Instrumentao em Bioqumica Clnica

I Histrico - Incio das determinaes em laboratrios: Costa Leste dos EUA no final do sc. XIX; - Primeiros analitos: Gases sangneos, substncias redutoras (acares) e compostos nitrogenados; - Anos 30: medidor de pH (Beckman), colormetro de filtro e fotmetro de chama;

Instrumentao em Bioqumica Clnica

I Histrico - Anos 40: espectrofotmetro de luz ultravioleta (Beckman); - Anos 50: balanas automticas, potencimetros, ampermetros, tituladores automticos, contador hematolgico (Coulter); - Anos 60: analisadores acoplados a computadores que controlavam, processavam e calculavam.

Figura 1: Espectrofotmetro de absoro, marca Beckman (1940).

Instrumentao em Bioqumica Clnica

I Histrico - Anos 70: eletroforese em gel de poliacrilamida, cromatografia lquida de alta performance (HPLC), uso do laser nos aparelhos contadores de clulas; - Ainda nos 70: uso de anticorpos marcados com agentes fluorescentes, citometria de fluxo.; - Anos 80: robotizao de processos, qumica do cido nuclico (sondas de DNA);

Instrumentao em Bioqumica Clnica

I Histrico - Anos 80 e 90: descentralizao (exames em shoppings, eventos, testes de farmcia, glicosmetros portteis) - Testes baseados em anlise do DNA: paternidade, propenso doenas, diagnstico de causas de doenas, etc

Instrumentao em Bioqumica Clnica

II Anlises baseadas em propriedades da luz 2.1 Radiaes eletromagnticas - Luz: uma radiao eletromagntica que se propaga na forma de pulsos;

- A luz uma energia que se propaga em pulsos; - Cada cor de luz se propaga em ondas com comprimento varivel, dependendo da cor.

Comprimento de onda (em nm)

... Lembrando que 1nm = 10-9m

Figura 2: Espectro de absoro da radiao eletromagntica. Note a faixa do vsvel, ou seja, que pode ser percebida pelo olho humano.

Comprimento de onda (em nm) ou

Figura 3: Espectro de absoro da radiao eletromagntica da faixa do visvel. Quanto mais vermelha a luz, maior o seu comprimento de onda.

Apenas para comparar...

Figura 3: Escala do espectro de absoro das radiaes eletromagnticas (REM). Note que o comprimento de onda das ondas de rdio grande, por isso elas alcanam grandes distncias, enquanto que dos raios X tem comprimento de onda menor e, por isso, ficam circunscritas a uma pequena distncia.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

II Anlises baseadas em propriedades da luz 2.1 Radiaes eletromagnticas - Uso das propriedades da luz: fotometria e espectrofotometria. - Ambos os mtodos buscam isolar partes do espectro de luz; - Tornam possveis as dosagens

Instrumentao em Bioqumica Clnica

II Anlises baseadas em propriedades da luz 2.2 Fotometria - Fotometria: um mtodo para determinao da quantidade de um analito por meio intensidade da luz; - O aparelho: fotocolormetro; - Para se isolar a luz usam-se filtros; - Baseia-se na equao Lei de Lambert-Beer

Instrumentao em Bioqumica Clnica

II Anlises baseadas em propriedades da luz 2.3 Espectrofotometria - Fotometria: um mtodo para determinao da quantidade de um analito por meio da intensidade da luz; - O aparelho: espectrofotmetro; - Para se isolar a luz usa-se o prisma; - Tambm baseia-se na equao Lei de Lambert-Beer

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3 Espectrofotometria/colorimetria 2.3.1 Fundamento - Lei de Lambert-Beer: Po = Luz incidente (proveniente da lmpada) P = Luz transmitida (que passou pelo objeto) Po/P = Transmitncia (T) - Transmitncia: refere-se luz que conseguiu passar pelo objeto.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3 Espectrofotometria/colorimetria 2.3.1 Fundamento - Lei de Lambert-Beer: - Absoro: a luz que no transmitida, absorvida pela soluo (Absorbncia) A = a.b.c
Onde, a = absoro; b = percurso da luz no objeto; c = concentrao da substncia de interesse

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3 Espectrofotometria/colorimetria 2.3.1 Fundamento - Lei de Lambert-Beer: - A concentrao de uma substncia diretamente proporcional quantidade de luz absorvida. - A concentrao de uma substncia exponencialmente proporcional quantidade de luz transmitida.

A relao entre a concentrao de uma substncia numa amostra com a quantidade de luz que passa atravs dessa amostra conseguida pela frmula T = 2 Log%T. Porm, no uma relao direta! Ela tem de ser convertida (por uma tabela) em absorbncia!

Figura 5: Grfico da transmitncia versus concentrao de uma substncia numa amostra. Quanto maior a concentrao, menor a transmitncia, mas de maneira exponencial.

A relao entre a concentrao de uma substncia numa amostra com a quantidade de luz que absorvida conseguida pela frmula A = a.b.c Com isso, temos uma relao linear, direta entre a absorbncia e a concentrao de determinada substncia numa amostra. POR ISSO QUE NA FOTOMETRIA/ESPECTROFO TOMETRIA TRABALHA-SE COM ABSORBNCIA

Figura 6: Grfico da absorbncia versus concentrao de uma substncia numa amostra. Quanto maior a concentrao, mais luz absorvida, ou seja, maior a absorbncia.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro - No entanto, cada substncia absorve luz em determinado comprimento de onda; - Como aproveitar a melhor absoro da luz na espectrofotometria? - Como garantir que a mxima quantidade de luz emitida por uma lmpada no se perder?
PARTES DO ESPECTROFOTMETRO/FOTOCOLORMETRO

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro a) MONOCROMADORES: FILTROS (colormetros) OU PRISMAS/GRADES DE DIFRAO (espectrofotmetros) - So componentes que tm a funo de regular a transmisso da luz, isolando um determinado comprimento de onda.

O prisma, feito de vidro com quartzo, tem a capacidade de isolar os diversos componentes da luz. a luz com o comprimento de onda isolado que ir incidir sobre a amostra (dentro de um tubo de vidro) para que seja feita a leitura a fim de mensurar a quantidade daquela substncia na amostra. Porm, para cada substncia, requerido um comprimento de onda diferente para melhor leitura. Assim, basta regular (ou mexer) o prisma.

Figura 7: Prisma de vidro. Note a decomposio da luz branca ( esquerda) em diversas luzes, de comprimento de onda diferente.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro b) FONTE DE LUZ: - uma lmpada que tem como funo fornecer uma luz (visvel e invisvel) que passar atravs do monocromador e tambm da amostra; - Geralmente: lmpada de tungstnio e de iodeto. - Durao: 2.000 3.000 horas.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro c) FENDA DE ENTRADA: - Tem a funo de limitar a entrada da luz emitida pela fonte, evitando que ela se disperse. - Assim, o mximo de luz emitida passa pelo monocromador e tambm da amostra; - Luz desviada = erros na Lei de Beer. Portanto, indica erro na leitura!

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro d) CLULA ANALTICA OU CUBETA: - o pequeno recipiente que acomodar a amostra no ato da passagem da luz. - Deve ser o mais translcido possvel, evitando interferncias na passagem da luz. - Cubetas sujas, arranhadas, manchadas = Luz desviada = erros na Lei de Beer. Portanto, indica erro na leitura!

Figura 8: Cubeta para anlise em espectrofotometria. Pode ser feita em vidro, borossilicato, quartzo ou plstico.

Instrumentao em Bioqumica Clnica

2.3.2 Componentes de um fotmetro e) GALVANMETRO: - um medidor da intensidade de luz que chega at a clula fotoeltrica. - Quanto menos luz chega clula fotoeltrica, indica maior absorbncia da substncia, o que indica maior concentrao dessa substncia na soluo.

Fenda de entrada

Figura 9: Esquema de um aparelho de fotocolorimetria.