Sunteți pe pagina 1din 53

MINISTERUL EDUCAIEI AL REPUBLICII MOLDOVA UNIVERSITATEA ACADEMIEI DE TIINE A MOLDOVEI CATEDRA BIOLOGIE

Tez de licen

ACTIVITATEA ANTIOXIDANT A EXTRACTELOR HIDROETANOLICE din SPIRULINA PLATENSIS LA ACIUNEA TOXIC A CUPRULUI

Conductor tiinific:

CEPOI Liliana, Doctor n biologie, Confereniar cercettor

Autor:

MALAI Mariana

CHIINU, 2012

CUPRINSUL
ADNOTARE..........................................................................................................................3 ANNOTATION.....................................................................................................................4 INTRODUCERE..................................................................................................................5 1. CIANOBACTERIILE I MICROALGELE SURS DE SUBSTANE BIOACTIVE CU PROPRIETI ANTIOXIDANTE 1.1. Sistemele enzimatice de protecie celular......................................................9
1.2.

Pigmenii aparatului fotosintetic parte component a sistemului de protecie

antioxidant..............................................................................................12 1.2. Aciunea unor factori asupra componentelor sistemelor de protecie antioxidant a biomasei cianobacteriilor i microalgelor.........................................14 1.3. Biomasa de Spirulina platensis surs de substane bioactive cu proprieti antioxidante....................................................................................................................20 2. MATERIALE I METODE DE INVESTIGARE 2.1. Materiale i metode de investigare a biomasei de spirulin............................25 2.1.1. Obiectul de studiu............................................................................................25 2.1.2. Metode de investigare......................................................................................26 2.3. Metode de analiz a rezultatelor.......................................................................31 3. ACTIVITATEA ANTIOXIDANT A EXTRACTELOR HIDROETANOLICE DE SPIRULINA PLATENSIS I MODIFICAREA COMPONENEI LOR 3.1. BIOCHIMICE LA ACIUNEA TOXIC A CUPRULUI Productivitatea Spirulina platensis la aciunea unor compui chimici ai

Cu(II).....................................................................................................................................35 3.2. Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis la aciunea unor compui chimici ai Cu(II)............................................................39 3.3. Modificarea componenei biochimice a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis obinut la cultivarea pe medii cu compui chimici ai Cu(II)............43 CONCLUZII ........................................................................................................................48 BIBLIOGRAFIE...................................................................................................................49

ADNOTARE MALAI Mariana Activitatea antioxidant a biomasei de Spirulina platensis la aciunea toxic a cuprului, tez de licen, Chiinu, 2012. Introducere, 3 capitole, concluzii, bibliografie din 61 titluri, 53 pagini text de baz, 9 figuri, 3 tabele.

Cuvintele cheie: cupru, sare simpl, compus coordinativ, aciune toxic, extracte hidroetanolice, activitate antioxidant, compoziie biochimic. Domeniul de studiu: 03.00.23 - Biotehnologie. Scopul lucrri: Stabilirea caracterului de aciune a cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis, precum i a impactului lui asupra activitii antioxidante a biomasei de spirulin. Obiectivele: Stabilirea caracterului de aciune a cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis; Stabilirea modificrilor intervenite n activiatea antioxidant a biomasei de spirulin la cultivarea ei n prezena cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ; Evaluarea modificrilor survenite n componena biochimic a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis obinut la cultivarea pe medii cu compui chimici ai Cu(II) Noutatea tiinific: Pentru prima dat, s-a stabilit toxicitatea cuprului sub ambele forme administrate: sare simpl i compus coordinativ asupra productivitii spirulinei. S-a stabilit aciunea negativ a cuprului sub form de sulfat asupra activitii antioxidante a extractelor hidroetanolice din biomasa i efectul pozitiv al acestui element asupra activitii antioxidante n extractele hidroetanolice obinute din biomasa de spirulin, la administrare sub form de compus coordinativ. S-a stabilit de asemenea, c valoarea expresivitii activitii antioxidante a extractelor este n funcie de perioada de administrare a compusului coordinativ i este determinat de modificrile intervenite n spectrul compuilor cu activitate antioxidant al spirulinei: componentele fenolice cu caracter preferenial lipofil i cele proteice. Semnificaia teoretic. n aspect teoretic, studiul comparativ realizat demonstreaz semnificaia cuprului asupra echilibrului oxidant/antioxidant al spirulinei, precum i forma de compus sub care acesta poate fi utilizat n procesele de cultivare a spirulinei, concentraia i perioada de administrare n cadrul ciclului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei, ceea ce este important pentru stabilirea componentelor bioactive responsabile de declanarea mecanismului de protecie antioxidant celular a spirulinei. Valoarea aplicativ a lucrrii. n aspect aplicativ, studiul comparativ al aciunii cuprului asupra echilibrului oxidant/antioxidant al spirulinei este important pentru procesele tehnologice de cultivare a spirulinei. Prin datele rezultate se obine informaia despre forma i perioada optimale de administrare a cuprului n cadrul ciclului tehnologic de cultivare a cianobacteriei, pentru activarea componentelor bioactive responsabile de declanarea mecanismului de protecie antioxidant celular a spirulinei, ceea ce va duce la sporirea eficienei economice a proceselor de cultivare industrial a spirulinei.

ANNOTATION Malai Mariana antioxidant activity of Spirulina platensis biomass to toxic action of copper, license degree thesis in biology, Kishinau, 2012. Introduction, four chapters, conclusions, bibliography of 61 references, 53 pages of the base text, 9 figures, 3 tables. The obtained results are published in ..scientific papers. 3

Keywords: copper, salt simple coordination compounds, toxic action, hidroetanolice extracts, antioxidant activity, biochemical composition. Direction of investigation: 03 00 23 Biotechnology. The aim: establish the action of copper in the form of inorganic and coordination compounds on the growth and development of Spirulina platensis and its impact on the antioxidant activity of Spirulina biomass. Objects: Establish nature of action of copper in the form of inorganic and coordination compounds on the growth and development of Spirulina platensis; Establishing activity antioxidant changes in biomass of Spirulina to its cultivation in the presence of copper in the form of inorganic and coordination compounds, evaluation of changes in biochemical composition hidroetanolice extracts of Spirulina platensis biomass obtained on cultivation of chemical compounds of Cu (II) Scientific novelty: For the first time, it was given the toxicity of copper in both forms: simple and compound coordinative salt on spirulina productivity. Established negative action of copper sulphate on antioxidant activity of extracts from biomass hidroetanolice the positive effect of this element of antioxidant activity in extracts derived from biomass Spirulina hidroetanolice to management as coordination compounds. It also established that the amount of antioxidant activity of extracts expressiveness depends on time management and coordination compounds is determined by changes in the spectrum of compounds with antioxidant activity of spirulina: preferential nature lipophilic phenolic components and protein. Theoretic significance: The theoretical aspect, mapping survey demonstrates the significance of copper on oxidant balance / antioxidant spirulina and form of the compound as it can be used in processes for growing spirulina, concentration and time of administration in the cycle of growth and development of cyanobacteria , which is important for determining bioactive components "responsible" for triggering the mechanism of cellular antioxidant protection spirulina. Application value: The applied aspect, the comparative study of copper action on the balance oxidant / antioxidant spirulina is important for technological processes for growing spirulina. The resulting date to obtain information about the shape and the optimal period of administration of copper in the technological cycle of growing cyanobacteria to activate bioactive components "responsible" for triggering the mechanism of cellular antioxidant protection spirulina, which will increase economic efficiency Spirulina cultivation of industrial processes.

INTRODUCERE Actualitatea i importana temei cercetate n procesul evoluiei natura a creat sisteme de protecie contra aciunii distructive a radicalilor liberi care alctuiesc prima linie de protecie mpotriva aciunii toxice a derivailor oxigenului - antioxidanii. Aceste sisteme sunt constituite din antioxidanii naturali, astfel ca enzimele, aa ca ca superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza. Enzimele antioxidante reduc la minimum concentraia radicalilor liberi ai oxigenului i peroxidului de hidrogen n celul, nu le dau posibilitatea s interacioneze cu formarea radicalului hidroxil .OH, care prevaleaz asupra O2- dup activitatea oxidant i toxicitate. n ultimii ani n calitate de surse importante de enzime antioxidante sunt precutate cianobacteriile i microalgele. De asemenea n protecia antioxidant celular, sunt angajai pigmenii aparatului fotosintetic al cianobacteriilor i microalgelor: clorofila a, ficobiliproteinele, carotenoizii. Din marea varietate de specii de cianobacterii i microalgae, n calitate de surs de antioxidani naturali, se evideniaz cianobacteria Spirulina platensis. Biomasa de spirulin se caracterizeaz printr-o compoziie biochimic echilibrat, coninnd un ir de substane bioactive bioprotectori, biocorectori i biostimulatori care nu se conin mai mult nici n unul din produsele de origine natural. Majoritatea componentelor biomasei de spirulin denot activitate antioxidant. Ctre acestea se refer n special, acizii grai nesaturai i polinestaurai (acidul linolic, gama linoleic, arahidonic), tocoferolul (vitamina E), carotenoizii (-carotenul, mixoxantofila, zeaxantina), ficobilproteinele (ficocianina), plozaharidele sulfatate, enzimele (superoxiddismutaza, glutationperoxidaza), polifenolii .a. Pentru nelegerea mecanismelor complicate ale sistemului antioxidant de protecie celular este necesar de a supune analizei i factorii care contribuie la activarea acestui sistem n condiiile stresului oxidativ. Pstrarea structurii native a moleculelor biologice i funcionarea normal a organismelor vii este imposibil fr interaciunea strns dintre macromoleculele organismului cu ionii metalici. Printre principalii factori care pot induce modificri n echilibrul oxidant/antioxidant sunt metalele de tranziie, astfel ca Fe, Mn, Zn i Co, Cu care se includ n structura multor enzime i complexe antioxidante, i ca parte component a acestora sunt angajate n principalele procese biochimice n celul. Cianobacteria Spirulina platensis este folosit cel mai frecvent n calitate de obiect-model al cercetrilor ficobiotehnologice, iar printre factorii care ar pute influena i/sau contribui la activarea sistemului de componente antioxidante a biomasei n condiiile stresului oxidativ pot fi metalele care pot fi administrate att sub form de sruri simple ct i sub form de compuii 5

coordinativi ai bioelementelor respective, acestea din urm manifestnd o toxicitate mai sczut i deci ar putea cotribui la fortificarea mecanismelor celulare antioxidante ale spirulinei. Printre metalele cu impact asupra echilibrului oxidant/antioxidant al spirulinei poate fi menionat cuprul. Metal tranziional de tip d, cuprul este component a numeroase enzime (tirozinaza, acidul ascorbic, oxidaza vegetal, succinil dehidrogenaza, citocromoxidaza, citocromoxidaza, superoxidismutaza, hemocianina, .a.). La excesul ionilor de cupru n culturile algale se determin intensificarea procesului de oxidare peroxid a lipidelor, sintezei intracelulare a alfa tocoferolului, superoxiddismutazei, catalazei, ascorbat peroxidazei i a glutation reductazei, coninutului de carotenoizi - componente ale sistemului de protecie antioxidant celular. Sub aciunea stresului oxidativ indus de prezena cuprului n celulele algale scade coninutul de componente bioactive ale biomasei: proteine cu distrugerea legturilor peptidice, carbohidrai i pigmeni fotosintetici. Scopul lucrrii. Stabilirea caracterului de aciune a cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis, precum i a impactului lui asupra activitii antioxidante a biomasei de spirulin. Pentru realizarea scopului nominalizat au fost trasate urmtoarele obiective:

Stabilirea caracterului de aciune a cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis. Stabilirea modificrilor intervenite n activiatea antioxidant a biomasei de spirulin la cultivarea ei n prezena cuprului, sub form de compus anorganic i compus coordinativ. Evaluarea modificrilor survenite n componena biochimic a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis obinut la cultivarea pe medii cu compui chimici ai Cu(II) Baza tiinifico-metodologic. Metodologia cercetrii tiinifice a fost asigurat n baza

conceptelor elaborate, expuse i argumentate n lucrrile lui Rudic V. (2002, 2007), Rudic V., Bulimaga V. (1998), Muruteri . (2006), Rudic V. i al. Baza de cercetare reprezint o combinare a metodelor de cultivare controlat a cianobacteriilor cu utilizarea compuilor chimici ai metalelor de tranziie, cu metode matematice de analiz statistic a datelor, precum i cu aplicarea metodelor biochimice de cercetare a biomasei cianobacteriene. Noutatea tiinific. Pentru prima dat, printr-un studiu comparativ s-a stabilit caracterul aciunii compuilor cuprului, n funcie de forma, concentraia i perioada la care este acesta administrat la mediul de cultivare asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis, asupra activitii extractelor hidroetanolice din biomasa de spirulin, precum i asupra unor principii antioxidante componente ale sistemului de protecie antioxidant celular. 6

S-a stabilit toxicitatea cuprului sub ambele forme administrate: sare simpl i compus coordinativ asupra productivitii spirulinei. S-a stabilit aciunea negativ a cuprului sub form de sulfat asupra activitii antioxidante a extractelor hidroetanolice din biomasa i efectul pozitiv al acestui element asupra activitii antioxidante n extractele hidroetanolice obinute din biomasa de spirulin, la dministrare sub form de compus coordinativ. S-a stabilit de asemenea, c valoarea expresivitii activitii antioxidante a extractelor este n funcie de perioada de administrare a compusului coordinativ i este determinat de modificrile intervenite n spectrul compuilor cu activitate antioxidant al spirulinei: componentele fenolice cu caracter preferenial lipofil i cele proteice. Semnificaia teoretic. n aspect teoretic, studiul comparativ realizat demonstreaz semnificaia cuprului asupra echilibrului oxidant/antioxidant al spirulinei, precum i forma de compus sub care acesta poate fi utilizat n procesele de cultivare a spirulinei, concentraia i perioada de administrare n cadrul ciclului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei, ceea ce este important pentru stabilirea componentelor bioactive responsabile de declanarea mecanismului de protecie antioxidant celular a spirulinei. Valoarea aplicativ a lucrrii. n aspect aplicativ, studiul comparativ al aciunii cuprului asupra echilibrului oxidant/antioxidant al spirulinei este important pentru procesele tehnologice de cultivare a spirulinei. Prin datele rezultate se obine informaia despre forma i perioada optimale de administrare a cuprului n cadrul ciclului tehnologic de cultivare a cianobacteriei, pentru activarea componentelor bioactive responsabile de declanarea mecanismului de protecie antioxidant celular a spirulinei, ceea ce va duce la sporirea eficienei economice a proceselor de cultivare industrial a spirulinei Sumarul compartimentelor tezei. Compartimentul I al tezei CIANOBACTERIILE I MICROALGELE SURS DE SUBSTANE BIOACTIVE CU PROPRIETI ANTIOXIDANTE red sinteza bibliografic referitor la stresul, oxidativ, sistemele enzimatice de protecie celular, spectrul de compui biologic activi, ndeosebi compuii cu activitate antioxidant pe care i ofer cianobacteriile i microalgele, n special cianobacteria Spirulina platensis, este elucidat rolul aciunii unor factori asupra componentelor sistemelor de protecie antioxidant a biomasei cianobacteriilor i microalgelor, printre aceti factori fiind metalele, n special cuprul. Compartimentul 2 al tezei MATERIALE I METODE DE INVESTIGARE reprezint suportul metodologic al lucrrii i descrie clar i concis materialul i metodele aplicarea crora au contribuit la soluionarea scopului i obiectivelor propuse. Acesta se refer la modelul biotehnologic (schema) de cultivare a tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02, precum i 7

metodele de determinare a creterii i productivitii tulpinii utilizate, de determinare a activitii antioxidante cu utilizarea unuia din radicalii liberi non biologici: 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil, de determinare a proteinelor, a ficobiliproteinelor, a coninutului de carotenoizi i fenoli - unele din componenetele spirulinei angajate n protecia celular a cianobacteriei. Metode de prelucrare statistic a rezultatelor obinute au permis stabilirea i au asigurat nivelul veridicitii rezulatelor obinute. Compartimentul 3 al tezei ACTIVITATEA ANTIOXIDANT A EXTRACTELOR HIDROETANOLICE DE SPIRULINA PLATENSIS I MODIFICAREA COMPONENEI LOR BIOCHIMICE LA ACIUNEA TOXIC A CUPRULUI prezint rezultatele i red analiza acestora obinute n cadrul studiului comparativ analizat. Prin rezultatele i analiza coninut compartimentul vine s elucideze caracterul aciunii compuilor cuprului, n funcie de forma, concentraia i perioada la care este acesta administrat la mediul de cultivare asupra procesului de cretere i dezvoltare a cianobacteriei Spirulina platensis, asupra activitii extractelor hidroetanolice din biomasa de spirulin, precum i asupra unor principii antioxidante componente ale sistemului de protecie antioxidant celular. Datele demonstreaz toxicitatea cuprului sub ambele forme administrate: sare simpl i compus coordinativ asupra productivitii spirulinei. Negativ este aciunea cuprului administrat sub form de sulfat asupra activitii antioxidante a extractelor hidroetanolice din biomasa. Efectul este pozitv asupra activitii antioxidante n extractele hidroetanolice obinute din biomasa de spirulin, ns la utilizarea acestui element sub form de compus coordinativ, la administrare sub form de compus coordinativ. Este de menionat, c semnul expresivitii activitii antioxidante a extractelor este n funcie de perioada de administrare a compusului coordinativ i este determinat de modificrile intervenite n spectrul compuilor cu activitate antioxidant al spirulinei: componentele fenolice cu caracter preferenial lipofil i cele proteice. Volumul tezei. Lucrarea este expus pe 53 pagini, inclusiv 9 figuri, 3 tabele. Lucrarea const din adnotare n limba romn i englez, introducere, 3 capitole, concluzii, bibliografie din 61 titluri.

1. CIANOBACTERIILE I MICROALGELE SURS DE SUBSTANE BIOACTIVE CU PROPRIETI ANTIOXIDANTE 8

n ultimii ani a crescut interesul fa de cianobacterii i microalge care sunt precutate n calitate de surse non convenionale a unui ir de substane biologic active, constituind astfel obiecte valoroase ale diverselor domenii biotehnologice. Spectrul de compui biologic activi pe care i ofer cianobacteriile i microalgele este reprezentat de ctre proteine, polizaharide, lipide, pigmeni,vitamine, enzime, microelemente .a. (Rudi L.2003- Rudic V., Rudi L., Chiriac, T., Cepoi, L., Cojocari, A., Miscu V., Bulimaga V. 2009). n prezent, cianobacteriile i microalgele sunt n continua atenie a studiilor biotehnologice n calitate de surse de antioxidani naturali, obinerea crora este o problem tiinfic actual cu aspecte practice bine conturate. Biomasa cianobacterian i microalgal conine numeroase structuri cu activitate antioxidant pronunat cum sunt ficobilinele, prezente n calitate de pigmeni fotosintetici auxiliari, carotenoizii i clorofila a, enzimele antioxidante, polizaharidele funcionale, acizii grai polienici, tocoferolii. Toate aceste componente sunt capabile s formeze complexe antioxidante eficiente. Raportul cantitativ al acestor substane biologic active determin caracterul aciunii biomasei sau a preparatelor complexe, obinute n baza acestei biomase, contra speciilor reactive de oxigen (Rudic V. 2007).
1.1.

Sistemele enzimatice de protecie celular

Nectnd la faptul c multe organisme vii (obligativ aerobe) nu pot exista fr oxigen, acestase manifest drept un agent care acioneaz distructiv asupra a tot ce este viu, cu ce contacteaz. Acest efect poart denumirea de paradox al oxigenului. Dereglarea echilibrului oxidant/antioxidant poate duce la stresul oxidativ. Noiunea de stres oxidativ a fost introdus de ctre Helmut Saise n rezultatul studiilor efectuate n anii 1981-1993. Astfel, n rezultatul creterii numrului de radicali liberi sau din contra, a scderii, n celule se produc urmtoarele schimbri: - Oxidarea peroxid a lipidelor; - Distrugerea moleculelor de protein (oxidarea grupurilor tiolice SH, pierderea funciei catalitice); - Deteriorarea structurii ADN, iniierea proceselor de mutagenez i cancerogenez;
-

Apoptoza celulelor (21).

Stresul oxidativ este un factor important n apariia multor patologii de la bolile oncologice la diversele dereglri la nivelul sistemul cardio-vascular i altor sisteme vitale ale organismului. O aciune negativ semnificativ asupra proceselor biochimice n celulele organismelor vii este manifestat de ctre particulele chimice deosebite, numite radicali liberi. Radicalii liberi prezint 9

formaiuni excesiv de active (particule fr electroni cuplai) care se formeaz n procesul de activitate vital a organismului. Aceste molecule tind s acapareze electronul de la alte molecule valoroase, n rezultatul crui fapt molecula care a suferit devine nsi un radical liber, declannd prin aceasta o reacie distructiv n lan care acioneaz negativ asupra celulei vii. Radicalii liberi pot de asemenea, manifesta proprieti mutagenice legate de deteriorarea structurii ADN i ARN-r, inducnd modificri n informia ereditar a celulei (Lawrence M., 2000). n procesul evoluiei natura a creat sisteme de protecie contra aciunii distructive a radicalilor liberi antioxidanii. Antioxidanii de origine natural posed un spectru mai larg de aciune i manifest o aciune protectoare mai eficient, dect antioxidanii sintetici (Patra J. 2007). Prima linie de protecie mpotriva aciunii toxice a derivailor oxigenului este format din antioxidanii naturali, inclusiv i enzimele, astfel ca superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza (figura1.1).

Antioxidanii naturali

Antioxidanii hidrofili: ascorbat, glutation, flavonoizi, .a.

Antioxidanii lipofili: carotenoizii, tocoferolul . a.

+e O2 Enzime O2 SOD H2O2 OH Catalaza

H2O+O2 Glutationperoxidaza Glutation Fig. 1.1. Sisteme antioxidante de protecie a celulei (Flora S.J. 2007).

Catalaza oxideaz consecutiv peroxidul de hidrogen pn la oxigenul molecular (Lawrence M 2000). Glutationperoxidaza care este compus in trei resturi aminoacide, cistein, glutamat, glicin considerndu-se un antioxidant puternic particip la restabilirea leziunilor ADN, asigur scindarea toxinelor, protejeaz structurile celulare de aciunea radicalilor liberi,n special de

10

peroxidul de hidrogen. Glutationperoxidaza regleaz de asemenea activitatea altor antioxidani (Alsher R. 2008). Enzimele antioxidante reduc la minimum concentraia radicalilor liberi ai oxigenului i peroxidului de hidrogen 2007). Mai mult de dou decenii cercettorii manifest un interes deosebit fa de superoxiddismutaza SOD. SOD este unica dintre enzime care asigur nemijlocit ruperea lanurilor reaciilor radicallibere dependente de oxigen n celulele organismelor vii. SOD asigur recombinarea radicalilor O2- cu formarea de peroxid de hidrogen i oxigen triplet. SOD este o enzim cu organizare structural subunitar. Dup prezena n centrul activ a metalelor se disting FeSOD (care conine fier) caracteristic pentru procariote, MnSOD caracteristic pentru procariote i mitocondriile eucariotelor, Cu/ZnSOD, caracteristic pentru eucariotele superioare, precum i forma cambialistic Fe/MnSOD, caractersitic pentru unele specii de microalge i cianobacterii (Regelsberger G. 2004). Conform unor date recente la cianobacterii se presupune existena formei NiSOD (Wolf F.L. 2006). Majoritatea formelor de superoxiddismutaze sunt structurate din 2 subuniti identice, fiecare din care conine cte un atom de metal. FeSOD i MnSOD sunt identice dup consecutivitatea aminoacid. Ambele forme de SOD au fost determinate la procariotele gram negative i gram pozitive, printre foto- i hematotrofe, anaerobii obligativi, formele aerobe i facultativ aerobe. Pentru unele specii s-a demonstrat c sinteza unui anumit tip de enzim depinde de prezena metalului n mediul de cultivare (Desai K. 2007). Prezena ctorva forme de izoenzime ale superoxiddismutazei demonstreaz rolul ei biologic. Forma Cu/Zn de superoxiddismutaz este sensibil fa de cianid i este localizat n fond n citozol i spaiul intermembranar al mitocondriilor eucariotelor. MnSOD i FeSOD din contra sunt cianid rezistente. Metalele din centrul activ al enzimelor ndeplinesc funcia de baz catalitic, consecutiv oxidndu-se i reducndu-se. Deosebit de acut este problema proteciei de oxigenul molecular i derivaiilor lorn celulele cianobacteriene. Posibil, din cauza c anume cianobacteriile, pentru prima dat au simit ntr-o mare msur efectele toxice ale oxigenului molecular. Superoxiddismutaza a fost determinat la toate cianobacteriile. Se consider c Fe i MnSOD au provenit din aceiai surs i reprezint molecule foarte vechi. Fierul a fost primul metal, care s-a utilizat n calitate de cofactor al SOD, forma FeSOD fiind respectiv prima, comparativ cu celelalte, cauza fiind surplusul de fier n mediul ambiant. Cu timpul cantitatea de oxigen n mediul nconjurtor a crescut, componentele 11 n celul, nu le dau posibilitatea s interacioneze cu formarea radicalului hidroxil .OH, care prevaleaz asupra O2- dup activitatea oxidant i toxicitate (Flora

minerale fiind supuse tot mai intens oxidrii. Diminuarea cantitii de fier disponibil n mediu a dus la apariia unei noi forme - MnSOD, deoarece manganul a devenit un metal mai accesibil dect fierul. MnSOD este stabil fa de KCN, ns spre deosebire de FeSOD, nu se inhib de ctre peroxidul de hidrogen (Wolf F.L. 2006). Superoxiddismutaza este un reglator important al proceselor oxidative din celul. Activarea enzimei n condiii nefavorabile este un rspuns la intensificarea producerii de radicali superoxid. Astfel, superoxiddismutaza i alte enzime antioxidante joac un rolsemnificativ n mecanismele de protecie a celuleor de aciunea stresului oxidativ (McCord J. 2000). Concepia despre rolul primordial al radicalilor liberi n mecanismele moleculare ale mbtrnirii permite a considera c sistemele antioxidante au o semnificaie deosebit n meninerea structurilor membranare la diferite etape ale ontogenezei. S-a demonstrat c rolul superoxiddismutazei crete la aciunea radiaiei ionizante. Radiostabilitatea multor esuturi este legat de activitatea acestei enzime. Astfel, spre deosebire de alte enzime antioxidante superoxiddismutaza este un radioprotector (Murley J. 2007). Aplicarea terapiei antioxidante cu urilizarea superoxiddismutazei este eficient la tratarea proceselor inflamatoare locale. Superoxidismutaza este de asmenea parte component eficient a tratamentului dermatitelor alergice, eczemelor, ischemiei cerebrale, bolilor Parkinson i Alzgeimer (Esco R. 2004). 1.2. antioxidant Pigmenii aparatului fotosintetic al cianobacteriilor i microalgelor: clorofila a, Pigmenii aparatului fotosintetic parte component a sistemului de protecie

ficobiliproteinele, carotenoizii, de asemenea sunt angajai n protecia antioxidant celular (48). Clorofila a este un pigment tetrapirolic de culoare verde prezent n celulele cianobacteriilor, i subliniaz autotrofia acestora. Derivaii clorofilei a sunt studiai intensiv n ultimii ani pentru utilizarea n calitate de sensibilizatori n terapia fotodinamic a cancerului, datorit capacitii lor de a se acumula preponderent n esuturile tumorale. Prezint interes din acest punct de vedere feoforbida a, clorina e6 i purpurina 18 ( . 1996). O atenie deosebit merit ficobiliproteinele, (caracteristice cianobacteriilor i unor grupuri de alge eucariote, aa ca algele roii i criptomonadele) pigmeni tetrapirolici hidrosolubili cu un potenial cuantic nalt al fluorescenei, de culoare roie sau albastr (Sidler W. 1994). Funcia lor de baz const n absorbia energiei solare cu lungimea de und de 495-650 nm i transferul ei spre clorofila a n centrele reactive ale aparatului fotosintetic adic snt pigmeni suplimentari care

12

asigur funcionarea sistemului fotosintetic II (Tandeau de Marsac, N. 2003). Rolul de transfer al energiei solare n fotosintez confer ficobiliproteinelor utilitate i randament biologic deosebit de preios. Culoarea ficobiliproteinelor depinde de grupele cromofore tetrapirolice (numite ficobiline), legate covalent cu radicalii cisteinici ai apoproteinelor (PATEL, A., 2005). n dependen de proprietile spectrale ficobiliproteinele se mpart n trei grupuri: ficoeritrine cu A max = 560 nm; ficocianine cu A max = 620 nm i aloficocianine cu A max = 650 nm. Grupul cromofor, care ntr n componena ficoeritrinei este ficoeritrobilina, iar a ficocianinei ficocianobilina (Figura 1.2).

Fig. 1.2. Structura ficoeritrobilinei (a) i a ficocianobilinei (b). Ficobiliproteinele devin atractive pentru utilizare comercial datorit numrului mare de cromofori, gradului de fluorescen nalt, capacitii de a forma conjugate stabile cu diferite substane, solubilitatea n ap. Ele sunt deja utilizate n calitate de colorani naturali n industria alimentar (C-ficocianina) i n industria cosmetic (C-ficocianina i R-ficoeretrina). Datorit proprietilor lor spectrale se mai utilizeaz n calitate de trasori n imunodiagnostic i microscopie diagnostic, i n cercetrile biomedicale (Romay, 2003). Ficobiliproteinele au capacitatea de a forma conjugai stabili cu anticorpii, streptavidina, biotina, ADN-ul, din care cauz domeniile de utilizare ale ficobiliproteinelor devin din ce n ce mai vaste. Astfel ficobiliproteinele pot fi utilizate ca marcheri fluoresceni pentru identificarea anumitor tipuri de celule i proteine (KIRK, E., BEHRENS P. 1999,). Semnificativ este aplicarea lor n citometria n flux i imunohistochimie (Telford, 2001). Paralel cu utilizarea n diagnosticul medical, ficobiliproteinele se utlizeaz i n medicin pentru normalizarea schimbului de substane i activizarea sitemului imunitar. C-ficocianina manifest aciune curativ n tratamentul ulcerului, sngerrilor hemoroidale i imunodeficienei 13

(Kato 1994), aciune hepatoprotectoare, antioxidativ i antiinflamatoare, aciune inhibitoare asupra creterii celulelor K562 n leucemia uman, anticancerigen (Volk 2006). Cercetrile efectuate la Universitatea din Kioto, Japonia au demonstrat c aciunea antioxidativ a ficocianinei este determinat de cromoforul tetrapirolic - ficocianobilina. C-ficocianina manifest efect antiinflamator inhibnd sinteza leucotrienei i a metaboliilor acidului arahidonic, care provoac inflamaia (Hirata 2000). n biomasa cianobacteriilor sunt prezeni aa carotenoizi ca: -carotenul, mixoxantofila, cantaxantina, echinenona, zeaxantina (Dencicov, 1998, Dencicov Rudic 2000). Datorit legturilor duble conjugate i inelelor hexenice nesaturate carotenoizii particip n reaciile oxidative i transformrile fotochimice. Carotenoizii intervin n aa procese biochimice importante ca fotosinteza, respiraia, transferul energiei absorbite la clorofile, fotoprotecie. Carotenoizii au capacitatea de a neutraliza radicalii agresivi ai oxigenului i de a proteja celulele de aciunea factorilor nocivi, manifestnd aciune antioxidativ, antimutagen i anticancerigen (Singh, 2005). Dintre carotenoizii cu proprieti antioxidante puternice o importan deosebit o are -carotenul predecesorul provitaminei A, care se descompune n organismul animal cu formarea vitaminei A. -carotenul, inhib creterea celulelor tumorale, reducnd astfel eficient riscul mbolnvirii de unele afeciuni oncologice (Burja, 2001; Singh 2005).
1.3.

Aciunea unor factori asupra componentelor sistemelor de protecie

antioxidant a biomasei cianobacteriilor i microalgelor. Pstrarea structurii native a moleculelor biologice i funcionarea normal a organismelor vii este imposibil fr interaciunea strns dintre macromoleculele organismului cu ionii metalici. Metalele de tranziie, astfel ca Fe, Mn, Zn i Co, Cu se includ n structura multor enzime i complexe antioxidante, i ca parte component a acestora sunt angajate n principalele procese biochimice n celul.

14

Fig. 1.3. Cile de biosintez a tetrapirolilor. Este artat reglarea biosintezei de tip feedback (Beale, 2000, 2001; , 1998; Papenbrock, 2001). n Figura 1.3 i Tabelul 1.1 sunt redate principalele etape ale procesului de biosintez a compuilor tetrapirolici ciclici i liniari i a principalelor enzime implicate n acest proces.

15

Tabelul 1.1. Enzime care particip la sinteza pigmenilor tetrapirolici Denumirea complet a enzimei Glutamil ARNt -sintaza Glutamil ARNt -reductaza Glutamat-1-semialdehid aminotransferaza Porfobilinogensintaza Hidroximetilbilansintaza Uroporfirinogen III sintaza S-adenosyl-l-methionindependent uroporfirinogen III metiltransferaza. Uroporfirinogen III decarboxilaza Coproporfirinogen III oxidaza (aerob) Coproporfirinogen III oxidaza (anaerob) Protoporfirinogen IX oxidaza Fierchelataza Magneziuchelataza Abrevier e GTS GTR GSA PBS HBS UPS UPM Cofactorii Piridoxalfosfatul, Mg2+, Mn2+ Piridoxalfosfatul Mg2+ , Zn2+ dipirometan lipsesc Acidul levulinic (Senior et al., 1996) Bromoporfobilinogen (Jones and Jordan) Inhibitorii specifici (Sursa bibliografic) Hemul, (Vothknect et al.1998); glutamate-1-semialdehida (Pontoppidan nd Kannangara,1994)

UDC COXae COXan POX FeCHEL

lipsesc Fe2+, Cu2+ Mg2+ FAD FeS cluster Difenileter-erbicid N-metilprotoporfirina IX (Suzuki et al, 2000); ATP (Walker et al., 1997) N-metilprotoporfirina (Walker et al.,1991); feoforbida (Popperl et al, 1997); AMP i ADP (Jensen et al, 1999) protoclorofilida, feoforbida a, protofeoforbida a (Ellswort and Pierre, 1975) Mg-protoporfirina IX dimetilester (Whyte and Castelfranco, 1993)

MgCHEL Mg2+

Magneziu protoporfirin MgPMT IX metiltransferaza Magneziu protoporfirin monometilester ciclaza Protoclorofilid oxidoreductaza Divinilclorofilidreductaz a Clorofil a sintaza Hemoxigenaza Ficocromobilin sintaza MgPCY POR DCR CAS HO FS Mg2+ sau Mn2+ Fe2+ Mg2+/Na+ , sau K+/Fe2+ FeS cluster

16

Este semnificativ faptul c principalele etape de biosintez a tetrapirolilor sunt identice pentru diferite grupuri de organisme: bacterii, cianobacterii, microalge, plante superioare, animale. Compuii intermediari i enzimele implicate n procesul de sintez sunt similare, cele din urm deosebindu-se prin ionii metalelor plasai n centrul activ. Aceast similaritate indic odat n plus asupra caracterului unic al proceselor biosintetice n lumea vie, independent de nivelul de organizare la care se efectueaz studiul. Sinteza acidului -aminolevulinic. Acidul -aminolevulinic servete ca precursor universal pentru tetrapirolii ciclici i cei liniari. Cianobacteriile, algele i plantele sintetizeaz acidul -aminolevulinic din glutamat (Beale, 1999). Primul pas n aceast reacie este legarea glutamatului de ARNt catalizat de glutamil ARNt sintaza. Apoi urmeaz reducerea glutamatului pn la glutamat-1-semialdehida, reacie catalizat de glutamil ARNt reductaza, avnd n calitate de centru activ ionul de Mg (II), Mn (II) sau piridoxalfosfatul. Urmeaz sinteza propriu zis a acidului -aminolevulinic, reacie catalizat de glutamat-1-semialdehid aminotransferaz. Sinteza porfirinelor. 2 molecule de acid -aminolevulinic sub aciunea porfobilinogensintazei se condenseaz formnd o molecul pirolic porfobilinogen. Urmtoarea etap a biosintezei const n transformarea a 4 molecule de porfobilinogen n macrociclul uroporfirinogen III, proces care are loc prin doi pai consecutivi i cu participarea a dou enzime: hidroximetilbilansintaza i uroporfirinogen III sintaza. Dup sinteza uroporfirinogenului III are loc prima ramificare a cilor de sintez a pigmenilor tetrapirolici: sirohemic spre vitamina B12 i cea porfirinic. Din uroporfirinogen III se sintetizeaz protoporfirina IX cu participarea coproporfirinogen III oxidazei i protoporfirinogen IX oxidazei. Aceasta poate avea loc att n condiii aerobe ct i anaerobe, cianobacteriile fiind unicul grup de organisme cu setul enzimatic necesar pentru ambele ci de biosintez. n condiii aerobe funcioneaz COXae unde centrul activ conine ionii de Cu sau Fe (enzim prezent i n plante), iar n condiii anaerobe COXan cu ionii de Mg n rol de centru activ (enzim caracteristic microorganismelor anaerobe). De la protoporfirina IX pornete cea de a doua ramificare a cilor de sinteza a pigmenilor tetrapirolici: n prezena ionilor de Fe2+ i a fierochelatazei are loc sinteza protohemului, cale ce duce spre sinteza ficobilinelor, iar n prezena ionilor de Mg2+ i a magneziuchelatazei spre sinteza clorofilei. Sinteza ficobilinelor. Din protohem se sintetizeaz hemul - cofactor al multor enzime, iar sub aciunea hemoxigenazei din hem se sintetizeaz biliverdina IXa, care fiind supus la rndul su aciunii repetate a enzimei ficocromobilin sintaza se transform n ficoeritrobilin (cromoforul ficoeritrinei), care prin izomerizare se poate transforma mai apoi n 17

ficocianobilin (cromoforul ficocianinei). Este paradoxal faptul, c fiind precursor biosintetic a ficocianobilinei, ficoeritrobilina nu provoac acumularea ficoeritrinei n celulele marii majoriti a cianobacteriilor care conin numai pigmentul albastru. Totui, chiar i n prezena cantitilor mari de ficoeritrin, prezena ficocianinei i aloficocianinei este absolut necesar n plan funcional pentru eficientizarea transferului de energie de la ficoeritrin n centrele fotosintetice, care are loc dup schema: ficoeritrinaficocianinaaloficocianinaclorofila a. Sinteza clorofilei. Am menionat deja, c odat cu includerea ionilor de Mg 2+ n protoporfirina IX se ncepe un lan nou de transformri biosintetice, care duc n final spre clorofila a. Aici i aduc aportul un ir de enzime, aa ca: magneziu protoporfirin IX metiltransferaza; magneziu protoporfirin monometilester ciclaza; protoclorofilid oxidoreductaza; divinilclorofilidreductaza i clorofil a sintaza, n care cu rol de centru activ ntlnim ionii de Na+, K+, Mg2+, Fe2+, Mn2+. Reglarea sintezei tetrapirolilor n organismele fotosintezatoare este complex, ns momentul cheie al acestui proces intervine naintea sintezei acidului aminolevulinic: reacia catalizat de glutamil ARNt reductaza apare ca primul punct de control al biosintezei. Disponibilitatea glutamatului i a ARNt,gly poate contribui la reglarea sintezei acidului aminolevulinic. Controlul asupra activitii glutamil ARNt reductazei include sinteza enzimei, degradarea ei i inhibiia prin feedback a glutamil ARNt reductazei de ctre protohemul i hemul liber. Urmtoarele dou reacii importante de reglare a cii de biosintez a tetrapirolilor sunt cele de formare a Fe- i Mg-protoporfirinei IX, care sunt n competiie de substrat cu protoporfirina IX. Direcionarea protoporfirinei IX n ramura Mg sau Fe este dirijat de disponibilitatea ionilor de Mg2+ i raportul ATP/ADP n tilacoizi (Papenbrock, 2000, 2001). Compuii porfirinici ce conin Mg, inclusiv moleculele de clorofil, care nu sunt incluse n fotosistema I, fotosistema II sau clorofila liber, pot influena etapele iniiale ale sintezei clorofilei provocnd degradarea rapid a enzimelor incluse n sintez. Acest tip de feedback este mediat de aciunea factorilor proteici (de tipul Small Cab-like proteinelor cianobacteriene) care schimb rata sintezei acidului aminolevulinic (Xu, 2002). Dac hemul sintetizat de novo nu este utilizat, el va inhiba etapele iniiale de sintez a pigmenilor tetrapirolici prin legarea glutamil ARNt reductazei. Degradarea hemului, clorofilei i probabil a porfirinelor ce conin magneziu poate contribui la echilibrul porfirinelor n celule. Acest mecanism de control al biosintezei hemului i clorofilei, asigur reglarea biosintezei prin diferii factori, minimalizeaz gradul pericolului de fotooxidare, care poate rezulta din acumularea compuilor intermediari. 18

Dup cum se vede din schema prezentat, fierul este parte component a mai multor enzime care sunt angajate n procesul de sintez a ficobilinelor. n afar de aceasta prezena ionilor de Fe2+ n citoplasm este absolut necesar pentru ca biosinteza s porneasc pe calea sintezei ficobilinelor i nu a clorofilei. Este de menionat c fierul, element tranziional de tip d ntr n constituia unor cofactori eseniali pentru multe proteine, care sunt pri componente active ale proceselor de respiraie (citocromi, citocromoxidaza); ale ciclului acizilor tricarboxilici (aconitaza, succinat dehidrogenaza); a sistemelor de protecie contra stresului oxidativ (catalaza, peroxidaza, superoxiddismutaza); proceselor de fixare a azotului la microorganismele azofixatoare (nitrogenaza). n procesul de fotosintez substanele fiercomponente sunt implicate n: transferul de electroni (citocromii, feredoxina, proteinele Fe-S); biosinteza ficobilinelor i clorofilei (coproporfirinogen III oxidaza, fierchelataza, magneziu protoporfirin monometilester ciclaza, protoclorofilid oxidoreductaza, hemoxigenza, ficocromobilinsintaza); asamblarea aparatului fotosintetic. Activitatea catalitic a fierului este legat de capacitatea lui de a-i schimba uor gradul de oxidare, fiind astfel un transportor eficient al electronilor n procesele biochimice. Lipsa sau insuficiena fierului n mediile de cretere afecteaz progresiv procesele metabolice celulare importante cum este fotosinteza. Insuficiena ionilor de fier cauzeaz stoparea proceselor de biosintez a clorofilei i ficobiliproteinelor, i schimbri n ultrastructura membranelor tilacoidale, provocnd n final scderea proporional a activitii fotosintetice i, corespunztor micorarea productivitii. Gradul de accesibilitate pentru celule a ionilor de fier este influenat de pH-ul mediului, de sursa de azot, i de concentraia ionilor CO32-; HCO3- i PO43-, care reduc solubilitatea compuilor cu fier. Cianobacteriile i-au dezvoltat un mecanism propriu de transport al Fe(III) din mediu, proces mediat de siderofori. Acetea din urm nu sunt altceva, dect nite substane exocelulare, care au capacitatea de a solubiliza i chelata ionii de Fe(III), i de a-i transporta prin membrana celular n citoplasm (SWINGLEY, W., 2005;). Printre elementele eseniale organismului viu i proceselor sale vitale se evideniaz zincul, care i exercit funcia biologic prin asociere cu proteinele. Zincul prezint un paradox chimic interesant pentru celulele vii. n timp ce excesul de Zn(II) manifest toxicitate semnificativ i poate duce la distrugerea sistemelor biologice, el este n acelai timp un micronutrient esenial, care joac roluri importante n numeroase procese fiziologice. Rolul catalitic al zincului este determinat de implicarea lui n structura catalazei, carboxianhidrazei, carboxipeptidazei, aldolazei. De rnd cu funcia catalitic, zincul asigur stabilitatea structurii cuaternare a proteinei (rolul structural), exercit funcia de reglare, fiind att activator, ct i inhibitor al activitii enzimatice (COLEMAN, J, 1992). n biosinteza ficobilinelor i clorofilei 19

zincul particip fiind cofactor al porfobilinogensintazei, enzim ce catalizeaz reacia de biosintez a porfobilinogenului din acidul -aminolevulinic. Manganul ntr n componena metaloenzimelor, care ndeplinesc diverse funcii n celulele bacteriene (YOCUM, C.,1999). Manganul este esenial pentru anumite ci metabolice, fiind parte activ n diverse procese de oxido-reducere i sisteme enzimatice. Spre exemplu, manganul este implicat direct n centrul activ al sistemului de oxidare a apei n sistemul fotochimic II la cianobacterii, este catalizator al activitii unor enzime cum ar fi MnSOD, mangancatalaza, polimeraza, galactotransferaza, arginaza, fosfataza alcalin, fosfataza acid. Multe reacii enzimatice din ciclul Krebs necesit mangan pentru activitatea lor optim. Manganul influeneaz absorbia i repartizarea fierului, cuprului i magneziului, catalizeaz oxidarea fierului bivalent n fier trivalent, influeneaz oxidarea azotului nitric i amoniacal, stimuleaz activitatea ARN-polimerazei i sinteza ARN-ului. Semnificaia biologic a manganului nu se limiteaz la enzime i reacii catalitice: manganul nonenzimic contribuie la stabilizarea peretelui celular bacterian i la activitatea unui spectru larg de produi bacterieni, inclusiv a antibioticelor secretate (Jakubovics, N., 2001).
1.4.

Biomasa de Spirulina platensis surs de substane bioactive cu proprieti

antioxidante Printre marea varietate de specii de cianobacterii i microalge un loc aparte revine cianobacteriei Spirulina platensis. Conform nomenclatorului sistematic bacteriologic prezentat n Determinatorul Bergey, Spirulina (Arthrospira) face parte din grupul de organisme cu o fotosintez ce are loc n prezena oxigenului. Relaiile filogenetice au fost stabilite n baza secvenierii subunitilor 16S din ARNr. n urma secvenierii subunitii 5S a ARNr a fost demonstrat c aceste organisme procariote fac parte din grupul eubacteriilor. Astfel poziia sistematic a spirulinei este urmtoarea: ncrengtura - Prokaryota; Grupul Eubacteria; Ordinul Prochlorales; Familia Oscilatorialles; Gen. Spirulina (Ciferi,1983). n urma examinrii microscopice Spirulina platensis apare ca un filament format din celule cilindrice, aranjate helecoidal n trihoame. Filamentele sunt mobile, lunecnd de-a lungul axei sale. Hetorocistele lipsesc. Forma spiralat a trihomilor este meninut doar n mediile lichide, n medii solide acestea se transform n filamente liniare. Diametrul celulelor are valori cuprinse ntre 1 - 3 m n cazul celulelor tinere i de la 3 la 12 m pentru cele mature. Seciunile ultrafine studiate cu ajutorul microscopiei electronice arat ca peretele celular este alctuit din 4 straturi: LI-IV. Toate

20

aceste straturi, cu excepia LII, sunt formate din peptidoglican, care confer peretelui celular rigiditate. Cea mai proeminent parte a citoplasmei este prezentat prin tilacoizii, care provin din invaginaiile interne ale plasmalemei, dar capt forme diferite n dependen de funcie (respiraie, fotosintez, fixarea i replicarea AND-lui). Ficobilizomii - agregate ale ficocianinei cu mas molecular mare sunt fixai de ctre tilacoizi i ndeplinesc rolul de pigmeni anten. Granulele de cianoficin servesc ca material de rezerv, fiind compuse din copolimerii aminoacizilor (poli-L-aspartic i arginin). Numrul granulelor de cianoficin variaz n dependen de compoziia mediului nutritiv, vrsta celulelor i temperatura de cultivare. Granulele de poliglican, carboxizomii i mezozomii, de asemenea, au fost identificai n celula cianobacteriei. Spirulina poate s se adapteze uor diferitor condiii ale mediului ambiant, coloniznd un numr variat de medii, unde poate deveni cu uurin specie predominant ca urmare a unei dezvoltri exponeniale. La fel ca i majoritatea cianobacteriilor, spirulina este un organism autotrof i nu poate crete n lipsa luminii. n ce privete sursa de carbon poate fi utilizat att carbonul anorganic, ct i carbohidraii. Productivitatea se mrete i la sporirea cantitii de azot n mediile de cultivare, n mod special cnd temperatura i iluminarea au valori optime. Intensitatea optim a luminii este de 20-30 klx. n laborator pH-ul optim are valori cuprinse ntre 8 i 11, dar spirulina poate crete i n mediile cu pH aproape de 7 sau mai mare de 11. Temperatura optim este de 32-35oC, n cazul n care temperatura depete valoarea de 40oC are loc stoparea creterii. Ciclul vital are trei etape fundamentale: fragmentarea trihomilor, creterea i maturizarea hormogoniilor, alungirea trihomilor. Trihomii maturi se rup cu formarea celulelor specializate, nicridii. Ca urmare se formeaz trihomi scuri a cte 2-4 celule. n procesul diviziunii citoplasma este mai puin granular, iar celulele capt o culoare verde-albastr pal. Numrul celulelor crete prin diviziunea binar, odat cu sporirea granulaiilor din citoplasm i celula devine verdealbastr pronunat. Biomasa de spirulin se caracterizeaz printr-o compoziie biochimic echilibrat, coninnd un ir de substane bioactive ficobiliproteine, polizaharide sulfatate, carotenoizi (n special caroten), vitamine (-tocoferolul, acidul ascorbic, B12), aminoacizi eseniali, acid gama-linolenic, substane fenolice, enzime (superoxiddismutaza, peroxidaza, catalaza) i unele microelemente (Rudic, 2007). Biomasa cianobacteriei Spirulina platensis conine astfel, un ir de bioprotectori, un ir de biocorectori i biostimulatori care nu se conin mai mult nici n unul din produsele de origine

21

natural. Complexitatea biologic a spirulinei determin proprietile sale fenomenale n calitatea sa de produs nutraceutic i curativo-profilactic cu un spectru larg de aciune. Majoritatea componentelor biomasei de spirulin denot activitate antioxidant. Ctre antioxidani se refer n special, acizii grai nesaturai i polinestaurai (acidul linolic, gama linoleic, arahidonic,), tocoferolul (vitamina E), carotenoizii (-carotenul, mixoxantofila, zeaxantina), ficobilproteinele (ficocianina), plozaharidele sulfatate, enzimele (superoxiddismutaza, glutationperoxidaza), polifenolii .a. Conform unor studii, extractele din biomasa de spirulin posed capacitatea de a suprima procesele care determin apariia i evoluia reaciilor alergice i anafilactice, precum i proprietatea de a prentmpina evoluia proceselor maligne n organismul uman i animal (Demmig Adams, 2002). Extractele din spirulin cu utilizarea solvenilor organici cu coninut de carortenoizi i acizi grai polinesaturai manifest activitate antioxidant nalt. S-a stabilit c acidul gama-linolenic ( circa 10% din coninutul total de lipide), este capabil s acioneze selectiv asupra celulelor tumorale , inducnd apoptoza. n complex cu acizii linolic i arahidonic, acidul gama linolenic regleaz metabolismul prostaglandinelor n epiteliul organelor reproductive. Acidul gama linolenic se utilizeaz n tratamentul afeciunilor cardiovasculare datorit capacitii de arestabili membarnele celulare, precum i datorit capacitii de normalizare a tensiunii arteruale, nivelului colestorlului n snge (rudi, 2003,) Sunt cunoscute procedee de obinere a preparatelor lipidece pe baza biomasei de spirulin (LS-E i LS-CE) cu un coninut sporit de acid gama-linolenic i ali acizi nesaturai importani cu proprieti antioxidante. Aceste preparate denot perspectiva utilizrii lor n medicin (traumatologie, stomatologie n scopul regenerrii esuturilor afectate, tratamentul aterosclerozei .a. ) (Rudi, 2006). Vitamina E, un alt component antioxidant al biomasei de spirulin (30-35mg/100g biomas absolut uscat) posed proprieti antiinflamatoare i este capabil s neutralizeze radicalii liberi. Datorit proprietilor sale antioxidante, tocoferolul prentmpin formarea trombelor, previne apariia afeciunilor cardiovasculare n rezultatul aciunii protectoare asupra eritrocitelor (Rudic, 2007, Packer 2001). Biomasa de spirulin conine de asemenea o cantitate considerabil de carotenoizi, inclusiv concentraii nalte de -caroten (0,42-0,44%) (Rudic V, 1993, 2007). Acest pigment realizeaz captarea radicalilor liberi n complexele biolipidice ale membranelor celulare, mpiedicnd astfel oxidarea lipidelor i lipoproteinelor. S-a demonstrat, c -carotenul reduce riscul apariiilor

22

maladiilor oncologice i contribuie la scderea nivelului de colesterol n snge (Abd El Baku,2003). De rnd cu utilizarea larg a -carotenului n calitate de antioxidant,o importan tot mai mare capt un alt pigment al spirulinei de natur proteic i cu proprieti antioxidante ficocianina care se refer la grupul de ficobiliproteine. Acest pigment particip activ la realizarea proceselor fotosintetice, absorbind razele spectrului vizibil cu maximumul de absorbie de 450nm (Rudic, Bulimaga, 1998; Rudic, .a2007). Biomasa de spirulin conine circa 60-70% protein, din care cota parte a ficocianinei reprezint circa 10-14% (Rudic .a. 2007).Potenialul nalt al ficocianinei, determinat n tratamentul i profilaxia diferitor maladii grave, inclusiv a bolilor oncologice i SIDA, o plaseaz drept un obiect important al studiilor tiinifice (Bhat, 2000). Microelementele din compoziia biomasei de spirulin, de asemenea sunt parte component a sistemului de protecie celular. Spre exemplu, seleniul care este unul din microelementele importante, servete drept parte component a enzimei glutationperoxidaza. Se tie c seleniul manifest proprieti antioxidante, asigurnd protecia membranelor celulare de urmrile stresului oxidativ. (Rudic, 2007). De rnd cu componentele nominalizate, un rol semnificativ n prentmpinarea apariiei i neutralizarea urmrilor stresului oxidativ, revine antioxidanilor de natur enzimatic. Protecia enzimatic antioxidant este reprezentat de catalaza, glutationperoxidaza, superoxidismutaza .a. Glutationperoxidaza este una una din enzimele principale reponsabile de distrugerea formelor active de oxigen ,n special peroxidul de hidrogen. Catalaza reduce H2O2 pn la H2O. Superoxidismutaza catalizeaz reacia dedismutare a radicalului superoxid n peroxidul de hidrogen sau oxigenul molecular (Patra, 2007; Alsher, 2008). n realizarea acestei reacii un rol important l joac metalele care intr n centrul activ al enzimei, n procesele de oxido-reducere din celule. superoxiddimutazei spirulinei, intr ionii de fier (Wolf, 2006). Pentru nelegerea mecanismelor complicate ale sistemului antioxidant de protecie celular este necesar de a supune analizei i factorii care contribuie la activarea acestui sistem n condiiile stresului oxidativ. Cianobacteria Spirulina platensis este folosit cel mai frecvent n calitate de obiect-model al cercetrilor ficobiotehnologice, iar printre factorii care ar pute influena i/sau contribui la activarea sistemul de componente antioxidante a biomasei n condiiile stresului oxidativ sunt metalele care pot fi administrate att sub form de sruri simple ct i sub form de compuii coordinativi ai bioelementelor respective, acestea din urm manifestnd o toxicitate mai sczut i deci ar putea cotribui la fortificarea mecanismelor celulare antioxidante ale spirulinei. 23 Se tie c n centrul activ al

Printre metalele cu impact asupra sistemului de componente antioxidante ale spirulinei poate fi menionat cuprul. Cuprul se include activ in procesele de oxidare a lipidelor structurale cu formare de radicali. n rezultatul oxidarii lipidelor structurale, membranele celulare pierd din fluiditate, scade capacitatea celulelor de adaptare i ac rezultat moartea lor.

2. MATERIALE I METODE DE INVESTIGARE

24

Cercetrile, rezultatele crora sunt rezumate i expuse n prezenta lucrare au fost efectuate pe parcursul anului 2011-2012 n Laboratorul Ficobiotehnologie al Institutului de Microbiologie i Biotehnologie al Academiei de tiine a Moldovei n cadrul Proiectului instituional de cercetri fundamentale 11.817.08.18F Stabilirea mecanismelor de modificare a statutului oxidativ i a componenei biochimice a biomasei unor microalge sub aciunea metalocomplexelor n scopul obinerii preparatelor antioxidante, realizat n cadrul Direciei strategice: 2.Valorificarea resurselor umane, naturale i informaionale pentru dezvoltarea durabil a economiei rii. 2.1. Obiectul de studiu Obiect al cercetrilor a fost tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB02(CYANOPHYTA), depozitat n Colecia Naional de Microorganisme Nepatogene de pe lng Institutul de Microbiologie al Academiei de tiine a Moldovei. Particulariti morfologice: La cultivarea spirulinei pe mediile nutritive lichide caracteristice (mediul Gromov i/sau Zarrouk), spirulina formeaz trihome care se rsucesc n spiral dreapt, limea spirei fiind de 22-46 mkm, distana dintre spire de 35-108mkm. Pe msur ce cultura mbtrnete, aceasta se despiralizeaz, se formeaz ghemuri de diferite dimensiuni cu diametrul de circa 2mm care rmn suspendate i care nu se fixeaz de pereii vasului i nu se sedimenteaz. De asemenea, la culturile mbtrnite predomin trihome separate, a cror lungime depete 200mkm (la culturile cu vrsta de 12-15 zile). Pe mediile nomnalizate cu agar spirulina manifest un polimorfizm pronunat care se exprim printr-un grad mai sporit sau mai sczut de spiralizare a trihomelor prin forma i dimensiunile celulelor, prin gradul de agregare a tihomelor n ghemuri.LUngimea trihomelor spiralate este de 17-38 mkm, iar a filamentelor drepte de pn la la 100mkm, diametrul trihomelor este de 2,6-5mkm, iar lungimea celulelor de 2-5mkm, cu conturul dreptunghiular sau n form de butoia. nmulirea. Spirulina se nmulete prin fragmentarea trihomelor i dezagregarea ghemurilor. n procesul fragmentrii trihomelor pereii celulari transversali se ngroa puin, devin bombai. Stangularea pereilor despritori continu pn la momentul despririi totale a fragmentelor (hormogoniilor) alctuite din 5-10 i mai multe celule. Diviziunea trihomelor i a celulelor decurge independent de regimul de iluminare, n surplus de substane nutritive, i al agitrii intensive fragmentarea trihomelor decurge mai intens. Dezagregarea ghemurilor la fel se intensific la o agitare i ilimunare suplimentar. 25

Particulariti fiziologo-biochimice i de cultivare. n vederea asigurri necesitilor vitale, spirulina se cultiv n vase de sticl (retorte) sau mini fotobioreactoare (cultivatoare) special, pe medii de cultur minerale specific cu coninut de macro- i microelemente, ca spre exemplu mediile Gromov Nr.16 i/sau Zarrouk ( 1991 ). Pe mediile de cultur lichide nominalizate spirulina crete n stratul superior al mediului de cultur, trihomele se contopesc n ghemuri, cu diametrul de 2mm i mai mult care nu se fixeaz de pereii vasului. Pe vraiantele agarizate ale mediilor date se dezvolt radial. n perioada iniial pn la ziua a 3-5-a cnd cultura ocup toat suprafaa mediului agarizat, spirulina are o nuan verde nchis, mai trziu cultura dezvoltnd o coloraie verde albastr. Tulpina S. platensis CNM-CB-02 asimileaz azotul sub form de nitrat (NaNO3, KNO3). Carbonul este asimilat foarte bine sub form de NaHCO3 i oxid de carbon (IV), precum i din compuii organici sruri ale acizilor organici, glucoz i alte monozaharide. n timpul dezvoltrii culturii are loc alcalinizarea mediului nutritiv, pH fiind mai mare de 10,8-11,0 stopeaz creterea i dezvoltarea spirulinei. Iluminarea se asigur pe parcursul a 24 ore la nivelul luminii de 15-24 mii erg/cm 2,s., temperatura de 30-35oC, pH-ul mediului 9,5-10,0. Pe parcursul a 24 ore tulpina trece prin 1-2 generaii, productivitatea constituind 0,3-0,4g/l. Biomasa absolut uscat de spirulin conine 1,3-3,3% aminoacizi liberi, 5,5-6,5 oligopeptide, 62-70% proteine, 9-11% ficobiliproteide, 10-15% polizaharide, 3-5% lipide, 0,42-0,44% caroten, 30-35mg% tocoferol, 80-100mg% acid ascorbic, vitaminele grupului B, inclusiv B12, fitohormoni i alte substane bioactive, reziduul mineral constituind 7-10%. Meninerea tulpinii n stare pur: pentru pstrarea ndelungat a tulpinii se utilizeaz mediile agarizate nominalizate diluate cu ap distilat (1:1) la o temperatur nu mai mare de 15 0C. Cultura se rennoiete la fiecare 2 luni. Tulpina se pstreaz i pe variantele lichide ale mediilor date la temperature camereie i iluminarea de zi, nnoirea mediului realizndu-se lafiecare 40-45 zile. 2.2. Metode de investigare Pentru realizarea obiectivelor propuse au fost utilizate urmtoarele metode biotehnologice i biochimice de investigare:

Modelul biotehnologic (schema) de cultivare a tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02. Metoda de determinare a creterii i productivitii tulpinii utilizate; 26

Metoda spectrofotometric de determinare a activitii antiradicalice cu utilizarea radicalilor liberi 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil; Metoda de determinare a proteinelor; Metoda de determninare a ficobiliproteinelor; Metoda de determinare a varierii coninutul de carotenoizi; Metoda de determinare a varierii coninutului de fenoli; Metode de prelucrare statistic a rezultatelor obinute. 2.2.1. Modelul biotehnologic (schema) de cultivare a tulpinii cianobacteriei Spirulina

platensis CNM-CB-02. Prepararea mediului nutritiv: Pentru cultivarea tulpinii S. platensis CNM-CB-02 n scopul evalurii impactului unor compui coordinativi noi ai Co (II) cu bazele Schiff asupra modificrii productivitii i componenei biochimice a ei, s-a utilizat varianta mediului nutritiv mineral Gromov cu urmtoarea componen: (n g/l) NaNO3-2,25; NaHCO3-8,0; NaCl-1,0; K2SO4-0,3; Na2HPO4-0,2; MgSO47H2O-0,2; CaCl2-0,024; 1ml/l soluie de microelemente ce conine (mg/l(mediu): H3BO3-2,86; MnCl24H2O-1,81; CuSO45H2O -0,08; MoO3 0,015); FeEDTA1ml/l; Fiecare macroelement n cantitatea i succesiunea indicat s-a cntrit i consecutiv s-a dizolvat ntr-un volum de ap distilat echivalent cu 3/5 din volumul unui vas cu capacitatea de 10 dm3. Dup, volumul mediului s-a adus la cota de 10 dm3. Inocularea spirulinei : La mediul nutritiv mineral preparat s-a introdus inoculumul de spirulin, reieind din proporia 0,4-0,45 g/l n recalcul la biomasa absolut uscat i s-a amestecat. Transferarea culturii n vasele de cultivare: Mediul nutritiv preparat s-a transferat cte 50cm3 n retorte conice din sticl cu volumul total de 100cm3. Introducerea compuilor chimici ai Cu(II) n experiene s-au utilizat sulfatul de cupru: CuSO4*5H2O i compusul coordinativ al Cu(II) RGT-11, sintetizat n laboratorul Chimie anorganic al USM, sub conducerea prof. univ. Aurelian Gulea. Concentraiile de studiu ale compuilor au fost: 10mg/ml i 20mg/ml care au fost administrate la cultura de spirulin la intervalul de 1-2 ore de la inoculare i dup 48 ore a procesului de cultivare. Experienele au inclus 5 variante experimentale i au fost montate n 3 repetri pentru fiecare concentraie studiat de compus. Cultivarea spirulinei: n vederea derulrii procesului de cultivare, retortele cu variantele experimentale s-au plasat pe o instalaie platou prevzut cu mecanisme de iluminare. S-au conectat o parte din dispozitivele de iluminare ale instalaiei - lmpi cu lumin de zi LB-80.

27

Instalaia este plasat ntr-o ncpere nchis, nclzit i aerisit. Cultivarea spirulinei s-a efectuat conform parametrilor: pentru primele 48 ore s-a respectat temperatura de 251oC; pH optim al mediului 8-9; iluminarea (asigurat de o parte din dispozitivele de iluminare) de 2000-3000lx i, respectiv pentru urmtoarele 96 ore: temperatura de 301oC; pH-ul-9-10; intensitatea iluminrii pn la 3000-4000lx. Pe perioada cultivrii cultura s-a supus monitorizrii nivelului volumului culturii i respectrii parametrilor specifici cultivrii. Separarea biomasei de spirulin i standardizarea ei La finalul procesului de cultivare, care este stabilit pentru primele ore ale fazei staionare de cretere i dezvoltare a spirulinei, variantele experimentale s-au supus filtrrii prin filtrul-ram din hrtie i separrii de lichidul cultural. Ficare din probele experimentale s-au standardizat la concentraia biomasei de 10mg/ml. 2.2.2. Determinarea productivitii spirulinei s-a efectuat fotometric cu recalculul masei celulare la biomasa absolut uscat (BAU) prin metoda descris (Rudic, . a. 2002), conform formulei: (g/l BAU) = A 680 x x k(0,60) unde: A680 densitatea optic a culturii de spirulin; diluia probei; k - coeficient de recalcul a culturii de spirulin n g/l BAU, calculat din curba de calibrare (de determinare a BAU). 2.2.3 Prepararea extractului etanolic din biomasa de spirulin fost efectuat prin extragerea cu etanol de 10 i 55%. A fost respectat raportul 100 mg biomas : 1 ml alcool. Extragerea s-a produs la temperatura camerei n condiii de agitare timp de 2 ore. Extractul a fost separate de biomas, standartizarea s-a efectuat dup concentraia biomasei utilizate. Extractele obinute au fost pstrate la temperature 00C. 2.2.4 Metoda spectrofotometric de determinare a activitii antioxidante cu utilizarea radicalilor liberi 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil. Principiul reaciei const n reducerea radicalilor DPPH (culoare violet) cu obinerea formei nonradicalice difenilpicrilhidrazin de culoare galben (9). Concentraia radicalului DPPH n soluia de lucru, precum i durata reaciei sunt individuale i se determin pentru fiecare caz n parte n dependen de natura substanei antioxidante i a (1)

28

solventului utilizat. Reducerea valorilor extinciei (% Inhibiie) a soluiei de DPPH se calculeaz conform ecuaiei: % Inhibiie =(AbsDPPH- AbsPROBA)/AbsDPPH * 100 unde: AbsDPPH absorbana reagentului DPPH la 517nm; AbsPROBA absorbana probei la 517nm 100 2.2.5. Cantitatea de protein s-a determinat dup Lowry (Rudic V. .a., 2002). Metoda este bazat pe determinarea intensitii coloraiei soluiei de protein prin reacia de reducere a amestecului de acizi fosfovolframic i fosfomolibdenic cu formarea unui compus complex colorat n albastru. Intensitatea coloraiei este proporional cu cantitatea de proteine n materialul cercetat. Pentru a extrage proteina, extractul hidroetanolic de 55% s-a supus evaporrii alcoolului, reziduul umed s-a dizolvat n 1ml ap la care s-a adugat 2ml Soluie A+B (Soluia A: NaCO 3 de 2% n NaoH de 0,1N 49ml; Soluia B: CuSO4 *5H2O de 0,5% n citrat de sodiu de 1,0% - 1,0ml). S-a agitat din nou, proba s-a lsat pentru 10min, dup care s-a adugat 0,2ml reactiv Folin (SIGMA), s-a agitat i s-a lsta timp de 40 min. la ntuneric pentru derularea reaciei (colorarea treptat a soluiei n albastru). Dup, s-a citit absorbana probelor la lungimea de und 750nm. Cantitatea de protein s-a calculat conform relaiei: %, BAU = A 750 x x k(2,45)/ m x 100 unde: A680 densitatea optic a probei; diluia probei; k - coeficient de recalcul a cantitii de protein n % din BAU, calculat din curba de calibrare pentru protein; m masa probei luat pentru analiz, mg/ml; 100 recalcul cantitate protein n %. 2.2.6. Coninutul de ficobiliproteine s-a determinat prin metoda spectrofotometric elaborat de Boussiba i Richmond la lungimile de und 620 i 650 nm, n modificaia (Rudic, Bulimaga, 1998), utiliznd coeficientul de extincie pentru ficocianin D1cm1% =73, iar pentru aloficocianin D1cm1%=58. Extractul hidroetanolic de 10% s-a fotometrat la lungimile de und 620 i 650 nm, utiliznd coeficientul de extincie pentru ficocianin D1cm1% =73, iar pentru aloficocianin D1cm1% =58. Pentru determinarea ficocianinei n prezena aloficocianinei (extract sumar de ficobiliproteine) s-a luat n consideraie aportul aloficocianinei, care absoarbe i la lungimea de und 620 nm, de aceea modificarea a constat n stabilirea ponderii aloficocianinei la 29 (3) 2)

aceast lungime de und, care este de 0,7E650, determinat din spectrul de absorbie a aloficocianinei pure i care trebuie sczut din valoarea extinciei la 620 nm pentru a obine valoarea real a cantitii de ficocianin. Fr aceast corecie la calcularea ficocianinei i a ficobiliproteinelor sumare se obin valori majorates. a) Calculul ficocianinei (% din biomas) s-a efectuat conform relaiei: (E620 0,7E650) 100/ 7,3 m unde: E620 extincia probei la maximumul de absorbie a ficocianinei E650 extincia probei la maximumul de absorbie a aloficocianinei - diluia probei m - cantitatea de biomas de spirulin luat pentru determinare, mg; b) Calculul aloficocianinei (% din biomas) s-a efectuat conform relaiei: E650 100/ 5,8 m aloficocianin. 2.2.7. Metoda de determinare a varierii coninutului de fenoli. Metoda are la baz transferul de electroni produs n mediul alcalin cu reducerea complexului acid fosfomolibdenic/fosfovolframic cu formarea cromogenului care se determin colorimetric (Singleton, Magalhaes). Soluia de lucru a reagentului Folin-Ciocalteu prin diluarea lui de 10 ori cu ap bidistilat. Sol NaHCO3: 750 mg la 100 ml H2O. La 0,3 ml se adug 1,5 ml reagent FolinCiocalteu (diluat de 10 ori cu) i 1,2 ml carbonat de sodiu. Amestecurile se agit i se incubeaz timp de 5 min la 500C. Solventul (etanolul, apa) se adaug n proba de control. Dup rcirea probelor se msoar extincia la 760 nm. Coninutul de fenoli se exprim n echivalent acid galic la 1 mg substan activ. Curba de calibrare pentru acidul galic este linear n intervalul 0,01-0,1 mg/ml (n=6, r2=0,999). 2.2.8. Metoda de determinare a varierii coninutului de carotenoizi. Pentru a determina carotenoizii, extractul cu coninut de carotenoizi s-a supus spectrofotometrrii la lingimea de und caracteristic 450nm, iar cantitatea de carotenoizi s-a determinat conform relaiei: %, M (martor) = A 470exp. x 100/A470martor unde: A 470exp absorbana probei experimentale la 470nm ; A
470martor

(4.1)

(4.2)

c) cantitatea de ficobiliproteine sumare s-a determinat prin suma cantitii de ficocianin i

(5)

absorbana probei martor la 470nm;

100 recalcul valori n %.

30

2.3. Metode de analiz statstic a rezultatelor Analiza statistic a valorilor obinute n trei serii de determinri ale productivitii i coninutului de proteine, ficobiliproteine i carotenoizi s-a bazat pe calculul urmtorilor indicatori statistici (Maruteri, 2006): Valoarea medie aritmetic. Valoarea medie definete cel mai bine tendina central a unei distribuii de frecven. Totui trebuie menionat c valoarea medie niveleaz varianiile valorilor prin obinerea unei valori mijlocii, care d impresia unei stabiliti a fenomenelor, care nu este real n biologie, de aceea pentru un studiu complet al unei compatibiliti statistice, sunt necesare metode statistice care stabilesc variaiile rezultatelor obinute i care, pentru o bun interpretare, trebuie s nsoeasc valoarea medie. Cea mai uzual n statistic este media aritmetic care corespunde formulei de mai jos:

(6) Dispersia (variana). Abaterea standard. Aa cum am mai mentionat, dispersia (variana) notat s2x este un indicator de mprtiere a datelor. Formula ei de calcul este:

(7.1) Unitatea de abatere individual fa de medie a fost denumit abaterea standard i a fost notat cu S ( se utilizeaz numai n cazul curbei ideale). Ea reprezint o msur a preciziei determinrilor sau, cu alte cuvinte, o msur a mprtierii rezultatelor individuale fa de medie. Practic abaterea standard se calculeaz ca rdcina ptrat din dispersie (varian):

(7.2) Eroarea standard. Este cunoscut faptul c determinrile biologice sunt supuse influenei a dou tipuri de erori: cele care influeneaz precizia determinrii i cele care influeneaz exactitatea determinrii. Pentru a afla exactitatea cu care s-au fcut o serie de determinri, trebuie s se calculeze abaterea medie a valorilor medii obinute sau, altfel spus, media erorilor ce se pot comite ntr-o determinare. Aceast abatere a fost denumit eroare standard, notat cu E. Calcularea ei se face cu ajutorul formulei:

31

(7.3) tiind c, n cazul distribuiei normale gaussiene, mprtierea n jurul mediei colectivitii a unei medii de antion este n ori mai mic dect mprtierea rezultatelor individuale, eroarea standard este dat i de formula:

(7.4) Ea reprezint formula clasic a erorii standard. Rezultatele experimentrilor biologice trebuie s fie nsoite ntotdeauna de eroarea standard sau de abaterea standard, utilizndu-se formulri de tipul M S sau M E, pentru a permite o just interpretare a lor. Coeficientul de variaie. Coeficientul de variaie se calculeaz ca un raport procentual ntre abaterea standard i valoarea medie a irului de valori.

(8) De remarcat c valoarea coeficientului de variaie nu are unitate de msur, se exprim procentual. Acest fapt permite folosirea indicatorului la compararea a dou sau mai multe serii de date, indiferent de ordinul de mrime al variabilelor (variantelor) i de unitile de msur folosite. Se poate considera c un coeficient de variaie sub 10% indic o dispersie mic (o mprtiere) a datelor, adic seria este omogen. Un coeficient ntre 10% i 30% indic dispersie mijlocie, iar peste 30% indic dispersie mare. Dac dispersia este mare, media nu este un indicator reprezentativ. Gradele de libertate i factorul de corecie t. Din cele discutate pn acum am vzut cum, plecnd de la un eantion al unei colectiviti, am nlocuit abaterea standard teoretic () prin Noiuni fundamentale de biostatistic abaterea standard de eantionaj (S). De asemenea, ca factor de corecie s-a folosit ptratul diferenelor individuale (d2) i s-a calculat S2. n aceeai ordine de idei, pentru a putea apropia pe S de s (abaterea teoretic) am diminuat numrul cazurilor din experiment cu o unitate, n locul efectivului total n punnd n-1. Spunem c n-1 este numrul gradelor de libertate. Gradele de libertate reprezint, n cazul determinrilor biologice numrul mrimilor (animale, determinri, observaii) folosite n experimentarea respectiv, din care se scade o unitate. Pornind de la aceast premiz, gradele de libertate reprezint practic numrul mrimilor independente folosite n experimentarea respectiv. Factorul de corecie t,

32

depinde de numrul gradelor de libertate (tn-1). Cantitatea t se gsete n tabele speciale, calculat pentru diferite probabiliti, n funcie de numrul de grade de libertate folosit (n general lucrm cu p= 0,05). Valoarea lui t scade cu ct crete numrul observaiilor, deci cu ct este mai mare numrul gradelor de libertate. n cazul determinrilor comparative martor/prob sau a mai multor doze (loturi) se scade din efectivul total cte o unitate pentru fiecare lot. (de exemplu numrul gradelor de libertate pentru dou loturi,menionat va fi (n1+n2-2). Pentru o interpretare corect, rezultatele experimentrilor biologice trebuie exprimate dup relaia de mai jos: M tS unde: M media determinrilor t factorul de corecie pentru probabilitatea dorit S abaterea standard. Valoarea lui P. Dup calcularea rezultatelor unor determinri biologice este necesar s se decid dac diferenele obinute de pild ntre mediile sau medianele eantioanelor analizate sunt datorate numai ntmplrii (de exemplu variabilitii biologice) sau sunt diferene reale (cu alte cuvinte dac cele dou eantioane fac parte din aceeai populaie statistic sau aparin unor populaii statistice diferite). Pentru a putea face aceasta este necesar nelegerea corect a unor noiuni fundamentale din domeniul statisticii, cum ar fi valoarea lui P. n cazul unui experiment efectuat asupra a dou eantioane, o ntrebare pertitent pe care am putea s o punem este urmtoarea: Dac cele dou populaii statistice studiate chiar au aceeai medie (sau media nu difer semnificativ), care este probabilitatea de a observa o aceeai diferen sau chiar una mai mare ntre mediile unor eantioane de aceeai mrime ntr-un viitor experiment ? Parametrul statistic ce rspunde la aceast ntrebare este valoarea lui P. P este de fapt o msur a probabilitii menionate mai sus, putnd lua valori ntre 0 i 1. Dac valoarea P este mic (de exemplu P<0,05) putem concluziona c este improbabil ca diferena observat ntre mediile celor dou eantioane s se datoreze ansei (eantionrii aleatorii). Cu alte cuvinte, putem trage concluzia c cele dou populaii studiate au ntr-adevr medii diferite. Cnd se face referire la valoarea lui P se folosete de asemenea i termenul de ipotez nul (notat cu H0). Ipoteza nul statueaz pur i simplu, aprioric, faptul c nu exist nici o diferen ntre grupurile (eantioanele) studiate. Simultan se formuleaz i o ipotez alternativ (notat cu Ha sau H1), ce statueaz exact contrariul: c exist o diferen ntre grupurile (eantioanele) studiate. (9)

33

Pornind de la acest fapt, putem defini valoarea lui P ca fiind probabilitatea de a observa (ntr-un viitor experiment) o aceeai diferen sau chiar una mai mare ntre dou eantioane aleatorii prelevate din cele dou populaii statistice studiate, dect am observat n acest moment, n cazul n care ipoteza nul s-ar fi dovedit adevrat. n general n cazul testelor statistice, o valoare a lui P>0,05 duce la acceptarea ipotezei nule H0, respectiv o valoare a lui P<0,05 determin respingerea ipotezei nule i acceptarea ipotezei alternative Ha. Testul F Fischer - Snedecor. Pentru a transforma varianele n mrimi apte de a fi comparate, de exemplu n cazul efectului farmacologic a dou forme farmaceutice coninnd aceeai substan activ, un instrument statistic eficient este testul F.

(10.1) Comparm valoare obinut de noi cu cea din tabelul special innd cont de gradele de libertate. Dac valoarea gsit de noi este mai mare dect cea teoretic, nseamn c exist o diferen statistic semnificativ ntre variana n jurul celor dou medii obinute experimental. Testul t Student. A fost propus de Gosset n cazul n care eantioanele sunt mici. El ine cont, n calculul diferenei semnificative dintre medii, de msura variabilitii i de ponderea observaiilor n funcie de numrul acestora (grade de libertate). Formulele de calcul a diferenei semnificative, n cazul testului t sunt urmtoarele:

(10.2)

(10.3) Se consider o diferen semnificativ, cu o probabilitate de eroare de 5% (p=0,05) dac t calculat este superior celui din tabelul special, pentru gradele de libertate corespunztoare.

34

35

3. ACTIVITATEA ANTIOXIDANT A BIOMASEI DE SPIRULINA

PLATENSIS LA ACIUNEA TOXIC A CUPRULUI


Metalele sunt elemente naturale, rspndite n diverse compartimente ale diferitor ecosisteme. Cu toate c unele metale sunt micronutrieni eseniali, n cantiti crescute ele pot fi toxice pentru majoritatea organismelor. Astfel, cuprul este un element esenial pentru multe procese celulare, dar n concentraii toxice, ionii lui acioneaz ca generatori de radicali liberi (Neumann et al., 2003). Pe de alta parte, ionii de Cu(II) pot crete potenialul antioxidant cellular prin activitatea unor enzime antioxidative, cum ar fi: superoxid dismutaza, peroxidaza si glutation peroxidaza (Norvell, 1993). Toate organismele aerobe au capacitatea de a se apra de efectele toxice ale speciilor reactive de oxigen. La cianobacterii i microalge exist cteva molecule cu proprieti antioxidante ca spre exemplu: glutationul, acidul ascorbic, alfa-tocoferolul i carotenoizii, precum i enzime care protejeaz mpotriva deteriorrilor oxidative. Astfel, sub aciunea superoxiddismutazei, radicalii O2- sunt convertii la H2O2, care e descompus sub aciunea catalazei, a ascorbat-peroxidazei sau a altor tipuri de peroxidaze. n ciclul ascorbatglutationului, aciunea enzimatic a ascorbat-peroxidazei reduce H2O2folosind ascorbatul ca donor de electroni. Ascorbatul oxidat este apoi redus prin reacii catalizate de monodehidroascorbat-reductaza, dehidroascorbat-reductaza si glutation-reductaza. Lipoxigenaza este implicat n procesele de cretere si dezvoltare, n biosinteza moleculelor reglatoare. Substratul este reprezentat de acizii grai polinesaturai prezeni in membranele lipidice, ceea ce duce la pierderea integritii membranare. n prezent, numeroase date tiinifice sugereaz c excesul de metale acioneaz pe post de catalizatori n deteriorrile oxidative ale macromoleculelor biologice, ceea ce sugereaz c toxicitatea datorat acestor metale poate fi rezultatul, cel puin parial, al stresului oxidativ. Se presupune ca ionii de cupru sunt cel puin la fel de eficieni ca i ionii altor metale, n catalizarea proceselor formative de specii de oxigen reactive. 3.1. Productivitatea Spirulina platensis la aciunea unor compui chimici ai Cu(II) La prima etap a cercetrilor a fost efectuat studiul influenei compusului coordinativ RGT n concentraie de 10 i 20 mg/l asupra productivitii la Spirulina platensis. Influena compusului coordinativ RGT a fost comparat cu influena sulfatului de cupru, care este considerat un compus toxic cu efecte nocive asupra celulelor vii, atunci cnd concentraia lui depete anumite limite de

36

concentraie, care sunt diferite pentru diferite tipuri de celule. Pentru a observa influena compusului RGT i a sulfatului de cupru acetea au fost introdui n cantiti egale n mediul nutritiv odat cu introducerea inoculumului n mediu. Probele de biomas au fost colectate la a doua, a cincea i a asea zi de cultivare. Rezutatele obinute sunt reflectate n Figura. 3.1.
1.4 1.2 Biomasa, g/l 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 2 zi cultivare 5 zi cultivare perioada colectrii biomasei 6 zi cultivare

martor

CuSO4 10 mg

CuSO4 20 mg

RGT 10 mg

RGT 20 mg

Fig. 3.1. Productivitatea spirulinei (g/l) cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n prima zi de cultivare Tabloul datelor nregistrate la cea de a doua zi de cultivare reflect lipsa efectului sulfatului de cupru asupra spirulinei i reducerea productivitii cianobacteriei n prezena compusului coordinativ. Aceste rezultate arat, c la inceputul cultivrii, adic n perioada de adaptare i nceputul fazei de cretere exponenial a culturii compusul coordinativ se dovedete a fi mai toxic pentru spirulin dect sulfatul de cupru. Acest lucru poate fi explicat prin biodisponibilitatea sporit a compuilor coordinativi pentru celulele vii, fa de rurile minerale. Presupunem, c efectul produs se datoreaz faptului c n celuke nimerte o cantitate mai mare de compus coordinativ, comparativ cu compusul mineral. Colectarea biomasei la cea de a cincea zi de cultivare arat, c reaciile de rspuns ale spirulinei difer de cele, care au fost observate la cea de-a doua zi de cultivare. Concentraiile de 10 mg/l ale ambilor compui au avut efecte similate asupra productivitii la spirulin, n ambele cazuri cantitatea de biomas n prezena compuilor cu cupru a sczut cu 33% fa de proba 37

martor. Concentraiile de 20 mg/l ale compuilor au avut efecte diferite, ambele inhibnd productivitatea, dar compusul coordinativ se pare a fi mai toxic comparativ cu sarea mineral. Biomasa obinut la cea de a cincea zi de cultivare n prezena a 20 mg/l sulfat de cupru constituie doar 56% din cantitatea de biomas n proba martor, iar n prezena a 20 mg/l de compus coordinativ - doar 44% fa de martor. Deci, putem face concluzia, c la sfritul fazei creterii exponeniale efectele negative ale concentraiilor mici de sulfat de cupru i de compus coordinativ se egaleaz, iar concentraiile mari acioneaz n mod diferit. Colectarea biomasei la cea de a asea zi de cultivare ne-a permis s constatm urmtoarele: efectul negativ al sulfatului de cupru de ambele concentraii s-a diminuat simitor i s-a egalat. Biomasa de spirulin obinut la cultivarea n prezena sulfatului de cupru constituie aproximativ 83% din cantitatea de biomas obinut n mod standard. Se mbuntete situaia i n cazul concentraiei de 10 mg/l de RGT. n acest caz biomasa obinut constituie 67% din biomasa probei martor. La ziua a cincea acest indice a constituit 56%. Concentraia de 20 mg/l a compusului RGT a stopat complet procesul de acumulare a biomasei dup cea de-a cincea zi de cultivare. Aceasta vorbete despre intrarea culturii de spirulin n faza staionar, ceea ce este prematur, i indic asupra unei toxiciti sporite i a unei stri de stres instalate n celulele de spirulin. Prin urmare, concentraia crescut a sulfatului de cupru se prezint ca un inhibitor al proceselor de reproducere, dar efectele negative au un caracter reversibil, urmat de redresarea situaiei, productivitatea final fiind identic pentru ambele concentraii de CuSO4. Compusul coordinativ RGT a fost mai agresiv, gradul lui de toxicitate s-a manifestat din primele zile de cultivare a spirulinei pe mediul nutritiv suplimentat cu compusul dat. Astfel, pentru concentraia de 10 mg/l RGT, n a doua zi de cultivare, productivitatea spirulinei este cu 50% mai redus fa de proba martor. n ziua a 5-a de cultivare productivitatea cianobacteriei crete, atingnd valorile probei suplimentate cu CuSO4, dar care este cu 44% mai mic dect varianta martor. n a 6-a zi de cultivare productivitatea este de asemenea cu 33% mai redus n comparaie cu martorul. Concentraia de 20 mg/l RGT n ziua a doua de cultivare a reinut creterea spirulinei n mod identic ca i concentraia de 10 mg a compusului, iar n ziua a 5-a efectele toxicitii compusului devin drastice. Dup cte se vede, cultura de spirulin nu reuete s cupeze efectele negative ale stresului provocat de prezena compusului. n unele publicaii se indic asupra posibilitii de reducere a gradului de toxicitate a compuilor fa de culturile de cianobacterii prin introducerea lor nu la iniierea procesului de cultivare, ci la ziua a treia, atunci cnd cultura intr pe platoul fazei de cretere exponenial.

38

n a doua parte a cercetrii a fost montat o experien, n care compusul coordinativ i compusul mineral a fost introdus la ziua a treia de cultivare. Rezultatele experienei sunt prezentate n Figura 3.2.

1,4 1,2

Biomasa, g/l

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

4 zi cultivare

6 zi cultivare

perioada colectrii biom asei m artor CuSO4 10 m g CuSO4 20 m g RGT 10 m g RGT 20 m g

Fig. 3.2. Productivitatea spirulinei (g/l) cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n ziua a 3-a de cultivare. Din rezultatele experienei se vede c sulfatul de cupru suplimentat la mediul de nutritiv n concentraia de 10 mg/l n a treia zi de cultivare nu a indus careva schimbri n procesul de acumulare de biomas. n ziua a 4-a i a 6-a zi, productivitatea spirulinei este identic cu cea obinut n probele martor. Concentraia de 20 mg/l a sulfatului de cupru a ncetinit procesul de acumulare a biomasei, imediat la suplimentarea lui la mediul nutritiv, productivitatea constituind 0,6 g/l. Spre sfritul ciclului vital, productivitatea a fost identic probelor martor i din exemplele cu sulfatul de cupru luat n concentraia de 10 mg. Compusul coordinativ al cuprului chiar i la suplimentarea lui ntrziat la mediul de cultivare s-a manifestat ca un compus toxic care reduce productivitatea spirulinei cu 44-66% n a patra zi de cultivare i cu 50-67% n a asea zi a ciclului vital.

39

3.2. Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis la aciunea unor compui chimici ai Cu(II) Din biomasa obinut au fost preparate extracte hidroetanolice cu utilizarea alcoolului etilic de 10 i 55%. n extractele obinute a fost determinat activitatea antioxidant cu utilizarea radicalului non-biologic DPPH. Rezultatele testului antioxidativ a extractelor etanolice, obinute n experiena cu suplimentarea compuilor cuprului n prima zi de cultivare, sunt prezentate n Figura 3.3 i Figura 3.4.

50 DPPH, % inhibiie 40 30 20 10 0 2 zi cultivare 5 zi cultivare perioada colect rii biomasei 6 zi cultivare

martor

CuSO4 10 mg

CuSO4 20 mg

RGT 10 mg

RGT 20 mg

Fig. 3.3. Activitatea antioxidant (DPPH, % inhibiie) a extractelor hidroetanolice de 10% din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n prima zi de cultivare. Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice de 10 % din proba martor demonstreaz scderea activitii odat cu avansarea culturii n ciclul vital. Aceast scdere este de aproximativ 20,4% i este cauzat de modificrile naturale, care se petrec cu componentele biomasei de spirulin pe parcursul dezvoltrii culturii statice. Extractele din biomasa probelor cu adaos de CuSO4 manifest o activitate antioxidant, care la ziua a doua de cultivare este de 2,3 ori mai mic comparativ cu activitatea extractelor din biomasa probei martor. Spre ziua a asea de cultivare diferena dintre activitatea extractelor din biomasa crescut pe mediul cu sulfat de cupru i cea din proba martor devine mai puin pronunat, dar totui destul de important - 1,5.

40

Extractele din biomasa crescut pe mediul cu adaos de compus coordinativ la ziua a 2-a de cultivare au o activitate antioxidant mai mic dect cea a extractelor din biomasa martor pentru doza mai mic cu 25%, iar pentru cea mai mare cu 15,7%. Spre finele ciclului vital activitatea extractelor din biomasa obinut pe mediul cu compus coordinativ devine cu 27 % mai mare dect activitatea extractelor obinute pe mediul martor.
50 DPPH, % inhibiie 40 30 20 10 0 2 zi cultivare 5 zi cultivare perioada colectrii biomasei 6 zi cultivare

martor

CuSO4 10 mg

CuSO4 20 mg

RGT 10 mg

RGT 20 mg

Fig. 3. 4. Activitatea antioxidant (DPPH, % inhibiie) a extractelor hidroetanolice de 55% din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n prima zi de cultivare. Pentru extractele alcoolice din biomasa probei martor de spirulin este caracteristic reducerea activitii antioxidante odat cu maturizarea culturii. Astfel, activitatea antioxidant care constituie 33% inhibiie n ziua a doua de cretere se reduce la 26% inhibiie spre sfritul ciclului de dezvoltare. Acelai procent de inhibiie a manifestat extractul obinut din biomasa colectat la a 5-a zi de cultivare. n probele cu suplimentarea mediului nutritiv cu sulfat de cupru, activitatea antioxidant a extractelor de 55% alcool etilic a manifestat un alt tip de reactivitate. Activitatea antioxidant a extractului din biomasa colectat la nceputul ciclului de dezvoltare este de 28-29% inhibiie, valorile pentru concentraiile de 10 i 20 mg/l compus. Prin urmare, concentraia sulfatului de cupru suplimentat n prima zi de cultivare nu modific activitatea antioxidant a biomasei de spirulin n primele ore ale contactului dintre biomas i compus.

41

Extractele alcoolice obinute din biomasa colectat spre sfritul ciclului de dezvoltare, au indicat o cretere a activitii antioxidante care constituie 37-38,6 % inhibiie DPPH. Prin urmare, sulfatul de cupru s-a manifestat toxic inducnd acumularea substanelor antioxidante. Compusul coodinativ RGT poate fi determinat ca toxic din primele zile ale introducerii lui n mediul de cultivare. Din ziua a doua, activitatea antioxidant a fost determinat prin valorile de 39,6 i 40% inhibiie DPPH. Valori identic de mari ale activitii antioxidante au fost determinate si n extractele etanolice obinute din biomasa colectat n zilele a 5-a (37-42% inhibiie) i a 6-a (38-44% inhibiie) a ciclului vital. Se observa influena concentraiei compusului suplimentat la mediul nutritiv. Pentru concentraia de 20 mg/l activitatea antioxidant determinat spre sfritul ciclului vital este mai mare, valorile fiind de peste 40% inhibiie. Pentru concentraia de 10 mg/l activitatea antioxidant determinat n extractele etanolice prezint valori care se menin la nivelul mai mic de 40% inhibiie. Sulfatul de cupru disociaz n ioni, i n mediul de cultivare al spirulinei este prezent ionul de Cu2+, care s-a dovedit a fi mai puin toxic. Compusul coordinativ RGT conine elementul Cu n sfer, care nu disociaz. Prin urmare, toxic este nu ionul de cupru, iar toxicitatea compusului coordinativ este determinat de structura lui. n continuare a fost determinat activitatea antioxidant a extractelor etanolice de 10 i 55% din biomasa colectat n experiena cu suplimentarea compuilor cu cupru la a treia zi de cultivare. Rezultatele testului antioxidativ sunt prezentate n Figura 3.5 i Figura 3.6.
50 DPPH, %inhibiie 40 30 20 10 0 4 zi cultivare martor CuSO4 10 mg CuSO4 20 mg 6 zi cultivare RGT 10 mg RGT 20 mg

Fig. 3.5. Activitatea antioxidant (DPPH, % inhibiie) a extractelor hidroetanolice de 10% din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n a 3-a zi de cultivare.

42

Ca i n cazul primei experiene, sulfatul de cupru reduce activitatea extractului de 10% , dar spre deosebire de primul caz, la adugarea compusului la ziua a treia de cultivare a spirulinei, efectul de diminuare a activitii antioxidante este mai puin pronunat. Compusul coordinativ RGT, ca i n cazul adugrii lui la nceputul cultivrii, a dus la sporirea activitii antioxidante a extractelor hidroetanolice de 10%. Aceast cretere n cazul concentraiei maximale a compusului coordinativ este de 36,7%. Observm, c comparativ cu prima experien, n experiena cu adugarea compusului de cupru la ziua a treia de cultivare, efecte observate au o intensitate mai mic. Acest lucru vorbete despre aceea, c adugarea compuilor cu potenial toxic nalt la o etap de cultivare mai avansat este mai puin traumatizant pentru spirulin. Sulfatul de cupru a indus o sensibilizare a componentelor antioxidante spre sfritul ciclului de cultivare, activatatea antioxidant a extractelor eatnolice fiind de 30% inhibiie pentru concentraia CuSO4 de 10 mg/l i de 37,8 % inhibiie pentru concentraia CuSO4 de 20 mg/l. Valorile activitii antioxidanet sunt cu 10 uniti mai mari fa de valorile activitii antioxidante a extractelor obinute din biomasa probelor martor. Concentraia de 10 mg/l a sulfatului de cupru s-a dovedit a fi mai puin toxic, activitatea antioxidant a extractului etanolic avnd valori cu 8% mai mici n comparaie cu aplicarea concentraiei de 20 mg CuSO4.

50 DPPH, %inhibiie 40 30 20 10 0 4 zi cultivare 6 zi cultivare

martor

CuSO4 10 mg

CuSO4 20 mg

RGT 10 mg

RGT 20 mg

43

Fig. 3.6. Activitatea antioxidant (DPPH, % inhibiie) a extractelor hidroetanolice de 55% din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului, suplimentai la mediul nutritiv n a 3-a zi de cultivare. Dac comparm rezultatele testului antioxidant cu experiena precedent, cnd compusul a fost suplimentat n primele ore de cultivare, observm reactivitatea identic a spirulinei la introducerea n mediul nutritiv a sulfatului de cupru. Prin urmare perioada introducerii sulfatului de cupru nu este un factor care determin efectul toxic al compusului. Spre sfritul ciclului de cultivare activitatea antioxidant a extractelor etanolice din biomasa de spirulin este identic indiferent de perioada introducerii sulfatului de cupru. Compusul coordinativ al cuprului RGT, n concentraia de 10 mg/l i adugat la mediul de cultivare la a 3-a zi s-a dovedit a fi mai puin toxic n comparaie cu rezultatele obinute n prima experien. Vom meniona c aici s-au manifectat ambii factori: perioada de suplimentare a compusului la mediul nutritiv si concentraia lui. n cazul experienei cu suplimentarea compusului RGT n concentraia de 20 mg/l, valorile activitii antioxidante sunt identice cu cele obinute n experiena suplinentrii compusului n primele ore de cultivare. Valorile activitii antioxidante sunt cu 67-75% mai mari n comparaie cu proba martor. Prin urmare compusul RGT n concentraia de 20 mg/l este toxic, iar gradul de toxicitate nu depinde de perioada introducerii lui la mediu. 3.3. Modificarea componenei biochimice a extractelor hidroetanolice din biomasa de Spirulina platensis obinut la cultivarea pe medii cu compui chimici ai Cu(II) n continuare am efectuat o ncercare de a determina componentele, care determin activitatea antioxidant a acestor extracte. Pornind de la proprietile soluiei extractante, am determinat acele componente biochimice, care pot trece n extract. Astfel, n extractul hidroetanolic de 10% au fost determinate proteinele, ficobilinele, compuii fenolici, iar n extractul de 55% au fost determinai pigmenii carotenoizi, proteinele, compuii fenolici. n Tabelul 3.1 sunt prezentate datele cu referire la coninutul biochimic al extractului hidroetanolic de 10 % obinut din biomasa de spirulin obinut n condiiile experimentale descrise anterior, iar n Tabelul 3.2 cele cu referire la coninutul extractului de 55% Coninutul de proteine n extractele obinute n cazul suplimentrii sulfatului de cupru la prima zi de cultivare scade simitor i acest nivel rmne stabil jos pn la finele experienei. De aici reese, c efectul acestui compus este unul toxic pronunat. Cu toate c nu am efectuat o separare i o purificare a 44

proteinelor care trec n extract, putem presupune c odat cu diminarea proteinelor generale, scade si cantitatea enzimelor antioxidante. n cazul compusului RGT cantitatea proteinelor iniial scade, dup care urmeaz o cretere a nivelului lor pn la nivelul nregistrat n proba martor. Acelai lucru se nregistreaz i la adugarea compuilor la cea de a treia zi de cultivare. Diferena const n aceea, c efectul negativ al sulfatului de cupru asupra coninutului de proteine este mai puin pronunat. Tabelul 3.1. Componena extractelor hidroetanolice de 10% din din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului Varianta experimental Proteine, mg/ml Ficobiline, mg/ml Compui fenolici, echivalent mg/ml acid galic 1.620.04 1.570.09 1.540.13 1.720.08 1.700.12 1.650.10 1.600.07 1.620.02 1.760.02 1.740.10 1.640.06 1.650.06 1.660.12 1.820.03* 1.800.09* 1.650.02 1.600.10 1.610.06 1.760.03 1.770.01 1.620.07 1.640.03 1.630.05 1.840.06* 1.830.04* extract extract Adugarea compusilor la prima zi 2 zi, Martor 4.350.09 0.950.03 2zi, CuSO4, 10 mg/l 2.820.16* 0.440.04* 2 zi, CuSO4, 20 mg/l 2.740.20* 0.370.06* 2 zi, RGT, 10 mg/l 3.510.07* 0.330.03* 2 zi RGT, 20 mg/l 3.630.03* 0.300.10* 5 zi, Martor 4.100.12 1.040.05 5 zi, CuSO4, 10 mg/l 2.900.17* 0.400.04* 5 zi, CuSO4, 20 mg/l 2.910.08* 0.340.02* 5 zi, RGT, 10 mg/l 4.120.22 0.280.11* 5 zi RGT, 20 mg/l 4.30.05 0.270.07* 6 zi, Martor 4.360.13 1.120.04 6 zi, CuSO4, 10 mg/l 3.000.12* 0.360.07* 6 zi, CuSO4, 20 mg/l 2.930.23* 0.320.10* 6 zi, RGT, 10 mg/l 4.340.08 0.270.03* 6 zi RGT, 20 mg/l 4.400.25 0.250.08* Adugarea compusului la ziua a treia 4 zi, Martor 4.140.07 1.020.08 4 zi, CuSO4, 10 mg/l 3.660.07* 0.420.02* 4 zi, CuSO4, 20 mg/l 3.540.18* 0.380.01* 4 zi, RGT, 10 mg/l 4.220.12 0.340.11* 4 zi RGT, 20 mg/l 4.280.32 0.330.02* 6 zi, Martor 4.340.10 1.120.05 6 zi, CuSO4, 10 mg/l 3.760.13* 0.400.12* 6 zi, CuSO4, 20 mg/l 3.810.23* 0.360.03* 6 zi, RGT, 10 mg/l 4.380.26 0.300.05* 6 zi RGT, 20 mg/l 4.450.07 0.290.06* *P<0.05 (la compararea probei respective cu martorul)

Tabelul 3.2. Componena extractelor hidroetanolice de 55% din din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor cuprului Varianta Proteine, mg/ml Carotenoizi, Compui fenolici, echi-

45

extract %, Martor Adugarea compusilor la prima zi 2 zi, Martor 1.740.02 100 2zi, CuSO4, 10 mg/l 1.670.06 103.4 2 zi, CuSO4, 20 mg/l 1.590.09 102.1 2 zi, RGT, 10 mg/l 1.730.07 94.8 2 zi RGT, 20 mg/l 1.650.04 96.7 5 zi, Martor 1.760.05 100 5 zi, CuSO4, 10 mg/l 1.740.07 109.5 5 zi, CuSO4, 20 mg/l 1.780.08 105.3 5 zi, RGT, 10 mg/l 1.750.22 97.8 5 zi RGT, 20 mg/l 1.640.05 98.9 6 zi, Martor 1.700.07 100 6 zi, CuSO4, 10 mg/l 1.690.04 106.2 6 zi, CuSO4, 20 mg/l 1.730.09 102.6 6 zi, RGT, 10 mg/l 1.680.02 100.3 6 zi RGT, 20 mg/l 1.750.05 101.7 Adugarea compusului la ziua a treia 4 zi, Martor 1.760.04 100 4 zi, CuSO4, 10 mg/l 1.660.05 103.4 4 zi, CuSO4, 20 mg/l 1.740.06 101.7 4 zi, RGT, 10 mg/l 1.700.10 99.6 4 zi RGT, 20 mg/l 1.720.02 98.6 6 zi, Martor 1.720.04 100 6 zi, CuSO4, 10 mg/l 1.760.05 106.3 6 zi, CuSO4, 20 mg/l 1.710.07 104.5 6 zi, RGT, 10 mg/l 1.680.06 102.3 6 zi RGT, 20 mg/l 1.750.02 107.2 *P<0.05 (la compararea probei respective cu martorul).

experimental

valent mg/ml acid galic 1.620.04 1.670.05 1.640.10 1.950.05* 2.070.07* 1.640.05 1.600.07 1.820.05* 1.900.08* 2.140.10* 1.590.06 1.860.07* 1.890.10* 2.140.03* 2.220.04* 1.630.05 1.640.07 1.660.06 1.860.03* 2.110.06* 1.630.05 1.840.03* 1.890.05* 2.170.05* 2.280.09*

Cantitatea ficobilinelor n extractele obinute din biomasa de spirulin crescut pe mediile cu adaos de compui ai cuprului, indiferent de varianta de suplimentare, este cu mult mai mic (de 2,0-3,8 ori) fa de cantitatea lor n componena extractelor obinute din biomasa probelor martor. Acest component al biomasei de spirulin este unul din cei mai labili i se modific foarte uor sub influena factorilor externi. Diminuarea ficobilinelor este asociat, de obicei cu scderea intensitii fotosintezei, ceea ce se exprim n diminuarea cantitii de biomas. n cadrul experienelor noastre am observat aceast dependen n cazul compusului RGT. n cazul sulfatului de cupru, mai ales n cazul adugrii lui la ziua a treia de cultivare, cantitatea de biomas acumulat este la nivelul martorului, dar cantitatea de ficobiline n biomas este foarte joas. Cantitatea fenolilor care se extrag cu soluia hidroetanolic de 10%, deci cei care au un caracter preferenial hidrosolubil, n extractele obinute din biomasa probelor experimentale este practic la nivelul martorului, fr devieri eseniale. Unicele variante n care cantitatea fenolilor este

46

statistic veridic mai mare dect cantitatea lor n proba martor sunt cele obinute pentru extractele din biomasa de spirulin la a asea zi de cultivare pentru ambele variante de suplimentare a compuilor. Anume n aceste variante de extracte a fost nregistrat i cea mai nalt activitate antioxidant. Am putea afirma, c cel puin parial, activitatea antioxidant n aceste probe este determinat de componentele fenolice. Deci, pentru extractele hidroetanolice de 10%, reieind din cele studiate de noi exist cel puin dou componente care ar putea asigura nivelul de activitate nregistrat. Unul este componenta fenolic, iar a doua este cea proteic. A doua afirmaie reiese din urmtoarele considerente. Variantele, n care se nregistreaz o activitate antioxidant joas se caracterizeaz prin diminuarea cantitii de proteine n extract, iar cele, n care activitatea antioxidant este la nivelul martorului, ori mai mare ca aceasta. Putem presupune, c n ultimul caz se pstreaz i o activitate normal a enzimelor antioxidante. Extractele hidroetanolice de 55% din biomasa de spirulin se caracterizeaz printr-o uniformitate a nivelului de proteine extrase. n cadrul acestor componente variaii semnificative din punct de vedere statistic nu au fost nregistrate. Acelai lucru putem afirma i despre carotenoizi, care n toate variantele experimentale se gsesc n cantiti tipice pentru martorii respectivi. Cu toate c de obicei, carotenoizii sunt unul din componentele biomasei, care sunt sintezai n exces n cazul unor condiii de stres, n cazul nostru, compuii cuprului, cu toate c se manifest ca susbstane toxice, nu provoac creterea cantitativ a lor n biomas. n extractele hidroetanolice de 55% coninutul fenolilor pu proprieti preferenial liposolubili variaz evident n dependen de compus periada de colectare a biomasei. n cazul sulfatului de cupru cantitatea lor este mai mare ca cantitatea fenolilor n extractul obinut din biomasa probei martor doar la etapele finale de dezvoltare a culturii. Compusul RGT din contra, dup cte se vede intensific procesul de acumulare a compuilor fenolici, care se caracterizeaz prin activitate antioxidant nalt. Acest fapt, posibil este determinat de toxicitatea nalt a acestui compus pentru cultura de spirulin. Noi asociem activitatea nalt a extractelor hidroetanolice obinute din biomasa de spirulin crescut n prezena compuilor cu cupru cu coninuitul nalt al componentelor fenolice cu caracter preferenial liposolubil.

47

CONCLUZII
1.

Compuii Cu(II) n concentraiile luate n studiu se manifest n calitate de substane toxice pentru cultura de Spirulina platensis. Sulfatul de cupru este mai puin toxic fa de compusul coordinativ RGT, ceea se manifest prin lipsa unui efect nociv asupra nivelului productivitii.

2.

48

3.

Aciunea negativ a compuilor cu coninut de cupru este determinat de concentraia compusului i de perioada de ntroducere a a lor n mediul nutritiv pentru cultivarea spirulinei. Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice de 10% din biomasa de spirulin crescut pe medii cu adaos de sulfat de cupru este mai joas dect cea nregistrat n extractele din biomasa probei martor n toate variantele, iar n cazul extractelor hidroetanolice de 55% - este mai mare, dect la martor, ceea ce se nregistreaz la finele perioadei de cultivare a spirulinei.

4.

5.

Activitatea extractelor hidroetanolice de ambele concentraii obinute din biomasa de spirulin crescut pe mediul cu adaos de compus coordinativ RGT este mai nalt ca cea a probelor martor n toate variantele experimentale.

6.

Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice de 10% din biomasa de spirulin crescut n prezena compuilor cu coninut de cupru este, posibil, determinat de componentele fenolice i cele proteice.

7.

Activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice de 55% din biomasa de spirulin crescut pe medii cu adaos de compui ai cuprului este, posibil, determinat de componentele fenolice cu caracter preferenial lipifil.

BIBLIOGRAFIE

1.

Abd El-Baky H. et al. Spirulina species as a sourse of carotenoids and -tocopherol and its anticarcinoma factosr. In: Biotechnology, 2003, vol.2,no. 3.p. 222-240. Alsher R. Biosynthesis andantioxidant function of glutathione in plants. In: Physiologia Plantarum. 2008, vol.77, no.3, p.456-464. Arnao Marino B., Cano A., Acosta M. The hydrophilic and lipophylic contribution to total antioxidant activity. In: Food Chemistry, 2001, v. 73, p. 239-244.

2.
3.

49

4. 5.

Beale , S. Enzymes of chlorophyll biosynthesis. In: Photosynth. Res., 1999, no.60, p.43-73. Bhat V. Madyastha K.M. C-phycocyanin: a potent peroxylradical scavenger in vivo and in vitro. In: Biochemical Research Communications. 200, no.1, p. 20-25. Bau A., Pilaszek T., Grzelak A., Dragan A., Bartosz G. Interaction between antioxidants in assays of total antioxidant capacity. In: Food and Chemical Toxicology, 2008, v. 46, p. 23652368.

6.

7.

Brevet de invenie. 1008 G2, MD C09B67/20. Procedeu de obinere a ficoianinei/ Valeriu Rudic, Valentina Bulimaga (MD). Cererea depus 30.04.1997, BOPI nr.8/1998. Burja A., Banaigs E., Abou-Mansour J.et al. Marine cyanobacteria - a prolific source of natural products. In: Tetrahedron. 2001, no.57, p.93479377. Cepoi L. Particularitile fiziologo biochimice de cultivare a algei roii Porphyridium cruentum CNM-AR-01 surs de substane bioactive. Autoref. tezei dr. n biologie. Chiinu, 1995.21 p.

8.

9.

10. 11.

Ciferri O. Spirulina, the edible microorganism. In: Microbiol. Rev., 1983, 47, p. 551-578; Cojocari A. p. Particularitile fiziologo biochimice i biotehnologice ale tulpinii Nostoc linckia /Roth) Born et Fah CNMN-CB-03. Autoref. tezei dr. n biologie. Chiinu, 2006. 26

12.

Coleman J. Zinc proteins: enzymes, storage proteins, transcription factors, and replication proteins. In: Ann. Rev. Biochem., 1992, no.61, p.897-946. Demmig Adams B, AdamsW. Antioxidants in photobsynthesis and human nutrition. In: Science. 2002, vol.298, no.5601, p.2149-2153. Demmig-Adams B., Adams W. Antioxidants in photobyosintesis and human nutrition. In: Science. 2002, vol.298, no 5601, p.2149-2153. Desai K., Sivakami S. Purification and biochemical characterisation of a super oxide dismutase from the soluble fraction of the cyanobacterium Spirulina platensis. In: World J. Microbiol. Biotechnology.2007, vol.23,no.11,p.1661-1666.

13. 14.
15.

16. 17.
18.

Esco R. et al. Efficacy of orgotein in prevention of late side effects of pelvic irradiation. In: Intrernational journal of radiation, oncology. 2004, vol.60, no.4, p. 1211-1219. Flora S.J. Role of free radicals and antioxidants in health and disease. In: Cell Molecular Biology, 2007, vol.53, no1, p.1-2. Hirata T., Tanaka, M., Ooike M. et al. Antioxidant activities of phycocianobilin prepared from Spirulina platensis. In: Journ. of Applied Phycology, 2000, no.12, p.435-439. Jakubovics N., Jenkinson H. Out of the iron age: new insights into the critical role of manganese homeostasis in bacteria. In: Microbiolgy, 2001, no.147, p.1709-1718. 50

19.

20.

Jiunn-Tzong Wu, Ming-T. Hsieh, Lai-Chu Kow. Role of proline accumulation in response to toxic copper in Chlorella sp. (Chlorophyceae) cells. In: Journal of Phycology. 1998. V. 34 p. 113-117.

21.
22. 23.

Junqueira V. et al. Aging and oxidative stress. In: Molecular aspects of medicine. 2004, vol.25,no.1-2,p.5-6. Kato, T. Blue pigment from Spirulina. In: New Food Industry, 1994, vol.29, p.17-21. Kirk, E., Behrens P. Commercial developments in microalgal biotechnology. In: J. Phycol., 1999, no.35, p.215226. Knauert S., Knauert K. The role of reactive oxygen species in copper toxicity to two freshwater green algae. In:. J. Phycol. 2008, Vol.44, Nr. 2, p.311-319. Lanfer-Marquez U., Barros R., Sinnecker P. Antioxidant activity of chlorophylls and their derivatives. In: Food Research International, 2005, v. 38, p. 885891. Lawrence M. Oxyradicals and DNA damage. In: Carcinogenesis. 2000,vol.21, no.3, p.361370. Mruteri . D. Noiuni fundamentale de biostatistic: note de curs / Marius Mruteri Trgu-Mure: University Press, 2006. 220p. McCord J. The evolution of free radicals and oxidative stress. In: Am. J. Med. 2000, vol 108, no. 8, p.652-659. Michel D. Antioxidant terapy partially blocks immune induced lung fibrosis. In: Inflammation ournal. 2005,vol.19,no.2, p.207-219. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. In: Sci. Technol., 2004, vol.2, p. 211-219. Murley J. et al. Manganese super oxide dismutase (SOD 2) mediated delayed radioprotection induced by the free thiol from of amifostine and tumor necrosis factor . In: Radioprotection research. 2007, vol.16t7, no. 4, p.465-474.

24.

25.

26.

27. 28.
29.

30.

31.

32.
33.

Packer L.et al. Molecular aspects of alfa tocotrienol antioxidant action and cell signaling. In: J. Nutr.2001, vol.131, no. 2, p. 369-373. Papenbrock J., Mock H., Tanaka R. et al. Role of magnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway. In: Plant Physiol., 2000, no.122, p.1161-1169. Papenbrock, J., Grimm, B. Regulatory network of tetrapyrrole biosynthesis studies of intracellular signalling involved in metabolic and developmental control of plastids. In: Planta, 2001, no. 213, p. 667-681.

34.

51

35.

Patel A., Misra S., Pawar R., Ghosh P. K. Purification and characterization of Cphycocyanin from cyanobacterial sp. of marine and fresh water habitat. In: Protein Expr. Purif., 2005, no. 40, p.248255.

36.

Patra J. et al. Evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of seweed extract. In: Turk J. Biol.2007, vol.32, no 2, p.119-125. Plaza M., Cifuentes A., Ibez E. In the search of new functional food ingredients from algae. In: Trends in Food Science & Technology, 2008, v. 19, p. 31-39. Pulz O., Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae. In: Appl

37.

38.

Microbiol Biotechnol., 2004, no. 65, p. 635648.


39.

Ratkevicius N., Correa J. A., Moenne A. Copper accumulation, synthesis of ascorbate and activation of ascorbate peroxidase in Enteromorpha compressa from heavy metal-enriched environments in northern Chile. In: Limnol. Oceanogr., 2003, vol..48, no.1, p. 179188.

40.

Regelsberger G et al. The iron super oxid dismutase from the filamentous cyanobacterium Nostoc PCC 7120. In: J. of Biol Chem., 2004, no.43, p.44384-44393. Rodriguez-Garcia I., Guil-Guerrero J.L. Evaluation of the antioxidant activity of three microalgal species for use as dietary supplements and in the preservation of foods. In: Food Chemistry, 2008, nr. 108, p.10231026.

41.

42.

Romay C., et al. C- Phycocianin: a biliprotein with antioxidamnt, anti-inflamatory ande neuroprotective effects. In: Proteine and peptide science. 2003, vol.4, no.3, p.207-216. Rudi L. Sinteza orientat a acizilor gari de ctre cianobacteria Spirulina platensis (nordst) Geitl CNM-CB-01 i microalga Porphyridium cruentum (Nag) CNM-AV-01 i procedee de obinere a preparatelor lipidice. Autoref. tezei dr. n biologie. Chiinu, 2006, 24 p.

43.

44.

Rudi L. Spirulina platensis productor de acizi gari eseniali. n: Anale t. ale USM, Seria: tiine chimico-biologice, 2003, p.181-182. Rudi L., Cepoi L., Cojocari A., Miscu V. Sisteme naturale de protecie contra radicalilor liberi. n: Anale tiinifice ale USM, Seria: tiine chimico-biologice. Chiinu, 2004, p. 113-116.

45.

46. 47.
48.

Rudic V. i alii. Ficobiotehnologie cercetri fundamentale i realizri practice. Chiinu: Elena V.I., 2007, 364p. Rudic V. i alii. Metode de investigare n ficobiotehnologie. Elaborare metodic. Centrul editorial USM, Chiinu, 2002. 60p. Rudic V., Denchikova L., Scutaru Iu. V. Pigments of photosyntetic apparatus in Spirulina platensis (Nordst.)Geitl. In: International Journal on Algae, 2000, vol. 2, no.2, p.91-95.

52

49.

Rudic V., Rudi L., Chiriac, T., Cepoi, L., Cojocari, A., Miscu V., Bulimaga V. Polizaharidele sulfatate de origine algal surs de noi remedii cu proprieti terapeutice polivalente. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii. 2009, nr. 2 (303), p.102-107.

50.

Sidler W. Phycobilisomes and phycobiliprotein structures. In: Bryant, D. R. (Ed.) The Molecular Biology of Cyanobacteria.Kluwer, Dordrecht, 1994, p. 139216. Singh S., Kate B., Banerjee U. Bioactive Compounds from Cyanobacteria and Microalgae. In: Critical Reviews in Biotechnology, 2005, vol. 25, no. 3, p.73-95. Stowik J., Pawlaczyk-Szpilowa M. Interaction between Scenedesmus obliquus and the Heavy Metals Copper and Lead. In: Acta hydrochimica et hydrobiologica, 2004, vol.7, no.5 , p.503509.

51.

52.

53.

Swingley, W., Marriott, M., Olson, T., Blankenship, R. Effect of Iron on Growth and Ultrastructure of Acaryochloris marina. In: Appl. Envir. Micr., 2005, vol. 71, no.12, p. 86068610.

54.

Tandeau de Marsac, N. Phycobiliproteins and phycobilisomes: the early observations. In: Photosynthesis Research, 2003, no.76, p.197-205. Tannin-Spitz T., Bergman M., van-Moppes D., Grossman S. Antioxidant activity of polysaccharide of the red microalga Porphyridium Sp. In: Journal of Applied Phycology, 2005, vol. 17, p. 215-222.

55.

56. Telford

G., Moss M, Morseman J., Allnutt F. Cyanobacterial stabilized phycobilisomes as

fluorochromes for extracellular antigen detection by flow cytometry. In: Journal of Immunological Methods, 2001, vol. 254, no. 1-2 , p. 13-30.
57. Tokus

Oglu O. and Unal M.K. Biomass Nutrient Profiles of ThreeMicroalgae: Spirulina

platensis, Chlorella vulgaris, and Isochrisis galbana. In: Journal of Food Science, vol. 68, nr. 4, 2003, p.1144-1148.
58. Volk

R., Furkert F. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites

produced and excreted by cyanobacteria durng growth. In: Microbiological Research, 2006, no.161, p.180-186. 59. Wolf F.L. The role and evolution SOD in algae. New Jersey, 2006, 132 p.
60. Yocum

C., Pecoraro, V. Recent advances in the understanding of the biological chemistry . . :

of manganese. In: Curr. Opin. Chem. Biol., 1999, no.3, p.182-187.


61.

, 1996, 8, . 32-40. 53