CAPITOLUL I

CARIOTIPUL UMAN NORMAL 1. Numrul cromozomilor

Celulele somatice umane (celule diploide) conin 46 de cromozomi, iar gameii (celule haploide) - 23 de cromozomi. Fuzionarea celor doi gamei haploizi n timpul fecundaiei reface numrul diploid i realizeaz 23 de perechi de cromozomi omologi, identici ca dimensiune, form i coninut genic, dar diferii ca origine (un membru al fiecrei perechi provine de la mam, iar cellalt membru provine de la tat): - 22 perechi de cromozomi reprezint cromozomii somatici sau autozomii, identici la cele dou sexe; - o pereche reprezint cromozomii sexuali sau gonozomii, care difer la cele dou sexe: XX la femeie i XY la brbat. Cromozomii X i Y sunt omologi doar ca funcie, deosebindu-se morfologic.

2. Morfologia cromozomilor metafazici

Analiza corect a morfologiei cromozomilor este realizat n metafaza diviziunii, cnd acetia sunt bine individualizai, se afl n acelai plan (placa metafazic) i sunt alctuii din dou cromatide unite la nivelul centromerului (cromozomi bicromatidici), delimitate la capete prin telomere. a) Elementele morfologice comune tuturor cromozomilor, a cror prezen este obligatorie, sunt cromatidele, centromerul i telomerele. (1) Cromatidele sunt structuri longitudinale identice (cromatide-surori). (2) Centromerul (cen) este regiunea cromozomial n care sunt ataate cele dou cromatide. Cu ajutorul tehnicilor uzuale de coloraie, regiunea centromeric apare mai palid dect restul cromozomului; deoarece la acest nivel cromozomul apare trangulat, ea a fost denumit constricie primar. n mod normal, fiecare cromozom are un singur centromer, la care se leag un complex proteic denumit kinetocor (cte unul pentru fiecare cromatid). Kinetocorul reprezint locul de fixare a microtubulilor filamentelor fusului de diviziune, care asigur deplasarea cromatidelor la polii fusului n decursul anafazei. Centromerul mparte cromatidele n dou brae: braul scurt notat cu p (petit) i braul lung notat cu q (qeue). n funcie de poziia centromerului, constant la fiecare cromozom, se descriu cromozomi (figura I.1): 1

(a)

(b)

(c)

Figura I.1. Reprezentare schematic a cromozomilor metafazici umani: (a) cromozom metacentric, (b) cromozom submetacentric, (c) cromozom acrocentric.

metacentrici, cu centromerul situat n mijlocul cromozomului i braele aproximativ egale; submetacentrici, cu centromerul situat n vecintatea punctului median al cromozomului i brae de lungimi diferite; acrocentrici, cu centromerul situat spre un capt al cromozomului; telocentrici, cu centromerul situat terminal, lipsesc n mod normal la om. (3) Telomerele (t) sunt structurile situate la capetele cromozomului (funciile telomerelor -

vezi curs). b) Elementele morfologice comune anumitor cromozomi (elemente distinctive): (1) Sateliii sunt mici mase de cromatin ataate la braele scurte ale cromozomilor acrocentrici (exceptnd cromozomul Y): perechile 13-15 i 21-22. Sateliii se ataeaz de restul cromozomului prin intermediul unor filamente ADN care conin genele pentru ARN ribozomal, denumite organizatori nucleolari. Satelitul este structura cea mai variabil din cromozom. Uneori se observ satelii foarte mari sau gigani. Intruct prezena lor nu este nsoit de apariia unor manifestri clinice, ei pot fi considerai variante morfologice normale. In unele cazuri, sateliii nii sunt divizai n dou poriuni, datorit unor constricii secundare, alctuind satelii dubli. (2) Constriciile secundare (h) sunt zone ngustate prezente pe braul lung al cromozomilor 1, 9 i 16, n regiunea proximal a braelor lungi, precum i n regiunea mijlocie a braelor lungi ai cromozomului Y. (3) Situsurile fragile sunt lacune necolorate, vizibile pe cromatidele cromozomilor - in vivo sau n anumite medii de cultur (inhibitori de acid folic).

3. Clasificarea cromozomilor umani

2

Se realizeaz conform Sistemului internaional de nomenclatur citogenetic uman (ISCN), adoptat n 1995. Pe baza taliei i poziiei centromerului, cromozomii au fost clasificai n 7 grupe, notate de la A - G. Fiecare cromozom somatic este desemnat printr-un numr de la 1 la 22, iar cromozomii sexuali sunt notai cu X i Y; se obine astfel o aranjare sistematizat a cromozomilor (fotografiai sau desenai) unei celule denumit cariotip (figura I.2): Grupa A (1-3) include cele mai lungi perechi de cromozomi. Perechile 1 i 3 sunt metacentrice, dar pot fi deosebite uor, cromozomii perechii 3 fiind mai scuri dect cromozomii perechii 1. Perechea 2 are aceeai lungime ca i perechea 1, dar cromozomii perechii 2 sunt submetacentrici. Grupa B (4-5) este alctuit din cromozomi lungi, submetacentrici. Prin definiie, perechea 4 este mai lung dect perechea 5, dar diferena de lungime este insuficient pentru a permite separarea precis a celor dou perechi. Grupa C (6-12 i X) cuprinde cromozomii de mrime mijlocie, submetacentrici. Cromozomii X au o dimensiune similar cu a cromozomilor din perechile 7-8. In practic, aceste criterii au ns o valoare foarte mic, iar perechile de cromozomi din grupa C nu pot fi identificate cu certitudine. In absena autoradiografiei, nici cromozomii X nu pot fi deosebii de ceilali cromozomi din aceast grup (la femei, unul din cromozomii X poate fi identificat numai datorit proprietii de replicare tardiv). Prezena constriciilor secundare permite ns separarea cromozomilor 9 de ceilali cromozomi din grupa C. Grupa D (13-15) este alctuit din trei perechi de cromozomi acrocentrici satelitai, de dimensiune mijlocie. Perechile de cromozomi din grupa D nu pot fi identificate nici pe baza taliei, nici a trsturilor morfologice. Grupa E (16-18) include trei perechi de cromozomi care pot fi identificate n mod individual. Cromozomii perechii 16 sunt metacentrici, de talie mai mare i au adesea o constricie secundar n partea proximal a braelor lungi. Cromozomii perechii 17 sunt mai mici i mai submetacentrici dect cromozomii perechii 18. Grupa F (19-20) cuprinde dou perechi de cromozomi mici, metacentrici, care nu pot fi deosebite ntre ele. Grupa G (21-22 i Y) este alctuit din dou perechi de cromozomi acrocentrici mici cu satelii. Cromozomul Y, lipsit de satelii, este de obicei mai mare dect cromozomii 21-22 i are braele dispuse paralel. Din datele prezentate rezult c repartizarea unui cromozom ntr-o anumit grup se poate face cu certitudine; apartenena la o anumit pereche poate fi stabilit cu precizie numai n cazul perechilor 1, 2, 3, 16, 17 i 18. Conform ISCN, pentru a desemna un cariotip normal sau anormal, se menioneaz n urmtoarea ordine i separai prin virgule: numrul de cromozomi, constituia cromozomilor sexuali
Fig.I.2. Cariotip normal masculin

i anomaliile numerice sau structurale ale cromozomilor somatici (atunci cnd sunt prezente). Prezena unui mozaic cromozomial se noteaz menionnd cariotipurile liniilor celulare componente, separate printr-o diagonal (/).

4. Tehnici de citogenetic
Sunt prezentate principiile de realizare a preparatelor citogenetice (cromozomiale). 1) Surse de celule utilizate n citogenetica uman Analiza cromozomial necesit prezena a numeroase celule n diviziune, deoarece morfologia cromozomilor poate fi studiat numai n stadiul de metafaz. Celulele n mitoz pot fi obinute din esuturi n diviziune rapid (de exemplu mduv osoas, tumori) sau din esuturi care n mod normal nu se divid rapid, dar care pot fi stimulate s se divid in vitro (de exemplu limfocitele din sngele circulant, fibroblastele din piele sau fascia lata, celulele amniotice). Celulele meiotice pot fi obinute numai din gonade (testicul i ovare). 2) Principii de tehnic citogenetic a. Generaliti Principiul fundamental al realizrii preparatelor cromozomiale const n convertirea unei celule sferice, tridimensionale, n care cromozomii sunt dispui n diferite planuri, ntr-o structur bidimensional, n care cromozomii, etalai, pot fi identificai n mod individual. n acest scop sunt parcurse urmtoarele etape: 1. celulele sunt prelucrate de obicei sub form de suspensie, pentru a permite aciunea eficient a soluiilor hipotone i fixatoare; unele celule se gsesc n mod natural n suspensie (celulele tumorale din exsudatele peritoneale i pleurale), altele fiind cultivate sub form de suspensie (limfocitele sanguine); 2. celulele suspendate sunt expuse la aciunea unui agent statmokinetic; 3. suspensia este centrifugat, lichidul supernatant este ndeprtat, iar celulele sunt resuspendate ntr-o soluie hipoton; 4. soluia hipoton este ndeprtat prin centrifugare, iar celulele sunt supuse aciunii unui agent fixator; 5. celulele sunt etalate pe lame; 6. preparatele sunt colorate sau prelucrate conform unor tehnici speciale. b. Agenii statmokinetici i efectul lor Colchicina (alcaloid extras din brndua de toamn - Colchicum autumnale) are proprietatea de a bloca desfurarea mitozei n stadiul de metafaz prin prevenirea formrii fusului mitotic. Expunerea celulelor n diviziune la aciunea colchicinei rezult astfel n acumularea metafazelor. 4

Analogul colchicinei - N-metil-N-dezacetilcolchicina (Colcemid) - are o aciune similar, dar este de 30-40 ori mai puin toxic; ali inhibitori mitotici (vinblastina, vincristina) pot fi utilizai n locul colchicinei, avnd efecte comparabile cu ale acesteia. Colchicina determin, de asemenea, o contractare a cromozomilor i accentueaz clivarea longitudinal a celor dou cromatide, clarificnd astfel conturul cromozomilor. c. Tratamentul hipotonic Ca urmare a aciunii soluilor hipotone (se utilizeaz soluii cu tonicitate la din valoarea fiziologic), celulele se umfl, iar cromozomii se disperseaz ntr-un spaiu mai mare, astfel nct pot fi individualizai cu uurin. Durata expunerii este de 10-30 minute (depinde de tipul de celul). Soluiile hipotone utilizate n mod obinuit sunt citratul de sodiu 1%, clorura de potasiu 0.075 M i diferite soluii saline (Hanks, Ringer, mediu de cultur) diluate cu ap distilat n proporie de 1:3. d. Fixarea Fixatorul utilizat n mod obinuit n citogenetic const ntr-un amestec de metanol i acid acetic glacial n proporie de 3:1. Durata fixrii depinde de cantitatea de material (30-60 minute). e. Prepararea lamelor Exist dou metode de preparare a lamelor: - tehnica de strivire (squash) - zdrobirea celulelor ntre lam i lamel, utilizat mai ales de scandinavi; - tehnica de uscare la aer: const n plasarea ctorva picturi de suspensie celular pe o lam umed, care este lsat s se usuce la aer sau este uscat rapid deasupra unei flcri sau cu ajutorul unui curent de aer cald. f. Prelucrarea lamelor n mod obinuit, lamele sunt colorate cu orcein acetic sau cu Giemsa. n funcie de necesiti se aplic una sau mai multe tehnici de bandare.

3.) Tehnici de citogenetic uman Culturile de limfocite Limfocitele din sngele periferic pot fi induse s se divid in vitro sub aciunea phytohaemaglutininei (PHA). Materialul poate fi obinut printr-o simpl puncie venoas, de la pacienii de toate vrstele. PHA este o substan extras din fasole (Phaseolus vulgaris), care a fost utilizat iniial, datorit proprietilor sale hemaglutinante, la separarea leucocitelor din sngele periferic. PHA are i proprietatea de a iniia activitatea mitotic n culturile de limfocite. Din punct de vedere chimic, PHA 5

prezint dou componente: o mucoprotein (MPHA) i o protein (PPHA), ambele avnd att proprieti mitogene, ct i proprieti aglutinante. Sub aciunea PHA, limfocitele mici i schimb morfologia, transformndu-se n celule blastice, capabile de diviziune.