LP. 7 Reaciile antigen-anticorp n laboratorul de microbiologie.

1. Antigen = substan strin care, ptruns ntr-un organism competent, determin rspuns imun

(imunogenitate) i reacioneaz specific cu efectorii imunitari aprui ca rezultat al acestui rspuns (specificitate). Anticorp = imunoglobulin produs n organism sub aciunea unui antigen i care are proprietatea de a reaciona specific cu antigenul corespondent. Reacia antigen-anticorp este stabil n zona de echivalen (cantitile celor doi reactivi sunt aproximativ egale). Fenomen de prozon = absena reaciei n prezena unui exces de anticorpi rezultat fals negativ. Aplicaiile practice ale reaciei antigen-anticorp = se bazeaz pe specificitatea cuplrii celor dou elemente Se pot urmri: - identificarea unui antigen necunoscut (n produse patologice sau tulpini izolate n laborator) prin anticorpul omolog prezent n seruri imune de referin - identificarea unui anticorp necunoscut prin antigenul omolog (diagnostic serologic) Se pot obine: - relaii calitative simpla identificare a unui reactiv - relaii cantitative determinarea titrului reactivului cercetat

2. Titru = inversul diluiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibil reacia cu cantiti constante i
definite ale reactivului omolog. Diagnostic serologic = urmrirea rspunsului imun al pacienilor la antigene ale microorganismului infectant prin teste in vitro. Criteriile de diagnostic serologic al unei infecii acute:

probe de ser prelevate n dinamic (serul I / acut i serul II / de convalescent, recoltate la interval de 10-14 zile) seroconversia = absena anticorpilor n prima prob i apariia lor n cea de a doua dinamica semnificativ = creterea de cel puin patru ori a titrului anticorpilor n a doua prob de ser fa de prima -

o singur prob de ser titrul semnificativ dozarea anticorpilor IgM (anticorpii rspunsului imun primar) diagnosticul unei infecii acute diagnosticul precoce al unor infecii congenitale 3. Principalele tipuri de reacii antigen-anticorp: A. Reacii de precipitare- sensibilitate sczut Principiu: un antigen solubil formeaz cu anticorpul omolog un complex insolubil. Clasificare dup mediul n care se desfoar reacia: a. Reacii n mediu lichid: reacia de precipitare inelar la interfaa reactivilor rezultate calitative

identificarea unor antigene e.g., gruparea streptococilor (Lancefield) reacia de floculare n amestecul reactivilor rezultate cantitative dozarea proteinelor b. Reacii n mediu gelificat: Imunodifuzia radial simpl (tehnica Mancini) antigenul difuzeaz radial dintr-un godeu n stratul de gel care conine ser imun monospecific n jurul godeului se formeaz un halou de precipitat al crui diametru este direct proporional cu concentraia antigenului. folosit pentru determinarea concentraiei proteinelor plasmatice

Imunodifuzia dubl radial (tehnica Ouchterlony)

antigenul i anticorpul difuzeaz radial din godeuri practicate la distan convenabil n stratul de gel. n zona dintre godeuri, unde reactivii au realizat proporii echivalente, apare o linie de precipitare utilizat pentru caracterizarea antigenelor n amestec Testul Eleck demonstrarea toxigenezei bacilului difteric

Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza
B. Reacii de aglutinare - Reacii sensibile Principiu = cuplarea unui antigen n suspensie cu anticorpul omolog determin apariia unui aglutinat sub form de mase vizibile, care se depun i las supernatantul limpede Clasificare dup modul de prezentare a antigenului n reacie a. Reacii de aglutinare direct Antigen = o suspensie bacterian Calitative = reacii de aglutinare pe lam identificarea unui antigen bacterian Cantitative = reacii de aglutinare n tuburi cuantificarea anticorpilor n serul pacienilor (e.g., reacia Widal pentru diagnosticul febrelor enterice) confirmarea rezultatelor aglutinrii pe lam b. Testul Coombs c. Reacii de aglutinare pasiv = se utilizeaz particule pe suprafaa crora a fost adsorbit un antigen bacterian (e.g., hematii reacia de hemaglutinare) d. Reacia de latexaglutinare = anticorpi specifici fixai pe suprafaa particulelor de latex identificarea antigenelor direct n prelevate patologice. e. Reacia de coaglutinare = anticorpul este fixat prin fragmentul Fc pe proteina A din nveliul stafilococilor aurii.

C. Reacia de fixare a complementului Principiu = dou complexe antigen-anticorp i disput complementul

Ag de referin Ac necunoscut Ag necunoscut Ser imun Cuplu hemolitic Hematii de oaie Ser antihematii

= complexul format n prima reacie fixeaz complementul, nct a doua reacie nu mai are loc i hematiile rmn intacte.

reacie (+ ) = lipsa hemolizei reacie () = hemoliz

D. Reacii de neutralizare Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a cror legare de receptori celulari este urmat de efecte definite = dup reacia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii celulari, sunt neutralizate. Clasificare: toxin. Neutralizri = supravieuirea animalelor receptive dup injectarea amestecului imunoser-virus / Reacii de inhibare a hemaglutinrii identificarea virusurilor hemaglutinante serodiagnosticul infeciilor determinate de virusuri hemaglutinante hemaglutinine + hematii hemaglutinare () hemaglutinine + Ac omologi + hematii sedimentare (+ ) E. Reacii cu anticorpi marcai: Imunofluorescena - tehnica direct = folosete anticorpi marcai fluorescent, specifici pentru fiecare antigen - tehnica indirect = folosete anticorpi marcai anti-imunoglobuline = elementele de identificat pot fi att antigenele, ct i anticorpii

Reaciile imunoenzimatice (EIA)

Principiu: anticorpul poate fi marcat cu o enzim; dup formarea complexului cu antigenul i ndeprtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activitii enzimatice, se adaug substratul cromogen al enzimei reacia de culoare dezvoltat este apreciat vizual sau spectrofotometric. - ELISA a. pentru detectarea antigenului direct Ac specific adsorbit pe suport insolubil + proba n care urmrim Ag + Ac marcat cu enzim b. pentru detectarea anticorpului indirect Ag adsorbit pe suport insolubil + ser n care urmrim Ac anti-Ag + Ac anti-Ig marcat cu enzim c. competitiv

Immunoblotting (Western blot) confirmarea infeciei cu HIV antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloz proba de ser testat (Ac)

splare

Ac anti-Ig uman marcat enzimatic splare Reacie colorimetric

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIEI Metodele microbiologiei clinice a. metode directe Calitatea prelevatelor pentru examenul microbiologic prelevate de bun calitate rezultate utile posibile; prelevate de calitate proast rezultate proste, periculoase pentru bolnavi, bani risipii a. alegerea prelevatelor i momentul prelevrii; b. prelevarea probelor nainte de instituirea tratamentului antimicrobian; c. prelevatele patologice trebuie s fie n cantitate suficient; d. prelevrile trebuie fcute aseptic; e. recipientele i instrumentele indicate pentru prelevri; f. transportul i conservarea probelor; g. buletinul de analiz cererea de analiz. tehnici rapide: i. microscopia direct: 1. controlul microscopic al calitatii prelevatelor contaminate; 2. caracterele reactiei inflamatorii; 3. bacterioscopia. ii. depistarea antigenelor microbiene; iii. metode ale biologiei moleculare. izolarea microorganismului infectant: i. semnificaia clinic a izolatelor: 1. cazul prelevatelor necontaminate; 2. cazul prelevatelor contaminate pe traiectele de eliminare; 3. cazul prelevatelor din zone normal colonizate.

b. metode indirecte nespecifice: leucograma, formula leucocitar, VSH, CRP; specifice: indicaii, dezavantaje; a. diagnostic serologic; i. criterii de semnificaie clinic a anticorpilor izolai;

b. intradermoreacii.