Sunteți pe pagina 1din 59

Disciplina: Microbiologie Specializarea: Medicina generala LP

Schema diagnosticului bacteriologic, virusologic, parazitologic

Nr.crt. METODE DIRECTE Recoltarea produsului patologic Examenul direct al produsului patologic

BACTERIOLOGIE

VIRUSOLOGIE

PARAZITOLOGIE

Diferita in functie de pp recoltat

Diferita in functie de pp recoltat

Diferita in functie de pp recoltat

1. examen macroscopic 2. examen microscopic microscopie optic o preparat nativ o coloraie negativ o coloraie simpl o coloraii compuse

1. examen macroscopic-nu 2. examen microscopic o evidenierea incluziilor virale microscopie optic o microscopie electronic

Examen coproparazitologic: 1. examen macroscopic 2. examen microscopic o metode directe preparat nativ, n ser fiziologic preparat nativ n soluie lugol frotiu colorat o metode de examinare n strat gros o metode de concentrare o metode larvoscopice o amprenta anal 3. detectarea ADN-ului - reacii de hibridizare, amplificare genic

3. reacii antigen-anticorp 3. evidenierea antigenelor bacteriene prin metode serologice (evidenierea antigenului) 4. detectarea ADN-ului microbian (reacii de hibridizare, amplificare genic PCR) 4. detectarea ADN-ului - reacii de hibridizare, amplificare genic (PCR)

Disciplina: Microbiologie Specializarea: Medicina generala LP 3


(PCR) Cultivarea paraziilor nsmnarea se face pentru paraziii unicelulari pe medii nclzite la 37C, 1sau mai multe zile animale de laborator

Cultivare

Izolarea germenului n cultur pur nsmnarea si cultivarea pe medii de cultur inoculare la animale de laborator Identificarea germenului izolat din cultur pur 1. cercetarea caracterelor de cultur si morfotinctoriale 2.cercetarea caracterelor biochimice si de metabolism

Cultivarea virusurilor

culturi celulare, linii celulare animale de laborator oul de gin embrionat

Identificare

Identificarea virusului izolat 1.prin examen microscopic

2. modificrile caracteristice aprute pe culturile celulare, OGE animale de experien 3. reacii antigen-anticorp 1.reacii antigen-anticorp

3.determinarea structurii antigenice prin: reacii de aglutinare reacii de precipitare reacii de umflare a capsulei 4. tehnici de detectare a ADN microbian

4. detectare a ADNului -reacii de hibridizare, amplificare genic (PCR)

2. tehnici de detectare a ADN microbian

5. Determinarea patogenitii germenului izolat prin: o teste in vitro

Disciplina: Microbiologie Specializarea: Medicina generala LP


o teste in vivo (boala experimental) DA

Antibiograma

METODE INDIRECTE
6
1. detectarea anticorpilor din serul bolnavilor (anticorpii se urmresc n dinamic) 1. detectarea anticorpilor din serul bolnavilor o Seroconversia: cresterea titrului de anticorpi n probele de ser recoltate la interval de 10-14 zile o (demonstrarea unei infecii recente, actuale 1. Detectarea anticorpilor din serul bolnavilor o anticorpii se urmresc n dinamic reacii biologice cutanate de diagnostic (IDR) - rar

Diagnosticul de laborator al infeciilor cauzate de genul: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus


Caracteristica general a grupului cocilor piogeni Familia Staphylococcaceae Genuri- Staphylococcus; - Gemella; - Macrococcus; - Salinicoccus; Familia Streptococcaceae: Genuri: - Streptococcus; - Lactococcus; Familia Neisseriaceae: Genul: Neisseria . Caracter comun - capacitatea de a condiiona procese supurative-distructive. Morfologic reprezint coci (sferici, lanceolai, riniformi), imobili, nesporogeni, unele specii formeaz capsule. n funcie de caracterele tinctoriale se disting: 1. Coci gram pozitivi (Staphylococcaceae, Streptococcaceae) 2. Coci gram negativi (Neisseriaceae) Cocii piogeni se deosebesc prin: Caractere de cultur: exigene nutritive, tipul de respiraie; Infecii nespecifice; Infecii specifice (gonoreea, scarlatina). Familia Staphylococcaceae Genul Staphylococcus Se disting 2 grupuri (varieti): 1. stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP - foarte viruleni (S. aureus, S. intermedius); 2. stafilococi coagulazo-negativi - SCN - potenial-patogeni (aproximativ 30 specii: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis). Habitat: 20-70% din populaie sunt purttori: S. aureus - cavitatea nazal, intestine; S. epidermidis tegument; S. saprophyticus - mucoasa uro-genital, tegument; Staphylococcus aureus Caractere morfobiologice: Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, n frotiu se aranjeaz n grmezi neregulate (ciorchine) n perechi sau izolat. Sunt imobili, nesporogeni, necapsulai (uneori microcapsule)

Caractere de cultur: facultativ anaerobi, nepretenioi la cultivare, cresc pe medii uzuale, pH-7,07,5. Cultura apare peste 24 h de incubare la 37C. Medii selective cu caracter diferenial-diagnostic: - geloz salin (3 % NaCl) cu glbenu de ou (GGO); - mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol); - geloz - snge . Colonii S, 2-3 mm, opace, bombate, pigmentate (galben-auriu, galben-citric, alb), pe geloz - snge cauzeaz hemoliz. Pe GGO coloniile sunt nconjurate cu un halou opac (aciunea lecitinazei). Pe mediul Chapman coloniile sunt nconjurate de un halou galben (fermentarea manitolului). Caractere biochimice: catalazo - pozitivi, fermenteaz glucoza i manitolul. Factori de patogenitate I. Factori structurali: - peptidoglicanul (induce secreia citokinelor de ctre celulele limfocitare, responsabile de starea de oc); - acizii lipoteichoici (induc o stare de hipersensibilitate tardiv); - proteina A (asigur fixarea Fc al IgG, mpiedic opsonizarea i fagocitoza); - microcapsula, rol antifagocitar; - adezine, proteine care asigur fixarea S. aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei, ulterior adeziunea la esuturi: a. proteine fixatoare de fibronectin i laminin. Fibronectina este prezent pe suprafee epiteliale i endoteliale, precum i n cheaguri sanguine. b. Clumping factor, proteina fixatoare de fibrinogen. Asigur aderarea la cheaguri i esuturi lezate, protejeaz stafilococii de fagocitoz. c. proteina fixatoare de colagen. Tulpinile ce posed astfel de adezine cauzeaz osteomielite i artrite septice. II. Toxine: - -toxina (alfa-hemolizina). Deterioreaz membranele celulelor gazdei (trombocite, monocite, hematii) prin integrare i formarea porilor; - -toxina (sfingomielinaza). Prezent la tulpinile izolate de la bovine cu mastit. - i -toxine. Efect leuco - i hemolitic; - leucocidina, efect litic fa de leucocite i macrofage, factor important n procese dermonecrotice;

- exfoliatine (epidermolizine) A i B. Manifest tropism cutanat. Mecanism: se fixeaz de unele proteine cutanate (profilagrin i filagrin), inducnd desprinderea intra-epidermic dintre stratum granulosum i stratum spinosum, cu formarea leziunilor buloase (pemphigus neonatorum, impetigo bulos, dermatit exfoliant/sindromul pielii oprite). III. Coagulaze: - coagulaza liber - protein extracelular care se leag de protrombina gazdei cu formarea unui complex. Astfel activat, trombina determin conversia fibrinogenului n fibrin i coagularea plasmei. Reprezint cauza tromboflebitelor septice i protejeaz cocii de fagocitoz; - coagulaza legat (Clumping factor) este un determinant superficial al S. aureus fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoac fenomenul de aglutinare a stafilococilor n prezena fibrinogenului. IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) - activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni). Complexul stafilokinaz-plasminogen manifest activitate proteolitic, cauznd dizolvarea trombilor (responsabil de localizri septice secundare). V. Enzime de patogenitate: - hialuronidaza faciliteaz diseminarea bacteriilor - alte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze. Rol n diseminarea infeciei i producerea leziunilor. Se disting multiple serotipuri de S. aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea n lizotipuri (fago-variante). Epidemiologia infeciilor stafilococice Sursa de infecie: - omul bolnav sau purttori sntoi de germeni. Rareori - bovinele bolnave de mastit; - contact direct sau diseminare manuportat; - contact indirect (alimente, praf, mbrcminte). Factori favorizani: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plgi, Formele clinice ale infeciilor cu S. aureus: - infecii cutanate i subcutanate: foliculite, furuncule, crbuncule, abcese, hidrosadenite, mastit, panariiu, infecie de plag (frecvent de origine nosocomial); - exfoliatina determin epidermoliza buloas (dermatita exfoliativ, sindromul pielii oprite, sindromul Lyel) la copii, pemphigus neonatorum la nou-nscui (boala Ritter) i impetigo bulos la mature; - infecii ale mucoaselor: mastoidite, sinuzite, otite, angine; - infecii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonit, meningit; - infecii osoase: osteomielit, spondilodiscit, infecie de protez; - infecii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite. S. aureus poate coloniza corpuri strine (catetere, proteze, etc). Dup implantare ele sunt acoperite cu proteine matriciale ale organismului (fibronectin, fibrinogen, laminin). Stafilococii prin adezinele sale se leag specific de aceste proteine matriciale, se

multiplic i secret exopolizaharide, constituind un biofilm. El protejeaz bacteriile de AB, anticorpi, celule imunitare i constituie un focar de diseminare a infeciei. Septicemii i endocardite. Cauzate i ntreinute de un focar infecios primar (infecie cutanat, pneumonie) complicat de tromboflebit. n mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace). Risc major de metastaze septice (endocard, oase, articulaii) Sindromul ocului toxic stafilococic: febr, hipotensiune arterial, erupie scarlatiniform n special pe palme i plante, urmat de descuamare, stare de oc, leziuni viscerale (cerebrale, renale, hepatice, musculare). Mortalitate 3-5%. Descris n 1978 n SUA la femei care utilizau tampoane periodice i sufereau de vaginit cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice. Intoxicaii alimentare (doza toxic - 1g la 100 g aliment). Incubaie scurt (1-6 ore). Vome, diaree, deshidratare, absena febrei Enterita fulminant - gravitate extrem i mortalitate nalt. Consecina unei antibioterapii, urmare a multiplicrii tulpinii de stafilococ productor de enterotoxin n intestin.

Infecii cauzate de SCN S. epidermidis produce un polizaharid de adeziune (glicocalix), care-i permite fixarea pe implante din polimeri sintetici, metalici, din ceramic (formarea unui biofilm). S. epidermidis determin infecii asociate cu un corp strin (proteze, catetere, sonde de intubare, stimulatori cardiaci) frecvent de origine nosocomial (endocardite, endoftalmii, peritonite la pacieni cu dializ peritoneal, bacteriemii, infecie de plag). S. saprophyticus este responsabil de 10-20% din infeciile acute ale tractului urinar, n special cistit la femei tinere. La brbai rareori - uretrit. S. lugdunensis - infecii de plag, endocardite. Imunitatea antistafilococic este mixt: celular i umoral. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Staphylococcus Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, etapele fiind urmtoarele. Recoltarea i transportul produsului patologic: - se face ct mai repede, la debutul bolii, nainte ca pacientului s primeasc antibiotice/chimioterapice, corect, asepsie; - se recolteaz: secreii purulente (n abcese, celulite, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (prin puncie sinusal, articular, pleural); exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, lichid de vrstur, materii fecale. Diagnostic direct: Examinarea microscopic a p.p. (Gram, RIF) cu realizarea a minim 2 frotiuri pe care le colorm cu A.M. i Gram: - se examineaz la microscop i se noteaz prezena celulelor (unele fiind modificate), prezena celulelor inflamatorii (leucocite) i prezena cocilor gram-pozitivi,

cu diametrul de 0,5-1,5 , dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate, intra sau extraleucocitar. Cultivarea pe medii de cultur a p.p. se face pentru a obine colonii izolate (cultur pur), necesar n etapele urmtoare. Se folosesc medii de cultur obinuite. Coloniile sunt de tip S, de 1-3 mm, pigmentate (auriu). Stafilococii se pot multiplica pe medii hiper clorurate, tolernd o concentraie de NaCl (mediul Chapman, pentru p.p. contaminate). Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza: caracterelor morfo-tinctoriale: coci gram-pozitivi, 0,5-1,5 ., dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate; caracterelor de cultur: colonii de tip Sv pigmentate auriu; caracterelor biochimice: fermenteaz zaharuri cu producere de acid (S. aureus este manito-pozitiv); sunt catalazo - pozitivi; caracterelor antigenice; caracterelor de patogenitate: se recomand ndeosebi efectuarea testul coagulazei; sensibilitii la bacteriofagi (n centrele de referin). altor caractere (n centre de referin: studiul acizilor grai celulari, hibridarea molecular, ribotipie, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea prin biologie molecular a rezistenei la antibiotice etc.). Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Diagnostic indirect (serologic) Se examineaz seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru> 2 UI/ml) - n caz de infecii profunde sau cronice sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) - n caz de endocardite sau focare inaccesibile. Familia Streptococcaceae: Genuri: - Streptococcus: fragili i exigeni la cultivare; - Lactococcus: anterior streptococi din grupul N. Genul Streptococcus Reunete specii facultativ anaerobe/anaerobe - aerotolerante caracterizate prin morfologie tipic (coci Gram+ n lanuri, imobili, nesporogeni, capsulai), metabolism fermentativ i lipsa catalazei.

Clasificarea streptococilor: 1. Dup aspectul hemolizei pe geloz - snge: - streptococi alfa-hemolitici (hemoliz incomplet, zon verzuie n jurul coloniilor); - streptococi beta-hemolitici (hemoliz complet, zon clar n jurul coloniilor); - streptococi nehemolitici (gamma-hemoliz): 2. Clasificarea imunologic Lancefield: Dup antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A - H, K - W). Streptococii care nu posed acest Ag nu se ncadreaz n clasificarea Lancefield (S. pneumoniae). Ei se identific dup caractere de cultur i biochimice. 3. Dup habitat i patogenitate: - streptococi piogeni, viruleni, beta-hemolitici (aparin grupurilor A, B, C, G); - streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili dup Lancefield; - streptococi fecali, specii comensale sau condiionat patogene ale tractului digestiv uman i animal; - streptococi lactici, reprezint flora laptelui i produselor lactate: Diferenierea streptococilor patogeni de cei saprofii se efectueaz n baza criteriilor Sherman: - creterea n BP la 10 i 45C; - creterea n bulion cu 6,5% NaCl; - creterea n mediu cu pH 9,6; - hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bil; - liza culturii n bulion biliat; - sensibilitatea la bacitracin i optochin; - hidroliza hipuratului de sodiu. Streptococcus pyogenes (gr. A) Bacterie strict uman, posibil portaj oro- i nasofaringean (20%). Caractere morfologice: lanuri scurte sau perechi de coci sferici Gram+, imobili, capsulai, nesporogeni. Caractere de cultur: facultativ-anaerobi, cultiv pe medii elective. Pe geloz - snge, dup 18-24 ore incubare la 37 C - colonii S mici (0,5 - 1mm), bombate, transparente sau translucide, cu zon de -hemoliz. n bulion glucozat, bullion - ser formeaz depozit la fundul i pe pereii tubului. S. pyogenes este sensibil la bacitracin. Structura antigenic a S.pyogenes (Lancefield-Griffith): - polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (dup Lancefield). Poate fi identificat n RP, latexaglutinare, co-aglutinare; - proteinele de suprafa: M (fimbriale), R i T (uneori asociate cu acizii lipoteicoici), care permit diferenierea S.pyogenes n 90 serotipuri (dup Griffith). Proteina M manifest reactivitate imunologic ncruciat (mimicrie antigenic) cu constitueni normali ai organismului (miozin, sarcolem, sinoviale), determinnd

procese imunopatologice (manifestri post-streptococice). Ag proteice de tip se identific n RP (Ag M) i RA (Ag T); n MCP a S. pyogenes exist Ag comun cu membrana bazal a glomerulilor renali. Factori de patogenitate 1.Factori de structur - capsula din acid hialuronic. Efect antifagocitar; - proteina M, adeziune, antifagocitar; - acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale; - proteina F, receptor de fibronectin: 2. Toxine: - streptolizinele O (oxigen-labil) i S (oxigen-stabil). Sunt toxine citolitice. SLO manifest efect cardiotoxic, hemolitic. Inhib chimiotaxisul PMN i reduce activitatea celulelor imunocompetente. Induce formarea Ac neutralizani - antistreptolizine O (ASLO). SLS nu este imunogen. Manifest activitate citolitic i leucotoxic; - toxinele eritrogene (pirogene) A, B i C sunt codificate de profagi. Responsabile de scarlatin. Au activitate de superantigen, producnd inflamaie asociat cu stare de oc. 3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza, streptokinaza (fibrinolizina). Faciliteaz diseminarea rapid n esuturi. Epidemiologia infeciilor provocate de S. pyogenes Sursa de infecie: bolnavii i purttorii sntoi (faringe i amigdale, mai rar intestin, tegument, vagin). Mecanismele i cile de transmitere: - aerogen (picturi Pflugge); - contact direct (leziuni cutanate): Patogeneza i formele clinice ale infeciilor provocate de S. pyogenes: - infecii ale mucoaselor; - sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite; - infecii cutanate i subcutanate: erizipel (leziune cutanat eritematoas, edem, febr), impetigo (leziuni cutanate superficiale: papul-pustul-crust), celulit, fasciit necrozant (leziuni necrotice subcutanate, durere, eritem, gangren, febr, oc, mortalitate 30% - 48 h), mionecroz (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecii ale plgilor i arsurilor; - scarlatin (angin streptococic nsoit de erupie cutanat i descuamare n convalescen, enantem, febr, adenopatie); - sindromul ocului toxic streptococic, determinat de tulpini productoare de toxin eritrogen (febr, hipotensiune, erupie generalizat, descuamare n convalescen, afectarea organelor). Letalitate 30%; - septicemii ; - alte infecii: endometrite, pneumonii; - infecii post-streptococice;

- RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vrst colar. Apare dup infecii faringiene repetate i este determinat de aciunea direct a streptolizinei, depozite de complexe imune (RHS III), precum i prin interaciunea autoAc i al Ac anti - streptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice i sinoviale (RHS II); - glomerulonefrita acut (GNA). Maladie a copilului de vrst precolar. Survine dup 10-20 zile de la o infecie cutanat, mai rar faringean. Se caracterizeaz prin perturbarea funciei renale, edem i hipertensiune arterial; - patogenie: efect toxic direct, reacii autoimune, bazate pe asemnarea unor Ag streptococice din MCP i membrana bazal glomerular (RHS II i III), persistena formelor L; - coreea (infecie a SNC prin RHS II). Imunitatea antistreptococic este specific de tip, asigurat de Ac anti-proteina M. Ac anti - eritrotoxin protejeaz de eritemul scarlatinos. Streptococcus agalactiae (gr. B): Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional gzduit de om n rinofaringe, vagin i intestin. Rol n patologie: - la gravide: infecie urogenital, infecie de plag, amniotite, endometrite, avort sau natere prematur; - la nou-nscut: infecie precoce (septicemie, pneumopatie n primele 10 zile de via) sau tardiv (meningit); - la adult: infecie de plag, osteo-artrite, infecii urogenitale, septicemii, endocardite, meningite. Streptococi din grupul C (S. equisimilis, S. equi) i din grupul G: Beta-hemolitici cu rezervor animal i uman (tegument, mucoase). Responsabili de infecii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infecii osteo articulare, meningite, pneumopatii, endocardite. Rareori urmate de GNA. Excepional pot cauza scarlatin. Streptococii din grupul D: S. bovis, S. equinus Fac parte din flora comensal a tubului digestiv al omului i animalelor. Rol n patologia uman: endocardite, septicemii neonatale, cholecistite, peritonite, infecii urinare, meningite, osteomielite vertebrale, artrite, abces cerebral. Streptococii negrupabili (lipsii de antigene polizaharidice de perete): S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. sanguis Prezeni n cavitatea bucal, joac rol n geneza cariei dentare, n infecii materno-fetale, bacteriemii i endocardite. Streptococcus pneumoniae: - habitat natural: mucoasa tractului respirator superior. 5-10% aduli i 20-40% copii - purttori sntoi de germeni; - caractere morfo - tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolai, Gram+, imobili, nesporogeni, capsulai.

- caractere de cultur: se cultiv pe medii elective (geloz - snge, geloz - ser, bulion ser), pH optimal 7,8. Pe geloz - snge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37C n atmosfer cu 5-10% CO2, formeaz colonii S mici (0,5-1,5 mm), opace, bombate, cu o zon de hemoliz alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se deprim. Tulpinile necapsulate formeaz colonii R. Structura antigenic: - antigene capsulare, de origine polizaharidic. Permit clasificarea pneumococilor n 90 serotipur; - antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare; - antigenul proteic M. Factori de patogenitate: - capsula (rol antifagocitar); - adezine; - sIgA - proteaz; - acidul lipoteichoic (implicat n reacii inflamatoare cu semne generale i leziuni tisulare, posibil oc); - autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol n virulen); - pneumolizina (hemolizina). Efect citolitic i citotoxic asupra celulelor epiteliale i endoteliale. Reduce activitatea bactericid a PMN; - hialuronidaza; - neuraminidaza: S.pneumoniae se difereniaz de ali streptococi prin: - sensibilitatea la optochin - liza culturii de pneumococi n prezena srurilor biliare (activarea autolizinelor) testul de solubilitate n bil; - patogenitatea pneumococilor pentru oarece; - prezena capsulei; - hidroliza inulinei. Epidemiologia infeciilor cu pneumococi: - sursa de infecie - purttorii sntoi (naso-faringe) sau bolnavii. - calea de transmitere - aerogen. Infeciile cauzate de S.pneumoniae: - infecii respiratorii: pneumonia franc lobar acut, broncho-pneumonii, bronite, otite, sinusite, mastoidite; - meningite (n special la copii); - bacteriemii cu artrite, peritonit, pericardit, endocardit. Imunitatea antipneumococic este specific de tip, prin Ac anti-capsulari.

Diagnosticul de laborator al infeciilor streptococice


Prelevate: n funcie de forma clinic (tampon faringean sau cutanat, puncie a esutului sub - cutanat, LCR, puroi, snge, etc) Metodele de diagnostic:

1. Diagnosticul direct: - examenul microscopic (frotiu Gram orientativ, RIF); - examenul bacteriologic (de baz); - detectarea serologic a Ag specifice (Ag capsulare pot fi identificate n reacii de latexaglutinare, reacia de umflare a capsulei cu Ac specifici); - identificarea ADN prin tehnici de biologie molecular. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Streptococcus: n faringita streptococic Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Recoltarea i transportul p.p: - produs patologic: secreia purulent de la nivelul faringelui; - se recolteaz dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i rar dup ce s-a splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii; - dac aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim 4 ore; - produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare pn la cultivare (preferabil 1-2 ore), n caz contrar este necesar un mediu de transport. Examinarea microscopic a p.p.: - se noteaz prezena celulelor, celulelor inflamatorii (leucocite) i a cocilor Grampozitivi aezai separat, n perechi sau n lanuri. Cultivarea: - se face pe agar snge; - cultura apare n 18-48 ore; - coloniile au aspect de tip S, sunt mici i nconjurate de o zon de fi-hemoliz (clar, cu diametrul mai mare dect diametrul coloniei). Identificarea se face pe baza caracterelor: morfotinctoriale (coci Gram-pozitivi, dispui n lanuri; de cultur (colonii de tip S, 0,5-1 mm, nconjurate de P-hemoliz); biochimice (hemoliz de tip beta, multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin i sunt rezisteni la trimetoprim-sulfametoxazol); antigenice (determinarea polizaharidului specific de grup, determinarea tipurilor M). Antibiograma nu este necesar dect la pacienii alergici la beta-lactamine sau n cazuri speciale. Sunt sensibili la penicilin. Dac se dorete confirmarea (retrospectiv) unei infecie invaziv sau trebuie s se confirme bolile poststreptococice, se apeleaz la reacia ASLO. Diagnosticul de laborator serologic Diagnosticul serologic este util pentru: - certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA); - identificarea unei eventuale stri de hipersensibilitate; - diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice; - evaluarea evoluiei clinice i eficacitii tratamentului. Diagnosticul serologic se realizeaz de obicei prin reacia ASLO, care identific titruri ale anticorpilor anti-streptolizin O. Testarea se face n dinamic, pe seruri recoltate la

interval de 7-10 zile. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict necesar realizarea controlului intern i extern de calitate. Exist i alte teste care se folosesc mai rar n ara noastr.

Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pneumoniae


Sunt coci Gram-pozitivi, alungii, dispui n diplo, ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz - snge determin -hemoliz. Creterea este favorizat de 5% CO2. Streptococcus pneumoniae este condiionat patogen. Poate produce infecii ale tractului respirator superior i inferior, urechii medii, sinusurilor, dar i meningit, endocardit. Diagnosticul microbiologic n pneumonia pneumococic Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic i bacteriologic (direct). Recoltarea i transportul p.p.: sput cu respect regulilor impuse pentru recoltarea i transportul produselor patologice. Examinarea microscopic a p.p.: - se noteaz prezena celulelor (macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN) i cocilor Gram-pozitivi, n diplo, cu o capsul comun. Cultivarea: - se face pe geloz - snge, cu incubare n atmosfer de 5% CO2 la temperatura de 35-37C, - apar colonii de tip S sau de tip M, cu -hemoliz. Identificarea se realizeaz pe baza: caracterelor morfo - tinctoriale: coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, n diplo, capsulai; caracterelor de cultur: colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de ahemoliz; caracterelor biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerat de sruri biliare (testul bilolizei), sensibilitate la optochin (etil-hidrocuprein); caracterelor antigenice: folosim seruri specifice anti-K polivalente i monovalente, n reacia de umflare a capsulei. caracterelor de patogenitate: inoculare la oarecele alb. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Pentru verificarea sensibilitii la penicilin se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin. Genul Enterococcus Definiie. ncadrare Germenii din genul Enterococcus sunt coci Gram-pozitivi, ovali sau coco-bacili, dispui izolat, n perechi sau lanuri scurte. Sunt aerobi facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazo-negativi, oxidazo-negativi. Enterococii au fost iniial inclui n grupa D Lancefield a genului Streptococcus. n 1984, pe baza diferenelor genetice, prin hibridarea ADN-ADN, genul Enterococcus a fost separat din genul Streptococcus. n prezent genul Enterococcus cuprinde 19 specii dintre care 3 sunt mai frecvent implicate n patologia uman: E. faecalis, E. faecium i E. durans (tabel I). Caractere generale

Habitat: sunt componeni ai florei comensale a tractului digestiv i genito-urinar, al omului i animalelor de unde jung n mediul extern. Pot fi prezeni, de asemenea n tractul biliar ceea ce atest capacitatea lor de a supravieui la concentraii mari de bil. Supravieuiesc n ap, sol, alimente, insecte. Caractere morfo - tinctoriale: sunt coci sferici, ovalari sau coco-bacilari, Gram pozitivi, dispui n diplo, lanuri scurte sau izolat. Sunt imobili, necapsulai, nesporulai. Caractere de cultur Cresc pe medii suplimentate cu 5% snge de berbec, incubate aerob la 37C, cu limite ale temperaturii de cretere ntre 10C i 45C. Pentru izolarea enterococilor din produse patologice contaminate se folosesc medii de cultur selective: agar - bil - esculin - azid sau agar Columbia cu supliment de colistin i acid nalidixic. Pe mediile solide formeaz colonii de tip S, -, - sau nehemolitice. Pe agar cu bil - esculin - azid formeaz colonii alb-cenuii cu halou negru iar pe mediile selective cu antibiotic coloniile sunt mai mici. Caractere biochimice Sunt bacterii catalaz i oxidaz negative. Cresc n bulion mbogit cu 6,5% NaCl, hidrolizeaz esculina n prezena a 40% bil sau sruri biliare, produc pirolidonilarilamidaz, leucinaminopeptidaz. Pe baza fermentrii manitolului, sorbozei, sorbitolului i a capacitii de hidroliz a argininei, enterococii sunt clasificai n 5 grupe n cadrul crora speciile se difereniaz n funcie de fermentarea arabinozei, rafinozei i zaharozei(tabel I). Grupa I, cuprinde 5 specii difereniate pe baza fermentrii arabinozei, rafinozei i a utilizrii piruvatului; Grupa II cu 5 specii identificate pe baza producerii de pigment, a mobilitii i a capacitii de a tolera teluritul; Grupa III cu 3 specii i 2 variante recunoscute pe baza utilizrii piruvatului i a fermentrii arabinozei, rafinozei i zaharozei; Grupa IV cuprinde 2 specii difereniate pe baza producerii de pigment i a fermentrii sorbitolului; Grupa V cu 1 specie i 3 variante cuprinde tulpini care nu descompun arginina. Structur antigenic Toate speciile din genul Enterococcus posed un antigen de suprafa care corespunde serogrupului D n clasificarea Lancefield a streptococilor. Caractere de patogenitate Patogeneza infeciilor cauzate de enterococi este puin cunoscut. n patogenitatea tulpinilor de enterococ sunt implicai urmtorii factori de virulen: - hemolizina/bacteriocina - o protein codificat plasmidic cu aciune litic pe hematiile umane. Acioneaz ca bacteriocin asupra altor coci Gram pozitivi. - factorul de agregare - o protein de suprafa, codificat plasmidic, care determin agregarea enterococilor. Poate media aderena enterococilor la celulele epiteliului urinar conferind tulpinilor capacitatea de a cauza infecii urinare. Poate iniia aderena la esutul endocardic tulpinile care posed acest factor fiind cauzatoare de endocardit; - gelatinaza - o peptidaz extracelular similar elastazei produs de Pseudomonas aeruginosa. A fost identificat la un numr mare de tulpini de enterococ izolate de la pacieni cu endocardit i de la pacieni spitalizai; - acidul lipoteichoic. Tulpinile de enterococ ce posed acidul lipoteichoic determin un rspuns inflamator exagerat din partea gazdei. E. faecium poate avea un nveli subire de carbohidrat care confer tulpinii rezisten la fagocitoz.

Rezistena fa de factori fizici i chimici Germenii din genul Enterococcus au o capacitate deosebit de a supravieui n variate condiii adverse. Sunt foarte rezisteni la antibiotice ceea ce pune probleme deosebite n mediul de spital transformndu-i n importani ageni etiologici ai infeciilor nosocomiale. Prezint dou feluri de rezisten: 1. rezisten intrinsec, de nivel sczut, mediat de gene cromozomale, netransferabil altor bacterii; 2. rezisten dobndit, de nivel nalt, mediat de plasmide i transpozoni, transferabil altor bacterii. Enterococii sunt n mod natural rezisteni la cefalosporine, sulfamide, lincosamide, aztreonam, clindamicin, trimetoprim-sulfametoxazol i fa de dozele uzuale de aminoglicozide. Au o mare capacitate de a dobndi rezisten fa de unele antibiotice: - rezisten de nivel nalt fa de aminoglicozide, penicilin i vancomicin; - au toleran fa de antibioticele cu aciune pe peretele celular (penicilin, vancomicin) care doar le inhib nu le distrug; - fa de penicilin au dezvoltat 2 mecanisme de rezisten prin: - beta-lactamaz; - modificarea afinitii proteinei de legare a penicilinei (PLP5). Penicilinele de semisintez au efect bacteriostatic asupra enterococilor. Rezistena dobndit fa de vancomicin are implicaii serioase asupra tratamentului i controlului infeciilor cauzate de tulpini de enterococ vancomicino-rezistent (VRE). Se cunosc 5 fenotipuri de rezisten la vancomicin codificate genetic: VanA, VanB, VanC, VanD, VanE cele maifrecvente fiind primele dou. Fenotipul VanA manifest rezisten de nivel nalt fa de vancomicin i teicoplanin, este mediat de transpozonul Tn 1546. Acesta conine 7 gene i este prezent mai ales la E. faecium. Fenotipul VanB este rezistent la vancomicin i sensibil la teicoplanin. Este mediat de transpozonul Tn1547 prezent la E. faecium i E. faecalis. Fenotipul VanC prezint rezisten de nivel sczut fa de vancomicin, este sensibil la teicoplanin. Este mediat de 2 gene cromozomale: vanC 1prezent constitutiv la E. gallinarum i vanC2 prezent constitutiv la E. casseliflavus. Aceste gene sunt netransferabile. Fenotipurile VanD i VanE sunt descrise la un numr mic de tulpini de enterococ. Posibilitatea transferrii genelor de rezisten de la Enterococcus la Staphylococcus aureus (posibil in vitro dar nesemnalat n clinic) crete importana aciunilor de limitare a circulaiei tulpinilor de enterococ vancomicino-rezistent. Patogenie. Boala la om Enterococii sunt bacterii condiionat patogene care pot fi implicate etiologic n: - infecii ale tractului urinar, nosocomiale (15%) sau comunitare, la pacieni cu uropatii obstructive, mai frecvent la brbai vrstnici; - ocup locul al III-lea n etiologia endocarditei subacute; - bacteriemie la vrstnici sau la pacieni cu imunitatea deprimat; - infecii mixte (asocieri cu enterobacterii sau bacterii anaerobe) ale plgilor chirurgicale sau ale ulcerelor de decubit, peritonite, infecii biliare, abcese intra abdominale. Specia mai frecvent implicat n patologia uman este E. faecalis (90%)

urmat de E. faecium (8%). Ocazional au fost izolai din infecii umane tulpini de E. raffinosus, E. durans, E. casseliflavus, E. avium.

Diagnostic de laborator n infeciile produse cu enterococ


Produse patologice: urina, materiile fecale, secreii din plgi. Semnificaia clinic a prezenei enterococilor n prelevatele patologice trebuie stabilit cu grij dat fiind uurina cu care contamineaz prelevatele. Examenul microscopic este util pentru prelevatele n mod curent sterile. Izolarea bacteriei se face pe agar cu snge de berbec sau pentru prelevatele contaminate pe medii selective: agar bil - sculin - azid sau medii cu supliment selectiv colistin + acid nalidixic pe care sunt inhibate bacteriile Gram negative. Identificarea se face pe baza caracterelor microscopice, biochimice. Identificarea preliminar se face pe baza urmtoarelor reacii pozitive: - testul la bil - esculin; - tolerana la 6,5% NaCl; - producerea de pirolidonil-arilamidaz, leucinaminopeptidaz; - sensiblitate la vancomicin. Identificarea definitiv are la baz: Caracterele fenotipice: - fermentarea zaharurilor util n ncadrarea n grupe i pentru identificarea speciilor n cadrul grupei; - hidroliza argininei; - testul toleranei la telurit; - testul mobilitii; - pigmentaia; - utilizarea piruvatului din mediul de cultur Identificarea unor markeri epidemiologici care permit tiparea i subtiparea tulpinilor de enterococ: - metode clasice: bacteriocinotipia, lizotipia,antibiotipia, serotipia; - metode moleculare: determinarea profilului plasmidic, analiza endonucleazei de restricie a ADN-genomic, analiza profilului de macrorestricie prin electroforez n cmp pulsat. Antibiograma este obligatorie, dup izolarea i identificarea tulpinii de enterococ i se efectueaz testnd antibioticele: beta-lactamice, aminoglicozide, glicopeptide. Este indicat determinarea CMI i a producerii de beta-lactamaz n vederea conducerii unui tratament eficient care s duc la vindecarea pacientului i totodat s evite selectarea de tulpini rezistente.

Diagnosticul de laborator al infeciilor cauzate de enterobacterii: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Shigella, Salmonella
Familia Enterobacteriaceae cuprinde: bacterii condiionat patogene: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus; bacterii patogene: Shigella, Salmonella. Patogenie i produse patologice Escherichia coli spp. produc: infecii ale tractului intestinal (enterocolite). n aceste infecii sunt implicate tulpinile patogene de Escherichia coli: EPEC, EHEC, EIEC, EAEC, EAggEC. Produsele patologice (p.p.) sunt reprezentate de: materii fecale, bil, alimente, vrsturi; infecii extraintestinale: - infecii urinare (UPEC) - pp: urin; - infecii intra-abdominale i ale plgilor - pp: puroi; - meningit - p.p.: LCR; - bacteriemie - p.p.: snge. Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis) produc: pneumonii (K. pneumoniae) - p.p.: sput; infecii urinare (K. pneumoniae, K. oxytoca) - p.p.: urin; infecii din sfera ORL: ozena (K. ozaenae), rinoscleromul (K. rhinoscleromatis) p.p.: secreii nazale; infecii ale esuturilor moi, ale urechii medii - p.p.: puroi; infecii digestive - p.p.: materii fecale, bil, vrsturi, alimente; meningit, septicemie - p.p.: LCR, snge. Proteus spp. (P. mirabilis, P. vulgaris) sunt implicate n: toxiinfecii alimentare - p.p.: materii fecale, vrsturi, alimente; infecii urinare - p.p.: urin; meningit - pp: LCR; abces cerebral (P. mirabilis) - p.p.: puroi; pneumonii - p.p.: sput; infecii din sfera ORL: - p.p.: secreii nazale; septicemie - p.p.: snge. Shigella spp. (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei) produc: dizenteria bacilar - p.p.: materii fecale emise spontan (recoltate pe sond Nelaton de la purttori), vrsturi, alimente. Salmonella spp. (S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis) produc: salmoneloze: febre tifo-paratifoide; salmoneloze digestive: toxi-infecii alimentare, gastro-enterite; manifestri extra-digestive: - bacteriemii nontifoidice; - infecii pleuro-pulmonare;

- afeciuni osteo-articulare: osteite, osteomielite, artrite septice, etc.; - infecii nozocomiale; - infecii cardio-vasculare: pericardite, arterite; - infecii urinare; - infecii abdominale: colecistite, abces al ficatului, splinei; - infecii ale SNC: meningite, abces al creierului, abces epidural, etc. Produsele patologice se recolteaz n cazul: febrei tifoide (S. typhi). de la bolnavi: n prima sptmn - snge; n a II-a sptmn. - materii fecale, bil, suc duodenal; n a III-a sptmn - materii fecale, snge pentru serodiagnostic; n a IV-a sptmm - snge pentru serodiagnostic; - de la purttor: materii fecale dup administrarea unui purgativ, bil; gastroenterite (S. enteritidis) - p.p.: materii fecale, vrsturi, alimente; septicemii - p.p.: snge. Diferenierea enterobacteriilor Familia Enterobacteriaceae include germeni care se pot multiplica pe medii simple, sunt aerobi sau facultativ anaerobi, utilizeaz glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidazo-negativi i catalazo-pozitivi. Formeaz colonii de tip S (R n cazul culturilor "vechi") sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (Escherichia coli, KlebsielIa spp.) sau sunt lactoz negativi (Salmonella spp., Shigella spp.). Diferenierea enterobacteriilor se realizeaz prin: Examen direct: se efectueaz doar din produse patologice normal sterile; se pot evidenia bacili G-, ciliai (Escherrichia coli, Proteus) sau capsulai (Klebsiella). Izolare: - pe medii selectiv-difereniale pentru enterobacterii (Leifson, Levine, SS - pentru Shigella i Salmonella); - pe medii difereniale (geloz lactozat); - pe medii geloz snge. Identificare: caractere morfotinctoriale Bacteria Coloraie Dispoziie Cili Capsul Escherichia coli Bacili GNeregulat Peritrichi Klebsiella Cocobacili GDiplo + Proteus Bacili polimorfi GNeregulat Peritrichi Shigella Bacili GNeregulat Salmonella Bacili GNeregulat Peritrichi caractere de cultur Bacteria Cultivare pe mediu de cultur solid Escherichia coli Formeaz colonii tip S, este lactozo +

Klebsiella

Proteus

Shigella Salmonella

- pe geloz - lactoz produce colonii galbene; - pe mediu Levine formeaz colonii violete cu luciu metalic; - pe geloz-snge formeaz colonii cenuii, unele tulpini produc hemoliz ; - pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermenteaz sorbitolul sau l fermenteaz tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip S, 1-3 mm, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz). Formeaz colonii mari de tip M, cu aspect de "curgere" pe suprafaa mediului de cultur (tendin de confluare). Este lactozo +. Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. - pe medii cu bil produce colonii tip S, transparente, lactozo - ; - pe medii fr bil nu formeaz colonii. Prezint fenomen de crare, colonii cu caracter invadant, margini dantelate ce pot acoperi toat suprafaa mediului; - fenomenul Dienes: - dac tulpinile provin de la aceeai specie i sunt nsmnate pe aceeai plac prin cretere se suprapun; - dac tulpinile sunt diferite, ntre ele rmne o zon de demarcaie. Formeaz colonii tip S, transparente, lactozo Formeaz colonii tip S, transparente, lactozo -; colonii ochi de pisic pe mediu SS.

caractere biochimice - importante pentru diferenierea enterobacteriilor; - toate descompun glucoza: enterobacteriile condiionat patogene sunt L+: - pe geloz lactozat formeaz colonii galbene, culoarea mediului vireaz n galben; - pe mediu Leifso produc colonii roii, culoarea mediului vireaz n rou; enterobacteriile patogene sunt L-: - colonii transparente, culoarea mediului rmne neschimbat. Caractere biochimice Bacteria TSI MIU Simmons G L Z H2S Uree I M Escherichia coli + + + + + Klebsiella + + + + V + Proteus + + + V + + Shigella + V Salmonella + + + +

Identificare antigenic Bacteria Tipul de reacii

Escherichia coli

Klebsiella Proteus Shigella Salmonella

Reacii de aglutinare pe lam: - cu seruri polivalente; - apoi ce seruri monovalente pentru EPEC, EIEC, EHEC (O157H7). Reacia de umflare a capsulei (determin prezena antigenului K) Reacii de aglutinare pe lam anti O i anti H Reacii de aglutinare pe lam cu seruri specifice de grup Reacii de aglutinare pe lam: - cu seruri polivalente de AgO; - cu seruri monovalente pentru serogrupurile A, B, etc.; - cu seruri monovalente pentru serotip; - determinarea antigenului Vi.

Determinarea patogenitii Klebsiella pneumoniae inoculat la oareci intraperitoneal sau subcutanat determin septicemie mortal; Shigella - testul keratoconjunctivitei la cobai (testul Sereny). Antibiograma se efectueaz la toate tulpinile isolate; tulpinile de Proteus spp. pot prezenta multirezisten, mai ales cele izolate din infecii nozocomiale. Diagnostic serologic n febra tifoid: detectarea i titrarea anticorpilor fa de Ag O, Ag H ai S. typhi i paratyphi A, B (reacia Widal). Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli Genul Escherichia cuprinde n bun parte germeni comensali. Specia reprezentantiv este Escherichia coli. Dei, majotitatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiionat patogene, exist i tulpini patogene (patotipuri: E. coli enteroagregativ, E. coli enterohemoragic, E. coli enteroinvaziv, E. coli enteropatogen, E. coli enterotoxigen, E. coli aderent difuz). Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv Recoltarea i transportul se efectuaz cu respectarea regulilor impuse pentra aceste operaii. Se recoltaz materii fecale, lichid de vrstur etc. Examinarea macroscopic este urmat de examen de laborator. n cazul infeciei produs de E. coli enterohemoragic (EHEC), materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoas epitelial. De obicei se face frotiu. Examinarea se face ntre lam i lamel i se pot observa hematii i PMN. Cultura. Cultivat pe MacConkey cu D-sorbitol, tulpina EHEC nu fermenteaz sorbitolul sau l fermenteaz tardiv. Coloniile suspecte, sunt de tip S, 1-3 mm, necolorate (coloniile sorbitol pozitive au o culoare roz). Identificarea se face pe baza:

- caracterelor morfotinctoriale: bacili gram-negativi; - caracterelor de cultur: colonii de tip S, cu caracterele menionate mai sus; - caracterelor biochimice (se examineaz numai acolo unde sunt condiii de biosiguran, conform unei Directive Europene): fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), lactoz-pozitivi, nu fermenteaz (sau fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili (exist i tulpini imobile) etc.; - caracterelor antigenice: prin reacii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri monovalente anti O157 i anti H7). Antibiograma este recomandat pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode difuzimetrice. Diagnosticul n infeciile urinare n principal se recolteaz urin. n funcie de forma clinic se poate recolta i snge (n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. nainte de recoltarea urinei, pe lng regulile impuse este necesar s se realizeze toaleta local. Atunci cnd nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat pentru recoltare 3-4 ore dup miciune. Dac p.p. nu este prelucrat imediat (n maxim 30 de minute dup recoltare), trebuie meninut la temperatura de refrigerare, iar transportul trebuie realizat la +4C. Se recolteaz urina "din mijlocul jetului". Exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare uretral, cu riscurile respective). Examenul macroscopic (urina poate fi tulbure) implic pregtirea sedimentului urinar". Examinarea preparatului se face ntre lam i lamel, stabilindu-se numrul de bacterii i respectiv numrul de PMN pe cmp (dac exist leucociturie). Cultura. Pentru cultivare se pot utiliza mai medii diferite. Se face o urocultur cantitativ pentru determinarea numrului de bacterii/ml de urin. Urina se dilueaz 1/1.000 i apoi se nsmneaz 0,1 mililitri de urin diluat. Pentru calcul numrului de bacterii/mL urin, numrul de colonii aprute dup cultivare se multiplic cu 10 i respectiv cu 1000. Interpretare urocultur cantitativ: dac numrul de bacterii/ml este mai mare de 100.000, se consider urocultura ca fiind pozitiv. Lipsa coloniilor sau un numr de maxim de 10.000 bacterii/ml, semnific o urocultur negativ. Dac urocultur este pozitive, bacteria izolat se identific pe baza caracterelor prezentate mai sus i se trateaz pacientul conform antibiogramei. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Klebsiella Bacteriile din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradeaz glucoza cu producere de gaz i fermenteaz lactoza. Specia tip este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulai). Este un microb condiionat patogen. Poate produce TLA de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc., inclusiv infecii nosocomiale. Pentru diagnostic, se ia ca exemplu cazul de pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul integral include elemente clinice, paraclinice i de laborator; diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei i tratamentului corespunztor. Recoltarea i transportul preparatului patologic se face cu respectarea regulilor cunoscute. Se recolteaz sput.

Examenul macroscopic poate evidenia aspectul mucoid, de culoare rou nchis, "n jeleu de coacze" al sputei. Examenul microscopic al p.p. permite observarea prezenei macrofagelor alveolare, celulelor inflamatorii (PMN) i a barililor gram negativi, de dimensiuni relativ mari, cu capsul (halou, vizibil). Cultura. P.p. se cultiv pe medii de cultur obinuite (18-24 ore, 35-37C) i se examineaz coloniile izolate, pentru identificare. Se recomand utilizarea mediilor slab selective (MacConkey), deoarece Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. K pneumoniae formeaz colonii lactoz-pozitive, mari, de tip M, cu aspect de "curgere" pe suprafaa mediului de cultur (tendin de confluare). Identificarea microorganismului se face pe baza caracterelor: morfotinctoriale: barili gram-negativi, dimensiuni mari, capsulai, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai; de cultur: colonii lactoz pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n "pictur de miere", care dau aspectul de "curgere" pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin la confluare; biochimice: glucoza pozitiv (cu producere de gaz), lactoz pozitiv, nu produce H2S, imobil, ureaz pozitiv, indol negativ, se dezvolt folosind citratul ca unic surs de C; antigenice: se utilizeaz seruri cu Ac cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (n laboratoare de referin); testarea sensibilitii la bacteriofagi. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz, de obicei, prin metode difuzimetrice. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Proteus Genul Proteus face parte din familia Enterobacteriaceae i cuprinde trei specii cu importan medical: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris i Proteus penneri. Germenii din genul Proteus sunt ubicuitar rspndii n natur, putndu-se ntlni n sol, ape reziduale, ape de suprafa, n materiile organice n putrefacie, n intestinul omului, n alimente i n produse patologice. Sunt bacili Gram-negativi, aerobi sau facultativ anaerobi, nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, sunt ciliai peritrichi sau lofotrichi i foarte mobili. Sunt polimorfi: au forme variate, de la bastonae scurte pn la forme lungi, filamentoase. Nu prezint capsul i nici spori. Sunt germeni condiionat patogeni. Pot produce TLA de tip infecios, infecii ale tractului urinar (ITU), dar chiar i alte infecii (tegumentare, genitale, infecii nosocomiale etc.). Diagnosticul de laborator n cazul infeciilor tractului urinar (ITU) produse de Proteus Diagnosticul de laborator microbiologic este, bacteriologic, direct. Recoltarea i transportul p.p. se realizeaz cu respectarea regulilor impuse. Produsul patologic este urina, care poate fi tulbure, purulent. Transportul trebuie realizat n maxim 30 minute, iar dac nu e posibil, p.p. trebuie transportat "la rece" (+ 4C). Examenul microscopic al produsului patologic include realizarea preparatului proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul urinar. Acest tip de examinare este foarte important, uor de realizat, ieftin i permite observarea unor elemente utile, care orienteaz

diagnosticul i stabilirea numrului de leucocite/cmp. De asemenea, mobilitatea poate fi evaluat. Cultura. Bacteriile din genul Proteus se cultiv pe medii de cultur simple, nu sunt pretentioase nutritiv. Pe geloza simpl i pe geloz-snge cresc avand o caracteristica unic n familia Enterobacteriaceae de a invada mediul, fenomen numit ,,fenomen de crare, ,,fenomen de invazie sau de ,,roire. Din locul inocularii, valuri succesive de cultur migreaz concentric pn la marginea mediului sau pn la ntlnirea cu valul migrator al altei colonii. Pentru ca rezultatul s fie pozitiv, numrul de bacterii/ml de urin trebuie s fie >100.000. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza caracterelor: morfotinctoriale: bacili gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme filamentoase de peste 30 m); de cultur: - fenomenul de invazie (dac nsmnm o tulpin la periferia unei plci Petri cu mediu simplu, cultura se "dezvolt n valuri concentrice", pe toat suprafaa mediului). Pe anumite medii selective (cu sruri biliare), invazia este inhibat i se obin colonii izolate, de tip S, lactoz negative; - fenomenul "liniei de demarcaie" (dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o "linie de demarcaie" ntre cele 2 tulpini); - fenomenul de "crare"; biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte caractere biochimice se pot studia pe mediile muli test, TSI, MTU etc.), glucoz pozitive (cu formare de acid i gaze), produc H2S, mobile, ureaz pozitive, fenilalanin pozitive, se pot dezvolta folosind citratul ca unic surs de carbon. Specia Proteus vulgaris este singura care produce indol; antigenice. Speciile de Proteus prezint:- antigen somatic O, cu specificitate de grup i antigen flagelar H, cu specificitate de tip. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz, de obicei, prin metode difuzimetrice. Sunt, n general, destul de rezistente la dezinfectani i antiseptice obinuite. Sunt destul de rspndite n mediul spitalicesc i au rezsten destul de mare la antibiotice. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Shigella Genul Shigella face parte din familia Enterobacteriaceae i reunete 4 subgrupe: A. Shigella dysenteriae (13 serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) i D. S. sonnei (1 serotip cu 2 faze, R i S). Sunt bacterii strict adaptate omului, ntotdeauna patogene. Sunt ntlnite n intestinul i materiile fecale ale bolnavului, convalescentului i purttorului aparent sntos. Sunt bacili Gram-negativi, neciliai, necapsulai, nesporulai. Sunt bacili gram negativi, imobili, nesporulai, necapsulai, aerobi sau facultativ anaerobi, glucoz pozitivi (fr producere de gaz), oxidaz negativi, lactoz negativi. Subgrupele se pot diferenia, pe baza fermentrii manitei (subgrupul A este manit negativ). Omul reprezint rezervorul de Shigella. Bacteriile sunt eliminate n mediul extern prin materiile fecale, contaminnd apa, alimentele, solul. Transmiterea este direct fecal-oral. Poarta de intrare este tractul digestiv, prin consum de apa i alimente contaminate.

Speciile mai frecvent ntlnite sunt S. dysenteriae i S. flexneri, fiind i cele maivirulente. Controlul infeciei se face prin igiena personal i comunitar. Produc infecii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate s apar dup ingestia a numai 10-100 bacterii. Shigella spp. pot produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios. Shigelele produc exotoxine care acioneaz ca enterotoxine (toxina Shiga n cazul infeciei cu Shigella dysenteriae, cu efect neurotoxic, citotoxic, enterotoxic). Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) i trebuie stabilit rapid. Recoltarea i transportul p.p. (materii fecale) se efectueaz cu respectarea regulilor cunoscute. Examenul macroscopic al materiilor fecale poate indica prezena unor cantiti mici de mucus, puroi, snge. Transportul trebuie s fie realizat rapid (se recomand nsmnarea la patul bolnavului; altfel, trebuie s fie folosit un mediu de transport, Cary-Blair). Recoltarea se poate face i cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoid. Examenul microscopic al p.p. este foarte important. El poate oferi un rspuns concret, rapid i util. Se examineaz preparatul ntre lam i lamel, iniial cu obiectivul 40x. Dac se evidenieaz numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dac se remarc un procent de peste 75% PMN, alturi de hematii, acest aspect este sugestiv pentru dizenteria bacterian. Cultura. Prima izolare se face pe medii slab sau moderat selective i medii difereniale (ADCL, Istrate-Meitert). Dac apar colonii lactoz negative, coloniile transparente, lactozo-negative sunt nsmnate pe medii (TSI, MIU, MILF, Simmons-citrat, uree), pentru identificare biochimic prezumptiv. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza caracterelor: morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, unele tulpini posed capsul; de cultur: produc colonii de tip S, lactoz negative, 1-2 mm, transparente; biochimice: sunt glucoz pozitivi, fr producere de gaz, lactoz negativi, nu produc H2S, imobili, ureaz negativi, indol negativi (excepie S. flexneri), oxidaz negatvi, citrat negativi, lizin negativi; antigenice: se utilizeaz seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri imune specifice de tip (reacii de aglutinare pe lam, conform schemelor de lucru). Antigenele mai importante sunt: antigenul somatic O, care st la baza mpririi n 4 grupe antigenice; Grupul A: S. Dysenteria; Grupul B: S. Flexneri; Grupul C: S. Boydii; Grupul D: S. sonnei i antigenul K; testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizat n scop epidemiologic. Antibiograma este recomandat. Se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat att n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente, ct i pentru stabilirea tratamentului antimicrobian corespunztor. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Salmonella Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae i cuprinde o singura specie, Salmonella enterica. Aceasta specie cuprinde peste 2300 serotipuri difereniate pe baza antigenelor somatice O i flagelare H. Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al omului i animalelor. Aceste doua surse vor determina poluarea solului,

apelor reziduale, apelor de suprafa n care pot supravieui de la cteva luni la civa ani, n condiii de temperatur i pH favorabile. Genul Salmonella include bacili gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, mobili cu cili peritrichi, necapsulai, nesporulai, nu fermenteaz lactoza, produc H2S, utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Pot produce salmoneloze minore (TIA) i salmoneloze majore (febra tifoid). n cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. n cazul afeciunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic i serologic. Diagnosticul de laborator n infeciile cu localizare digestiv Recoltarea i transportul p.p. se efectueaz cu respectarea regulilor cunoscute. Preparatul patologic este reprezentat de materii fecale. Examenul microscopic al p.p. se face ntre lam i lamel i se remarc prezena granulocitelor. Cultura. Salmonella spp. se cultiv pe urmtoarele medii de cultur: un mediu lichid de mbogire (bulion selenit) i dou medii selectivo-difereniale (MacConkey i ADCL). Dup 18-24 ore la 35-37C, pe mediile solide pot aprea colonii bacteriene suspecte (lactozo-negative) din care se obine cultura pur. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit se repic pe medii solide. Pe mediile selective i difereniale determin colonii lactozonegative de tip S. Producerea de H2S, evideniat prin apariia unei pete de culoare neagr n centrul coloniilor, face ca acestea s se numeasc ,, n ochi de pisic. Pe mediul Wilson-Blair formeaz colonii opace, rugoase, cu margini neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de mbogire pentru Salmonella sunt mediile cu selenit, azid de sodiu i bulionMuller-Kauffmann. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza caracterelor: morfotinctoriale: sunt bacili gram-negativi; de cultur: pe medii selective i difereniale determin colonii lactozo-negative de tip S, necolorate (pe mediu MacConkey). Producerea de H2S, evideniat prin aparia unei pete de culoare neagr n centrul coloniilor, face ca acestea s se numeasc ,, n ochi de pisic (pe mediu ADCL). Pe mediul Wilson-Blair formeaz colonii opace, rugoase, cu margini neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de mbogire pentru Salmonella sunt mediile selenit azid de sodiu i bulionMuller-Kauffmann; biochimice: fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt germeni lactoznegativi, produc H2S, indol negativi, lizin pozitivi i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon; antigenice: reacii de aglutinare pe lam prin utilizarea serurilor imune cu Ac antiO i ulterior Ac anti-H, cu respectarea protocolului de lucru. Salmonella prezint trei tipuri importante de antigene: antigenul somatic O, este rezistent la cldur i alcool, prezint specificitate de grup; antigenele de suprafa (nveli, antigenul Vi este un antigen specific de suprafa ntlnit doar la trei serovaruri Salmonella: typhy, paratyphy C, Dublin; antigenele flagelare H, sunt proteine labile termic situate la nivelul cililor. Fenomenul de variaie de faz se ntlnete la multe tipuri de salmonele, astfel putnd si schimbe tipul de specificitate al flagelilor cu un altul. LPS (lipopolizaharidul) bacteriilor din genul Salmonella este coninut de nveliul celular i eliberat dup liza bacterian i funcioneaz ca endotoxin. Aceasta poate juca un rol important n patogeneza multor manifestri clinice: febr, activarea sistemelor de coagulare, scderea contractilitii miocardului, oc septic. Patogenitatea salmonelelor

este datorat factorilor de virulen, adezinele i toxinele enterotoxinele termo-stabil (ST), termo-labil (LT), verotoxina (toxina Shiga-like), citotoxina implicat n invazia i distrucia celular, antigenul Vi cu rol de adezin, fimbrii. sensibilitate la bacteriofagi. Antibiograma este recomandat n cazul pacienilor foarte n vrst sau n cazul copiilor foarte mici, prematuri, cu alte boli adugate i pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice. Sunt sensibile la cloramfenicol, streptomiocin, tetraciclin, ampicilin, dar au aprut i tulpini plurirezistente. Diagnosticul de laborator n febrele enterale (febra tifoid) Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea i identificarea bacteriei S. typhi din p.p. Diagnosticul bacteriologic, direct respect etapele prezentate anterior. n prima sptmn de boal, p.p. este reprezentat de snge; ulterior pot fi recolte materii fecale, urin, lichid biliar, mduv hematogen etc. Dac p.p. este reprezentat de materii fecale, se respect procedura indicat mai sus (exist i unele particulariti). Coloniile de S. typhi pot s nu prezinte centrul de culoare neagr pe ADCL. S. typhi nu produce gaz din glucoz, H2S fiind produs n cantitate mic. Nu folosete citratul ca unic surs de carbon. Pentru identificarea AgO este necesar o inactivare prealabil (termic). Prezena AgVi poate crea probleme n identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte util. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice este indicat n toate infeciile produse de S. typhi. Diagnosticul serologic se realizeaz cu respectarea principiile generale. Serodiagnosticul Widal (folosind culturi vii) nu se mai practic astzi. Tehnica actual poart numele de analiz seric cantitativ (aglutinare n tuburi), n cadrul creia se utilizeaz serii de tuburi (cte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Pentru a evidenia Ac anti-O (TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphiB) i anti-H (d - S. typhi, a-S. paratyphi A, b -S. paratyphi B) se folosesc 6 serii de tuburi. Se pregtesc diluiile, se incubeaz pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52C i 10 minute la temperatura camerei, iar pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52C i 10 minute la temperatura camerei i apoi se procedeaz la citirea reacia. Un titru de 1/250 n cazul Ac anti-O i unul de 1/2.500 n cazul Ac anti-H sunt sugestive. Creterea de 4 ori a titrului, la 2 determinri succesive confirm diagnosticul. n cazul convalescenilor i purttorilor este recomandat reacia de aglutinare n tuburi pentru identificarea prezenei i titrului Ac anti-Vi (titru mai mare de 1/40).

Diagnosticul de laborator al infeciilor virale: Hepatita, infecii virale respiratorii, infecia HIV/SIDA
Virusuri
Particulariti Virusurile reprezint structuri acelulare cu potenial infecios, cu dimensiuni de ordinul nm (20-400 nm). Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic (AN: ADN sau ARN). Virusurile sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari. Nu cresc i nu se divid, se reproduc n celule vii, nu pot fi cultivate pe medii artificiale. Manifest rezisten natural la antibiotice. Clasificarea virusurilor - dup tipul AN (cu genom ARN/ADN); - dup dimensiuni (mici: 20-50 nm; medii: 50-150 nm, mari: peste 150 nm); - dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt); - dup compoziia chimic: virusuri simple constituite din acid nucleic (AN) i nveli proteic - capsida (ansamblu numit nucleocapsid); virusuri complexe alctuite din nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos); - dup gazd (om, animal, insect, bacterie); - dup sensibilitatea n mediul extern, la substane chimice, etc.

Diagnosticul hepatitelor virale


Hepatitele virale reprezint probabil cel mai comun tip de infecie viral din lume. Cercetrile asupra etiologiei acestor boli au dat rezultate remarcabile n ultimii 25 ani. Astfel, sunt identificate i bine caracterizate o serie de virusuri hepatotrope: virusurile hepatitelor A, B, C, D i E. n ultimii doi ani au mai fost descrise dou virusuri cu tropism hepatic la om: virusurile hepatitei F si G. Diagnosticul hepatiei virale A Hepatita A. Virusul hepatitei A (HAV) a fost descoperit n anul 1972. Este un picornavirus (aparine genului Enterovirus) i se prezint sub forma unei particule sferice de 27 nm care conine ARN. Viremia este de foarte scurt durat i, de aceea, determinarea HAV n snge este lipsit de importan. Hepatita A este cea mai uoara form de hepatit, se vindec n 99% din cazuri, se transmite pe cale oral prin ap i alimente infectate, mini murdare, alimente crude consumate nesplate; virusul se elimina prin materiile fecale; de obicei, boala se vindec rapid i complet, nu duce la hepatit cronic. Dup o scurt perioad de incubaie, virusul este excretat n fecale, fazele preicteric i icteric aprnd la aproximativ dou sptmni. nc de la debutul acestor faze apar de regul i IgM anti-HAV i cresc transaminazele. Nivelurile crescute ale IgM anti-HAV sunt prezente doar n faza acut i dispar n aproximativ 10 sptmni. Din acest moment, apar IgG anti-HAV care confer protecie. n practic se dozeaz doar IgG. Din punct de vedere evolutiv este notabil absena portajului cronic. Receptivitatea la boal este general. Profilaxia se realizeaz prin izolarea bolnavilor i controlul

contacilor, educaie sanitar, protecia apei i alimentelor, controlul igienico-sanitar. Exist i profilaxia specific, n cazuri individuale, cu gamaglobulin. Produs patologic: - snge, saliv - pentru evidenierea anticorpilor; - materiile fecale; - biopsie din ficat pentru evidenierea virusului. Examen direct (nu se practic de rutin) se face din biopsie hepatic prin reacii imunohistochimice i din materii fecale prin reacii antigen-anticorp (greu evideniabile la nceputul bolii) pentru evidenierea virusului din materii fecale prin ME i evidenierea antigenelor virale. Izolare: nu se practic de rutin; dei virusul poate crete pe linii celulare, nu produce efect citopatic. Diagnosticul serologic urmrete dinamica apariiei anticorpilor: - IgM: apar odat cu primele simptome de boal - ajung la titru maxim n 1-3 sptmni, dispar n 3-6 luni; - IgG: apar dup aproximativ o lun de la infecie, ajung la titru maxim n 3-6 luni, apoi persist la un nivel detectabil toat viaa; - anticorpii se detecteaz prin ELISA. Diagnosticul Hepatitei virale B Hepatita B este o boal de natur infecioas, agentul patogen fiind virusul hepatitei B (HBV).Virusul este de tip ADN (adenovirus) (aparine familiei Hepadnaviridae), iar boala mai este cunoscut i sub denumirea de hepatit seric. Particula viral de 27 nm este alctuit dintr-o anvelop lipoproteic care conine antigenul HBs i o nucleocapsid central (miez) care conine ADN circular i ADN-polimeraz. Capsida formeaz antigenul central (HBc) cruia i este asociat (sub form mascat) antigenul HBe. Acesta din urm poate fi regsit n sngele circulant sub form liber sau asociat. Mai trebuie mentionat c antigenul HBs prezint numeroase subtipuri. Virusul hepatitei B este prezent n sange i n esuturi, se elimin prin saliv, lacrimi, secreii genitale, sperm, snge menstrual, care sunt i principalele elementele de transmitere a bolii; se poate transmite de la mam la copilul nou nscut n timpul sarcinii; din 100 de bolnavi aduli cu hepatit acut B, 95 se vindec, 5 fac hepatit cronic i 2 mor prin complicaii ale hepatitei cronice (ciroz sau cancer de ficat); dac hepatita acut B a fost fcut n copilarie, sub vrsta de 5 ani, riscul de a deveni purtator este de cca 90%, iar cel de cronicizare este de 25-80%. Dac hepatita acut a fost contractat n perioada de adult, riscul de cronicizare este mult mai mic de 3-10%. Produs patologic: - snge pentru detectarea markerilor virali (antigene i anticorpi); - esut hepatic - detectarea antigenelor virale; - virusul se mai elimin prin secreii genitale, saliv. Izolare: virusul HBV nu este cultivabil. Diagnostic: Cei mai utilizai markeri virali n aprecierea evoluiei sau nu a infeciei cu virus B sunt:

Antigenul HBs (Ag HBs) o proteina de la suprafaa virusului B al hepatitei: - apare la 4 sptmni de la contactul cu virusul B; - n hepatita cronic persist mai mult de 6 luni; - dispare n caz de vindecare dar uneori persist n organism chiar dupa vindecare, situaie numit de purttor sntos (inactiv) de virus B hepatitic. Anticorpii HBs (Ac HBs) sunt anticorpii impotriva proteinei S a virusului: - apar atunci cnd se elimin virusul din corp, dar i n cazul vaccinrii; - prezena sa n organism, nu nseamna c ai virusul, ci ca ai anticorpi mpotriva virusului, obtinui prin vindecarea unei hepatite sau n urma vaccinarii mpotriva virusului B; - cine are acesti anticorpi, este imun la virusul hepatitei B. Antigenul HBc (Ag HBc) este o substan care se gsete n interiorul virusului, prezena sa arat ca virusul se gsete n interiorul organismului uman, n snge i ficat. Anticorpii impotriva HBc (Anti-HBc) sunt anticorpii impotriva proteinei C, prezena lor nu nseamn vindecarea hepatitei, dect dac se asociaz i cu prezena AcHBs. Sunt doua tipuri de anticorpi anti HBc: Anti HBc IgM, care arat un contact recent cu virusul hepatitei B (infecie acut) de cel mult 6 luni; Anti HBc IgG, care arat o infecie veche (cronic) cu virusul hepatitei B i fa de cel anterior, persist toat vita (nu numai 6 luni). Antigenul HBe (Ag HBe) este o proteina a virusului hepatitei B: - se gsste n snge doar dac este prezent i virusul; - de obicei dispare la vindecarea bolii; - exist i variante de virus hepatitic B fr acest antigen (mutani), destul de frecvente i n Romnia, mai ales dac pacientul a facut tratament cu lamivudin. Anticorpii impotriva HBe (Anti HBe) sunt anticoprii mpotriva proteinei E a virusului B: - apariia lor ntr-o hepatit acut nseaman vindecarea bolii; - persist o perioad ndelungat n snge; - apariia lor ntr-o hepatit cronic poate nsemna vindecarea sau lipsa de mulire a virusului. Acidul nucleic al viruslui B (AND-VHB): - detecia sa n snge nseamn prezena virusului; - n funcie de concentraia sa, se poate spune c persoana are: hepatit cronic cu virus B, dac concentratia >2.000 UI/ml; purtator inactiv de virus B, dac concentraia <2.000 UI/ml; hepatita B ocult, dac concentraia este <200 UI/ml. Markeri virali detectabili din snge prin ELISA: - Ag HBs, Ac anti HBs; - Ag HBe, Ac anti HBe; - Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare); - Ac anti HBc; - din snge se mai poate evidenia ADN-ul viral prin PCR, polimeraza (cercetare). Markeri virali detectabili din biopsie hepatic prin imunohistochimie: -Ag HBs; - Ag HBc; - AgHBx (markerul cronicizrii i al malignizrii - cercetare);

- ADN viral. Dinamica apariiei markerilor virali n snge: AgHBs: - se evideniaz primul, apare n perioada de incubaie (la 1-2 sptmni de la infecie) scade n convalescen; - dispare odat cu apariia anticorpilor antiHBs; - detectarea lui dup 6 luni de la infecie semnific cronicizare. AgHBe: - se evideniaz nc din perioada de incubaie, imediat dup apariia AgHBs; - dispare n convalescen odat cu apariia anticorpilor antiHBe; - detectarea lui indic infectivitatea persoanei. Anticorpi antiHBc: - primii anticorpi produsi, apar odat cu simptomele bolii i persist mai muli ani; - se determin IgM sau Ig totale (IgG+IgM); - detectarea IgM indic replicare viral. Anticorpi antiHBe: apar dup anticorpii antiHBc. Anticorpi antiHBs: - apar la cteva luni sau ani de la infecie, dup anticorpi antiHBe; - detectarea lor indic instalarea imunitii.

Dinamica apariiei markerilor virali n snge Profiluri serologice posibile n hepatita viral B: Prezena AgHBe = infectivitate: - AgHBs + IgM antiHBc = hepatit acut; - AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecie persistent; - AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatit cronic. Prezena Ac anti HBs = vindecare: - Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecie recent, vindecat; - Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru sczut) = infecie n antecedente, vindecat; - Ac anti HBs (fr ali markeri) = imunitate postvaccinal; - Persistena AgHBs dup 6 luni = infecie persistent.

Diagnosticul Hepatitei virale C Hepatita C. Virusul hepatitei virale C (HCV) este denumit i virusul hepatitei non A-B, like-B sau virusul posttransfuzional. Aparine familiei Flaviviridae i se prezint sub forma unei particule cu diametrul de 50-60 nm care conine o anvelop lipidic cu proteine transmembranare i ARN monocatenar. Majoritatea subiecilor infectai cu HCV prezint modificri clinice minime i doar civa necesit spitalizare. Perioada de incubaie este de 3-150 zile (cel mai frecvent fiind de 8 sptmni). Mai mult de 60% din cazurile infectate prezint niveluri uor crescute ale transaminazelor pe o perioad mai mare de un an, iar biopsia hepatic arat n majoritatea cazurilor caracteristici de afectare hepatic, iar n 10% din cazuri ciroz. O variaie marcat ntr-o perioad scurt de timp a nivelului transaminazelor este o trstur a hepatitei C. Debutul formei acute este nespecific i la 25% din cazuri este urmat de icter. Boala nu poate fi difereniat de hepatita B doar prin examen clinic. Virusul este prezent n snge i esuturi, care reprezint principalele elemente de transmitere; transmiterea prin contact sexual i de la mam la copil n timpul sarcinii sunt foarte rare; poate s evolueze ctre hepatit cronic mai frecvent dect hepatita B - 80% din cazuri, aceasta putnd s se complice cu ciroz sau cancer de ficat. Seroconversia este tardiv, prezena anticorpilor fiind caracteristic mai ales perioadei de convalescen i hepatitei cronice. Doar n 55% din cazuri anticorpii apar n prima lun; 15% din cazurile de hepatit C sunt seronegative. De asemenea, exist reacii fals pozitive obinute prin utilizarea truselor ELISA anti-HCV. Cea mai sigur metod de diagnostic este determinarea ARN viral din plasm prin PCR (polymerase chain reaction) la subiecii pozitivi n urma unui test ELISA. n prezent, sngele donatorilor este testat prin ELISA pentru HBV, HCV i HIV. Produs patologic: - snge; - esut hepatic. Examen direct: evidenierea acidului nucleic din snge (viremie) sau din ficat prin PCR. Izolarea nu se practic. Diagnostic serologic: - detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA, metode radioimune, folosind antigene recombinate; - detectarea imunoglobulinelor prin metode Western-blot. Diagnosticul hepatiei virale D Hepatita D. Virusul hepatitei D (HDV) a fost descoperit n 1976 i se mai numete i agentul delta. Este un virus hepatotropic defectiv, ntruct replicarea i infectivitatea sa se realizeaz doar n prezena HBV de care depinde sinteza anvelopei externe. Calea de transmitere este cea parenteral. Infecia cu HDV este acut sau cronic. Exist dou forme de infecie acut: coinfecia cu HBV. Ea se poate asocia cu cazuri de hepatit fulminant. Este sugerat doar de serologie (apariia anticorpilor anti-HDV); suprainfecia cu HDV a unor cazuri de hepatit B cronic; n 80-90% din cazuri se trece la cronicizarea infeciei, cu persistena HDV n ficat. Clasic, se descrie situaia unui purttor cronic de HBV, cu nivele normale ale transaminazelor. Apoi are loc creterea

persistent a acestor enzime cu apariia anticorpilor anti-HDV care persist la un titru ridicat o perioad lung de timp. Infecia cronic are un prognostic prost pentru bolnav. 70-80% din aceste forme evolueaz spre ciroz (15% n mai puin de doi ani). n practic, serologia determin doar IgM anti-HDV. Evoluia favorabil este dat de scderea rapid a titrului de anticorpi. De asemenea, se mai pot determina (mai greu i nu curent) antigenul HDV i ARN viral, utile n cazurile de cronicizare. Produs patologic: - snge; - esut hepatic. Examen direct: - evidenierea virusului n nucleul hepatocitelor prin ME, metode imunohistochimice; - evidenierea ARN-ului viral din snge, dup tratarea serului cu detergeni pentru a ndeprta AgHBs care nvelete virusul. Diagnostic serologic: - evidenierea anticorpilor anti HDV prin ELISA. Diagnosticul hepatitei viral E Hepatita E. Virusul hepatitei E(HEV) a fost descoperit n 1988 i aparine familiei calicivirusurilor. Nu prezint anvelop extern, are dimensiuni de 32-34 nm i conine ARN. A mai fost denumit virusul hepatitei non-A-B A-like, iar anglosaxonii l noteaz Hev. Infecia are o cale de transmitere oro-fecal i se ntlneste n regiuni ale lumii a treia cu condiii precare de igien (Africa de Nord, Orientul Apropiat i Mijlociu). Are o perioad de incubaie de 21-42 de zile, iar boala survine, de obicei, acut i nu se nsoete de icter. Serologia nu este nc aplicabil. Din punct de vedere evolutiv, infecia nu este urmat de portaj cronic. De menionat este ns gravitatea bolii la gravide, mortalitatea cazurilor infectate ajungnd la 20%. n rndul populaiei generale mortalitatea este de 12%. Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinnd forme uoare de boal, cu excepia femeilor gravide la care boala poate avea o evoluie letal. Boala evolueaz epidemic n Asia, n nord-vestul Africii i n Mexic. Foarte rar apare n SUA. Nu s-au descris cazuri la noi n ar. Hepatita F. Hepatita F (hepatita non-A-E) a fost raportat recent n cazuri izolate din Europa de Vest, S.U.A. i India. HFV a fost izolat din fecalele subiecilor infectai, unde apare sub form de particule cu dimensiuni de 27-37 nm care conin o molecul de ADN dublucatenar de aproximativ 20 kb. Acest virus difer substanial de HAV i HEV, ambele alctuite din cte o molecul de ARN monocatenar de 7,5 kb. Nu exist teste serologice pentru diagnosticul hepatitei F, dar el poate fi pus n eviden n urma examinrii prin microscopie electronic a scaunului pacienilor. Sunt suspecte de a prezenta infecia acele cazuri de hepatit a cror etiologie nu poate fi determinat n urma testrii pentru celelalte virusuri. epatita G. Virusul hepatitei G (HGV) a fost descoperit recent i mai este frecvent denumit virusul GB. HGV aparine familiei Flaviviridae i are un genom reprezentat de o

molecul de ARN monocatenar de aproximativ 9,5 kb. Se transmite i are evoluie ca a virusului hepatitic C.

Diagnosticul de laborator n afeciuni respiratorii


Diagnosticul de laborator n grip Gripa este o boal infecioas acut foarte contagioas, obinuit autolimitat, febril, cauzat de virusul gripal. Virusul gripal (Myxovirus influenzae): - aparine familiei Orthomyxoviridae; - are o forma sferic, cu diametrul de 80-120 nm; - conine un lan unic negativ ARN compus din 8 fragmente care codific 10 proteine virale; - fragmentele de ARN au un nveli proteic comun, constituit dintr-o membran lipidic, care le unete formnd nucleoproteidul (antigen-S), care determin tipul virusului (A, B sau C); - la suprafaa virusului se afl structurile superficiale: hemaglutinina (hemaglutinina asigura capacitatea virusului de a se uni cu celula receptor) i neuraminidaza (rspunde de capacitatea particulei virale de a ptrunde n celula gazd i de a iei din celul dup multiplicare); - structurile superficiale (hemaglutinina i neuraminidaza) au specificitate de subtip i de tulpin; determin diferitele tulpini ale unui tip de virus. Exist 16 subtipuri antigenice ale hemaglutininei (H1-H16) i 9 ale neuraminidazei (N1-N9). Virusul gripal A: - produce mbolnvirea de gravitate medie sau mare; - infecteaz att omul ct i unele animale domestice (calul, porcul, psrile); - este responsabil de apariia pandemiilor i a epidemiilor extinse; - prezint o multitudine de subtipuri ale gripei A, clasificate dup antigenii superficiali (16 tipuri de hemaglutinin i 9 tipuri de neuraminidaz). Virusul gripal B: - este capabil s i modifice structura antigenic; - este prezent numai la om i are manifestri epidemice moderate, cu o evoluie lent. Virusul gripei C: - este destul de puin studiat; - conine doar 7 fragmente de acid ribonucleic i un antigen superficial; - infecteaz doar omul; - simptomele bolii sunt foarte uoare sau nu se manifest deloc; - nu produce epidemii i nu duce la urmri serioase; - este cauza unor mbolnviri sporadice, n special, la copii; - structura antigenului nu este supus unor transformri ca la virusul gripei A. Variaia antigenic este particularitatea fundamental a virusurilor gripale A si B. Aceasta are loc la nivelul antigenilor superficiali ai virusului (hemaglutinina i neuraminidaza). Exist dou mecanisme ale variaiei antigenice: minor (antigenic drift) i major (antigenic shift). La virusul gripal A se ntlnesc ambele variaii antigenice, n timp ce la virusul B se manifest numai variaia antigenic minor.

Evoluia gripei este endemic, cu manifestri epidemice la interval de 2-3 ani pentru virusul de tip A i 4-6 ani pentru virusul de tip B. Pandemiile care apar datorit unor tulpini complet noi a virusului, provenite, de obicei, din Extremul Orient, intervin la 1020 ani. Gripa prezint periodicitate sezonier, cazurile aprnd n sezonul rece, de obicei, iarna-primvara: incubaia: 18-36-72 de ore; debutul este brusc, uneori brutal cu frisoane, febr 39-40C, mialgii, cefalee, astenie; perioada de stare este dominat de semne toxice generale; sunt prezente: - febra nalt 3-5 zile, faciesul uor congestionat, cefalee, dureri n globii oculari, mialgii, astenie marcat, tulburri de somn, apatie, iritabilitate; - manifestri respiratorii: catar nazal, enantem difuz, durere sau arsur retrosternal (traheite), tuse uscat; - manifestri viscerale diverse: cardiovasculare, digestive; perioada de convalescen n care persist manifestri ca astenie, subfebrilitate, tuse, irascibilitate. Diagnosticul virusologic este necesar n cazul unei epidemii ntr-o colectivitate (institut) sau cnd rezultatul poate influena decizia terapeutic. Produs patologic: - secreie faringian, nazal sau nazofaringian; - lichid de spltur nazofaringian; - aspirat bronic; - esut pulmonar - diagnostic postmortem; - snge: Examen direct: - evidenierea antigenelor virale: prin RIF, ELISA (RHA-HAI); - se pot diferenia tipurile A si B prin metode rapide (15-30 minute) imunocromatografice; - rezultatele negative se verific prin metoda de cultivare; - evidenierea acizilor nucleici virali RT - PCR. Izolare i identificare: Izolarea virusului este singura metod care permite caracterizarea specific a subtipurilor circulante. cultivare pe OGE - inoculare intra-amniotic: se determin prezena hemaglutininelor (hemadsorbie); cultivare pe culturi de celule: - efect citopatogen discret; - replicarea viral se evideniaz prin hemadsorbie; - RIF - difereniaz tipurile A i B. Diagnostic serologic: - evidenierea seroconversiei: RFC; - reacia de hemaglutinoinhibare. Diagnosticul de laborator n infeciile cauzate de rhinovirusuri Rhinovirusuri sunt ageni etiologici ai rcelii comune.

Produs patologic: - lichidul de spltur nazal - recoltat n perioada de nceput a bolii, cnd excreia viral este maxim. Examen direct: - detectarea antigenelor virale n lichidul de spltur nazal - reacia ELISA. Izolarea i identificarea: - linii celulare HeLa sau culturi de fibroblati umani; - efectul citopatic - rotunjirea celulelor. Diagnostic serologic: - detectarea anticorpilor prin: - reacia de virus-neutralizare; - reacia ELISA. Diagnosticul de laborator n infeciile cauzate de virusul sinciial respirator (VSR) virusul sinciial respirator face parte din familia Paramyxoviridae; afecteaz persoane de toate vrstele, n special copii pn la 2-3 an; produce epidemii iarna; cel mai frecvent determin: - simptome asemntoare rcelii; - pneumonie; - broniolit (grav la pacieni imunodeprimai). Produs patologic: - lichid de spltur nazofaringian; - snge. Examen direct: - evidenierea antigenelor virale prin RIF, ELISA; - evidenierea ARN prin RT-PCR. Izolare i identificare: - cultivare pe linie HeLa sau HEp-2 - evidenierea efectului citopatogen. Diagnostic serologic: - evidenierea seroconversiei: RFC, ELISA. Diagnosticul de laborator n infeciile cauzate de adenovirusuri determin apariia unor infecii cu localizri multiple: - infecii respiratorii inferioare i superioare; - conjunctivit; - cistit hemoragic; - gastroenterite; - infecii la pacieni cu transplant de organe. Produs patologic: - exsudat faringian, nazal, nazofaringian; - sput; - secreie conjunctival; - urin;

- materii fecale; - snge. Diagnostic direct: detectarea antigenelor virale prin RIF Izolare i identificare: - linii celulare: efect citopatogen (aglomerarea celulelor n ciorchine), incluzii nucleare; - unele adenovirusuri enterice nu sunt cultivabile: Diagnostic serologic: determinarea seroconversiei: - RFC - detecteaz anticorpi specifici de grup; - RHAI - anticorpi specifici de tip.

Diagnosticul de laborator n infecia HIV


HIV reprezint prescurtarea n limba englez a Human Immunodeficiency Virus (Virusul Imunodeficienei Umane). Aceste virusuri fac parte din categoria retrovirusurilor. Virusurile HIV se mpart n dou grupe: - grupa HIV-1 care cuprinde trei subtipuri M, N i O. Virusurile din subtipul M, cu rspdirea cea mai larg n lume, se mparte la rndul lui n subtipurile A i B. Subtipul B este cel mai rspndit n Europa de vest i n America de Nord; - grupa HIV-2 se mparte la rndul su n subtipuri. Cele mai frecvente sunt subtipurile A i B. Aceast subgrup este prezent preponderent n Africa de vest, dar care se rspndete ns i n Europa; 15% din persoanele nou infectate n Portugalia n 2005 au fost infectate cu virusul HIV-2. HIV-1 i HIV-2 se aseamn din punct de vedere al evoluiei i simptomelor clinice a infeciei. Evoluia HIV-2 se pare c este mai lent dect HIV-1. Ambele virsuri au aceeai prezentare sub microscopul electronic, dar se deosebesc prin greutatea molecular a proteinelor i ordinea genelor. Contaminarea Virusul HIV (HIV) se transmite prin snge, sperm, secreii genitale, lichid cefalorahidian (LCR) i lapte matern. Porile de intrare cele mai frecvente sunt rnile proaspete, sngernde din mucoas (ocular, bucal, vaginal, anal) sau rnile nevindecate sau insuficient protejate de pe oricare parte a pielii corpului. Cile de transmitere: - vaginale sau anale datorate nefolosirii prezervativelor i practicii sexuale orale; - intravenoase prin folosirea n comun de toxicomani a acelor de sering; - transfuzii de snge i produse preparate din snge; - intrauterine sau la natere n timpul travaliului, cnd HIV se poate transmite de la mam la ft (n 10-30% din cazuri); - prin nepturi, tieturi sau contactul direct pe pielea lezat, neprotejat corespunztor n cazul personalului sanitar care poate veni n contact cu secreiile i sngele pacientului infectat. Structur i funcionare - HIV este un retrovirus circular, cu diametrul este de 100-200 nm, din specia lentivirusurilor;

10

- este nconjurat de un nveli lipoproteic, care se formeaz din membrana celulei gazd, avnd i o parte din proteinele membranare ale celulei gazd (molecule HLA I i II i proteine de adeziune, de legare); - prezint sub nveli circa 72-100 de complexe glicoproteice, formate dintr-o parte extern (gp 120 cu rol de legare de receptorii CD4 ai celulei int) i o parte transmembranar de nveli (gp41); - genomul virusului HI este mai complex dect cel a altor retrovirusuri, fiind constituit din 2 lanuri scurte de ARN, compuse din 9200 nucleotide precum i enzime virale, clasificate astfel: proteine structurale/enzime virale (produii genelor Gag, Pol, Env): revers-transcriptaza, proteaza, ribonucleaza i integraza, toate ncapsulate ntr-o anvelop lipidic, care conine antigenul Gp120 cu rol foarte important n legarea de CD4 a genomului HIV; proteine reglatoare: Tat i Rev (HIV) i Tax/Rex (HTLV) care moduleaz transcripia i sunt eseniale pentru propagarea virusului i proteine auxiliare: Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Nef, unele cu rol nc neelucidat; - ARN-ul viral se afl n interiorul a dou capside alturi de enzime; - nu este vizibil sub microscopul electronic din cauza diametrului foarte mic; - infeciile cu acest tip de virus decurg de regul cronic, cu o perioad lung de laten, afectnd i sistemul nervos.

Imaginea virusului HI Stadii n evoluia infeciei cu HIV: - stadiul I: infecie lipsit de simptomatologie sau cu simptome ce pot fi ntlnite i n alte afeciuni infecioase sau neinfecioase: dureri de cap, dureri musculare i articulare, febr, greuri, scderea poftei de mncare, umflarea ganglionilor (simetric); - stadiul II: infecie asimptomatic cu excepia umflrii ganglionilor; - stadiul III: apar simptome ce reflect prezena unor infecii fr gravitate: dureri de cap, febr, transpiraii nocturne, oboseal cronic, diaree, afeciuni ale pielii, leziuni ale mucoasei bucale; - stadiul IV: infecie simptomatic: boli gastrointestinale, boli pulmonare, boli neurologice;

11

- stadiul V: pierdere de greutate, debilitate pronunat, afectarea sistemului nervos central. O infectare cu HIV-1 i HIV-2 duce dup o perioad lung de incubare, de ani, chiar zeci de ani, la declanarea bolii SIDA (sindromul imunodeficienei dobndite) letal. Diagnosticul de laborator n infecia HIV Produs patologic: snge (pentru examen direct i serologic): - ser; - plasm pe EDTA; - snge integral; secreii genitale, saliv, urin, LCR, lapte de mam, unde poate fi identificat HIV; lapte de mam i saliv, unde pot fi gsii anticorpii specifici. n cursul diagnosticului infeciei cu HIV se evideniaz: - antigene virale; - ARN viral, ADN proviral; - anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope. Dinamica producerii markerilor virali Antigenul p24: - se gsete n serul persoanei infectate; - detectabil n infeciile recente, nainte de apariia anticorpilor; - dispar dup apariia anticorpilor anti p24; - reapar n stadiile tardive de boal (SIDA), semnificnd replicare viral intens i un prognostic grav. Anticorpii anti p24: - apar la 3-12 sptmni de la infecie. Perioada de la infecie pn la apariia lor se numete fereastr imunologic. Anticorpii anti gp120: - nu au rol protector; - sunt folosii ca marker de diagnostic.

Dinamica producerii markerilor virali Diagnostic

12

Diagnosticarea infectrii cu virusul HI se mparte n depistare i confirmare. Scopul depistrii este descoperirea tuturor persoanelor seropozitive, cu riscul de a depista n aceast prim faz i fali seropozitivi. Din cauza posibiltii unui test fals pozitiv, se recurge la confirmarea seropozitivitii, testare care se supune unei stricte confidenialiti medicale pentru protejarea sferei de intimitate a celui posibil seropozitiv. Acest proces de secretizare a identitii celui testat este reglementat n Romnia prin lege. Confirmarea infectrii cu HIV se face n laboratoare specializate. Protocolul standard de diagnostic: se evideniaz anticorpii prin metoda ELISA, prima etap de diagnostic a infeciei HIV (screening), avnd sensibilitate de aproape 100% i specificitatea de 99,5%: - generaia I: se folosete lizatul total viral de pe culturi de limfocite (whole virus); - generaia II: se folosesc antigene clonale; - generaia III: se folosesc antigene recombinate; - generaia IV: metode combinate care testeaz simultan prezena anticorpilor anti HIV i a antigenului P24; Metodele de generaie III i IV au sensibilitate i specificitate ridicate, dar este posibil i apariia unor rezultate false: - fals negative [fereastra imunologic, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) i subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M)]; - fals pozitive (probe de snge alterate, incorect etichetate sau schimbate, greeli de laborator, contaminarea probelor). Rezultatul pozitiv al testrii ELISA se raporteaz ca ser reactiv i nu confirm diagnosticul pozitiv de infecie HIV. n cazul pozitivrii se face o retestare printr-o metod cel puin la fel de sensibil din aceeai prob de snge (determinare ELISA la centre de referin). Dup retestare, probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot: se detecteaz proteinele specifice virale: - glicoproteine de nveli (env): gp41, gp120, gp160; - proteine nucleare (gag): p18, p24/25, p55; - endonucleaze-polimeraze (pol): p34, p40, p52, p68; se consider pozitive probele care prezint: - 2 benzi pentru antigene din grupul env (dup World Health Organization WHO); - 1 band (glicoprotein) + 1 band (alt protein specific HIV) (dup Deutsches Institut fr Normung - DIN); - benzi pentru P24, p34, gp41, gp120/160 (dup Food and Drug Administration).

13

Testul Western-Blot are o senzitivitate de 99,9996% ceea ce nseamn c doar 0,0004% primesc un rezultat pozitiv fals, motiv pentru care este indicat pentru confirmarea seropozitivitii HIV. Testul Western Bolt determin mai muli anticorpi din snge care s-au format contra anumitor componente proteice, fiind adresat anticorpilor este ns i el aplicabil doar dup 12 sptmni de la expunere; testul ELISA determin masa general de anticorpi HIV-1, HIV-2. Teste rapide de diagnostic (point-of-care, bedside tests): Se bazeaz pe 4 principii: aglutinare, immunodot, imunofiltrare sau imunocromatografie. Se pot efectua din snge capilar/venos. Rezultatele se obin n 15-30 min. Testele OraQuick, Reveal, UniGold Recombigen au specificitate i sensibilitate nalte. Diagnostic direct: nu se face de rutin; detectarea AN virali: ADN proviral din limfocite sau ARN viral; reprezint marker de infecie; se folosete n situaii speciale: - calitativ: suspiciune de infecie primar, cnd Ac lipsesc (fereastra imunologic); nou nscut din mam infectat cu serologie pozitiv (Ac materni); - cantitativ (ncrctura viral): marker de prognostic; monitorizarea tratamentului. Nu se folosete ca metod de diagnostic PCR (polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction). Izolarea virusului: - rezervat pentru cazuri speciale, se face n laboratoare specializate; - pe culturi de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinin, n prezena interleukinelor; - efect citopatogen n 2-3 sptmni.

14

Protocol de diagnostic i management n cazul infeciei HIV

15

Diagnosticul de laborator al infeciilor cauzate de genul: Neisseria, Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Bacillus, Clostridium, Treponema
Diagnosticul de laborator n infecii cauzate de germenii din genul Pseudomonas Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind reprezentat de Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic/"bacilul puroiului albastru"). Sunt bacili Gram - negativi, aerobi, oxidaz pozitivi, nesporulai, mobili (cu unu sau mai muli cili polari). Pseudomonas aeruginos, poate produce diferite infecii grave (tegumentare superficiale sau profunde, sepsis cu evoluie grav etc.). Infecteaz persoanele care prezint arsuri. Poate fi implicat n diferite infecii de spital. P. aeruginosa este izolat de la pacienii cu fibroz chistic. Pseudomonas aeruginosa face parte din categoria germenilor de spital, determinnd infecii nozocomiale, ceea ce implic recoltarea de probe de pe instrumente, instalaii sanitare, soluii medicamentoase i dezinfectante. Diagnosticul de laborator n infeciile supurative ale tegumentelor este un diagnostic bacteriologic, direct. Produse patologice: - exsudate purulente, puroi din plgi, arsuri suprainfectate, leziuni necrotice cutanate; - secreii nasofaringiene, sput; - urin; - materii fecale, bil; - snge; - LCR; - secreii vaginale; - secreii conjunctivale. Recoltarea i transportul p.p. (puroi) respect recomandrile cunoscute. Examen direct: - macroscopic al p.p. poate evidenia un aspect sugestiv (culoare albastr/galbenverzui fluorescent). Puroiul poate degaj un miros caracteristic aromat; - microscopic se practic doar din produse biologice n mod normal sterile din care se realizeaz cel puin 2 frotiuri (colorate cu A.M. i Gram). Se observ prezena celulelor inflamatorii (PMN) i a bacililor Gram negativi, subiri, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai, cu un cil polar, necapsulai, nesporulai. Cultura. Cultivarea se poate face pe medii de cultur obinuite i diferniale (bulion, geloz simpl, geloz snge, medii selective i difereniale pentru enterobacterii: Leifson), timp de 18-24 ore. Bacilul piocianic se poate multiplica la temperaturi care variaz ntre 5-42C, ns dezvoltarea optim este la 30-37oC. Pentru p.p. contaminate se recomand utilizarea unor medii de cultur selective. Se formeaz colonii de tip S care se pigmenteaz, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). Cultura poate avea un miros asemntor florilor de tei. Identificarea microorganismului se bazeaz pe caracterele: - morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai, relativ polimorfi. n culturi mai vechi pot aprea diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspt, ntre lam i lamel.

- de cultur: n mediu lichid - tulbur uniform mediul, formeaz o pelicul la suprafa (strict aerob) sub care se acumuleaz pigment; pe mediu solid - colonii de tip S, lactozo - negative, uneori cu luciu metalic. Pe msur ce cultura mbtrnete, coloniile devin de tip R, se produce un pigment verzui difuzibil.Pe geloz snge - se dezvolt colonii cenuii, unele produc hemoliz beta; - biochimice: bacteriile din genul Pseudomonas sunt oxidaz pozitive; - pe geloz lactozat nu fermenteaz lactoza; - lichefiaz mediul Loffler (produce proteoliz); - pe geloz snge - hemoliz beta; - produc colonii de tip S pigmentate (se remarc i pigmentarea mediului, albastru sau galben-verde fluorescent). Pigmenii sunt: piocianina, specific, verde albstrui, solubil n cloroform; pioverdina (fluorescein), galben - verzuie, solubil n ap. Tipizare: lizotipie este util n scop epidemiologic pentru stabilirea sursei unei infecii nozocomiale; piocinotipie se folosete pentru identificare pe baza tipizrii piocianinei, care este specific fiecrui tip. Antibiograma este obligatorie, multe tulpini de Pseudomonas prezentnd rezisten multipl la antibiotice. Antibiograma se realizeaz, de obicei, prin metode difuzimetrice. Diagnosticul de laborator al holerei: genul Vibrio Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscut specie este Vibrio cholerae. Bacteria Vibrio cholerae este considerat potenial periculoas i letal de aceea se impune respectarea riguroas a msurilor de protecia a muncii. Vibrio cholerae (vibrionul holeric) este un germen mobil, aerob sau facultativ anaerob, oxidaz pozitiv, rezistent la pH alcalin i sruri biliare. Produce toxina holeric i respectiv holera. Diagnosticul este bacteriologic, direct i trebuie realizat urgent. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile impuse. Se recolteaz materii fecale sau/i lichid de vrstur. Dac nu se poate ajunge la laborator n 1-3 ore este necesar s se foloseasc mediul de transport Cary-Blair. Apa peptonat alcalin (pH 9-9,5) poate fi utilizat ca mediu de transport, dar i ca mediu de mbogire. Produsele patologice mai pot fi reprezentate de probe de ap i de alimente. Examen direct: - macroscopic: scaun apos, cu coninut fecaloid minim, aspect riziform. Materiile fecale au culoare verzuie, miros fetid, conin mucus; - microscopic. Pentru examenul microscopic al p.p. se face un preparat ntre lam i lamel (nu frotiuri). Se utilizm obiectivul 40x. Nu se evideniaz PMN. Exist vibrioni care prezint micri active. Prin coloraie Gram se observ bacili Gram negativi, subiri, ncurbai, sub form de virgul, care prezint un cil la un capt, necapsulai, nesporulai. Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat se efectueaz un preparat nativ. Sunt germeni foarte mobili. Testul de imobilizare se efectueaz cu ser imun anti-O1, antiO:139. Imobilizarea germenilor din preparat ridic suspiciunea prezenei vibrionului n preparat. Cultura. Se cultiv (direct sau dup transport) n ap peptonat alcalin (APA). Dup 6-

8 ore la 35-37C, se trece pe un mediu selectiv, cu sruri biliare [TCBS (tiosulfat, citrat, bil, zaharoz) i/sau BSA (bile salt, agar)], prelevnd de la suprafaa mediului lichid (unde ar putea s apar un vl"). Dac se examineaz microscopic (ntre lam i lamel) coninutul vlului" se poate grbi diagnosticul. Se poate cultiva i pe mediu gelozsnge. Identificarea se face pe baza caracterelor: - morfotinctoriale: bacili gram-negativi; - de cultur: n mediu lichid crete foarte rapid i formeaz un vl la suprafa, mediul rmne clar; pe mediul TCBS produc colonii de tip S, galbene, mari de 2-4 mm; pe mediul BSA se formneaz colonii de tip S, rotunde, strlucitoare, transparente ca picturile de rou; pe geloz snge cresc colonii de tip S, mici, mate, alb-cenuii, nehemolitice; - biochimice: germeni oxidaz pozitivi; - alte teste biochimice se pot efectua n laboratorul de referin; - antigenice: se utilizeaz ser anti-holeric O:1 (reacii de aglutinare pe lam). n laboratorul de referin se confirm reacia pozitiv i se identific serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima); dac rezultatele sunt negative se folosete i serul anti-holeric O:139; Testarea sensibilitii la bacteriofagi se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare (n laboratorul de referin). Identificare antigenic se face pe baza antigenului O (O:1, O:139). Diagnosticul definitiv se confirm n laboratoare de referin. Antibiograma se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, pentru supravegherea apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul Neisseria Familia Neisseriaceae include mai multe genuri. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de meningococ (Neisseria meningitidis) i gonococ (Neisseria gonorrhoeae) Bacteriile din genul Neisseria sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structura capsular comun. In funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri. Sunt oxidaz pozitivi. Sunt germeni pretenioi. Au nevoie de CO2. Diagnosticul n meningit meningococic Diagnosticul include elemente clinice, ntr-un context epidemiologie. Pentru stabilirea etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct) i urgent. Este recomandat ca primele etape s fie efectuate la patul bolnavului. Recoltarea p.p. (LCR, puncie dup realizarea examenului fundului de ochi") ar trebui realizat la patul bolnavului, unde se repartiz o cantitate de LCR pentru examenul citologic i biochimic, restul pentru frotiuri i culturi. Dac transportul este inevitabil, trebuie efectuat fr ntrziere i nu la temperaturi sczute ci aproape de temperatura corpului. Meningococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc.

Examinarea microscopic a p.p. permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) i a cocilor gram-negativi, dispui n diplo, capsulai, situai intra sau extraleucocitar. Cultura. Cultivarea se face pe medii complexe, n atmosfer de 3-5% CO2 la 37C. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor: - morfotinctoriale: coci gram-negativi, n diplo, reniformi; - de cultur: colonii de tip S, 1-2 mm; pot fi i de tip M; - biochimice: metabolizeaz diferite glucide (glucoz i maltoz) i produc citocromoxidaz (testul oxidazei este test cheie n identificare); - antigenice: se poate identifica serogrupa (pot aparine grupului A, B, C, Y sau W135). Antibiograma este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Diagnosticul de laborator n gonoree La brbai apare uretrita gonococic. La femei, gonoreea se localizeaz endocervical. La nou-nscutul care se nate pe cale natural din mam cu gonoree, poate s apar oftalmia gonococic. Gonococul poate disemina cu apariia unor leziuni la distan. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct). Recoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute. La brbat se recolteaz secreia uretral iar la femeie recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul colului uterin. Secreiile au, de obicei, un aspect purulent. Este de preferat cultivarea foarte rapid, pe medii de cultur complexe (n atmosfer de CO2). Transportul trebuie realizat foarte rapid n medii de transport (Amies plus crbune activat). Examen microscopic al p.p. pune diagnosticul. Se noteaz prezena celulelor, celulelor inflamatorii (leucocite) i a cocilor gram-negativi (n diplo, situai intra sau extraleucocitar). Cultura. Cultivarea se face pe medii selective (medii cu vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) dac p.p. este contaminat. Se recomand cultivarea att pe medii selective, ct i pe medii neselective, n atmosfer de 3-10% CO2, la 35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Sunt colonii de tip S, de 0,5-1 mm, sau colonii de tip M. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor: - morfotinctoriale: coci gram-negativi, n diplo, eventual nconjurai de o structur capsular comun; - de cultur: coloniile sunt de tip S sau M; - biochimice: metabolizeaz diferite glucide (glucoza) i produc citocrom-oxidaz (testul oxidazei este testul cheie n identificare); testul catalazei este intens pozitiv; - antigenice; - altor caractere (studiate prin metode ale biologiei moleculare). Antibiograma este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Este necesar testarea producerii de 3-lactamaz. Diagnosticul de laborator al infeciei crbunoase: Bacillus anthracis Produse patologice: - n crbunele cutanat - exsudat din pustula malign; - n crbunele intestinal - materii fecale; - n crbunele pulmonar - sput;

- n formele septicemice - snge; - pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe. Examen direct: - frotiu Gram; - bacili Gram pozitivi, cu capetele retezate sau uor concave, asezai n lanuri, cu aspect ce imit trestia de bambus; - prezint un spor central; - n produsul patologic prezint capsul. Izolare: germene nepretenios, poate fi cultivat pe: - bulion; - geloz simpl; - geloz snge. Identificarea se face pe baza caracterelor: - morfotinctoriale: sunt bacili Gram pozitivi, mari (3-5 m lungime/1-1,2 m grosime), cu capetele tiate drept sau uor concave, imobili. Pe frotiurile din esuturile animalelor bolnave apar dispui n lanuri scurte sau n perechi nconjurai de o capsul unic. Pe frotiurile din cultur bacilii sunt dispui n lanuri paralele i sunt sporulai. Sporul, format numai n prezena oxigenului, are diametrul egal sau mai mic dect grosimea bacilului, este oval i este dispus central; - de cultur: este o bacterie aerob facultativ anaerob, nepretenioas nutritiv, se dezvolt pe medii simple, la 35-37C. Limitele de temperatur la care se poate dezvolta sunt foarte largi: 12-40C. Sporularea are loc la temperature camerei. n mediu lichid formeaz un depozit floconos, mediul rmne clar; pe medii solide se formeaz colonii de tip R cu suprafaa rugoas, centrul ombilicat, margini dantelate cu prelungiri laterale (cap de Medus); n geloz dreapt apar creste sub forma unui brad inversat. Pe geloza snge nu produce hemoliz; - biochimice: este o bacterie catalaz pozitiv. Are activitate proteolitic, lichefiaz gelatina, dar nu produce ureaz. Fermenteaz unele zaharuri (glucoza, maltoza, zaharoza). Produce acetil-metil-carbinol (reacia Vogues-Proskauer pozitiv) proprietate util n clasificarea speciilor de Bacillus. Reduce nitraii, hidrolizeaz cazeina, este indol negativ. Diagnostic diferenial fa de ali germeni din genul Bacillus (B. cereus): - sensibilitatea la penicilin: B. anthracis este sensibil, B. cereus este rezistent; - hemoliza: B. anthracis nu produce hemoliz, B. cereus produce hemoliz; - sensibilitatea fa de bacteriofagi. Diagnostic retrospectiv: - reacia Ascoli. Prin reacia Ascoli sau prin tehnici imunoenzimatice se poate identifica antigenul polizaharidic termostabil n extracte tisulare; - reacie de precipitare inelar; - evideniaz prezena antigenelor n fragmente de organe recoltate de la cadavre. Diagnosticul serologic const n demonstrarea anticorpilor prin metoda fluorescent direct, este posibil dar nu este util.

Diagnosticul de laborator al infeciei cu bacterii din genul Clostridium Genul Clostridium include mai multe specii care se gsesc n intestinul animalelor de unde sunt eliminate n mediul extern prin materii fecale i sporuleaz. Sporii rezist pe sol timp ndelungat i sunt termorezisteni. Sunt bacili gram pozitivi, anaerobi, sporulai, de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi (Clostridium perfringens este capsulat). Clostridium tetani sintetizeaz toxina tetanic i produce tetanos descendent la om. Toxina blocheaz eliberarea unor mediatori cu rol inhibitor, neuronii motori spinali rmn n stare de excitaie rezultnd contracturi/spasme (paralizie spastic). Afecteaz musculatura feei - risus sardonicus, musculatura membrelor, musculatura coloanei vertebrale - opistotonus. Orice stimul extern poate determina atacul de tetanos. Moartea se poate poate produce prin asfixie, paralizia musculaturii respiratorii. Mortalitatea este de circa 50%. Produse patologice: - fragmente bioptice din plgi contaminate; - probe de pmnt, de metal; - materii fecale; - medicamente injectabile; - cat-gut. Clostridium botulinum sintetizeaz toxina botulinic (exist 8 tipuri de toxin). Cel mai frecvent determin toxiinfecii alimentare de tip toxic (toxina se afl, deja, n aliment). Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, prin circulaie ajunge la nivelul plcilor neuromusculare i mpiedic eliberarea de acetilcolin (paralizie flasc). Botulismul debuteaz cu afectarea globilor oculari, ptoz palpebral; evoluie este descendent; decesul survine prin paralizia musculaturii respiratorii. Produse patologice: - ser; - probe de alimente; - urin; - materii fecale; - fragmente de organe. Clostridium perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. pot produce, n asociere, gangrena gazoas. Sporii ajung n esuturi dup traumatisme deschise i dac se creeaz condiii de anaerobioz germineaz, formele vegetative se multiplic, sintetizeaz toxine histotrope, fermenteaz zaharuri (cu producere de gaz). Apar edeme, senzaia prezenei de gaz, necroz. n 20-80% din cazuri evoluia este grav, spre deces. Clostridium perfringens este implicat n toxiinfecii alimentare, produce o toxin, altereaz epiteliul intestinal i produce diaree apoas. Produse patologice: - ser; - probe de alimente; - materii fecale. Examen microscopic are rol orientativ i poate servi la alegerea terapiei antimicrobiene. Germenii sunt bacili G+, sporulai.

Cultura. Pentru culitivarea clostridiilor este obligatorie asigurarea condiiilor de anaerobioz prin: - metode fizice - anaerostat; - metode chimice - hrtie de filtru mbibat cu pirogalol (se lipeste n interiorul cutiei Petri, absoarbe oxigenul); - metode biologice - cultivare pe aceeai cutie Petri i germeni aerobi i anaerobi. Cultivarea se face pe mediu Schaedler - geloz snge glucozat,pe geloz simpl sau pe bulion VF plus neomicin. Incubarea se face n aerobioz i anaerobioz i se evalueaz n funcie de apariia coloniilor dac sunt germeni aerobi sau anaerobi. Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore, la 35-37C. Identificarea se face pe baza: caracterelor morfotinctoriale: Specia Coloraie Cili Capsul Spori Forma celulei C. tetani Bacili Gram + Peritrichi Spor rotund + (terminal) C. botulinum Bacili Gram + Peritrichi Spor oval + (subterminal) C. perfringens Bacili Gram + + Spor oval + (subterminal) caracterelor de cultur: Specia Geloz dreapt Schaedler C. tetani Colonii pufoase Colonii tip R C. botulinum Colonii cu centrul transparent Colonii tip R C. perfringens Colonii lenticulare Colonii tip R Speciile mobile (majoritatea) formeaz colonii de tip S, cu margini ondulate i tendin de invadare a mediului; dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos; Clostridium perfringens (imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea i aspect R); caracterelor biochimice: - produc hemoliz pe mediu Schaedler; - unele tulpini sintetizeaz lecitinaz. Pentru acestea se pot verifica mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia crnii; - mirosul este caracteristic: - de corn ars - C. tetani; - de rnced - C. botulinum; - de acid butiric - C. perfringens. Costridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la colistin. Caractere antigenice: - se demonstreaz prezena tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci; - se testeaz prezena anti-toxinei tetanice (titrul protectiv >0,01UAI/ml); - se demonstreaz prezena toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de cultur [se preleveaz cultur din bulion VF, se centrifugeaz i supernatantul se mparte n 2 tuburi; un tub se nclzete la 100C; se rcete; se inoculeaz intraperitoneal la dou loturi de oareci; dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba

de toxina botulinic (pentru c toxina botulinic este termosensibil)]; prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (se protejeaz un oarece cu antitoxin de tip A i un alt oarece cu anti-toxin de tip B, apoi se injecteaz cu p.p.; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieuiete, iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A). Boala experimental C. tetani inoculat la cobai/oareci pe cale subcutanat determin paralizie spastic; C. botulinum inoculat la: - oareci conduce la paralizia flasc a trenului posterior; - cobai produce paralizia mm. abdominali; - pisic determin diaree, tulburri de acomodare. Antibiograma nu se recomand, n infeciile cu bacili Gram-pozitivi sporulai (lucrurile difer n cazul germenilor anaerobi Gram-negativi). Clostridiile sunt sensibile la penicilin, cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc., ns tratamentul este mai complex. Diagnosticul de laborator n infecii cauzate de Acinetobacter Genul Acinetobacter cuprinde 19 specii dintre care, mai frecvent implicate n patologia uman sunt speciile: - Acinetobacter baumannii; - Acinetobacter lwoffi; - Acinetobacter calcoaceticus; - Acinetobacter haemolyticus; - Acinetobacter junii. Sunt cocobacililor Gram negativi nefermentativi, aerobi, catalaz pozitivi, oxidaz negativi, nepigmentogeni. Bacteriile din genul Acinetobacter sunt larg rspndit n mediu, colonizeaz mucoasele, fiind germeni cu potenial nosocomial cu rezisten natural fa de multe antibiotice. Tratamentele antibiotice prelungite favorizeaz apariia infeciilor. Patogenie la om: Cele mai frecvente entiti clinice avnd ca etiologie specii de Acinetobacter sunt: - infecii respiratorii, - infecii ale plgilor i arsurilor, - bacteriemii; - infecii de cateter; - meningite; - infecii ale tractului urinar; - endocardite la cei cu proteze valvulare; - peritonit la cei cu dializ peritoneal; - infecii oculare. Produse patologice: - sput; - aspirat bronic; - puroi;

- urin; - snge; - LCR; - catetere: Examen direct: - microscopic: bacili pleomorfi, scuri, groi, pn la cocoizi, Gram negativi, adesea dispui n perechi. Pe acelai frotiu se pot ntlni forme cocoide i forme filamentoase cu o lungime de cteva zeci de micrometri. Sunt germeni imobili, frecvent capsulai. Cultura. Crete pe medii uzuale, geloz simpl, geloz snge, MacConkey, fiind un germen nepretenios. n funcie de specie cresc la temperaturi cuprinse ntre 10-35oC. Identificarea se bsazeaz pe caracterele: - morfotinctoriale: sunt bacili pleomorfi, scuri, groi, pn la cocoizi, Gram negativi, adesea dispui n perechi. Pe acelai frotiu se pot ntlni forme cocoide i forme filamentoase cu o lungime de cteva zeci de micrometri. Sunt imobili, frecvent capsulai. Pe frotiul colorat Gram adesea pot fi confundai cu Haemophilus influenzae; - de cultur: colonii de tip S, rotunde, netede, convexe, lucioase sau mate, nepigmentate; unele specii produc hemoliz beta pe geloz snge. Este un germen nepretenios, se cultiv pe medii uzuale i crete la temperaturi cuprinse ntre 10-35C, n funcie de specie; - biochimice: nu fermenteaz glucoza (germen nefermentativ), catalaz pozitive, oxidaz negative, lactoz negative, nu reduc nitraii. Identificarea de specie se face pe baza caracterelor de cultivare (temperatura de cretere) i biochimice (acidifierea glucozei, hidroliza gelatinei, hemoliza, auxonograma). Antibiograma este obligatorie. Diagnosticul de laborator al infeciei cu bacterii din genul Treponema (Sifilis) Microorganismele din acest gen sunt bacterii spiralate, subiri, foarte mobile. Sunt strict aerobe sau microaerofile i sunt foarte pretenioase nutritiv. Exist specii patogene i specii care fac parte din flora normal a cavitii bucale i a mucoaselor genitale. Speciile patogene pentru om sunt Treponema pallidum cu trei subspecii: pallidum, agentul etiologic al sifilisului, subspecia endemicum, agentul etiologic al bejelului i subspecia pertenue, agentul etiologic al pianului. Patogenie. Boala la om Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului venerian care se transmite prin contact sexual, direct cu leziunile ulcerative ale persoanei infectate. La gravidele infectate, n perioadele de bacteriemie, T. pallidum trece transplacentar determinnd sifilisul congenital. Sifilisul dobndit poate evolua n mai multe etape: sifilisul primar, secundar, latent i teriar. n 2-10 sptmni de la contactul infectant, la locul inoculrii se formeaz ancrul dur (cu lichid clar, foarte bogat n treponeme). Dup alte 2-10 sptmni apar leziunile secundare (maculopapule roii, localizate la orice nivel, dar i condiloame n diferite regiuni ale corpului. Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice i trebuie confirmat prin metode de laborator; poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Produse patologice: - serozitate din ancrul sifilitic (stadiul I.)

- snge (serologic). Recoltarea i transportul p.p. se face cu mult atenie cu respectarea unor particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar de la nivelul leziunilor primare, de la nivelul leziunilor secundare sau din ganglionii limfatici regionali etc. Produsul patologic se recolteaz cu grij dup ndeprtarea crustelor care acoper leziunea (nu trebuie s producem sngerare). Examen microscopic: se realizeaz preparate microscopice ntre lam i lamel. Examinarea trebuie fcut rapid, n maxim 20 de minute. Aceast etap este deosebit de important. Examen direct microscopic al preparatului nativ se face la microscop cu fond ntunecat. Pentru examenul microscopie pe fond ntunecat (MFI), se pregtesc 2 lame pentru fiecare leziune din care au fost recoltate p.p. Preparatele n ateptare" sunt meninute ntr-o cutie Petri n care exist puin vat umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea. Preparatul trebuie examinat insistent, cel puin 10 minute n cazul unui rezultat aparent negativ. Trebuie s existe antrenament i experien pentru a identifica aspectele caracteristice: microorganisme foarte subiri i lungi, spiralate, luminoase pe fondul negru al cmpului; mobile - deplasarea nu este foarte rapid, seamn cu o micare de nurubare. Rezultatul pozitiv pune diagnosticul de sifilis primar. O problem ar putea fi reprezentat de existena treponemelor saprofite, care microscopic arat foarte asemntor cu Treponema pallidum. EF direct permite diferenierea Treponema pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcai fluorescent. Pot fi realizare i preparate colorate: coloraie Giemsa; coloraie negativ (Burri); impregnare argentic (Fontana-Tribondeau). Rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis; n cazul unui pacient suspect, se repet testul dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni. Se ia n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul treponemic, diagnosticul bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un rezultat pozitiv n condiiile n care toate celelalte date sunt negative este, de obicei, un rezultat fals pozitiv. Pot aprea rezultate fals pozitive la persoane cu hepatit viral acut, pneumonii virale, rujeol, malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoane care se drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reaciile fals pozitive pot aprea i pe parcursul sarcinii. Rezultatul este intens pozitiv atunci cnd sunt vizualizate flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Caractere morfotinctoriale: Treponema pallidum este o bacterie spiralat, cu spire regulate i cu capetele drepte. Este foarte subire i relativ scurt avnd lungimea de 2-20 m i grosimea de 0,1-0,3 m. Este foarte mobil, mobilitatea fiindu-i asigurat prin mai multe fibre axiale periplasmice nfurate n jurul protoplastului i inserate la extremitile cilindrului protoplasmic prin corpii bazali. Micarea caracteristic se observ prin examinarea treponemelor la microscopul cu fond ntunecat unde apar ca spirochete fine, cu 6 - 14 spire regulate (1,1 m lungimea de und i 0,3 m amplitudine) capetele efilate, animate de micri graioase de nurubare, flexie i translaie. Caractere de cultur: Treponema pallidum nu se poate cultiva pe medii de cultur artificiale. Poate fi meninut n via prin inoculri intratesticulare la iepure care dezvolt o orhit sifilitic. n acest mod s-a pstrat n laboratoarele de referin tulpina Nichols de Troponema pallidum obinut n 1912 de la un pacient care a decedat de neurosifilis. Din aceast tulpin se prepar antigenele necesare diagnosticului serologic.

Caractere biochimice: Este un germen microaerofil i pentru c nu poate fi cultivat in vitro caracterele biochimice nu sunt cunoscute. Izolare prin metode biologice: - treponemele patogene nu pot fi cultivate pe medii arificiale; - inoculare intratesticular la iepure - orhit sifilitic. Diagnostic indirect - serologic: reacii serologice clasice: - evidenierea anticorpilor antilipoidici; - antigen folosit: cardiolipina; - reacia de floculare (VDRL); - latexaglutinare (RPR). Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) se realizeaz pe crduri din material plastic (exist mai multe cercuri cu diametrul de 18 mm). Ag este preparat asemntor VDRL (dar nu mai este necesar inactivarea prin cldur); conine i particule de crbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat n cercul de pe crd. Dac exist Ac anti-Treponema pallidum, are loc combinarea cu particulele lipidice din Ag i rezult aglutinarea. Apar granule negre pe fondul alb al crdului; - reacia de fixare a complementului (RFC): - pot apare reacii fals positive; - pentru confirmare, diagnosticul se completeaz cu reacii moderne (specifice). reacii serologice moderne: - evideniaz anticorpii antiproteici; - antigene folosite - antigene treponemice specifice de gen i de specie; reacii cu specificitate de gen: - RFC, care utilizeaz Ag treponemice extrase din T. reiter (specificitate de grup). Mai importante sunt reaciile care utilizeaz Ag treponemice extrase din tulpina Nichols de Treponema. pallidum (au specificitate mare, de tip); - CIEF; Reacii cu specificitate de specie: - FTA - Abs (Fluorescent Treponemal Antibody Absorbtion Test). Testele de imunofluorescen indirect au folosit iniial serul de cercetat diluat 1/5, ulterior diluia a fost de 1/200 (FTA-200). n ultimii 45 de ani s-a utilizat tehnica FTA-Abs, care implica: obinerea din tulpina T. reiter a unui extract Ag, util pentru ndeprtarea Ac care nu sunt specifici pentru T. Pallidum; diluarea serului de la pacient la 1/5; punerea serului n contact cu extractul care conine Ag treponemice de grup/Reiter pentru nlturarea Ac nespecifici; apoi se practic DF). n cazul n care serul de cercetat este pozitiv, treponemele apar fluorescente (galben verzui); - TPHA (reacie de hemaglutinare pasiv); - TIT (testul de imobilizare a treponemelor). Serul de cercetat este diluat i amestecat cu complement i treponeme vii, mobile (obinute din testicul de iepure). Dac n ser exist Ac specifici, treponemele sunt imobilizate (examinarea se face cu MF); - ELISA. Tehnica ELISA (detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum) este util pentru diagnosticul sifilisului congenital. Interpretarea rezultatelor se face n context clinic, epidemiologie i de laborator. Dac att VDRL, ct i FTA dau un rezultat negativ, infecia este, de obicei, exclus. ns, n cazul n care pacientul se afl la debutul bolii iar

Ac nu sunt nedectabili (suspiciunea clinic sau epidemiologic persist), se repet testele dup 3 sptmni. Rezistena fa de agenii fizici, chimici i biologici: Treponema pallidum este distrus de uscciune, de temperaturi de 42C, de sruri de mercur i bismut, de antiseptice, dezinfectante. Este sensibil fa de antibioticele beta-lactamice, n special, fa de penicilin. Treponema pallidum rmne viabil mai muli ani n suspensia pstrat la 70C. Structura antigenic Se difereniaz trei structuri antigenice importante: - antigenul cardiolipinic. Este prezent la toate treponemele dar i la alte bacterii, la unele plante i n esuturile animale, cum ar fi cordul de bou. Acest antigen determin formarea de anticorpi antilipoidici, denumii n trecut i reagine; - antigenul proteic Reiter. Are specificitate de gen i este prezent la toate treponemele, indiferent dac sunt patogene sau nu. mpotriva lui se formeaz anticorpi antiproteici; - antigenul specific numai pentru Treponema pallidum. Fa de acest antigen se formeaz anticorpi antiproteici, antipolizaharidici i imobilizine.

Diagnosticul de laborator al Mycobacterium, Corynebacterium,

infeciilor

cauzate

de

genul

Diagnosticul de laborator n infecii produse de Mycobacterium tuberculosis varianta hominis Genul Mycobacterium include peste 100 de specii i subspecii diferite, dintre care Mycobacterium tuberculosis prezint importan medical. Germenii din genul Mycobacterium sunt bacili care nu cedeaz colorantul nici sub aciunea combinat a acidului diluat i a alcoolului. Din acest motiv se numesc bacilli acido-alcoolorezisteni. Aceast proprietate se datoreaz cantitii mari de lipide i ceruri din peretele bacterian. Mycobacterium tuberculosis produce tuberculoz (TB), care poate avea diferite localizri. Tuberculoza se manifest sub form de: - tuberculoz pulmonar: primoinfecie latent; primoinfecie manifest; forma cavitar comun; pleurezie; forme mediastinale; forme miliare; - tuberculoz extrapulmonar, care este rar i are localizri meningiene, renale, genitale, osoase, articulare, ganglionare sau digestive. Cea mai frecvent ntlnit este TB pulmonar. Epidemiologie: pacienii cu TB pulmonar (elimin prin sput bacili acid/alcool rezisteni/BAAR) i reprezint sursa de infecie. Diagnosticul i tratamentul corect i complet al acestor pacieni sunt eseniale. Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (radiologie) i de alte elemente de laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea i identificarea bacteriei Mycobacterium tuberculosis. Diagnosticul de laborator este esenialmente bacteriologic, direct. Datele obinute n cadrul diagnosticului imunobiologic i serologic pot fi utile i completa informaiile. Produse patologice: - lichid de spltur bronic; - LCR; - urin; - lichide recoltate prin puncie articular, - probe obinute prin biopsie; - puroi; - secreii vaginale; - sput. Recoltarea i transportul p.p. se realizeaz cu respectarea anumitor reguli i a normelor privind protecia personalului medical. n tuberculoza pulmonar se recolteaz sput eliminat dup un puseu de tuse sau la copii recoltat prin spltur gastric. Sputa trebuie decontaminat (prin tratare cu NaOH 4%) i neutralizat (cu acid) n vederea realizrii etapelor urmtoare.

Examen microscopic. Examinarea microscopic a p.p. implic prepararea a minimum 3 frotiuri (colorate A.M., Gram i Ziehl Neelsen). Se observ la microscop prezena macrofage alveolare de la nivelul tractului respirator inferior, prezena celulelor inflamatorii (PMN) i prezena BAAR. BAAR apar ca bacili subiri, drepi, de 0,4/3 m, roii pe fond albastru (celelalte structuri au culoare albastr). Rezultatele examenului microscopic (TQF/Z-N) trebuie s fie cuantificate prin numrul de BAAR n raport cu numrul de cmpuri examinate (10-30 cmpuri n cazul 1F, 100-300 n cazul Z-N). De ex. 1-9 BAAR/10 cmpuri (n IF) sau 1-9 BAAR/100 de cmpuri (Z-N) permite s se noteze n buletinul de analiz 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9 BAAR/1 cmp/Z-N). Acest mod de notare permite compararea rezultatelor ntre laboratoare diferite sau compararea rezultatelor unui bolnav n cursul tratamentului. Examenul microscopic negativ nu exclude diagnosticul de TB. Cultura. Cultivarea se poate face pe 3 grupe de medii de cultur [(lichide, semisolide i solide, pe baz de ou (mediul Lowenstein-Jensen)]. La compoziia mediului L-J se adaug verde malachit pentru inhibarea multiplicrii unor microorganisme. Pentru izolare este necesar o atmosfer care conine 8-10% CO2. Incubarea se face la 35-37C. Este foarte important s se examineze mediile n fiecare zi (n prima sptmn dup inoculare), ulterior sptmnal pn la mplinirea a 6-12 sptmni (Mycobacterium tubercidosis are o rat de diviziune de 12-27 ore). Exist i metode de cultur rapide: sisteme bifazice de izolare i identificare care detecteaz Mycobacterium tuberculosis n 20 de zile; sisteme respirometrice care constau n detectarea radiometric sau fotometric a CO2 eliminat n metabolismul bacterian evideniind creterea bacterian n 15 zile; -metode chimice, cromatografice de analiz a acizilor micolici din peretele bacterian permit identificarea de specie; reacii de tip PCR aplicabile direct produsului patologic permit un diagnostic n cteva ore i au o mare sensibilitate; metode de hibridare a ADN-ului i ARN-ului bacterian cu sonde marcate sau detectarea acidului tuberculo-stearic prin cromatografie gazoas i spectrometrie de mas sunt metode rapide de identificare a tulpinii de Mycobacterium tuberculosis. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza caracterelor: morfotinctoriale: BAAR; de cultur: Mycobacterium tuberculosis formeaz colonii de tip R, rugoase, grunjoase, nepigmentate sau pigmentate crem-bej, cu suprafaa zbrcit, uscate, conopidiforme asemnate cu firimiturile de pine. Pe mediul lichid Mycobacterium tuberculosis crete sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridic pe peretele flaconului de cultur. Astfel de cretere pe medii de cultur o numim cretere eugonic (abundent, optim). Tulpinile de Mycobacterium tuberculosis rezistente la HTN pot forma colonii S; biochimice: bacterie strict aerob, produce: - acid nicotinic sau niacin; - nitrat-reductaz, catalaz, ureaz; - este sensibil fa de pirazinamid; - este rezistent fa de hidrazida acidului tiophen-2-carboxilic; antigenice (se examineaz n centre de referin). Mycobacterium tuberculosis prezint la nivelul peretelui celular urmtoarele structuri antigenice:

- tuberculolipidele reprezentate de acizii micolici, ceruri i alcooli superiori. n peretele tulpinilor patogene se gsete un sulfo-lipid care induce dezvoltarea pe cultur sub form de cordoane: cord-factor; - tuberculoproteinele induc sensibilizare de tip anafilactic iar n asociere cu tuberculolipide induc rspuns imun predominant celular; - polizaharidele induc formarea de anticorpicirculan; de patogenitate: Mycobacterium tuberculosis este patogen pentru cobai. Antibiograma este necesar, se realizeaz conform recomandrilor Programului Naional de Control al TB i se efectueaz paralel cu identificarea. Se pot utiliza metodele: metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten etc. Diagnosticul imunobiologic presupune detectarea strii de sensibilizare fa de proteinele bacilului tuberculos prin intradermoreaii i are la baz un mecanism de RIC. Se utilizeaz BDR cu PPD. Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (Ac antimicobacterieni pot fi evideniai prin tehnica ELISA). n diagnosticul TB nici un element nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un context clinic, paraclinic i epidemiologic. Diagnosticul de laborator al infeciilor cauzate de genul Corynebacterium Genul Corynebacterium reunete microorganisme care se caracterizeaz prin prezena n compoziia peretelui celular a: - acidului mezo-diaminopimelic; - acizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi de C). Coninutul de GC este cuprins ntre 46-74%. Prezint asemnri cu microoganismele din genurile Mycobacterium i Nocardia. Genul Corynebacterium cuprinde: corinebacterii fitopatogene; corinebacterii patogene pentru animale, care afecteaz accidental omul: Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans; corinebacterii cu tropism uman: - specie patogen: Corynebacterium diphtheriae (biovaruri: gravis, mitis, intermedius). Colonizeaz frecvent rinofaringele, mai rar tegumentul. Exist i purttori sntoi; - specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): Corynebacterium xerosis, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium pseudodiphthericum, etc Diagnosticul de laborator n difterie Bacterie patogen: Corynebacterium diphtheriae. Produsul patologic: - fals membran, secreie faringian; - secreie nazal la purttori; - secreie conjunctival, vulvar, din plgi. Recoltarea se face cu 3 tampoane. Ca medii de transport i mbogire se pot folosi: geloz-ser semilichid cu telurit de K; mediul OCST (ou-cistin-ser-telurit).

Examen microscopic: Cu primul tampon se efectueaz 3 frotiuri: frotiu colorat Gram pentru observarea morfologiei i dispoziiei spaiale a bacteriei Corynebacterium diphtheriae - bacil Gram pozitiv, uor ncurbat, cu capetele mciucate, dispus caracteristic (litere chinezeti, chibrituri aruncate pe mas); frotiu colorat Neisser pentru evidenierea corpusculilor metacomatici BabesErnst. Corynebacterium diphtheriae prezint corpusculi metacromatici la capete; frotiu colorat Giemsa pentru diagnosticul diferenial cu angina fuso-spiralar pe frotiu cnd se evideniaz fusobacterii i forme spiralate (Treponema vincenti). Cultura. Tamponul al doilea se nsmneaz pe mediul de mbogire OCST i se incubeaz 12-18 ore, dup care se izoleaz pe medii caracteristice. Tamponul al treilea se descarc pe medii de cultur folosite pentru izolare i identificare. Caractere morfotinctoriale ale Corynebacterium diphtheriae: Bacterii (bastonae) de 1-8 m x 0,3-0,8 m, drepte sau puin ncurbate, cu extremitile rotunjite sau ngroate (aspect de halter sau de mciuc), datorit granulaiilor de volutin (corpii Babe-Ernst). n frotiuri se aranjeaz ungiular, n palisade sau sub forma caracterelor chinezeti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V, imobile, asporogene, necapsulate. Se coloreaz G+, pentru evidenierea granulaiilor de volutin Loeffler, Neisser Caractere de cultur: Corynebacterium diphtheriae este o specie facultativ anaerob, exigent la cultivare, temperatura optim de cultivare fiind de 37C, pH 7,4. Medii de cultur elective: mediul Lffler (ser bovin coagulat): colonii S, caracteristice circulare uor crenelate mici, netede, opace, albe-glbui sau albe-cenuii, apar peste 16-24 ore de cultivare; geloz-snge - colonii albe-gri perlate friabile. Medii de cultur selective difereniale: mediul Clauberg (geloz-snge cu telurit de potasiu). Corynebacterium diphtheriae gravis: colonii R mari, negre (reducerea teluritului n teluriu), crenelate, aspect de floare de margaret, nehemolitice; mitis: colonii S, mijlocii, negre, bombate, cu zon de hemoliz ; mediul Tinsdale (geloz-ser-cistin-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun; mediul Bucin (geloz-snge cu hinozol) - colonii albastre; mediul Gundel Tietz - se difereniaz cele trei tipuri de bacil difteric: - tipul gravis - colonii negre de tip R plate cu margini crenelate centrul mamelonat cu striaiuni radiare ca o floare de margaret; - tipul mitis - colonii negre de tip S; - tipul intermedius - colonii de tip S-R; bulion: - tipul gravis - formeaz pelicul la suprafa restul mediului rmne clar; - tipul mitis - tulbur uniform mediul; - tipul intermedius - formeaz inel la suprafa depozit si tulbur uniform mediul. Caractere biochimice:

- producerea de H2S - se studiaz pe mediul PISU (cu cistein); - ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-; - fermentarea zaharurilor (metabolism zaharolitic): n funcie de fermentarea monozaharidelor (glucoz maltoz si zaharoz) bacilii difterici se pot ncadra n specie (Corynebacerium diphtheriae hoffmanii xerosis); n funcie de fermentarea polizaharidelor (dextrin amidon si glicogen) se face ncadrarea Corynebacterium diphtheriae n tip: - gravis: glucoza+, amidon+, zaharoza- mitis: glucoza+, amidon-, zaharoza- intermedius. Posed catalaz, citocromi a, b, c i este oxidaz- . Caractere de patogenitate - cercetarea producerii de exotoxin difteric: teste in vivo; teste in vitro; testul Elek - reacie de precipitare n gel: - se toarn geloz peste o hrtie de filtru impregnat n ser antidifteric; - se nsmneaz n striuri tulpinile de cercetat; - dac o tulpin produce exotoxin difteric (Ag) aceasta este eliberat n mediu i apare o band de precipitare; testul Ramon - reacie de floculare prin care se dozeaz putere toxic a toxinei. Diagnosticul indirect IDR Shick - IDR de neutralizare. Se injecteaz strict intradermic 1 unitate de toxin. Dac organismul nu are anticorpi toxina i exercit efectul i la locul inoculrii apare un eritem - organism receptiv. Dac organismul are anticorpi acestia vor neutraliza toxina deci nu apar modificri la locul inoculrii - organism imun; Reacii de hemaglutinare pasiv - determinarea cantitativ a antitoxinelor.