Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus linfotrpicos de clulas T tipo I/II

(HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica Western Blot indeterminate patterns in reactive serum by antibodies against T lynphotropic virus I/II (HTLV I/II) in blood donors in Costa Rica
Ximena Corts
,

, Zaida Garca, Lorena Torres, Lizeth Taylor,

1. Departamento de Virologa. Facultad de Microbiologa. Universidad de Costa Rica. San Jos, Costa Rica. 2. Centro Internacional de Investigacin y Adiestramiento Mdico (ICMRT). Facultad de Microbiologa. Universidad de Costa Rica. San Jos, Costa Rica. 3. Subrea Laboratorios Clnicos. rea Regulacin y Sistematizacin de Servicios de Salud. Caja Costarricense de Seguro Social. San Jos, Costa Rica.

Resumen
Los virus linfotrpicos humanos tipo I y II (HTLV I/II) son retrovirus asociados a diferentes patologas. El HTLV I fue el primer retrovirus relacionado con enfermedad y ocasiona principalmente dos tipos de patologas: la leucemia o linfoma de clulas T del adulto (LTA) y la paraparesia espstica tropical (PET). El HTLV-II se ha asociado a cuadros neurolgicos similares. Centroamrica, Amrica del Sur y el Caribe se definen como reas de alta prevalencia. Para prevenir la transmisin de la infeccin de estos retrovirus, se ha implementado el tamizaje de la donacin sangunea en muchos pases, incluido Costa Rica. En donadores tamizados la tcnica de Western Blot (WB) ha demostrado una actividad incompleta de anticuerpos contra los antgenos virales. Estos patrones se definen como indeterminados. Entre diciembre del 2002 y marzo del 2006 se reportaron los siguientes resultados de WB al evaluar sueros reactivos por ensayo inmunoenzimtico: 39 (0,02%) donantes positivos, 254 (0,14%) indeterminados y 113 (0,06%) negativos. Se seleccionaron 42 muestras indeterminadas y 25 positivas para ser analizadas por un sistema comercial (HTLV I/II Blot 2.4); las positivas se clasificaron como: 15 HTLV I, 8 HTLV II y dos muestras indeterminadas. Del grupo de indeterminados se presentaron 4 resultados no concordantes: 1 HTLV II, 1 HTLV y 2 negativos. Se demostr que, en muestras nacionales, patro-nes positivos dbiles pueden estar relacionados a WB indeterminados o a reactividad parcial de infeccin por HTLV II. El patrn indeterminado ms descrito se denomina HGIP (HTLV-gag inde-terminate profile pattern) y es definido como un perfil de protenas especficas donde se presentan las bandas p19, p26, p28, p32, p36 y p53 sin la presencia de la banda p24 o alguna de las glicoprotenas del gen de la envoltura (gp 46, gp 61/68). En las muestras

nacionales se observ que 22 presentaron un patrn similar, sin la p24. Sin embargo, se observaron 6 muestras con patrones diversos que incluyen la p24. Este primer anlisis de muestras nacionales seala la necesidad de realizar un estudio molecular para determinar el estado real de infeccin por HTLV en donadores nacionales que presenten el perfil indeterminado en la tcnica de WB. Esta informacin permitir establecer asociaciones con casos verdaderos positivos o con reacciones inespecficas. Palabras clave: HTLV I / HTLV II, donantes, Western Blot, patrones indeterminados.

Abstract
Human T lymphotropic virus type I and II (HTLV I/II) are retroviruses associated with different clinical manifestations. HTLV I was the first retrovirus associated to human disease, and it is the etiological agent of two main pathologies: adult`s T-cell leukemia (ATL) and myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). HTLV-II has been related to similar neurological disorders. Central America, South America and the Caribbean are areas of high prevalence. In many countries, including Costa Rica, blood screening has been implemented to prevent retroviral blood transmission. Applying the Western Blot (WB) technique, screening for HTLV I/II in blood donors has shown incomplete antibody reactivity against viral antigens, which has been classified as an indeterminate pattern. Between december 2002 and march 2006, enzyme immunoassay (ELISA) reactive samples were reported as 39 (0,02%) positive, 254 (0,14%) indeterminate and 113 (0,06%) negative. For further study with the commercial system (HTLV I/II Blot 2.4), there were selected 42 indeterminate samples and 25 positive ones. The results for the positive group were: 15 HTLV-I, 8 HTLV-II and 2 indeterminate. In the indeterminate group we found 4 discordant results: 1 HTLV II, 1 HTLV and 2 negative samples. In this research, using national serum samples, it is weak show positive patterns can be related to indeterminate WB or to partial reactivity of HTLV II infected donors. The most characteristic indeterminate pattern is the HTLV-I gag indeterminate (HGIP), which has been defined as a protein profile which includes p19, p26, p28, p32, p36 and p53, but excludes p24 or envelope glycoproteins (gp 46, gp 61/68). In the present study, a similar pattern was observed in 22 samples. However, there were 6 samples with patterns that include p24. This first analysis of indeterminate patterns in national samples demonstrates the importance of molecular studies to establishing the HTLV infection status in national blood donors with this WB profile. This information will enable identify true positives cases and unspecific reactions. Key words: HTLV I / HTLV II, blood donors, Western Blot, indeterminate patterns.

Introduccin

Los virus linfotrpicos humanos tipo I y II (HTLV I/II) son retrovirus asociados a diferentes patologas. El HTLV I fue el primer retrovirus relacionado con enfermedad y ocasiona principalmente dos tipos de patologas: la leucemia o linfoma de clulas T del adulto (LTA) (ATL, del ingls adult T-cell leucemia) (1, 2) y la paraparesia espstica tropical (PET) (TSP del ingls tropical spastic paraparesis) (3). El HTLV-I adems se ha vinculado a cuadros como uveitis, dermatitis, artritis y otros desrdenes autoinmunes (4). El HTLV-II se ha asociado a cuadros neurolgicos similares a los inducidos por el tipo I, pero no se cuenta con la evidencia epidemiolgica suficiente para confirmar su papel como agente etiolgico (5). La distribucin geogrfica del HTLV es mundial, y Centroamrica, Amrica del Sur y el Caribe se definen como reas de alta prevalencia, con conglomerados de personas infectadas (6). Para prevenir la transmisin de la infeccin por sangre de estos retrovirus se ha implementado el tamizaje de la donacin sangunea en muchos pases y Costa Rica no ha sido la excepcin. En todo el mundo, en donadores de sangre tamizados para HTLV I/II se ha demostrado una actividad incompleta de anticuerpos contra los antgenos virales; en la tcnica de Western Blot (WB) estos patrones se definen como indeterminados (7-10). En Costa Rica entre diciembre del 2002 y diciembre del 2004 los patrones indeterminados representaron un 0,12% del total de donantes tamizados, y se obtuvo un 0,02% de positivos y un 0,06% de negativos (11). El patrn indeterminado ms comn se ha definido como un perfil de protenas especficas de grupo donde se presentan las bandas p19, p26, p28, p32, p36 y p53, sin la presencia de la banda p24 o alguna de las glicoprotenas correspondientes al gen de la envoltura (gp 46, gp 61/68) (7, 8). Este perfil se ha denominado HGIP (por sus siglas en ingls, HTLV-gag Indeterminate Profile Pattern) y se ha descrito principalmente en zonas tropicales endmicas (8, 12, 13). En el estudio previo, utilizando un sistema de WB implementado en el laboratorio del Centro Internacional de Investigacin y Adiestramiento Mdico (ICMRT: International Center for Medical Research Training), no se observ una alta frecuencia de este patrn; por el contrario, se obtuvieron patrones con bandeo mltiple que presentaban la protena 24 y/o alguna banda del gen de la envoltura (11). En el presente trabajo se pretende obtener mayor informacin con respecto al patrn de bandas indeterminado observado en muestras nacionales, caracterizar muestras positivas con patrones de bandeo dbil y comparar el WB implementado en el laboratorio (in house) con el sistema comercial.

Materiales y mtodos
Poblacin de estudio La poblacin original comprende 174.667 muestras de suero de donantes de sangre de todo el territorio nacional, que asistieron a los bancos de sangre de los laboratorios clnicos de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS) entre diciembre del 2002 y marzo del 2006. Estas muestras fueron analizadas por diferentes pruebas para detectar agentes infecciosos transmitidos por transfusin sangunea, para Virus Hepatitis C (VHC), Virus Hepatitis B (VHB), Virus Inmunodeficiencia Humana (VIH), contra el Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), contra elTreponema pallidum (sfilis) y anticuerpos tipo IgG contra los virus HTLV I/II. De esta poblacin general se seleccionaron 42 muestras indeterminadas y 25 positivas.

Muestras Las muestras fueron enviadas y transportadas como se describi de previo (11), y el suero fue almacenado a -20 C. Cada muestra se descongel para realizar la tcnica de WB "in house" y WB comercial. Western Blot El WB "in house" se realiz como se describi anteriormente (11). Por este sistema las muestras fueron procesadas por duplicado. Segn criterio del Centro de Control de Enfermedades de Atlanta de Estados Unidos (14), una muestra es negativa si no presenta bandas, positiva si reacciona contra la protena 24 del gen Gag (p24) y con una o mas protenas del gen de la envoltura (ENV) gp46 y/o gp 61/68; si no se cumple el criterio anterior se considera una muestra indeterminada. Para el WB comercial se utiliz el sistema HTLV Blot 2.4, de Genelabs Diagnostics, siguiendo las especificaciones de la casa comercial. En este sistema una muestra se considera HTLV-I positiva si reacciona con las protenas centrales (del core) p19 con o sin p24 y con 2 protenas de la envoltura, que son la recombinante especfica para HTLV-I (rgp46-I) y la recombinante especfica para HTLV I y HTLV-II, la GD21. Una muestra se considera HTLV-II positiva si reacciona con la protena central p24 con o sin p19 y las 2 protenas de la envoltura, la recombinante especfica para el tipo II (rgp46-II) y la GD21. Finalmente, si una muestra slo reacciona con la p19, la p24 y la GD21 se interpretan como positivos para HTLV, sin definir a cual tipo pertenece.

Resultados
Del total de donantes tamizados (174.667) se procesaron las muestras reactivas por ensayo immunoenzimtico (EIA); con la prueba confirmatoria de WB se obtuvieron los siguientes resultados: 39 (0,02%) donantes positivos, 254 (0,14%) donantes indeterminados y 113 (0,06%) con resultado negativo. A todas las muestras con resultado de EIA positivo se les realiz el WB "in house"; de las interpretadas como positivas en este sistema, a 25 que contaban con suficiente suero se les realiz el WB comercial. De estas muestras se clasificaron 15 como HTLV I, 8 como HTLV II y 2 muestras como indeterminadas. Al comparar estos resultados se observ que en el sistema "in house" los bandeos dbiles, an con las bandas de criterio diagnstico, se relacionaron con un resultado indeterminado. En las muestras indeterminadas se observ una amplia variedad de patrones con bandas individuales (p15, p19, p24, p28, p46, p53, p68) o patrones de dos bandas que incluyeron: p15 y p28, p19 y p28 o p32, p24 y 15 10, 28, 46 53. Igualmente, se obtuvieron patrones con bandeo mltiple (3 o ms) (cuadro 1). De este segundo grupo se seleccionaron 42 muestras que fueron analizadas por el sistema comercial. De dichas muestras 4 no fueron concordantes y se identificaron como 1 HTLV II, 1 HTLV y 2 negativas. Las muestras restantes fueron concordantes con un patrn indeterminado. Una de las muestras indeterminadas por el sistema "in house" se negativiz en la segunda y tercera muestra en el mismo sistema, reduciendo a 3 las muestras no concordantes.

En las muestras procesadas por el sistema comercial se observ que 17 presentaron el perfil de p19, p26, p28 y p36 (figura 1) y 5 ms presentaron un patrn similar. Este patrn es semejante al HGIP descrito, que incluye p19, p26, p28, p32, p36 y p53 sin la p24. Sin embargo, tambin se observaron 6 muestras con patrones diversos que incluyen la banda p24 (cuadro 2).

Discusin
Actualmente no se ha determinado la importancia clnica de patrones de WB indeterminados. El tamizaje de donantes nacionales ha sealado que la prevalencia de patrones indeterminados es mayor a la de muestras positivas y negativas, 0,13% vs 0,02 y 0,06%, respectivamente (11). Conocer el significado de estos resultados indeterminados es de suma importancia para el seguimiento integral de los casos. Se ha postulado que los pacientes con perfiles indeterminados HGIP no se asocian a infeccin por este virus; sin embargo, diferentes estudios han demostrado que patrones indeterminados pueden presentar reacciones en cadena de la polimerasa positivas (13, 15) y en algunos casos se han relacionado con la presencia de la banda GD21 (16, 17). En este estudio se detect una muestra indeterminada que present la banda GD21 (figura 1). Por otra parte, se han propuesto diversas hiptesis para la presencia de WB indeterminados, por ejemplo, presencia de secuencias provirales (16), cargas virales bajas (18), o presencia de HTLV-defectuoso (19). Recientemente se describi el HTLV3 que presenta homologa parcial con los anteriores y podra producir reacciones cruzadas (20). En el presente estudio el sistema comercial detect una muestra que no se pudo clasificar como HTLV I o II, solamente como HTLV. Este resultado podra estar relacionado con alguna de las causas expuestas anteriormente. La comparacin de las muestras positivas e indeterminadas entre ambos WB mostr una buena concordancia (ndice Kappa: 0,8687). Las discrepancias de los resultados indeterminados se podran explicar como: una muestra negativa asociada a un resultado inespecfico del sistema "in house"; una muestra con reactividad parcial que tampoco fue asignada en forma definitiva por el sistema comercial (HTLV) o bien, clasificada como HTLV-II, que fue detectada por las protenas recombinantes especficas del sistema comercial.

HTLV II puede presentar patrones no completos de reactividad que no permite clasificarlos por el sistema "in house" (figura 2). Este resultado concuerda con lo reportado en la literatura, donde se seala que individuos infectados por HTLV II pueden presentar reactividad indeterminada en WB o INNO-LIA (21).

A pesar de que en el sistema comercial el mayor patrn detectado (42,5%) fue semejante al HGIP, en ambos sistemas se detectaron diversidad de patrones inespecficos y de patrones individuales que deben considerarse en el control y seguimiento de donadores indeterminados. Los resultados serolgicos indeterminados de la prueba confirmatoria de WB no constituyen un problema aislado, ya que son comunes en estos retrovirus, as como en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), especialmente en poblaciones de bajo riesgo. Las causas de estas reacciones son muy diversas y pueden estar asociadas a caractersticas propias de determinadas poblaciones y zonas geogrficas. Actualmente, en el pas no se conoce cules factores virales o ambientales podran estar relacionados. No obstante, es bien entendido que las reacciones de muestras indeterminadas deben ser rechazadas para uso en el banco de sangre. A consecuencia de esto, el manejo del donante de sangre con un resultado indeterminado es complicado tanto para l mismo como para el personal que da la consejera, debido a que amerita un seguimiento prolongado. El WB es necesario en el estudio de HTLV I / II; sin embargo, la alta prevalencia de indeterminados en la poblacin nacional resalta la necesidad de un criterio diagnstico ms especfico. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) podra ser una herramienta til para resolver casos indeterminados en un plazo corto.

En la actualidad no se dispone de una cura para la LTM o la M/PTE, por lo que la transmisin de estas enfermedades puede acarrear costos sociales y econmicos a largo plazo. Este es el primer anlisis de patrones indeterminados de muestras nacionales que seala la necesidad de realizar un estudio molecular para poder determinar el estado real de infeccin por retrovirus en donadores nacionales que presenten patrones indeterminados, de manera que se establezcan asociaciones con casos verdaderos positivos o con reacciones inespecficas.

Agradecimiento
Los autores agradecen al Dr. Jos Luis Salas Oviedo de la Direccin Desarrollo Servicios de Salud, rea de Regulacin y Sistematizacin, Subrea de Laboratorios Clnicos-CCSS y a todos los funcionarios que conforman la Red de Laboratorios Clnicos y Bancos de Sangre. Al Seor Marvin Aguilar (ICMRT) por la asistencia tcnica y al Dr. Cesar Vega de la O por la colaboracin brindada.

Recibido: 29-03-07 Aceptado: 19-04-07

Referencias
1. Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gadzar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type c retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci1980; 77:7415-7419. [ Links ] 2. Blattner WA, Takatsuki K, Gallo RC. Human T-cell leukemia-lymphoma virus and adult T-cell leukemia. JAMA1983; 250:1074-1080. [ Links ] 3. Gessain A, Barin E, Vernant JC, et al. Antibodies to human T-lymphotropic virus type-1 in patients with tropical spastic paraparesis. Lancet 1985; ii: 407410. [ Links ] 4. Proietti FA, Carneiro-Proietti AB, Catalan-Soares BC, Murphy EL. Global epidemiology of HTLV-1 infection and associated diseases. Oncogene 2005; 24: 60586068. [ Links ]

Diagnstico LAS PRUEBAS SOROLGICAS PARA EL DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL HTLV-YO Y HTLV-II Las muestras de suero son seleccionadas para el anticuerpo anti-HTLV-I usando 2 pruebas inmunoenzimticas autorizadas, de diferentes fabricantes, preparados con los antgenos del HTLV-I a partir del "lisado" total del virus y algunas protenas recombinantes. Estos ensayos varan en la sensibilidad para descubrir los anticuerpos para HTLV-II (4,5). Inicialmente, las muestras reactivas son probadas dos veces para reducir la posibilidad de la reactividad de ser debida a error tcnico. Especimenes que son reactivos en cualquiera de las pruebas, las pruebas reproducidas, son consideradas reactivas repetidamente. Especimenes que no reaccionan en alguna de las pruebas repetidas son considerados no reactivos (3). Mas, recientemente, antgenos recombinantes del HTLV-I, - II y gp21e estn incorporados a ELISA, mejorando la especificidad y la sensibilidad. Las pruebas adicionales, como el "immunoblot" (WB) y el anlisis por radioinmunoprecipitacin, son necesarios para interpretar, con correccin, los especimenes repetidamente reactivos. Las tales pruebas adicionales deben ser capaces de identificar los anticuerpos para protenas del core (gag) y del sobre (env) HTLV-I/II. La investigacin de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFA) para HTLV-I/II fue realizada en algunos laboratorios. Ninguna de las pruebas adicionales fue autorizada por FDA, pero ellos estn disponibles en las instituciones de la investigacin, bancos de sangre, algunos laboratorios de salud pblica, los laboratorios industriales y como pruebas "internas" en algunos laboratorios de diagnstico. Los siguientes criterios, para soropositividad de HTLV-I/II, se adoptaron por un grupo de trabajo del Servicio Norteamericano de salud Pblica (USPHS) en 1988 (3): un espcimen que es reactivo repetidamente por ELISA para HTLVI/II tiene que demostrar inmunoreactividad a la protena p24 y para un producto de gen env (el gp61/68 y/o de gp46). Ellos son considerados indeterminados. Indeterminados Los "sueros reactivos indeterminados que no satisfacen stos criterios pero ellos muestran la inmunoreactividad a por lo menos un producto. Pueden ser exigidos "Inmunoblot" y radioinmunoprecipitacin y determinar si un espcimen es positivo o indeterminado. Los especimenes de suero sin inmunoreactividad para cualquier producto del gene HTLV, en las pruebas adicionales ms especficas, son considerados falsopositivos. Varios estudios que involucran la amplificacin del provirus apoyaron la precisin de stos criterios de diagnsticos; son considerados infectados los individuos cuyos especmenes satisfacen los criterios para la positividad con HTLV-I o HTLV-II (7,70).

Diagnstico PRUEBAS SOROLGICAS PARA EL DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL HTLV-I Y HTLV-II

En contraste, personas cuyas muestras son "indeterminadas" raramente estn infectadas con cualquier uno de los virus (70,71). En raros casos, personas con reactividad para p19 y para un producto de gene de env (gp61/68 y/o gp46), mas sin reactividad para p24, fueron consideradas infectadas por el HTLV-I/II (72). Un avance importante en las pruebas sorolgicas para HTLV fue el desarrollo de una protena recombinante del env, p21e. Reactividad para p21e (ELISA y WB) fue considerada altamente sensible para infeccin por el HTLVI/II, y fue observada en casi 100% de las personas infectadas (73). Sin embargo, la especificidad de la reactividad de p21e fue interrogada (74,75). Para propsitos de notificacin y recomendacin, l a positividad de m ue stras que indican sorologicamente p21e de b era n ser confirmadas por pruebas que identifica n rea c tividad para env, como radioi n munoprecipita cin o ensayos basados en protenas recombinantes (76), o por PCR, hasta informacin adicional estar disponible. Las pruebas sorolgicas adicionales, discutidas anteriormente, son incapaces, as, de diferenciar anticuerpos a HTLV-I de HTLV-II. Fue usada la intensidad relativa de la reactividad para el p19 de protenas de mordaza y p24 en el "inmunoblot" para diferenciar HTLV-I de HTLV-II (77), mas tal diferenciacin puede no ser verdadera (78). Recientemente, fueron desarrollados varios peptdeos sintticos y protenas recombinantes para este propsito (8,9,79). As, como las pruebas adicionales previamente discutidas, todas estas pruebas son utilizadas solo para pesquisa. Datos preliminares indican que pueden ser altamente especficos para diferenciar los anticuerpos de HTLV-I y HTLV-II (8,9,79). Ni todos los especmenes de sueros HTLV-I/II-positivos pueden ser diferenciados en HTLV-I o HTLV-II, usando estas pruebas. En estos casos, son necesarios mtodos mas sofisticados, como amplificacin de pro virus o aislamiento de virus, para diferenciar infeccin por el HTLV-I o por el HTLV-II. Una de las pruebas confirmatorias ms utilizadas en el momento es el WB para HTLV-I y II (WB HTLV 2.4, Genelabs, EUA) que utiliza protenas recombinantes especficas del HTLV-I y HTLV-II y mas una regin truncada de la gp21 (GD21), adems de protenas comunes a los dos virus. As, el criterio de positividad ocurre cuando el suero reacciona contra la protena del core (gp19 o p24), GD21, la recombinante especfica del HTLV-I (RGP46-I) o la recombinante especfica del HTLV-II (RGP46-II). Cualquier otro padrn con bandas es considerado inconclusivo, o cuando no reacciona para la RG46-I o RG46-II, mas hay presencia de la GD21, como HTLV-I/II (Figura 1).

Pgina 1 1 HTLV I / II ELISA 4,0 Instrucciones de uso FOR RESEARCH USE ONLY NO USAR EN PROCEDIMIENTOS DE DIAGNSTICO FECHA DE REVISIN: 09/08 Nota: Los cambios Destacados MBG 0012-ENG-1 23082-192: (192 kit de pruebas) 23082-480: (480 kit de pruebas) NOMBRE Y USO PREVISTO El MP Diagnostics (MPD) HTLV I / II ELISA 4,0 es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas destinado a la deteccin de anticuerpos contra las clulas T humanas tipo virus linfotrpico 1 (HTLV-I) y tipo 2 (HTLV-II) en suero o plasma humano. Este kit se suministra con fines de investigacin solamente. No se pretende para el uso en el diagnstico o pronstico de la enfermedad. INTRODUCCIN De clulas T humanas (virus linfotrpicos HTLVs) son retrovirus patgenos que pueden causar graves enfermedades hematolgicas y neurolgicas en individuos infectados. La familia HTLV se compone de dos miembros bien estudiadas: HTLV-I y HTLV-II, as como dos recin descubierto miembros: HTLV-3 y HTLV-4. HTLV-I es conocido como el agente etiolgico de clulas T del adulto leucemia / linfoma (ATL), HTLV-mielopata asociada / paraparesia espstica tropical (HAM / TSP), y el HTLV asociado a uvetis.

HTLV-II infeccin tambin se ha asociado con enfermedad de leucemia y neurolgicos aunque es menos patognico que HTLV-I. Varias lneas de evidencias moleculares sugieren que HTLV-3 posee algunas de las propiedades de HTLV-I Aunque se sabe poco sobre la patogenicidad de HTLV-3. Los estudios de la distribucin geogrfica de la infeccin por HTLV-I revelan que el virus es altamente prevalente en Japn, frica, islas del Caribe y Amrica del Sur. Recientes estudios epidemiolgicos en la Estados Unidos y Europa confirmar la presencia de una prevalencia mixta de HTLV-I y HTLV-II entre las diferentes poblaciones de alto riesgo, como los usuarios de drogas por va intravenosa y transfusin destinatarios. Los virus se pueden transmitir a travs del contacto sexual, y contaminado a travs de productos sanguneos y la madre al nio a travs de la lactancia materna. El MPD HTLV I / II ELISA 4,0 es un inmunoensayo de sndwich directa que utiliza una combinacin de protenas recombinantes y de una protena de fusin recombinante tri-marcado con peroxidasa de rbano picante. Este formato de ensayo asegura la deteccin simultnea de varios especfico IgA, IgG e IgM contra HTLV-I y HTLV-II. Adems, las pruebas externas han demostrado que MPD HTLV I / II ELISA 4.0 es capaz de detectar anticuerpos contra HTLV-3/STLV-3 (vase la seccin "Rendimiento Especfico Caractersticas "). El MPD HTLV I / II ELISA 4,0 pretende ser una semi-cualitativa inmunoenzimtico ensayo para la deteccin de anticuerpos para HTLV-I y HTLV-II se ha encontrado en el suero humano o plasma. QUMICOS Y BIOLGICOS PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO Los pocillos de las tiras de microplacas de poliestireno se recubren con una mezcla de tres diferentes HTLV protenas recombinantes, que corresponden a los segmentos altamente antignicas de HTLV-I y HTLV- II virus. El conjugado se basa en una protena de fusin recombinante tri-, que est marcado con peroxidasa de rbano picante. El antgeno tri-fusin se genera mediante la clonacin de los tres fragmentos de cDNA que codifica para las tres protenas recombinantes de HTLV en un solo vector. Suero o plasma humano, diluido en el diluyente que contiene el conjugado, se incuba en estos pocillos recubiertos. HTLV-I/II anticuerpos especficos (IgA, IgG e IgM), si est presente, se unir tanto a los antgenos inmovilizados en la fase slida y el antgeno tri-fusin del conjugado. Despus de la incubacin, los pocillos es lavado a fondo para eliminar los materiales no unidos una solucin de sustrato incoloro que contiene cromgeno 3,3 ', 5,5' - tetrametilbenzidina (TMB) se aadieron a cada pocillo.

La presencia de anticuerpos especficos se indica por la presencia de un color azul despus de la incubacin, que cambia a amarillo cuando la reaccin de color se termin mediante la adicin de cido sulfrico. La intensidad de el producto de color amarillo resultante se mide a 450 nm utilizando un espectrofotmetro y se proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra. COMPONENTES DEL KIT Componente Descripcin Cantidad prevista 1. HTLV MICROPLACA Doce tiras de 8 pocillos por placa. Cada pocillo de microplaca contiene adsorbido HTLV-I y HTLV-II recombinante protenas. Contenido: 96 pocillos por placa Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 2 PLACAS 192 pruebas 5 placas 480 pruebas 2. NO REACTIVO DE CONTROL Suero humano normal, no reactivo para anti-HCV, anti-VIH- 1/2, anti HTLV-I/II y HBsAg. Contiene timerosal y de azida sdica como conservante. Contenido: 1,2 ml por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales 3. CONTROL REACTIVO Suero humano inactivado que contiene un alto ttulo de IgG anticuerpos especficos para HTLV. Contiene timerosal y de azida sdica como conservante. Contenido: 1,2 ml por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales Page 2 4. DILUYENTE Tamponada con fosfato solucin salina que contiene casena y detergente. Contiene Bronidox TM como conservante. Contenido: 50 ml por botella. Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 botella 2 botellas 5. PLACA DE CONCENTRADO DE LAVADO (20X) Salina tamponada con fosfato con Tween-20. Contiene cloroacetamida como conservante. Contenido: 120 ml por botella. Almacenamiento: 2 o C a 8 o C.. 1 botella 2 botellas 6. CONJUGADO HTLV tri-fusin antgeno marcado con peroxidasa de rbano picante. Contiene 0,02% de timerosal como conservante. Contenido: 160 l por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales 7. SUSTRATO Solucin incolora que contiene 3,3 ', 5,5' Tetrametilbencidina (TMB). Contenido: 25 ml por botella Almacenamiento: 2 o C a 8 o C en la oscuridad 1 botella 3 botellas 8. PLACA DE CUBIERTAS Adhesivo fundas para microplaca durante la incubacin. 8 piezas 12 piezas 9. INSTRUCCIONES DE USO 1 copia Nota: la solucin de parada (H 2 M 2 SO 4 ) No se proporciona en el kit. Para el protocolo de preparacin, por favor refirase a la seccin <PREPARACIN DE REACTIVOS>. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Este equipo es para uso exclusivo en investigacin. 1. Evite la contaminacin microbiana de los reactivos al abrir y extraer partes alcuotas de la viales o frascos originales. 2. No pipetear con la boca. 3. Maneje las muestras de ensayo, microplacas, controles reactivos y no reactivos como potencialmente agentes infecciosos. 4. Use bata de laboratorio y guantes desechables durante la realizacin del ensayo. Deseche los guantes en riesgo biolgico de residuos-bags. Lvese bien las manos despus. 5. Es muy recomendable que este ensayo se realiza en una cabina de riesgo biolgico. 6. Mantenga los materiales fuera de la comida y la bebida. 7. En caso de un accidente o de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase consejo mdico. 8. Consulte a un mdico inmediatamente en caso de que los materiales contaminados son ingeridos o venir en contacto con heridas abiertas u otras en la piel. 9. El cido sulfrico puede causar quemaduras. Evitar el contacto. Si entra en contacto con la piel, lvese a fondo con agua. 10. Evitar el contacto del cido sulfrico con cualquier agente oxidante o metal. 11. No exponga el sustrato a una luz intensa. 12. Limpie los derrames de materiales potencialmente infecciosos inmediatamente con papel absorbente y limpiar el rea contaminada con un agente desinfectante eficaz antes de reanudar el trabajo. PRECAUCIONES DE ANLISIS 1. Utilice slo muestras de suero o plasma con EDTA, heparina, citrato de sodio, oxalato o K cido citrato dextrosa (ACD). Antes del almacenamiento, asegrese de que cogulos de sangre o clulas sanguneas tienen se separ por centrifugacin. 2. No utilice sangre completa u otros fluidos corporales 3. Rendimiento ptimo del ensayo debe respetarse estrictamente el procedimiento del ensayo descrito en estas instrucciones de uso. Cualquier modificacin del procedimiento puede dar lugar a resultados aberrantes.

4. NO MODIFICAR NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE MUCHO JUEGO DE UNO A OTRO. Controles, conjugado y las microplacas estn ajustados para un rendimiento ptimo. Utilice slo el reactivos suministrados con el kit. 5. No utilice los componentes del kit despus de la fecha de caducidad impresa en la caja del kit. 6. Evite la contaminacin microbiana de los reactivos, al abrir y extraer partes alcuotas de la viales o frascos originales. Como esto prematuramente reducir la vida til de los kits y dar resultados errneos. Utilizar tcnicas aspticas incluyendo pipetas o puntas de pipeta desechables cuando dibujo alcuotas de los viales. 7. Para evitar la contaminacin cruzada, use una punta de pipeta nueva para cada muestra alcuotas a, y hacer no tocar la parte superior o la parte inferior de las tiras, el borde de los pozos o el lquido en los pocillos con dedos o puntas de pipeta. 8. Se recomienda que los elementos de vidrio utilizados con los reactivos deben ser lavados con 2M cido clorhdrico y se lav a fondo con agua destilada o desionizada antes de usarlo. 9. Para obtener los mejores resultados que todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (25 C 5 C) antes de utilizar. Inmediatamente despus del regreso de uso a 2 C a 8 C en almacenamiento. 10. Utilice slo la calidad de grado reactivo, agua desionizada o destilada para diluir los reactivos. 11. Todos los reactivos deben ser mezclados antes de usar. Pgina 3 12. Solucin de trabajo de conjugado debe estar recin preparado USAR. 13. No exponga los reactivos o realizar una prueba en un rea con un alto contenido de sustancias qumicas gases desinfectantes (por ejemplo, vapores de hipoclorito) durante el almacenamiento o durante las etapas de incubacin. Contacto inhibe la reaccin de color. Asimismo, no se exponga los reactivos a la luz intensa. 14. No retire microplacas de la bolsa de almacenamiento hasta inmediatamente antes de su uso. Abierto, las tiras no utilizadas deben conservarse entre 2 C y 8 C en la bolsa de almacenamiento con el desecante suministrado. 15. Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo muestras de pacientes para cada ensayo. 16. Se debe tener cuidado de evitar tocar o salpique el borde del pocillo con conjugado. No "Soplar" de la micropipeta. Se recomienda el uso de pipeteo inverso cuando posible.

17. El uso de muestras muy hemolizadas, sueros coagulada incompleta, muestras de plasma que contienen fibrina o muestras con contaminacin microbiana puede dar lugar a resultados errneos. 18. NO USE un bao de agua a incubar microplacas. 19. Durante 37 C de incubacin, la evaporacin debe ser evitado. Cubrir las placas cubiertas con adhesivos proporcionado. 20. Evitar abrir y cerrar repetidamente la puerta de la incubadora durante las etapas de incubacin. 21. Asegrese de que la parte inferior de la placa est limpio y seco y que no hay burbujas presentes en el superficie del lquido antes de leer la placa. Eliminar cualquier burbuja en el pozo, por ejemplo, por suave tapping. 22. Asegrese de que el equipo automatizado si se usa es validado antes de su uso. 23. El mantenimiento rutinario del sistema de aspiracin / lavado es muy recomendable para evitar prrroga a partir de muestras muy reactivas a las muestras no reactivas. ALMACENAMIENTO 1. Tienda MPD HTLV I / II ELISA 4.0 kit y sus componentes a 2 C a 8 C cuando no est en uso. 2. Todos los reactivos y las tiras en la condicin cerrada o sin abrir, cuando se almacena a 2 C a 8 C, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit. No congele los reactivos. 3. Los cristales se pueden formar cuando la placa Wash Concentrate (20x) se conserva entre 2 C y 8 C. Estos cristales debe ser disuelto por calentamiento a 37 C antes de su uso. 4. La estabilidad del kit despus de la primera apertura es de 12 meses. Kit de expiracin ser el da de expiracin fecha, ya sea en el estado cerrado o abierto. 5. Abierto, las tiras no utilizadas microplacas deben almacenar junto con el desecante suministrado a 2 C a 8 C en una bolsa cerrada. RECOGIDA, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO Las muestras de suero o plasma con EDTA, heparina, citrato de sodio, oxalato de K-o ACD puede ser utilizado. Antes del almacenamiento, garantizar que cogulo de sangre o clulas de la sangre se han separado por centrifugacin. Especmenes frescos se prefieren, los especmenes que se someten a congelacin y descongelacin repetidas veces no son recomendado. Las muestras deben ser almacenadas de 2 C a 8 C si la prueba se va a ejecutar dentro de los 7 das de coleccin o congelarse a -20 C si la prueba es que se retrase por ms de 7 das.

Adems, hasta 0,1% de azida sdica se puede utilizar para estabilizar las muestras de suero o plasma almacenado a 2 C a 8 C. Claro, no se prefieren muestras hemolizadas. Lipmicas, ictricas o contaminadas (partculas) deben filtrarse (0,45) o centrifugadas antes de la prueba. Las muestras pueden ser virus inactivado, aunque podra no ser ptima para la ejecucin del ensayo como potencial efecto del tratamiento sobre los anticuerpos IgM no se entiende completamente. Si es necesario, inactivar como sigue: 1. Afloje las tapas de los recipientes de suero. 2. El calor suero a 56 C durante 30 minutos en un bao de agua. 3. Permita que el suero se enfre antes de volver a apretar las tapas. 4. El suero puede conservarse congelado hasta el anlisis. MATERIALES ADICIONALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Disposable banco absorbente superior del papel y toallas de papel. 2. Tubos de polipropileno o contenedores. 3. Pipetas graduadas: 5 ml, 10 ml. 4. Multicanal capaz de dispensar 50 l, l 100, y 200 l pipeta. 5. Pipeta capaz de entregar 1-1000 l. 6. Puntas de pipeta desechables. 7. Reservorios de reactivos (cubetas), con una capacidad de 25 ml. 8. El agua desionizada o destilada, grado reactivo calidad. 9. Frascos: 500 ml, 1 litro. 10. cido sulfrico 2 M (como solucin de parada), 6 ml se requiere por placa 11. Lavador de microplacas ELISA. Alternativamente, el lavado se puede realizar manualmente mediante el uso de un pipeta multicanal entrega de volmenes de 0,3 ml y un dispositivo aspirador. 12. A 37 1 C incubadora. 13. Un doble (A 450 -A 620 ) O individual (A 450 ) Microensayo longitud de onda lector de placas. 14. Desinfectante eficaz.

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS 1. CONJUGADO DE TRABAJO un conjugado. trabajo debe prepararse inmediatamente antes de su uso. b. Mezclar CONJUGADO y diluyente antes de usar. NO GIRAR el vial conjugado. c. Diluya el conjugado con un factor de dilucin de 1:200 con diluyente. Por ejemplo, aadir 10 l conjugado en 2,0 ml de diluyente. d. Utilice slo recipientes de polipropileno o tubos. e. 6,0 ml de conjugado de trabajo es necesario para una microplaca. Page 4 TABLA DE PREPARACIN CONJUGADO Nmero de pruebas Vol. de Conjugado (l) Vol. de diluyente (ml) 24 15 3,0 48 25 5.0 72 30 6.0 96 40 8.0 2. Lave la placa diluido (1X Lave la placa) un lavado. PLACA diluido (1X Lave la placa) es estable durante 2 semanas a temperatura ambiente. b. Diluir 1 volumen de lavar la placa 20X con 19 volmenes de agua destilada (grado reactivo calidad). Mezclar bien. Aproximadamente 200 ml de tampn de lavado se necesita para lavar 1 placa. 3. Solucin de parada, 2M H 2 SO 4 (No incluido en el kit, 6ml es necesaria por placa) una. Aadir aproximadamente 11,2 ml de grado analtico lentamente cido sulfrico concentrado a 80 ml de agua destilada o desionizada (precaucin: no en orden inverso) y luego completar hasta 100 ml con ms agua. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO IMPORTANTE: - Los inmunoensayos de esta naturaleza son sensibles a la temperatura y tiempo dependiente. El cumplimiento estricto del procedimiento de ensayo se asegurar de ensayo ptimo rendimiento. Cualquier modificacin del procedimiento recomendado puede conducir a aberrantes resultados. 1. Equilibrar todos los componentes del kit y las muestras de prueba a temperatura ambiente antes de su uso. 2. Preparar CONJUGADO DE TRABAJO como descrito en la PREPARACIN DE REACTIVOS. 3. Retire una microplaca de la bolsa de aluminio. 4. Mezclar viales de muestras y control a fondo antes de su uso. 5. Llenar un depsito de reactivo con CONJUGADO DE TRABAJO. Utilizando un pipeta multicanal, se aaden 50 l de conjugado de trabajo a todos pocillos. 50 l 6. Wells A1 y B1 estn "en blanco". NO AGREGAR A LA MUESTRA Estos pozos. Aadir 50 l de diluyente por pocillo a estos pocillos. 50 l

7. Aadir 50 l de muestra de ensayo a la bien asignado, a partir de A2 bien. Esto dar una dilucin final de la muestra de 1:2. Mix pipeteando arriba y por lo menos una vez. Repita este paso con otras muestras de prueba hasta todo se aade. 50 l 8. Aadir 50 l de NO REACTIVO DE CONTROL por pocillo a los pocillos C1, D1 y E1. Mezclar pipeteando arriba y abajo al menos una vez. 50 l 9. Aadir 50 l de CONTROL REACTIVO por pocillo a los pocillos F1, G1 y H1. Mezclar pipeteando arriba y abajo al menos una vez. 50 l 10. Toque suavemente por todos los lados de la microplaca para asegurar la mezcla adecuada de la muestras y controles. Con cuidado, cubrir la microplaca con una placa Cubrir para evitar la evaporacin durante la incubacin. 11. Incubar durante 60 2 minutos a 37 1 o C en una incubadora (No utilice un bao de agua durante la incubacin). 60 2 min 37 1 o C 12. Retire y deseche la cubierta de la placa y lavar la microplaca con Lave la placa diluido (1X Lave la placa) utilizando uno de los dos mtodos recomendados: A. automtico o semi-automtico de microplacas Lavadora - Lavado de seis (6) veces con un mnimo de 300 l por pocillo por lavado. B. Manual de microplacas Lavadora - Aspirar completamente el contenido de todos los pocillos mediante la reduccin de la punta del aspirador suavemente a la parte inferior de cada uno tambin. Tenga cuidado de no rayar el interior de la BIEN LA SUPERFICIE. Llenar toda la placa con al menos 300 l / pocillo, luego aspirar inmediatamente en el mismo orden. Lleve a cabo este ciclo de seis (6) veces. 300 l por bien por lavar 13. Secar por inversin de la microplaca y golpeando firmemente sobre absorbente papel. Todos tampn de lavado placa residual debe ser borrado en seco. Color formacin puede ser inhibida durante la incubacin del sustrato por residual amortiguador placa de lavado. 14. Llenar un depsito de reactivo con el sustrato. El uso de un multicanal pipeta, aadir 100 ml de sustrato a cada pocillo. Aplique una placa Cubierta. 100 l 15. Incubar durante 30 2 minutos en la oscuridad a 37 1 o C. 30 2 min 37 1 o C 16. Retire y deseche la cubierta de la placa. 17. Usando una pipeta multicanal, aadir 50 l de cido sulfrico 2 M a cada uno pocillo para detener la reaccin de color. Toque suavemente para mezclar la placa. 50 l 18. Determinar la absorbencia de cada pocillo a 450 nm. Si un filtro dual instrumento se utiliza, la longitud de onda de referencia debe ser 620 nm. La 450/620 nm

NOTA: La absorbancia debe leerse dentro de 10 minutos despus de la adicin de la 2M H 2 SO 4 Solucin de parada. Page 5 CONTROL DE CALIDAD 1. Asegrese de que cada muestra y control es bien mezclado con el trabajo Conjugar, pipeteando arriba y abajo al menos una vez despus de la adicin. 2. Cambio del color de CONJUGADO DE TRABAJO indica que el suero o plasma ha sido aadido. 3. El blanco debe ser analizadas por duplicado, mientras que NO REACTIVO DE CONTROL y CONTROL REACTIVO por triplicado en cada placa con cada serie de muestras. 4. Los valores en blanco debe tener una absorbancia de 0,100. 5. No reactivo valores de control debe tener una absorbancia de 0,100. 6. Por lo menos 2 de los 3 valores del control reactivo debe tener absorbancia 0,600. Cualquier valor fuera de este rango no debe ser utilizado para el clculo de la media Control de reactividad (RCX). 7. Si dos valores del control reactivo se desvan ms del 30% de la media, la carrera no es vlido y se debe repetir. 8. Para los ensayos no vlidos, consulte la gua de problemas. ENSAYO DE CORTE VALOR Cada microplaca debe considerarse por separado en el clculo e interpretacin de los resultados de la ensayo, independientemente de la cantidad de placas procesadas simultneamente. La presencia o ausencia de anticuerpos especficos para HTLV-I/II se determina por la relacin absorbancia de las muestras al valor de corte (COV) de la placa. La CUT-OFF El valor se calcula como (0,25 absorbancia media + NRC): Valor de corte (COV) = 0.25 + NRCx CLCULO DE LOS RESULTADOS 1. Clculo de la No-reactiva absorbancia media del control (NRCx) Ejemplo: No. Bueno Absorbancia C1 0,020 D1 0,021 E1 0,022 Total 0,063 Significar = 0.063 / 3 = 0,021 Individuales no reactivo valores de control deben ser 0,100 unidad. Si uno no reactivo valor de control no cumple con los criterios anteriores, se debe evitar en la medida aberrante. La media de control no reactivo (NRCx) entonces debe ser recalculado usando el permaneciendo los valores individuales del control

reactivo. Todo individuo restante no reactivo de control valores deben cumplir con los criterios anteriores o el ensayo no es vlido y debe repetirse. 2. Clculo de la absorbancia media del control Reactivo (RCX) Ejemplo: No. Bueno Absorbancia E1 1,221 F1 1,144 G1 1,298 Total 3,663 Significar 3.663 / 3 = 1.221 Valores individuales del control reactivo debe ser 0,600 unidad. Si un valor de control reactivo no cumple con los criterios anteriores, debe ser excluido como aberrante. La media de control reactiva (RCX), entonces debe ser recalculado usando el permaneciendo los valores individuales del control reactivo. Todos los restantes control reactivo individuo valores deben cumplir con los criterios anteriores o el ensayo no es vlido y debe repetirse. 3. Clculo de la CUT - valor OFF (COV) CUT - valores Apagado = 0,250 + NRCx Ejemplo: NRCx = 0,021 CUT - valores Apagado = 0,250 + 0,021 = 0,271 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS 1. Las muestras con valores de absorbancia menores que el valor CUT - OFF se considera no Reactiva por el MPD HTLV 4.0 I / II ELISA. 2. Las muestras con valores de absorbancia superiores o iguales a la CUT - OFF son de valor consider inicialmente reactivo por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA y debe ser analizado de nuevo por duplicado antes de la interpretacin. 3. Los especmenes encontrados reactiva en un nuevo anlisis puede ser interpretado como r epeatedly reactiva para anticuerpos frente a HTLV-I/II por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA. 4. Inicialmente, las muestras reactivas que no son reactivos en nuevas pruebas se consideran negativas por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA. CARACTERSTICAS ESPECFICAS DE FUNCIONAMIENTO Sensibilidad 515 HTLV-I/II positivo, 40 HTLV indeterminado y 11 HTLV-3/STLV-3 muestras positivas fueron Estudi en tres sitios, entre ellos uno de la casa, dos en Francia. Los resultados, resumidos en la Tabla 1, mostr una tasa de deteccin del 100% para 515 muestras confirm HTLV-I/II positivos, y casi 72,7% (8/11) para HTLV-3/STLV-3 (homlogo de simio de HTLV-3) muestras positivas. Pgina 6 Tabla 1: Tasa de deteccin de anticuerpos contra el HTLV-I y HTLV-II en varios grupos de muestras HTLV MPD HTLV-I/II ELISA 4,0 Tipo de muestra N de muestras Reactivo Negativo Confirmado positivo para anticuerpos contra HTLV-I/II un HTLV-I 371 371 0 371 HTLV-II 134 134 0 134 HTLV-I/II co-infeccin 6 6 0 6 HTLV seropositivos 4 4 0 4 Indeterminado HTLV 40 13 27 0 HTLV-3/STLV-3 b 11 8 3 c NA un

Todas las muestras positivas HTLV-I/II se han confirmado con un ELISA alternativo y la mayora de los las muestras se confirm adems con MPD HTLV Blot 2,4 y / o PCR. b Todas las 11 muestras positivas por PCR. Seis de las muestras son de mono (STLV-3) fuente. Las otras 5 muestras representaron purga de serie de 2 HTLV-3 individuos infectados: Lobak18 (Perfil tipable en MPD HTLV Blot 2.4) y Pyl43 (probado como indeterminado con MPD HTLV Seque 2,4). c Estas tres muestras son negativas lmite de Pyl43, cuyo HTLV-3 de carga proviral es muy baja segn lo determinado por PCR. Especificidad Un total de 5.306 muestras al azar formando parte de muestras de donantes de sangre (n = 5001), las muestras clnicas (N = 205) y muestras potencialmente interferentes (n = 100) fueron probados. Los resultados, resumidos en Tabla 2, mostr una especificidad de diagnstico de 99,82% para el donante de sangre al azar, y 100% para los muestras clnicas y muestras potencialmente interferentes. Tabla 2: Especificidad diagnstica de ELISA MPD HTLV-I/II 4,0 en varios grupos de muestras MPD HTLV I / II ELISA 4,0 Muestra Grupo N de muestras No- Reactivo Repetidamente Reactivo Confirmado Falso Positivo un Donante de sangre 5001 4990 11 9 (0,18%) Paciente hospitalizado 205 204 1 0 Embarazo clnico 50 50 0 0 VHC 10 10 0 0 VIH 20 17 3 0 H.pylori 10 10 0 0 Factor Reumatoide 10 10 0 0 Total 5306 5291 15 9 (0,18%) un Todas las muestras repetidamente reactivas se confirmaron posteriormente con MPD HTLV Blot 2.4 para descartar las muestras verdaderas positivas e indeterminadas. Reproducibilidad La precisin del ensayo del MPD HTLV 4.0 I / II ELISA se evalu en casa con tres calibradores de suero, incluyendo un control reactivo (RC), una muestra de HTLV-I positivo y un HTLV-II muestra positiva. Dentro de plazo: tres lotes de componentes de ELISA se analizaron en un 30 repeticiones por suero calibrador en 3 ocasiones. El coeficiente de variacin (CV) para los 3 calibradores en carrera diferente vari entre 6,5% y 13,6% (Tabla 3). Entre plazo: Un total de 90 observaciones se registraron para evaluar precisin entre distintas series. Estas observaciones representan 3 carreras con 3 lotes de componentes ELISA con cada suero calibrador. El coeficiente de variacin para los 3 calibradores variaron entre 8,2% y 15,7% (Tabla 3). Total precisin: tres lotes de componentes de ELISA se analizaron como 4 repeticiones por suero calibrador en cada ocasin. Esto se repite 36 veces durante un perodo de 40 das por 4 operadores. La precisin global se evalu con 430 puntos de datos normalizadas (OD / COV) obtenidos con 3 calibradores de suero. El coeficiente de variacin es de 15,9%. Tabla 3 Ensayo de reproducibilidad de MPD HTLV-I/II ELISA 4,0 Muestras Ensayo Componentes N de Replica Significar OD / COV Dentro de la corrida Precisin (CV,%) Entre plazo Precisin (CV,%) # 1 30 5,455 8,5 # 2 30 5,890 9.0 Reactivo Controle # 3 30 6,053 8.0 9,5 # 1 30 5,380 6,5 # 2 30 5,355 10,9 HTLV-I Positivo # 3 30 5,310 6,7 8,2 HTLV-II Positivo # 1 30 10,530 9,1 15,7 Page 7 GUA DE PROBLEMAS

Problema Posibles causas Solucin 1. Ensayo no es vlido debido a la fuera de especificacin absorbancia valor de blanco o NRC (> 0,100) La temperatura de incubacin fuera de rango Incorrecto volumen de dispensacin Tiempo de incubacin ms largo que el especificado Dilucin incorrecta de Trabajo Conjugado La contaminacin cruzada de los controles Control y conjugado de trabajo no est bien mixto Componente mezclado de diferentes kits Un lavado insuficiente Compruebe la preparacin de reactivos, , Aseguran los reactivos se mezclan bien antes de utilizar Revise el control de signos de contaminacin No utilice los componentes de muy diferente de los kits Verificar la calibracin y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector 2. Ensayo no es vlido debido a la fuera de especificacin absorbancia valor de RC (<0,600), o general dbil o completamente sin color desarrollo La temperatura de incubacin fuera de rango Incorrecto volumen de dispensacin El tiempo de incubacin es insuficiente Dilucin incorrecta de Trabajo Conjugado Control y conjugado de trabajo no est bien mixto Los controles y las muestras de la prueba no equilibraron a temperatura ambiente antes ensayo Deterioro de la actividad enzimtica de conjugado Deterioro de la microplaca Filtro lectura incorrecta o interferencia de camino ptico. Componente mezclado de diferentes kits

 El lavado excesivo Compruebe la preparacin de reactivos, asegurar los reactivos son bien mezclado antes de utilizar No girar vial conjugado antes utilizar Revise el control de signos de contaminacin Verifique la fecha de caducidad del kit y su componentes No utilice los componentes de muy diferente de los kits Equilibrar reactivos a la habitacin temperatura antes de su uso Verificar la calibracin y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector 3. Ensayo vlido pero en general color desarrollo es demasiado fuerte con demasiadas reactiva inicial especmenes La temperatura de incubacin fuera de rango Incorrecto volumen de dispensacin Tiempo de incubacin ms largo que el especificado Oxidacin del sustrato debido a la inadecuada almacenamiento o uso del canal sucio Preparacin incorrecta de tampn de lavado 1x Deterioro de Lavado 1X Plate Un lavado insuficiente o ineficaz Compruebe la preparacin de reactivos, asegurar los reactivos son bien mezclado antes de utilizar Revise el control de signos de contaminacin Verifique la fecha de caducidad del kit y su componentes No utilice los componentes de muy diferente de los kits Equilibrar reactivos a la habitacin temperatura antes de su uso Utilice recipientes limpios y valles Compruebe la calidad de agua destilada o agua desionizada utilizada para la dilucin Verificar la calibracin y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector

 Compruebe que 1X Wash Plate es dentro de 2 semanas despus de la vida til preparacin LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La desviacin de los procedimientos recomendados puede dar lugar a resultados aberrantes. LIMITADA EXPRESA RENUNCIA DE GARANTA El fabricante no hace ninguna garanta expresa excepto que el kit funciona como un Investigacin ensayo Slo para uso dentro de las especificaciones y limitaciones descritas en el producto Manual de instrucciones cuando se utiliza de acuerdo con las instrucciones contenidas en el mismo. La fabricante se exime de cualquier garanta expresa o implcita, incluyendo expresado tal o garanta implcita respecto a la comerciabilidad, idoneidad para el uso o utilidad implcita para cualquier otro propsitos. El fabricante est limitada al reemplazo del producto o reembolso del el precio de compra del producto. El fabricante no ser responsable ante el comprador o terceros partes por cualquier dao, perjuicio o comoquiera que las prdidas econmicas causadas por el producto en el uso o en la aplicacin de la misma.

PROBLEMAS TCNICOS / QUEJAS Debera haber un problema tcnico / queja, por favor haga lo siguiente: 1. Anote el nmero de lote del kit y la fecha de caducidad. 2. Conserve los kits y los resultados que se obtuvieron. 3. Pngase en contacto con la ms cercana oficina de MP Biomedicals o con su distribuidor local. BIBLIOGRAFA 1. Poisez BJ et al., La deteccin y el aislamiento de las partculas de retrovirus de tipo C de nuevo y cultivos de linfocitos de un paciente con linfoma cutneo de clulas T. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1980, 77:7145-7419. 2. Kalyanaraman VS, et al., Un nuevo subtipo de virus de la leucemia humana de clulas T (HTLVII) asociada con una variante de clulas T de la leucemia de clulas pilosas. Ciencia 1982; 218:571573. 3. AE Williams et al., Seroprevalencia y factores relacionados con epidemiolgicas de la infeccin por HTLV-I en US donantes de sangre. Science 1988; 240:643-646.

4. Lipka JJ, et. al., 1990. Aumento de la sensibilidad de HTLV-I en inmunoensayos Humano Retrovirology: HTLV, Edt WA Blattner, Raven Press (NY). pp 409-475. 5. Lee H. et. al., tasa alta de infeccin por HTLV-II en seropositivos drogodependientes intravenosos en Nueva Orleans. Science 1989; 244:471-475. 6. Lipka JJ et. al., ensayo modificado de Western Blot para la confirmacin y la diferenciacin de De clulas T humanas de tipo I y II Virus linfotrpico. J. Infect Dis. 1991; 164:400-403. 7. Lipka JJ et. al., separacin de clulas T humanas tipo virus linfotrpico I y II infecciones por la reactividad de anticuerpos a Epitopes.J Viral Unique. Infect. Dis. 1992; 165:268-272. 8. Hadlock KG, CJ Goh, PA Bradshaw, S. Perkins, J. Lo, RK Habbas, L. Kaplan, y Foung SKH Delineacin de un eptopo especfico inmunodominante y HTLV muy dentro el HTLV-I glicoprotena transmembrana. Blood 1995; 68 (4) :392-1399.