ANEXO I

Medios de Cultivo
NOTA Los medios de cultivo son presentados independientemente de su estado fsico. Agua Peptonada. Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 1,0 g 8.5 g 1,0 L en orden alfabtico,

Disolver los componentes de la formulacin en un litro de agua y ajustar la solucin a pH de 7,0, con solucin de hidrxido de sodio 1N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la tcnica y esterilizar a 121 C1 C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, los volmenes y el pH de la solucin deben ser iguales a los iniciales. Agua Peptonada Alcalina (APW). Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 10,0 g 10,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que despus de esterilizar ste sea de 8,5 0,2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121C. Principio de accin Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del gnero Vibrio ya que las condiciones ptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino. Agua de Peptona amortiguadora. Peptona Cloruro Sdico Fosfato sdico dibsico Fosfato potsico monobsico 10,0 g 5,0 g 3,5 g 1,5 g

Agua destilada

1,0 L

Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, despus de la esterilizacin a 7,0 en caso de ser necesario. Distribuir en recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar a 1211 durante 20,0 minutos. C Principio de accin El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperacin de clulas daadas por los procesos de conservacin de alimentos. Almidn, agar. Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Almidn de maz Agar Agua destilada 5,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 20,0 g 1,0 L

Suspender homogneamente el almidn, en 100 mL de agua destilada fra, hasta eliminar cualquier grumo. Por otra parte, disolver los dems ingredientes en 900 mL de agua, calentar y agitar continuamente. Ajustar el pH a 7.20,1 y aadir la suspensin de almidn a la solucin anterior, agitar continuamente hasta completa homogeneizacin. Esterilizar a 121 durante 15 minutos C, Principio de accin: Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de hidrolizar el almidn (polisacrido); este compuesto est constituido por un conjunto de unidades de -D-glucosa cuya estructura qumica es una hexosa. Por otra parte, se sabe que el almidn forma un complejo de color azul intenso en presencia de yodo, en ocasiones la coloracin es rojiza debido al alto contenido de dextrinas que presenta el almidn, sin embargo los mono y disacridos no se enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloracin azul ni rojiza. Algunos microorganismos contienen enzimas como las o amilasas, capaces de hidrolizar el almidn dando como productos de la reaccin mono o disacridos, por lo que al adicionar a estos azcares la solucin de yodo, no aparecer coloracin azul ni rojiza (no confundir con el color de la solucin de yodo que es caf). Arginina y glucosa, agar.

Peptona Extracto de levadura Triptona Cloruro de sodio Glucosa Clorhidrato de L-arginina Citrato frrico amnico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilada

5,0 g 3,0 g 10,0 g 20,0 g 1,0 g 5,0 g 0,5 g 0,3 g 0,2 g 13,5 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolucin del agar; envasar cantidades de 5,0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y 7,0, Esterilizar en autoclave a 121 durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el C medio inclinando los tubos. Principio de accin: La descarboxilacin del aminocido L-arginina, es realizada por microorganismos que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unin del grupo carboxilo, liberando dixido de carbono (gas) y formando putrescina, esta ltima es una diamina que se caracteriza por presentar reaccin alcalina. Por otra parte el indicador, prpura de bromocresol en medio alcalino presenta una coloracin prpura y en medio cido es amarillo. Por lo tanto si se produce putrescina el medio intensifica el color prpura por la alcalinidad producida, en caso contrario el medio no cambia de color; finalmente tambin se podr observar la fermentacin de la glucosa con su respectiva produccin de acidez, virando el medio a color amarillo verdoso. ASTEL, agar. (Ver: Soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura, agar). Baird Parker, agar. Ingredientes del medio base* Peptona de casena Extracto de levadura Extracto de carne Glicina Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua destilada 10,0 g 1,0 g 5,0 g 12,0 g 5,0 g 10,0 g 15,0 g 950,0 mL

Suspender 58,0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitacin constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a 121 C1,0 durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45 C C. Solucin de telurito de potasio: Preparar una solucin de telurito de potasio al 1% en agua, esterilizar a 121 C durante 15 minutos. La solucin puede ser almacenada por varios meses a una temperatura entre 0 y 5 C. Emulsin de yema de huevo: La preparacin de la emulsin de yema de huevo, tambin se realiza por separado, para lo cual lavar los huevos frescos con agua y jabn, enseguida limpiar los cascarones con una solucin de tintura de yodo (solucin alcohlica al 2%), o bien sumergirlos en una solucin de cloruro mercrico (1:1000); enjuagar con agua estril y secar con gasa tambin estril. En una campana de flujo laminar o en condiciones aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estril. Transferir las yemas en una probeta, hasta un volumen de 60,0 mL y completar a 90,0 mL con solucin salina isotnica estril, posteriormente verter la emulsin a un matraz Erlenmeyer que contenga perlas de vidrio estriles y agitar fuertemente para que se forme la emulsin, despus se filtra sobre gasa estril. Preparacin del medio: Medio base Solucin de telurito de potasio Emulsin de yema de huevo 95,0 mL 1,0 mL 5,0 mL

Mezclar perfectamente bien los ingredientes, manteniendo el medio a 45 C, posteriormente repartir en cajas de Petri entre 15,0 y 20,0 mL de este medio, dejar enfriar hasta solidificacin del medio. Las cajas pueden almacenarse hasta por 48 h. despus de su preparacin, conservndolas a una temperatura entre 0 y 5 C. Principio de accin: S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio metlico (Te), por esta razn las colonias se presentan de color negras metlicas de acuerdo a la siguiente reaccin: Te4+ Te0

Las lecitinas son fosfoglicridos, cuya estructura corresponde a steres de cidos grasos unidos con el cido fosfrico, glicerol y colina; son componentes normales de la yema de huevo. Las lecitinas pueden ser hidrolizadas por enzimas denominadas lecitinasas, existen 4 tipos de ellas, la A; B; C y D, siendo la C la producida generalmente por las bacterias; los productos de dicha hidrlisis son cido fosfrico y colina, por esta razn las colonias de S. aureus patgeno, al llevar a cabo la hidrlisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la

colonia negra (reduccin del telurito), adems al romperse las uniones lipoproticas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una opalescencia alrededor de la colonia. Bilis rojo violeta, agar. Peptona de carne Extracto de levadura Cloruro de sodio Lactosa Mezcla de sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada 7,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 1,5 g 0,03 g 0,002 g 13,0 g 1,0 L

Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7.40,1 y esterilizar en matraz durante 30 minutos en bao de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de accin: La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno. Bilis verde brillante, agar. Bilis de buey deshidratada Lactosa Peptona de gelatina Verde brillante Agar Agua destilada 20,0 g 10,0 g 10,0 g 0,0133 g 18,0 g 1,0 L

Suspender 40,0 g del medio en un litro de agua destilada, agitando constantemente para ayudar a la humectacin, despus hervir con agitacin constante para evitar que ste se queme. Se esteriliza en matraz a 121 C1,0 C durante 15 minutos. Principio de accin:

La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las sales biliares son derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina. Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Bilis de buey deshidratada Lactosa Peptona de gelatina Verde brillante Agua destilada 20,0 g 10,0 g 10,0 g 0,0133 g 1,0 L

Suspender 40,0 g de medio en un litro de agua destilada, agitar constantemente para ayudar a la disolucin. Distribuir el medio de cultivo en tubos de ensayo que contengan campanas de Durham. Esterilizar a 121 durante 15 minutos. Tener C cuidado que ninguna campana de Durham presente gas despus de la esterilizacin. Principio de accin: La enzima -D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa, monmeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta cidos y CO2; este ltimo subproducto se detecta en las campanas de fermentacin despus de incubar de 24 a 48 h. Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos y tambin tienen efecto txico sobre algunos microorganismos Gram negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la de ciclo pentano perhidrofenantreno. El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y la mayora de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la lactosa como el Clostridium perfringens que dara reacciones falsas positivas. BPLS modificado, agar. Peptona de carne Extracto de levadura Extracto de carne Fosfato monobsico de sodio 10,0 g 3,0 g 5,0 g 0,6 g

Fosfato dibsico de sodio (Na2HPO4) Lactosa Sacarosa Rojo de fenol Verde brillante Agar Agua destilada

1,0 g 10,0 g 10,0 g 0,09 g 0,0047 g 12,0 g 1,0 L

Suspender 52,0 g del medio en 750,0 mL de agua, para humectar los polvos insolubles, despus adicionar el resto del agua y calentar a ebullicin durante un minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas Petri. Principio de accin: En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formacin de acidez a partir del azcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no fermentan la lactosa. Brewer anaerbico, agar. Peptona de casena Peptona de soya Cloruro de sodio L-cistina Dextrosa Tioglicolato de sodio Formaldehdo sulfoxilato de sodio Azul de metileno Agar Agua destilada 10,0 g 5,0 g 5,0 g 0,4 g 10,0 g 2,0 g 1,0 g 0,002 g 12,6 g 1,0 L

Suspender 55,0 g del medio en 750,0 mL de agua para humectar perfectamente bien, posteriormente adicionar el resto del agua, agitar y calentar hasta ebullicin durante un minuto o bien hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121 durante 15 minutos; el pH final debe ser de 7.20,2. C Principio de accin: El tioglicolato de sodio consume el oxgeno ambiental, creando una atmsfera anaerbica, que es el objetivo de este medio. Adems este medio contiene ms sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehdo, los cuales garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de metileno es un indicador para reacciones de xido reduccin.

Bismuto sulfito, agar. Extracto de carne de res Mezcla de peptonas Glucosa Fosfato sdico dibsico (anhidro) Sulfato ferroso (anhidro) Sulfito de bismuto Verde brillante Agar Agua destilada pH final 5,0 g 10,0 g 5,0 g 5,0 g 0,3 g 8,0 g 0,025 g 20,0 g 1,0 L 7,60,2

Suspender todos los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta su disolucin completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45 y C verter en cajas de Petri estriles, distribuyendo de manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, ce color verde plido y deben usarse el mismo da de su preparacin. Si la coloracin es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. Principio de accin: En este medio el sulfito de bismuto acta con el verde brillante como agente selectivo para la inhibicin de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la produccin de cido sulfhdrico, mientras que la reduccin de las sales de bismuto a bismuto metlico tie las colonias de un brillo negro o caf metlico por la reduccin del sulfito a sulfuro, produciendo cido sulfhdrico. BRILA, caldo (Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo). Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC) Solucin 1: Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Solucin Stock de colorante 1000 X Agar Agua destilada 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0 mL 15,0 g 0,9 L

Ajustar el pH a 7.6, posteriormente hervir hasta que el agar se funda, despus esterilizar a 121 durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 55 C C.

Solucin stock de colorantes 1000 X: Azul de bromotimol Rojo de cresol Etanol al 95% 4,0 g 4,0 g 100,0 mL

Para obtener un color firme del medio, usar una solucin colorante stock, en lugar de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes en el alcohol etlico hasta obtener una concentracin de 4% (peso/volumen); de esta solucin se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solucin 1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55 C. Solucin 2: Celobiosa Colistina Polimixina B Agua destilada 10,0 g 400000 UI 100000 UI 0,1 L

Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfriar y agregar los antibiticos. Esterilizar por filtracin y adicionar la solucin 2 a la solucin 1, mezclar y distribuir en cajas Petri. Principio de accin: La polimixina B, es un antibitico que inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos, esto es un antibitico de espectro reducido. Permite entre otros, el desarrollo del gnero Vibrio, por ser stos Gram negativos. Adems contiene una alta concentracin de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos halotolerantes.

Cianuro, caldo (KCN). *Cianuro de potasio Polipeptona NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Agua destilada 0,5 g 3,0 g 5,0 g 0,225 g 5,64 g 1,0 L

Disolver todos los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave a 121 durante 15 min. C Principio de accin. Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiri electrones al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificacin de aqullos que carecen de dicha enzima. El cianuro interrumpe el ltimo eslabn de la cadena respiratoria, sin embargo hay microorganismos que generan su energa metablica por vas alternas. Cuenta Estndar, agar (Ver Mtodos estndar, agar). Citrato Simmons, agar. Sulfato de magnesio Fosfato dihidrogenado de amonio Fosfato dipotsico Citrato de sodio tribsico Cloruro de sodio Azul bromotimol Agar Agua destilada pH 0,2 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 5,0 g 0,08 g 15,0 g 1,0 L 7,0 0,2

Disolver 23,0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente los ingredientes. Distribur en tubos y esterilizar en autoclave a 121 durante 15 min. Inclinar los tubos despus de esterilizar. Enfriar antes de su C uso y conservar en refrigeracin (4-10 La caducidad es aproximadamente de C). 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio slido (se recomienda agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO EN EL PICO DE FLAUTA Principio de accin. El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciacin de la familia Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono. La energa puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentacin o produccin de cido lctico por la utilizacin del citrato como nica fuente de carbono. Los microorganismos podrn introducir el citrato al citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a travs de la enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato y/o dixido de carbono. El medio contiene tambin sales inorgnicas de amonio.

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, stas son degradadas a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerndose de esta forma la reaccin como positiva. Descarboxilasa (arginina, lisina y ornitina), medio base. Peptona Extracto de levadura Dextrosa (D-glucosa) Prpura de bromocresol Agua destilada 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,02 g 1,0 L

Se sugiere aadir 20,0 g de cloruro de sodio, en cada litro de medio de cultivo, cuando se desee identificar Vibrio cholerae; para Vibrio spp. haloflicos, adicionar 15,0 g de cloruro de sodio en cada litro de medio base; para otros gneros y especies de microorganismos seguir la formulacin descrita. Adicionar 5,0 g del aminocido de prueba; arginina, lisina y ornitina, en cada litro de medio base.

Como control, usar base sin suplemento (aminocido). El medio se distribuye en tubos y se esterilizan a 121 durante 10 minutos; el pH del medio despus de C esterilizar debe estar en 6.50,2 Principio de accin La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de desarrollo de los microorganismos. La descarboxilacin del aminocido que contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que poseen algunos microorganismos, provocan la liberacin del grupo carboxilo, quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza, dando una coloracin prpura. La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la descarboxilacin solamente se lleva a cabo en medio cido (por debajo de pH 6,0), el medio debe acidificarse mediante la fermentacin de la glucosa; esto quiere decir que este medio slo se utiliza para la diferenciacin de microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima descarboxilasa. Los microorganismos que son descarboxilasa negativos, pero son fermentadores de la glucosa, ocasionan que el medio se acidifique, por lo que el indicador vira a amarillo. En perodos de incubacin muy prolongados, se puede presentar

alcalinizacin de la superficie del medio, dando por consecuencia un cambio en el color del medio, esto es se intensifica el color violeta. DNA, agar. cido desoxirribonuclico (DNA) helicoidal de timo de ternera o 0,03 g equivalente Agar 1,0 g Solucin de cloruro de calcio anhidro 0,01M 0,1 mL Cloruro de sodio 1,0 g Solucin de azul de toluidina 0,1M 0,3 mL Solucin de Tris-(hidroximetil- aminometano) 0,05M, pH 9,0 100,0 mL Mezclar todos los ingredientes, excepto el azul de toluidina y agitar hasta disolucin del cido desoxirribonuclico, calentar a ebullicin. Posteriormente adicionar el azul de toluidina y distribuir en frascos pequeos con tapn de hule; NO ES NECESARIO ESTERILIZAR. Este medio es estable a temperatura ambiente an despus de 4 meses, funciona de manera correcta an despus de fundido varias veces. Principio de accin: Los cidos nucleicos, estn constituidos por azcar-fosfato-bases nitrogenadas, el azcar es la -D-desoxirribosa, que forma uniones ster con el cido fosfrico, unidas tambin a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina, dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos steres pueden ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrlisis del DNA por la nucleasa microcccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinuclotidos, son productos de la ruptura del azcar (carbono 3 y 5) con el fosfato. Es importante hacer notar que la enzima DNAasa, es ms activa sobre el DNA desnaturalizado (por calentamiento) que sobre el DNA original, adems es una caracterstica de S. aureus patgeno. Dulcitol rojo de fenol, caldo. Peptona de casena Extracto de carne Cloruro de sodio Rojo de fenol Dulcitol Agua destilada pH

10,0 g 1,0 g 5,0 g 0,018 g 10,0 g 1,0 L 7,40,2

Pesar con precisin la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solucin. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilizacin. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar

116-118 durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilizacin del medio C base SIN EL CARBOHIDRATO a 121 durante 15 min, enfriar el medio base a C 45 y agregar la solucin del carbohidrato esterilizada por filtracin en C membrana. Distribuir en tubos estriles. Conservar en refrigeracin (4-10 C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubacin. Principio de accin Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato especfico en un medio basal y producir cido o cido con gas visible. La fermentacin es un proceso anaerbio de oxidacin-reduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como el aceptor final de electrones. Los productos caractersticos de la fermentacin bacteriana son: a) cido lctico, b) cidos actico y frmico, c) cido lctico y alcohol etlico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) cido succnico a cido propinico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol isoproplico y h) cido butrico a alconol butlico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentacin del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayora de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son cidos y generaran un vire del indicador a amarillo. EC, caldo (Escherichia coli, caldo para). Bacto triptosa Bacto lactosa Bacto sales biliares No. 3 Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Agua destilada 20,0 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1,0 L

Disolver todos los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para una mejor disolucin. Ajustar el pH a 6.9 0,2 (25C) y distribuir 10 mL del medio a cada tubo de ensayo, con campanas de Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se C. deje bajar la temperatura a 75 para evitar que se introduzcan burbujas de aire C en las campanas de Durham. Principio de accin:

La lactosa es hidrolizada por la enzima -D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, generndose como subproductos glucosa y galactosa que, secuencialmente, son metabolizados hasta cidos y CO2; este ltimo se detecta en las campanas de Durham. Cuando la fermentacin de lactosa se lleva a cabo a 44.5 la prueba positiva indica presencia de Escherichia coli. C Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas particularmente los bacilos y los estreptococos fecales. La triptona constituye la fuente ms importante de nutrimentos y los fosfatos constituyen el sistema regulador del pH. El cloruro de sodio regula el equilibrio osmtico. EC-MUG, caldo (Escherichia coli, caldo con metilumbeliferil glucurnido). Preparar el caldo EC y adicionar 50,0 mg de 4-metilumbeliferil- (MUG) por cada litro medio de cultivo antes de esterilizar (121 por 15 minutos). C Principio de accin: Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas) producen la enzima -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este ltimo compuesto es fcilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta.

Eosina azul de metileno de Levin, agar (EMB-L). Peptona Lactosa Fosfato dibsico de potasio Eosina Y Azul de metileno Agua destilada 10,0 g 10,0 g 2,0 g 0,4 g 0,065 g 1,0 L

Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua, calentar a ebullicin hasta la disolucin completa. Posteriormente distribuir en porciones de 100 200 mL y esterilizar a no ms de 121 por 15 minutos; el pH debe ser de 7.1 0,2. C Fundir el medio antes de su uso y adicionar a cada porcin de 100 mL: a) 5 mL de solucin de lactosa al 20% b) 2 mL de solucin acuosa de eosina al 2% c) 4,3 mL de solucin acuosa de azul de metileno al 0,15%. Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Principio de accin El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La accin selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa y productores de una gran cantidad de cido, de aquellos microorganismos que producen poco cido, o que no fermentan la lactosa. Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa productores de gran cantidad de cido se observan de color verde metlico, esto se debe a la precipitacin de los colorantes -sobre la superficie de las colonias e incluso en la superficie del medio de cultivo-, cuando las condiciones son extremadamente cidas. Eosina azul de metileno, agar (EMB-lactosa sacarosa, agar). Peptona Lactosa Sacarosa K2HPO4 Eosina Yellow Azul de metileno Agar Agua destilada 10,0 g 5,0 g 5,0 2,0 g 0,4 g 0,065 g 13,5 g 1,0 L

Humectar y disolver los ingrediente, posteriormente hervir el medio y ajustar el pH a 7.1 0,2, esterilizar a 121C durante 15 minutos y finalmente verter en placas. Principio de accin La sacarosa y lactosa permiten distinguir al gnero Salmonella y Shigella, (porque ambas no fermentan dichos azcares), de la flora acompaante, por ejemplo Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero s la sacarosa; cuando el resto de la flora acompaante son bacterias Gram positivas, stas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno. Entrico de Hekten, agar. Proteosa peptona Extracto de levadura Lactosa Sacarosa Salicina Sales biliares 12,0 g 3,0 g 12,0 g 12,0 g 2,0 g 9,0 g

Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico amoniacal Azul de bromotimol Fucsina cida Agar Agua destilada pH final

5,0 g 5,0 g 1,5 g 0,064 g 0,1 g 13.5 g 1,0 L 7,50,2

Suspender los ingredientes en el agua destilada estril, hervir con agitacin hasta la disolucin completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60 C, posteriormente distribuir en cajas de Petri estriles en condiciones aspticas. Principio de accin La concentracin alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales (sacarosa y salicina) mejoran la diferenciacin con respecto a la lactosa, y la menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperacin. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina cida, las colonias lactosa-positivas muestran una diferencia cromtica de color amarillo, frente a las colonias lactosanegativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y ms fcilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fcilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patgenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente. El tiosulfato y el citrato frrico se utilizan para la deteccin de los organismos productores de cido sulfhdrico por reduccin del tiosulfato. Una mezcla de sales biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompaante. Se recomienda la adicin de novobiocina en una concentracin de 15,0 mg/mL, lo cual mejora la selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus. Esculina bilis, agar. Extracto de carne Peptona Sales biliares Citrato frrico amoniacal Esculina Agar Agua destilada 3,0 g 5,0 g 40,0 g 0,50 g 1,0 g 15,0 g 1000,0 mL

Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400,0 mL de agua destilada.

Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100,0 mL de agua destilada y el citrato frrico amoniacal en otros 100,0 mL de agua destilada. Mezclar todas las soluciones y completar hasta 1000,0 mL con agua destilada. Calentar la mezcla hasta la completa disolucin de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Enfriar a temperatura de 50C y aadir 100,0 mL de solucin de esculina al 1% esterilizada por filtracin. Distribuir aspticamente en tubos de ensayo y dejar solidifcar en posicin inclinada. Principio de accin La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrgeno, minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato frrico amoniacal) que contiene el medio para producer un complejo negro a caf rojizo que aparece en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las sales biliares. El agar es el agente solidifante. Extracto de Malta, agar. Extracto de malta Peptona de harina de soya Agar Agua destilada 30,0 g 3,0 g 15,0 g 1,0 L

Suspender 33.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar humectar el polvo, calentar y agitar frecuentemente, dejar hervir durante un minuto. Esterilizar a 121 durante 15 minutos. Ajustar el pH a 5.6 0,1. C Principio de accin: Se utiliza para la demostracin, aislamiento y numeracin de hongos y levaduras. A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que stos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polucin de cido tartrico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del cido. Fraser base, caldo. Digerido pancretico de casena Proteosa peptona No. 3 Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de sdio 5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 20,0 g

Fosfato disdico Fosfato monopotsico Esculina Acido nalidxico Acrilflavina HCl Cloruro de ltio Fraser caldo, suplemento Vial com 10 mL de citrato frrico amoniacal

9,6 g 1,35 g 1,0 g 0,02 g 24,0 mg 3,0 g 0,5 g

Suspender 55 g de polvo en un 1,0 L de agua destilada. Mezclar para homogeneizar. Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 minuto hasta disolucin completa. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Aspticamente aadir 10,0 mL del suplemento para caldo Fraser. Mezclar bien. Principio de accin Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrgeno, vitaminas y minerales. El fosfato de sdio y potasio son los agentes amortiguadores. La diferenciacin se ve estimulada por la adicin del citrato frrico amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la adicin de iones fierro al medio detectar la reaccin. Un ennegrecimiento del medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formacin del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro. La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de ltio, cido nalidxico y acrilflavina en la frmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como medio para inhibir el crecimiento de los enterococos. Gelatina, agar (GA). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agar Agua destilada 10,0 g 10,0 g 30,0 g 15,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolucin de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.20,2 y esterilizar en autoclave a 121 durante 15 C minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50 y distribuir en cajas de Petri. C Principio de accin:

En el caso especfico de la determinacin de V. cholerae se utiliza este medio de cultivo para purificacin de colonias sospechosas provenientes de los medios de cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia. Gelatina con sal, agar (GS). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agar Agua destilada 10,0 g 30,0 g 30,0 g 15,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en agua y hervir hasta disolucin de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.20,2 y esterilizar en autoclave a 121 durante 15 C minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50 y distribuir en cajas de Petri. Si es C necesario para inhibir la diseminacin de Vibrio spp, tal como Vibrio alginolyticus, usar entre 25,0 y 30,0 gramos de agar por litro del medio. Principio de accin: En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no, en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas proteolticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas concentraciones de sal. Gelatina con sal, caldo (GS). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agua destilada 10,0 g 30,0 g 30,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en agua y calentar si es necesario para ayudar a la disolucin del medio; ajustar el pH a 7.20,2 y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos en tubos de 13 x 100, Principio de accin: Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan algunos microorganismos. Hierro y tres azcares, agar (TSI). Peptona de carne Peptona de casena 10,0 g 10,0 g

Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Agar Rojo de fenol Sulfato ferroso amnico pentahidratado Tiosulfato de sodio Agua destilada

5,0 g 10,0 g 10,0 g 1,0 g 13,0 g 0,025 g 0,20 g 0,20 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar a ebullicin agitando ocasionalmente hasta disolucin completa. Enfriar a 60 y ajustar el pH a 7.3 C 0,2. Distribuir en volmenes de 3,0 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121 durante 15 minutos. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en C el fondo alcance una altura de 3,0 cm. y una profundidad de 4,0 cm. El medio es de color rojo. Principio de accin En esta prueba bioqumica, se pueden observar: a) fermentacin de los diferentes azcares que contiene, b) produccin de gas: CO2 e H2 y c) produccin de cido sulfhdrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacrido lo degrada la galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 ltimos azcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a travs del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energa: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la va de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, cido pirvico, llegando finalmente a travs del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energa. El indicador rojo de fenol, en medio cido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentacin de los azcares es de color rojo. La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioqumica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y cido pirvico y como productos finales: cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2O y energa. La sacarosa (1%) se pone de manifiesto virando todo el tubo a una coloracin amarilla, esto puede traer confusin, cuando se encuentra un microorganismo que no fermenta la lactosa, pero s la sacarosa, sin embargo el resultado del resto de bioqumicas ayudarn a la interpretacin de esta prueba. Otro sistema para la diferenciacin es aportado por los indicadores de cido sulfhdrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio frrico, y otro producto qumico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar

presentes. En una primera etapa de la reaccin el microorganismo en ambiente cido reaccionar con el tiosulfato de sodio para generar el cido sulfhdrico. En la segunda etapa de la reaccin este compuesto reaccionar con los iones frricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formacin del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente cido, sin embargo para la formacin del cido sulfhdrico existe una condicin cido aunque no sea visible. El TSI es un medio para la diferenciacin de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa, sacarosa y/o glucosa, y para producir cido sulfhdrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de stas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razn se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioqumica como el caldo urea o el agar urea. Hugh Leifson con glucosa 1%, medio. Peptona Extracto de levadura Cloruro de sodio Dextrosa Prpura de bromocresol Agar Agua destilada 2,0 g 0,5 g 20,0 g 10,0 g 0,015 g 3,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar; ajustar el pH a 7.40,2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a 121 durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde. C Principio de accin El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias, sin embargo la fermentacin es un proceso anaerobio y las bacterias que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas. Los microorganismos al fermentar un azcar, hidrolizan el carbohidrato, dando como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos, dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el cido pirvico. La ms importante va metablica para fermentar la glucosa es la de Embden-Meyerhof-Parnas. Al aadir un carbohidrato al medio de cultivo, se puede llevar a cabo la degradacin de ste con la subsecuente produccin de cido, lo que se hace evidente por el indicador de pH, prpura de bromocresol, el que vira a color amarillo. La degradacin se lleva a cabo mientras el medio est expuesto al aire

(esta degradacin puede ser oxidativa o fermentativa), o en ausencia del aire (degradacin fermentativa solamente). Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo seleccionado como patrn positivo, la inoculacin se hace por picadura hasta el fondo de los tubos, despus de lo cual un tubo se sella con parafina estril y otro no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculacin deber estar en fase logartmica de desarrollo. Incubar de 24 a 48 h a temperatura de 35 2 de incubacin. Una coloracin C C amarilla en ambos tubos, abierto y sellado con parafina, significa una degradacin fermentativa, mientras que una coloracin amarilla slo en el tubo abierto, indica que el carbohidrato en cuestin es degradado solamente por va oxidativa. La degradacin oxidativa se presenta slo o cercanamente en la superficie del medio, mientras que la degradacin fermentativa, se presenta en todo el tubo, inclusive en la superficie de ste. Se comprueba finalmente el crecimiento microbiano producido mediante la observacin de turbidez, si sta se observa solamente a lo largo de la lnea de la picadura (cepa no mvil) o a lo largo de todo el medio (cepa mvil). Infusin cerebro corazn, caldo. Infusin cerebro corazn, agar (BHI, caldo/ BHI, agar). Infusin de cerebro de ternera Infusin de corazn de res Peptona de gelatina Cloruro de sodio Fosfato dibsico de sodio, dodecahidratado Glucosa Agar bacteriolgico a Agua destilada a En caso de requerirse agar infusin cerebro corazn 200,0 mL 250,0 mL 10,0 g 5,0 g 2,5 g 2,0 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolucin de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en matraces o tubosde acuerdo a la monografa correspondiente y esterilizar a 121 C1,0 durante 15 minutos. En C caso de requerirse en cajas de Petri deber enfriarse a 45 y verter en C condiciones de asepsia. Principio de accin: Los componentes de la infusin de cerebro de ternera y de la infusin de corazn de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.

Kligler hierro, agar. Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Glucosa Sulfato ferroso heptahidratado Citrato de amonio frrico / citrato de amonio Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua desionizada pH 3,0 g 3,0 g 15,0 g 5,0 g 10,0 g 1,0 g 0,2 g 0,5 g 5,0 g 0,3 g 0,024 g 12,0 g 1,000 mL 7,40,2

Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolucin de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en tubos de acuerdo a la monografa correspondiente y esterilizar a 121 C1,0 durante 15 minutos. Deber enfriarse C a 45 e inclinar. C Principio de accin En esta prueba bioqumica, se pueden observar: a) fermentacin de los diferentes azcares que contiene, b) produccin de gas: CO2 e H2 y c) produccin de cido sulfhdrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacrido lo degrada la galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 ltimos azcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a travs del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energa: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la va de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, cido pirvico, llegando finalmente a travs del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energa. El indicador rojo de fenol, en medio cido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentacin de los azcares es de color rojo. La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioqumica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y cido pirvico y como productos finales: cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2O y energa. Otro sistema para la diferenciacin es aportado por los indicadores de cido sulfhdrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio frrico, y otro producto qumico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar

presentes. En una primera etapa de la reaccin el microorganismo en ambiente cido reaccionar con el tiosulfato de sodio para generar el cido sulfhdrico. En la segunda etapa de la reaccin este compuesto reaccionar con los iones frricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formacin del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente cido, sin embargo para la formacin del cido sulfhdrico existe una condicin cido aunque no sea visible. El agar Kligler hierro es un medio para la diferenciacin de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa, y para producir cido sulfhdrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de stas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razn se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioqumica como el caldo urea o el agar urea Koser citrato de, caldo. NaNH4HPO4 4H2O KH2PO4 MgSO4 7H2O Citrato de sodio 2H2O Agua destilada 1,5 g 1,0 g 0,2 g 3,0 g 1,0 L

Disolver todos los ingredientes en el agua, si es necesario calentar para ayudar a la disolucin, despus ajustar el pH final de 6,7 0,2 y distribuir preferentemente en tubos de ensayo con tapa de rosca. Esterilizar a 121 por 15 minutos. C Esta formulacin se recomienda en los Mtodos de Anlisis Oficial de AOAC y en los Mtodos Estndares para el Anlisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Principio de accin: En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la obtencin de energa. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la clula. El citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la condensacin del acetilo activo con el cido oxaloactico. El citrato es hidrolizado por la enzima citrasa, generando como productos cido oxaloactico y acetato. Estos productos son convertidos enzimticamente a cido pirvico y dixido de carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es positiva.

Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosado, caldo. Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada 3,0 g 5,0 g 5,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65 Distribuir en C. porciones de 225,0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 1211 C durante 15,0 min. Principio de accin El caldo lactosado se utiliza para la identificacin presuntiva de organismos coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo, puede tambin utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperacin de clulas daadas por los procesos de conservacin. Lauril sulfato de sodio, caldo. Bacto triptosa Bacto lactosa Fosfato potsico, dibsico Fosfato potsico, monobsico Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua destilada 20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentando si es necesario, para ayudar a la disolucin; posteriormente ajustar el pH a 6.8 0,2 a 25 y C distribuir en tubos de ensayo conteniendo campanas de Dirham la cantidad necesaria del medio. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 Antes C. de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75 para que no queden C burbujas en las campanas de Durham. Preparacin de caldo lauril sulfato de sodio de acuerdo con el inculo utilizado

INOCULO (mL) 1 10 10 20 100 100 100

CANTIDAD MEDIO TUBO (mL) 10 o ms 10 20 10 50 35 20

DE VOLUMEN DE CALDO LAURIL POR MEDIO MAS TRIPTOSA REQUERIDO g/L INOCULO (mL) 11 o ms 20 30 30 150 135 120 35,6 71,2 53,4 106,8 106,8 137,1 213,6

Principio de accin Este medio se usa como prueba presuntiva en la deteccin del grupo coliforme. El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de stos, sin embargo s se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona proporciona nitrgeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La fermentacin de la lactosa da como productos finales cido y gas, este ltimo es detectado en las campanas de fermentacin (Durham). Leche descremada reconstituida Leche descremada Verde brillante al 0,1% Agua destilada 100,0 g 0,45 mL 1,0 L

Diluirla leche descremada reconstituida en el agua destilada. Agitar circularmente hasta disolucin. Distribuir en volmenes de 225,0 mL en matraces Erlenmayer de 500 mL. Esterilizar a 1211 por 15 min. C Principio de accin La leche por ser un alimento rico en nutrientes (protenas y azcares) puede utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para

inhibir la microbiota acompaante se debe adicionar 0,45 mL de una solucin de verde brillante al 0,1%. Lisina Hierro, agar (LIA). Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa L-Lisina Citrato frrico de amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilada 5,0 g 3,0 g 1,0 g 10,0 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121C. Enfriar de 50-60C y ajustar el pH de 6,7 0,1. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfran en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm. Principio de accin La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol. Puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6,0), es necesario que se produzca previamente la acidificacin de medio de cultivo, por fermentacin de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo slo puede utilizarse para la diferenciacin de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar una alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formacin de HxS produce una coloracin negra debida al sulfuro de hierro producido. Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de algunas cepas de Proteus morganii, desamina a la lisina a cido -cetocarbnico. Este ltimo forma compuestos pardo-rojizos en la regin superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia de oxgeno. Listeria para enriquecimiento (EB) pH 7,3, caldo.

A 500 mL de caldo soya tripticasena con extracto de levadura (CSTEL) estril se le aade aspticamente 5,0 mL de cada una de las siguientes soluciones que integran el medio (solucin de acrilflavina, solucin de cicloheximida y solucin de cido nalidxico). El caldo de enriquecimiento as preparado (EB), se distribuye en matraces Erlenmeyer de 500,0 mL estrilies a razn de 250,0 mL.: Solucin de acriflavina Clorhidrato de acriflavina Agua destilada Solucin de cido nalidxico Acido nalidxico (sal sdica) Hidrxido de sodio 0,05N Solucin de cicloheximida Cicloheximida Etanol Agua destilada

15,0 mg 1.0 mL 40,0 mg 10,0 mL 50,0 mg 4,0 mL 6,0 mL

Precaucin: La cicloheximida es una sustancia qumica altamente txica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de proteccin y lavarse las manos Principio de accin Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora. El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El cido nalidxico inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora para inhibir hongos saprofticos. LMP, medio. Cloruro de litio feniletanol-moxolactam (para Listeria). Fenil etanol agar 35,5 g Glicina anhidra 10,0 g Cloruro de litio 5,0 g Solucin de moxolactam al 1% disuelto en solucin amortiguadora 2,0 mL de fosfatos de pH 6,0 Agua 1,0 L Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 50C y agregar la solucin de moxolactam previamente esterilizada por filtracin. Distribuir volmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de Petri estriles. Las placas delgadas facilitan la observacin de las colonias.

Mac Conkey, agar. Proteasa peptona o polipeptona Peptona o gelizante Lactosa Sales biliares No. 3 Cloruro de sodio Rojo neutron Cristal violeta Agar Agua destilada 3,0 g 17,0 g 10,0 g 1,5 g 5,0 g 0,03 g 0,001 g 13,5 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar si es necesario para disolver, ajustar el pH a 7.1 0,2 a 25 y esterilizar a 121 durante 15 minutos. C C Enfriar a 45-50 y vaciar en cajas Petri. C Principio de accin El agar Mac Conkey es un medio esta dada por las sales biliares positivas. El cristal violeta es un algunas bacterias Gram-positivas. fuente de nutrimentos. selectivo y diferencial. La selectividad del medio que inhiben el desarrollo de bacterias Gramcolorante que tambin inhibe el crecimiento de Finalmente, las peptonas constituyen la principal

El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa de los que no lo son, mediante el indicador de pH rojo neutro. Cuando la lactosa es fermentada, el medio de cultivo se acidifica, esto provoca el vire del indicador a rojo; por lo que las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa aparecen de color rojo oscuro o rosadas. Las colonias de las bacterias no fermentadoras de lactosa son transparentes, incoloras o mbar. Manitol rojo de fenol, caldo Peptona de casena Extracto de carne Cloruro de sodio Rojo de fenol Manitol Agua destilada pH 10,0 g 1,0 g 5,0 g 0,018 g 10,0 g 1,0 L 7,40,2

Pesar con precisin la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solucin. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilizacin. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116118 durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilizacin del medio base C

SIN EL CARBOHIDRATO a 121 durante 15 min, enfriar el medio base a 45 y C C agregar la solucin del carbohidrato esterilizada por filtracin en membrana. Distribuir en tubos estriles. Conservar en refrigeracin (4-10 C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubacin. Principio de accin Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un carbohidrato especfico en un medio basal y producir cido o cido con gas visible. La fermentacin es un proceso anaerbio de oxidacin-reduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como el aceptor final de electrones. Los productos caractersticos de la fermentacin bacteriana son: a) cido lctico, b) cidos actico y frmico, c) cido lctico y alcohol etlico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) cido succnico a cido propinico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isoproplico y h) cido butrico a alconol butlico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentacin del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayora de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son cidos y generaran un vire del indicador a amarillo. Malonato, caldo. Extracto de levadura Sulfato de amonio Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Malonato de sodio Glucosa Azul de bromotimol Agua desionizada pH 1,0 g 2,0 g 0,6 g 0,4 g 2,0 g 3,0 g 0,25 g 0,025 g 1,000 mL 6,70,2

Pesar la cantidad exacta como se indica en el rtulo. Rehidratar en el agua desionizada. Calentar la solucin suavemente. Colocar a proximadamente 3,0 mL en tubos de 13 x 100, Esterilizar en autoclave a 121 durante 15 min. C Principio de accin Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como nica fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimtico competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima no puede combinarse con el sustrato normal, el cido succnico, cesando de esta manera la funcin normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn

o utilizar el malonato como nica fuente de carbono. Microorganismos que pueden realizar esta actividad metablica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter. mCPC, agar. Ver: Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar Mtodos Estndar, agar Peptona de casena Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua destilada 5,0 g 2.5 g 1,0 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullicin para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 0,2 a 25 Distribuir en tubos de C. ensayo con tapn de rosca o en un matraz, despus esterilizar a 121 durante 15 C minutos. Enfriar a 45-50 y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola C vez cuando se necesite. Principio de accin La peptona de casena proporciona aminocidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energa. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. MTM, medio. Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio Agar Agua destilada 3,0 g 10,0 g 5,0 g 4,0 g 1,0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos y ajustar el pH final a 7,4 0,2 con HCl 0,1 N o NaOH 0,1 N. Nitratos, caldo. Nitrato de potasio Cloruro de sodio 1,0 g 0,5 g

Peptona Agua destilada

2,0 g 1,0 L

Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolucin completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 1 C durante 15 minutos. Principio de accin En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo, este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reaccin de diazoacin y copulacin) o bien llegar a nitrgeno libre, que se detecta por burbujas en el medio. Oxford, medio base (OXA). Base de agar Columbia Esculina Citrato frrico amnico Cloruro de litio Agua 39,0 g 1,0 g 0,5 g 15,0 g 1,0 L

Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullicin hasta disolucin completa. Posteriormente esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Enfriar el medio base a 50C y en condiciones aspticas agregar los siguientes suplementos: Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: Cicloheximida 400,0 mg Sulfato de colistina 20,0 mg Acriflavina 5,0 mg Cefotetan 2,0 mg Fosfomicina 10,0 mg Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1 de etanol:agua. Esterilizar por filtracin antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estriles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como mximo dos semanas. Principio de accin: La flora acompaante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato de colistina, cefotetn, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formacin de hierro (III), que producen compuestos complejos negros, que luego tien de negro las colonias de L. monocytogenes.

Papa dextrosa, agar. Infusin de papa Dextrosa Agar Agua destilada 200,0 g 20,0 g 15,0 g 1,0 L

Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectacin de los polvos, para evitar la formacin de grumos que son difciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullicin y finalmente esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en bao de agua hasta 45 1 C C, despus acidificar a un pH de 3.50,1, con cido tartrico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de cido tartrico por cada 100 mL de medio de cultivo). Despus de adicionar el cido tartrico al medio de cultivo, medir el pH con un potencimetro. Principio de accin A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusin de papa, se observa que stos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polucin de cido tartrico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del cido. Prpura de bromocresol para fermentacin de carbohidratos, caldo. Proteosa peptona No. 3 Cloruro de sodio Extracto de carne Prpura de bromocresol Agua destilada 10,0 g 5,0 g 1,0 g 0,02 g 1,0 L

Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 1 El pH final debe ser de 6,8 0,2. Posteriormente C. agregar la solucin del carbohidrato que se desee, previamente esterilizada por filtracin, para obtener una concentracin final de 0,5 %. Principio de accin Este medio sirve para observar la fermentacin de azcares con produccin de acidez. Nota: Los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales.

RM-VP, caldo (prueba de rojo de metilo y Voges Proskauer). Peptona tamponada Glucosa K2HPO4 Agua destilada 7,0 g 5,0 g 5,0 g 1000,0 mL

Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en volmenes de 10 mL en tubos de ensayo de 16x150 mm y esterilizar a 121 por C 15 minutos. El pH final debe ser de 6,9 0,2. Principio de accin La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la obtencin de energa. Los productos finales de la oxidacin de la glucosa varan dependiendo de la ruta metablica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por lo tanto se describen a continuacin dos vas: Prueba de Rojo de metilo La prueba de rojo de metilo se lleva a cabo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los cidos orgnicos generados por la fermentacin de la glucosa. El indicador de pH rojo de metilo a pH de 4.4 tiene un color rojo y a pH de 6,0 o superior, su color es amarillo. Aunque todos los microorganismos entricos fermentan la glucosa y producen cidos orgnicos, esta prueba se emplea para diferenciar Escherichia coli de Enterobacter aerogenes Estos microorganismos en las primeras h. de incubacin producen cidos orgnicos. Escherichia coli es capaz de estabilizar y mantener el pH cido (4,04.4) hasta finalizar el periodo de incubacin (24-48 h) debido a que produce ms cidos por lo que vence el sistema amortiguador. Por su parte, Enterobacter aerogenes es capaz de convertir estos cidos en productos neutros como etanol y acetilmetilcarbinol (acetoina) por lo que el pH se eleva aproximadamente a 6. Prueba de Voges-Proskauer Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de generar como productos finales del metabolismo de la glucosa, compuestos neutros como el acetilmetilcarbinol (acetoina). La glucosa es metabolizada por algunas bacterias hasta cido pirvico, la descarboxilacin de dos molculas de este cido producen la acetoina, que es un

precursor del 2,3-butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3-butanodiol son compuestos neutros. En presencia de oxgeno atmosfrico y lcali, la acetoina como el 2,3-butanodiol reaccionan con el alfa-naftol generando diacetilo este compuesto se condensa con la guanidina presente en el medio de cultivo generando un compuesto de color rojo o rosa (prueba positiva) en un tiempo aproximado de 15 minutos. Si la acetoina no esta presente los reactivos no cambian de color (prueba negativa) Salmonella y Shigella, agar (SS). Extracto de carne Polipeptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio deshidratado Tiosulfato de sodio pentahidratado Citrato frrico Agar Rojo neutro Verde brillante Agua destilada 5,0 g 5,0 g 10,0 g 8,5 g 8,5 g 8,5 g 1,0 g 13.5 g 0,025 g 0,330 mg 1,0 L

Suspender los ingredientes en agua destilada estril y calentar hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 7,0 0,2. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50 y C distribuir en cajas de Petri estriles en condiciones aspticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. Principio de accin El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras patolgicas, alimentos contaminados, etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompaante son inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El tiosulfato en combinacin con el fierro acta como indicadores de la produccin de cido sulfhdrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las colonias. Las colonias de coliformes quedan sealadas por la demostracin de la degradacin de la lactosa a cido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Sangre de carnero, agar

Base de agar sangre Sangre de carnero desfibrinada

95,0 mL 5,0 mL

Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 2C y agregar aspticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25 Homogeneizar el medio y verter en C). las cajas Petri estriles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL para la prueba de hemlisis. Principio de accin Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos, pudiendo diferenciar las hemlisis alfa o beta. Selenito-cistina, caldo. Triptona o polipeptona Lactosa Fosfato sdico dibsico Selenito cido de sodio L-cistina Agua destilada estril pH final 25C 5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g 0,01 g 1,0 L 7,0 0,2

Disolver los ingredientes en el agua destilada estril. Distribuir en volmenes de 10,0 (tubos de ensayo) o bien, 225,0 mL en (matraces) recipientes estriles, segn se requiera. El caldo as preparado es transparente de color ladrillo. De preferencia usarlo el mismo da de su preparacin. Si se desea conservar el medio por varios das, puede exponerse al calor en autoclave a 110 1 durante 5 C minutos tomando entonces un color salmn. Precaucin: Descartar el medio preparado si se observan grandes cantidades de precipitado rojo debidas al selenito reducido. No se incube por ms de 24 h. porque el efecto inhibitorio del selenito disminuye despus de 6-12 h. de incubacin. El biselenito de sodio es txico por inhalacin o ingesta. Existe peligro de efectos acumulativos. Cuando se utilice no coma, beba o fume. Despus del contacto con la piel, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de ingestin accidental acuda al mdico inmediatamente. Principio de accin El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la incubacin. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo

clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable para prevenir un incremento en el pH durante la incubacin ya que cualquier aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa puede explicar que resistan la inhibicin. El efecto de la cistina puede deberse a dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito. Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM). Peptona de casena Peptona de carne Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar Agua 20,0 g 6,1 g 0,2 g 0,2 g 3,5 g 1,0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 1 durante 15 C minutos. El pH final deber estar en 7,3 0,2. Principio de accin El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es mvil, esto es que presente flagelos, lo cual se observa si despus de incubar existe desarrollo ms all de donde pas el asa microbiolgica al inocular al medio, b) si el microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta cido sulfhdrico, que al estar este ltimo en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la eliminacin del grupo alquilo, que est constituido por un aminocido, transformndose esta fraccin a cido pirvico y amonaco, gracias a la presencia de la triptofanasa. Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo. Soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura, agar (ASTEL). (Listeria). Agar soya tripticasena Extracto de levadura Agua 40,0 g 6,0 g 1,0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 1C durante 15 minutos, el pH final ser de 7,3 0,2. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. Soya tripticasena con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL. (Listeria). Caldo soya tripticasena Extracto de levadura Agua 30,0 g 6,0 g 1,0 L

Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 1C durante 15 minutos. El pH final de la solucin debe ser 7,3 0,2. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. Soya tripticasena, caldo / Soya tripticasina, agar. Tripticasa o triptosa Fitona Glucosa Cloruro de sodio Agar bacteriolgico Agua destilada 17,0 g 3,0 g 2,5 g 2,5 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando lentamente hasta su disolucin completa. Distribuir porciones de 225,0 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave a 1211 durante 15 minutos. En caso de C requerirse en cajas de Petri enfriar el agar a 45 y verter en condiciones de C asepsia. El pH final debe ser de 7.30,2. Principio de accin

Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. Soya tripticasena estril adicionado con sulfito de potasio, caldo. Caldo soya tripticasa Sulfito de potasio 1,0 L 5,0 g

Adicionar al caldo soya tripticasena el sulfito de potasio por cada 1,0 L de medio, de tal forma que la concentracin final del sulfito de potasio sea 0,5%. Esterilizar a 1211 por 15 minutos. C Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, se recomienda para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio acta como un agente selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la produccin de cido sulfhdrico. SS, agar. Ver Salmonella Shigella, agar. Sulfito de Bismuto agar. Ver: Bismuto sulfito, agar. Surraco, caldo Sacarosa Urea Azul de timol Base caldo rojo de fenol Agua destilada 0,8 g 0,8 g 4 gotas 1,5 g 100,0 mL

Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada, agregar 0,8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solucin se toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121 (15 libras de presin) durante 10 minutos (EVITAR C SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltracin, agujas y

jeringas. Una vez esterilizado el material y los mdios, dejar enfriar. Al matraz con los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0,8 g de urea, agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado) al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estril y distribuir volmenes de 3,0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados previamente. Principio de accin. Medio para la diferenciacin de microorganismos, especialmente de la familia Enterobacteriaceae basndose en la produccin de ureasa y/o de fermentar la sacarosa. El medio de cultivo est libre de carbohidratos fermentables, si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la urea, forman amonio, produciendo reaccin alcalina en el medio que se manifiesta por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol. TCBS, agar. Ver: Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar. T1N1, agar (tripticasa y sal, agar). Triptona o tripticasa o digerido pancretico de casena Cloruro de sodio Agar Agua destilada 10,0 g 10,0 g 20,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolucin del agar. En caso de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y despus de esterilizar en autoclave a 121 durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deber estar en 7.20,2. Para el C llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50 antes C de llenar las cajas. Principio de accin Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentracin del cloruro de sodio de esta frmula por la deseada. Tripticasa y sal, caldo (T1N1, caldo). Triptona o tripticasa o digerido pancretico de caseina Cloruro de sodio Agua destilada 10,0 g 10,0 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua y calentar si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121 durante 15 minutos; el pH final deber estar en 7.20,2. C Principio de accin Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentracin del cloruro de sodio de esta frmula por la deseada. Triptosa agar / Triptosa caldo. Triptosa (digerido enzimtico protico) Dextrosa Cloruro de sodio Agar Agua destilada 20,0 g 1,0 g 5,0 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes (para preparacin del caldo omitir el agar) en el el agua destilada, mezclar y calentar lentamente hasta su disolucin completa. Esterilizar a 121 1C durante 15 minutos. Principio de accin. El medio de triptosa es un medio para propsitos generales, no selectivo. La triptosa es una mezcla de un hidrolizado enzimtico con propiedades nutricionales distintivas. El medio de triptosa posee pptidos de alto peso molecular adecuado para requerimientos de amino cidos de cadena larga. Proporciona nitrgeno, amino cidos y vitaminas. Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS). Peptona de casena Peptona de carne Extracto de levadura Sacarosa Tiosulfato de sodio pentahidratado Citrato de sodio dihidratado Colato de sodio Bilis de buey Cloruro de sodio Citrato frrico Azul de bromotimol Azul de timol Agar Agua destilada 5,0 g 5,0 g 5,0 g 20,0 g 10,0 g 10,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 1,0 g 40,0 mg 40,0 mg 15,0 g 1,0 L

Preparar en un matraz por lo menos tres veces ms grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitacin constante hasta ebullicin e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar y ajustar el pH a 8.60,2 a 25 enfriar a 50 y colocar el medio en C; C cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45 antes de usarlas. C Principio de accin La alta concentracin de tiosulfato y citrato, as como la fuerte alcalinidad de este medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando hay liberacin de cido, an en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar a 35 aerbicamente durante 18 a 24 h. C De acuerdo a las caractersticas metablicas del microorganismo, se presentan las colonias en este medio, como se describen en el siguiente cuadro:

Apariencia de las colonias Amarillas, planas, con dimetro entre 2 y 3 mm Pequeas con centro azul verde Grandes amarillas Azules Muy pequeas, transparentes

Microorganismos V. cholerae, V. cholerae variedad El Tor Vibrio parahemolyticus Vibrio alginolyticus Pseudomonas y Aeromonas Enterobacteriaceae y otros

Tetrationato, caldo. Proteosa peptona o triptona Sales biliares Carbonato de calcio Tiosulfato de sodio pentahidratado Agua destilada 5,0 g 1,0 g 10,0 g 30,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada estril y ajustar el pH a 7,00,1. Distribuir, agitando constantemente en porciones de 10,0 y 225,0 mL, en recipientes estriles, de acuerdo a las necesidades. Guardar en refrigeracin. Antes de usar el medio agregar 2,0 mL de una solucin de yodo-yoduro de potasio y 1,0 mL de solucin de verde brillante al 0,1% por cada 100,0 mL de medio. El medio deber utilizarse el mismo da.

Principio de accin El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados, etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e inhiben junto con la solucin de verde brillante especialmente a la microbiota Gram-positiva. La adicin de la solucin yodo-yoduro funciona para formar el tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos. Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al medio de cultivo 40,0 g de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la adicin del yodo-yoduro. Triptona al 1%, caldo (Prueba de indol). Triptona o tripticasa Agua destilada 10,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes y si es necesario calentar. Distribuir porciones de 5 mL del medio, en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Esterilizar a 121 por 15 C minutos. El pH final debe ser de 6.9 0,2 Principio de accin La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la diferenciacin de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e indolactco. La enzima triptofanasa cataliza la reaccin de desaminacin del triptofano produciendo indol, cido pirvico y amonaco. El cido pirvico puede ser catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO2 y agua; el amonaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar nuevos aminocidos. El indol puede ser detectado si se combina con el paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinacin es un una quinona de color rojo. TSI, agar. Ver: hierro y tres azcares, agar. Urea, caldo. Fosfato monopotsico

9,1 g

Fosfato disdico Extracto de levadura Urea de alta pureza (20%) Rojo fenol Agua desionizada pH

9,5 g 0,1 g 20,0 g 0,01 g 1,0 L 6,8

Pesar la cantidad con precisin segn las directivas del rtulo. Rehidratar con el agua desionizada. No calentar la solucin, con el calor la urea se descompone. Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121 durante C 15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtracin en membrana y agregar al medio base ya estril y fro. De manera asptica distribur aproximadamente 3,0 mL en tubos de 13 x 100 con tapn de rosca. Principio de accin El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima especfica, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos molculas de amoniaco. En solucin, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la descomposicin de compuestos orgnicos, clasificada como una amidasa. La ureasa acta en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen puestes peptdicos. El indicador rojo de fenol virar a un colo rosarojo intenso cuando la prueba sea positiva. Urea rpido, caldo. Extracto de levadura Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico Rojo fenol Agua desionizada pH 0,1 g 20,0 g 0,091 g 0,095 g 0,01 g 1,0 L 6,9

Esterilizar por filtracin utilizando una membrana de 0,45 m. Fraccionar en condiciones aspticas 3,0 mL en tubos de 13 x 100 con tapn de rosca estriles. Principio de accin Ver caldo urea. Para la prueba rpida de la urea el indicador virar a color cereza (prpura rojizo), en caso de ser positiva. Urea y sacarosa, caldo. Ver: Surraco, caldo.

Vassiliadis-Rappaport, caldo. Solucin A Triptona Cloruro de sodio Fosfato monobsico de potasio Agua destilada 5,0 g 8,0 g 1,6 g 1,0 L

Disolver los componentes en el agua destilada por calentamiento a 70 C. Solucin B Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada 400,0 g 1,0 L

Disolver el cloruro de magnesio en el agua destilada. Como esta sal es muy higroscpica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un envase recientemente abierto, de tal modo que la concentracin de la solucin sea de 0,4 g/mL. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Solucin C Oxalato de verde de malaquita Agua destilada 0,4 g 100,0 mL

Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Preparacin del medio completo Solucin A Solucin B Solucin C 1000,0 mL 100,0 mL 10,0 mL

Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estriles en cantidades de 10,0 mL. Esterilizar a 115 durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para C que al final de la esterilizacin sea de 5.2. Almacenar en refrigeracin. Principio de accin Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede tambin utilizarse para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una cantidad de inculo pequea. La formulacin se desarroll denotando cuatro caractersticas que posee Salmonella cuando se compara con la familia Enterobacteriaceae:

1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmticas relativamente altas 2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos 3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita 4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus. Verde brillante, agar. Extracto de levadura Polipeptona (proteosa peptona No. 3) Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Rojo de fenol Agar Verde brillante Agua destilada 3,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 0,08 g 20,0 g 0,0125 g 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua destilada y calentar a ebullicin, hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 6.9 0,2. Esterilizar en autoclave a 1211 C durante 15 minutos. Enfriar el medio a 50 y distribuirlo en cajas de Petri C estriles. El aspecto del medio es oscuro color marrn. Principio de accin El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradacin a cido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol, que acta como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompaante Gram-positiva, as como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota acompaante lactosa-positiva dbil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva. Para la inhibicin de Proteus se recomienda la adicin de desoxicolato de sodio al 0,2%. La adicin de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar 1,0 g de sulfonamida o 0,8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en la forma habitual. Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Xilosa lisina desoxicolato, agar (XLD). Xilosa L-lisina Lactosa 3,75 g 5,0 g 7,5 g

Sacarosa 7,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Rojo de fenol 0,08 g Agar 15,0 g Desoxicolato de sodio 2,5 g Citrato frrico amoniacal 0,8 g Tiosulfato de sodio 6,8 g Agua destilada 1,0 L 0,2 Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en bao de agua a 55 agitando frecuentemente, hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 6.9 C, 0,2. Enfriar a 50 y verter en cajas de Petri estriles. No se esterilice. El C sobrecalentamiento produce una precipitacin, la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeas. Principio de accin Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificacin presuntiva de Salmonella y Shigella. Basado en la fermentacin de la xilosa, la descarboxilacin de la lisina y la produccin de cido sulfhdrico para la diferenciacin inicial entre Shigella y Salmonella de otras bacterias no patgenas. La Salmonella es reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el cido sulfhdrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un compuesto de color negro. La fermentacin rpida de la xilosa es casi universal entre las bacterias entricas excepto para los miembros de los gneros Shigella, Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las especies del gnero Shigella pueden identificarse por una reaccin negativa. Las especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patognicos por la incorporacin de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reaccin presentada por Shigella. Sin embargo, la presencia de los gneros Salmonella y Edwardsiella se diferencia de las de Shigella por un indicador de la produccin de cido sulfhdrico. Por otra parte, la gran concentracin de cido producido por la fermentacin de la lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de cido sulfhdrico no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos microorganismos hasta despus de 18-24 h. de incubacin. El desoxicolato de sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el desarrollo de Shigella y Salmonella.

DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES. Azul de toluidina, solucin 0,1M. Azul de toluidina Agua destilada 3,05 g 100,0 mL

En un matraz aforado de 100,0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen con el agua. Calcio cloruro, solucin 0,01M. Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110,99) Agua destilada Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro. Etanol 70 %. Alochol etlico absoluto Agua destilada 1,199 g 1,0 L

70,0 mL 100,0 mL

Solucin de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estril. Desoxicolato de sodio Agua destilada estril Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estril. Solucin reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solucin concentrada). Fosfato monobsico de potasio Agua destilada 34,0 g 1,0 L 0,5 g 99,5 mL

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solucin de hidrxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solucin a 121 C1,0 y conservar en refrigeracin. C Solucin de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solucin anterior (solucin concentrada) y transferirlos a un matraz volumtrico de un litro, aforando con agua; despus de distribuir en matraces o tubos, los volmenes especificados en

cada monografa, se debe esterilizar a 121 C1,0 durante 15 minutos. Despus C de la esterilizacin, los volmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales. Reactivo de Kovacs. p-dimetilaminobenzaldehdo Alcohol amlico (normal) HCI concentrado 5,0 g 75,0 mL 25,0 mL

Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico normal y adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4 C. Para la prueba de indol: Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor cantidad de oxgeno ambiental que ayude a la reaccin. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Principio de accin El triptofano es un aminocido, que por accin de la triptofanasa lo degrada en indol, escatol y cido indolactico . Un intermediario importante es el cido indolpirvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile el cido indolactico, se forma el escatol Prueba del Ortonitrofenil galactsido (ONPG). Reactivos Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7. o-nitrofenil--galactosido (ONPG), 0,75 M Solucin fisiolgica Tolueno Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) agar triple azcar hierro (TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solucin fisiolgica hasta producir una suspensin abundante. Aadir a dicha suspensin una gota de tolueno y mezclar enrgicamente unos segundos para liberar la enzima de las clulas bacterianas. Aadir a la suspensin igual cantidad de solucin buffer de ONPG y colocar la mezcla en bao de agua a 37C. Interpretacin. La velocidad de hidrlisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser rpida en algunos organismos, producindose una reaccin que se visualiza por la

aparicin de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayora de las pruebas son positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubacin. El color amarillo indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por accin de la -galactosidasa. Principio de accin El ortonitrofenil galactsido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil. Por accin de la -galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrlisis. Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y galactosidasa, requeridas para la produccin de cido a partir de la fermentacin de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molcula de lactosa penetre en la clula bacteriana, donde la -galactosidasa puede romper la unin galactsido, produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir cido a partir de lactosa. Algunas especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de permeasa pero si tienen -galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los llamados fermentadores tardos de lactosa pueden demorar en producir cido a partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una prueba de ONPG positiva puede proveer una identificacin rpida de los fermentadores tardos. Reactivo de oxidasa. N-Tetrametil-p-Fenilendiamina Agua destilada 0,5 g 100,0 mL

Conservar en frasco oscuro a 5-10 El reactivo se conserva durante 14 das. C. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un mtodo fcil consiste en colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornar prpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patgenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii). Interpretacin. La reaccin positiva se observa por la produccin de un color azul en un minuto. Principio de accin

Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno, con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-pFenilendiamina, que aca como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al oxgeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol. Plasma de Conejo. Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es cido etilendiaminotetractico (EDTA) al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado, diluir con agua estril en proporcin 1:3. Puede utilizarse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de sangre citratada. Principio de accin El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un cogulo de fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y sta ltima al encontrarse frente al fibringeno, forma un cogulo de fibrina. La tcnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregacin, se realiza en un portaobjetos. Es responsable de la absorcin del fibringeno, el cual precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregacin de estos microorganismos, observndose una aglutinacin celular. En este caso, el factor de agregacin, transforma el fibringeno en fibrina de manera directa, no toman parte los factores plasmticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la coagulasa libre. La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada; la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de reaccin de la coagulacin, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibringeno en fibrina, liberando pptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar iones de calcio para formar el cogulo. Rojo de metilo, reactivo.

Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada

0,2 g 300,0 mL 200,0 mL

Mantener el reactivo en refrigeracin cuando no se utilice, el reactivo es estable de 2 a 3 semanas. Prueba de Rojo de metilo Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubacin a un tubo de ensayo. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato: Una coloracin roja indica produccin de acidez por lo que la prueba es positiva. Salina isotnica, solucin. Cloruro de sodio Agua destilada 8,5 g 1,0 L

Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 C1,0 durante 15 C minutos. Tartrico cido al 10%. cido tartrico Agua destilada 10,0 g 100,0 mL

Disolver el cido en el agua y esterilizar a 121 durante 15 minutos, o bien por C filtracin a travs de una membrana de 0,45 m. Tris-(hidroximetilaminometano), solucin amortiguadora 0,05M. Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9,0 Agua destilada 6,055 g 100,0 mL

Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumtrico de 100,0 mL y llevar a volumen con el agua. Voges-Proskauer, reactivos (VP). VP 1

alfa-naftol Alcohol absoluto VP 2 Hidrxido de potasio Agua destilada Prueba de Voges-Proskauer (VP):

5,0 g 100,0 g

40,0 g cbp 100,0 mL

Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubacin, a un tubo de ensayo. Despus adicionar 0,6 mL de la solucin VP 1 y 0,2 mL de la solucin VP 2. Agitar despus de la adicin de cada solucin. Para intensificar y acelerar la reaccin adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados despus de 4 h. de adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloracin rosa es una prueba positiva. Nitritos, reactivos para la determinacin de. Reactivo A Alfa-naftilamina cido actico 5N Reactivo B cido sulfanlico cido actico 5N Reactivo C Alfa-naftol cido actico 5N 1,0 g 200,0 mL 1,0 g 125,0 mL 0,5 g 100,0 mL

Solucin de sulfato de cadmio al 20% Colocar granallas de zinc en solucin de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio, adicionando cido clorhdrico 1N.

TINCIONES Gram Alcohol-acetona Etanol (95%) Acetona Mezclar perfectamente ambos lquidos. Cristal violeta Solucin A Cristal violeta Etanol (95%) Disolver el cristal violeta en el etanol. Solucin B Oxalato de amonio Agua 700,0 mL 300,0 mL

2,0 g 20,0 mL

0,8 g 80,0 mL

Disolver el oxalato de amonio en el agua. Despus de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente. Solucin de Yodo Yodo Yoduro de potasio Agua 1,0 g 2,0 g 300,0 mL

Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extraccin. Aadir una pequea cantidad de agua para lavar el mortero, agregar el resto del agua y agitar. Guardar la solucin en envases de color ambar. Nota: Evitar el contacto de los reactivos con la piel! Solucin de Safranina Safranina Etanol (95%) Agua 0,25 g 10,0 mL 100,0 mL

Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solucin con papel filtro. Tcnica de la tincin de Gram: 1. Colocar sobre un porta-objetos una gota de agua y la colonia que se desea teir, fijando a calor moderado la preparacin. En caso de utilizar un cultivo lquido, omitir la gota de agua y colocar directamente sobre un porta-objetos una gota del cultivo lquido. 2. Adicionar cristal violeta a la preparacin y dejarlo durante un minuto 3. Lavar con agua (usar de preferencia una piceta) y dejar escurrir 4. Cubrir la preparacin el lugol (solucin yodo-yodurada), y dejarlo actuar durante un minuto. 5. Lavar con agua y decolorar con etanol al 95%, hasta que deje de salir colorante, (aproximadamente 30 segundos). 6. Inmediatamente despus enjuagar con agua y escurrir. 7. Aplicar el colorante de contraste (safranina), esperar durante 30 segundos y 8. Enjuagar con agua, escurrir y dejar secar, para posteriormente hacer la observacin microscpica. Impronta Hmeda Lactofenol azul algodn Agua destilada Cristales de fenol QP cido lctico Glicerina Azul algodn 20,0 mL 20,0 g 20,0 mL 20,0 mL 0,05 g

Disolver el fenol en el agua, agregar el cido y la glicerina y calentar a 70 y C adicionar el colorante. Filtrar. Conservar en frascos de vidrio mbar perfectamente tapados. Tcnica de la impronta hmeda para observacin de hongos. 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodn sobre un portaobjetos 2. Utilizando tcnica asptica y con asa micolgica tomar una muestra del hongo (desarrollado sobre la caja de Petri), tratando de no romper las estructuras. 3. Si se tiene un cultivo puro, utilizar un bistur estril y cortar una porcin muy delgada del agar en el que se desarroll el hongo, transferirlo al portaobjetos y calentarlo suavemente para fundir el agar, de esta manera no se rompen las estructuras y se asegura una buena observacin.

4. Cubrir la preparacin, colocarla en la platina del microscopio. 5. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 6. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las caractersticas observadas. Tcnica de la impronta hmeda para observacin de hongos (DIUREX) 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodn sobre un portaobjetos 2. Colocar en el ltimo tercio del asa micolgica un pedacito de direx de 1.5 cm de largo, enrollndolo ligeramente. 3. En condiciones de asepsia, destapar la caja de Petri que contiene el cultivo del hongo, introducir el asa con el direx y presionar ligeramente sobre una fraccin de la colonia, tratando de no romper las estructuras. 4. Depositar la muestra en el portaobjetos que contiene el colorante, extender el direx y colocar encima un portaobjetos. 5. Colocar la preparacin en la platina del microscopio. 6. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 7. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las caractersticas observadas.