infestao, mas vivel em instalaes); d) minimizar o contato de eqinos com secrees, sangue ou outros eqinos de status sanitrio desconhecido, at que sejam testados e certicados livres do vrus.
5.7 Vrus da leucemia felina

O vrus da leucemia felina (FeLV) pertence ao gnero Gamaretrovirus, cujo prottipo o vrus da leucemia murina (MLV). Dentre os gamaretrovrus de mamferos, o FeLV se enquadra na categoria dos vrus autnomos para a replicao, enquanto os outros vrus do gnero so defectivos. Embora ainda no tenham sido descritos sorotipos, os isolados do FeLV possuem variantes ou subgrupos (FeLV-A, FeLV-B, FeLV-C e FeLV-T), devido variabilidade das seqncias de aminocidos das glicoprotenas do envelope. As variaes de seqncias detectadas na protena SU seriam responsveis pela utilizao de diferentes receptores celulares, o que resultaria em diferenas de tropismo e patogenia entre isolados de campo.
5.7.1 Epidemiologia
A infeco pelo FeLV possui distribuio mundial, e a sua prevalncia notadamente maior em locais de grande densidade de felinos, como os gatis e abrigos. Nesses locais, o contato freqente e prximo entre os animais facilita a transmisso e pode resultar em prevalncias de at 33%. A prevalncia geralmente mais baixa, podendo atingir nveis aproximados de 1%, na populao geral de gatos domsticos, em que o contato entre animais apenas casual. No Brasil, a ocorrncia da infeco tem sido demonstrada em felinos domsticos e selvagens em vrios estudos. No zoolgico da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), 12 de 16 felinos selvagens possuam antgenos do FeLV e, no Cear, 83% dos gatos de rua testados foram positivos. Um estudo em So Paulo revelou uma prevalncia baixa (<5%). Acredita-se que a transmisso ocorra principalmente por contato direto e indireto, atravs da saliva, sendo favorecida durante as brigas. Isso pode explicar o porqu de gatos castrados apresentarem incidncia menor da infeco. Os gatos com infeco persistente podem excretar at 106 vrions por mL de saliva, o que constitui a principal fonte de vrus para a transmisso por contato
832
Captulo 31
direto ou por fmites. A utilizao de seringas e outros equipamentos contaminados com sangue tambm podem transmitir o agente. J foi descrita a transmisso vertical, inclusive de fmeas apresentando a infeco latente.

A forma mais comum de apresentao clnica por animais infectados pelo FeLV a imunodecincia, causada principalmente por variantes do subgrupo A. Os vrus desse subgrupo so igualmente os mais descritos na transmisso natural, na qual se classica o isolado FeLV-FAIDS. Alm do quadro de imunodecincia, outras manifestaes esto associadas infeco pelo FeLV: linfomas, leucemia, anemia e falhas reprodutivas. Os sinais clnicos mais comuns so os observados em casos de imunodecincia e devem-se a infeces oportunistas e repetidas: estomatite e gengivite crnicas, leses de pele e abscessos subcutneos, doenas respiratrias crnicas e maior incidncia de peritonite infecciosa felina. A ocorrncia de toxoplasmose tambm favorecida pela infeco pelo FeLV. A imunodecincia est relacionada com a presena do antgeno viral oncovrus felino associado membrana (feline oncovirus membraneassociated antigens, FOCMA) e ocorre por causa da depleo das clulas linfides infectadas, provavelmente pela ao citotxica mediada por anticorpos (ADCC). A leucemia e anemia so induzidas a partir da transformao de clulas-tronco, das linhagens mielides e linfides, que do origem aos linfcitos e eritrcitos. Os variantes do subgrupo C, aparentemente gerados a partir de mutaes de vrus do subgrupo A, parecem estar associados com os casos de anemia induzidos pelo FeLV. Os linfossarcomas representam 30% dos tumores em felinos, e evidncias indicam que a maioria deles est associada ao FeLV. Esses tumores podem se desenvolver em diferentes clulas e tecidos, como o timo, trato gastrintestinal, sistema nervoso, pele e outros.
O contato com o FeLV, na maioria dos gatos, leva a uma infeco aguda temporria que pode progredir para a recuperao clnica completa ou infeco latente. Em outras situaes, pode ocorrer uma viremia persistente, que resulta no desenvolvimento da doena, nas suas diversas manifestaes fatais. Os fatores que conferem resistncia ou susceptibilidade no so totalmente conhecidos, embora tenha sido descrito que animais jovens sejam mais susceptveis do que animais adultos. A exemplo dos outros retrovrus, a infeco pelo FeLV essencialmente persistente. Recentemente, analisando animais vacinados e no-vacinados desaados experimentalmente, pesquisadores propuseram quatro categorias para denir as relaes do FeLV com o hospedeiro: a) abortiva, em que no foi detectado DNA proviral, nem antgeno viral; b) regressiva, quando no detectado antgeno viral e a carga proviral transitria ou baixa; c) latente, antigenemia transitria e carga proviral moderada e d) progressiva, antigenemia e carga proviral elevadas e persistentes. As diferentes categorias observadas experimentalmente sugerem que alguns animais, naturalmente infectados, poderiam eliminar o vrus e no apresentariam nenhuma sintomatologia clnica. Por outro lado, animais com infeco latente poderiam no ser detectados atravs da antigenemia e seriam provveis fontes de transmisso. A deteco de anticorpos neutralizantes tem sido associada com a recuperao dos animais infectados. No entanto, o surgimento de anticorpos posterior erradicao do vrus em animais que desenvolvem uma infeco transitria, o que indicaria a existncia de uma resposta imune do tipo celular.

O isolamento do vrus no muito utilizado como mtodo diagnstico, embora antgenos virais possam ser detectados em clulas do sangue perifrico. Conseqentemente, a tcnica mais utilizada no diagnstico a IFA, em esfregaos sangneos, utilizando anticorpos especcos para as protenas do capsdeo. Existem kits de ELISA e
Retroviridae
833
testes imunocromatogrcos disponveis para a deteco de antgenos virais. Esses kits podem ser utilizados em clnicas e consultrios e permitem a obteno do resultado em poucos minutos, porm possuem um custo relativamente alto. Considerando os animais em que a presena do antgeno viral no seja detectada, tcnicas moleculares de deteco do genoma viral e proviral (RT-PCR e PCR, respectivamente) podem ser necessrias. Na Sua, um estudo demonstrou que 10% dos gatos eram portadores, detectados atravs da presena do provrus, embora no tenha sido possvel detectar o antgeno viral. Recentemente foi descrita a utilizao de RT-PCR e PCR para deteco de RNA viral e DNA proviral, respectivamente, na saliva de animais infectados. O controle da infeco pode ser realizado a partir do diagnstico correto e envolve necessariamente o isolamento dos animais positivos, evitando que transmitam o agente a outros animais. Vacinas preparadas com o vrus completo inativado obtido a partir de cultivos celulares so disponveis comercialmente, assim como vacinas recombinantes contendo protenas virais expressas em sistemas heterlogos. O uso das vacinas inativadas pode resultar em uma reduo de 70% de incidncia da doena nos animais imunizados. Alguns estudos indicam a necessidade de induo de uma resposta mediada por linfcitos Tc, como a induzida por vacinas de DNA, para a obteno de uma imunidade realmente protetora. A vacina para o FeLV foi a primeira a ser desenvolvida e utilizada na preveno de uma doena causada por retrovrus em mamferos. O fato de que algumas delas sejam capazes de proteger completamente o animal vacinado (infeco abortiva), sugere que alguns animais possam erradicar totalmente o vrus quando infectados naturalmente.
cincia, e as caractersticas ultra-estruturais das partculas vricas, assim como a deteco da atividade de transcriptase reversa, permitiram a sua classicao como um retrovrus pertencente ao gnero Lentivirus. Os isolados de campo do FIV so agrupados em cinco genotipos (A, B, C, D e E), com base em similaridade gentica. Os genotipos A e C so mais freqentes na Amrica do Norte, embora atualmente os gentipos A e B sejam os mais detectados em todo o mundo. Filogeneticamente o FIV mais prximo dos lentivrus EIAV, CAEV e MVV do que dos lentivrus de primatas, como o HIV. Apesar disso, esse vrus considerado um modelo animal adequado para estudos de patogenia, pesquisa de drogas anti-retrovirais e desenvolvimento de vacinas para o HIV. Isso se deve principalmente s caractersticas semelhantes dos quadros de imunossupresso observados em gatos (FIV) e humanos (HIV).
5.8.1 Epidemiologia
O FIV apresenta uma distribuio mundial e j foi isolado tambm de felinos selvagens, alm de j terem sido descritos vrios isolados de gatos domsticos. A soroprevalncia na populao geral pode variar de 1 a 30%, com ndices mais elevados entre animais que apresentam sinais de doena. Em nveis mundiais, estima-se uma prevalncia de aproximadamente 12% nos felinos domsticos. O FIV tem sido descrito em felinos no Brasil. No Rio de Janeiro, 21% dos felinos testados eram positivos para o vrus. No Rio Grande do Sul, Minas Gerais e So Paulo, estudos epidemiolgicos tm conrmado a presena da infeco em felinos com imunodecincia ou sem sinais clnicos. A infeco ocorre com maior freqncia em gatos com mais de um ano de idade. A principal forma de transmisso parece ser pelo contato direto, atravs da saliva, pelas mordidas durante as brigas entre animais. Os machos se infectam com o dobro da freqncia das fmeas, pelo seu comportamento social e agressivo distinto. O vrus tambm pode ser transmitido pelo smen durante a cpula e pelo leite de fmeas infectadas (infeco pela via oral).
5.8 Vrus da imunodecincia felina

O primeiro isolamento de imunodecincia felina (FIV) foi descrito em 1986, na cidade de Petaluma, Estados Unidos. A presena do vrus estava associada com um quadro de imunode-
834
Captulo 31

A imunossupresso observada nos animais infectados pelo FIV o resultado da depleo dos linfcitos T auxiliares (CD4+), que leva a uma inverso da relao CD4+/CD8+. O comprometimento do sistema imunolgico resulta no desenvolvimento de infeces oportunistas, que caracterizam os estgios nais da doena (Tabela 31.3). A disseminao do vrus no organismo do hospedeiro ocorre principalmente pelos linfcitos infectados e, em menor escala, pelos moncitos e macrfagos. Estes ltimos estariam relacionados com a persistncia do vrus nos estgios nais da doena. O vrus pode ser detectado em rgos linfides, nos pulmes, fgado, rins e no plexo coride. Os achados histopatolgicos associados com a enfermidade consistem de hiperplasias no tecido linfide associados s mucosas (MALT), nos linfonodos, tonsilas, timo e medula ssea. A presena de anticorpos contra o FIV pode ser evidenciada por testes sorolgicos em duas a quatro semanas aps a infeco. Os machos adultos tm sido apontados como a categoria animal
de maior incidncia da infeco, provavelmente devido aos fatores de risco para a transmisso do agente (agressividade, brigas, contato com vrios animais).
5.8.3 Diagnstico
A sintomatologia clnica observada em gatos infectados pelo FIV inespecca e reete um quadro geral de imunossupresso, semelhante ao observado na leucemia pelo FeLV. Quadros sugestivos de imunossupresso devem ser investigados para a presena de anticorpos, antgenos ou cidos nuclicos virais. Para a deteco de anticorpos, os testes mais utilizados so o ELISA, IFA e o Western blot. Animais com testes negativos devem ser testados novamente aps 60 dias, para a conrmao do resultado. Existem kits baseados em cromatograa para o diagnstico da infeco em nvel ambulatorial, pela deteco de antgenos virais no sangue total. A deteco do provrus em clulas sangneas por PCR tambm pode ser realizada, utilizando-se o DNA extrado dos leuccitos. Essa tcnica tem se difundido nos ltimos anos e se constitui em uma importante ferramenta para a identicao de animais infectados. Porm, a
Tabela 31.3. Manifestaes clnicas e estgios da infeco pelo FIV.
Forma
Infeco aguda
Manifestaes clnicas
Nenhuma ou inespecfica (febre, linfoadenopatia, diarria, infeces respiratrias) Nenhuma Aumento generalizado dos linfonodos, sinais inespecficos (febre, anorexia, perda de peso), alteraes comportamentais Linfoadenopatia, infeces crnicas secundrias (na cavidade oral e trato respiratrio superior) Infeces crnicas oportunistas e secundrias severas, tumores e emaciao
Durao
Semanas ou meses
Portador subclnico Linfoadenopatia generalizada ARC (AIDS related complex)
Anos Anos
Meses a anos
FAIDS (AIDS felina)

a
Meses
Fonte: adaptado de Ishida e Tomoda (1990).
Retroviridae
835
utilizao da tcnica de PCR para o diagnstico da infeco pelo FIV tem sido questionada, pela falha na deteco de vrus com variaes genmicas.
macrfagos e estimula a produo de linfocinas e a resposta imune celular, aumentando a atividade das clulas NK. O AZT (Retrovir), usado no tratamento da AIDS em humanos, tambm utilizado em gatos com sinais clnicos de FIV.
5.8.4 Controle e prolaxia 5.9 Vrus da leucose aviria

Aps a identicao dos animais positivos, o controle pode ser realizado pela sua separao dos demais animais, reduzindo a possibilidade de transmisso. Animais que tem acesso s ruas, e que, portanto, entram em contato com outros animais, apresentam uma probabilidade maior de serem infectados. A limitao do acesso de gatos domsticos s ruas pode reduzir o risco de adquirirem a infeco, mas isto nem sempre exeqvel. Diversas vacinas experimentais tm sido desenvolvidas e avaliadas, incluindo vacinas com vrus inativado, protenas recombinantes e vacinas de DNA. De uma maneira geral, a diversidade gentica e antignica dos isolados de campo tem dicultado o sucesso e a utilizao das vacinas em larga escala. Vacinas inativadas tm demonstrado maior ecincia em triagens vacinais. Uma vacina que contm dois gentipos do FIV e protege contra um terceiro gentipo foi licenciada nos EUA e atualmente comercializada. No entanto, a sua eccia em limitar a transmisso natural do vrus na populao felina necessita de comprovao. Alguns estudos tm demonstrado resultados promissores com a utilizao de interferon recombinante para o tratamento da infeco, aumentando a sobrevida dos animais tratados. O tratamento de felinos infectados com o FIV e FeLV por cinco dias, com rFeIFNw (interferon omega recombinante felino), pela via subcutnea, aumentou duas vezes as chances de sobrevivncia. Clnicos tm utilizado interferon- humano para o tratamento de vrias doenas virais felinas, relatando alguns sucessos na terapia. No entanto, ainda so necessrios estudos para a comprovao da eccia do interferon em espcie heterloga. Drogas que estimulam o sistema imune, como a Immunoregulin, tambm so utilizadas. Essa droga contm a Propionibacterium acnes, que ativa Descrito, pela primeira vez, em 1908, o vrus da leucose aviria (ALV) um Alpharetrovirus causador de displasias e neoplasias do sistema hematopoitico em aves. O termo refere-se s manifestaes clnicas do vrus, como a leucemia, caracterizada pela presena de linfcitos B imaturos na corrente sangnea, e a invaso de rgos perifricos como o bao, fgado, rins e sistema nervoso por essas clulas. Aspectos relacionados ao espectro de hospedeiros susceptveis (presena de receptores), neutralizao viral por anti-soro especco e interferncia viral foram utilizados para classicar o vrus da leucose aviria em vrios subgrupos. Os ALV so divididos em grupos endgenos presentes no genoma das galinhas (subgrupo E) e grupos exgenos (subgrupos A, B, C, D e J). A maioria dos surtos de leucose aviria tem sido atribuda aos subgrupos A, B e J. O subgrupo J tem sido identicado como o principal agente causal de tumores em frangos de corte e tambm o grupo de vrus que atinge o maior nmero de linhagens de galinhas, uma vez que j foram descritas vrias linhagens resistentes a um ou mais dos outros subgrupos.
5.9.1 Epidemiologia
O ALV est presente de forma endmica em praticamente todos os pases que possuem avicultura comercial. A incidncia da infeco pode variar de 3 a 20%, com a ocorrncia de surtos espordicos. O subgrupo J j foi descrito como ocasionando perdas de at 30% em matrizes de corte. A transmisso ocorre de duas formas principais: vertical e horizontal. A transmisso vertical pode ocorrer pela transferncia congnita do vrus infeccioso e por transmisso gentica, com
836
Captulo 31
a integrao do provrus DNA nos cromossomos dos gametas. Essas duas formas de transmisso vertical esto associadas com quadros clnicos diferentes. A primeira forma resulta no desenvolvimento de viremia e leucemia, enquanto a presena do provrus no gameta no induz viremia, e a infeco geralmente latente. A transmisso horizontal pelo contato direto ou indireto com saliva contaminada pode desempenhar um papel importante na disseminao da infeco devido alta densidade populacional em granjas industriais.

A forma mais comum de apresentao de doena pelos animais infectados com ALV a leucose, que acomete aves de 14 a 30 semanas de idade, sem o desenvolvimento de sinais clnicos especcos. As aves apresentam fraqueza, reduo na ingesto de alimentos e pode haver a formao de tumores na bursa de Fabricius, bao, fgado e outros rgos. A infeco inicia-se na bursa de Fabricius, com a formao de folculos, aproximadamente um ms aps a infeco, caracterizados por acmulo de linfoblastos (pr-B). A maioria dos folculos regride, mas alguns podero dar origem a ndulos neoplsicos que, em seis a oito meses, sero responsveis por metstases no fgado e no bao. A transformao celular decorrente da integrao do provrus prximo a um proto-oncogene celular (c-myc). Outras manifestaes clnicas tambm associadas com a infeco pelo ALV so: osteopetrose, que atinge principalmente os membros inferiores, e anemia. Os sinais clnicos e leses podem aparecer associados com a leucemia e tumores.
a) o isolamento viral em ovos embrionados ou em cultivos celulares, b) teste de xao do complemento para deteco da protena do capsdeo em cultivo celular inoculado (teste de COFAL), c) ELISA, d) IFA e e) PCR para deteco do provrus, com capacidade de diferenciao entre os subtipos. O controle baseia-se em medidas prolticas para evitar a transmisso horizontal onde h alta densidade populacional (sistema all-in-all-out) e na escolha de linhagens resistentes, o que levou a uma diminuio signicativa de infeco por ALV em granjas comerciais. Apesar da seleo de linhagens resistentes, o surgimento de mutantes e/ou recombinantes capazes de infectar essas linhagens tem sido descrito.
BARON, T. et al. Detection of bovine immunodeciency-like virus infection in experimentally infected calves. Archives of Virology, v.143, p.181-189, 1998. BENDINELLI, M. et al. Feline immunodeciency virus: an interesting model for AIDS studies and an important cat pathogen. Clinical Microbiology Reviews, v.8, p.87-112, 1995. BIENZLE, D. et al. The variability of serological and molecular diagnosis of feline immunodeciency virus infection. The Canadian Veterinarian Journal, v.45, p.753-757, 2004. BRUNNER, M.A.; LEIN, D.H.; DUBOVI, E.J. Experiences with the New York State bovine leucosis virus eradication and certication program. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, v.13, p.143-150, 1997. CAMARGOS, M.F. et al. Development of a polymerase chain reaction and its comparison with agar gel immunodifusion test in the detection of bovine leukemia virus infection. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.40, p.341-348, 2003. CANAL, C.W.; SILVA, E.N. Enfermidade de Marek, complexo leuctico avirio e reticuloendoteliose. In: BERCHIERI JNIOR, A; MACARI, M. Doenas das Aves. Campinas, SP: Fundao Apinco de Cincia e Tecnologia Avcolas, 2000. Cap.5.1, p.255265. CAXITO, F.A.; RESENDE, M. Feline immunodeciency virus: a review. Virus Reviews and Research, v.9, p.7-17, 2004. COFFIN, J.m. Retroviridae: The viruses and their replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.58, p.1767-1848.

O diagnstico de leucose aviria geralmente realizado por ocasio da necropsia, associando-se os achados tumorais com o histrico e sinais clnicos. No diagnstico diferencial, devese considerar a doena de Marek. Como testes laboratoriais a serem utilizados para o diagnstico denitivo, podem ser citados:
Retroviridae
837
MEAS, S. et al. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeciency virus in dairy cattle herds. Veterinary Microbiology, v.84, p.275-282, 2002. MONTI, G.E.; FRANKENA, K. Survival analysis on aggregate data to assess time to sero-conversion after experimental infection with Bovine Leukemia Virus. Preventive Veterinary Medicine, v.68, p.241-262, 2005. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. NARAYAN, O. et al. Visna-Maedi: the prototype lentiviral disease. In: NATHANSON, N. Viral pathogenesis. New York: Lippincott-Raven, 1997. Cap.27. p.657-668. PALMARINI, M. et al. Jaagsiekte retrovirus is necessary and sufcient to induce a contagious lung cancer in sheep. Journal of Virology, v.73, p.6964-6972, 1999. PEDERSEN, N.C. et al. Isolation of a T-lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeciency-like syndrome. Science, v.235, p.790-793, 1987. PETERHANS, E. et al. Routes of transmission and consequences of small ruminant lentiviruses (SRLVs) infection and eradication schemes. Veterinary Research, v.35, p.257-274, 2004. RAVAZZOLO, A.P. et al. Viral load, organ distribution, histopathological lesions, and cytokine mRNA expression in goats infected with a molecular clone of the caprine arthritis encephalitis virus. Virology, v.350, p.116-127, 2006. SCHWARTZ, I.; LVY, D. Pathobiology of bovine leukemia virus. Veterinary Research, v.25, p.521-536, 1994. SUAREZ, D.L.; WHETSTONE, C.A. Camparison of different PCR tests to detect bovine lentivirus in cell culture and experimentally and naturally infected cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.9, p.421-424, 1997. TAVARES, L.; PEREIRA, J.M. Patognese das infeces por retrovrus da sub-famlia Oncornavirinae. Revista Portuguesa de Cincias Veterinrias, v.526, p.61-72, 1998. TORRES, A.N.; MATHIASON, C.K.; HOOVER, E.A. Reexamination of feline leukemia virus:host relantionships using real-time PCR. Virology, v.332, p.272-283, 2005. VAN DER MAATEN, M.J.; BOOTHE, A.D.; SEGER, C.L. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocitosis. Journal of the National Cancer Institute, v.49, p.1649-1657, 1972. VON GROLL, A. et al. Deteco do vrus da imunodecincia bovina (BIV) em bovinos naturalmente infectados no Rio Grande do Sul, Brasil. In: SALO DE INICIAO CIENTFICA, 9., 1997, Porto Alegre. Resumos... Porto Alegre: Pr-Reitoria de Pesquisa da UFRGS, 1997. p.104.
CRAWFORD, P.C. et al. Accuracy of polymerase chain reaction assays for diagnosis of feline immunodeciency virus infection in cats. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.226, p.1503-1507, 2005. CRAWFORD, T.B. et al. Chronic Arthritis in goats caused by a retrovirus. Science, v.207, p.997-999, 1980. DIVERS, T.J. et al. Evidence for transmission of bovine leukemia virus by rectal palpation in a commercialdairy herd. Preventive Veterinary Medicine, v.23, p.133-141, 1995. FLYNN, J.N.; HANLON, L; JARRET, O. Feline leukaemia virus: protective immunity is mediated by virus-specic cytotoxic T lymphocytes. Immunology, v.101, p.120-125, 2000. GOMES-KELLER, M.A. et al. Shedding of feline leukemia virus RNA in saliva is a consistent feature in viremic cats. Veterinary Microbiology, v.112, p.11-21, 2006. GONDA, M.A. Bovine immununodeciency virus. AIDS, v.6, p.759-776, 1992. HEATON, P.R.; JOHNSTONE, P.; BROWNLIE, J. Investigation of the cellular tropism of bovine immunodeciency-like virus. Research in Veterinary Science, v.65, p.33-40, 1998. HECHT, S.J. et al. Distribution of endogenous type B and type D sheep retrovirus sequences in ungulates and other mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.93, p.3297-3302, 1996. ISHIDA, T.; TOMODA, I. Clinical staging of feline immunodeciency virus infection. Japanese Journal of Veterinary Science, v.52, p.645-648, 1990. JOHNSON, R.; KANEENE, J.B. Bovine leukemia virus. Part I. Descriptive epidemiology, clinical manifestation, and diagnostic tests. Continuing education article 12. The Compendious, North American Edition. Food Animal, v.13, p.315-327, 1991. KETTMANN, R. et al. Bovine leukemia virus: An exogenous RNA oncogenic virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.73, p. 1014-1018, 1976. LARA, V.M. Estudo epidemiolgico e gentico do vrus da imunodecincia felina identicados no estado de So Paulo. 2004. 94f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinria) Curso de Ps-graduao em Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2004. LEVY, J.K.; CRAWFORD, P.C.; SLATER, M.R. Effect of vaccination against feline immunodeciency virus on results of serologic testing in cats. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.225, p.1558-1561, 2004. MANSKY, L.M.; TEMIN, H.M. Lower mutation rate of bovine leukemia virus relative to that of spleen necrosis virus. Journal of Virology, v.68, p.494-499, 1994.
OUTRAS FAMLIAS VIRAIS

Fernanda Silveira Flores Vogel1 & Eduardo Furtado Flores
32
841 841
842 842 842 842
1 Introduo 2 Polyomaviridae
2.1 Classicao 2.2 Propriedades gerais 2.3 Ciclo replicativo 2.4 Biologia e patogenia
3 Hepadnaviridae
844
844 844 844 845 846 846 846 846 847
4 Arenaviridae
5 Astroviridae
848
848 848 849 849
6 Filoviridae
849
850 850 850 851
Luiz Carlos Kreutz elaborou a seo 7.4.2 (Vrus da pancreatite necrosante dos salmes, INPV).
7 Birnaviridae
7.1 Classicao 7.2 Propriedades gerais 7.3 Ciclo replicativo 7.4 Birnavrus de importncia veterinria 7.4.1 Vrus da doena de Gumboro 7.4.2 Vrus da pancreatite necrtica infecciosa
851
851 851 852 852 852 855
8 Bornaviridae
8.1 Classicao 8.2 Propriedades gerais 8.3 Ciclo replicativo 8.4 Biologia e patogenia 8.5 Doena de Borna
856
856 857 857 858 858
859
1 Introduo
Algumas famlias abrigam vrus que possuem importncia limitada, como patgenos de animais de companhia ou de criao, apresentando menor relevncia em medicina veterinria. Este captulo abordar, de forma sucinta, os principais aspectos das famlias de vrus cujos membros possuem importncia clnica limitada em animais de interesse veterinrio. Dentre os membros dessas famlias, alguns possuem importncia como patgenos humanos; outros so patgenos de animais de laboratrio, de invertebrados ou produzem doenas apenas em animais silvestres; um terceiro grupo abrange vrus que, aparentemente, no esto envolvidos com doena em vertebrados e a sua importncia limita-se a aspectos peculiares de sua estrutura, biologia e ecologia. Deve-se ressaltar que os critrios utilizados nesta classicao so relativos, e que as linhas que delimitam os grupos de vrus de acordo com a sua importncia clnica so tnues, podendo ser circunstanciais e temporrias. Certos agentes podem ser considerados pouco importantes dentro de um contexto, mas so muito importantes em outras situaes. Da mesma forma, vrus historicamente considerados pouco importantes podem adquirir importncia clnica devido a alteraes genticas ou ecolgico-ambientais que inuenciam as suas interaes com os hospedeiros, podendo resultar na ocorrncia de doenas humanas e animais. Um exemplo recente a adaptao do vrus da inuenza a ces, espcie at ento considerada refratria infeco. Ao nal deste captulo, ser apresentada a famlia Birnaviridae, uma pequena famlia, que abriga pelo menos dois vrus importantes em animais: o INPV (vrus da pancreatite necrtica infecciosa), que infecta peixes e possui importncia em criatrios de salmes, e o IBDV (vrus da doena de Gumboro ou doena da bursa de Fabricius), que infecta galinhas e possui grande importncia na avicultura comercial em vrios pases. Outro vrus que possui importncia relativa em alguns pases o vrus da doena de Borna (BDV), pertencente a famlia Bornaviridae, que
infecta principalmente, mas no exclusivamente, eqinos.
2 Polyomaviridae
A famlia Polyomaviridae era classicada anteriormente como uma subfamlia da Papovaviridae, cuja denominao se devia aos vrus prottipos de cada subfamlia: Pa (papilomavrus de coelhos); po (poliomavrus de camundongos); va (agente vacuolizante, vrus smio 40, SV-40). Atualmente, os poliomavrus e o prottipo SV40 so classicados separadamente, na famlia Polyomaviridae. O interesse maior nesses vrus se iniciou com a descoberta de que o SV-40 e outros poliomavrus eram capazes de produzir tumores em hamsters (por isto foram denominados pequenos vrus DNA tumorais). O SV-40 foi descoberto acidentalmente como contaminante de linhagens celulares de macacos rhesus utilizadas para a produo de vacinas contra a poliomielite. Como conseqncia, aproximadamente 50 milhes de doses de vacinas produzidas contra a poliomielite e utilizadas na dcada de 1950 estavam contaminadas com o SV-40. Posteriormente, constatou-se que o SV-40 era capaz de produzir tumores em hamsters, aumentando a preocupao sobre uma possvel atividade tumorignica tambm em humanos. Embora estudos extensivos realizados durante dcadas no tenham sido capazes de demonstrar associao entre o SV-40 e tumores humanos, estudos recentes demonstraram a presena de seqncias de DNA e antgenos do SV-40 em certos tumores raros em humanos, renovando o interesse por este vrus. O interesse inicial pelos poliomavrus deveu-se ao seu potencial oncognico. No entanto, estes vrus foram mais estudados como modelos para a Virologia e Biologia Molecular do que como patgenos humanos ou animais. Importantes conhecimentos na Biologia Molecular, como a estrutura do DNA superenrolado, origens e iniciao da replicao do DNA, estrutura e funo de promotores e enhancers, splicing alternativo e regulao da expresso gnica, entre outros, foram obtidos a partir de estudos realizados com esses vrus.
842
Captulo 32
2.1 Classicao
Os vrus da famlia Polyomaviridae infectam animais e humanos, e todos pertencem ao gnero Polyomavirus. Entre estes vrus esto: poliomavrus de camundongos (PyV), vrus K (camundongos), vrus smio 40 (SV-40) (macaco rhesus), agente smio 12 (SA-12) (babunos), poliomavrus linfotrpico (LPyV) (macaco-verde-africano), poliomavrus bovino (BPyV), vrus vacuolizante renal de coelhos (RKV), poliomavrus de hamsters (HaPV), poliomavrus de ratos atmicos (ARPyV), vrus da doena de Budgerigar edgling (BFDV) (psitacdeos), poliomavrus JC (JCV) (humanos), vrus BK (BKPyV) (humanos), poliomavrus B linfotrpico, o vrus pneumotrpico de murinos (MPtV), o Kilham poliomavrus (KPyV) e o vrus do rim de fetos do macaco rhesus.
2.3 Ciclo replicativo

Os detalhes da replicao dos poliomavrus esto apresentados com detalhes no captulo referente replicao dos vrus DNA. Do ponto de vista biolgico, importante ressaltar que a replicao desses vrus em clulas de espcie homloga ou heterloga pode ter conseqncias diferentes. A infeco de clulas permissivas (espcie homloga) resulta na ocorrncia de todas as etapas do ciclo e na conseqente produo de prognie viral infecciosa. Por outro lado, a infeco de clulas semi-permissivas (geralmente de espcies heterlogas) resulta em replicao abortiva, na qual ocorre apenas a expresso dos genes iniciais, sem a replicao do genoma ou produo das protenas estruturais (tardias). A persistncia do genoma viral nessas clulas, associada com a expresso contnua dos antgenos T, pode levar imortalizao e transformao celular.

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos poliomavrus esto apresentadas no Quadro 32.1. Os poliomavrus so vrus que geralmente produzem infeces subclnicas persistentes em seus hospedeiros naturais. Alguns deles esto associados com a produo de tumores em espcies heterlogas, pricipalmente hamsters.
2.4 Biologia e patogenia

Em geral, os poliomavrus humanos e animais esto mais freqentemente associados com infeces subclnicas e apenas esporadicamente produzem sinais clnicos ou tumores em hospedeiros heterlogos. Portanto, possuem importncia limitada em medicina veterinria. Alguns,
Polyomaviridae
Vrions pequenos (45 mm), icosadricos, sem envelope; Genoma: DNA circular, fita dupla, 5 kb; Genoma conjugado com histonas formando um minicromossomo; Existem poliomavrus de vrios mamferos de humanos e aves; Espectro restrito de hospedeiros; No replicam produtivamente em outra espcie; Causam infeces inaparentes na maioria dos hospedeiros naturais; Alguns vrus produzem tumores em hamsters recm-nascidos; Infeco de clulas heterlogas pode resultar em transformao; Chamados de "pequenos vrus DNA tumorais".
Quadro 32.1. Propriedades biolgicas e moleculares da famlia Polyomaviridae. direita: fotografia de microscopia eletrnica de vrions do SV-40.
Outras famlias virais
843
no entanto, podem estar associados com doena severa, como o BFDV. A Tabela 32.1 apresenta os principais poliomavrus animais, os seus hospedeiros e os aspectos mais importantes da infeco. Dois poliomavrus humanos j foram identicados at o presente: os vrus JC e BK. Esses vrus infectam grande parte das pessoas durante a infncia ou adolescncia, produzindo infeces subclnicas ou com sinais clnicos discretos, e permanecem latentes ou persistentes no epitlio renal de algumas pessoas. Acredita-se que cerca de 80% da populao mundial apresente anticorpos contra esses vrus. A associao desses agentes com enfermidade incerta, embora o BKV j tenha sido isolado de pacientes transplantados imunodeprimidos e o JCV j tenha sido identicado no crebro de pacientes com leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML). J foi
demonstrado que o JCV capaz de estabelecer infeco latente em linfcitos, no trato urogenital e no crebro de pessoas infectadas. Em indivduos imunodeprimidos, o vrus pode reativar e produzir infeco clnica. Nestes indivduos, o JCV pode determinar a PML, que uma enfermidade degenerativa que afeta as clulas oligodendrticas. As pessoas doentes apresentam perda de memria, confuso mental, desorientao, ataxia, hemiparesia, incoordenao e anormalidades visuais. A morte pode ocorrer entre trs e seis meses aps o incio dos sintomas. Alm disso, o JCV j foi encontrado associado com nefropatias em pacientes recm-transplantados. Quanto ao BKV, no h evidncias de que este vrus determine infeco clnica em pessoas imunocompetentes. Em pacientes que receberam transplante renal, o BKV tambm incriminado como uma das causas de insucesso do transplante.
Tabela 32.1. Principais poliomavrus animais, hospedeiros e principais aspectos da infeco
Vrus
Hospedeiro
Caractersticas principais
Infeco natural em camundongos silvestres; infeco de camundongos de laboratrios e colnias; causa infeco renal persistente Infeco natural de camundongos, replica nos endotlios pulmonares Infeco renal persistente em macacos silvestres na sia Infeco natural em baboons na frica Infecta linfoblastos da linhagem B Comum em bovinos; persiste nos rins Infeco natural em coelhoscauda-de-algodo Associado com tumores cutneos Infecta a glndula partida Doena aguda e fatal em psitacdeos
Poliomavrus de camundongos (PyV)
Camundongos
Vrus K (PyK)
Camundongos
Vrus smio 40 (SV-40)
Macacos rhesus
Agente smio 12 (SA-12) Poliomavrus linfotrpico (LPV) Poliomavrus bovino (BPyV) Vrus vacuolizante renal de coelhos (RKV) Poliomavrus de hamsters (HaPV) Poliomavrus de ratos atmicos (ARPyV) Vrus da doena de Budgerigar fledgling (BFDV)
Baboons Macaco-verde-africano Bovinos
Coelhos Hamsters Ratos atmicos Psitacdeos
844
Captulo 32
3 Hepadnaviridae
A famlia Hepadnaviridae composta por vrus DNA pequenos, que apresentam um tropismo marcante por clulas hepticas. Essa famlia abriga um importante patgeno de humanos, o vrus da hepatite B (HBV), que o seu prottipo. Por isso, os hepadnavrus so genericamente denominados vrus das hepatites B. O HBV considerado um dos principais patgenos de humanos e, em todo mundo, acredita-se que cerca de 300 milhes de pessoas estejam cronicamente infectadas. Entre as conseqncias da infeco pelo HBV, esto a hepatite aguda ou crnica, infeco subclnica persistente, cirrose e o carcinoma hepatocelular (HCC). Esta famlia tambm abriga alguns vrus de animais, como os hepadnavrus de esquilos (ground squirrel hepatitis virus, GSHV), marmotas (woodchuck hepatitis virus, WHV) e patos (duck hepatitis B virus, DHBV). Recentemente, outros hepadnavrus foram identicados em garas, gansos, marsupiais e orangotangos. Os hepadnavrus possuem tropismo marcante por clulas hepticas, e as manifestaes clnicas da infeco so predominantemente hepticas embora no exclusivamente.
3.1 Classicao
Os vrus da famlia Hepadnaviridae so classicados em dois gneros, de acordo com os seus hospedeiros naturais, a sua estrutura e organizao genmica. Os Orthohepadnavirus infectam mamferos (marmotas e esquilos) e os Avihepadnavirus infectam aves (patos, gansos, garas e outras espcies), produzindo hepatite do tipo B em seus hospedeiros.

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos hepadnavrus esto apresentadas no Quadro 32.2. Dentre as propriedades biolgicas mais marcantes, destacam-se o hepatotropismo e a capacidade de produzirem infeces hepticas persistentes, muitas vezes, seguidas de desenvolvimento de cirrose heptica e de carcinoma hepatocelular.

O ciclo replicativo dos hepadnavrus nico entre os vrus animais e inclui uma etapa de transcrio reversa distinta dos retrovrus. Aps a
Hepadnaviridae
Vrions pequenos (42-47 nm), esfricos, com envelope; Nucleocapsdeo icosadrico; Genoma DNA circular (3.0 to 3.3 kb), fita parcialmente dupla; Partculas subvirais em abundncia (esfricas, filamentosas); A polimerase viral est presente nos vrions; O ciclo replicativo envolve uma etapa de transcrio reversa; Parte da replicao do genoma no ncleo parte no citoplasma; No replicam bem em cultivo celular; Espectro restrito de hospedeiros in vivo; Hepatotropismo marcante; Produzem infeces hepticas persistentes; Associados com carcinoma hepatocelular (HCC).
Fonte: Dr Linda Stannard.uct.ac.za
Quadro 32.2. Propriedades biolgicas e moleculares dos hepadnavrus. direita: fotografia de microscopia eletrnica de vrions e partculas subvirais esfricas e filamentosas do HBV.
845
penetrao na clula, transporte ao ncleo e desnudamento, o DNA genmico circularizado em uma ta parcialmente dupla e convertido por enzimas celulares e/ou pela polimerase viral em uma molcula circular, covalentemente fechada de ta dupla (covalently closed circle, ccc). A molcula de DNA ccc serve de molde para a transcrio pela RNA polimerase II celular, originando RNAs mensageiros subgenmicos (mRNA) e um RNA mensageiro da extenso do genoma (pgRNA). Esses RNAs so exportados para o citoplasma, onde os mRNA so traduzidos nas protenas virais (polimerase, capsdeo e envelope). A polimerase recm-produzida pela traduo utiliza o pgRNA como molde e realiza transcrio reversa, resultando em uma cpia de DNA complementar (cDNA), que convertida em ta dupla pela prpria polimerase. Essa reao ocorre em capsdeos recm-formados e interrompida quando ocorre o brotamento e egresso dos vrions das clulas. Como resultado, os vrions contm, no seu interior, uma molcula de DNA de ta parcialmente dupla. Parte desses vrions pode reciclar para o ncleo e reiniciar o ciclo; outra parte liberada da clula.

A infeco pelo HBV pode ser subclnica ou resultar em enfermidade heptica, caracterizada por hepatite aguda a crnica, cirrose e carcinoma hepatocelular. A maioria das pessoas infectadas
se recupera da infeco. No entanto, em algumas pessoas, a infeco se torna persistente, determinando uma doena heptica de moderada a severa, com taxas de morbidade e mortalidade baixas. A extenso e a severidade da infeco pelo HBV dependem de fatores virais e do hospedeiro. Sabe-se que esse vrus apresenta mecanismos de adaptao ao hospedeiro, como mutaes em determinadas regies do genoma, favorecendo a infeco persistente. Aps a infeco, o incio da injria hepatocelular ocorre pela induo de apoptose mediada por linfcitos T citotxicos em hepatcitos infectados. Durante a infeco aguda, a patologia varia de leve a moderada. Em alguns casos, no entanto, existe uma reao inamatria intensa, que resulta em uma grande injria hepatocelular e em hepatite fulminante. Por outro lado, a hepatite crnica resulta da injria contnua dos hepatcitos. Em pacientes assintomticos, existe certa tolerncia aos antgenos do HBV, o que resulta em injria leve ou ausente aos hepatcitos, pelas clulas do sistema imune. Para um melhor esclarecimento da patogenia do HBV, animais, como camundongos e chimpanzs, tm sido utilizados como modelos experimentais. Uma vacina recombinante, contendo a glicoprotena de superfcie do HBV, produzida em levedura, tem sido utilizada em humanos. A Tabela 32.2 apresenta os principais hepadnavrus, os seus hospedeiros e as principais caractersticas da infeco em cada espcie.
Tabela 32.2. Hospedeiros e principais aspectos da patogenia dos hepadnavrus
HBV
Hospedeiro Humanos Chimpanzs Fgado Rins Pncreas Leuccitos Portadores subclnicos; hepatite aguda e crnica; cirose, HCC
WHV
Marmotas
GSHV
Esquilos Marmotas
DHBV
Patos Gansos Fgado Rins Pncreas Bao Portadores subclnicos; hepatite
Tropismo
Fgado Rins Pncreas Leuccitos Portadores subclnicos; hepatite; HCC
Fgado
Manifestaes clnicas
Portadores subclnicos; hepatite; HCC
846
Captulo 32
4 Arenaviridae
Os membros da famlia Arenaviridae so vrus que possuem roedores silvestres da Europa, frica e Amricas como hospedeiros naturais. Nesses hospedeiros, os arenavrus geralmente produzem infeces subclnicas persistentes, sendo continuamente excretados na saliva, urina e fezes, condies que favorecem a sua transmisso e disseminao. A exposio humana usualmente ocupacional e freqentemente envolve trabalhadores rurais. As conseqncias da infeco humana variam desde infeces inaparentes, com sintomatologia leve a moderada, at febre hemorrgica fatal. Por isso, esses vrus so genericamente denominados agentes de febres hemorrgicas. Mais de 20 espcies de arenavrus j foram identicadas em vrios continentes; todas, provavelmente, associadas com hospedeiros roedores, e algumas associadas com doena humana. O prottipo dessa famlia o vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV), um agente que infecta roedores silvestres, colnias de roedores cativos e, ocasionalmente, pessoas. O interesse maior no LCMV tem sido como modelo para estudos imunolgicos. Descobertas importantes, como a imunotolerncia, imunopatologia induzida por vrus, reconhecimento de antgenos virais por linfcitos T CD4+ e CD8+, atividade das clulas NK (natural killer), entre outras, vieram de estudos com o LCMV. Os arenavrus que causam doena humana devem ser manipulados em laboratrios com estritas condies de biossegurana para evitar a exposio (nvel 4 de biossegurana).
argentina); Machupo (febre hemorrgica boliviana); Guanarito (febre hemorrgica venezuelana) e Sabi (febre hemorrgica brasileira). Esses e outros arenavrus foram identicados nas Amricas do Norte, Central e do Sul em infeces persistentes em vrias espcies de roedores silvestres e, ocasionalmente, infectando humanos, nos quais podem causar desde infeces subclnicas at febre hemorrgica fatal. O nmero de arenavrus cresce continuamente medida que estudos epidemiolgicos so realizados nos nichos ecolgicos dos seus hospedeiros naturais. A importncia de vrios desses vrus recm-descobertos, para a sade humana e animal, no entanto, difcil de ser estimada no presente.

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos arenavrus esto apresentadas no Quadro 32.3. Os vrions envelopados contm ribossomos celulares no seu interior, o que confere um aspecto granular a sua superfcie. O genoma composto por duas molculas de RNA lineares, ta simples (S = 3.4 kb; and L = 7.2 kb) de polaridade negativa. No entanto, os produtos dos genes localizados na metade 3 dos segmentos genmicos so codicados no sentido genmico, estratgia denominada ambissense. A replicao ocorre no citoplasma, geralmente no-citoltica e freqentemente resulta na produo de partculas defectivas. Como a infeco, na maioria das vezes, no-citoltica, pode favorecer o estabelecimento de infeces persistentes in vivo.
4.1 Classicao 4.3 Ciclo replicativo

A famlia Arenaviridae apresenta um nico gnero (Arenavirus). Os arenavrus so classicados em dois grupos, com base em propriedades genticas e antignicas: os arenavrus do Novo Mundo (Junin, Machupo, Guanarito e vrus Sabi) e os arenavrus do Velho Mundo (LCMV e Lassa vrus). O LCMV o prottipo do segundo grupo, que tambm inclui os arenavrus da frica. Os arenavrus do Novo Mundo so agentes associados com febres hemorrgicas nas Amricas, incluindo o vrus Junin (febre hemorrgica Os vrions se ligam aos receptores na superfcie celular atravs da glicoprotena GP1 e so internalizados por endocitose. A fuso do envelope com a membrana do endossomo dependente de pH e mediada pela GP2, ocorrendo, ento, a liberao dos nucleocapsdeos no citoplasma. A protena L (RNA polimerase dependente de RNA), que est presente no nucleocapsdeo associada ao genoma, sintetiza o mRNA do gene da nucleoprotena (NP) (presente no segmento S) e do gene da protena L (segmento L). Estes genes,
847
Arenaviridae
Vrions pleomrficos (110 a 130 nm), envelopados; Envelope recoberto com peplmeros cubides (10-12 nm); Os vrions contm ribossomos; aparncia de areia (areia = arena); Genoma: 2 molculas de RNA fita simples, polaridade negativa; Um dos segmentos de RNA ambissense; Dois nucleocapsdeos helicoidais; cada um com um RNA; Polimerase viral presente nos vrions; Roedores silvestres so os hospedeiros naturais, Replicao citoplasmtica, geralmente no-citoltica; Infeces persistentes so freqentes in vivo.
Fonte: Scientific American.ICTVdB.
Quadro 32.3. Propriedades biolgicas e moleculares dos arenavrus. direita: fotografia de microscopia eletrnica de um vrion desta famlia.
portanto, so codicados pelo RNA com sentido antigenmico. Os genes que esto localizados na metade 3 dos segmentos genmicos (segmento S = glicoprotenas GPG; segmento L = protena Z) so codicados no sentido do genoma. A sua expresso ocorre pela traduo de RNAs (com o mesmo sentido do genoma) que so produzidos pela transcrio do RNA de sentido antigenmico. Esses RNAs seriam, por denio, de sentido negativo, porm so traduzidos em protenas. Essa estratgia de expresso denominada ambissense e tambm ocorre em alguns membros da famlia Bunyaviridae. O precursor das GPG sofre modicaes ps-translacionais, em que a GPG clivada em GP1 e GP2. O RNA genmico se conjuga com a protena NP, formando o nucleocapsdeo, que transportado at a membrana plasmtica, onde interage com as glicoprotenas e realiza o brotamento. As molculas de GP1 formam homotetrmeros, mantidas unidas por pontes dissulfeto. A GP2, ancorada na membrana, tambm forma homotetrmeros. O complexo da GP1 e da GP2 interage e forma as projees na superfcie dos vrions. Na morfognese das partculas vricas, a GP2 interage com a NP. Os vrions adquirem envelope e so liberados sem, necessariamente, causar lise celular.

A infeco de mamferos com os arenavrus pode cursar de forma aguda ou crnica, com taxas variveis de morbidade e mortalidade. Os
roedores, em particular os camundongos, cobaias e hamsters, so excelentes modelos experimentais para estudos da infeco. Poucas informaes esto disponveis a respeito da infeco de caninos, felinos, animais de produo e de vertebrados no-mamferos por arenavrus. Porm sabe-se que esses animais podem potencialmente participar da epidemiologia da infeco. Embora tenha sido demonstrado que o LCMV replica em mosquitos, alm de outros arenavrus terem sido isolados de artrpodes, o signicado epidemiolgico desses achados permanece incerto. A patogenia dos arenavrus envolve uma replicao inicial no stio de penetrao, geralmente nos pulmes, aps a inalao de aerossis contaminados. Os linfonodos do hilo, tecidos pulmonares e, mais tardiamente, outros rgos parenquimatosos so importantes stios de replicao viral. O LCMV produz infeco e doena humana, eventos que ocorrem quando roedores silvestres infectados entram em contato com pessoas. Esse vrus tambm produz infeces persistentes assintomticas em colnias de camundongos e hamsters. Outras espcies, como ces, coelhos, sunos e primatas, tambm podem ser ocasionalmente infectadas. Em roedores, a durao da viremia parece estar diretamente associada com a idade em que ocorre a infeco. Para os vrus Lassa e LCMV, foi demonstrado que a viremia persiste por toda a vida quando a infeco dos roedores intra-uterina ou ocorre logo aps o nascimento. Quando
848
Captulo 32
roedores adultos so infectados, a viremia transitria. J para o vrus Junin, a infeco intra-uterina determina morte fetal e aborto. A infeco de neonatos resulta em viremia que persiste por toda a vida; j a infeco de adultos pode resultar em viremia transitria ou persistente. Conseqentemente, a presena da infeco persistente decorrente da interao de vrios fatores.
importantes distinguem os astrovrus de outros pequenos vrus RNA de ta simples, como os picornavrus e os calicivrus.
5.1 Classicao
Os astrovrus so classicados em dois gneros: Mamastrovirus e Avastrovirus. Os vrus que pertencem ao gnero Mamastrovirus infectam mamferos e incluem vrus de bovinos (dois sorotipos US1 e US2), felinos, ovinos, sunos, marta e humanos (oito sorotipos). As espcies de mamastrovrus so denidas de acordo com o hospedeiro de origem. Os Avastrovirus infectam aves, incluindo pssaros, galinhas, patos e perus. O vrus da nefrite aviria (ANV), que est associado com nefrite aguda em galinhas, inclui-se nesse gnero. Os astrovrus so espcie-especcos e no apresentam reatividade sorolgica cruzada. A anlise sorolgica de vrios isolados de diferentes espcies (sete de humanos, um de ovinos, um de sunos, trs de bovinos e um de aves) no demonstrou relao antignica entre eles.
5 Astroviridae
Os astrovrus so agentes muito comuns que infectam animais e humanos, mas raramente esto associados com enfermidade clnica. Ocasionalmente so encontrados associados com outros agentes em casos de diarria. Esses vrus foram descobertos, inicialmente, pelo exame ultramicroscpico de fezes de crianas e, posteriormente, foram encontrados nas fezes de vrias espcies, como ces, gatos, ovinos, bovinos, sunos, entre outras. Em aves, manifestaes clnicas intestinais e hepticas associadas com astrovrus tm sido descritas. Patos jovens podem desenvolver hepatite aguda fatal quando infectados. Os astrovrus tambm tm sido implicados como co-fatores em casos de diarria em crianas em pases subdesenvolvidos. O nome da famlia deriva da aparncia de estrela de cinco ou seis pontas que alguns vrions apresentam quando examinados sob microscopia eletrnica. Aspectos moleculares e biolgicos

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos astrovrus esto apresentadas no Quadro 32.4. Esses agentes apresentam vrias caractersticas moleculares e de replicao seme-
Astroviridae
Vrions esfrico-icosadricos, 28 a 30 nm, sem envelope; Alguns vrions apresentam aparncia de estrelas (astro = estrela); Genoma RNA linear polaridade positiva, 6.8 kb; Protena ligada na extremidade 5'; cauda poliA na extremidade 3'; Duas protenas do capsdeo; vrias protenas no-estruturais; Traduo parcial do genoma; produo de mRNA subgenmicos; Replicao citoplasmtica; Prognie viral acumula-se em arranjos cristalinos no citoplasma; A liberao de vrions ocorre por lise celular.
Fonte: www.epa.gov
Quadro 32.4. Propriedades biolgicas e moleculares dos astrovrus. direita, fotografia de microscopia eletrnica de vrus desta famlia.
849
lhantes a outros vrus RNA de polaridade positiva, como os calicivrus.

A patogenia da infeco pelos astrovrus pouco conhecida. No entanto, a replicao desses vrus no intestino tem sido associada com o achatamento das vilosidades e a ocorrncia de diarria. Como a replicao desses vrus ocorre principalmente no epitlio intestinal, grandes quantidades de partculas vricas so excretadas nas fezes. A maioria das infeces subclnica; algumas resultam em diarria discreta autolimitantes principalmente em animais jovens ; e casos de enfermidade severa so raros. Os indivduos adultos dicilmente desenvolvem sinais clnicos devido imunidade adquirida previamente. Os sinais clnicos so mais freqentemente observados em casos de infeces mltiplas. Em infeces experimentais, sunos, felinos e bovinos so menos susceptveis do que ovinos. O astrovrus de peru (TAstV) produz diarria, que persiste por aproximadamente oito dias. Este mesmo vrus foi isolado de pssaros com uma sndrome entrica denominada PEMS (poult enteritis mortality syndrome). O vrus da nefrite aviria (ANV), que infecta galinhas, provoca retardamento do crescimento e nefrite intersticial aguda, sendo um exemplo de astrovrus que causa infeco extra-intestinal. A infeco de patos jovens (menos de seis semanas de idade) freqentemente resulta em hepatite aguda, que fatal em aproximadamente 50% dos casos.

O ciclo replicativo dos astrovrus ainda no foi completamente esclarecido. Porm, sabe-se que, durante a infeco, so produzidos RNAs subgenmicos, alm dos RNA genmicos e antigenmicos. A exemplo de outros vrus RNA de polaridade positiva, a replicao do genoma envolve a sntese de uma molcula de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa). O genoma viral contm trs ORFs. A ORF-1a e a ORF-1b codicam as protenas no-estruturais e esto localizadas nos dois teros prximos extremidade 5. A ORF-2 codica a protena do capsdeo e est localizada no tero prximo extremidade 3. As ORF-1a e 1b esto presentes apenas no RNA genmico e esto separadas por um frameshift dos ribossomos. Os seus produtos (protenas no-estruturais nsP1a e nsP1b) so sintetizados a partir da traduo direta do RNA genmico. Como a ORF-2 est presente tanto no RNA genmico como nos mRNAs subgenmicos, sugere-se que o papel do mRNA subgenmico seja a codicao para a sntese de maior quantidade de protenas estruturais. A ORF-1a codica uma protease, que importante no processamento das protenas virais. A ORF-1b codica a RNA polimerase viral (RNA polimerase dependente de RNA); e a ORF-2 codica um precursor da protena do capsdeo. Esse precursor clivado antes da formao da partcula vrica. As duas protenas no-estruturais nsP1a (protease) e nsP1b (replicase), aps o processamento por proteases virais e celulares, do origem s protenas responsveis pela transcrio do RNA genmico, produzindo o RNA de sentido antigenmico. O RNA antigenmico serve de molde para a produo de mltiplas cpias de um RNA subgenmico (mRNA para produo da protena do capsdeo) e para a produo de RNA genmico, para ser encapsidado na prognie viral. A replicao ocorre inteiramente no citoplasma, os vrions se acumulam em arranjos cristalinos e so liberados aps a lise celular.
6 Filoviridae
Os lovrus foram os primeiros vrus associados com febre hemorrgica em humanos. Esses vrus foram inicialmente identicados em casos da doena em laboratoristas na Alemanha, na dcada de 1960. O vrus foi caracterizado e denominado vrus Marburg, tornando-se o prottipo dessa famlia. A origem do vrus Marburg foi, posteriormente, determinada e, provavelmente, ocorreu pela importao de macacos-verdes africanos de Uganda. Aproximadamente uma dcada depois, o vrus Ebola foi reconhecido como agente etiolgico de surtos de febre hemorrgica no Zaire e no Sudan. Um vrus similar, denominado de Reston, foi introduzido nos EUA por
850
Captulo 32
macacos importados das Filipinas. Desde ento, surtos espordicos de febre hemorrgica associados ao vrus Ebola tm sido descritos em vrios pases africanos. Nesses surtos, tem sido sugerida a participao de um hospedeiro silvestre como introdutor do agente na populao humana. Uma vez introduzido na populao, o vrus se dissemina geralmente por transmisso nosocomial (agulhas, prticas parenterais no-apropriadas) e por contato direto. Em alguns surtos, a taxa de letalidade pode chegar a 80%. O vrus Ebola um dos vrus mais letais de humanos e classicado como um agente de biossegurana nvel 4. Embora o vrus Ebola e os demais lovrus apresentem um carter claramente zoontico, os reservatrios naturais do vrus permanecem desconhecidos e se constituem em um grande desao para os epidemiologistas.

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos lovrus esto apresentadas no Quadro 32.5. Muitos aspectos estruturais e do ciclo replicativo so semelhantes aos das famlias Rhabdoviridae e Paramyxoviridae, tambm componentes da ordem Mononegavirales.

O ciclo replicativo dos lovrus inicia pela ligao da glicoprotena viral (GP) a receptores na superfcie da clula hospedeira. Os vrions so internalizados em vesculas endocticas, a penetrao ocorre pela fuso do envelope com a membrana do endossomo, e o nucleocapsdeo liberado no citoplasma. O RNA genmico de polaridade negativa utilizado como molde para a sntese de mRNAs monocistrnicos individuais para cada gene. Estes mRNA contm cap, so poliadenilados e traduzidos pelos ribossomos celulares. A transcrio e replicao so realizadas pela enzima replicase (RNA polimerase dependente de RNA) presente nos vrions. As protenas virais podem sofrer modicaes aps a traduo. A GP0 (precursora da glicoprotena) clivada em GP1 e GP2, que so altamente glicosiladas. A GP1 e a GP2 se ligam formando heterodmeros. Trmeros destes heterodmeros formam, ento, os peplmeros da superfcie dos vrions. A precursora da glicoprotena secretada (SGP) clivada em SGP e em um peptdeo delta, ambos secre-
6.1 Classicao
A famlia Filoviridae pertence ordem Mononegavirales, juntamente com outros vrus com genoma RNA no-segmentado de polaridade negativa. Na famlia Filoviridae, existem dois gneros: os vrus semelhantes ao Ebola (Ebola-like viruses), com quatro espcies (Zaire, Sudan, Reston e Cte dIvoire), e o gnero dos vrus semelhantes ao Marburg (Marburg-like viruses). No existe reatividade sorolgica cruzada entre os vrus dos diferentes gneros. No entanto, existem alguns epitopos em comum entre os vrus do grupo do Ebola.
Filoviridae
Vrions pleomrficos, filamentosos, em forma de U ou 6; Dimetro uniforme (80 nm); extenso pode chegar a 14.000 nm; Nucleocapsdeo helicoidal (50 nm de dimetro) pode atingir 800 nm; O envelope contm peplmeros (10 nm); Genoma RNA cadeia simples polaridade negativa (19.1 kb); RNA polimerase viral presente nos vrions; Os vrions possuem sete protenas estruturais; Associados com febre hemorrgica; O vrus Ebola um dos mais letais para humanos.
Fonte: Dr F. Murphy. ICTVdB.
Quadro 32.5. Propriedades biolgicas e moleculares dos filovrus. direita, fotografia de microscopia eletrnica de um virion do vrus Ebola.
851
tados. Quando a quantidade de protenas virais no interior da clula atinge um determinado nvel, ocorre a troca de transcrio para replicao. Utilizando o RNA genmico como molde, molculas de RNA de sentido antigenmico (polaridade positiva) so sintetizadas e utilizadas como molde para a produo de mais molculas de RNA de sentido genmico. Estas so encapsidadas por mltiplas cpias da nucleoprotena (NP), formando os nucleocapsdeos, que contm ainda a replicase. Os nucleocapsdeos recm-formados se associam com as glicoprotenas do envelope, que esto inseridas na membrana plasmtica da clula, local onde ocorre o brotamento e o egresso das partculas vricas.
variedade de sinais clnicos, que incluem sinais gastrintestinais, respiratrios, vasculares e neurolgicos. A sndrome hemorrgica caracterizada pela presena de petquias, equimoses, tempo de coagulao aumentado e hemorragias nas mucosas. O exame post-mortem revela a presena de extensas hemorragias nas vsceras. Vacinas contra o vrus Ebola esto em fase de pesquisa e desenvolvimento e podem auxiliar na reduo da morbidade e mortalidade comumente associada com os surtos que ocorrem em comunidades africanas.
7 Birnaviridae
Os membros da famlia Birnaviridae so vrus que infectam vertebrados, insetos, moluscos e crustceos. Os birnavrus de maior importncia so os que infectam aves e peixes, entre eles, o agente da doena de Gumboro, tambm conhecida como doena da bursa de Fabricius. A doena de Gumboro possui grande repercusso sanitria na avicultura comercial de vrios pases.

Os lovrus so responsveis pela forma mais severa de febre hemorrgica em humanos. Embora as taxas de mortalidade em surtos naturais de infeco pelo vrus Ebola sejam altas, a deteco de anticorpos em pessoas sem histrico clnico compatvel com a doena sugere que esta infeco nem sempre est associada com sinais clnicos. Alternativamente, a existncia de outros vrus antigenicamente relacionados ao vrus Ebola poderia explicar a presena desses anticorpos em populaes saudveis. A patogenia do vrus Ebola tem sido extensivamente estudada em modelos experimentais, como macacos, cobaias e camundongos. Atualmente, os modelos mais utilizados so macacos e cobaias, pois a patogenia nessas espcies parece ser mais semelhante quela observada em humanos. Em macacos, a virulncia dos lovrus bastante varivel, similarmente ao que ocorre em humanos. Entre os vrus semelhantes ao Ebola, os vrus Zaire so mais virulentos do que os Reston. A infeco pelos vrus Zaire progride rapidamente, sendo fatal entre quatro e oito dias aps a infeco. Os sinais da infeco pelos lovrus incluem febre, mialgia, calafrios e depresso, aps um perodo de incubao de 4 a 10 dias. Posteriormente, os sinais clnicos reetem um envolvimento multissistmico, o que pode determinar uma
7.1 Classicao
A famlia Birnaviridae apresenta trs gneros: Aquabirnavirus, Avibirnavirus e Entomobirnavirus. No gnero Aquabirnavirus, esto classicados vrus que infectam peixes, moluscos e crustceos. Entre estes se destacam o vrus da pancreatite necrtica infecciosa (INPV) que infecta peixes, o vrus Tellina (TV-2) e o vrus yellowtail ascites (YTAV). O gnero Avibirnavirus abriga os vrus que infectam as aves (vrus da doena da bursa de Fabricius IBDV) e o gnero Entomobirnavirus congrega vrus que infectam insetos. Tanto o INPV como o IBDV possuem diferentes sorotipos.

As principais propriedades biolgicas e moleculares dos birnavrus esto apresentadas no Quadro 32.6. O genoma composto por duas molculas de RNA de ta dupla (segmentos A e B). Cada segmento codica uma poliprotena, que posteriormente clivada em produtos funcionais.
852
Captulo 32
Birnaviridae
Vrions esfrico-icosadricos, sem envelope, 60 nm; Capsdeo icosadrico, 5 protenas, 162 capsmeros; Genoma RNA de fita dupla, 2 segmentos (A e B); Protena (VPG) na extremidade 5'; sem poliA; Segmento A= 3.1kb, protenas do capsdeo + protease; Segmento B= 2.8 - replicase viral; Replicam no citoplasma; Transcrio/replicao no interior dos capsdeos; IBDV= infecta linfcitos B, doena de Gumboro em aves.
Fonte: Dr S. McNulty; qub.ac.uk
Quadro 32.6. Propriedades biolgicas e moleculares dos birnavrus. direita, fotografia de microscopia eletrnica de vrions desta famlia.
Existe uma pequena ORF adicional presente no segmento maior (A). As protenas do capsdeo e as protenas no-estruturais so codicadas no segmento A; a RNA polimerase dependente de RNA codicada no segmento B. O segmento A codica atravs da ORF 1 uma protena de 17 kDa (VP5), cuja funo desconhecida; a ORF 2 codica uma poliprotena de 106 kDa que processada, originando trs protenas. O primeiro produto a VP2, que a maior protena do capsdeo. O segundo a protena no-estrutural (NS), chamada de VP4, que uma protease que sofre truncamento e clivagem adicional; e a VP3, que a protena interna do capsdeo. A NS assim denominada nos aquabirnavrus. Nos demais gneros, essa protena denominada VP4. O segmento genmico B (2,8 kb) codica uma nica protena de 94 kDa (VP1), a partir da ORF 3, que a RNA polimerase dependente de RNA.
presente nos vrions, formando os mRNAs para a sntese protica. Cada segmento transcrito em um nico mRNA, cuja traduo resulta em uma poliprotena, que clivada logo aps a traduo. O mRNA do segmento A codica quatro protenas, sendo duas protenas estruturais do capsdeo, uma protease e outra de funo desconhecida. O segmento B codica a replicase viral. Os RNAs de sentido positivo tambm servem de molde para a sntese de molculas de RNA de sentido negativo. As molculas de cadeia dupla (RNA positivo + RNA negativo) so, ento, includas como genoma nas partculas vricas, juntamente com a replicase viral. A morfognese ocorre no citoplasma, e as partculas vricas maduras so liberadas aps a lise celular.
7.4 Birnavrus de importncia veterinria 7.4.1 Vrus da doena de Gumboro

A doena de Gumboro causada por um vrus da famlia Birnaviridae (infectius bursal disease virus, IBDV), ocorre em aves jovens e apresenta a bursa de Fabricius como rgo-alvo, sendo tambm conhecida como doena infecciosa da bursa de Fabricius (IBD). Esta enfermidade possui distribuio mundial e tem causado grandes perdas econmicas indstria avcola em vrios pases, por determinar mortalidade e imunossupresso

A replicao dos birnavrus ocorre no citoplasma das clulas hospedeiras. A penetrao ocorre por endocitose e a estrutura dos vrions desestabilizada pelo pH cido presente no interior dos endossomos. A transcrio e a replicao do genoma ocorrem ainda no interior de capsdeos parcialmente desintegrados ou em capsdeos pr-formados. A primeira etapa a transcrio das cadeias de RNA negativas pela transcriptase
853
nas aves infectadas. Uma importante conseqncia da infeco de frangos jovens pelo IBDV a imunossupresso. Alm disso, a infeco com cepas virulentas pode determinar taxas de mortalidade elevadas. As medidas de controle envolvem a vacinao e medidas gerais de biossegurana. A doena de Gumboro foi inicialmente descrita, em 1962, por Cosgrove, na cidade de Gumboro, nos Estados Unidos, da a sua denominao. Nos ltimos anos, a emergncia de variantes antignicas e de cepas de alta virulncia, que podem produzir doena clnica mesmo em animais vacinados, tem ressaltado a importncia desta doena. Diferentes cepas do IBDV foram identicadas nos EUA (entre 1986 e 1987), na Blgica e nos pases baixos (em 1987). As cepas de alta virulncia foram descritas na Europa em 1986. Tanto as cepas clssicas como as mais virulentas esto presentes em todos os pases, com exceo da Amrica do Norte e da Austrlia, pois nestes dois pases predominam as cepas variantes (maior virulncia) do IBDV. O IBDV apresenta dois sorotipos. No sorotipo 1, so classicados os isolados patognicos do IBDV, que apresentam as clulas linfides da bursa como alvo para replicao. Os IBDV do sorotipo 2 so isolados de perus e, geralmente, so apatognicos. Pelas diferenas antignicas entre os sorotipos, os frangos expostos ao sorotipo 2 no possuem proteo contra uma infeco posterior por um IBDV do tipo 1. As galinhas so os nicos hospedeiros conhecidos que desenvolvem a forma clnica da infeco pelo IBDV, porm perus e patos tambm podem ser infectados. O vrus transmitido pela via fecal-oral, com a ingesto de fezes e/ou outros materiais orgnicos contaminados, ou, ainda, verticalmente, via ovo. O vrus bastante resistente s condies ambientais, sobrevive a 60C por 60 minutos e em pH entre 3 e 9, o que representa um entrave para o combate infeco. Aps a ingesto de material contaminado, o vrus pode ser detectado em macrfagos e em clulas linfticas do duodeno, jejuno e ceco em quatro ou cinco horas. O duodeno, jejuno e ceco so os rgos de replicao primria do vrus, que pode chegar ao fgado pelo sistema porta. A
presena do vrus no fgado pode ser detectada cinco horas aps a infeco, onde as clulas de Kpfer fagocitam uma quantidade considervel de partculas vricas. A partir desses stios de replicao inicial, o vrus invade a corrente sangnea e se dissemina por vrios rgos, incluindo a bursa. Neste rgo linfide, os linfcitos B imaturos, presentes nos folculos, so as principais clulas-alvo para a replicao viral. Aproximadamente 13 horas aps a infeco, a maioria dos folculos da bursa apresenta antgenos virais. Uma segunda viremia ocorre aproximadamente 15 a 16 horas aps a infeco. Os sinais clnicos, quando ocorrem, so observados em 64 a 72 horas aps a infeco. A severidade dos sinais clnicos e das leses depende da virulncia da cepa viral, da raa (corte ou postura), da idade e do status imunitrio dos animais. O perodo de incubao da doena muito curto, e os sinais clnicos so observados entre dois e trs dias ps-exposio. As leses na bursa de Fabricius so severas e geralmente permanentes nas aves infectadas, produzindo um quadro severo de imunossupresso. Essas aves apresentam maior susceptibilidade a outros agentes infecciosos (adenovrus, reovrus, micoplasma spp., E. coli, Salmonella spp., coccdeos e outros) e no respondem adequadamente a vacinaes. Duas formas da infeco so descritas: clnica e subclnica. A forma clnica ou aguda da doena ocorre em aves com trs a seis semanas de idade, perodo de desenvolvimento intenso da bursa de Fabricius. Essas aves apresentam depresso, anorexia, diarria, penas eriadas, tremores e desidratao por trs a quatro dias. A forma subclnica ocorre em aves com idade inferior a trs semanas e muito importante, pois causa imunossupresso severa. As aves mais jovens apresentam imunidade passiva, o que explica a menor incidncia de doena clnica nessa faixa etria. Aves com mais de seis semanas de idade raramente desenvolvem sinais clnicos, porm produzem anticorpos contra o vrus. Quando no h mortalidade, as aves se recuperam dentro de cinco a sete dias. Freqentemente os lotes no so uniformes, pois h baixo ganho de peso e menor converso alimentar. Quando o vrus introduzido na propriedade, a
854
Captulo 32
taxa de mortalidade do surto pode ser superior a 90%. No entanto, taxas de mortalidade entre 20 e 30% so mais comuns. Na necropsia, a atroa da bursa caracterstica, os rins encontram-se aumentados, com o acmulo de uratos e uma provvel deposio de imunocomplexos nos glomrulos. Cepas de alta virulncia causam leses severas na bursa e em outros rgos linfides, como o timo, bao e a medula ssea. As alteraes na bursa variam de acordo com a extenso e progresso da leso. Dois a trs dias aps a infeco, a bursa apresenta edema e um transudato gelatinoso sobre a superfcie serosa. A partir do quinto dia aps a infeco, o transudato e o edema comeam a desaparecer, e a bursa retorna a sua colorao acinzentada. Nos casos de doena aguda, petquias so observadas nos msculos peitorais e nas coxas, pois o IBDV interfere com mecanismos de coagulao do sangue. O fgado pode apresentar-se edemaciado, e os intestinos com quantidade aumentada de muco. Microscopicamente, a principal alterao na arquitetura folicular da bursa ocorre em conseqncia da degenerao e necrose dos linfcitos na regio medular e da apoptose de clulas na regio central dos folculos. Estudos demonstraram que a imunodepresso induzida pelo IBDV se deve, em parte, apoptose. Os linfcitos foliculares so substitudos por heterlos, restos celulares necrticos e por clulas reticuloendoteliais hiperplsicas. medida que a inamao regride, formam-se cavidades csticas na regio medular folicular, sinais de necrose e de fagocitose de clulas inamatrias e broplasia do tecido conjuntivo interfolicular. O diagnstico da infeco deve ser baseado no quadro clnico, associado com as leses observadas na necropsia e no exame histopatolgico da bursa, alm do histrico do lote. A microscopia eletrnica pode ser empregada para demonstrar o vrus nos rgos-alvo. Antgenos virais podem ser demonstrados na bursa de Fabricius por imunouorescncia, imunistoqumica, precipitao em gel de gar ou por testes imunoenzimticos. O IBDV pode ser isolado pela inoculao em ovos embrionados livres de anticorpos anti-IBDV. Anticorpos podem ser detectados por ELISA na rotina. Para a caracterizao de isola-
dos do IBDV, utiliza-se o teste de soroneutralizao (SN), que capaz de diferenciar os isolados em sorotipo e subtipo dentro do sorotipo 1. A tcnica de RT-PCR tem sido cada vez mais utilizada para o diagnstico. Quando associada com anlise de restrio enzimtica (RFLP), permite a identicao rpida das cepas de alta virulncia e a caracterizao de isolados entre os seis grupos moleculares do IBDV. Em estdios mais avanados da infeco, difcil conrmar o diagnstico somente pelo exame da bursa atroada. Outras doenas que cursam com alteraes similares, como a doena de Marek, micotoxicoses, coccidioses, sndrome hemorrgica, hepatite por corpsculos de incluso e bronquite infecciosa, devem ser consideradas no diagnstico diferencial. Pela grande capacidade de disseminao do IBDV, as medidas de preveno e controle dessa enfermidade requerem uma abordagem bem coordenada, envolvendo medidas de biossegurana e vacinao. No ambiente, o vrus pode persistir por quatro meses. A vacinao deve ser utilizada para proteger os frangos nas primeiras semanas de vida. Para garantir altos ttulos de anticorpos passivos, as matrizes poedeiras devem receber vacinas inativadas com adjuvante oleoso quando completarem 18 semanas de vida, com revacinaes anuais. Algumas vacinas so aplicadas pela via oral, adicionadas na gua dos bebedouros. Os pintos so imunizados com uma vacina atenuada, iniciando a aplicao com uma ou duas semanas de vida, porm a proteo comprometida nessas aves pela presena de imunidade passiva, que pode permanecer por quatro a sete semanas e neutralizar o vrus vacinal. A proteo dos frangos frente a cepas de alta virulncia tambm pode ser comprometida quando os antgenos vacinais utilizam cepas altamente atenuadas. Por outro lado, a utilizao de cepas pouco atenuadas pode no ser segura, e os animais apresentarem infeco subclnica, acompanhada de leso na bursa e imunossupresso. Vacinas recombinantes esto em desenvolvimento, utilizando alguns poxvrus, herpesvrus (vrus da doena de Marek) e togavrus (vrus Semliki Forest) como vetores. Vacinas de subunidade, utilizando a protena VP2 como antgeno, tambm esto sendo estudadas
855
e apresentaram uma resposta satisfatria. Vacinas de DNA tambm esto em fase de pesquisa e desenvolvimento. No entanto, nenhuma dessas vacinas est disponvel no comrcio.

A infeco per se dos salmes com o aquabirnavrus no suciente para causar a doena. A ocorrncia de manifestaes clnico-patolgicas depende da cepa viral, do ttulo do inculo, das condies ambientais e da idade dos peixes. O efeito da densidade dos peixes na transmisso e ocorrncia da doena ainda controverso. A infeco pelo INPV em alevinos de salmondeos cursa com alta morbidade e mortalidade. Alm disso, desde a dcada de 1980, observou-se que a infeco tambm tem sido fatal em salmes com mais de dois anos de idade (juvenis). A morte geralmente sobrevm 2 a 3 meses aps o contato ou transferncia dos salmes com a gua do mar. Os sinais da infeco pelo INPV caracterizamse por um aumento repentino e progressivo na mortalidade diria de peixes, acompanhada de pigmentao escurecida, exoftalmia, distenso abdominal, hiperventilao, geralmente prxima superfcie, e natao errtica, em espiral, sobre seu prprio eixo. A mortalidade total pode variar de menos de 10% at acima de 90%. Alm disso, comum a infeco persistente e assintomtica em salmes adultos. Nestes casos, o vrus encontra-se associado aos neutrlos e moncitos da corrente sangnea e do rim. O estado de portador cursa com reduo do apetite e, conseqentemente, com reduo na produo. Alm disso, a mortalidade em salmes com infeco assintomtica cinco vezes maior do que em salmes no-infectados. Acredita-se que aproximadamente 90% dos peixes que sobrevivem infeco tornam-se portadores e mantm o INPV por vrios anos. No entanto, a persistncia do vrus pode ser afetada pela espcie de salmondeo infectada e parece diminuir gradativamente com o tempo e com a quantidade de anticorpos neutralizantes. Outras espcies de peixes tambm podem manter o INPV no ambiente aqutico. Condies de estresse reativam a infeco nos peixes infectados de forma persistente. A resistncia infeco depende da idade e da temperatura da gua, e ocorre aproximadamente aos 1.500 graus-dias, valor esse obtido pela
7.4.2 Vrus da pancreatite necrtica infecciosa

A pancreatite necrtica infecciosa (infectious necrotizing pancreatitis, INP) uma doena infecto-contagiosa de grande importncia na produo de diferentes espcies de salmondeos em diversos pases da Unio Europia, sia, Amrica do Norte e Amrica do Sul. A doena foi descrita, pela primeira vez, nos EUA, em 1955, em trutas de gua doce; porm, relatos compatveis com a doena datam da dcada de 1940. Na Europa, a doena foi descrita na Inglaterra, em 1971, em trutas-arco-ris (Oncorhynchus mykiss). O agente etiolgico da INP um vrus noenvelopado, pertencente ao gnero aquabirnavirus, famlia Birnaviridae. Os isolados do vrus da INP (INPV) possuem uma grande variabilidade antignica e podem ser classicados em dois sorogrupos imunologicamente distintos: sorogrupos A e B. A grande maioria dos isolados do vrus pertencem ao sorogrupo A, que possui, pelo menos, nove sorotipos com diferentes nveis de patogenicidade e virulncia.
O INPV transmitido horizontalmente, por meio de fezes, urina e secrees, e tambm verticalmente, por meio das ovas infectadas. Algumas espcies de aves e mamferos aquticos, caranguejos e protozorios podem servir como vetores mecnicos do vrus. Experimentalmente, a doena pode ser transmitida pela ingesto do vrus, imerso em gua contaminada ou pela injeo do vrus nos salmes. A doena ocorre com freqncia em trutasarco-ris (Oncorhynchus mykiss), trutas-brool (Salvelinus fontinalis), trutas-marrons (Salmo trutta), salmes do Atlntico (Salmo salar) e diversas outras espcies de salmes do oceano Pacco (Oncorhynchus spp.).
856
Captulo 32
multiplicao da idade do peixe (em dias), pela temperatura mdia da gua (em C) durante a sua vida. No entanto, salmes do oceano Atlntico, criados em cativeiro, so susceptveis infeco logo aps a transferncia da gua doce para a gua salgada, que ocorre aproximadamente aos dois anos de idade. A mortalidade mais rpida e maior em temperaturas em torno de 10 a 14C; em temperaturas acima de 14C, a mortalidade signicante, mas reduzida. As leses patolgicas observadas na INP caracterizam-se por palidez heptica e esplnica; o estmago e o intestino encontram-se repletos de uido mucide; observam-se hemorragias petequiais ao longo do tecido pilrico e pancretico. As clulas acinares do pncreas apresentam necrose intensiva, caracterizada por picnose, cariorrexia, incluses intracitoplasmticas e inltrao de macrfagos e clulas polimorfonucleares. O piloro, a ceca do piloro e tambm o intestino anterior apresentam necrose intensa. H desprendimento do epitlio intestinal, o qual se combina com o muco para formar um exsudato catarral esbranquiado. Observa-se tambm degenerao do tecido renal hematopoitico, tecido excretor e fgado.
e a utilizao de gua de boa qualidade (isto , proveniente de riachos ou poos articiais), na qual impossvel a introduo de salmondeos (ou outras espcies de peixes) portadores do INPV. Deve-se tambm evitar condies de manejo estressantes. Em criatrios, guas contaminadas podem ser tratadas com cloro, oznio e radiao ultravioleta, porm a eccia desses tratamentos inuenciada por diversos fatores, como presena de matria orgnica. Alm disso, recomenda-se a desinfeco rotineira dos ovos com desinfetantes ionofros tamponados. A utilizao de vacinas para o controle ainda incipiente. Vacinas inativadas estimulam uma boa resposta imune quando administradas via injeo ou imerso, mas no conferem proteo quando administradas com o alimento ou por inltrao hiperosmtica. Vacinas vivas atenuadas apresentam problemas de ordem legal relacionados ao controle da disseminao do vrus e interferncia com mtodos de diagnstico. Vacinas de subunidades e vacinas recombinantes esto sendo testadas para controle da INP, bem como o desenvolvimento de peixes geneticamente resistentes infeco pelo INPV.
8 Bornaviridae
7.4.2.3 Diagnstico
O diagnstico da infeco pelo INPV dos salmes baseia-se no isolamento viral em cultivo celular, seguido da identicao imunolgica do vrus por meio de soroneutralizao (SN), ELISA, imunouorescncia (IFA) ou imunoperoxidase (IPX). Mtodos moleculares de diagnstico, como a RT-PCR, executadas diretamente em amostras clnicas, tambm tm sido desenvolvidos e apresentam alto grau de concordncia e especicidade. Antgenos virais tambm podem ser detectados por meio de imunohistoqumica em tecidos preservados em formalina. A famlia Bornaviridae constituda por vrus RNA de ta simples e polaridade negativa que infectam vertebrados. O membro mais importante dessa famlia o vrus da doena de Borna (BDV), que acomete principalmente os eqinos e ovinos. A denominao da doena se refere cidade alem, onde vrios cavalos morreram de doena neurolgica em 1895. Esta enfermidade foi, ento, denominada de doena de Borna (BD), e o agente identicado, em 1926, foi denominado vrus da doena de Borna (BDV). Nas ltimas dcadas, vrus com caractersticas semelhantes tm sido identicados como patgenos de humanos, porm ainda esto em processo de caracterizao.

O controle da infeco se baseia na adoo de medidas prolticas, para evitar a introduo do agente na criao, que consistem na obteno de ovas provenientes de matrizes livres de INPV
8.1 Classicao
A famlia Bornaviridae pertence ordem Mononegavirales, juntamente com os vrus das fam-
857
lias Filoviridae, Rhabdoviridae e Paramyxoviridae. A famlia Bornaviridae possui um nico gnero, o Bornavirus, cujo nico membro o BDV. Existem diferentes isolados do BDV, obtidos de diferentes espcies e em diferentes locais. No entanto, a anlise logentica revela que esses isolados so altamente relacionados entre si e apresentam uma alta reatividade sorolgica cruzada, justicando o seu agrupamento no mesmo gnero.

Os bornavrus possuem vrions esfricos, envelopados, com 80 a 100 nm de dimetro. Possuem uma molcula de RNA de ta simples, sentido negativo, de aproximadamente 8.9 kb como genoma. A superfcie do envelope recoberta por peplmeros de aproximadamente 7 nm. O ncleo dos vrions (nucleocapsdeo) parece no possuir uma forma bem denida. Ao contrrio das outras famlias que compem a ordem Mononegavirales, os bornavrus replicam no ncleo, apresentam unidades de transcrio sobrepostas e alguns transcritos sofrem processamento (splicing) pela maquinaria da clula hospedeira. As propriedades gerais dos bornavrus esto resumidas no Quadro 32.7. O genoma dos bornavrus (RNA de polaridade negativa, 8.9 kb) apresenta seis ORFs, que esto divididas em trs unidades de transcrio. As outras trs ORFs so geradas por splicing. A ORF da RNA polimerase se localiza na regio prxima
extremidade 5; a ORF da nucleoprotena est situada prxima extremidade 3. As protenas codicadas pelas ORFs so: ORF 1 nucleoprotena (p40), ORF 2 p24 uma fosfoprotena (cofator da polimerase), ORF 3 p10, uma protena de 9 kDa cuja funo desconhecida, porm aparentemente um regulador negativo da polimerase ou tem funo na importao para o ncleo das demais protenas virais; est em posio sobreposta a ORF 2; ORF 4 protena da matriz (p16) de aproximadamente 16 kDa; ORF 5 glicoprotena de 56 kDa, e ORF 6 RNA polimerase (p190). As ORFs 4, 5 e 6 so geradas de uma mesma unidade de transcrio, seja por sobreposio em diferentes fases de leitura seja por splicing.

Os bornavrus so os nicos vrus RNA de polaridade negativa no-segmentados que replicam no ncleo das clulas hospedeiras. Estudos tm demonstrado que tanto o RNA de polaridade positiva como o RNA de polaridade negativa so encontrados no ncleo, porm em localizaes distintas. Cadeias de RNA de polaridade positiva esto preferencialmente localizados prximos aos nuclolos, enquanto os de polaridade negativa podem ou no estar prximos aos nuclolo, sugerindo um papel dessas organelas na replicao do BDV. Os bornavrus penetram na clula hospedeira por endocitose, seguida de fuso do envelope
Bornaviridae
Vrions esfricos, com envelope (80-90 nm); Envelope com peplmeros (7 nm); Capsdeo sem morfologia definida; Genoma RNA fita simples, polaridade negativa, 8.9 kb; Genes sobrepostos; 6 ORFs; Alguns mRNAs sofrem splicing; Replicao do genoma ocorre no ncleo; Infeco in vitro geralmente no-citoltica; Membro principal: vrus da doena de Borna (eqinos).
Fonte: Dr W.Garten. Inst.Virol.Marburg.
Quadro 32.7. Propriedades biolgicas e moleculares dos bornavrus. direita, est uma ilustrao esquemtica de um vrion.
858
Captulo 32
com a membrana endoctica. A gp-43 est presente no envelope e na superfcie das clulas infectadas e provavelmente fuso. A gp-84 parece estar envolvida na ligao do vrus aos receptores celulares. Os detalhes da replicao dos bornavrus no esto bem esclarecidos. Alguns pesquisadores sugerem que exista um mecanismo de regulao do genoma atravs de digesto enzimtica na extremidade 5, envolvendo a deleo de partes do genoma para limitar a expresso gnica. Sugere-se que esta estratgia seja benca aos bornavrus, pois permitiria o estabelecimento de infeco persistente, sem determinar efeitos citolticos.

O BDV infecta primariamente neurnios e clulas da glia, nas quais no produz efeito citoptico aparente. Constitui-se, portanto, em um vrus neurotrpico. O BDV apresenta nveis de replicao e produo de prognie viral inferiores quando comparado com outros vrus. Outra caracterstica importante desse vrus a sua capacidade de permanecer no sistema nervoso central (SNC) de animais infectados em infeces persistentes.
8.5 Doena de Borna

A doena de Borna uma enfermidade severa, de curso geralmente fatal, caracterizada pelo desenvolvimento de distrbios nervosos em eqinos e ovinos, causada pelo BDV. A enfermidade cursa com uma meningoencefalite no-supurativa. A importncia dessa enfermidade tem aumentado nos ltimos anos, pois uma srie de estudos tem demonstrado uma associao do bornavrus com desordens neuropsiquitricas. A distribuio geogrca da infeco pelo BDV desconhecida. A infeco natural tem sido descrita na Europa, na Amrica do Norte e em parte da sia (Japo e Israel). No entanto, deve-se considerar que a falta de reagentes para diagnstico certamente contribui para o pouco conhecimento sobre essa doena em muitos pases. Assim, considera-se que esse vrus possa ter uma distribuio maior do que a relatada at o presente.
Originalmente, o BDV foi identicado como agente de enfermidade em eqinos. No entanto, o vrus tambm tem sido isolado de ovinos, lhamas, felinos e bovinos. Vrias espcies animais j foram infectadas experimentalmente, o que sugere que este vrus seja capaz de infectar virtualmente todos os animais de sangue quente, incluindo primatas. Anticorpos anti-BDV tm sido detectados tanto em animais como em humanos sem sinais clnicos, o que indica que as infeces subclnicas so, provavelmente, mais prevalentes do que as clnicas. De fato, acredita-se que a maioria das infeces pelo BDV em eqinos so assintomticas, pois anticorpos anti-BDV so freqentemente encontrados em animais sem histrico clnico da enfermidade. No se conhecem possveis reservatrios naturais do BDV, nem a forma de transmisso. O BDV penetra provavelmente pela via nasal, replica nos neurnios localizados prximos ao stio de entrada e migra atravs de transporte axonal at o sistema nervoso central (SNC), provavelmente pelo sistema olfatrio. No SNC, o BDV apresenta tropismo pelo sistema lmbico, incluindo o hipocampo. O sistema lmbico est envolvido na regulao da memria, das interaes ambientais e das emoes e parece ter um papel importante em algumas desordens neuropsiquitricas em humanos. Tardiamente aps a infeco, o BDV migra via transporte axonal antergrado para o sistema nervoso perifrico, infectando clulas como astrcitos, oligodendrcitos e as clulas de Schwann. rgos no-neurais podem ser infectados posteriormente. A presena de cidos nuclicos e de protenas do BDV em clulas mononucleares perifricas (PBMC) podem indicar uma disseminao pela via hematgena. A infeco experimental em roedores resulta em persistncia viral e est associada com a presena do vrus na saliva, na urina e nas fezes. Levantou-se a hiptese de que roedores poderiam ser os hospedeiros naturais do agente. No entanto, o BDV ainda no foi demonstrado em infeces naturais em roedores. Em eqinos e em ovinos, a infeco caracterizada por alteraes comportamentais agressivas, que progridem para a paralisia e inanio em poucas semanas. A patogenia da infeco parece
859
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Ebola Hemorrhagic Fever. Atlanta, GA: CDC. Disponvel em: http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/spb/mnpages/ebola.htm. Acesso em: 05 dez. 2006. CHISARI, F.V.; FERRARI, C. Viral Hepatitis. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.31, p.745-778. HOW, L.T.; BROKER, T.R. Small DNA Tumor Viruses. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.12, p.267-301. COLE, C.N. Polyomavirinae: The Viruses and Their Replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.63, p.1997-2025. DOHERTY, P.C.; AHMED, R. Immune Responses to Viral Infection. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.7, p.143-161 . FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. GANEM, D. Hepadnaviridae and Their Replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.85, p.2703-2737. GANEM, D.; SCHNEIDER, R.J. HEPADNAVIRIDAE: THE VIRUSES AND THEIR REPLICATION. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.36, p.1285-1321. GARCIA, J.; URQUHART, H.; ELLIS, A.E. Infectious pancreatic necrosis vrus establishes an assymptomatic carrie state in kidney leukocyte of juvenile Atlantic cod, Gadus morhua L. Journal of Fish Disease, v.29, p.409-413, 2006. LUKERT, P.D.; SAIF, Y.M. Infectious Bursal Disease. In: SAIF, Y.M. et al. Diseases of poultry. 11. ed. Ames: IO: Iowa State University Press, 2003. Cap.6, p.161-179. MATSUI, S.M.; GREENBERG, H.B. Astroviruses. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.26, p.811-824. McALLISTER, P.E. Salmonid sh viruses. In: STOSKOPF, M.K. (ed). Fish medicine. Philadelphia: W.B. Saunders Co., 1993. Cap.38, p.380-408. MURPHY, F.A. et al. Arenaviridae. In: ___. Veterinary virology. 3. ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 32, p. 485-464. MURPHY, F.A. et al. Astroviridae. In: ___. Veterinary virology, 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 37, p.543-546. MURPHY, F.A. et al. Birnaviridae. In: ___. Veterinary virology, 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 25, p.405-409. MURPHY, F.A. et al. Birnaviridae. In: ___. Veterinary virology.
estar ligada doena mediada pelo sistema imunolgico. Os sinais clnicos mais freqentemente observados em cavalos so: excitao, ataxia, postura anormal, opisttono, nistagmo, cegueira, paralisia e morte. Por outro lado, a infeco pode tambm ser assintomtica, persistente ou crnica. Roedores tm sido utilizados como modelo experimental para estudos de patogenia da infeco pelo BDV. Ratos adultos apresentam hiperatividade, que coincide com a presena de produtos virais em neurnios do sistema lmbico e inltrao de clulas mononucleares no crebro. Em animais que sobrevivem infeco, embora a inamao regrida em algumas semanas, o vrus persiste e os animais podem apresentar diferentes sinais neurolgicos associados com alteraes no SNC. No entanto, quando ratos so infectados quando neonatos, a doena caracterizada por crescimento retardado, distrbios de comportamento e apetite depravado. Estes animais no so capazes de montar uma resposta imune celular contra o vrus. Primatas infectados experimentalmente apresentam distrbios comportamentais nos aspectos social e sexual. Alguns destes apresentam relaes anormais de dominncia e no conseguem copular. Os macacos rhesus infectados experimentalmente se tornam inicialmente hiperativos e, posteriormente, apticos e hipocinticos. O diagnstico diferencial de doenas neurolgicas em eqinos deve, necessariamente, considerar a possibilidade de doena de Borna, sobretudo em reas onde a doena j foi diagnosticada. O diagnstico laboratorial pode ser realizado com testes sorolgicos, por imunouorescncia, Western blot, radioimunoprecipitao e ELISA.
BOWDEN, T.J. et al. Experimental challenge of post-smolts with IPNV: mortalities do not depend on population density. Journal of Fish Disease, v.26, p.309-312, 2003. BOWDEN, T.J.; SMAIL, D.A.; ELLIS, A.E. Development of a reproducible infectious pancreatic necrosis virus challenge model for Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Disease, v.25, p.555-563, 2002.
860
3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 25, p.405-409. MURPHY, F.A. et al. Filoviridae. In: ___. Veterinary virology. 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 28, p.447-453. MURPHY, F.A. et al. Papovaviridae. In: ___. Veterinary virology. 3.ed. San Diego: Academic Press, 1999. Cap 20, p.335-342. MURRAY, A.G.; BUSBY, C.D.; BRUNO, D.W. Infectious pancreatic necrosis virus in scottish atlantic salmon farms, 19962001. Emerging Infectious Diseases, v.9, p.455-460, 2003. PETERS, C.J. et al. Filoviridae: marburg and ebola viruses. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.39, p.1161-1176. PETERS, C.J.; LEDUE, J.W. An introduction to Ebola: the virus and the disease. The Journal of Infectious Diseases, v.179, p.ixxvi, 1999. PETERSON, A.T.; BAUER, J.T.; MILLS, J.N. Ecologic and geographic distribution of lovirus disease. Emerging Infectious Diseases, v.10, p.40-47, 2004.
Captulo 32
ROBERTS, R.J.; PEARSON, M.D. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Disease, v.28, p.383-390, 2005. SHOPE, R.E.; MEEGAN, J.M. African hemorrhagic fevers caused by marburg and ebola viruses. In: EVANS, A.S.; KASLOW, R.A. (eds). Viral infections of humans: epidemiology and control. 4.ed. New York: Plenum, 1997. Cap.5, p.139-148. SOUTHERN, P.J. Arenaviridae: the viruses and their replication. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. Cap.49, p.1505-1519. VAN DEN BERG, T.P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology, v.29, p.175-194, 2000. ZINKERNAGEL, R.M. Virus-induced immunopathology. In: NATHANSON, N. (ed). Viral pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. Cap.8, p.163-179.
ABREVIATURAS E SIGLAS
A
AAV: vrus adeno-associado. AcM: anticorpo monoclonal. ADCC: citotoxicidade celular dependente de anticorpos. ADE: infeco mediada por anticorpos. AdV: adenovrus. ADV: vrus da doena de Aujeszky (herpesvrus suno 1, SuHV1 ou vrus da pseudoraiva, PRV). AE: encefalomielite das aves. AEC: aminoetilcarbazol. AEV: vrus da encefalomielite das aves. AGID: imunodifuso em gar. AHSV: vrus da peste eqina. AIDS: sndrome da imunodecincia humana adquirida. AIG: anemia infecciosa das galinhas. AiV: vrus Aichi. AIV: vrus da inuenza aviria. AKAV: vrus Akabane. AlHV-1: herpesvrus alcefaline (vrus da febre catarral maligna, forma africana). ALT: alanina aminotransferase. ALV: vrus da leucose aviria. AMDV: vrus da doena das martas Aleutian. AmPV: metapneumovrus avirio. ANV: vrus da nefrite aviria. ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. AP: fosfatase alcalina. APC: clula apresentadora de antgeno. APMV: paramixovrus avirio. APV: pneumovrus avirio.
ARPyV: poliomavrus de ratos atmicos. ARV: ortoreovrus de aves. ARV-A: aquareovrus A. AS: cido silico. ASF: peste suna africana. ASFV: vrus da peste suna africana. ATP: adenosina trifosfato. ATPase: atividade de hidrlise de ATP.
B
B19: parvovrus humano. BAdV: adenovrus bovino. BALT: tecido linfide associado aos brnquios. BCG: bacilo de Calmette e Guerin. BCoV: coronavrus bovino. BCR: receptor de linfcitos B. BD: doena de Borna. BDV: vrus da doena da fronteira (ovinos) e tambm vrus da doena de Borna (eqinos). BEFV: vrus da febre efmera dos bovinos. BEV: enterovrus bovino. BeV: vrus Berne. BFV: vrus da doena das penas e bicos dos psitacdeos. BHK-21: clula de rim de hamster jovem. BHM: mamilite herptica bovina. BIV: vrus da imunodecincia bovina. BKPyV: vrus BK. BKV: poliomavrus humano BLV: vrus da leucose bovina. BoHV: herpesvrus bovino (1, 2, 4 e 5).
862
BoRV: rinovrus bovino. BOTV: vrus Bunyamwera. bPI3V: vrus da parainuenza bovina tipo 3. BPSV: vrus da estomatite papular bovina. BPV (1-7): papilomavrus bovino. BPV: parvovrus bovino. BPV-1: papilomavrus bovino tipo 1. BPyV: poliomavrus bovino. BRSV: vrus respiratrio sincicial bovino. BRV: ortoreovrus de babunos. BRV: rotavrus bovino. BrV: vrus Breda. BSL: nvel de biossegurana. BT: lngua azul. BT: linhagem celular de corneto nasal bovino. BToV: torovrus bovino. BTV: vrus da lngua azul. BVDV: vrus da diarria viral bovina.
Virologia Veterinria
CCHF: febre hemorrgica da Crimia-Congo. CCHFV: vrus da febre hemorrgica Crimia-Congo. CCoV: coronavrus canino. CD4: marcador de linfcitos T auxiliares (Th). CD8: marcador de linfcitos T citotxicos (Tc). Cdk: quinases dependentes de ciclinas. cDNA: DNA complementar CDV: vrus da cinomose. CEF: cultivo primrio de embrio de galinha. CEK: clula de embrio de pinto. CF: xao do complemento. ChPV: Chanfnch papilomavrus. ChPV: parvovrus das galinhas. ChPVs: cordopoxvrus. CID: coagulao intravascular disseminada. CLP: partcula semelhante ao core ou ncleo viral. CMV: citomegalovrus humano. CnMV: vrus minuto dos ces. CNPV: poxvrus do canrio.
C
C: capsdeo. CA: protena do capsdeo. CaCV: circovrus do canrio. CAdV: adenovrus canino. CAdV-1: adenovrus canino tipo 1. CAdV-2: adenovrus canino tipo 2. CAEV: vrus da artrite-encefalite caprina. CaHV: herpesvrus canino. Cap: 7-metil-guanina ligada na extremidade 5 do RNA. CAR: receptor do adenovrus e do vrus Coxsackie. CAV: vrus da anemia aviria. CAV9: Coxsackievirus A9. ccc: crculo covalentemente fechado.
COCV: vrus Cocal. CoCV: coronavrus canino. COPV: papilomavrus oral canino. Cp: citoptico. CPE: efeito citoptico. CpHV: herpesvrus caprino. CPIV-2: vrus da parainuenza canina tipo 2. CPSH: sndrome cardiopulmonar por hantavrus. CPV: parvovrus canino. CR1, 2 e 3: regies conservadas. CRCV: coronavrus canino respiratrio. Cre: seqncia regulatria cis-acting. CRFK: clula de linhagem de rim felino. CRIB: clula de linhagem de rim bovino resistente ao BVDV.
Abreviaturas e siglas
863
EAV: vrus da arterite eqina. EBHSV: vrus da doena hemorrgica das lebres pardas europias. EBTr: clulas de linhagem de traquia de feto bovino. EBV: vrus Epstein-Barr. ECMV: vrus da encefalomiocardite. ECP: efeito citopatognico ou citoptico. ED: clula de derme eqina. EDS: sndrome da queda da postura. EEE: encefalite eqina do leste. EEEV: vrus da encefalite eqina do leste.
cRNA: RNA complementar. CRPV: papilomavrus dos coelhos cauda-de-algodo. CRSV: vrus respiratrio sincicial caprino. CRV: reovrus canino. CSF: peste suna clssica. CSFV: vrus da peste suna clssica. CTFV: vrus da febre dos carrapatos do Colorado. CTL: linfcito T citotxico. CV-1: clula de linhagem de primatas. CV-B5: Coxsackievirus B5 de humanos.
D
Da: dalton. DAB: diaminobenzidina. DAdV: adenovrus de patos. DBP: protena de ligao ao DNA. DC: clula dendrtica. DeAdV: adenovrus de cervdeos. DHBV: vrus da hepatite B dos marrecos. DHOV: vrus Dhori. DM: doena das mucosas. DNA: cido desoxirribonuclico. dNTP: desoxirribonucleotdeo. DPV: papilomavrus de cervdeos. DR: repetio direta. ds: cadeia dupla (double stranded). dsRNA: RNA de ta dupla. DUGV: vrus de Dugbe. dUTPase: enzima que desdobra o nucleotdeo UTP.
EEPV: papilomavrus do alce europeu. EEV: partcula vrica envelopada extracelular. EEV: vrus da encefalose eqina. EHD: doena epizotica hemorrgica dos cervos. EHDV: vrus da doena epizotica hemorrgica dos cervos. EHV: herpesvrus eqino 1, 3 e 4. EIAV: vrus da anemia infecciosa eqina. eIF-2: fator eucariota de iniciao. EITB: ensaio imunoenzimtico em blot. EIV: vrus da inuenza eqina. ELISA: ensaio imunoenzimtico. EMCV: vrus da encefalomiocardite murina. EqPV: papilomavrus eqino. EqRV: rinovrus eqino. ERBV: vrus da rinite eqina B. ETF: fator de transcrio dos genes iniciais. EToV: torovrus eqino. EVA: arterite viral eqina.
E
E (early): genes de expresso inicial (ou precoce). E1 a E7: protenas iniciais. EAdV: adenovrus eqino.
F
F: protena de fuso. FA: Fosfatase alcalina FAdV: adenovrus avirio.
864
FAIDS: sndrome da imunodecincia felina adquirida. FAO: seo da ONU responsvel pela agricultura e alimentos. Fc: xao do complemento. FCoV: coronavrus entrico felino. FCV: calicivrus felino. FDPV: papilomavrus felino. FeCoV: vrus da peritonite infecciosa felina. FeHV: herpesvrus felino. FeLV: vrus da leucemia felina. FIP: peritonite infecciosa dos felinos. FIPV: vrus da peritonite infecciosa felina. FITC: isotiocianato de uorescena. FIV: vrus da imunodecincia felina. FluAV: Inuenzavrus A. FluBV: Inuenzavrus B. FluCV: Inuenzavrus C. FMD: febre aftosa. FMDV: vrus da febre aftosa. FMO: falncia mltipla dos rgos. FOCMA: antgeno do oncovrus felino associado membrana. FPL: panleucopenia felina. FPLV: vrus da panleucopenia felina. FVR: rinotraquete viral felina. FWPV: vrus da bouba aviria. GP: glicoprotena. GSHV: vrus da hepatite B dos esquilos. GTPV: poxvrus dos caprinos.
H
H: hemaglutinina. HA: teste de hemaglutinao. HA: hemaglutinina. HAD: hemadsoro. HaOPV: papilomavrus oral do hamster. HaPV: polyomavrus de hamsters. HAV: vrus da hepatite A humana. HBV: vrus da hepatite B humana. HCC: carcinoma hepatocelular. HCMV: citomegalovrus humano (HHV-5). HCoV: coronavrus humano. HCV: vrus da hepatite C. HE: hemaglutinina-esterase. HEF: glicoprotena multifuncional no envelope. HeLA: clulas de linhagem humana. HEV: vrus da encefalomielite hemaglutinante dos sunos. HeV: vrus Hendra. HFRS: febre hemorrgica com sndrome renal. HHV: herpesvrus humanos tipos 1-8. HI: inibio da hemaglutinao.
G
GAdV: adenovrus caprino. GaHV-1, 2 e 3: herpesvrus galdeo tipos 1, 2 e 3. gB (C etc.): glicoprotenas do envelope. GBK: clula de rim bovino. GDD: glicina-asparagina-asparagina. GEH: gastrenterite hemorrgica. GoAdV: adenovrus de gansos. GoCV: circovrus dos gansos.
HIC: hepatite infecciosa canina. HIRRV: rabdovrus hirame. HIV: vrus da imunodecincia humana. hPEV1: parechovrus humano 1. hPIV: vrus da parainuenza humana HPS: sndrome pulmonar por hantavrus. HPV: papilomavrus humanos. HRPO: horseradish peroxidase. hRSV: vrus sincicial respiratrio humano.
865
Ig: imunoglobulina. IgA: imunoglobulina A IHC: imunoistoqumica. IHNV: vrus da necrose hematopoitica infecciosa. IHQ: imunoistoqumica. IL: interleucinas. ILTV: vrus da laringotraquete infecciosa das aves. IMV: partcula vrica intracelular madura. IN: integrase. INPV: vrus da pancreatite necrtica infecciosa. IPB: balanopostite pustular bovina.
HRV: rhinovrus humano. HSV: vrus do herpes simplex (HSV-1 e HSV-2). HT 29: clula de tumor retal humano. HTLV: vrus da leucemia de linfcitos T. HTNV: vrus Hantaan ou hantavrus. HToV: torovrus humano. HuCoV: coronavrus humano. HuCV: calicivrus clssicos humanos. HV: herpesvrus. HVT: herpesvrus de perus.
I
IBDV: vrus da doena de Gumboro. IBR: rinotraquete infecciosa bovina. IBRS-2: clula de rim suno (Instituto Biolgico de So Paulo). IBRS2: clula de linhagem de rim suno. IBRV: vrus da rinotraquete infecciosa bovina (BoHV-1). IBV: vrus da bronquite infecciosa aviria. ICAM-1: molcula de adeso intercelular tipo 1. IcHV-1: herpesvrus do catsh. ICPs: polipeptdeos virais produzidos em clulas infectadas por herpesvrus. ICQ: imunocitoqumica. ICTV: Comit Internacional de Taxonomia de Vrus. ID: intestino delgado. ID50: dose infectiva para 50% dos cultivos celulares. IDGA: imunodifuso em gar. IE: genes de transcrio imediata. IFA: imunouorescncia. IFD: imunouorescncia direta. IFI: imunouorescncia indireta. IFN: interferon. IFN-: interferon alfa. IFN-: interferon beta. IFN-: interferon gama.
IPIC: ndice de patogenicidade intracerebral. IPV: vulvovaginite pustular bovina. IPX: imunoperoxidase. IR: repetio invertida. IR: regio intergnica. IRES: stio interno de reconhecimento pelos ribossomos. ISAV: vrus da diarria infecciosa do salmo. ISCOM: complexo imunoestimulante. ISH: hibridizao in situ. ITR: repetio terminal invertida. IV: vrus da doena de Ibaraki.
J
JCV: poliomavrus humano. JEV: vrus da encefalite japonesa. JSRV: vrus da adenomatose pulmonar dos ovinos (retrovrus Jaagsiekte). JUNV: vrus Junin.
K
kb: quilobase. kbp: quilopares de bases. kDa: quilodalton. KDV: vrus kadipiro.
866
KIR: receptor inibidor de morte celular. KPyV: Kilham poliomavrus. MACV: vrus Machupo.
MALT: tecido linfide associado com mucosas. MARC145: linhagem derivada da MA104.
L
L: large (grande). L: polimerase. L (late): genes de expresso tardia. LACV: vrus La Crosse. LASV: lassavrus de roedores e humanos. LAT (LTR): transcrito associado latncia. LC: clula de Langerhans. LCMV: vrus da coriomeningite linfoctica. LCR: regio longa de controle. LD50: dose letal para 50% dos animais. LDEV: vrus elevador da lactato desidrogenase. LDL: lipoprotena de baixa densidade. LNYV: vrus da necrose amarela da alface. LPS: lipopolissacardeo. LPyV: poliomavrus linfotrpico. LSD: doena da pele nodulosa (lumpy skin disease). LSDV: vrus da LSD. LT: laringotraquete infecciosa das galinhas. lT: antgeno T grande. LTR: regio longa terminal. LTR: transcrito relacionado com a latncia.
MCF: febre catarral maligna. MCF-AO: febre catarral maligna associada a ovinos. MCFV: vrus da febre catarral maligna. MD: doena de Marek. MDBK: clula de linhagem de rim bovino. MDCK: clula de linhagem de rim canino. mDCs: clulas dendrticas mielides. MDCT-RP19: linhagem broblastide. MDPV: parvovrus dos patos Muscovy. MDV: vrus da doena de Marek (GaHV-2). ME: microscopia eletrnica. MeHV-1: herpesvrus melagridis tipo 1. MEV: vrus da enterite das martas. MHC: complexo maior de histocompatibilidade. MHC-I: complexo maior de histocompatibilidade do tipo I. MHC-II: complexo maior de histocompatibilidade tipo II. MHV: vrus da hepatite murina. miRNA: micro RNAs com atividade interferente. MLV: vrus da leucemia murina. MMTV: vrus do tumor mamrio do camundongo. MNPV: papilomavrus dos Mastomys natalensis. MNT: teste de neutralizao viral em camundongos. MOCV: vrus do Moluscum contagiosum.
M
M: mdio (medium). M: protena da matriz. M1: protena principal da matriz. M2: protena com atividade de canal de ons. MA: protena da matriz. MA-104: clulas de rim de macaco. MAC: complexo de ataque membrana.
MPtV: vrus pneumotrpico dos murinos. mRNA: RNA mensageiro. mRNAsg: RNA subgenmico. MRV: ortoreovrus de mamferos. mT: antgeno T mdio. MuLV: vrus da leucemia murina. MV: vrus do sarampo. MVEV: vrus Murray Valley.
867
OvHV-2: herpesvrus ovino tipo 2. OvPV: papilomavrus ovino.
MVM: vrus minuto dos camundongos. MVV: vrus Maedi-Visna. MYXV: vrus do mixoma dos coelhos.
P N
NA: neuraminidase. NC: protena do nucleocapsdeo. NCP: no-citoptico. ND: doena de Newcastle. NDV: vrus da doena de Newcastle. NiPV: vrus Nipah. NK: clulas natural killer. NLS: sinais para localizao nuclear. nm: nanmetro. NP (ou N): nucleoprotena ou protena do nucleocapsdeo. NS: protena no-estrutural. NSD: doena das ovelhas de Nairobi. NSDV: vrus da doena das ovelhas de Nairobi. NSp: protenas no-estruturais. nt: nucleotdeo. PA: polimerase cida. PAdV: adenovrus suno. PAGE: eletroforese gel de poliacrilamida. PANAFTOSA: Centro Pan-americano de Febre Aftosa. Pb: pares de bases. PB1: polimerase bsica 1. PB2: polimerase bsica 2. PBMC: clulas mononucleares do sangue perifrico. PBS: stio de ligao do primer. PCNA: fator celular de processividade do complexo de replicao. PCR: reao da polimerase em cadeia. PCV-1: circovrus suno tipo 1. PCV-2: circovrus suno tipo 2. pDCs: clulas dendrticas plasmacitides. PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas. PEDV: vrus da diarria epidmica dos sunos.
O
OAdV: adenovrus ovino. OE: ovo embrionado. OIE: Escritrio Internacional das Epizootias. OMS: Organizao Mundial da Sade. OP: uido esofgico-faringeano. OPC: carcinoma pulmonar dos ovinos. OPPV: vrus da pneumonia progressiva dos ovinos. ORF: fase aberta de leitura. ORFV: vrus do ectima contagioso dos ovinos. ORI: origem de replicao. ORSV: vrus respiratrio sincicial ovino.
PEMSV: vrus da sndrome de mortalidade de galinhas. PePV: papilomavrus dos psitacdeos. PEV: enterovrus suno. PFU: unidades formadoras de placas. pgRNA: RNA pr-genmico. PhAdV: adenovrus de faises. PhCoV: coronavrus de faises. PhDV: morbilivrus das focas. PI: persistentemente infectado. PiCV: circovrus dos pombos. PIVs: vrus da parainuenza. PK: clulas de rim suno. PK15: clula de linhagem de rim suno.
868
PKR: protena quinase R. PLSD: pseudo lumpy skin disease. PML: leucoencefalopatia progressiva multifocal. polyA: seqncia de adeninas. PoV: poliomavrus de camundongos. PoV: poliomavrus. PoxV: poxvrus. PPRV: vrus da peste dos pequenos ruminantes. PPT: trato de polipurina. PpV: papilomavrus. PPV: parvovrus suno. PR: protease. PRA: ensaio de reduo de placa. pRB: protena do retinoblastoma. PRCoV: coronavrus respiratrio dos sunos. PRRSV: vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos. PRV: vrus da pseudoraiva (SuHV-1). PsPV: papilomavrus dos cetceos. PToV: torovrus suno. pTP: precursora da protena terminal. PTV: teschovrus suno 1. PV: poliovrus. PYDV: vrus do tomate pequeno amarelo. PyV: poliomavrus de camundongos. RFV: vrus do broma dos coelhos.
RHDV: vrus da doena hemorrgica dos coelhos. RhPV: parvovrus do macaco rhesus. RI: molcula intermediria de replicao. RIA: radioimunoensaio. RIP: radioimunoprecipitao. RK13: clulas de linhagem de rim de coelho. RNA: cido ribonuclico. RNApolII: RNA polimerase II. RNAse H: ribonuclease H. RNAse: ribonuclease. RNP: ribonucleoprotena. RPA: protena replicativa A. RPM: rotaes por minuto. RPV: parvovrus do mo-pelada (racoon). RPV: vrus da peste bovina. RR: ribonucleotdeo redutase. RRE: elemento responsivo ao Rev. RRV: vrus Ross River. RS: Rio Grande do Sul. RSV: vrus do sarcoma Rous. RSVs: vrus respiratrios sinciciais. RT: transcriptase reversa. RT-PCR: transcrio reversa seguida de PCR. RVF: febre do vale Rift. RVFV: vrus da febre do vale Rift.
R
RabV: vrus da raiva. Rb: produto do gene do retinoblastoma. RdRp: RNA polimerase dependente de RNA. RE: retculo endoplasmtico. REA: anlise de restrio enzimtica. RER: retculo endoplasmtico rugoso. RFFIT: tcnica de inibio de focos uorescentes. RFLP: polimorsmo de tamanho de fragmentos de restrio.
S
S: pequeno (small). SA-12: vrus smio 12. SABV: vrus sabi. SaHV-2: herpesvrus saimiri tipo 2. SARS-CoV: coronavrus causador da pneumonia asitica, SARS. SAT: South African Territory 1, 2 e 3.
869
SAV: adenovrus suno. SCR: seqncia repetida consenso. SDNS: sndrome da dermatite e nefropatia suna. SFV: vrus Semliki Forest. SH: protena hifrofbica pequena. SHFV: vrus da febre hemorrgica dos smios. SHS: sndrome da cabea inchada. SI: inuenza suna. SIN: vrus Sindbis. SIRS: sndrome da resposta inamatria sistmica. SIV: vrus da inuenza suna (tambm vrus da imunodecincia dos smios). SK6: clulas de linhagem de rim suno. SLEV: vrus da encefalite Saint Louis. SMDS: sndrome multissistmica do denhamento. SMSV: vrus dos lees-marinhos de San Miguel. SN: soroneutralizao. SNC: sistema nervoso central. SPA: adenomatose pulmonar dos ovinos. SPF: livres de patgenos especcos. SPV: parvovrus dos smios. SRLV: lentivrus dos pequenos ruminantes. SRSV: vrus pequenos arredondados. ss: cadeia simples (single stranded). ssRNA: RNA de ta simples. sT: antgeno T pequeno. ST: linhagem celular de testculo suno. SToV: torovrus suno. SU: protena de superfcie. SuHV: herpesvrus suno. SV-40: vrus smio 40. SVCV: vrus da viremia primaveril das carpas. SVDV: vrus da doena vesicular dos sunos. SVEV: vrus do exantema vesicular dos sunos. SwPV: poxvrus suno.
T
TAdV: adenovrus de perus. TANV: vrus Tanapox. Taq: polimerase do organismo Thermophilus aquatics. TAS: seqncia associada transcrio. TAstV: astrovrus de perus. TBEV: vrus da encefalite transmitida por carrapatos. TBP: protena de ligao ao TATA box. Tc: linfcito T citotxico. TCID50: dose infectiva para 50% dos cultivos celulares. TCoV: coronavrus dos perus. TCR: receptor de linfcitos T. TfR: receptor da transferrina. TGE: gastrenterite transmissvel dos sunos. TGEV: vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos. TGF: fator de crescimento tumoral. TGI: trato gastrintestinal. Th: linfcito T auxiliar (helper). THOV: vrus Thogoto de carrapatos. TIC: traqueobronquite infecciosa canina. TIF: fator ativador dos genes alfa. TK: timidina quinase. TM: protena transmembrana. TNF: fator de necrose tumoral. TOC: cultivo de anel da traquia. TP: protena terminal. TRHV: vrus da rinotraquete dos perus. tRNA: RNA transportador. TRS: seqncia de regulao da transcrio. TS: mutantes sensveis temperatura. TTE: triuortricloroetano. TTV: circovrus humano (torquetenovrus). TV-2: vrus Tellina.
870
VS: estomatite vesicular.
U
UH: unidade hemaglutinante. UL: regio nica longa. UL(n): protena cujo gene est na regio UL. US: regio nica curta. UTR: regio no-traduzida. UV: ultravioleta.
VSAV: vrus da estomatite vesicular Alagoas. VSIV: vrus da estomatite vesicular Indiana. VSNJV: vrus da estomatite vesicular New Jersey. VSV: vrus da estomatite vesicular. VV: vrus da vaccinia. VWD: sndrome do vmito e denhamento. VZV: vrus da varicela-zoster (HHV-3)
V
VAP: protena viral de ligao. VCAM-1: molcula de adeso de clulas vasculares tipo 1. VEE: encefalite eqina venezuelana. VEEV: vrus da encefalite eqina venezuelana. VERO: clula de rim de macaco-verde-africano. VESV: vrus do exantema vesicular dos sunos. VHSV: vrus da septicemia hemorrgica. VIAA: antgeno associado com infeco viral. VLDL-R: lipoprotena de baixssima densidade. VLP: partcula semelhante ao vrion. VP1, 2 e 3: protenas do capsdeo. VP-16: transativador dos genes alfa dos herpesvrus (o mesmo que alfa-TIF). VPg: protena terminal. VPs: protenas virais. vRNA: RNA genmico. YFV: vrus da febre amarela. YMTV: atapox dos macacos. YTAV: vrus yellowtail ascites.
W
WB: Western blot. WBV: vrus Wesselbron. WDSV: vrus do sarcoma dermal de Walleye. WEE: encefalite eqina do oeste. WEEV: vrus da encefalite eqina do oeste. WHV: vrus da hepatite B das marmotas. WNV: vrus do Nilo Ocidental
GLOSSRIO
cido nuclico: molcula de cido deoxirribonuclico (DNA) ou cido ribonuclico (RNA). cido silico: sacardeo composto por nove carbonos, encontrado em glicoprotenas e glicolipdios de membranas celulares. utilizado como receptor por alguns vrus. Adjuvante: substncia ou formulao utilizada em vacinas noreplicativas para potencializar o efeito imunoestimulante do antgeno. Adsoro: etapa inicial do ciclo replicativo dos vrus, na qual os vrions se ligam aos receptores celulares. Aglutinao em ltex: tcnica de deteco de antgeno ou anticorpos que utiliza microesferas de ltex como suporte para a imobilizao da reao. Ambissense: molcula de RNA que contm informao gentica tanto no sentido do genoma quanto no sentido antigenmico. Amostra viral: vrus de uma determinada espcie viral que foi isolado e no caracterizado. Os termos cepa e isolado tambm so utilizados. Amplicon: segmento de DNA amplicado por PCR. Tambm chamado de produto de PCR. Anlise de restrio: anlise comparativa de molculas de DNA com base no tamanho dos fragmentos gerados pela clivagem por enzimas de restrio (endonucleases). Antergrado: relativo direo do transporte neuronal: do corpo neuronal para as extremidades dos axnios ou dendritos. Anticorpos: classe de globulinas plasmticas com funo de ligao a determinantes antignicos. Tambm chamados de imunoglobulinas. Anticorpos maternos: anticorpos recebidos da me atravs da placenta, pelo colostro/leite ou pela gema do ovo. Anticorpos monoclonais: populao de anticorpos altamente especcos e homogneos, produzidos por clones de clulas hbridas (hibridomas) obtidas pela fuso entre linfcitos B e clulas de mieloma. Anticorpos policlonais: populao heterognea de anticorpos produzidos por um animal em resposta a um determinado antgeno. So produtos de secreo de inmeros clones diferentes de linfcitos B (plasmcitos). Anticorpo primrio: anticorpo especco para o antgeno de interesse, utilizado em tcnicas de deteco de antgenos.
Anticorpo secundrio: anticorpo contra imunoglobulinas (antiIg) de determinadas espcies animais, utilizado em tcnicas de deteco de antgenos. Antgeno: macromolcula capaz de se ligar especicamente aos receptores de clulas do sistema imunolgico. Antgeno T: poliomavrus. protena complexa multifuncional dos
Antigenmico: molcula de cido nuclico com sentido complementar (inverso) ao genoma. Anti-soro: soro de animal que contm anticorpos, geralmente em altos ttulos, contra um determinado antgeno ou agente. Antissense: molcula de cido nuclico cuja seqncia de nucleotdeos complementar (sentido contrrio) a outra determinada molcula. Aparelho de Golgi (complexo de Golgi): organela citoplasmtica vesicular em cujo lmen ocorrem modicaes qumicas de protenas e metabolismo de lipdios. O aparelho de Golgi responsvel pelo direcionamento de protenas e outras macromolculas s diferentes organelas da clula e tambm para exportao. Apatognico: agente no-patognico ou atenuado. Apoptose: mecanismo de morte celular desencadeado por uma variedade de estmulos siolgicos ou patolgicos, que cursa com ativao de vrios genes e culmina com a fragmentao do DNA celular. Tambm denominada morte celular programada. Aptido biolgica: conjunto de caractersticas fenotpicas que favorecem a replicao e perpetuao de um agente em um determinado ambiente biolgico. Arbovirose: (insetos). infeco vrica transmitida por artrpodes
Arbovrus: vrus transmitidos primariamente por artrpodes (insetos). rea livre: rea ou regio que no possui um determinado agente etiolgico. Atenuao: reduo (ou abolio) da patogenicidade de um agente. Atenuao da transcrio: reduo da ecincia de transcrio medida que o complexo enzimtico avana ao longo da molcula molde.
872
Atenuado: agente etiolgico com patogenicidade reduzida. Ativador promscuo: fator de transcrio (ou ativao) que se liga em seqncias presentes em uma grande variedade de promotores, ativando a transcrio dos respectivos genes. Atividade hemaglutinante: atividade de aglutinar eritrcitos animais. ATPase: enzima com atividade de desdobramento de ATP para o fornecimento de energia para processos biolgicos. Autcrina: ao de uma substncia na prpria clula que a produz. Bacterifago: vrus que infecta bactrias. Balstica: metodologia de introduo de macromolculas em organismos uni ou multicelulares por meio de projteis impulsionados por um equipamento apropriado. Barreira sanitria: conjunto de medidas utilizadas em zonas limtrofes para impedir a introduo de agentes patognicos em determinadas reas ou populaes. Base nitrogenada: componente dos nucleotdeos que compem o DNA e RNA. Adenina, timina (uracil), citosina e guanina. BCR: receptor de linfcitos B. Brotamento: mecanismo de aquisio do envelope viral, no qual o nucleocapsdeo projeta-se atravs de membranas celulares. Bursa de Fabricius: rgo linfide primrio das aves que controla o desenvolvimento e maturao de linfcitos B. Cadeia complementar: molcula de cido nuclico cuja seqncia de nucleotdeos exatamente complementar a de outra molcula, de acordo com o pareamento de bases Watson-Crick (A-T, C-G). Cadeia do processo infeccioso: srie de etapas que ocorrem seqencialmente e continuamente na histria natural dos agentes infecciosos na natureza. Cadeia lagging: descontinuamente. molcula de DNA sintetizada
Capsmero: unidade estrutural do capsdeo; aparece como projeo ou depresso na superfcie dos vrions; pode ser formado por uma ou mais protenas. Caspase: famlia de proteases, algumas das quais envolvidas no mecanismo de apoptose. Cauda poli A: seqncia de adeninas com extenso varivel (tipicamente 100-200) adicionada extremidade 3 de RNAs mensageiros celulares e virais. Parece conferir estabilidade ao mRNA e pode tambm ter participao no incio da traduo. Caveola: estrutura vesicular envolvida na internalizao de macromolculas e pequenas partculas por clulas eucariotas. Clula apresentadora de antgeno (APC): clula que processa antgenos proticos endgenos ou exgenos e apresenta a linfcitos T, induzindo a sua estimulao. Clula de Langerhans: clula da linhagem monoctica que atua como APC na pele. Clula de memria: clula linfide (T ou B) originada a partir da expanso clonal estimulada pelo contato com o antgeno. Essas clulas possuem longa vida e podem ser reestimuladas quando o organismo reexposto ao antgeno especco. Clula dendrtica: populao de clulas da linhagem mielide ou linfide que se distribuem no sangue e em tecidos linfides e no-linfides, cuja funo principal a captura e apresentao de antgenos aos linfcitos. Clula efetora: denominao dada s clulas que atuam diretamente em determinada funo. Clula hospedeira: denominao genrica dada s clulas que servem de hospedeiras para a replicao de um vrus. Clula interdigitante: clula da linhagem das clulas dendrticas que residem no bao. Clula M: clula especializada na produo de muco que se localiza entre as clulas epiteliais da mucosa do intestino delgado. Clula natural killer: clula da linhagem linfide cuja funo principal lisar inespecicamente clulas tumorais e clulas infectadas por vrus, alm de produzir citocinas. Tambm participa da lise celular dependente de anticorpos (ADCC). Clula permissiva: clula que apresenta as intracelulares necessrias para a replicao viral. condies
Cadeia leading: molcula de DNA sintetizada continuamente. Cap: guanina metilada na posio 7, com orientao inversa, incorporada na extremidade 5 de RNAs mensageiros de eucariotas e que serve de sinal para o reconhecimento e traduo pelos ribossomos. Alguns cap possuem a segunda e terceira bases tambm metiladas. Capa ogstica: camada na de leuccitos que se forma entre a coluna de eritrcitos e de plasma aps centrifugao de sangue integral no-coagulado. Capsdeo: camada protica que reveste externamente o genoma viral.
Clula primria (cultivo primrio): clula cultivada in vitro recentemente removida de tecidos animais. capaz de um nmero limitado de divises. Clula semipermissiva: clula que apresenta condies intracelulares parciais para a replicao viral ou que apresenta condies para a ocorrncia somente de algumas etapas do ciclo replicativo.
Glossrio
873
Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC): mecanismo de lise celular mediada por clulas, que se ligam poro Fc de imunoglobulinas que esto ligadas a antgenos na superfcie da clula-alvo. Clatrina: protena estrutural da membrana plasmtica, cuja aglomerao em certos locais antecede e media a endocitose. Clivagem enzimtica: clivagem de uma macromolcula pela ao de enzimas. Cdon: seqncia de trs nucleotdeos que codica um aminocido ou a terminao da traduo (cdon de terminao). Cdon de iniciao: seqncia AUG que determina o local exato do incio da traduo. Este cdon tambm codica o aminocido metionina. Cdon de terminao: seqncia de trs nucleotdeos que no codica aminocidos e determina a terminao da traduo (UGA, UAA, UAG). Compactao gentica: capacidade de compactar o mximo de informao gentica no genoma. Complementao: interao entre os produtos gnicos de diferentes vrus que permite a multiplicao de um ou mais vrus, sem alterao do seu gentipo. Complemento: sistema plasmtico formado por um grupo de protenas enzimticas inativas, cuja ativao seqencial desencadeia a formao de molculas com atividades biolgicas diversas, principalmente relacionadas com a ativao da inamao e combate a microorganismos. Complexo antgeno-anticorpo: complexo molecular formado pela ligao do anticorpo ao antgeno especco. Complexo basal de transcrio: conjunto mnimo de fatores de transcrio e enzima RNA polimerase necessrios para a realizao de nveis basais de transcrio. Complexo de ataque membrana (MAC): complexo formado pelos componentes C5-C9 do complemento, que se insere e forma poros nas membranas celulares e bacterianas. Complexo de histocompatibilidade principal (MHC): protenas de membrana celular, envolvidas na apresentao de peptdeos endgenos (MHC-I) ou exgenos (MHC-II) para clulas do sistema imunolgico. Identicadas inicialmente como responsveis pela rejeio (ou no) de transplantes. Complexo replicativo: conjunto de enzimas e fatores auxiliares que realizam a replicao do genoma. Complexo ribonucleoprotena: complexo formado pelo RNA genmico e protenas associadas. Concatmero: molcula longa de DNA formada por mltiplas cpias de unidades genmicas contnuas. Constituem-se em molculas intermedirias na replicao do genoma de alguns vrus DNA.
Clula susceptvel: clula que apresenta as condies para a ocorrncia completa do ciclo replicativo, desde a penetrao at o egresso da prognie viral. Cepa ou estirpe: vrus de uma determinada espcie viral que j foi caracterizado fenotipicamente e/ou genotipicamente. Cepa de referncia: cepa viral bem caracterizada que utilizada como referncia por vrios laboratrios com diversas nalidades. CD4: molcula de superfcie celular que atua conjuntamente com o TCR na ligao ao MHC-II e peptdeos na superfcie de APCs, no processo de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T auxiliares. o principal marcador molecular dessta populao de linfcitos. CD8: molcula de superfcie celular que atua conjuntamente com o TCR na ligao ao MHC-I e peptdeos na superfcie de clulas infectadas por vrus e clulas dendrticas, no processo de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T citotxicos. o principal marcador molecular desta populao de linfcitos. Chaperone: protena ou estrutura protica que assiste e auxilia as protenas a assumirem a conformao tridimensional logo aps a sua sntese. Ciclinas: famlia de protenas envolvidas na regulao do ciclo celular. Ciclo ltico: ciclo replicativo viral que resulta na lise/destruio da clula hospedeira. Ciclo replicativo: srie de etapas que compem a multiplicao/ reproduo dos vrus em clulas susceptveis. Crculo rolante: mecanismo de replicao de DNA em que a estrutura replicativa se assemelha a um crculo em movimento. A replicao ocorre ao longo da molcula circular de DNA, resultando em uma molcula linear crescente que, posteriormente, clivada nas unidades genmicas. Cis-acting: seqncia de nucleotdeos cuja atividade exercida na prpria molcula; geralmente serve de stio de ligao para protenas que ativam/reprimem a transcrio ou replicao; ex. promotores, enhancers, origens de replicao. Cistron: gene. Citocinas: substncias solveis secretadas por determinadas clulas em resposta a um estmulo e que exercem funo modulatria em outras clulas. Citoesqueleto: rede de bras, brilas, tbulos e microtbulos proticos que conferem a forma e uma variedade de movimentos s clulas eucariotas, alm de servirem de elos de ligao entre os diferentes locais e organelas no interior da clula. Citomegalia: aumento de volume celular. Citopatologia: patologia em nvel celular. Freqentemente se manifesta sob a forma de alteraes estruturais e/ou morfolgicas.
874
Convalescena: fase de recuperao clnica. Core (ou ncleo): estrutura compacta formada pelo genoma viral geralmente conjugado com protenas. Co-receptor: molcula de superfcie celular que participa, juntamente com os receptores, no processo de ligao e penetrao dos vrus nas clulas. Corpsculo de incluso: estrutura intracelular produzida como resultado da replicao viral. Pode ser formado por produtos virais e/ou por estruturas celulares modicadas. Corpsculo de Lenz: corpsculo de incluso observado em neurnios do sistema nervoso central durante a infeco com o vrus da cinomose. Corpsculo de Negri: corpsculo de incluso observado em neurnios do sistema nervoso central durante a infeco pelo vrus da raiva. Cristal violeta: corante utilizado para corar cultivos celulares. Cromatina: complexo formado pelo DNA celular conjugado com protenas nucleares denominadas histonas. CTL: linfcito T que possui atividade citotxica. Cultivo celular: cultivo de clulas de animais utilizado para a multiplicao de vrus in vitro. Dambos: depresses extensas no terreno que se enchem de gua em pocas de chuva e secam durante a estiagem. So tpicos de certas regies da frica. Degranulao: liberao citoplasmticos. do contedo de grnulos
Diapedese: movimentao de clulas sangneas para fora do leito vascular e atravs dos tecidos. Diluio limitante: diluio seriada utilizada para quanticar unidades vricas infecciosas presentes em um material. Diplide: organismo que contm duas cpias do genoma. Disseminao hematgena: disseminao pelo sangue. DNA: cido desoxirribonuclico. DNA complementar (cDNA): molcula de DNA cuja seqncia de nucleotdeos complementar a outra molcula de DNA ou RNA. DNA extracromossmico: molcula de DNA que no faz parte do cromossomo ou genoma celular. DNA genmico: DNA que constitui o genoma do organismo. DNA intermedirio: molcula de DNA, complementar ao DNA genmico, que serve de intermedirio na replicao do genoma de alguns vrus. DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA a partir de uma molcula molde. Doena emergente: doena que assumiu importncia recentemente. Pode ser uma doena realmente nova, que aumentou de incidncia ou que foi recentemente diagnosticada. Doena espordica: doena de ocorrncia rara, imprevisvel, em uma determinada populao. Doena extica: doena que no existe em uma determinada populao. Doente: hospedeiro que apresenta sinais clnicos resultantes de alteraes da siologia. Doena atpica: doena cujas caractersticas clnico-patolgicas diferem da maioria dos casos daquela enfermidade. Domnio: regio de uma molcula de protena que possui uma determinada funo e que assume uma conformao independente do restante da molcula. Geralmente os diferentes domnios de uma protena so codicados por diferentes exons. Drift antignico: alterao antignica discreta em protenas de superfcie de agentes infecciosos que altera o padro de reconhecimento destes agentes pelo sistema imunolgico. Eclipse: perodo inicial da infeco viral em cultivo celular, no qual ocorrem as fases iniciais da replicao. Ecossistema: conjunto de componentes fsicos e biolgicos presentes em uma determinada rea. Efeito citoptico (ou citopatognico): alterao morfolgica de clulas de cultivo associada com a replicao viral. Pode ser observado sob microscopia ou, s vezes, pelo exame visual direto (placas).
Deleo: ausncia ou remoo de um segmento do genoma. Dendritos: prolongamentos citoplasmticos presentes em certos tipos de clulas, tipicamente neurnios. Deoxirribonucleotdeo (dNTP): nucleotdeos que contm a desoxirribose como acar. So as unidades componentes do DNA. Depopulao: remoo ou eliminao total da populao de uma determinada rea. Desnaturao: perda da conformao tridimensional natural. Termo utilizado para protenas e cidos nuclicos. Desnudamento: srie que eventos que ocorrem aps a penetrao viral e que resultam na remoo parcial ou total das protenas que recobrem o genoma, tornando-o acessvel maquinaria de transcrio e/ou traduo. Determinante antignico: pequena regio do antgeno que se liga s regies variveis dos receptores de linfcitos B e T. Tambm denominado epitopo. Diagnstico sorolgico: diagnstico baseado na deteco de anticorpos especcos.
Glossrio
875
Epidemia em ponto: epidemia caracterizada pela ocorrncia de um grande nmero de casos em um curto intervalo de tempo. Epissomal: livre, no integrado ao cromossomo celular. Epitopo: o mesmo que determinante antignico. Epizootia: o mesmo que epidemia, termo aplicado a populaes animais. Espcie heterloga: outra espcie, que no a espcie em questo. Espcie homloga: mesma espcie em questo. Especicidade (anticorpos): propriedade de anticorpos em se ligar apenas aos epitopos que so exatamente complementares s suas regies variveis. Especicidade (testes): propriedade de uma tcnica diagnstica de identicar, detectar e diagnosticar um determinado agente (ou anticorpos) e distingui-lo de outros agentes. Espectro de hospedeiros: gama ou conjunto de hospedeiros que um agente pode potencialmente infectar. Espectrofotmetro: aparelho que mede a capacidade de diferentes substncias de absorver luz em diferentes comprimentos de onda. utilizado para determinar a concentrao de diversas substncias em diferentes materiais. Espcula (spike): projeo formada pelas protenas de superfcie de alguns vrions. O mesmo que peplmero. Estabilidade gentica: estabilidade (conservao) da seqncia de nucleotdeos de um determinado genoma ao longo do tempo. Estacional: padro de ocorrncia de doena cuja incidncia apresenta variaes a intervalos anuais, geralmente coincidentes com uma determinada estao do ano. Estrutura secundria (ou terciria): conformao bi ou tridimensional adotada por macromolculas (protenas, cidos nuclicos). Eucariota: organismo cujo genoma separado do citoplasma por uma membrana nuclear e dividido em cromossomos individuais. Evaso imunolgica: denominao genrica ao conjunto de mecanismos utilizados por agentes infecciosos para se evadirem da resposta imunolgica montada pelo hospedeiro. Exocitose: processo celular de secreo de macromolculas, no qual vesculas contendo essas molculas se fusionam com a membrana plasmtica, liberando o contedo no meio extracelular. Exon: seqncia codicante dos genes descontnuos de eucariotas, que so unidas entre si aps a remoo das seqncias intervenientes (ntrons), pelo mecanismo de splicing.
Egresso: sada ou liberao da partcula vrica da clula hospedeira. Eletroferogrupo: classicao dos rotavrus em grupos, de acordo com o padro de migrao dos segmentos genmicos em gis de poliacrilamida. Eletroforese em gel de poliacrilamida: mtodo de anlise de cidos nuclicos e protenas, baseado na migrao eletrofortica das molculas em uma matriz gelatinosa e porosa de poliacrilamida. ELISA: ensaio imunoenzimtico para a deteco de antgenos ou anticorpos. Empacotamento: mecanismo de incluso do genoma viral nas partculas vricas recm-formadas. Tambm chamado de encapsidao ou encapsidamento. Encapsidao: o mesmo que empacotamento. Endemia (enzootia): doena presente em uma determinada populao e cuja incidncia no apresenta grandes variaes ao longo do tempo. Endmica: padro de ocorrncia de uma doena que ocorre naturalmente em uma populao sem grandes variaes de incidncia ao longo do tempo. Endocitose: mecanismo celular de internalizao de partculas e macromolculas por meio de invaginao progressiva e formao de vesculas derivadas da membrana plasmtica. Endonucleases: enzimas que clivam e degradam cidos nuclicos, clivando as ligaes entre nucleotdeos internos da molcula. Enhancer: seqncia de nucleotdeos do DNA localizada a distncias variveis dos locais de iniciao da transcrio. Serve de stio de ligao para os fatores de transcrio. No essencial para a transcrio basal, mas aumenta a ecincia de transcrio a partir de um determinado promotor. Enhancer constitutivo: enhancer cuja atividade permanente, geralmente em nveis basais. Ensaio de placa: ensaio biolgico realizado em tapetes celulares. Baseia-se na capacidade de certos vrus de produzirem focos de destruio celular. utilizado para a anlise fenotpica, quanticao e clonagem biolgica (puricao) de vrus. Envelope: envoltrio lipoprotico externo presente em algumas famlias de vrus. derivado de membranas celulares e contm protenas virais inseridas. Epidemia: aumento signicativo do nmero de casos de uma doena em uma determinada populao em um perodo de tempo. Epidemia de propagao: epidemia em que o nmero de novos casos aumenta gradativamente ao longo do tempo.
876
Exonucleases: enzimas que degradam molculas de cidos nuclicos a partir da remoo de nucleotdeos de suas extremidades. Expanso clonal: multiplicao de clulas a partir de clulas progenitoras individuais. Expresso gnica: termo genrico que denota a expresso ou materializao das informaes genticas contidas no genoma. Resumidamente, refere-se produo de protenas e s funes decorrentes das suas atividades. Fbrica viral: local especco no citoplasma ou ncleo onde se acumulam os produtos virais e vrions em diferentes estgios de morfognese. o local de replicao do genoma e produo das partculas vricas. Fagocitose: processo celular de internalizao de partculas grandes, que envolve alteraes marcantes na estrutura da membrana plasmtica, gasto de energia e reorganizao do citoesqueleto cortical. Fagossomo: vescula derivada da fagocitose que contm o material fagocitado. Fator de necrose tumoral: um tipo de interleucina secretada por leuccitos. Fatores de transcrio: protenas celulares que auxiliam a enzima RNA polimerase no reconhecimento, ligao aos promotores e incio da transcrio. Fentipo: conjunto de caractersticas observveis de um indivduo. o resultado da expresso do gentipo. Fidelidade: propriedade das polimerases de DNA e RNA em produzirem cpias exatamente complementares s molculas utilizadas como molde. Filamentos de actina: lamentos da protena actina que compem o citoesqueleto. Fita complementar (ou cadeia complementar): molcula de cido nuclico (RNA ou DNA) cuja seqncia de nucleotdeos exatamente complementar molcula parental que serviu de molde para a sua produo. Fixao do complemento: tcnica de deteco de anticorpos que se baseia na capacidade de molculas de imunoglobulinas se ligarem a molculas do complemento quando interagem com o antgeno. Flebotomdeo: espcie de inseto hematfago. Envolvido na transmisso mecnica de alguns vrus. Fluorescena: substncia que emite luminosidade uorescente ao ser exposta a luz ultravioleta. Fluxo axoplsmico: uxo de vesculas e macromolculas ao longo do citoplasma (axoplasma) dos axnios de neurnios. Fmite (ou veculo): qualquer objeto (ser inanimado) que serve para transmitir um agente infeccioso entre hospedeiros.
Fonte de infeco: animal vertebrado que abriga e multiplica um vrus, podendo transmiti-lo a outro hospedeiro. Fosfatase alcalina: imunoenzimticos. enzima utilizada em testes
Fragmentos de Okazaki: segmentos de DNA (100: 2.000 nucleotdeos) produzidos durante a sntese da cadeia descontnua (lagging) na replicao semidescontnua do DNA celular e de alguns vrus. Frameshift: mudana de fase de leitura do RNA mensageiro pelos ribossomos durante a traduo. Fuso: processo de fusionamento entre membranas biolgicas pela interao entre seus componentes. A fuso entre o envelope viral e a membrana celular proporciona a penetrao do nucleocapsdeo no citoplasma da clula. Gene: seqncia de nucleotdeos nos cidos nuclicos que codica um produto (protena). Genes alfa (ou de transcrio imediata): grupo de genes dos herpesvrus que so transcritos imediatamente aps a penetrao viral na clula. Genes beta (ou iniciais): grupo de genes de alguns vrus que so preferencialmente transcritos em fases iniciais do ciclo, antes da replicao do genoma. Genes de virulncia: genes cujos produtos esto envolvidos na determinao da virulncia de um agente infeccioso. Gene essencial: gene cujo produto essencial para a replicao viral em cultivo. Genes gama (ou tardios): grupo de genes dos herpesvrus que so transcritos somente aps o incio da replicao do genoma. Gene no-essencial: gene cujo produto dispensvel para a replicao viral em cultivo celular. Genes tardios: genes que so expressos em fases tardias do ciclo, geralmente aps a replicao do genoma. Gentica reversa: denominao genrica para a metodologia utilizada para estudar a gentica de organismos na ordem inversa gentica tradicional, ou seja, parte de um determinado gentipo e estuda as conseqncias da produo deliberada de mutaes e outras alteraes genticas no fentipo do organismo. Genoma: molcula de cido nuclico (DNA, RNA) que contm o conjunto completo de informaes genticas do organismo. Gentipo: conjunto de seqncias especcas e informaes genticas contidas no genoma de um organismo. Glicoprotena: protena que possui molcula(s) de acar associada(s) covalentemente. Golden standard: teste padro universal de um determinado mtodo, cujos resultados servem de comparao com os resultados de outros testes.
Glossrio
877
no o transmite, ou seja, no participa do ciclo de manuteno do agente na natureza. Host range in vitro: conjunto de tipos de clulas de cultivo susceptveis infeco por um determinado vrus. Host-range in vivo: conjunto de espcies animais susceptveis a um determinado agente. Pode-se referir a um host range natural (infeces naturais) ou experimental (espcies susceptveis infeco experimental). Iatrognico: transmisso de um agente entre hospedeiros, decorrente da realizao de procedimentos mdicos. Icosaedro: estrutura geomtrica que consiste de 20 faces triangulares arranjadas ao redor da superfcie de uma esfera. Constitui-se na simetria fundamental de vrios vrus. Icossomos: estruturas esferides encontradas associadas aos prolongamentos citoplasmticos das clulas dendrticas e que contm antgenos a serem apresentados aos linfcitos. Imortalizao: denominao dada capacidade de algumas clulas de cultivo de se multiplicarem indenidamente. Importinas: protenas componentes do processo de importao de protenas e outras molculas para o interior do ncleo celular. Imunidade: estado de resistncia adquirida de um hospedeiro a um agente infeccioso. Imunidade de mucosas: conjunto de mecanismos imunolgicos localizados nas mucosas corporais. Imunidade de populao (ou de rebanho): nvel e abrangncia da imunidade contra um determinado agente existente em uma determinada populao. Imunidade passiva: imunidade recebida passivamente atravs da placenta, pelo colostro/leite, ou pela administrao de soro hiperimune. essencialmente humoral (anticorpos). Imunizao: induo de imunidade. Imunizao ativa: induo de imunidade pela exposio do hospedeiro ao antgeno. Imunizao passiva: induo de imunidade pela administrao de anticorpos pr-formados (via placentria, colostral ou soro hiperimune). Imunoblot: tcnica de deteco de antgenos (ou anticorpos) realizada em impresses do material suspeito em membranas. Imunocitoqumica: tcnica imunoenzimtica de deteco de antgenos em clulas. Imunocomplexo: complexo molecular formado pela conjugao de anticorpos com o antgeno especco. Imunocromatograa: tcnica de deteco de antgenos (ou anticorpos) baseada em cromatograa.
Granzimas: enzimas contidas em grnulos citoplasmticos de determinadas clulas efetoras. Hairpin: estrutura semelhante a um grampo de cabelo, formada pelo exionamento de molculas de cido nuclico sobre si mesmas. Geralmente ocorre prximo s extremidades das molculas. Haplide: organismo que contm apenas uma cpia do genoma. Helicases: enzimas que separam cadeias de DNA e RNA. So necessrias para a transcrio e replicao. Hemadsoro: atividade biolgica de protenas de alguns vrus quando expressas na superfcie de clulas infectadas. Refere-se adsoro de eritrcitos superfcie celular que contm essas protenas. Hemaglutinao: atividade biolgica de aglutinao de eritrcitos animais por partculas vricas ou por protenas de alguns vrus. Hemaglutinina: protena viral responsvel pela aglutinao de eritrcitos. Hepatotrpico: agente que apresenta tropismo por clulas hepticas. Heterodmero: estrutura molecular formada pela associao de duas subunidades (molculas) diferentes. Hibridizao: associao entre duas molculas complementares de cido nuclico, porm de origens diferentes. Hibridizao in situ: tcnica de deteco de cidos nuclicos em cortes de tecidos que utiliza o princpio da hibridizao. Hbrido: molcula de cido nuclico de cadeia dupla cujas cadeias componentes possuem origens diferentes. Termo tambm utilizado para designar o organismo cujo genoma contm informaes genticas de duas espcies heterlogas. Histonas: protenas nucleares que se conjugam com o DNA cromossmico, proporcionando o seu empacotamento e compactao. Homlogo: da mesma espcie, semelhante. Homologia de nucleotdeos: grau de similaridade da seqncia de nucleotdeos entre duas ou mais molculas de cidos nuclicos. Horseradish peroxidase (HRPO): enzima utilizada em testes imunoenzimticos. Hospedeiro: espcie animal que abriga e permite a multiplicao de um determinado agente biolgico. Hospedeiro natural (ou reservatrio): espcie animal na qual um determinado agente mantido na natureza. Hospedeiro terminal (acidental): espcie animal que pode ser, ocasionalmente, infectada por um determinado agente, mas que
878
Imunodifuso em gel de gar (IDGA): tcnica de deteco de anticorpos (e antgenos) que se baseia na migrao e precipitao dos complexos antgeno-anticorpos em uma matriz de gar. Imunoeletromicroscopia: tcnica de microscopia eletrnica que utiliza anticorpos especcos para melhor localizar e marcar o antgeno alvo. Imunouorescncia: tcnica de deteco de antgenos que utiliza anticorpos conjugados com uma substncia que emite luminosidade uorescente quando excitada por luz ultravioleta. Imunogenicidade: potencial de determinado antgeno de estimular a resposta imunolgica do hospedeiro. Imunogold: tcnica de microscopia eletrnica que utiliza anticorpos marcados com micropartculas de ouro para melhor localizar o antgeno alvo no material examinado. Imunoistoqumica: tcnica imunoenzimtica de deteco de antgenos em cortes de tecidos. Imunopatologia: patologia celular ou tecidual resultante da resposta imunolgica do hospedeiro. Imunoperoxidase: tcnica imunoenzimtica de deteco de antgenos (ou de anticorpos) que utiliza anticorpos marcados com a enzima peroxidase. Inativao: supresso da viabilidade atividade qumica ou biolgica. Incidncia: freqncia relativa de novos casos de uma doena em relao ao tempo. Indene: rea livre de uma determinada doena. Infeco: penetrao e multiplicao de um agente infeccioso em um organismo (ou em clulas de cultivo). Infeco abortiva: infeco que no resulta em produo de prognie viral, geralmente pela interrupo do ciclo replicativo em alguma etapa. Infeco aguda: infeco de durao limitada, algumas vezes acompanhada de altos nveis de replicao. Infeco disseminada: infeco que atinge vrios rgos e tecidos do hospedeiro. Infeco latente: infeco caracterizada pela permanncia do genoma do agente no hospedeiro, com expresso gnica limitada ou ausente e sem produo de prognie infecciosa. Infeco localizada: infeco limitada a determinado stio, tecido ou rgo. Infeco persistente ou crnica: infeco que persiste por um longo tempo. Infeco persistente temporria: infeco cuja replicao viral persiste por longo tempo, porm eventualmente cessa.
Infeco produtiva: infeco que resulta na produo de prognie viral infecciosa. Infeco sistmica: infeco disseminada por vrios rgos e tecidos, geralmente disseminada pelo sangue. Infeco subclnica persistente: infeco persistente sem manifestaes clnicas perceptveis. Inibio da hemaglutinao (HI): tcnica de deteco de anticorpos que inibem a atividade hemaglutinante de determinados vrus. Inoquidade: ausncia de atividade (biolgica) deletria ao organismo. Insidiosa: infeco ou doena que se dissemina rapidamente entre hospedeiros susceptveis. Integrao: insero de um segmento de cido nuclico na molcula de outro cido nuclico. Integrase: enzima que catalisa a integrao de um segmento de cido nuclico em outra molcula de cido nuclico. Interferncia: inibio parcial ou completa da replicao viral por outro vrus. Interferons: grupo de peptdeos solveis sintetizados por clulas infectadas e por clulas do sistema imunolgico. Possuem atividade antiviral e/ou de modulao sobre a atividade de outras clulas. Interleucinas: substncias solveis (geralmente peptdeos) produzidas por leuccitos e que modulam a proliferao e funo de outras clulas. Intermedirio replicativo: molcula de cido nuclico que se constitui em um intermedirio da replicao do genoma dos vrus. Internalizao: etapa seguinte adsoro, na qual as partculas vricas (ou os nucleocapsdeos) so internalizadas na clula. Introns: seqncias intervenientes, no-codicantes, presentes na maioria dos genes de eucariotas. So removidos dos transcritos primrios pelo mecanismo de splicing. In vitro: em Virologia, geralmente se refere ao sistema de multiplicao viral em cultivos celulares. IRES (Internal Ribosomal Entry Site): estrutura secundria encontrada prxima extremidade 5 do RNA genmico de alguns vrus e que necessria para o reconhecimento do RNA pelos ribossomos da clula hospedeira para o incio da traduo. Isolado: vrus obtido a partir de hospedeiros infectados e que ainda no foi caracterizado. O termo amostra tambm utilizado para designar esses vrus. Isolamento: obteno do agente infeccioso vivel e puro.
Glossrio
879
Matriz: camada protica, geralmente composta por mltiplas molculas de uma nica protena, localizada entre o nucleocapsdeo e o envelope de alguns vrus. Maturao: etapa nal do ciclo replicativo, na qual as partculas recm-formadas adquirem infectividade. Em alguns vrus, ocorre concomitantemente com a morfognese. Membrana plasmtica: membrana celular que delimita o compartimento citoplasmtico e o separa do meio extracelular. Tambm denominada membrana celular. Memria imunolgica: propriedade que permite ao sistema imunolgico reagir de forma e magnitude diferentes em exposies subseqentes ao um mesmo antgeno. Mesognica: denominao medianamente patognicas. dada a amostras do NDV
kb: quilobase, 1.000 nucleotdeos. kDa: unidade de massa de protenas. Corresponde a 1.000 daltons. Lagging (strand): cadeia descontnua de DNA sintetizada durante a replicao semidescontnua do DNA cromossmico celular e do genoma de alguns vrus. Latncia: o mesmo que infeco latente. Leading (strand): cadeia contnua de DNA sintetizada durante a replicao semidescontnua do DNA cromossmico celular e do genoma de alguns vrus. Lentognica: denominao dada a amostras do vrus da doena de Newcastle (NDV) pouco patognicas. Letalidade: medida da mortalidade entre os animais que desenvolvem uma determinada doena. Ligase: enzima que catalisa a ligao entre extremidades de molculas de cidos nuclicos. Linfcitos B: populao de linfcitos envolvidos na resposta humoral (produo de anticorpos) e que possuem molculas de imunoglobulinas como marcadores de membrana. Linfcitos T auxiliares: populao de linfcitos cuja funo principal secretar interleucinas que estimulam e modulam a resposta imunolgica celular e humoral. Possuem molculas de TCR e CD4 como marcadores de membrana. Linfcitos T citotxicos: populao de linfcitos cuja funo principal identicar e destruir clulas infectadas por vrus. Tambm secretam algumas interleucinas. Possuem o TCR e CD8 como marcadores de membrana. Linhagem celular: populao de clulas homogneas derivadas de clulas removidas de animais e cultivadas in vitro. Linhagem contnua: linhagem de clulas homogneas e bem caracterizadas, geralmente capazes de multiplicao innita in vitro. Lise celular: morte e desintegrao da clula causada pela ruptura da membrana plasmtica. Lisossomo: vescula intracelular que contm enzimas hidrolticas envolvidas na degradao ou digesto de material internalizado por endocitose ou fagocitose. Luminmetro: luminosidade. aparelho que quantica a emisso de
Minicromossomo: estrutura semelhante aos cromossomos celulares, formada pela associao do genoma dos poliovrus e papilomavrus com protenas celulares chamadas de histonas. Mistura fenotpica: mescla de componentes fenotpicos, sem a ocorrncia de interaes genticas. Molde (ou modelo): molcula de cido nuclico utilizada como modelo para a sntese de uma molcula exatamente complementar. Monocamada (monocapa, tapete): camada nica e plana de clulas, geralmente achatadas, que se multiplicam aderidas superfcie de frascos de cultivo. Monocistrnico: segmento de DNA ou RNA que contm apenas uma regio codicante (cistron = gene). Moncito: clula sangnea da linhagem mielide que origina os macrfagos. Monmero: unidade bsica que compe as macromolculas. Morfognese: mecanismo de montagem das partculas vricas a partir dos componentes pr-formados. Tambm denominada reunio. Motif (motivo) de DNA/RNA: seqncias especcas de nucleotdeos localizadas prximas aos locais de iniciao da transcrio dos genes. Servem de stios de reconhecimento e ligao para os fatores de transcrio e RNA polimerase para o incio da transcrio. Motif (motivo) de protena: seqncia especca de aminocidos ou estrutura tridimensional especca correlacionada com alguma atividade ou funo. mRNA: RNA mensageiro, molcula de RNA intermediria na sntese protica. mRNA policistrnico: RNA mensageiro que contm mais de uma regio codicante.
Macrfago: clula derivada dos moncitos sangneos cujas funes principais so a fagocitose, digesto e reorganizao tecidual, secreo de citocinas, processamento e apresentao de antgenos a linfcitos T auxiliares. Macropinocitose: pinocitose de macromolculas ou de partculas grandes.
880
mRNA subgenmico: RNA mensageiro com extenso menor do que o genoma. miRNA: RNA pequenos produzidos durante a infeco com alguns vrus e que interferem com funes celulares e virais. Multiplicidade de infeco (moi): nmero aproximado de partculas vricas infecciosas por clula contida em uma suspenso viral inoculada em cultivo celular. Mutao: alterao da seqncia de nucleotdeos de uma molcula de cido nuclico em comparao com a molcula parental. Mutao em ponto: substituio de um nucleotdeo na molcula de cido nuclico, comparando-se com a molcula parental. Mutao espontnea: mutao que ocorre naturalmente, decorrente de erros da polimerase ou por fatores externos. Mutao induzida: mutao induzida propositalmente pelo uso de agentes qumicos ou fsicos. Mutao letal: mutao que resulta na inviabilidade absoluta do organismo que a possui. Mutao missense: mutao pontual que resulta na codicao de um aminocido diferente do original. Mutao nonsense: mutao pontual que resulta na criao de um cdon de terminao da traduo. Mutao silenciosa: mutao pontual que no resulta na alterao do aminocido codicado. Mutagnese direcionada: mutao introduzida articialmente, na qual se substitui os nucleotdeos desejados. Mutante: organismo que possui uma ou mais mutaes no genoma. Mutante atenuado: vrus mutante que possui patogenicidade e virulncia reduzidos em comparao com o organismo parental. Mutante condicional: vrus cujo fentipo mutante se manifesta apenas em algumas condies. Mutante de escape: vrus que possui mutao ou mutaes que resulta na falha de reconhecimento de suas protenas de superfcie por anticorpos neutralizantes do hospedeiro. Mutante de gama de hospedeiro: vrus mutante que possui a capacidade de infectar um conjunto de espcies hospedeiras diferente do vrus parental. Mutante de placa pequena: vrus mutante cuja replicao em cultivos celulares resulta em focos menores de destruio celular, comparando-se com o vrus parental. No-citoptico: vrus cuja replicao em cultivo celular no resulta em citopatologia aparente.
nested PCR: variao da tcnica de PCR em que um segmento interno do produto da primeira reao reamplicado em uma segunda reao. Neuraminidase: glicoprotena do envelope de alguns vrus que cliva a ligao dos vrions ao cido silico. Neuroinvasividade: propriedade de invadir o sistema nervoso central a partir de penetrao e replicao inicial em stios perifricos. Neurovirulncia: propriedade de replicar no sistema nervoso central e causar doena neurolgica. Neutralizao: supresso da capacidade infectiva. Nvel de erro limitante: freqncia de mutao limite para a viabilidade do organismo. Northern blot: tcnica de deteco de RNA que se baseia no princpio da hibridizao e utiliza oligonucleotdeos complementares a seqncias da molcula alvo como sonda. Nt: nucleotdeo de uma molcula de cido nuclico. Ncleo celular: compartimento de clulas eucariotas que contm o genoma e delimitado e separado do citoplasma por uma membrana. Nucleocapsdeo: estrutura formada pelo genoma viral associado com protenas e revestida externamente pelo capsdeo. Nucleoprotenas: protenas que se conjugam com o genoma viral, formando o core (ou ncleo). Nucleossomo: unidade estrutural da cromatina celular, formada pelo DNA enrolado ao redor de uma massa cilndrica formada pelas histonas. Ncleo viral (core): estrutura compacta formada pelo genoma associado com protenas. Oligonucleotdeo: molcula linear formada por um nmero limitado de nucleotdeos ligados entre si. Oligossacardeo: polmeros pequenos de acar. Oncogene: gene que codica uma protena capaz de induzir transformao tumoral em clulas. Oncognese: induo ou produo de neoplasias. Oncognese insercional: induo de neoplasias pela insero do genoma viral em cromossomos celulares, alterando a expresso de genes envolvidos na induo ou represso da formao de tumores. Opsonizao: revestimento de partculas por determinadas substncias (complemento, anticorpos) e que facilita a fagocitose. ORF (seqncia aberta de leitura): seqncia de nucleotdeos de um gene ou mRNA que traduzida em protena; inicia-se em
Glossrio
881
PCR em tempo real: variao da tcnica de PCR em que os resultados podem ser obtidos medida que o processo de amplicao ocorre e no apenas ao nal, como na tcnica tradicional. PCR in situ: variao da tcnica de PCR utilizada para a deteco e amplicao de cidos nuclicos diretamente em cortes de tecidos. Penetrao: etapa do ciclo replicativo dos vrus em que o nucleocapsdeo ou o genoma ultrapassam a membrana plasmtica e ganham acesso ao citoplasma celular. Pode ocorrer na superfcie celular ou em vesculas endocticas ou fagocticas. Peplmero: projeo protica presente na superfcie de alguns vrions, formada por glicoprotenas virais. Peptdeo: molcula linear composta por um nmero limitado de aminocidos unidos entre si por ligaes peptdicas. Perl eletrofortico: perl de migrao de segmentos de cidos nuclicos ou protenas em eletroforese. Perforinas: protenas presentes em clulas NK e linfcitos T citotxicos que, quando secretadas, produzem poros na membrana plasmtica das clulas-alvo. Perodo de incubao: intervalo de tempo entre a infeco de um hospedeiro e o incio dos sinais clnicos. Perodo de incubao extrnseco: perodo de replicao do vrus no artrpode vetor antes de poder ser transmitido pelo vetor. Perodo de transmissibilidade (ou comunicabilidade): perodo de excreo do agente pelo hospedeiro infectado. Perodo pr-patente: perodo entre a infeco e o incio da excreo do agente pelo hospedeiro recm-infectado. Perodo prodrmico: perodo situado no nal do perodo de incubao, quando o hospedeiro apresenta sinais inespeccos de doena. Permissividade: propriedade das clulas em permitir a ocorrncia das etapas intracelulares da replicao viral. Placa: foco localizado de alteraes morfolgicas ou destruio celular produzido pela replicao viral em monocamadas de clulas. Placas de Peyer: acmulos linfides localizados na submucosa do intestino delgado de mamferos. Plasmdeos: molculas extracromossmicas de DNA, geralmente circulares, encontradas em procariotas. Replicam independentemente do DNA cromossmico. Plasmcitos: clulas derivadas da proliferao e diferenciao dos linfcitos B, especializadas na secreo de imunoglobulinas. Polaridade negativa (sentido negativo): seqncia de nucleotdeos que complementar a seqncia do RNA mensageiro (que, por conveno, possui polaridade positiva).
um cdon iniciador (AUG) e termina em um cdon terminador (UAA, UAG ou UGA). rgos linfides secundrios: rgos linfides que servem de locais de maturao e proliferao de clulas linfides em resposta a antgenos. Origem da replicao (ori): seqncia especca do DNA (ou RNA) genmico que serve de stio de reconhecimento, ligao e incio da replicao pelo complexo enzimtico envolvido na replicao do respectivo genoma. Ovo embrionado: desenvolvimento. ovo de galinha com embrio em
Ovoscpio: aparelho utilizado para embrionados em desenvolvimento.
se
examinar
ovos
Palindrome: seqncia de nucleotdeos cuja ordem dos nucleotdeos individuais a mesma em ambas as direes. Pandemia: epidemia de propores continentais ou mundiais. Panhandle: estrutura semelhante a um cabo de panela, formada pelo pareamento de seqncias complementares localizadas nas extremidades de molculas de DNA e/ou RNA. Paraendmica: doena de ocorrncia rara, espordica. Partcula Dane: partcula vrica completa, infecciosa, do vrus da hepatite B. Partcula defectiva: partcula vrica anmala, no-infecciosa, produzida no ciclo replicativo de alguns vrus. Essas partculas geralmente contm genomas defectivos em um ou mais genes e, por isso, so capazes de replicar autonomamente. Partcula infecciosa: partcula vrica infectiva, vivel, capaz de infectar e replicar autonomamente uma clula susceptvel. Partcula viral: o mesmo que partcula vrica, vrion. Partcula vrica: o mesmo que partcula viral, vrion. Passagem (de clulas): refere-se a cada subcultivo das clulas cultivadas in vitro. Os termos repique e subcultivo tambm so utilizados. Passagem (de vrus): refere-se a uma etapa de multiplicao do vrus em clulas de cultivo. Inicia com a inoculao e termina com a coleta do sobrenadante contendo a prognie viral. Dependendo do vrus e do intervalo entre a inoculao e a coleta, cada passagem pode abranger mais de um ciclo replicativo do vrus. Patogenicidade: capacidade do agente de produzir doena nos hospedeiros. Pb: par de bases. Refere-se a unidades formadas pelo pareamento entre duas bases complementares em molculas de cido nuclico (DNA, RNA) de ta dupla. PCR: tcnica de amplicao enzimtica de seqncias especcas de cidos nuclicos pelo uso de enzimas polimerases.
882
Polaridade positiva: seqncia de nucleotdeos com o mesmo sentido do RNA mensageiro. Poliadenilao: adio de uma seqncia de adeninas (100-200) extremidade 3 do RNA mensageiro. Policistrnico: segmento de DNA ou RNA que contm mais de uma regio codicante (cistron = gene). Polimerases: enzimas que sintetizam cidos nuclicos (RNA, DNA) a partir de um molde. Polimerizao: adio seqencial de nucleotdeos durante a sntese de molculas de DNA e RNA. Poliploidia: presena de vrias cpias do genoma em um organismo. Poliprotena: protena extensa que clivada medida que vai sendo produzida, originando protenas menores com funes diversas. Poliribossomos: agregados citoplasmticos de vrios ribossomos, nos quais ocorre a traduo de RNAs mensageiros. Pontos quentes (hot spots): locais do DNA ou RNA que apresentam uma freqncia maior de mutaes do que o restante do genoma. Populao: grupo de indivduos no qual se est estudando algum aspecto relacionado sade ou doena. Populao de risco: parcela da populao que susceptvel a um determinado agente ou doena. Populao local: populao restrita geogracamente, cujos indivduos componentes interagem entre si com certa freqncia. Portador: hospedeiro que abriga o agente e permite a sua multiplicao sem manifestar sinais clnicos da infeco. Portador ativo: portador que abriga e excreta o agente. Portador passivo: portador que abriga, mas no excreta o agente. Prevalncia: freqncia relativa de um fator relacionado sade ou doena em um determinado momento em uma populao. Primases: enzimas capazes de iniciar a sntese de DNA a partir de um molde, propriedade inerente a algumas DNA polimerases. Primer: oligonucleotdeo (RNA ou DNA) que serve de iniciador para a sntese de DNA. Primovacinao: primeira administrao de um determinado antgeno a um hospedeiro. Procariota: organismo cujo material gentico no se encontra separado do restante da clula por uma membrana. Produto de PCR (amplicon): segmento de DNA ou RNA amplicado por PCR.
Prognie viral: populao de vrions resultantes da replicao viral. Promotor: seqncia de nucleotdeos do DNA localizada prxima ao local de iniciao da transcrio. Serve de stio de ligao para os fatores de transcrio e/ou RNA polimerase. Proofreading: sistema de correo de erros durante a polimerizao (sntese) de cidos nuclicos, no qual as polimerases removem nucleotdeos errados, eventualmente incorporados, e os substituem pelos nucleotdeos corretos. Protease: enzima que cliva e/ou degrada protenas. Protease de cistena: protease que cliva protenas em locais onde existem aminocidos do tipo cistena. Proteo cruzada: proteo contra agentes heterlogos, porm semelhantes, produzida pela imunizao com um determinado agente. Protena de matriz: protena estrutural que reveste internamente o envelope de alguns vrus, mediando as suas interaes com o nucleocapsdeo. Protena de fuso: protena da superfcie dos vrions responsvel pela fuso do envelope viral com a membrana celular e a conseqente penetrao do material gentico na clula hospedeira. Protena endgena: protena produzida no interior da clula. Protena estrutural: protena viral que faz parte da estrutura da partcula vrica. Protena exgena: protena de origem externa clula ou hospedeiro. Protena heterloga: protena estranha, de organismo diferente. Protena imunodominante: protena com capacidade superior de estimular o sistema imunolgico. Protena integral de membrana: protena que se encontra inserida em membranas celulares por meio de uma regio transmembrana. Protena motora: protena que participa dos sistemas de transporte de macromolculas no interior das clulas. Protena no-estrutural: protena viral que no faz parte da estrutura da partcula vrica. Protena perifrica de membrana: protena que se encontra associada com membranas, sem, no entanto, possuir uma regio transmembrana. Protena terminal (TP): protena ligada covalentemente extremidade 5 do genoma dos adenovrus. Protena truncada: protena incompleta produzida pela terminao precoce da traduo devido presena de um cdon de terminao na regio codicante.
Glossrio
883
Recombinante: organismo que contm no seu genoma material gentico heterlogo, produto de recombinao. Recrudescncia: ressurgimento patolgicos de doena. de manifestaes clnico-
Protmero: unidade estrutural dos capsdeos, forma os capsmeros. Prova biolgica: teste diagnstico da raiva, em que camundongos lactentes so inoculados pela via intracerebral com um macerado de crebro de animais suspeitos de terem contrado a enfermidade. Provrus: molcula de DNA de ta dupla, em que uma das cadeias exatamente complementar ao RNA genmico dos retrovrus. Pseudovrion: partcula vrica incompleta, no-infecciosa, dos poliomavrus e de outros vrus. Quarentena: perodo de isolamento e observao clnica de hospedeiros, para vericar se se encontram no perodo de incubao de uma doena infecciosa. Quasispecies: populao heterognea de variantes virais que compem uma populao de vrus. So tpicas de vrus RNA. Quilobase (kb): unidade de cido nuclico que equivale a 1.000 bases. Quimiotaxia: movimentao de clulas inamatrias atravs dos tecidos em resposta a estmulos qumicos. Quinase: enzima que fosforila determinados substratos. Quinesina: protena componente de um dos intracelulares de transporte de macromolculas. sistemas
Refratariedade: estado de resistncia absoluta de uma espcie animal a um agente infeccioso. Regio conservada: seqncia de nucleotdeos (ou de aminocidos) que pouco varivel entre os vrus pertencentes a uma mesma espcie viral (ou entre diferentes vrus). Regio regulatria: regio do genoma que contm promotores e enhancers e que, por isso, est envolvida na regulao da transcrio e expresso gnica. Regio intergnica (IR): seqncia de nucleotdeos nocodicante situada entre regies codicantes de genomas. Renaturao: retorno conformao e estrutura nativa original por molculas de cidos nuclicos e protenas previamente submetidas desnaturao. Replicao (de cido nuclico): sntese ou duplicao de uma molcula de cido nuclico a partir de uma molcula parental. Replicao abortiva: replicao viral interrompida em alguma etapa do ciclo e que no resulta na produo de prognie infecciosa. Replicao primria: replicao viral que ocorre no incio da infeco de um hospedeiro, geralmente em stios prximos ao local de penetrao. Replicao semidescontnua: mecanismo de replicao do DNA em que a sntese de uma das molculas realizada de forma contnua e a outra de forma descontnua. Replicao viral: denominao genrica para o processo de multiplicao dos vrus. Replicase: enzima (polimerase de RNA) envolvida na replicao do genoma de vrus RNA. Replicativo intermedirio: molcula de DNA ou RNA que se constitui em um intermedirio no processo de replicao do genoma. Replicon: molcula de cido nuclico que contm as informaes para a sua prpria replicao. Reprodutibilidade: propriedade de uma tcnica diagnstica em produzir resultados reproduzveis ou idnticos quando repetida. Reservatrio: o mesmo que hospedeiro natural. Resolvases: enzimas envolvidas na fase nal da replicao do genoma de alguns vrus, em que as molculas-lhas so individualizadas pela clivagem de multmeros ou de molculas complexadas.
Radioimunoensaio: tcnica de deteco de antgenos e anticorpos que utiliza anticorpos especcos conjugados com istopos radioativos. Reao sorolgica cruzada: reao imunolgica do soro que contm anticorpos contra um determinado agente, com antgenos de outro agente antigenicamente semelhante. Rearranjo: denominao genrica para alteraes na seqncia e estrutura de molculas de cidos nuclicos. Essa denio abrange inseres, duplicaes, delees e outras alteraes genticas. Reativao: retomada da replicao produtiva aps um perodo de infeco latente. Reatividade cruzada: o mesmo que reao sorolgica cruzada. Receptor viral: molcula da superfcie celular que serve de stio de ligao para os vrions. Recombinao: intercmbio de seqncias genmicas entre dois ou mais genomas. Recombinao homloga: recombinao entre molculas de DNA com seqncias semelhantes. Recombinao intramolecular: intercmbio de seqncias genmicas entre locais diferentes de uma mesma molcula de cido nuclico.
884
Resposta celular: resposta imunolgica mediada por clulas efetoras. Resposta humoral: imunoglobulinas. resposta imunolgica mediada por
codicantes de aminocidos). Tambm denominado RNA de sentido negativo, RNA de cadeia negativa ou simplesmente RNA negativo. Possui seqncia complementar ao RNA mensageiro. RNA de polaridade positiva: RNA que traduzido diretamente pelos ribossomos; possui sentido de RNA mensageiro (contm as seqncias codicantes de aminocidos). Tambm denominado RNA de sentido positivo, RNA de cadeia positiva ou simplesmente RNA positivo. RNA genmico: cido nuclico que constitui o genoma viral. Esse termo utilizado para diferenci-lo de outros RNAs virais produzidos durante o ciclo replicativo e que no so includos nos vrions. RNA intermedirio: molcula de RNA que serve de intermedirio na replicao do genoma. Possui polaridade inversa do genoma. RNA mensageiro (mRNA): RNA intermedirio da sntese protica. Produto da transcrio e de modicaes co e pstranscripcionais (adio do cap, cauda poliA, splicing). RNA apto a ser traduzido em protena RNA monocistrnico: molcula de mRNA que possui apenas uma seqncia codicante (ORF). Contm apenas um gene. RNA polimerases: enzimas que sintetizam RNAs a partir de um molde DNA ou RNA. RNA pol II: RNA polimerase celular que realiza a transcrio dos genes que codicam protenas. Sazonal ou estacional: padro de ocorrncia de uma doena, em que variaes de incidncia ocorrem a intervalos anuais, coincidentes com as estaes do ano. SDS-PAGE: tcnica de anlise de protenas e de cidos nuclicos (de baixo peso molecular), que se baseia na separao eletrofortica das molculas em um gel de poliacrilamida. Sensibilidade: capacidade da tcnica em detectar mnimas quantidades do respectivo alvo (protena, cido nuclico, vrus etc.). Sentido negativo: o mesmo que polaridade negativa (RNA). Sentido positivo: o mesmo que polaridade positiva (RNA). Seqncia-alvo: determinada regio de uma molcula de DNA ou RNA a ser amplicada por PCR. a seqncia compreendida entre os dois primers. Seqncia cis-acting: ver cis-acting. Seqncia consenso: seqncia de nucleotdeos predominante (ou mais freqente) em vrios isolados, amostras ou cepas de um mesmo vrus ou em clones de um mesmo vrus. Seqncia conservada: o mesmo que regio conservada. Seqncia regulatria: denominao genrica para uma seqncia de nucleotdeos que serve para a ligao de fatores
Resposta imune: conjunto de mecanismos efetores desencadeados em resposta estimulao antignica. Resposta imune adquirida: resposta imune montada ativamente pelo hospedeiro em resposta exposio ao antgeno. Resposta imune inata: conjunto de mecanismos inespeccos que compem a defesa do organismo contra agentes patognicos. Resposta imunolgica: conjunto de mecanismos moleculares e celulares produzidos pelo sistema imunolgico do hospedeiro em resposta a exposio a um determinado agente. Resposta primria: resposta imunolgica montada pelo hospedeiro em uma primeira exposio a um determinado antgeno. Resposta secundria: resposta imunolgica montada pelo hospedeiro em reexposies a um determinado antgeno. Ressortimento: evento de recombinao gentica caracterizada pela troca de segmentos genmicos entre dois ou mais vrus durante uma co-infeco. Ocorre somente em vrus que possuem o genoma segmentado. Retculo endoplasmtico: compartimento intracitoplasmtico, local de sntese de certas protenas e em cujo lmen essas protenas sofrem modicaes. Retrgrado: relativo direo do transporte neuronal (das extremidades dos axnios ou dendritos para o corpo neuronal). Reverso virulncia: reaquisio do fentipo virulento por um mutante viral atenuado. Ribavirina: droga que possui atividade antiviral contra alguns vrus RNA. Ribonuclease: enzima que cliva e degrada molculas de RNA. Ribonucleoprotena: complexo formado por RNA genmico e protenas virais associadas. Ribonucleotdeo redutase: enzima envolvida do metabolismo de nucleotdeos para a sntese de DNA. RNA: cido ribonuclico. RNA antigenmico: RNA com sentido contrrio (complementar) ao RNA genmico. Tambm chamado de RNA complementar ou intermedirio replicativo. RNA complementar: molcula de RNA com seqncia complementar ao genoma (tambm denominado RNA antigenmico). RNA de polaridade negativa: RNA cuja seqncia no permite a sua traduo direta pelos ribossomos (no contm as seqncias
Glossrio
885
Soropositivo: indivduo que apresenta anticorpos especcos para um determinado agente. Em algumas infeces, a soropositividade do animal indica a presena da infeco. Soroprevalncia: prevalncia de um determinado agente na populao determinada pela deteco de anticorpos especcos. a freqncia relativa de animais com anticorpos contra um agente em um determinado momento em uma populao. Sorotipo: vrus ou grupo de vrus cujos membros apresentam reatividade sorolgica cruzada entre si e que podem ser distinguidos sorologicamente de outros vrus ou grupos de vrus. Southern blot: tcnica de deteco de DNA que se baseia no princpio da hibridizao e utiliza oligonucleotdeos complementares a seqncias da molcula-alvo como sonda. Splicing: mecanismo de processamento dos transcritos primrios (RNA) resultantes da transcrio de genes descontnuos de eucariotas, pelo qual os introns so removidos, e os exons so religados entre si. Splicing alternativo: mecanismo pelo qual um transcrito pode originar diferentes mRNAs (e diferentes protenas) pela remoo diferencial de introns e ligao entre diferentes exons. Suabe: dispositivo composto por uma haste com material absorvente na extremidade utilizado para coletar secrees orgnicas para exames. Subclnica: sem manifestaes clnicas perceptveis. Substrato: composto qumico utilizado em testes imunoenzimticos, que sofre alteraes qumicas pela ao de enzimas. Substrato cromognico: substrato que muda de colorao pela ao de enzimas especcas. Substrato luminescente: substrato que emite luminosidade pela ao de enzimas especcas. Sulfato de heparina: molcula pequena conjugada com protenas de superfcie de clulas de uma diversidade de tecidos. Faz parte do (ou se constitui no) complexo molecular utilizado como receptor para alguns vrus. Surto: o mesmo que epidemia. Susceptibilidade: propriedade das clulas (ou do hospedeiro) em permitir a infeco natural e multiplicao dos vrus. Tapete celular: monocamada formada por clulas animais sobre a superfcie dos frascos de cultivo. Taq polimerase: DNA polimerase do organismo Thermophilus aquaticus amplamente utilizada para amplicao de cidos nuclicos in vitro. TATA box: pequena seqncia de timidinas e adeninas localizada prxima ao stio de iniciao da transcrio de inmeros genes e que faz parte do promotor destes genes.
de transcrio e enzima polimerase para o incio da transcrio. Signicado semelhante, porm mais abrangente e genrico do que promotor e enhancer. Seqenciamento: determinao da seqncia de nucleotdeos de uma molcula de cido nuclico. Shift antignico: alterao marcante no perl antignico de um vrus, que resulta na falha de reconhecimento por anticorpos produzidos contra o vrus original. Geralmente surge nos vrus da inuenza, fruto de ressortimento entre dois vrus diferentes com troca nos genes que codicam as glicoprotenas HA e NA. Sinal de localizao nuclear (NLS): seqncia de aminocidos presente em algumas protenas que as direcionam para o ncleo da clula. Sinal mitognico: sinal qumico (mediador) que determina o incio dos processos bioqumicos celulares que culminam com a mitose celular. Sinccio: massa celular multinucleada resultante da fuso de vrias clulas. Sistema avidina-biotina: sistema de amplicao de sinal utilizado em testes de deteco de antgeno (e anticorpos) para aumentar a sensibilidade. Baseia-se na grande anidade e nos vrios stios na biotina em que se ligam molculas de avidina. Sistema complemento: ver complemento. Sistema heterlogo: outra espcie de organismo (bactria, levedura, clula de inseto). Stios de privilgio: stios ou locais no organismo que apresentam algum tipo de restrio ao acesso de clulas e molculas envolvidas na resposta imunolgica. Sonda: oligonucleotdeo sinttico ou fragmento de DNA ou RNA conjugado com um marcador radioativo ou enzimtico utilizado para detectar seqncias especcas de cidos nuclicos em testes de hibridizao. Soroconverso: produo de anticorpos contra um determinado antgeno ou agente. Termo tambm utilizado para designar um aumento nos nveis de anticorpos contra um determinado antgeno ou agente. Sorogrupo: grupo de vrus que induzem em seus hospedeiros uma reatividade sorolgica cruzada entre si e que pode ser distinguida sorologicamente de outros grupos. Soro-hiperimune: soro animal que contm altos ttulos de anticorpos especcos contra um determinado antgeno ou agente. Sorologia: denominao genrica de mtodos destinados a detectar anticorpos especcos contra um agente em amostras clnicas (geralmente soro). Soro-neutralizao (SN): teste de deteco de anticorpos com atividade antiviral neutralizante.
886
Taxa de morbidade: freqncia de doena causada por um determinado agente em relao populao de risco exposta. Taxa de mortalidade: freqncia de morte causada por um determinado agente em relao populao de risco exposta. Taxa de mutao: freqncia de mutao determinada pelo nmero de mutaes introduzidas por unidade genmica a cada ciclo de replicao. Tegumento: substncia protica amorfa presente entre o nucleocapsdeo e o envelope dos herpesvrus. TCR: receptor de linfcitos T. Tcnica sorolgica: tcnica de deteco de anticorpos. Telomerase: enzima que replica as extremidades do DNA cromossmico celular. Template (molde ou modelo): molcula de DNA ou RNA utilizada como molde (ou modelo) pelas polimerases para a sntese de molculas exatamente complementares (molculaslhas). Tendncia secular: padro de variao de doenas cuja incidncia varia lenta e discretamente ao longo de grandes perodos. Termociclador: aparelho utilizado para a tcnica de PCR. Produz ciclos contnuos, constitudos por trs etapas, com temperaturas diferentes, que proporcionam a ocorrncia das trs reaes: desnaturao, anelamento e extenso. Teste de Coggins: teste de imunodifuso em gar, utilizado como teste ocial de diagnstico da anemia infecciosa eqina. Teste sorolgico: teste de deteco de anticorpos. Timidina quinase (TK): enzima que fosforila a timidina para a sua incorporao a molculas de DNA. Ttulo: medida relativa da quantidade de vrus infecciosos ou de anticorpos presentes em um determinado material. Ttulo viral: medida indireta do nmero de partculas vricas infecciosas presentes em um material. Titulao: mtodo de determinao do ttulo viral. Tolerncia imunolgica: ausncia de resposta imunolgica contra determinado antgeno. Topoisomerase: enzima que altera o estado superenrolado do DNA, geralmente promovendo um relaxamento do tensionamento por clivagem de uma ou das duas cadeias. Toride: forma semelhante a um fuso, porm sem a extremidade alada. Traduo: decodicao do cdigo gentico pelos ribossomos, em que cada seqncia de trs bases (cdon) convertida em um aminocido. Processo de sntese de protenas a partir da seqncia de nucleotdeos do mRNA.
Trans-acting: produto cuja funo exercida distncia. Transativador: protena celular ou viral que atua estimulando ou favorecendo a transcrio de genes. Transcrio: sntese de molculas de RNA de sentido positivo (mRNA) a partir de um molde RNA ou DNA. Transcrio reversa: sntese de molculas de DNA complementar a partir de um molde RNA. Transcriptases: enzimas virais responsveis pela transcrio do genoma dos vrus RNA (replicases). Transcriptase reversa: enzima viral que sintetiza DNA a partir de um molde RNA. Transcrito: molcula de RNA resultante da transcrio. Transcrito associado latncia (LAT): transcrito RNA detectado no ncleo de neurnios durante a infeco latente pelos alfaherpesvrus. Transcrito primrio: produto inicial da transcrio (RNA), antes de qualquer modicao. Transestadial: transmisso de agentes atravs de diferentes estgios de desenvolvimento (em organismos que as possuem em seu ciclo de vida). Transfeco: introduo do genoma viral em clulas por meios articiais para permitir a replicao. Transformao: alterao morfolgica, bioqumica ou de padro de diviso de uma clula. Transformao tumoral: transformao celular com caractersticas fenotpicas de clulas neoplsicas, tumorais. Transgnico: organismo geneticamente modicado que contm gene(s) heterlogo(s). Transio: substituio de uma base purnica por outra purnica; ou de uma pirimidina por outra pirimidina. Translocao: transposio da membrana ou da separao fsica entre compartimentos. Penetrao do genoma viral no citoplasma ou no ncleo. Transmisso area: transmisso de agentes por meio de aerossis ou de pequenas partculas transportadas pelo ar. Transmisso direta: transmisso de agentes pelo contato entre as superfcies corporais. Transmisso horizontal: transmisso de agentes indivduos, proporcionada pela convivncia e contato. Transmisso iatrognica: transmisso hospedeiros por procedimentos mdicos. de agentes entre
entre
Transmisso indireta: transmisso de agentes entre hospedeiros por intermdio de seres animados ou de objetos inanimados.
Glossrio
887
Vacina de peptdeos sintticos: vacina constituda por peptdeos sintticos (pequenas seqncias de aminocidos) correspondentes aos epitopos imunodominantes do agente de interesse. Vacina deletada: vacina que contm o agente com deleo em um ou mais genes. Vacina diferencial: o mesmo que vacina com marcador antignico. Vacina de DNA: vacina composta por molculas de DNA que contm o gene da protena contra a qual se deseja produzir resposta imunolgica. Vacina inativada: vacina que contm o agente inativado, invivel, no-replicativo. Vacina monovalente: vacina que contm antgenos de apenas um agente. Vacina multivalente: vacina que contm antgenos de vrios agentes. Vacina morta: o mesmo que vacina inativada. Vacina no-replicativa: vacina que no contm o agente replicativo. Vacina polivalente: o mesmo que vacina multivalente. Vacina viva modicada: o mesmo que vacina atenuada. Vacinao: imunizao ativa pela administrao de preparaes de antgenos. Vacinao perifocal: vacinao realizada em populaes de indivduos localizadas ao redor de um foco de uma doena infecciosa, para impedir que o agente se dissemine a partir do foco. Vacolo: vescula intracelular. Vacuolizao: formao de vacolos intracelulares. Variao antignica: variao nos componentes de superfcie (epitopos) que so reconhecidos pelos mecanismos efetores do sistema imunolgico (anticorpos e linfcitos T). Variao cclica: variao na incidncia de uma determinada doena que ocorre ciclicamente a intervalos maiores do que um ano. Variante viral: vrus com alguma diferena fenotpica em relao ao vrus parental. Variolao: procedimento emprico de imunizao de pessoas contra a varola, em que crostas e lquido de vesculas de pessoas doentes eram administrados a indivduos susceptveis para imuniz-los. Vazio sanitrio: perodo em que uma determinada rea, propriedade ou instalao deixada sem animais para se assegurar da inexistncia de possveis agentes patognicos anteriormente presentes.
Transmisso perinatal: transmisso de agentes da me para a prognie durante ou nas proximidades do parto. Transmisso transovariana: transmisso de agentes dos progenitores para a prognie por meio dos gametas. Transmisso transplacentria: transmisso de agentes da fmea para os embries ou fetos atravs da placenta. Transmisso vertical: transmisso de agentes dos progenitores para a prognie. Transporte antergrado: transporte de macromolculas do corpo neuronal em direo s extremidades dos axnios ou dendritos. Transporte axoplasmtico rpido: transporte rpido de macromolculas ao longo de axnios. Transporte retrgrado: transporte de macromolculas das extremidades dos axnios ou dendritos em direo ao corpo neuronal. Transverso: mutao que resulta na substituio de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. Tripsina: enzima utilizada para individualizar clulas de tecidos e de cultivo. Tropismo: predileo de um vrus por determinadas clulas, tecidos ou rgos. Ubiquitina: protena celular utilizada como marcador para protenas destinadas degradao. Unidade formadora de placa: unidade de medida referente quantidade de partculas infecciosas presentes em uma suspenso viral. Unidade transcripcional: segmento de DNA que abrange a regio transcrita por um evento de iniciao, elongao e terminao de transcrio. UTR (NTR): regio no-traduzida do genoma. Vacina: preparao de antgenos utilizada para induzir resposta imunolgica especca no hospedeiro. Vacina atenuada: vacina que contm o agente vivel, porm com patogenicidade e virulncia reduzidas. Vacina atenuada por deleo: vacina replicativa que contm o agente atenuado pela deleo de genes envolvidos com a virulncia. Vacina com marcador antignico: vacina que induz uma resposta sorolgica diferencivel da resposta induzida pela infeco natural. Vacina de protenas recombinantes: vacina constituda por protenas virais produzidas em organismos recombinantes (bactrias, leveduras).
888
Veculo: o mesmo que fmite. Velognica: denominao dada a amostras muito patognicas do NDV. Vetor bacteriano: bactria utilizada para carrear genes heterlogos (virais) com ns vacinais. Vetor biolgico: inseto que participa biologicamente da transmisso de um agente infeccioso. O agente geralmente amplicado ou desenvolve alguma fase do seu ciclo no organismo do vetor para, ento, ser transmitido. Vetor mecnico: inseto que participa apenas mecanicamente da transmisso de um agente infeccioso. Vetor vacinal: organismo que carreia genes heterlogos (de outro organismo) e utilizado para imunizar hospedeiros. Via de excreo: via pela qual os agentes infecciosos so excretados do hospedeiro. Via de penetrao: via pela qual os agentes infecciosos penetram no hospedeiro. Vigilncia epidemiolgica: conjunto de atividades utilizadas para monitorar continuamente a situao epidemiolgica de uma determinada doena em uma populao. Viremia: presena de vrus no sangue. Viremia ativa: viremia derivada da replicao viral em tecidos do hospedeiro. Viremia passiva: viremia derivada da introduo direta dos vrus no sangue. Viremia primria: viremia que se segue replicao primria. Ocorre precocemente durante a infeco. Viremia secundria: viremia derivada da replicao viral nos rgos e tecidos-alvo. Ocorre mais tardiamente durante a infeco. Vrion: unidade estrutural dos vrus; partcula vrica completa, infecciosa. Tambm denominada partcula viral. Viroplasma: local intracelular de replicao e morfognese dos vrus. O mesmo que fbrica viral. Virose: denominao genrica das doenas causada por vrus. Virossomo: estrutura citoplasmtica grande onde ocorrem vrias etapas do ciclo replicativo dos reovrus. Contm protenas e cidos nuclicos virais, capsdeos em diversas fases de maturao e membranas celulares. Virulncia: propriedade que se refere gravidade da doena causada pelo agente.
Vrus atenuado: vrus com patogenicidade e virulncia reduzidas (ou abolidas). Vrus citoltico (ou ltico): vrus cuja replicao resulta em lise e destruio celular. Vrus citopatognico (ou citoptico): vrus cuja replicao resulta em patologia celular (citopatologia). Vrus com marcador antignico: vrus que possui uma composio protica diferente do vrus parental e que, por isso, induz no hospedeiro uma resposta sorolgica que pode ser distinguida da resposta montada contra o vrus parental. Vrus de campo: o vrus original que circula na natureza. Constitui-se no vrus parental com o qual os mutantes e variantes so comparados. Vrus DNA: vrus que possuem o cido desoxirribonuclico (DNA) como genoma. Vrus emergente: vrus que assumiu importncia recentemente. Vrus helper: vrus que complementa determinadas funes e permite a replicao de vrus defectivos. Vrus heterlogo: vrus de outra espcie viral ou outra cepa. Vrus homlogo: vrus da mesma espcie viral e/ou mesma cepa. Vrus pH-dependente: vrus cuja fuso e penetrao na clula hospedeira dependem da reduo do pH, ocorrendo em compartimentos intracelulares. Vrus pH-independente: vrus cuja fuso e penetrao na clula hospedeira ocorrem independentemente de reduo de pH. Vrus RNA: vrus que possuem o cido ribonuclico (RNA) como genoma. Vrus temperatura sensvel (TS): variante viral que no replica com ecincia sob a temperatura corporal. Vrus vetor: vrus utilizado para carrear informao gentica (genes) de outros vrus ou organismos. Vitronectina: componente protico de membranas plasmticas celulares, utilizado como receptor ou co-receptor por alguns vrus. Zoonose: doena infecciosa transmissvel entre os animais e o homem. Western blot: tcnica imunoenzimtica de deteco de protenas.

Virologia Veterinaria - Flores

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Virologia Veterinaria - Flores

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

VIROLOGIA VETERINRIA

Eduardo Furtado Flores (ORG.)

Santa Maria, 2007

Reitor Vice-reitor Diretor da Editora Conselho Editorial

Parte I - Virologia Geral

2 Classicao e nomenclatura dos vrus

3 Deteco, identicao e quanticao de vrus

4 Gentica e evoluo viral

6 Replicao dos vrus DNA

7 Replicao dos vrus RNA

8 Patogenia das infeces vricas

9 Resposta imunolgica contra vrus

10 Epidemiologia das infeces vricas

11 Diagnstico laboratorial de infeces vricas

Parte II - Virologia Especial

32 Outras famlias virais

PARTE I VIROLOGIA GERAL

ESTRUTURA E COMPOSIO DOS VRUS

1 Introduo 2 Estrutura das partculas vricas

3 Protenas virais 4 Outros componentes dos vrions

5 Partculas vricas anmalas 6 Propriedades fsico-qumicas 7 Bibliograa consultada

2 Estrutura das partculas vricas

Poxvrus Clulas animais Bactrias Vrus e ribossomos Protenas

Microscopia tica Microscopia eletrnica

Fonte: adaptado de Flint et al.(2000).

VRUS - DEFINIES E CONCEITOS

Quadro 1.1. Conceitos e definies fundamentais.

Estrutura e composio dos vrus

Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu

Estrutura e composio dos vrus

Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu

Estrutura e composio dos vrus

Fonte: adaptada de Carter et al. (2005).

nucleocapsdeo genoma membrana lipdica envelope glicoprotenas

Adaptado de Reschke, M.; www.biographix.de

Estrutura e composio dos vrus

Estrutura e composio dos vrus

4.2 Outras protenas

4 Outros componentes dos vrions

4.5 cidos nuclicos celulares

4.6 Protenas celulares

5 Partculas vricas anmalas

Estrutura e composio dos vrus

15-22 nm, esfrico-icosadricos

DNA de cadeia simples, circular, 1.7-2,2kb

DNA de cadeia dupla, circular, superenrolada, 8 kb

120-200 nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos

DNA de cadeia dupla, linear, 120-235 kb

170- 200 x 300-450nm, ovides/retangulares

DNA de cadeia dupla, linear e contnua, 130-375 kb

175-215nm, quase esfricos ou com aspecto de prismas hexagonais

40-48nm, esfricos, ocasionalmente pleomrficos, partculas subvirais em excesso

Estrutura e composio dos vrus

28-30nm, esfrico-icosadricos 30-38nm, esfrico-icosadricos

80-220nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos

50-70nm, aproximadamente esfricos

150-300nm, pleomrficos, aproximadamente esfricos, filamentosos

70-85 x 130-380 nm, forma de projtil

RNA de cadeia simples (-), linear, 13-16kb

80 x 780-970nm (at 14.000), pleomrficos (filamentosos, forma de U ou 6

RNA de cadeia simples (-), linear, 19.1kb

90nm, esfricos (?)

80-120nm, ovides, filamentosos, aproximadamente esfricos, pleomrficos