3

CUPRINS

Introducere 7
Capitolul I. Formarea N-nitrozoaminelor n ap 11
I.1. Procese de nitrozare a aminelor 11
I.1.1. Nitrozarea aminelor secundare 11
I.1.2. Formarea agenilor de nitrozare 13
I.1.3. Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice 15
I.1.4. Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice 17
I.1.5. Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice 24
I.1.6. Influena inhibitorilor asupra procesului de nitrozare
a aminelor secundare alifatice 29
I.1.6.1. Influena derivailor acidului tartric asupra nitrozrii DMA i DEA 29
I.1.6.2. Influena (+)-catehinei asupra nitrozrii DMA i DEA 33
I.1.6.3. Influena enoxilului asupra nitrozrii dimetilaminei 34
I.2. Nitrozarea aminelor ciclice 37
I.2.1. Nitrozarea morfolinei 37
I.2.1.1. Formarea agenilor de nitrozare i efectele toxice
asupra organismului 37
I.2.1.2. Legiti cinetice n procesul de nitrozare a morfolinei cu nitrii 39
I.2.1.3. Metodele de inhibiie n procesul de formare a N-nitrozomorfolinei 44
I.3. Nitrozarea amidelor 54
I.3.1. Precursori ai N-nitrozometilureei 54
I.3.2. Cinetica i mecanismul nitrozrii metilureei 56
I.3.3. Inhibiia procesului de nitrozare a metilureei 59
I.3.4. Denitrozarea N-nitrozometilureei 62
Capitolul II. Formarea N-nitrozoaminelor n tutun i n fumul de igar 67
II.1. Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului 67
II.1.1. Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului din predecesori 68
II.1.2. Formarea endogen a N-nitrozoaminelor 70
II.2. Materiale i metode utilizate la analiza NAST i a predecesorilor din tutun 71
II.3. Formarea N-nitrozoaminelor n tutun i n fumul de igar 74
II.3.1. Determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului n diferite tipuri
de igri i a predecesorilor lor n tutun i n fumul de igar 74
II.3.2. Formarea N-nitrozoaminelor la diferite etape de prelucrare
i la arderea tutunului 77
II.3.3. Studiul cinetic al procesului de formare a NAST n sisteme-model 82
II.3.4. Diminuarea coninutului de N-nitrozoamine specifice tutunului
n fumul de igar 87
II.3.4.1. Influena inhibitorilor asupra procesului de formare
a NAST n tutun 87
II.3.4.2. Degradarea fotolitic a N-nitrozoaminelor 89
II.3.4.3. Adsorbia N-nitrozoaminelor din fum 91
Capitolul III. Formarea N-nitrozoaminelor n produsele alimentare 95
III.1. Formarea N-nitrozocompuilor volatili i nevolatili n produsele alimentare 95
III.1.1. Transformarea nitrailor i nitriilor n produsele alimentare 98
III.2. Transformarea nitrailor, nitriilor i formarea N-nitrozoaminelor n produsele alimentare comercializate n Republica Moldova 101
III.2.1. Coninutul nitrailor i nitriilor n produsele din carne 101
III.2.2. Influena substanelor reductoare asupra concentraiei nitriilor
i nitrailor n produsele din carne 105
III.2.3. Nitrai, nitrii i N-nitrozoamine n produsele lactate 107
III.2.4. Analiza N-nitrozoaminelor n mal i bere 110
III.2.5. Coninutul NNA n produsele alimentare din carne i pete 111
Capitolul IV. Formarea N-nitrozoaminelor n sistemele sucului gastric
imitat i real 117
IV.1. Conversia nitrailor i nitriilor n tractul digestiv 117
IV.2. Transformarea oxidului de azot(II) n organismul uman 120
IV.3. Nitrozarea endogen a aminelor i proteinelor n sistemul gastrointestinal 122
IV.4. Nitrozarea substratelor cu nitrii n suc gastric imitat i real 126
IV.4.1. Concentraia ionilor nitrai i nitrii n sucul gastric n funcie de pH 127
IV.4.2. Reducerea enzimatic a ionilor nitrai n prezena Bificolului
i nitrozarea aminelor secundare n sucul gastric 129
IV.5. Nitrozarea enzimatic a metaboliilor proteinelor cu ioni nitrii
n prezena pepsinei, tripsinei i chimotripsinei 132
IV.6. Inhibiia procesului de nitrozare a metaboliilor formai
la proteoliza proteinelor 136
IV.7. Influena hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra coninutului
de substrat proteic i de aminoacizi la proteoliza cazeinei 137
Capitolul V. Formarea methemoglobinei sub aciunea ionilor nitrii
la oxidarea oxihemoglobinei cu nitrii 145
V.1. Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii i alte xenobiotice 145
V.1.1. Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitrii 146
V.1.2. Participarea altor xenobiotice n oxidarea hemoglobinei 148

V.2. Metode de inhibiie n procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii 150
V.2.1. Descompunerea peroxidului de hidrogen 150
V.2.2. Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenului 151
V.2.3. Captarea radicalilor NO2
-
153
V.2.4. Reducerea methemoglobinei 154
V.3. Noi metode de inhibiie n procesul de oxidare a hemoglobinei cu nitrii 155
V.3.1. Metode experimentale de cercetare 156
V.3.2. Legitile cinetice n sistemele HbO2 NO2
-
i HbO2 NO2
-
H2O2
156
V.3.3. Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2
-
n prezena inhibitorilor 159
V.3.3.1. Utilizarea acidului ascorbic n inhibiia procesului
de oxidare a HbO2 160
V.3.3.2. Influena dihidroxifumaratului acid de sodiu
asupra oxidrii HbO2 cu NO2 161
Capitolul VI. Mecanismul procesului de reducere a ionilor nitrii
n prezena antioxidanilor 165
VI.1. Efectul protector al unor reductori naturali n apariia cancerului.
Transformarea nitriilor n prezena compuilor reductori 165
VI.2. Reducerea ionilor nitrii cu polifenoli, acid ascorbic, acid dihidroxifumaric
i derivaii lui 168
VI.2.1. Reducerea ionilor nitrii sub aciunea acidului ascorbic 169
VI.2.2. Reducerea nitriilor n prezena acidului dihidroxifumaric
i a derivailor lui 170
VI.3. Reducerea ionilor nitrii cu polifenoli 174
VI.3.1. Efectul reducerii ionilor nitrii cu rezveratrol 174
VI.3.2. Efectul reducerii nitriilor cu (+)-catehin i cvercetin 179
VI.3.3. Gradul de reducere a ionilor nitrii cu reductori n funcie de diferii parametri ai mediului 181
Capitolul VII. Determinarea activitii antioxidante/antiradicalice a inhibitorilor 185
VII.1. Activitatea antioxidant a reductorilor naturali 185
VII.2. Metode de evaluare a activitii antioxidante/antiradicalice a inhibitorilor
prin testul cu radicalul DPPH 190
VII.2.1. Studiul activitii antioxidante/antiradicalice a inhibitorilor naturali
prin utilizarea testului cu radicalul DPPH 192
Capitolul VIII. Metode electrochimice de reducere a nitrailor i nitriilor din ap 197
VIII.1. Metode biologice de reducere a compuilor minerali ai azotului 197
VIII.2. Metode fizico-chimice de nlturare a ionilor de NO3
-
din ap 199
VIII.3. Metode electrochimice de nlturare a ionilor de NO
-
3 din ap 201
VIII.4. Reducerea electrochimic a nitrailor i nitriilor cu anozi solubili 203
VIII.4.1. Metode i materiale 203
VIII.4.2. Reducerea concentraiei de NO3
-
din soluii-model i ape naturale la tratarea lor electrochimic cu anozi solubili de aluminiu 205
VIII.4.2.1. Reducerea concentraiei ionilor nitrai n sisteme-model 205
VIII.4.2.2. Tratarea electrochimic a apelor naturale de NO3
-

cu anozi solubili de aluminiu 213
VIII.4.2.3. Reducerea electrochimic a ionilor nitrai din sisteme-model
i ape naturale cu anozi solubili de magneziu i fier 215
VIII.4.3. Reducerea concentraiei ionilor nitrii din soluii-model i ape naturale
la tratarea lor electrochimic cu anozi solubili de aluminiu 217
VIII.4.3.1. Tratarea electrochimic 217
VIII.4.3.2. Reducerea electrochimic a ionilor nitrii
cu anozi insolubili 220
Concluzii 222
Bibliografie 225
Anexe 255

Introducere

n ultimele decenii s-au efectuat multiple investigaii urmrindu-se estimarea riscului pentru om al substanelor cancerigene care persist n
mediul ambiant. Printre numrul mare de astfel de substane un loc deosebit l ocup N-nitrozocompuii (NNC), dintre care ~ 80% posed aciune
cancerigen i induc apariia tumorilor maligne practic n orice organe ale omului i animalelor.
N-nitrozocompuii se formeaz destul de uor n organismul uman, mediul ambiant, produsele alimentare i n fumul de igar. Sinteza acestor
compui se realizeaz, preponderent, din amine secundare i nitrii sau oxizi de azot.
Cercetrile tiinifice n domeniul cancerogenezei acestor compui se dezvolt n cteva direcii: (1) identificarea noilor cancerigeni activi, (2)
monitorizarea surselor de NNC cunoscui n mediul ambiant, (3) determinarea mecanismelor de formare a cancirigenilor i (4) elaborarea
metodelor de prevenire a apariiei i rspndirii agenilor cancerigeni.
Pentru profilaxia i inhibiia apariiei tumorilor pot fi utilizai diferii antimutageni i anticancerigeni. Cu toate acestea, pn n prezent rmn
neclare unele aspecte ale proceselor date: la care etape ale procesului de cancerogenez este posibil inhibiia real; ce grupe ale inhibitori chimici
sunt mai cu perspectiv pentru utilizarea n practic i studiul anticancerogenezei; care sunt mecanismele de aciune inhibitoare n cancerogenez; ce
sisteme de testare pot fi recomandate pentru selectarea anticancerigenilor; care sunt gradele de corelare a efectelor antimutagenelor i anti-
cancerigenelor i cum este posibil extrapolarea rezultatelor experimentale asupra populaiei? Cunoaterea mecanismelor de formare a N-
nitrozocompuilor, elaborarea metodelor de diminuare a concentraiei agenilor de nitrozare i de inhibiie a procesului de nitrozare a diferitelor
substraturi in vitro i in vivo ar permite stabilirea mecanismelor de formare a substanelor cancerigene i elaborarea unui sistem de profilaxie i de
prentmpinare a dezvoltrii diferitelor boli oncologice.
Scopul prezentei lucrri rezid n stabilirea mecanismelor de nitrozare n sistemele-model i reale, a procedeelor de inhibiie prin utilizarea
diferitelor substane obinute din produse secundare vinicole i n elaborarea metodelor de diminuare a polurii mediului ambiant.
Pentru realizarea scopului au fost propuse urmtoarele sarcini:
- stabilirea mecanismelor de nitrozare a aminelor secundare alifatice, heterociclice, a amidelor i determinarea legitilor cinetice de nitrozare n
funcie de diferii parametri;
- cercetarea procesului de formare a NNC la diferite etape de prelucrare i determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului i fumului de
igar;
- cercetarea proceselor de transformare a nitrailor, nitriilor i de formare a N-nitrozoaminelor n diferite produse alimentare;
- stabilirea particularitilor de nitrozare enzimatic i neenzimatic a unor amine i peptide n sucul gastric;
- determinarea legitilor cinetice de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitrii in vitro i in vivo i a mecanismelor de aciune a unor inhibitori
naturali n aceste procese;
- elaborarea metodelor de diminuare a concentraiei nitriilor i nitrailor, ca predecesori ai procesului de nitrozare, n sisteme-model i ape
naturale;
- elaborarea metodelor de inhibiie n procesul de formare al N-nitrozocompuilor prin utilizarea unor reductoni naturali obinui din produse
secundare vinicole i determinarea activitii lor antioxidante/antiradicalice;
n rezultatul studiilor experimentale:
- pentru prima dat s-a determinat mecanismul de inhibiie a nitrozrii aminelor secundare alifatice cu utilizarea reductonilor obinui din produse
secundare vinicole;
- pentru prima dat s-a constatat efectul inhibitor al acidului dihridroxifumaric n procesul de formare a N-nitrozonornicotinei in vitro i in vivo;
- s-a stabilit c gradul de inhibiie n procesul de nitrozare a aminelor secundare depinde de natura inhibitorului i bazicitatea aminei;
- s-a stabilit c tartratul de dipotasiu este un inhibitor mai efectiv n procesul de nitrozare a nicotinei, comparativ cu acizii citric i tartric, iar
utilizarea lui mbuntete calitatea tutunului, aroma fumului i acioneaz pozitiv asupra duratei de ardere a tutunului;
- analiza coninutului substratului proteic nehidrolizat la proteoliza cazeinei a artat c hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu, utilizat n calitate
de inhibitor la nitrozarea metaboliilor formai, nu influeneaz asupra activitii enzimelor specifice;
- s-a determinat mecanismul de aciune a hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra procesului de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni
nitrii, care se bazeaz pe interaciunea cu radicalul OH
*
i HO2
*
.
Au fost elaborate noi metode de inhibiie n procesul de formare a substanelor cancerigene, prin utilizarea reductonilor obinui din produse
secundare vinicole (acidul dihidroxifumaric, hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu, rezveratrol, esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric). S-a stabilit
mecanismul de inhibiie a nitrozrii aminelor secundare alifatice i ciclice cu ioni nitrii. Au fost elaborate noi metode de inhibiie n oxidarea
oxihemoglobinei cu ioni nitrii cu utilizarea reductonilor obinui din produse secundare vinicole i s-a stabilit mecanismul acestor procese.
Valoarea aplicativ a lucrrii este determinat de metodele elaborate pentru diminuarea concentraiei ionilor nitrai, nitrii i N-nitrozocompui
n ap, produse alimentare, snge, suc gastric, tutun i fum de igar.
n acest context:
s-au optimizat condiiile de utilizare a reductorilor obinui din produse secundare vinicole pentru inhibiia proceselor de formare al N-
nitrozocompuilor;
s-a stabilit posibilitatea utilizrii reductorilor studiai pentru diminuarea concentraiei NNA din sucului gastric;
eliminarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului la fermentarea i arderea tutunului s-a efectuat prin utilizarea tartratului de potasiu i folosirea
diatomitelor din Republica Moldova;
s-a constatat c utilizarea acidului dihidroxifumaric i a acidului tartric n dieta alimentar diminueaz coninutul de N-nitrozonornicotin, care
se formeaz la nitrozarea nornicotinei cu ioni nitrii in vivo;
s-a stabilit rolul inhibitor al acidului dihidroxifumaric la nitrozarea diureticelor (hidroclortiazida) cu ioni nitrii n sistemele sucului gastric prin
diminuarea concentraiei nitrozohipotiazidei;
s-au optimizat condiiile de tratare a apelor naturale pentru diminuarea concentraiei ionilor nitrai i nitrii prin metoda electrochimic n celula
cu anozi solubili de aluminiu i anozi insolubili de fier i magneziu n funcie de concentraia lor, timpul tratrii, intensitatea curentului electric i
pH-ul soluiei;
introducerea hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu n tehnologia de fabricare a salamurilor a micorat concentraia ionilor de nitrii i nitrai,
iar indicele ascorbat, care determin proprietatea de reducere a nitriilor n diferite produse, crete odat cu mrirea concentraiei reductorilor.

Cuvinte cheie: N-nitrozoamine, N-nitrozoamide, ageni de nitrozare, mecanisme de nitrozare, inhibiia nitrozrii, reductoni, activitate
antioxidant/antiradicalic, constante de vitez, methemoglobin, ioni nitrii i nitrai, amine, amide, tutun, fum de igar, N-nitrozoamine specifice
tutunului, suc gastric, metode electrochimice, produse alimentare.
Lista abrevierilor
NNC N-nitrozocompui, DFH4 acidul dihridroxifumaric, DMA dimetilamina, DEA dietilamina, NDEA N-nitrozodietilamina, NDMA N-
nitrzodimetilamina, NNA N-nitrozoamine, DFH3Na hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu, MOR morfolina, NMOR N-nitromorfolina, EDMT
esterul dimetilic al acidului tartric, EDMD esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric, MU N-metilureea, NMU N-nitrozometilureea, (+)Cat (+)
catehina, NNN N-nitrozonornicotina, NNK 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-1-butanona, NNAL acidul 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-butiric,
NNAC acidul [4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-but-1-il]--O-D-glucoziduronic, NAST N-nitrozoamine specifice tutunului, NPJP N-
nitrozopiperidina, AAs acid ascorbic, AGl acid galic, NOCP predecesorii N-nitrozoaminelor, ATE analiza termo-energetic, PC pigment
caratenoidic, Alb albumina, MetHb methemoglobina, HbO2 oxihemoglobina, RedH2 compui cu proprieti reductoare, Red produs de oxidare
al RedH2, Rezv. rezveratrol, DPPH

2,2-difenil-1-picrilhirazil, PAR puterea antiradicalic, CE50 concentraia eficient, Cv cvercetina, Eneox

extract de enotanine din semine de struguri, ENOXIL - extract de enotanine din semine de struguri modificat, NVNC N-nitrozoamine volatile, SG
suc gastric, GI grad de inhibiie, EC epicatehina, ECG epicatehin galat, EGCG epigalocatehingalat, EGC epigalocatehin, ABTS
+
2,2
azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-6-acid sulfonic.

Capitolul I. Formarea N-nitrozoaminelor n ap

I.1. Procese de nitrozare a aminelor
I.1.1. Nitrozarea aminelor secundare
N-nitrozocompuii sunt substane puternic cancerigene i mutagenice formate la interaciunea dintre diferii nucleofili (amine, amide) i acidul azotos. Rspndirea larg a acestei
grupe de compui n mediul ambiant, proprietatea evideniat de a provoca tumori n diferite organe, efectele cancerigen, mutagen, transplacentar i alte particulariti de acest gen indic la
pericolul N-nitrozocompuilor (NNC) pentru animale i om. Principala primejdie a NNC, comparativ cu ali cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice, aflatoxinele, bifenilii
policlorurai), este proprietatea de a se forma uor din predecesori n organisme vii i n mediul ambiant.
N-nitrozocompuii cancerigeni deriv de la diferii compui, ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) i teriare (R3N), amidelor secundare (RCO.NHR1O) i teriare (RCO.NR1R2),
N-substituenii ureei (R1HNCO.NH2), guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) i uretanii (RR1N.COR). Cei mai rspndii NNC deriv de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaii lor N-
alchilai [1].
Principalele procese de nitrificare i denitrificare sunt foarte bine adaptate n ecosistem, dar aciunea antropogen asupra mediului nu doar c introduce schimbri, dar n unele
cazuri manifest un impact negativ asupra naturii. Introducerea excesiv a ngrmintelor minerale de azot (sruri de amoniu, nitrai, uree), poluarea mediului cu oxizi de azot formai n
industrie i transport influeneaz asupra ciclurilor naturale ale azotului; astfel, n biosfer se creeaz exces de predecesori ai NNC din care se formeaz aceti cancerigeni.
Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis, Rid, Mirvish i Williams). Soluiile apoase acide de sruri ale nitriilor la pH< 5 sunt cele
mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate.
Studiile efectuate demonstreaz c acidul azotos i ionii nitrii nu reacioneaz direct cu aminosubstratul. Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formeaz n rezultatul interaciunii
catalizatorului nucleofil (Y
-
, care este, de exemplu: NO2
-
, Cl
-
, SCN
-
) cu acidul azotos, protonat ntr-o faz rapid cu instaurarea urmtoarelor echilibre (I.1.1, I.1.2 i I.1.3) [1].
NO2
-
+ H3O
+
HNO2 + H2O (I.1.1)
HNO2 + H3O
+
H2O + NO
+
(I.1.2)
H2O + NO
+
+ Y
-
Y-NO + H2O (I.1.3)
R2NH2
+
+ H2O R2NH + H3O
+
(I.1.4)
R2NH + Y-NO R2NNO + HY (I.1.5)
S-a constatat c doar aminosubstratul neprotonat, care este n echilibru cu acidul lui conjugat (ec. I.1.4), reacioneaz cu Y-NO dup ecuaia (I.1.5) [5]. Astfel, n irul echilibrelor
prezentate, direcia procesului va depinde de pH, bazicitatea aminosubstratului i prezena catalizatorilor anionici (Y
-
). n absena altor nucleofili, ionul nitrit acioneaz n calitate de
catalizator, Y
-
, i n acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3, format n reacia chimic:
2HNO2 N2O3 + H2O (I.1.6)
Nitrozarea aminelor secundare este studiat destul de larg, iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaia I.1.7 [2]:

Este cunoscut c aminele au un caracter bazic datorit electronilor neparticipani de la azot; astfel, n soluii apoase se instaureaz un echilibru (ec. I.1.8), iar constanta de echilibru
reprezint constanta de bazicitate (kb):
R- NH2 + H2O R- NH3
+
+ HO
-
(I.1.8)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercit influen decisiv asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi. Cu ct mai sczut este bazicitatea aminei, cu att se
reduce posibilitatea ei de a fi ionizat i astfel crete viteza de nitrozare. Bazicitatea aminelor este influenat de structura lor i de densitatea electronic la atomul de azot.
Aminele alifatice sunt baze mai tari dect amoniacul datorit grupelor alchil, cu efect respingtor de electroni (+Is), efect ce mrete bazicitatea. Aminele secundare sunt baze mai
tari dect aminele primare, deoarece conin dou grupri alchil cu efect (+Is), dar aminele teriare sunt baze mai slabe datorit unui efect de influen steric, produs de cele trei grupe alchil.
Aminele aromatice sunt baze mai slabe dect amoniacul. Bazicitatea mai sczut a aminelor aromatice se datoreaz implicrii electronilor neparticipani de la atomul de azot ntr-o conjugare
cu electronii t ai nucleului benzenic. Pentru aminele studiate n prezenta lucrare scderea bazicitii i creterea vitezei reaciei de nitrozare are loc conform irului din Figura I.1.1.
Din investigaiile tiinifice se constat c pentru aminele secundare care au pKa > 5 vitezele reaciilor de formare a N-nitrozoaminelor, calculate dup consumul total de amine i
ioni nitrii, au o dependen caracteristic de pH, atingnd maximum pentru amine la pH ~ 3,4, iar pentru aminoacizi ~ 2,5 [3].
Aceast dependen reflect influena aciditii mediului reactant asupra concentraiilor de oxid de azot (III) i amine neprotonate. Totui, mrimea vitezelor de nitrozare n funcie
de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa), care determin partea de amin neprotonat ce particip n reacie.
n intervalul de pH2-5, n absena catalizatorilor (de ex., ioni de tiocianat, Cl
-
, I
-
), reacia de nitrozare
aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) i nu depinde de natura
soluiei-tampon.
Aminocompuii slab bazici (de ex., amidele, derivaii ureei) nu se nitrozeaz att de activ prin
intermediul N2O3. Viteza de nitrozare pentru aceti compui crete cu micorarea pH-ului, datorit formrii altui
agent de nitrozare NO
+
sau H2O
+
NO; astfel, nitrozarea acestor substraturi are loc prin interaciunea lor cu ionul de
nitrozoniu hidratat sau nehidratat dup urmtoarea ecuaie:
W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O
+
]
(I.1.9)
Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporional cu ptratul concentraiei
ionilor nitrii i manifest, dup cum s-a menionat mai sus, o valoare maxim la pH 3-3,4.
W = k10 [R(R1)NH][HNO2]
2

(I.1.10)
Viteza de nitrozare a N-alchilureelor, N-alchilcarbamailor, amidelor este proporional cu concentraia
ionilor nitrii i a ionilor de hidrogen (ec. I.1.9); astfel, viteza de nitrozare nu manifest un maxim n funcie de
pH, dar crete cu scderea pH-ului.
Se poate constata c, n general, aminele secundare slab bazice, N-alchilureele, N-alchilamidele simple
i guanidinele sunt nitrozate mai rapid. Aminele primare, teriare i cuaternare de obicei se nitrozeaz cu mult
mai ncet, cu excepia compusului aminoteriar aminopiridina, care este nitrozat extrem de rapid. Viteza de
nitrozare depinde de pH-ul mediului i de concentraia ionilor nitrii.

I.1.2. Formarea agenilor de nitrozare
Formarea agenilor de nitrozare are loc n rezultatul interaciunii ionilor nitrii cu protonii (H
+
sau
H3O
+
) cu formarea acidului azotos (HONO). n soluii apoase se stabilete un echilibru ntre acidul azotos i
oxidul de azot (III), conform ecuaiei (I.1.6) [5].
Valoarea constantei de echilibru a fost determinat conductometric la 25C, iar mai trziu, prin metoda poteniometric, spectrofotometric i cinetic, de ctre Markovits i col., a
crei valoare este de 3,0 10
-3
l mol
-1
.
Reacia (I.1.6) este o cale important de formare a agenilor de nitrozare att in vivo, ct i in vitro, n particular n mediul ambiant, produse alimentare i n stomac.
Protonarea ionilor nitrii este doar una n irul mare de reacii ce au loc, deoarece n afar de N2O3 se formeaz i ali ageni de nitrozare, ca ionul acidului azotos (H2O
+
NO), tetraoxidul de
azot (N2O4) i al. Proporiile relative ale fiecrei specii depind de aciditatea mediului, ns la o aciditate moderat (pH2-5) ei sunt toi prezeni i pot fi detectai spectrofotometric (Fig. I.1.2)
[7].

Fig. I.1.1. Dependena vitezei
de nitrozare de bazicitatea aminelor.
(I.1.7)

Fig. I.1.2. Formarea agenilor de nitrozare la interaciunea nitriilor cu protonii.
La pH2 este important cationul H2O
+
NO, care este predominant n reacia de nitrozare. Ionul de nitrozoniu NO
+
este instabil n mediul bazic (ec. I.1.11):
NO
+
+ OH

HNO2 NO2

+ H
+
(I.1.11)
n mediul acid echilibrul (I.1.12) este deplasat n dreapta i N2O3 se transform n ionul de nitrozoniu:
N2O3 + 2H
+
2NO
+
+ H2O (I.1.12)
Acest echilibru a fost determinat n baza studierii absorbiei n UV a ionului nitrit la diferite pH-uri. La valori ale pH<7 n soluia de ioni nitrii n regiunea UV = 225 nm absorb doar
moleculele de HNO2 i cu micorarea valorii pH-ului pn la pH 2 absorbia HNO2 scade, deoarece are loc formarea N2O3, care nu absoarbe n regiunea dat. Iar la micorarea ulterioar a
pH-ului (pH<2) absorbia crete, fapt cauzat de apariia n sistem a NO
+
, care absoarbe n regiunea dat a spectrului. n acelai timp, apariia NO
+
a fost depistat n sistem deja de la pH 3,0.
Pentru reaciile ce decurg la pH moderat (pH 3), N2O3 apare ca reagent principal n procesul de nitrozare. Oxidul de azot (III) este instabil i se descompune, la nclzire, la un amestec de oxid
de azot (II) i oxid de azot (IV) (Fig. 1.I.2, etapa VI) [8].
Acidul azotos poate fi oxidat pn la ion nitrat (ec. I.1.13) n rezultatul diferitelor procese chimice, sau redus la oxid de azot (II) (I.1.14) [1]:
HNO2 + H2O NO3 + 3H
+
+ 2 e (E = -0,94 V) (I.1.13)
HNO2 + H
+
+ e NO + H2O (E = -1,0 V) (I.1.14)
Oxidarea acidului azotos necesit reageni relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul, iar oxidanii mai slabi sunt efectivi n mediul alcalin:
NO2
-
+ 2OH NO3 + H2O + 2 e (E =0,01 V) (I.1.15)
Acidul azotos poate fi uor redus pn la oxid de azot (II) cu ajutorul reductorilor anorganici, aa cum sunt ionii de cupru (Cu
+
), fier (Fe
2+
), (I) i bisulfit (HSO3), i al compuilor
organici, ca acidul ascorbic, polifenolii, tiolii i al. Comportarea acidului azotos n prezena agenilor reductori depinde de natura reductorilor, pH-ul mediului i temperatur. Astfel, n
reacia dintre ionul nitrit i hidrogenul sulfurat se produce NO i sulfur, n soluii acide amoniac i sulfur, n soluie-tampon de bicarbonat i amoniac sulfur i tiosulfat [8].
Mai mult ca att, acidul azotos poate fi redus pn la azot liber n prezena amoniacului, aminelor primare (RNH2), amidelor (RCONH2), hidrazinei (H2NNH2), ureei (H2NCONH2),
acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec. I.1.16):
XNH2 + HNO2 N2 + H2O + XOH (I.1.16)
Soluiile apoase ale nitriilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin procesul de fotoliz sau radioliz; n rezultat, obinem amestec de NO

i NO2

, care n continuare este

n echilibru cu N2O3 [8]:
h sau
2 2
NO NO NO
v - -
+
2 3
N O (I.1.17)
Oxidul de azot (III), generat din acidul azotos, atac substratul (S) conform reaciei (I.1.18), iar viteza reaciei este determinat cu ajutorul formulei (I.1.19), unde K este constanta
de echilibru:
N2O3 + S
k
S
+
- NO + NO2 (I.1.18)
W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]
2
[S] (I.1.19)
Pentru concentraii mari ale substratului (S), viteza reaciei I.1.18 este cu mult mai mare dect viteza de hidroliz a N2O3.
Astfel, etapa limit devine formarea N2O3 n reacia (I.1.10), unde expresia vitezei va include concentraia acidului azotos de ordinul doi. Pentru concentraia substratului de ordinul zero
[5,10]:
W = k [HNO2]
2
(I.1.20)
Constanta k a fost calculat pentru diferite substraturi: N-metilanilin, 1,2-dimetilindol, acid ascorbic, hidroxilamin. Valoarea k este aproximativ constant i egal cu 91 lmol
-1
s
-
1
la 25C i cu 0,81 lmol
-1
s
-1
la 0C [11].
Mecanismul de formare a N2O3 reprezint o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos, care, la rndul su, reacioneaz rapid cu anionul B
-
formnd BNO, iar ultimul, la
interaciunea cu ionul nitrit, duce la formarea N2O3 [11].

2 3
HNO H O
+
+
repede

2 2 2
H NO H O
+
+
(I.1.21)
2 2
H NO B
+
+
repede

2
BNO H O +
(I.1.22)
2
BNO NO

+
lent

2 3
N O B

+
(I.1.23)

O schem similar poate fi prezentat i n cazul cnd este implicat ionul de nitrizoniu.

I.1.3. Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici i induc tumori la diferite specii de animale, obolani, oareci, epuri, psri, peti n diferite organe, precum vezica urinar,
rinichi, ficat, esofag sau stomac [9,12,13]. N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot att de uor i n organismul uman. n primul rnd, expunerea la N-alchilnitrozoamine este bine
asociat cu creterea riscului de cancer al sistemului gastric, colon, vizicei urinare [14-16]. n al doilea rnd, biotransformarea i activitatea biologic a acestor NNC la animale este similar
celei din organismul uman [17]. Agenia Internaional de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA
i NDEA, i aa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om). Cercetrile epidemiologice i riscul pentru cancer al NNC se studiaz permanent [19]. n
acest context, legitile proceselor de formare a NNC i factorii fizico-chimici ce influeneaz asupra acestor procese sunt de o importan deosebit. Studiul procesului de nitrozare a DMA a
fost iniiat n 1972 de ctre Taylor i Price, dar a fost studiat mai nti descompunerea NDMA, ns dependena vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiat. Cinetica procesului de
nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiat de Mirvish [10] la pH 3,4, t = 25C n prezena soluiei-tampon, dup formarea NDMA. Viteza reaciei de nitrozare a DMA este proporional
cu concentraia N2O3, sau cu ptratul concentraiei HNO2liber i concentraia speciilor neionizate de substrat:
W = k [DMA] [HNO2]
2
, (I.1.24)
unde constanta de vitez (k) este independent de pH, ns concentraia DMA i HNO2 trebuie calculat pentru fiecare valoare a pH-ului. Concentraia de NaNO2 utilizat n sistem a fost
variat n intervalul 0,02 0,125M, iar concentraia DMA 0,02M.
Pentru a simplifica calculele, viteza procesului a fost determinat dup concentraia total a aminei i ionului nitrit la pH constant, cnd raportul ntre amin i HNO2 ionizat i
neionizat nu variaz:
W = k [Total DMA] [Total nitrit]
2
(I.1.25)

(I.1.27)
n acest caz, valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) n ecuaia (I.1.25) variaz odat cu variaia pH-ului [10]. Valoarea k a fost calculat utiliznd ecuaia (I.1.26):
2
2
[Total DMA] [Total nitrit]
k k
[MeNH] [HNO ]

| |
=
|
\ .
(I.1.26)
Produsul mediu de NDMA format n condiii standard la pH 3,4 este de 15,8%, iar valoarea k este 9,9 10
-2
mol
-2
min
-1
l
2
[10].
Populaia poate fi expus la N-alchilnitrozamine pe dou ci: calea exogen i calea endogen [20-22]. Expunerea exogen poate avea loc n rezultatul consumului alimentelor,
inhalrii fumului de tutun (0-140 ng/igar), utilizrii articolelor din cauciuc, a produselor cosmetice, aciunii mediului ambiant (aer, ap) [23-26]. Expunerea endogen rezult din nitrozarea
precursorilor N-nitrozoaminelor n organismul uman cu formarea lor n condiii acide, care prevaleaz n special n stomac [16,27].
Modelarea matematic [28] i studiul in vivo al formrii N-nitrozoprolinei (NPRO) indic la faptul c expunerea endogen este mult mai important dect expunerea exogen [29].
N-nitrozodimetilamina este prezent n alimente (n special bere) [30], pete i n produse din pete, n produse din carne [31], pesticide (190-640 mg/l), n apa potabil clorurat
(0,02-0,82 g/l) [32] i se formeaz la poluarea industrial. Concentraia NDMA n produse alimentare variaz n intervalul 0-85 g/kg. La fel, NDMA a fost detectat n medicamente, ce
sunt formate cu aminopirin, de la 10 pn la 371 g/kg.
Aminele secundare sunt constitueni normali n urin, care deriv din degradarea proteinelor, aminoacizilor, fosfolipidelor i a altor substane bazice, sub influena enzimelor
proteolitice i a bacteriilor intestinale.
Dimetilamina, care este principala amin secundar detectat n urin, este prezent n condiii normale n jur de 0,5 mM. Ionul nitrit este depistat n urin, de asemenea, n
concentraii variabile, dependente de diet i concentraia lui n apa potabil. Astfel, prezena NDMA n urin este determinat de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme (Proteus,
Escherichia coli), care transform ionul nitrat n nitrit, formnd n rezultat diferii ageni de nitrozare ce nitrozeaz DMA.
Au fost supuse cercetrii procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale i a apelor naturale i s-a constatat c n procesul de potabilizare se pot produce poteniali cancerigeni
NDMA (ec. I.1.27) i NDEA n concentraii de aproximativ 100 i 10 ng/l, respectiv [32].


La acest pH, fracia de HNO2 produs din concentraia total de ioni nitrii este de 0,48, iar concentraia de HN(CH3)2 neionizat este de 4,79 x 10
-8
(calculat din valoarea pka 3,37 i
10,72, respectiv). Utiliznd aceste date, a fost calculat valoarea constantei de vitez (k), egal cu 8,94 x 10
6
mol
-2
min
-1
l
2
, care nu se deosebete cu mult de valoarea k calculat de Ridd, egal
cu 2,4 x 10
7
mol
-2
min
-1
l
2
[11].
Lijinsky i Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100C. n aceste condiii, la incubare prelungit i pH sczut, ionul nitrit este instabil, iar viteza maxim de nitrozare nu
este la pH 3,4, ci la pH 4,5. Procesul de nitrozare al diferiilor compui depinde de structura substratului de nitrozare i de pH-ul mediului. Procesul de nitrozare in vivo i in vitro duce la
formarea N-nitrozocompuilor, care se caracterizeaz prin proprieti mutagene i cancerigene. n acest context, studiul legitilor cinetice ale procesului de formare i de inhibiie a NNC
prezint un mare interes.

I.1.4. Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
Reactivi chimici. La efectuarea cercetrilor au fost folosite urmtoarele N-nitrozoamine: N-nitrozodimetilamin compania SIGMA, No 7756, puritatea 99,8%; N-
nitrozodietilamin compania SIGMA, No 0756, puritatea 99,6%.
Inhibitori: acid dihidroxifumaric Sigma-Aldrich, Germania; rezveratrol Fluka; (+)-catehina Fluka; cvercetina Sigma-Aldrich, Germania; ester dimetilic al acidului
dihidroxifumaric (EDMD), acid ascorbic importator S.R.L. Ecochimie, Moldova, extracte din semine de struguri oxidate obinute la Institutul de Chimie al AM [49], dihidroxifumarat de
sodiu sintetizat n Centrul Chimie Aplicat i Ecologic. Pentru analiza ionilor nitrii s-a utilizat -naftilamin, acid sulfanilic, acid acetic glacial importator S.R.L. Ecochimie, Moldova;
reagent Griess Fluka, Germania.
S-a utilizat analizatorul de energie termic Model 610 (Thermedics Detection Inc., SUA), spectrofotometrul SF-46, spectofotometrul UV/VIS, pH-metrul Cecher, lonomerul 120-2
(Gomel, Bielorusia),Termostatul U-190 (Germania).
Metodica experimentului. Procesul de nitrozare a fost efectuat ntr-o celula cu termostatare. Coninutul celulei a fost agitat cu amestectorul magnetic. Soluiile substanelor iniiale
au fost pregtite separat i amestecate dup termostatare la temperatura necesar cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectiv prin utilizarea soluiei-tampon citrat-fosfat. Probele necesare
pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacie peste anumite perioade de timp. La determinarea NNA procesul de nitrozare n partea-alicot folosit a fost stopat
prin adugarea (1:10) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu n l00 mM soluie-tampon borat (pH 9). Partea-alicot utilizat pentru analiza ionilor nitrii a fost analizat imediat.
Determinarea N-nitrozocompuilor s-a efectuat prin metoda lui Walter, care include tratarea NNC cu HBr [6]. n rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formeaz NO,
care reacioneaz cu ozonul, formnd NO2* n stare excitat, i apoi se descompune prin emanarea unui foton. Emisia chemiluminescent este detectat de un fotomultiplicator instalat n
analizatorul de energie termic (AET):
R1R2NNO
HBr
R1R2NH + NOBr (I.1.28)
NOBr Br2 + NO (I.1.29)
NO + O3 NO2* + O2 (I.1.30)
NO2* NO2 + h (I.1.31)
Limita de detecie este de 100 pmol. Sistemul analitic pentru determinarea coninutului de NNC este alctuit dintr-un sistem de detecie unit cu analizatorul de energie termic
(model 610 sau model 402 Thermedics, Waltham, MA) i un integrator (Hewlett-Packard, Avondale, PA). Vasul de reacie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gturi 24/40,
un gt No7 (Ace-thred), pentru introducerea probei, fiind plasat ntr-o manta de nclzire (Fig. I.1.3) [6]. Unul din gturile 24/40 a fost conectat la un tub de sticl de admisie a gazului de la
o butelie cu argon, n al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracie i n al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux, rcit cu o
pomp imersabil n circulaie. Gtul Nr.7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat dup fiecare experiment). Partea superioar a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un
robinet de admisie a aerului i la un tub de nlturare a gazului (NO). Gazul NO trece prin apte vase de splare, dintre care n primele 1-4 se conin cte 60 ml de 1,5 N NaOH, 5 N NaOH,
99% NaOH (solid) i 99% NaOH granulat anhidru. Vasele de splare 5 (cu 20 ml EtOAc), 6 (cu 20 ml de aceton) i 7 (gol) sunt plasate ntr-un congelator la -30C (Cryfridge, Baxter,
McGraw Park, IL).
Metoda analizei NNC cu HBr. n vasul de reacie se adaug 160 ml de etilacetat. Se stabilete fluxul de oxigen pentru ATE (25 ml/min) i fluxul de argon (40 ml/min). Atunci cnd
vidul n ATE atinge 0,5 mm, se introduce mantaua de nclzire pentru a da o vitez de reflux de 1 pic/sec i o temperatur de 28C pentru vasul de reacie.
Se injecteaz cu seringa HCl concentrat/acid acetic glacial (5:95, 15 mL), iar mai trziu 7,5 ml de HBr n acid acetic glacial (33%) i se las pe 15-30 min. dup fiecare adaos,
pentru ca rspunsul ATE s se ntoarc la linia de baz. Mostrele de analizat (de obicei, 100 L) sunt injectate cu seringa n gtul Nr.7; atunci cnd rspunsul integratorului cade aproape de
linia de baz (fiecare 7-10 min.), obinem picuri ascuite. Standardele de N-nitrozoprolin se prepar zilnic (0,1 nmol, 100 L de 1,0 M NPRO) i sunt injectate la nceputul, mijlocul i la
sfritul fiecrei serii a experimentului.
Pentru nlturarea ionilor nitrii din proba selectat (dup incubarea aminelor secundare cu NO2
-
) se introduce acid sulfamic (AS) proaspt pregtit (soluie saturat) i HCl de 2N
[35].

10

Fig. I.1.3. Schema metodei grup-selective pentru determinarea
coninutului total de NNC [6].

Pentru analiza coninutului total de NNC se iau 400 L prob, se adaug 50 L AS saturat i 50 L HCl de 1N, se agit i dup 15 min. se analizeaz, introducnd, de regul, 100
L de prob din acest amestec n vasul pentru extracia NNC n EtOAc i descompunerea lor cu HBr (I.1.28-I.1.29). Aceast metod de analiz a NNC este de o selectivitate nalt
(coeficientul de variaie a trei msurri este de 5-10%), sensibil (detecia limit este de 0,01 mol/L i poate fi utilizat fr extracie prealabil). Legtura N NO n N-nitrozoaminele
volatile este foarte slab i energia ei poate fi determinat reieind din cldura standard de ardere a substanelor iniiale, precum i din cldura standard de formare a produilor de reacie.
Pentru N-nirozodimetilamin:
D[(CH3)2N NO] = Hf
0
[NO] + Hf
0
[(CH3)2N] Hf
0
[(CH3)2N NO] (I.1.32)
(CH3)2N NO (CH3)2N + NO (I.1.33)
D[(CH3)2N NO] = 52.1 kcalmol
-1
(I.1.34)
Fragmentul organic obinut nu duce la formarea radicalului nitrozil i, prin urmare, nu poate servi ca surs de interferen.
Nitrozarea DMA i DEA
Din studiile bibliografice s-a constatat c n cercetri procesul de nitrozare a DMA i DEA s-a urmrit dup viteza de formare a NNC. n lucrarea dat cinetica nitrozrii
alchilaminelor secundare s-a studiat dup viteza de consum a predecesorilor NNC, adic dup variaia nitritului, aminelor i dup formarea NNC. Nitrozarea aminelor s-a studiat n diferite
sisteme-model i sisteme reale, n condiiile cnd concentraia NO2
-
este cu mult mai mic (110
-5
- 510
-4
M) dect cea studiat n literatur (0,02-0,2M), concentraia substratului fiind de ordinul
mM [26,35], iar raportul [NO2
-
]:[Amin]<1. Aceste studii s-au efectuat reieind din intervalul de concentraii ce se gsesc n sisteme reale.
Nitrozarea DMA
Petele conine o cantitate mare de DMA, care n continuare poate fi nitrozat. Aceast amin este cea mai rspndit n produsele alimentare. Astfel, studiul procesului de nitrozare
a DMA are o importan deosebit. n sistemele reale (produse alimentare, ap, sistem gastrointestinal) concentraiile agenilor de nitrozare sunt cu mult mai mici; de exemplu, n ap sunt de
ordinul 10
-5
-10
-3
M. Reieind din aceste considerente, procesul de nitrozare a DMA cu nitrii a fost studiat n soluii apoase ce conineau DMA (110
-3
M), NaNO2 (0,0510
-3
-110
-3
M), i n
soluie-tampon citrat-fosfat; procesul a fost studiat la 37C. Viteza reaciei s-a determinat dup variaia concentraiei ionilor nitrii, NDMA i DMA n sistem n funcie de diferii parametri [54,55].
Cinetica procesului de nitrozare a DMA, studiat dup variaia concentraiei ionului nitrit n sistem n funcie de [NO2
-
]0, este prezentat n Tabelul I.1.1.

Tabelul I.1.1
Dependena vitezei iniiale de consum a NO2
-
la nitrozarea DMA n funcie de [NO2
-
]0;
pH 2,6, t = 37C, [DMA]0 = 1 10
-3
M

[NaNO2]0
.
Wini.10
7
[NO2
-
]10
5
M % de NO2
-

10
5
M M/s la 30 min. reacionat
0,5 0,5 0,09 82
1,0 1,2 0,39 61
5,0 7,5 1,32 73
10,0 8,9 4,60 55

Din rezultatele experimentale obinute n Tabelul I.1.1 constatm c viteza procesului de nitrozare a DMA crete odat cu creterea concentraiei ionilor nitrii. Raportul [NO2
-
]0 / [DMA]o n sistemul-model este mai mic de 1. Au fost utilizate concentraii mici de ioni nitrii comparativ cu substratul de nitrozare.
n cazul concentraiilor mici de ioni nitrii ordinul de reacie dup [NO2
-
]0 este doi, la fel cum se prezint n literatur [35,36], pentru intervalul concentraiilor mari.
Excesul de amin fa de concentraia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO2
-
). Astfel, ecuaia vitezei va fi prezentat la pH constant n felul
urmtor:

11

2 2
1 3 2 2
d[NO ]
k [(CH ) NH] [HNO ]
dt

= (I.1.35)
Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului, dar [DMA] i [HNO2] trebuie calculat pentru fiecare valoare de pH. n toate cazurile, viteza reaciei depinde de concentraia aminei
neionizate. Oxidul de azot (III) se formeaz reversibil din dou molecule de HNO2. n cazul dat, conform ordinului doi, dup [NO2
-
]0 la nitrozare particip N2O3 n calitate de agent de
nitrozare.
Dac utilizm n ecuaia vitezei concentraiile totale ale reactanilor, atunci constanta de vitez k2 din ecuaia vitezei va depinde de pH:
2 2
2
d[NO ]
k [DMA] [nitrit]
dt

= (I.1.36)
Din curbele cinetice de consum ale nitriilor n f(pH) n sistemul-model (CH3)2NH-NaNO2 s-a constatat c viteza trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.4) ce corespunde
constantei de disociere a HNO2 (pKa = 3,37). La pH <3,4 ionul nitrit se transform aproape totalmente n HNO2 (ec. I.1.1). Astfel, am constatat c pentru intervalul de concentraii mici ale
reactanilor n procesul de nitrozare maximul vitezei n funcie de pH este situat la pH 3,4, la fel ca pentru intervale de concentraii de ~100 de ori mai mari [38].

Fig. I.1.4. Dependena vitezei de consum a nitriilor i a [NO2
-
] remanente
de valoarea pH; [NO2
-
]0 = 1 10
-4
M, [DMA]0 = 1 10
-3
M, t = 37C.

n procesul de nitrozare, concentraia aminosubstratului neprotonat, care este n echilibru cu acidul lui conjugat (ec. I.1.37), este dependent de pH-ul mediului (pentru DMA pKa =
10,72) [35].
(CH3)2NH2
+
+ H2O
4
k

(CH3)2NH + H3O
+
(I.1.37)
Astfel, viteza reaciei de nitrozare este dependent de pH-ul mediului i bazicitatea substratului, care determin proporia de amin neprotonat. Cu ct mai mic este pH-ul, cu att
mai mare este concentraia aminei protonate, iar cu ct mai mare este pH-ul cu att mai mic este concentraia agentului de nitrozare.
Pentru viteza de formare a NDMA, studiat dup concentraia produsului format i calculat din concentraiile totale ale aminei i nitritului de sodiu (ec. I.1.36), s-a obinut o
dependen caracteristic de pH, atingnd maximul la pH aproximativ 3,4.

Tabelul I.1.2
Influena pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA;
[NO2
-
]0

= 110
-4
M, [DMA]0 = 1 10
-3
M, t = 37C

Nitrozarea DMA n funcie de pH
Dup variaia [NO2
-
] Dup variaia [NDMA]

pH Wini. [NO2
-
]10
5
M % [NO2
-
] pH Wini. [NDMA]10
4
M [NDMA]
10
7
la 30 min. react. 30 min. 10
8
la 90 min. la 90 min.,
M/s MS
-1
%
1,5 2,5 6,0 40 1,68 5,0 1,4 14
2,0 4,5 4,0 60 3,56 18,3 1,8 18
2,5 5,3 3,0 70 4,01 13,3 1,6 16
3,0 7,8 2,0 80 6,86 8,3 1,5 15
3,5 8,7 1,0 90
4,0 6,3 1,5 85

Nitrozarea DEA
N-nitrozodietilamina se formeaz n diferite produse alimentare: n produse vegetale marinate 0,69 g/kg i n moare 4,9 g/kg [39], n bere n medie 0,22 g/l, maximum
2,2 g/l [40], n carne [41].
La fel, NDEA a fost depistat n produse de cauciuc (92 g/kg), produse cosmetice (1,5-5 g/kg) [42], aer poluat cu fum de igri (0,01-0,1 ng/m
3
) [43], ap deionizat (0,03-0,34
g/l) [44] i n ape reziduale (pn la 5 g/l) [45].

12

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiat n funcie de diferii parametri (pH, [NO2
-
]0, [DEA]0) dup creterea concentraiei de NDEA, determinat prin metoda
extracional-spectrofotometric [46], dup variaia concentraiei de nitrii i variaia [DEA] [53-55]. Rezultatele experimentale sunt prezentate n Tabelul I.1.3.

Tabelul I.1.3
Viteza iniial de nitrozare a DEA n dependen de pH, [NO2
-
]0 i [DEA]0;
[NO2
-
]0 = 1 10
-4
M, DEA]0 = 1 10
-3
, pH 3,5, t = 37C
Nitrozarea DEA
n f (pH) n f [NO2
-
]0 n f [DEA]0

pH Wini. 10
8
M s
-1
[NO2
-
]0 Wini. 10
8
M s
-1
[DEA]0 Wini. 10
8
M s
-1

dup variaia: 10
4
M dup variaia: 10
4
M dup variaia:

[NO2
-
] [NDEA] [NO2
-
] [NDEA] [NO2
-
] [NDEA]

1,68 40 1,3 0,1 35 2,1 0,1 5,0 0,01
2,6 45 2,9 0,5 40 2,8 0,3 2,0 2,0
3,56 50 6,4 1,0 50 6,2 1,0 12,0 3,6
4,01 45 5,5 5,0 61 7,1 5,0 22,0 5,0
6,86 11 4,7 10,0 72 8,0 10,0 52,0 6,3
S-a stabilit c cu creterea concentraiei reactanilor viteza reaciei de nitrozare a DMA crete. Astfel, variaia concentraiei ionului nitrit n intervalul 110
-5
- 1 10
-3
mol/l duce la
creterea vitezei de formare a NDEA de la 2,110
-8
M s
-1
pn la 8,0 10
-8
M s
-1
, iar viteza de consum a ionului nitrit n acest interval variaz de la 3,510
-7
mol/l s pn la 7,210
-7
mol/l s.
Cota-parte calculat de NDEA format n funcie de [NO2
-
] variaz n limitele 2,2-8,9 % (Fig. I.1.5a). Calculele cinetice efectuate dup consumul [NO2
-
] pentru diferite concentraii
de DEA (0,1-10,0) 10
-4
mol/l indic (Tab. I.1.3) creterea vitezei de nitrozare n intervalul (5-52) 10
-8
mol/ls. Dac raportul dintre amin i ioni nitrii crete, pentru intervalul dat de
concentraii, cota-parte de NDEA format (la concentraia constant a ionului nitrit) scade (Fig. I.1.5a). Astfel, n sistemul NO2
-
DEA cota-parte de NDEA format din DEA variaz n
intervalul 7,8-40,0% pentru intervalul 0,110
-4
- 1 10
-3
mol/l de DEA.
(a)

(b)
Fig. I.1.5. Cota-parte de NDEA format n funcie de (-lg [NO2
-
]0) i (-lg [DEA]0) (a)
i n funcie de pH (b). [NO2
-
]0 = 1x10
-4
M, [DEA]0 = 1x10
-3
M, t = 37C

Pentru raportul [DEA]0/[NO2]0 = 1 n sistemul de reacie concentraia NDEA alctuiete aproximativ jumtate din concentraia substratului de nitrozare, deoarece raportul
stoechiometric ntre NO2
-
i DEA este de 2:1. Astfel, constatm c ordinul dup concentraia NO2
-
este doi.
Viteza procesului de nitrozare a DEA n f(pH), att dup variaia [NO2
-
]0, ct i dup formarea NDEA0, trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.5b) [33,34]. n toate cazurile viteza
de consum a nitritului este cu mult mai mare dect viteza de formare a NDEA (Tab. I.1.3), deoarece ionii nitrii nu particip direct la sinteza NNC, dar sufer o serie de transformri (ec. I.1.1,
I.1.2, I.1.3) ce duc la formarea agenilor de nitrozare, care, la rndul lor, particip n procesul de nitrozare.
Dac comparm vitezele procesului de nitrozare a DMA i DEA, constatm c formarea NDMA are loc cu o vitez cu mult mai mare [53,55].
Delocalizarea electronilor necuplai de la azot depinde de structura aminei; astfel, pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA. n rezultat, DEA are
proprieti bazice mai puternice dect DMA i forma protonat este mai stabil. ns, aminele protonate nu se supun nitrozrii; astfel, viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mic dect
a DMA.

I.1.5. Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor i, n particular, a aminelor secundare alifatice (DMA i DEA) include formarea agenilor de nitrozare, care, la rndul su, n
continuare interacioneaz cu substratul de nitrozare (ec. I.1.1-I.1.5). n baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka, K1, K2, deducem expresia teoretic pentru viteza de nitrozare,
reieind din faptul c n calitate de ageni de nitrozare particip NO
+
(H2O
+
NO) i N2O3.
NO2
-
+ H
+

a
k

HNO2 ka = 4 10
-4
[47] (I.1.38)
HNO2 + HNO2
1
K

N2O3 + H2O K1 = 3 10
-3
[47] (I.1.39)
HNO2 + H
+

2
K

H2ONO
+
K2 = 3 10
-7
[47] (I.1.40)
(CH3)2NH + N2O3
3
k

(CH3)2 N NO + HNO2 (I.1.41)

(CH3)2 NH + NO
+

4
k

(CH3)2N NO + H
+
(I.1.42)
(CH3)2NH + H
+

5
k

((CH3)2NH2)
+
(I.1.43)
C
o
t
a
-
p
a
r
t
e

N
D
E
A
,

%

C
o
t
a
-
p
a
r
t
e

N
D
E
A
,

%

13

Din ecuaia (I.1.39)
K1 =
2 3 2
2
2
[N O ][H O]
[HNO ]
, iar
2
1 2
2 3
2
K [HNO ]
[N O ] .
[H O]
= (I.1.44)
Pentru determinarea concentraiei HNO2 utilizm expresia pentru partea de mas a formei protonate ( o ):
2
2
HNO
2
[HNO ] [H ]
,
[NO ] Ka [H ]
+
+
o = =
+
de unde
2 2
[H ]
[HNO ] [NO ]
Ka [H ]
+
+
=
+
(I.1.45)
Expresia pentru viteza reaciei (I.1.41) este urmtoarea:

2 3
N O
W = k3[N2O3][(CH3)2NH] (I.1.46)
2 3
2 2
1 3 2
N O 3 2 2
2 a
K k [NO ] [H ]
W [(CH ) NH]
[H O] (K [H ])
+
+
=
+
(I.1.47)
Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO
+
(H2O
+
NO) o determinm n acelai mod.
Din ecuaia (I.1.40) constanta de echilibru K2 este egal cu:
2
2
2
[NO ][H O]
K
[HNO ][H ]
+
+
= (I.1.48)
2 2
2
K [HNO ][H ]
[NO ]
[H O]
+
+
= (I.1.49)
Expresia vitezei reaciei de nitrozare a DMA cu NO
+
pentru reacia (I.1.42) este:
2
4 2 2
4 3 2 3 2
NO
2 2
k K [NO ][H ]
W k [NO ][(CH ) NH] [(CH ) NH]
[H O] (Ka [H ])[H O]
+
+
+
+
= =
+
(I.1.50)
Viteza general a procesului de nitrozare a DMA cu NO2
-
poate fi redat prin expresia:
2 3
2 2 2 2
1 3 2 4 2 2
N O 3 2 3 2 2 NO
2 2
K k [NO ] [H ] k K [NO ] [H ]
Wt W W [(CH ) NH] [(CH ) NH]
[H O] (Ka [H ]) [H O] (Ka [H ])
+
+ +
+ +
= + = +
+ +
(I.1.51)
Exprimm:
1 3
A
2
K k
K
[H O]
= ;
4 2
B
2
k K
K
[H O]
= (I.1.52)
Expresia vitezei totale va fi:
2 2 2 2
2 2
A 3 2 B 3 2 2
[NO ] [H ] [NO ] [H ]
Wt K [(CH ) NH] K [(CH ) NH]
(Ka [H ]) (Ka [H ])
+ +
+ +
= +
+ +
, (I.1.53)
unde KA i KB constante ce caracterizeaz participarea N2O3 i NO
+
, corespunztor, n procesul de nitrozare. Utiliznd datele obinute din studiile experimentale, au fost calculate mrimile
constantelor de vitez (k3, k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab. I.1.4) [50].
Tabelul I.1.4
Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor, KA i KB

Constanta de vitez, M
-1
s
-1

Amine nitrozate
DMA DEA MOR Pip.
k3
k4
KA
KB
1,68x10
5
1,18x10
8
35,55
5,12
1,26x10
4
1,84x10
6
10,55
8,5
1,21x10
7
7,68x10
9
2304,27
0,05
9,7x10
4
6,74x10
7
20,23
13,30

Din comparaia mrimilor obinute pentru constantele de vitez constatm c NO
+
este un agent de nitrozare cu mult mai activ dect N2O3 (k4>>k3) [50,53]. Dar, n rezultatul
studiilor experimentale s-a constatat c KA>KB (Tab. I.1.4).
Aceast neconcordan ntre constantele de vitez i KA, KB poate fi determinat de concentraia agenilor de nitrozare ce se formeaz n mediul de reacie. Pentru a concretiza
aceast presupunere, calculm concentraiile teoretice ale NO
+
i N2O3 la diferite pH-uri. n acest scop a fost elaborat un model matematic, iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine
secundare
2
NO

.

Modelarea matematic a procesului de nitrozare a aminelor
Modelarea matematic s-a realizat n baza experimentului real al nitrozrii metiluree. Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatur constant. Probele din ambele celule cu
2
NO

i substrat (1 i 2, corespunztor) au fost aduse la pH-ul necesar i termostatate cu termostatul U-10. Dup termostatare soluia din celula 1 se trece n celula 2. Momentul
omogenizrii (t = 0) se consider momentul iniial al reaciei, caracterizat prin vectorul Z, ai crui componeni reprezint concentraiile tuturor speciilor recalculate n volumul reactant:
Z{[MU]0, [NMU]0, [H3O+]0, [NO2
-
]0, [HNO2]0, [N2O3][NO
+
]0}t = 0
La evaluarea computaional a vectorului Z a fost aplicat metoda numeric Newton-Rafson, al crei algoritm este expus n limbajul de programare TP7.0.
La soluionarea modelului static prin experimentul computaional s-au determinat condiiile iniiale (concentraiile speciilor n soluia 1) la timpul = 0 i la momentul cnd se
atinge echilibrul chimic = e, unde valoarea e este necunoscut (Tab. I.1.5).

14

Tabelul I.1.5
Determinarea computaional a concentraiilor speciilor din soluia 1
i a componentelor vectorului Z
Determinarea computaional a concentraiilor speciilor n soluia 1
specia
2
NO


H3O
+
HNO2 NO
+
N2O3
C10,M
C1e,M
2,0010
-4

7,8310
-6

1,0010
-2

9,8010
-3

0,00+00
1,9210
-4

0,00+00
5,6510
-12

0,00+00
1,110
-10

Determinarea computaional a componentelor vectorului Z
specia
2
NO


H3O
+
HNO2 N2O3 MU NMU
Ct=0, M 3,9210
-6
9,9010
-3
9,6110
-5
5,5410
-11
1,0010
-3
0,00+0

n Figura I.1.6 se prezint dependena concentraiei speciilor la echilibru n funcie de aciditatea soluiilor (-lg[H3O
+
]1e), evaluate computaional cu ajutorul programului NITRIT.PAS la
valoarea fixat a [NO2
-
]10 = 210
-4
M. Experimentul computaional indic (Fig. I.1.6) c la echilibru concentraia agentului de nitrozare N2O3 (10
-10
M) este cu dou ordine mai mare
dect concentraia cationului de nitrozoniu (~10
-12
M) i variaz n funcie de pH. n Figura I.1.7 este prezentat dependena raportului [NO
+
]1e/[N2O3]1e n funcie de aciditatea
soluiei, din care constatm c acest raport crete mai intens ncepnd cu pH<2 (Fig. I.1.7).

Fig. I.1.6. Concentraiile speciilor agenilor de nitrozare la echilibru n funcie de pH;
[NO2
-
]0 = 2 10
-4
M, t = 25C.

Fig. I.1.7. Raportul concentraiilor agenilor de nitrozare n funcie de pH;
[NO2
-
]0 = 2 10
-4
M, t = 25C.

15

Pentru optimizarea constantelor de vitez s-a asamblat un program OPTIMK.PAS, unde concentraiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de
integrare numeric.
n Figura I.1.8 sunt prezentate n scar semilogaritmic curbele cinetice evaluate computaional prin soluionarea modelului dinamic la t = 25C i la valorile cunoscute ale
vectorilor Z i g. Concentraiile tuturor speciilor, n afar de produsul de reacie, la timpul t = 10
-10
s (t 0) nu sunt nule, mulimea lor alctuiete elementele vectorului Z. Conform
experimentului computaional, procesul de nitrozare poate fi mprit n patru etape. Prima etap este cuprins n limitele 10
-10
t 10
-7
s i n aceast perioad sistemul se afl ntr-o stare
staionar. Etapa a doua, cuprins n segmentul de timp 10
-7
t 10
-4
s, ncepe odat cu consumul cationului de nitrozoniu (10
-7
t 10
-6,5
s), consumarea parial a agetului de nitrozare N2O3
se observ puin mai trziu, n intervalul 10
-6
t 10
-4
s. n continuare, procesul trece iari ntr-o stare staionar ce dureaz pn la t = 1s (etapa III). Ultima etap este cuprins n intervalul 1
t 5s, n care se observ consumul speciilor HNO2, NO2
-
,

N2O3, MU i formarea produsului reaciei NMU.
Din concentraiile speciilor prezentate n sistem (Fig. I.1.8) constatm c concentraia NO2
-
la intervalul de pH 1,0-2,0 este cu mult mai mic (de ordinul 10
-7
-10
-6
M) dect a HNO2
(de ordinul 10
-5
M). Astfel, s-a demonstrat c n sistem specia principal la pH<2 este HNO2; astfel, NO2
-
este transformat n HNO2. Concentraia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10
-
11
M, iar concentraia NO
+
este de ordinul aproximativ 10
-15
-10
-12
M.
Din Figura I.1.7 constatm c n cazul cnd pH<2 raportul [NO
+
]/[N2O3] crete brusc; astfel, principalul agent de nitrozare este NO
+
, iar la pH>2 n procesul de nitrozare particip
preponderent N2O3. Dar, deoarece produsul k4[NO
+
]k3[N2O3] la pH 2,5, am putea presupune c n procesul de nitrozare particip ambii ageni de nitrozare.

Fig. I.1.8. Curbele cinetice determinate computaional,
pH = 1,25, [NO2
-
]0 = 1 10
-4
M, [MU]0 = 1 10
-3
M.

Folosind mrimile concentraiilor agenilor de nitrozare, calculate prin metoda computaional, se pot explica variaiile densitii optice la = 230 nm. Studiind variaia
concentraiei NO2
-
la max = 230 nm n funcie de pH, constatm c la pH3,5 absorbia este determinat de HNO2, iar n mediul puternic acid de ionul NO
+
(H2O
+
NO). Astfel, diminuarea
absorbiei A230 n sectorul I poate fi explicat prin micorarea concentraiei HNO2 cu transformarea lui n N2O3 (Fig. I.1.9).
Din datele calculate (Fig. I.1.7) observm c la pH<2 practic se stopeaz acumularea N2O3 n sistem i concentraia lui rmne aproape constant. De aici reies c creterea A230 n
sectorul II este determinat de acumularea NO
+
. Variaia concentraiei NO
+
a fost determinat dup formarea complexului NOSCN (Fig. I.1.10), care absoarbe la = 490 nm.


Fig. I.1.9. Variaia densitii optice
a diferitelor specii n soluiile de ioni nitrii n funcie de pH.
Fig. I.1.10. Variaia densitii optice
a compusului NOSCN n funcie de pH pentru diferite [NO2
-
].
I.1.6. Influena inhibitorilor asupra procesului de nitrozare
a aminelor secundare alifatice
Pentru a diminua concentraia NDMA i NDEA au fost utilizai diferii inhibitori: acidul dihidroxifumaric (DFH4), dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na, (+)-catehina, esterul
dimetilic al acidului tartic (EDMT), rezveratrolul (Rezv.) i extractul enotaninic.
C(NO2

) = 110
-4
M
C(NO2

) = 110
-3
M
C(NO2

) = 510
-4
M
C(NaNO2

) = 510
-4
M

16

OH
HO
Rezveratrol
C
2
H
5
OOCH CH COO C
2
H
5
HO OH
EDEAT


Fig. I.1.11. Formule de structur a inhibitorilor utilizai
n procesul de nitrozare a DMA i DEA.

I.1.6.1. Influena derivailor acidului tartric asupra nitrozrii DMA i DEA
Pentru a micora concentraia NNA formate n diferite sisteme in vivo i in vitro, este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiie. n acest scop s-a cercetat viteza procesului de
formare a NNA i de consum a NO2
-
n prezena derivailor acidului tartric

n funcie de concentraia reductorilor n intervalul 110
-5
- 110
-3
M [52,56]:
3 2 3 2 3 2 3 2 3 2
1 2 5 3 5 4 4 5 4
DFH N DFH N DFH N DFH N DFH N
(C 0, C 1 10 M, C 5 10 M, C 1 10 M, C 5 10 M)

= = = = =

Procesul de inhibiie s-a studiat n condiiile cnd concentraia ionilor nitrii a fost mai mic dect concentraia substratului de nitrozare ([NO2
-
]0 = 110
-4
M, [DMA]0 = = 110
-3
M),
iar pH-ul mediului 3,4 i temperatura de incubare 37C.
Rezultatele experimentale prezentate n Figura I.1.12(a) cu privire la procesul de inhibiie studiat dup viteza de formare a NDMA indic la faptul c, odat cu creterea
concentraiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I), are loc micorarea vitezei de nitrozare i creterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52].
Concentraia NDMA formate n sistemul DMA NO2
-
DFH3Na scade la mrirea concentraiile inhibitorului (Fig. I.1.12(b)). Pentru intervalul de concentraii ale DFH3Na 10-500
M concentraia NDMA peste 90 min. scade de la 180 M pn la 40 M (Fig. I.1.12(b)). n aceleai condiii experimentale a fost studiat procesul de inhibiie pentru formarea NDEA (Fig.
I.1.13). Rezultatele experimentale obinute pentru ambele amine (DEA, DMA) att dup concentraia NNA formate, ct i dup consumul de ioni nitrii n prezena DFH3Na, sunt prezentate n Tabelul
I.1.6 i n Figura I.1.13(a). Concentraia NDMA formate la nitrozare n absena inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare dect a NDEA. Cota-parte de NDMA se micoreaz de 4,5 ori
(de la 18% pn la 4,0%) cu creterea [DFH3Na]0 n intervalul dat, iar pentru NDEA de ~ 3 ori (de la 6,3 la 2,2%). Viteza de consum a nitriilor n procesul de nitrozare a aminelor crete
i n ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10
-4
M este de 100%.




Fig. I.1.12(a). Viteza de formare a NDMA (I) i de consum a NO2
-
(II)
n f[DFH3Na]0; [DMA]0 = 1 10
-3
M,
[NO2
-
]0 = 110
-4
M, pH 3,5, t = 37C.

Fig. I.1.12(b). Curbele cinetice de formare a NDMA n f [DFH3Na]0, [DMA]0 = 110
-3
M,
[NO2
-
]0 = 110
-4
M, pH 3,5, t = 37C.


Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiie (GI) la formarea NDEA i NDMA n funcie de [NFH3Na]0 i s-a constatat c GI crete cu creterea [DFH3Na]0 (Fig.
I.1.13), iar n cromatogram se observ scderea [NDEA].
Tabelul I.1.6

17

Nitrozarea DMA i DEA n f [DFH3Na]0, [DMA]0 = [DEA]0 = 1 10
-3
M,
[NO2
-
]0 = 110
-4
M, pH 3,5, t = 37C
a)
b)
Fig. I.1.13. Dependena gradului de inhibiie n f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA i DMA (a),
(b) cromatograma variaiei concentraiei NDEA (metoda ATE) n funcie de [DFHNa]0.

Pentru a micora viteza procesului de nitrozare a aminelor, de rnd cu DFH3Na, s-a utilizat i DFH4. Procesul de nitrozare s-a efectuat n urmtoarele condiii: [NO2
-
]0 = = 5,9 mM,
[DEA]0 = 5,9 mM, [NaCl] = 1,1810
-2
M, pH = 2,8 soluiei-tampon citrat-fosfat, t = 37C. Timpul de incubare a alctuit 60 min. Concentraia de DFH4 a variat n felul urmtor:
4
DFH
1
C = 0,25 mM;
4
DFH
2
C = 0,75 mM;
4
DFH
3
C = 1,00 mM;
4
DFH
4
C = = 1,25 mM;
4
DFH
5
C = 1,5 mM i
4
DFH
6
C = 0. Pentru determinarea NDEA
s-a utilizat metoda ATE.

Tabelul I.1.7
Variaia concentraiei NDEA n funcie de [DFH4]0 ; [NO2
-
] = 5,9 mM, pH
2,8, t = 37C

DMA DEA
Formarea NDMA Consumul
NO2
-

Formarea NDEA Consumul
NO2
-

[DFH3Na]0 10
4
M [NDMA] la 90
min.,
10
4
M
Wini,
10
7
Ms
-1

% de
NDMA
format
Wini,
10
7
Ms
-1

% NO2
-
redus la
90 min.
[NDEA] la 90
min.,
10
4
M
Wini,
10
7
M*s
-1

% de NDEA
format
Wini,
10
7
Ms
-1

% NO2
-
redus
la
90 min.
0,0
0,1
0,5
1,0
5,0
1,80
1,10
0,8
0,58
0,40
1,5
0,9
0,4
0,3
0,1
18,0
11,0
8,0
5,8
4,0
0,33
0,50
0,66
1,16
1,88
50
55
62
80
98
0,63
0,52
0,44
0,33
0,22
0.83
0,72
0,50
0,25
0,08
6,3
5,2
4,4
3,3
2,2
0,33
0,58
0,75
1,0
1,33
40
55
60
78
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
GI, %
0.1 0.5 1.0 5.0
[DFH3Na]o, x10^-4 M
NDEA
NDMA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
GI, %
0.25 0.75 1.00 1.50
[DFH4]o, mM

18

[DFH4]0, mM Concentraia NDEA
Grad de
inhibiie
mM % %
0,00 0,98 0,019 0
0,25 0,91 0,018 7,14
0,75 0,72 0,014 26,5
1,00 0,20 0,004 79,6
1,50 0,14 0,003 85,7
Fig. I.1.14. Dependena GI de [DFH3Na].

Din datele experimentale prezentate n Tabelul I.1.7 constatm c concentraia NDEA, determinat dup 60 min. de incubare a DMA cu NO2
-
, scade odat cu creterea
concentraiei de DFH4. Gradul de inhibiie a fost determinat dup urmtoarea formul:
GI = (A-B)/A 100 %, unde A concentraia NDEA fr inhibitor;
B concentraia NDEA n prezena lui.
La variaia concentraiei DFH4 n intervalul 0,25-1,5 mM GI crete de la 7,14 pn la 85%. Din rezultatele experimentale s-a constatat c cota-parte de DEA transformat n NDEA
n aceste condiii (timp de 60 min.) este destul de mic i se micoreaz cu creterea [DFH4]0; de la 0,019% (fr inhibitor) pn la 0,003%.
Influena esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMA
Esterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric, care, la rndul su, a fost obinut din produse secundare vinicole. Acest inhibitor a fost utilizat n sistemul DMA-
NO2
-
la pH 3,4, t = 37
o
C n intervalul de concentraii 110
-5
110
-3
M. Efectul reducerii ionilor nitrii sub aciunea EDMT variaz de la 15,5 la 52,5% pentru un interval de [EDMT]o destul de
larg (0,1-10,010
-4
M) (Tab. I.1.8). Dac comparm efectul reducerii NO2
-
n prezena Ent, DH3Na, (+)-catehina cu efectul reducerii n prezena EDMT, constatm c ultimul are cel mai mic
grad de reducere a ionilor nitrii (Fig. I.1.15).
Tabelul I.1.8
Variaia parametrilor cinetici n sistemul DMA-NO2
-
n f[EDMT]0 i [SCN
-
]0;
[NO2
-
] = 110
-4
M, [DMA] = 110
-3
M
[EDMT]o
10
4
M
Wini
10
7
Ms
-1

[NO2
-
]
10
5
M
(20 min.)
Efectul
reducerii NO2
-
, %
n prezena [SCN
-
]
n sistemul NO2
-
- DMA
[SCN
-
]
10
3
M
Wini
10
7
M s
-1

Reducerea NO2
-
,

%
0,1
0,5
1,0
5,0
10,0
0,5
1,0
1,1
2,0
2,3
7,6
6,8
6,4
5,3
4,3
15,5
24,4
28,8
41,4
52,2
0,05
0,1
1,0
5,0
0,08
0,25
0,33
0,53
17,6
20,0
31,3
40,6


Fig. I.1.15. Efectul total de reducere a NO2
-
n funcie de natura reductorului la [Red]0 = 110
-4
M, [NO2
-
] = 110
-4
M, [DMA]0 = 110
-3
M, t = 37C, pH 3,5.
I.1.6.2. Influena (+)-catehinei asupra nitrozrii DMA i DEA
Din grupa polifenolilor n calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a aminelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18], cvercetina, rezveratrolul, enotatina solubil i
insolubil.Viteza iniial de interaciune a DMA cu NO2
-
se micoreaz odat cu creterea concentraiei (+)-catehinei n intervalul 0 - 510
-4
M, iar viteza de consum al ionilor nitrit crete. n
acest caz are loc concurena pentru agentul de nitrozare ntre substrat i (+)-catehin.
Tabelul I.1.9
Aciunea (+)-catehinei n procesul de nitrozare a DMA cu NO2
-
;
[DMA] = 110
-3
M, [NO2
-
] = 110
-4
M, pH 3,5, t = 37
o
C

Dup variaia [NDMA] Dup consumul [NO2
-
]
[(+)-Ct]
10
5
M
Wini
10
7
Ms
-1

% de NDMA
[NDMA]
10
4
M la
t = 90 min.
GI,
%
Wini
10
7
Ms
-1
[NO2
-
]
10
4
M la
t = 90 min.
Reducerea NO2
-
la
90 min., %

19

0,0
1,0
5,0
10,0
50,0
1,46
0,80
0,30
0,16
0,05
18,0
10,0
4,8
3,0
1,0
1,80
1,08
0,78
0,30
0,10
0,0
40
73
83
94
0,53
0,66
0,86
1,4
2,0
0,58
0,33
0,36
0,10
0,01
42
67
74
90
99

Din Tabelul I.1.9 constatm c gradul de inhibiie n procesul de formare a NDMA crete n intervalul 0,0-94% pentru domeniul dat de concentraie a (+)-catehinei, iar efectul
reducerii nitriilor crete de la 42% (pentru sistemul fr (+)-catehin) pn la 99% (pentru C(+)-ct=510
-4
M).
n cazul raportului dintre [(+)-Ct]:[NO2
-
] = 1 GI atinge 83%, iar pentru raportul [(+)-Ct]o: [NO2
-
]o >1 n sistemul dat procesul de nitrozare se inhib aproape complet (94%) [56].
Dac comparm GI la formarea NDMA n prezena DFH3Na cu GI al (+)-Ct i DFH4 , observm c efectul inhibitor al DFH4 i (+)-catehinei este mai nalt dect al DFH3Na (Fig.
I.1.16) n aceste condiii.


Fig. I.1.16. Dependena GI
n funcie de [RedH2].
Fig. I.1.17. Dependena vitezei de consum a [NO2] n f [RedH2] n sistem DMA-NO2
-
-RedH2, pH 3,4, t
= 37C, [DMA]0 = 110
-3
M, [NO2
-
]0 = 110
-4
M.
Viteza de consum a [NO2
-
] n prezena (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum n prezena DFH3Na i (DFH4) (Fig. I.1.17). Astfel, constatm c DFH4 are o capacitate de
inhibiie mai mare comparabil cu (+)-Ct i este mai activ dect DFH3Na.

I.1.6.3. Influena enoxilului asupra nitrozrii dimetilaminei
Enotaninele se gsesc n poam i reprezint un amestec complex de catehine i epicatehine, care conin n compoziia lor forme monomerice pn la oligomerice [48]. Lanul de
polimeri se formeaz n rezultatul condensrii grupelor funcionale la atomul de carbon C4 n ciclul C i atomul C8 n ciclul A. Aceti compui se caracterizeaz prin solubilitate sczut n ap;
astfel, utilizarea lor n diferite domenii este dificil. Enoxilul este un produs obinut la oxidarea enotaninelor cu H2O2 [49], care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine i
epicatehine cu formarea derivailor monomerici ce conin grupe hidroxile [48].
Scopul principal al acestor investigaii rezid n cercetarea procesului de formare a NNA n prezena enoxilului. Lund n consideraie prezena grupelor hidroxile n compoziia
enoxilului, am presupus rolul lui n calitate de inhibitor n procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2
-
. Procesul de nitrozare s-a studiat dup viteza de consum a NO2
-
.
Concentraia enoxilului, ce reprezint extractul (din semine de struguri) de enotanine solubilizate (Ent), a fost variat n intervalul 0-0,3 g/l pentru a studia inhibiia procesului de nitrozare a
DMA cu NO2
-
la pH 2,6, t = 37C.
Din rezultatele experimentale s-a constatat c enotaninele interacioneaz cu ionii nitrii i viteza de consum a ionilor nitrii crete odat cu mrirea concentraiei lor. Efectul
reducerii ionilor nitrii n sistemul NO2
-
Ent n funcie de diferite concentraii de reductor (0,003-0,3 g/l) variaz n intervalul 15,4-68,0% (Tab. I.1.10) [57].
n prezena DMA n sistemul NO2
-
Ent DMA are loc o reducere a NO2
-
mai mare fa de sistemul NO2
-
Ent. n acest caz, efectul reducerii ionilor nitrii crete pn la 79%
(Tab. I.1.10). Astfel, constatm c n prezena aminei efectul diminurii NO2
-
sub aciunea Ent este mai mare dect n absena ei. La concentraia Ent de 0,12 g/l efectul reducerii ionilor nitrii
este prezentat n Figura I.1.18. n concuren pentru nitrii enotaninile interacioneaz cu o vitez mai mare n prezena a DMA:
2
Ent NO
W

+
= = 2,0810
-7
M/s,
2
DMA NO
W

+

= 1,710
-7
M/s,
2
Ent DMA NO
W

+ +

= 3,4310
-7
M/s, pentru [Ent]o = = 0,1g/l (Fig. I.1.19).
n sistemul Ent NO2
-
DMA, Wini crete semnificativ n intervalul concentraiilor de Ent ntre 0,03-0,12 g/l, iar efectul maxim de reducere al NO2
-
atinge 65,7%. Mrirea n
continuare a concentraiei de Ent de 3 ori nu duce la o cretere proporional a vitezei iniiale (Fig. I.1.19). n sistemul Ent NO2
-
, viteza iniial a reaciei crete n intervalul 0,2510
-7

5,5810
-7
Ms
-1
odat cu creterea concentraiei reductorului [57,58]. Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare i substratul nitrozat.
Viteza de consum a ionilor nitrii n prezena Ent depinde de pH-ul mediului. S-a constatat c Wi de consum a ionilor nitrii n intervalul de pH 1,5-2,6 este maxim, iar cu creterea
ulterioar a pH-ului viteza scade brusc. La pH-uri mai nalte viteza de interaciune a Ent cu ionii nitrii scade datorit transformrilor ce au loc n structura lor. Grupele hidroxile, ce se gsesc n
structura acestor compui, odat cu creterea pH-ului ar putea s se oxideze formnd compui chinonici. La fel, asupra vitezei reaciei influeneaz concentraia agenilor de nitrozare, care scade
cu mrirea pH-ului (pH>3,4).

Tabelul I.1.10
Variaia parametrilor cinetici n f[Ent]0 n sistemul NO2
-
Ent i NO2
-
DMA Ent;
[NO2
-
] = 110
-4
M, [DMA] = 110
-3
M, pH 2,6 t = 37
o
C

Sistemul NO2
-
Ent Sistemul DMANO2
-
Ent
[Ent]0,
g/l
Wini
10
7
Ms
-1

[NO2
-
]
10
5
M
(20 min.)
Efectul
reducerii NO2
-
, %

Winit
10
7
Ms
-1
[NO2
-
]
10
5
M
(20 min.)
Efectul
reducerii NO2
-
, %
0,0
0,003
0,015
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,30
0,25
0,36
0,45
0,85
1,36
1,75
2,08
3,00
5,58
8,46
8,44
8,26
7,50
7,23
6,27
6,03
5,40
3,20
15,4
15,6
17,4
25,0
27,7
37,3
39,7
46,0
68,0
1,73
1,97
2,06
2,25
5,53
6,2
6,59
7,02
7,52
6,83
6,74
6,58
6,52
4,05
3,75
3,43
3,24
2,10
31,7
32,6
34,2
36,8
59,5
62,5
65,7
67,6
79,0

20

0
20
40
60
80
R
e
d
u
c
e
r
e
a

n
i
t
r
i
t
u
l
u
i
,

%
1 3 5 10 15 20
Timpul de reactie, min
DMA Reducator DMA+Reducator


Fig. I.1.18. Efectului de reducere al [NO2
-
]
la interaciunea lor n sistem cu DMA, Ent,
DMA + Ent; [Ent]0 = 0,12g/l; [NO2
-
] = 110
-4
M, [DMA] = 110
-3
M, pH 2,6, t = 37C.
Fig. I.1.19. Variaia WI de consum a NO2
-

n funcie de concentraia inhibitorului; [NO2
-
] = 110
-4
M, [DMA] = 110
-3
M,
pH 2,6, t = 37C.

Astfel, constatm c enotaninele, obinute din semine de struguri i supuse solubilizrii n intervalul de concentraii 0,003-0,3 g/l, micoreaz coninutul ionilor nitrii n sistem,
astfel manifestnd proprieti de antioxidant. Efectul reducerii ionilor nitrii n sistemul EntNO2
-
pentru concentraia maxim (0,3 g/l) de Ent utilizat atinge 68%. n prezena DMA
concentraia ionilor nitrii se micoreaz semnificativ, datorit participrii lor n procesul de nitrozare a substratului dat; iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0,003-0,1g/l atinge 62,5%. Creterea de
mai departe a [Ent]0 nu influeneaz semnificativ asupra efectului reducerii [NO2
-
]; astfel, mrirea [Ent]0 de 3 ori (de la 0,1 la 0,3 g/l) duce la creterea efectului reducerii cu ~11%. n
sistemul Ent NO2
-
DMA viteza maxim de reducere a ionilor nitrii este la pH 2,6.
Concluzii
n baza datelor cinetice obinute experimental n procesul de formare a NDMA i NDEA studiat dup variaia concentraiei NNA i consumul ionilor nitrii n procesul de nitrozare
a DMA i DEA constatm:
viteza de consum a ionilor nitrii, aminelor i acumularea NNA formate crete cu mrirea
2 0
[NO ] ,

[DMA]0 i [DEA]. Viteza procesului trece prin maximul la pH3,5;

viteza procesului de formare a NDMA este mai mare dect a NDEA pentru aceleai condiii de reacie. Aceast diferen este condiionat de structura lor, care confer o bazicitate
mai nalt pentru DEA i astfel o vitez mai mic de nitrozare;
viteza procesului de nitrozare, determinat dup formarea NNA, este mai mic ca viteza de consum a reactanilor, iar neegalitatea vitezelor indic asupra formrii intermediarilor n
sistem:
d[NNA]
dt
<
2
d[NO ]
dt

;
d[NNA]
dt
<
2
d[R NH]
dt

Ionii nitrii n mediul acid formeaz diferii ageni de nitrozare (NO
+
, H2NO2
+
, N2O3), care particip la nitrozarea aminelor secundare alifatice:
3
k
2 3 2 2 2
N O R NH R N NO H O + = +
4
k
2 2 2 2 3
H NO R NH R N NO H O
+ +
+ = +
apariia maximului vitezei de formare a NDMA i NDEA n funcie de pH la
pH 3,5 este determinat de faptul c n sistem la pH>3,5 are loc micorarea concentraiei N2O3, care este agentul principal de nitrozare, iar la pH<3,5 concentraia lui N2O3 se
micoreaz i ncepe s creasc concentraia NO
+
. Dar, cu toate c NO
+
este un agent de nitrozare mai activ dect N2O3, viteza procesului de formare a NNA se micoreaz. Aceast
micorare a vitezei este condiionat de protonarea aminelor la pH sczut;
s-au determinat, prin evaluarea computaional, concentraiile speciilor agenilor de nitrozare la echilibru n funcie de pH n sistemul NO2
-
H3O soluionat ntr-un model static i s-a
constatat c concentraia agentului de nitrozare N2O3 este aproximativ cu dou ordine mai mare dect concentraia cationului de nitrozoniu i c, odat cu creterea aciditii soluiei
n sistemul dat, crete brusc concentraia NO
+
;
prin soluionarea modelului dinamic s-a constatat la fel c cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ; astfel, cu mrirea pH-ului n sistem ncepe s creasc aportul
agentului N2O3;
procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea urmtorilor reductoni: DFH4, DFH3Na, (+)-catehin, enoxil, esterul dimetilic al DFH4 i al
acidului tartric. Dup efectul reducerii ionilor nitrii inhibitorii pot fi aranjai n urmtorul ir:
EDET< ENOXIL < EDMD< DFH3Na < (+)-Ct < DFH4
gradul de inhibiie a reductorilor, determinat dup formarea NNA, depinde de natura inhibitorului, de raportul [Inh]0/ [NO2
-
] i de natura substratului de nitrozare. S-a constatat c
cu ct aminele alifatice sunt mai slab bazice, cu att mai mic este gradul de inhibiie.

I.2. Nitrozarea aminelor ciclice
I.2.1. Nitrozarea morfolinei
I.2.1.1. Formarea agenilor de nitrozare i efectele toxice asupra organismului
Expunerea profesional i a mediului ambiant la NNC este considerat a fi un potenial pericol pentru sntatea populaiei [59-61]. Precursorii NNC, ionii nitrii i aminele
secundare se conin n multe alimente i pot interaciona n condiii acide n stomac. Morfolina, ca amin secundar, este utilizat pe larg n producerea cauciucului i poate fi convertit la N-
nitrozomorfolin (NMOR) (Fig. I.2.1) n prezena nitritului deopotriv in vivo i in vitro [60]. N-nitrozomorfolina a fost depistat ca o impuritate n morfolin (0,8 mg/kg), n gazele de
evacuare din industria cauciucului. n solul din mprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat n concentraie de 4,4 mg/kg. Este posibil ca NMOR s se formeze i n
rezultatul transnitrozrii din N-nitrozodifenilamin, care se formeaz la producerea anvelopelor mpreun cu morfolina. N-nitrozomorfolina este prezent n aerul atmosferic al uzinelor de
producere a chimicalelor (10-40 mg/m
3
) [20]. La fel, populaia poate fi expus la morfolin i NMOR prin alimentaie, produse cosmetice i fumul de igri [62,63]. Produsele alimentare
pot fi contaminate la tratarea direct, de exemplu, a fructelor acoperite cu cear (care conine morfolin) n scopuri de conservare, la utilizarea ambalajului (0,098-8,4 mg/kg), la tratarea cu
aburi n timpul procesrii.
N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic, iar n prezena N-nitrozodietilaminei produce carcinom celular hepatic cu rspndirea metastazelor n plmni (100%) [64].
Mecanismele efectelor citotoxice i genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse. Alchilnitrozoamidele sunt ageni de alchilare direct a ADN prin mecanismul SN1 i nu necesit activare
metabolic (metileaz toi atomii de oxigen i aproape toi atomii de azot). Leziunea mutagenic principal format de alchil-nitrozoamide
este la O
6
-metilguanina [65,66]. Alchilarea n poziia O
6
este responsabil de mutagenitatea i cancerigenitatea agenilor de alchilare. NMOR
este un cancerigen cu aciune indirect, care acioneaz asupra ADN, ducnd la ruperi mono- i dicatenare [67]. Acest tip de NNA sunt
activate prin reducerea nitrogruprilor la N-hidroxilaminele din ADN [68,69].
n acord cu Appel i Graf [70], aciunea indirect are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) n rezultatul transferului unui
electron de la fierul citocromului P450, rezultnd amina secundar i NO care, la rndul su, ar putea ataca ADN.
Efectul genotoxic i clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale oarecilor [71] i Hep62 [72],
Fig. I.2.1.
Structura NMOR.
W
i
n
i

1
0
7
M
/
s

21

dar i pentru celulele V79 i VH10 [72,73] cu un nivel sczut de metabolizare enzimatic.
N-nitrozoaminele se formeaz n rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferii ageni de nitrozare, care se pot forma in vivo. Este cunoscut faptul c monoxidul de azot (NO)
poate fi generat n organism de o larg varietate de celule din arginin, n prezena unor enzime. n organism, NO este un important mediator fiziologic n relaxarea muchilor,
neurotransmisie i reglarea presiunii sangvine [74]. Dei n majoritatea sistemelor biologice coninutul de NO este de ordinul nanomolilor, el poate reaciona eficient cu radicalii superoxizi
(O2
-
) ntr-un proces controlat de difuzie [k (NO+ O2
-
) = (3,9-19)x10
9
M
-1
s
-1
(75-77)], formnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO
-
/ONOOH) [78,79], ns ntr-o concentraie
mic. n condiii patologice, concentraia NO crete i poate atinge 30 M [80,81], formnd n continuare diferii ageni de nitrozare [82]:
2 NO + O2 2 NO2 k1 = 2,9 10
6
M
-2
s
-1
(I.2.1)

NO + NO2 N2O3 k2 = 1,1 10
9
M
-1
s
-1
(I.2.2)
k -2 = 5,03 10
4
s
-1


2 NO2 N2O4 2k3 = 9 10
8
M
-1
s
-1
(I.2.3)
k -3 = 1,38 10
4
s
-1

Dup cum am menionat mai sus, macrofagii activai produc NO, care poate reaciona cu O2 sau O2
.
i forma ageni de nitrozare (N2O3) [82]. De rnd cu N2O3, NO poate reaciona
extracelular cu O2 formnd NO2
-
i NMOR n prezena morfolinei [85-87].
2NO + O2 2 NO2 (I.2.4)
NO + NO2 N2O3 (I.2.5)
N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2
-
+ 2H
+
(I.2.6)
N2O3 + MOR NMOR + NO2
-
+ 2H
+
(I.2.7)
N2O3 + X
-
+ H2O HX + 2 NO2
-
+ 2H
+
(I.2.8)
La pH fiziologic, cnd echilibrul n reacia (I.2.6) este deplasat spre dreapta, produsul este NO2
-
. Reacia (I.2.8) este, n esen, o hidroliz n prezena diferiilor anioni (X
-
= Cl
-
, I
-
,
Br
-
, CN
-
.a.). S-a stabilit c ionii de Cl
-
particip n astfel de reacii la pH fiziologic i constantele de vitez au fost deja determinate [85].
Formarea NO3
-
la oxidarea NO cu O2 nu are loc. Determinarea concentraiilor de NO format n sistem a permis de a constata c numai 476% din cantitatea de NO2
-
revine NO
eliminat. Deci, autorii [86] constat c schema redat mai sus este responsabil numai pentru jumtate din cantitatea de NO2
-
format i c este posibil prezena unor alte ci de formare a NO2
-
.
Ionii nitrii se pot forma la fel n rezultatul interaciunii NO cu O2
-
, care se formeaz concomitent n mediile de cultur [87,69]. Produsul reaciei dintre NO i O2
-
este ONOO
-
, care
n continuare reacioneaz cu NO i, n rezultat, are loc formarea NO2
-
i NO2 [86,74]:
NO + O2
-

9
k
ONOO
-
(I.2.9)
NO + ONOO
-
NO2
-
+ NO2 (I.2.10)
n schema general ce include reaciile (I.2.4)-(I.2.10) stoechiometria general de formare a NO2
-
n prezena superoxiddismutazei (SOD) este:
3NO + O2
-
+ H2O
SOD
3 NO2
-
+ 2H
+
(I.2.11)
Astfel, numai un mol de O2
-
este consumat pentru formarea a trei moli de NO2
-
. Interaciunea peroxinitritului cu NO este demonstrat prin capacitatea lui NO de a inhiba parial
hidroxilarea benzoatului mediat de peroxinitrit. Constanta de vitez pentru formarea ONO2
-
este k9 = 6,7x10
9
M
-1
s
-1
[86]. n prezena O2
-
au loc la fel reacii adugtoare, ce descriu formarea
NO3
-
:
ONOO
-
NO3
-
(I.2.12)
O2
-
+ H2O
SOD
O2 + H2O2 +OH
-
(I.2.13)
Constantele de vitez sunt: pentru k11 = 1s
-1
i pentru k12 = 2,5x10
9
M
-1
s
-1
. Astfel, viteza de formare a NO3
-
este proporional cu [ONO2
-
] (reacia I.2.12), care este aproximativ
proporional cu raportul [NO]/[O2
-
] (reacia I.2.9). Valorile raportului [NO3
-
]/[NO2
-
] pentru culturi de macrofagi variaz ntre 0,67 i 1,0 [86].
Apariia NO n fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2
-
i NO3
-
, care au fost formai cu viteze aproximativ egale. Adugarea superoxiddismutazei n mediul de reacie reduce
vizibil raportul dintre [NO3
-
] i [NO2
-
] datorit micorrii [O2
-
] (reacia I.2.13) [86].
Adugarea morfolinei n acest sistem a rezultat cu formarea NMOR, concurent cu ceilali produi. Astfel, formarea NMOR poate avea loc i la pH fiziologic (7,4), iar concentraia
ei coreleaz cu concentraia NO, care apare n fluidul extracelular ntr-o cultur n suspensie de macrofagi.
Lund n consideraie c NMOR este un cancerigen, care produce carcinom hepatic, cu inducerea metastazelor n diferite organe, studiul procesului de nitrozare i inhibiie a
formrii N-nitrozomorfolinei are o nsemntate deosebit. Elaborarea unor noi metode de inhibiie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraia NMOR ce se poate forma in vivo
i in vitro.
n acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraii ale reactanilor, similare celor ce se gsesc n sistemele reale i, n condiiile date, s-a
determinat influena unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR.

I.2.1.2. Legiti cinetice n procesul de nitrozare a morfolinei cu nitrii
Nitrozarea morfolinei cu ioni nitrii s-a studiat n sisteme-model dup variaia concentraiei ionilor nitrii i dup formarea NMOR [106,107]. Iniial s-a studiat procesul de
nitrozare dup variaia concentraiei ionilor nitrii n sistem la pH 2,6 (soluie-tampon citrat-fosfat) la t = 37C. Cinetica procesului de nitrozare a morfolinei s-a studiat n funcie de
concentraia NO2
-
, a morfolinei i de mrimea pH-ului. Rezultatele cercetrilor experimentale n funcie de [NO2
-
]0 i [MOR]0 sunt prezentate n Tabelul I.2.1.

22

Tabelul I.2.1
Consumul nitriilor la nitrozarea MOR t = 37C, pH 2,6, = 520 nm,
[MOR]0 = 1x10
-3
M, [NO2
-
]0 = 1x10
-4
M

Nr.
crt.
[NO2
-
]o, mol/l

NO2
-
consumat (30
min.), %
W x
10
6
Ms
1
Constanta
de vitez, M
-1
s
-1
[MOR]o, mol/l

NO2
-
consumat (30
min.), %
W x
10
7
Ms
-1

1 510
-5
56,14 0,17
K

=

0
,
6
5

510
-6
M 38,16 1,13
2 110
-4
65,19 0,35 110
-5
M 46,38 1,85
3 210
-4
69,25 1,29 110
-4
M 65,2 3,5
4 310
-4
70,09 1,8 110
-3
M 74,27 4,95

Odat cu variaia [NO2
-
]0 n sistem n intervalul 5x10
-5
3x10
-4
M cota-parte de ioni nitrii consumai crete n intervalul 56,14-70,09%, iar viteza iniial variaz de la 0,17x10
-6

Ms
-1
pn la 1,8 x10
-6
Ms
-1
. Din rezultatele prezentate n Figura I.2.2 constatm c viteza crete liniar n funcie de [nitrit total]0
2
. Aceast dependen liniar a W de [NO2

]
2
indic faptul c
specia, care reacioneaz cu MOR, este N2O3, deoarece se formeaz din doi moli de HNO2 (ec. I.2.2, I.2.5). Raportul dintre concentraia ionului nitrit i a substratului crete (cu creterea [NO2
-
]0)
de la 0,05 pn la 0,3, dar rmne mai mic dect 1.
Fig. I.2.2. Dependena vitezei de consum a NO2
-
n funcie de [NO2
-
]0 i [NO2
-
]0
2

la nitrozarea MOR; t = 37C, pH 2,6, [MOR]0 = 110
-3
M.

n cazul n care [NO2
-
]0 nu este egal cu [MOR]0 i [MOR]0>>[NO2
-
]0, pentru a determina constanta de vitez utilizm ecuaia redat n [108]:
2
2
2 0 0
NO
0 2 0 2 0 2 0
NO
[NO ] ([MOR] X )
1
k 1n
[MOR] [NO ] [NO ] ([NO ] X )

=

sau (I.2.14)
2
2
0
NO
0
0 2 0
2 0 2 0
NO
[MOR] X
[MOR]
1g 1g 0.434 ([MOR] [NO ] ) kt
[NO ] X [NO ]

= +

(I.2.15)
Constanta de vitez calculat pentru reacia de nitrozare a morfolinei, determinat dup consumul de NO2
-
, este k1 = 0,65 M
-1
s
-1
, iar expresia vitezei de nitrozare se exprim n modul
urmtor:
W = k1 [MOR][NO2
-
]
2
(I.2.16)
n expresia vitezei, [MOR] reprezint concentraia total de substrat, care indic concentraia molar a MOR ionizate plus MOR liber, iar [NO2
-
] concentraia total de ioni
nitrii, care alctuiete suma concentraiilor molare de NO2
-
i HNO2. Viteza procesului de consum a ionului nitrit n funcie de [MOR]0 variaz n intervalul 1,13x10
-7
4,95x10
-7
Ms
-1
(Tab.
I.2.1).

23

Fig. I.2.4. Dependena
2
NO
W

de valoarea pH,
[MOR]
0
= 110
-3
M, [NO
2
-
]
0
= 110
-4
M, t = 37C.
Fig. I.2.3. Determinarea constantei de vitez la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 110
-3
M,
[NO2
-
]0 = 110
-4
M, pH 2,6, t = 37C, unde a [MOR]0, b [NO2
-
]0).

n acest interval de concentraii efectul concentraiei NO2
-
este predominant, deoarece n expresia pentru vitez ionul nitrt este la puterea a doua. Din Tabelul I.2.1 observm c
creterea concentraiei NO2
-
de ase ori duce la creterea vitezei de nitrozare de apte ori. ns, creterea [MOR]o de 200 de ori mrete viteza iniial numai de 4,3 ori [107].
Viteza de formare a NMOR, calculat din concentraiile totale de substrat i ion nitrit, depinde de pH-ul mediului. Datele experimentale obinute sunt prezentate n Tabelul I.2.2 i
n Figura I.2.4.
Tabelul I.2.2
Cinetica nitrozrii MOR cu nitrit-ion, dup consumul de NO2
-
, n funcie de pH
(t = 37C, [MOR]0 = 110
-3
M, [NO2
-
]0 = 110
-4
M, = 520 nm)

Nr.
crt.
pH Nitritul consumat timp de 30 min., %
W x 10
7

Ms
-1
k1,
M
-1
s
-1

1 1,0 49,75 1,41 0,37
2 2,0 54,42 1,78 0,52
3 3,0 84,21 2,7 1,14
4 3,4 89,89 4,0 1,23
5 4,0 71,05 2,33 0,71

Viteza iniial n funcie de pH trece prin maximum la pH 3,4 (egal cu valoarea pKa pentru HNO2), iar consumul de NO2
-
la acest pH este cel mai nalt (89,89%). Aceast dependen
reflect influena aciditii mediului asupra concentraiei agenilor de nitrozare i a morfolinei neprotonate.
Agenii de nitrozare formai se consider cancerigeni i mutageni datorit capacitii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR. n procesul de reacie ionii nitrii se consum, iar
viteza de consum depinde, cum a fost constatat, de diferii factori fizico-chimici.
Numai morfolina neprotonat particip n procesul de
nitrozare i formeaz N-nitrozomorfolina. Notnd concentraia
morfolinei totale ca [MOR] i forma neionizat [MOR
o
], atunci
concentraia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinat din
relaia [86]:
0
pk pH
[MOR]
[MOR ] ,
1 10

=
+
(I.2.17)
unde pk la 37C este 8,23. Pentru a studia procesul de nitrozare a
MOR dup variaia concentraiei de NMOR format s-a utilizat
metoda de analiz termoenergetic (ATE) [101]. Nitrozarea MOR cu
ioni nitrii s-a efectuat n soluie-tampon citrat-fosfat (~pH 2,5) n funcie
de concentraia NO2
-
n intervalul (1,37-5,5)x10
-3
M. S-a constatat (Tab.
I.2.3) c concentraia NMOR crete de la 129 M la 259 M, iar cota-
parte de NMOR format la nitrozare variaz n limitele (3,08-6,20)%
pentru intervalul dat al [NO2
-
]0 (Fig. I.2.5).
Astfel, cu creterea [NO2
-
]0 n sistem observm
creterea [NMOR]. Cantitatea iniial de MOR este de 25 mol,
iar n procesul de nitrozare se transform de la 0,77 mol pn
la 1,55 mol n proba analizat (Tab. I.2.3). Randamentul sczut
al reaciei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la
pH 2,5, care nu se supun nitrozrii.
Tabelul I.2.3
Determinarea NMOR prin ATE n f[NO2
-
]0 i influena unor
inhibitori
asupra procesului de nitrozare; pH 2,5, t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat, [MOR]0 = 5 mM

[NO2
-
]0,
mM
Standard Proba NO-Amina
Aria Conc. Vol. Aria Vol. Conc. Diluia Conc. Total
10 M uM uL 10 M uL uM uM umol
5,5 NO2- MF 2,79 1,0 100 7,23 100 2,59 100 259 1,55
4,16 NO2- MF 2,79 1,0 100 5,23 100 2,10 100 210 1,26
2,75 NO2- MF 2,79 1,0 100 4,44 100 1,59 100 159 0,95
1,37 NO2- MF 2,79 1,0 100 3,59 100 1,29 100 129 0,77
DMA+DFH4 2,79 1,0 100 0,13 100 0,05 10 1 0,00
DEA+DFH4 2,79 1,0 100 0 100 0 1 0 0,00
MF etanol 65% 2,79 1,0 100 0,94 100 0,34 100 34 0,2
MF 2.34 spir. 2,79 1,0 100 0,83 100 0,3 100 30 0,18
MF2.34 rezv. 2,79 1,0 100 2,28 100 0,82 100 82 0,49
spir. SA 2,79 1,0 100 0 100 0 1 0 0

Dac comparm datele obinute la nitrozarea morfolinei (Tab. I.2.4) la un pH mai ridicat (pH 2,8) la aceeai concentraie de NO2
-
egal cu 5 mM (dar mai introducem n sistem
NaCl de 0,05 M) cu datele din Tabelul I.2.3 la aceeai [NO2
-
]0, atunci constatm c concentraia NMOR formate n sistem crete de la 269 M pn la 416 M. n prezena ionilor de Cl
-

viteza procesului de nitrozare crete (Tab. I.2.4), deoarece se formeaz clorura de nitrozil, NOCl, care este un catalizator al procesului de nitrozare.











Fig. I.2.5. Dependena randamentului reaciei de formare a NMOR n funcie de [NO2
-
]0
i cromatograma obinut; [MOR]0 = 5 mM, pH 2,5, t = 37C.

Din rezultatele experimentale prezentate n [110] s-a constatat c procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR. Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la
nitrozarea cu ioni nitrii. Dup viteza de consum a ionilor nitrii n sistem am constatat c acest proces depinde de [NO2
-
]0, pH i [MOR]0.
0
1
2
3
4
5
6
7
R
a
n
d
a
m
e
n
t
,

%
1.37 2.75 4.16 5.5
[NO2-]o, mM
R
a
n
d
a
m
e
n
t
,

%

[NO2
-
]0, mM

24

Fig. I.2.6. Formarea aminocarbamailor.
I.2.1.3. Metodele de inhibiie n procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
Diminuarea efectelor citotoxice, genotoxice i clastogenice ale NNC este obiectivul principal n cercetrile tiinifice n acest domeniu. Proprietile mutagenice i cancerigenice ale
NNC pot fi inhibate pe mai multe ci [69]: (1) inhibiia formrii NNC; (2) inhibiia reaciei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN i (3) inhibiia mutagenicitii NNC prin activarea
reparrii leziunilor induse de NNC n ADN.
Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectai diferii antioxidani, ca vitaminele C i E [72]. Au fost optimizate concentraiile acestor inhibitori [89], utiliznd
testarea pe celulele V79 ale hamsterilor i celulele carcinomei colonului uman Caco-2. Citotoxicitatea a fost evaluat utiliznd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indic prezena
celulelor moarte) n celulele Caco-2 i testul eficienei de nsmnare n celulele hamsterilor V79 (care determin mrirea sau pierderea capacitii de reproducere).
Dup cum s-a evideniat n [89], vitamina C a micorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR: de la 60 la 40% n celulele Caco-2 i de la 56 la 20% n celulele V79.
S-a micorat i efectul citotoxic n prezena vitaminei C n ambele sisteme. Vitamina E a redus citotoxicitatea indus de NMOR numai n celulele Caco-2, care se gsesc n colon.
Astfel, s-a constatat c vitamina C este un reductor mai puternic, care inhib formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [59,90]. Aciunea antimutagenic a vitaminei C poate fi corelat cu
capacitatea acesteia de a bloca legarea covalent a unor NNC de ADN celular [91]. Prin compararea aciunii efectului inhibitor al acestor dou vitamine la reducerea efectelor toxice n
prezena NMOR i N-metil-N-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG), s-a constatat c ambele vitamine nu prezint nici un efect protector mpotriva citotoxicitii induse de MNNG [93]. Astfel,
s-a presupus c nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indus de MNNG sau repararea acestor modificri ale ADN, confirmnd faptul c, dei att NMOR, ct i MNNG,
aparin aceluiai grup de NNC, mecanismul efectelor lor citoxice este diferit.
Un alt inhibitor testat n procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon. S-a presupus acelai mecanism de inhibiie n formarea NMOR ca i n cazul
vitaminei C, adic, n primul rnd, diminuarea concentraiei agentului de nitrozare, care se poate forma printr-un amestec de NO i O2 [85]. Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compui
donori de NO (PAPA NONOate i MAMA NONOate) n funcie de pH, Kirsch i col. [94] au ajuns ns la o alt concluzie.
n rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat c HCO3
-
nu poate s protejeze morfolina n procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 7,4), ns CO2 inhib nitrozarea
pn la pH 8,9. Acest efect protector al lui CO2 se explic prin formarea carbamatului de morfolin (Fig. I.2.6), dar nu prin diminuarea concentraiei agenilor de nitrozare [95]. Se presupune
c formarea aminocarbamailor in vivo este o ulterioar posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor att de ctre NO/O2, ct i de ctre NO/O2
-
. ntruct nucleofilitatea aminelor are un rol
decisiv n reaciile de nitrozare provocate de N2O3, factorii care micoreaz densitatea electronilor la atomul de azot trebuie s diminueze reactivitatea aminelor fa de N2O3. n [94] s-au
efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuiei sarcinii la morfolin, anionul carbamatului de morfolin
i al acidului corespunztor i s-a obinut micorarea sarcinii de la -0,71 la -0,59 i -0,51, corespunztor.
Astfel, atomul de azot al carbamatului de morfolin sau al acidului corespunztor este un nucleofil mai
slab dect atomul de azot al morfolinei i, astfel, carbamaii formai sunt mai puin susceptibili atacului
oxidativ al N2O3.
Gradul de inhibiie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul
sistemului de nitrozare (NO/O2 sau NO/O2
-
), dar depinde strict de proprietile chimice ale aminelor de
a produce carbamai.
Valorile pKa ale aminelor frecvente n organismele vii se afl n limitele 9-12. n general, ele
vor fi protejate de atacul agenilor de nitrozare, deoarece la pH 7,4 ele sunt aproape complet prezente n
form protonat. n condiii acide nitritul este capabil s nitrozeze substratele genernd dou specii de ageni
de nitrozare, i anume: N2O3 i ionul H2NO2
+
, care este n echilibru cu NO
+
i care trebuie s nitrozeze
direct aminele protonate [96]. Totui, exist substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul
terminal al peptidelor, proteinelor i aminogruprile hemoglobinei (pKa =6,17,1) [96].
La fel s-a studiat inhibiia N-nitrozrii morfolinei prin inducerea n diet a vitaminelor C i E [97,98], a catehinelor, a ceaiului verde i a sucului din fructe [99]. Se constat c
efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din diet [98,109]. Este necesar a constata c efectul genotoxic al NMOR sintetizate n condiii de laborator, n prezena antioxidanilor,
este similar pre-tratrii celulelor cu vitaminele A, C i E ce se conin n diet [100]. Produsele dezaminrii, cum ar fi uracilii, hipoxantinele i xantinele, sunt mutageni puternici i ele.
Pentru a micora viteza acestui proces am studiat influena diferiilor inhibitori: acid DFH4, DFH3Na, pigment carotenoidic extras din spirulin, EDMT, EDMT, (+)-Ct.
Datele prezentate n Tabelul I.2.4 (obinute att dup formarea NMOR, ct i dup consumul de NO2
-
), indic la faptul c odat cu creterea [DFH4]0 concentraia de NMOR se
micoreaz de la 416 M pn la 70 M pentru concentraiile:
4
1
DFH
C 0; =
4
2
DFH
C 0, 5 = mM;
4
3
DFH
C 1, 5 = mM;
4
4
DFH
C 2, 0 =
mM;
4
5
DFH
C 3, 0 = mM (Tab. I.2.4). n intervalul dat al concentraiei inhibitorului randamentul reaciei de nitrozare scade de la 10% pentru [DFH4]0 = 0 pn la 1,7% la [DFH4]0
= 3,0 mM (Fig. I.2.7).
Tabelul I.2.4
Determinarea NMOR prin ATE n f [DFH4]0; [NO2
-
]0 = 5 mM; pH 2,8; t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat, [NaCl]0 = 0,05 M
[DFH4]0, mM
Standard Proba NO-Morfolina
Aria Conc. Vol. Aria Vol. Conc. Diluia Conc. Total
10 M uM uL 10 M uL uM uM umol
0,00 DHF 4,07 1,0 100 8,47 50 4,16 100 416 2,50
0,5 DHF 4,07 1,0 100 6,26 50 3,08 100 308 1,85
1,5 DHF 4,07 1,0 100 5,48 50 2,69 100 269 1,62
2,00 DHF 4,07 1,0 100 3,55 50 1,74 100 174 1,05
3,00 DHF 4,07 1,0 100 1,43 50 0,70 100 70 0,42

25

Fig. I.2.7. Dependena randamentului reaciei de formare a NMOR i a activitii inhibitoare (%
fa de control) de [DFH4]0 i cromatogramele obinute; pH 2,8; [NO2
-
]0 = 5 mM,
[MOR]0 = 5 mM, [NaCl]0 = 0,05 M; timp de reacie 60 min.

Raportul [DFH4]/[NO2
-
]0 este <1 pentru toate concentraiile de DFH4 utilizate n sistem, ns reacia dat este inhibat aproape complet. Cu creterea acestui raport [DFH4]: [NO2
-
]>1 obinem o inhibiie total chiar i n cazul MOR, care are o vitez de nitrozare destul de nalt (k1 = 0,65 M
-1
s
-1
) comparativ cu DMA (k1 = 0,0017 M
-1
s
-1
), sau, cu att mai mult, DEA (Tab.
I.2.3), care n condiiile date nu formeaz NDEA [110].
S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR n prezena extractului carotenoidic din Spirulin. Este cunoscut [102] c Spirulina conine un ir de compui importani pentru
meninerea proceselor vitale ale organismului uman, printre care sunt peste 50 de principii bioactive, care exercit o aciune terapeutic benefic i care intervin n reglarea tuturor funciilor
organismului [102]. De rnd cu toate vitaminele (excepie face vitamina D), Spirulina conine carotenoizi, dintre care o mare pondere o are beta-carotenul, precursor al vitaminei A.
n cercetrile experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obinut din Spirulin [102]. Din extractul de Spirulin n concentraie de 6 mg/ml s-au pregtit diferite concentraii
de pigment carotenoidic (PC): C
1
PC = 0,1 mg/ml; C
2
PC = 0,5 mg/ml; C
3
PC = 0,75 mg/ml; C
4
PC = 1,5 mg/ml i C
5
PC = 2,5 mg/ml. Randamentul reaciei de nitrozare este maximal n absena
spirulinei ( = 16,1%) i scade pn la 1,5% pentru [Spir]0 = 2,5 mg/ml (Fig. I.2.8).


Din datele prezentate n Tabelul I.2.5 i n Figura I.2.8 se observ c cantitatea de NMOR format scade brusc de la 4,44 mol pn la 0,71 mol n intervalul (0-0,5) mg/ml de PC, iar
creterea [PC]0 n continuare influeneaz mai puin asupra efectului inhibitor.

Tabelul I.2.5
Determinarea NMOR prin ATE n f [PC]0; [NO2
-
]0 = 5 mM; pH 2,6; t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat

[PC]o, mg/ml Standard,
concentraia 1,0 uM, vol. 100 uL
Proba,
vol. 100 uL, diluia 1000
NO-Morfolina % NMOR
form.
Grad
de inh., %
Aria Aria Conc. Conc. Total
10 M 10 M uM uM umol
0,00 4,59 3,40 0,74 672 4,03 16,12 0,0
0,10 4,59 2,78 0,61 606 3,63 14,52 10,0
0,50 4,59 0,55 0,12 120 0,72 2,88 82,24
0,75 4,59 6,82 1,49 149 0,89 3,56 77,92
0,75 4,59 0,67 0,15 146 0,88 3,52 78,20
1,50 4,59 0,38 0,08 83 0,50 2,00 87,60
2,50 4,59 0,33 0,07 57 0,34 1,36 91,60

Fig. I.2.8. Dependena randamentului reaciei de formare a NMOR i a gradului de inhibiie
de [PC]
0
, i cromatograma obinut (t = 60 min).

26

Din datele experimentale obinute am constatat c viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitrii sub aciunea DFH4 i a pigmentului carotenoidic se micoreaz. Concentraia
NMOR, determinat prin metoda ATE, scade n prezena DFH4 n intervalul de concentraie (0,0-3,0) mM cu 85,2% fa de cantitatea de NMOR format fa de control.
n cazul procesului de inhibiie cu PC n intervalul (0,0-2,5) mg/ml are loc o diminuare a coninutului de NMOR cu 91,6%.
Consumul de NO2
-
la inhibiia procesului de nitrozare a MOR
La fel, s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiilor antioxidani n procesul de nitrozare a morfolinei dup viteza de consum a ionilor nitrii. Unii antioxidani, cum sunt acidul
ascorbic, vitamina E i acidul 5-aminosalicilic, inhib reaciile de N-nitrozare n procesul de cataliz acid [104].
n Tabelul I.2.6 sunt prezentate rezultatele experimentale obinute n inhibiia procesului de nitrozare a MOR n prezena diferiilor reductori: DFH3Na, DFH4, (+)-catehin la pH
2,6 i EDET, EDMD, DFH4 la pH 3,4. La pH 2,6 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient n inhibiia reaciei de nitrozare a MOR, comparativ cu DFH3Na i (+)-catehin.
Concentraia de DFH4 necesar pentru a diminua aproape total concentraia de NO2
-
n sistem este de 1x10
-3
M. Conform datelor prezentate n Tabelul I.2.6, constatm c DFH3Na
este un inhibitor mai puin eficient n procesul de nitrozare a MOR dect (+)-Ct i DFH4.
Concentraia de nitrit (n %), calculat din diferena Cx-C0 (unde Cx,C0 concentraia NO2
-
redus n prezena i n absena inhibitorilor corespunztori), crete odat cu creterea
[Inh]0 (Fig. I.2.10a). Derivaii sintetizai (Fig. I.2.9) din acidul tartric (EDET) i DFH4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH4 n procesul de reducere a ionilor nitrii
(Fig. I.2.10b).
Tabelul I.2.6
Inhibiia nitrozrii morfolinei n funcie de concentraia iniial a reductorului
([MOR]0 = 110
-3
M, [NO2
-
]0 = 110
-4
M, pH 2,6, t = 37C)

pH 2,6
DFH3Na DFH4 (+)-Ct
[Red]o,
M
NO2
-
(%) rezid. la
30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

NO2
-
(%) rezid. la
30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

NO2
-
(%) rezid. la
30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

0 33,34 2,37
0,74
33,34 2,37
1,74
33,34 2,37
1,01
110
-4
27,5 3,15 18 5,5 23,33 4,6
510
-4
20,9 4,28 10,3 7,35 18,46 5,27
110
-3
8,97 5,2 1,5 9,73 6,79 6,8
pH 3,4
[Red]o,
M
NO2
-
(%) rezid. la
t=30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

[Red]o,
M
NO2
-
(%) rezid. la
t=30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

NO2
-
(%) rezid. la
t=30 min.
Win, x10
7
Ms
-1

Kinh,
M
-1
s
-1

EDET EDMD DFH4
110
-4
65,4 3,07
0,25
510
-5
63,3 2,91
1,4
46,65 3,96
1,84
510
-4
64,87 3,37 110
-4
52,26 3,1 25,78 8,0
110
-3
63,7 3,4 310
-4
42,7 3,75 0,33 9,8
510
-4
31,16 5,17 0,28 12,1

Fig. I.2.9. Structura chimic a esterului dimetilic al DFH4 (a), a esterului dietilic
al acidului tartric (b) i a cetotautomerului EDMD (c).

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2
-
este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA i DMA. La concentraia NO2
-
de 110
-4
M i MOR de 110
-3
M se consum 60% de ioni nitrii. n
prezena inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2
-
crete i alctuiete ~ 100 % (Tab. I.2.6). n cazul EDET, pentru aceleai condiii de reacie, consumul de ioni nitrii alctuiete 34,6%
(Tab. I.2.6), ceea ce este mai puin cu 32,1% dect n absena inhibitorului (Fig. I.2.10). Pentru EDMD la concentraia de 110
-4
M consumul NO2
-
este mai mare (47,7%) comparativ cu EDET,
dar la fel este mai mic cu 19% dect n absena inhibitorului, iar odat cu creterea [EDMD]o pn la 510
-4
M crete i consumul NO2
-
(pn la 68,8%).












(a) (b)

Fig. I.2.10. Concentraia de ioni nitrii redus de inhibitor n funcie de [inh]o (Cx-Co), n %,
unde Cx-Co % de nitrit redus n prezena (Cx) i n absena (Co) diferiilor inhibitori.

Rezultatele obinute indic la faptul c n cazul EDMD i EDET reacia predominant este interaciunea acestor inhibitori cu amina i nu cu agenii de nitrozare. Esterul dimetilic al
DFH4 interacioneaz rapid cu anilina sau cu substituenii anilinei n cataliza acid cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103]. Am putea presupune c i morfolina la fel
poate interaciona n procesul de cataliz acid (pH 3,4) cu inhibitorul, dar nu cu ionul nitrit, ceea ce duce la micorarea consumului de NO2
-
. Teoretic pot avea loc dou mecanisme de cataliz
acid la sinteza produsului ntre amin i inhibitor [103]: (a) protonarea cetotautomerului EDMD, urmat de reacia cu aminele, eliminarea apei, formarea celui de-al doilea cetotautomer i
repetarea etapei de mai sus; (b) adiia acid-catalizat a aminei la legtura dubl a EDMD, urmat de eliminarea apei i repetarea acestor etape. Mecanismul (a) este mai favorabil [103],
deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacioneaz cu amina n condiiile catalizei acide, iar EDMD reacioneaz uor.


DFH4
DFH4
DFH3Na

27

Fig. I.2.12. Gradul de inhibiie a reductorilor
fa de control, pentru [MOR]
0
= 110
-3
M,
[NO
2
-
]
0
= 110
-4
M.
(I.2.18)



n rezultatul reaciei (I.2.18) n sistem are loc diminuarea concentraiei aminei (MOR), care la fel este un predecesor n procesul de formare a NNC.
Determinarea constantelor de vitez pentru reacia dintre nitrit i inhibitori a fost bazat pe viteza de reacie cunoscut a substanei de referin. Rezultatele descrise mai sus
au indicat c inhibitorii utilizai au inhibat N-nitrozarea n mod liniar (Fig. I.2.11), iar din Figura I.2.3 am constatat c agentul de nitrozare este N2O3. n acest caz, constanta de vitez (kR)
pentru reacia dintre inhibitor i N2O3 poate fi
calculat utiliznd constanta de vitez
determinat pentru reacia MOR cu N2O3 (0,65 M
-1
s
-1
).
















Fig. I.2.11. Dependena Wi de consum a NO2 n f
[Inh]o, pentru [MOR]0 = 110
-3
M,
[NO2
-
]0 = 110
-4
M.

n sistemul dat, agentul de nitrozare, N2O3,
generat n mediul acid poate reaciona n trei moduri
[104]:
(1) interaciunea cu inhibitorii:
V = d[Inh]/dt = kInh [Inh][N2O3] (I.2.19)
(2) interaciunea cu morfolina:
d[N2O3]/dt = kM [MOR] [N2O3] (I.2.20)
(3) hidroliza N2O3 cu formarea
nitritului:
d[N2O3]/dt = kh [N2O3] (I.2.21)
Hidroliza N2O3 este neglijabil, deoarece
aceast reacie este prea lent pentru a fi relevant (kh =
1000s
-1
) [105]. Astfel, viteza de consum a N2O3 este
urmtoarea:
W = -d[ N2O3]/dt = kInh [Inh] [N2O3] + kM [MOR] [N2O3] (I.2.22)
n absena inhibitorilor, viteza de consum a agentului de nitrozare este proporional vitezei iniiale de interaciune a N2O3 cu MOR. Prin mprirea ecuaiei (I.2.22) la (I.2.19)
obinem urmtoarea ecuaie:
W/V = 1+ kM [MOR]/ kInh [Inh] (I.2.23)
Din concurena inhibitorilor i MOR pentru N2O3 se calculeaz constanta de vitez a reaciei dintre inhibitor i N2O3 (kInh). Valorile constantelor de vitez a N2O3 cu toi
inhibitorii studiai sunt calculate i prezentate n Tabelul I.2.6. Mrimea constantei vitezei de interaciune a inhibitorilor cu EDMD (k = 0,75 M
-1
s
-1
) i cu EDMT (k = 0,34 M
-1
s
-1
) este cu mult
mai mic dect constanta de vitez pentru nitrozare a MOR cu NO2
-
(fr inhibitor la pH 3,4). Astfel, constatm c aceti esteri se consum n reacia nu cu ionii nitrii, dar cu aminele. n acest
caz, consumul NO2
-
fa de control (sistemul NO2
-
MOR) va fi negativ. Efectul inhibitor al compuilor studiai coreleaz cu constantele de vitez pentru reacia dintre N2O3 i inhibitor. Gradul
de inhibiie (n %) a reductorilor este prezentat n Figura I.2.12 pentru concentraia reductorilor de 110
-4
M. Din rezultatele prezentate observm c concurena pentru agentul de nitrozare n
sistemul dat o ctig mai uor DFH4, apoi urmeaz (+)-catehina i DFH3Na. La fel, a fost testat pigmentul caratenoidic n procesul de nitrozare a MOR dup viteza de consum a ionilor nitrii.
S-a studiat variaia concentraiei NO2
-
n sistemul NO2
-
PC n funcie de concentraia pigmentului carotenoidic: C
1
PC= 0,008 mg/ml; C
2
PC= 0,012 mg/ml; C
3
PC = 0,016 mg/ml; C
4
PC = 0,024 mg/ml i
C
5
PC = 0,032 mg/ml.
Acest interval de concentraii s-a ales mai ngust, reieind din datele experimentale obinute n sistemul MOR NO2
-
PC, studiat dup formarea NMOR prin metoda ATE
(intervalul a fost (0,1-2,5) mg/ml) (Fig. I.2.8), adic s-a studiat intervalul concentraiilor PC, n care efectul inhibitor variaz semnificativ n funcie de [PC]0. S-a determinat variaia
concentraiei de ioni nitrii n sistemul NO2
-
PC i MOR NO2
-
PC n funcie de pH-ul mediului, [PC]0 i [NO2
-
]0. Rezultatele cinetice, obinute n sistemul NO2
-
PC n funcie de [PC]0
indic la faptul c viteza de consum a NO2
-
crete odat cu creterea [PC]0, iar timp de 40 minute concentraia NO2
-
se micoreaz cu 90% la C
5
PC (Tab. I.2.7). Astfel, constatm c n sistem PC
interacioneaz cu NO2
-
i micoreaz concentraia agenilor de nitrozare.

Tabelul I.2.7
Dependena parametrilor cinetici n funcie de [PC]0 la nitrozarea MOR;
[NO2
-
] = 110
-4
M; pH 2,6, t = 37C

Sistemul NO2
-
PC (I) Sistemul MOR NO2
-

PC (II)
[PC]0 Wini. [NO2
-
] 10
5
M
% de NO2
-
Wini.
[NO2
-
] 10
5
M % de NO2
-

x10
2
, x10
7
, la 40 min.
redus la x10
7
,
la 40 min. redus la
mg/ml Ms
-1

40 min. Ms
-1
40 min.
0 0 10,0 0 0 10,0 0
0,8 1,2 3,3 67 3,5 1,6 84
1,2 1,6 2,4 76 4,8 1,3 87
1,6 2,0 1,8 82 5,3 1,1 89
2,4 3,0 1,3 87 7,5 0,6 94
3,2 3,6 1,0 90 8,3 0,55 95
0
2
4
6
8
10
12
0 0.5 1 [Inh], mM
W
*
1
0
^
7
,

M
s
^
-
1
DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)
EDET (4) EDMD (5)
1
2
3
4
5
W
*
1
0
^
7
,

M
s
^
-
1

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)
Consumul de NO2 total Consumul de NO2 comparat cu controlul
DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control
pH 2,6 pH 2,6 pH 2,6 pH 3,4 pH 3,4 pH 3,4

28

Cl
H
2
NSO
2
N
S
NH
CH
2
H
O O

Analiznd datele din Tabelul I.2.7, observm c viteza iniial de consum a NO2
-
la C
5
PC este de 2,3 ori mai mare n prezena MOR dect n sistemul NO2
-
PC (Fig.
I.2.13), fapt datorat consumului NO2
-
n procesul nitrozrii MOR. Concentraia de NO2
-
n sistemul I timp de 40 min. este aproximativ de dou ori mai mare dect n sistemul II (Tab. I.2.7).
La determinarea NMOR n procesul de nitrozare cu NO2
-
prin metoda ATE n funcie de [PC] s-a constatat c [NMOR] scade brusc pn la 0,5 mg/ml de PC (Fig. I.2.8). Aceste
rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraiilor de NO2
-
dup 40 min. de reacie. Concentraia de NO2
-
se micoreaz brusc de la 1010
-5
M pn la 110
-5
M n intervalul de
concentraii ale PC de 0,008-0,032 mg/ml datorit interaciunii agenilor de nitrozare formai cu inhibitorii.
S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice hidroclorotiazida (HCTZ) i inhibiia proceselor de formare a NNA n sisteme-model. S-a determinat viteza
procesului de nitrozare a HCTZ dup variaia concentraiei nitritului n timp, n prezena diferiilor inhibitori: acidul ascorbic(AAs); rezveratrolul (Rez); (+)-catehina ((+)-Ct);
acidul dihidroxifumaric (DFH4); tanin standardizat (tanin st.); enoxil; enotanin.
Hidroclorotiazida are o nalt activitate diuretic i hipotensiv i reprezint un preparat din grupul derivailor benzotiodiazidici, care conine n poziia C(7) gruparea funcional
sulfonamid, avnd urmtoarea structur:

- Formula de structur - Aranjarea spaial a moleculei

Mecanismul de formare a Nnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmrit n schema ce urmeaz (I.2.23):
hidroclorotiazida
Nnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiia procesului de formare a NHCTA a fost calculat concentraia remanent de ioni nitrii, n funcie de concentraia utilizat de reductor.
Reieind din valorile obinute, a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA n funcie de natura i concentraia reductorilor.
Din rezultatele obinute constatm c reductorii obinui din produse secundare vinicole demonstreaz capacitai de inhibiie n formarea NHCTZ.
Concluzii
Cercetrile proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitrii, efectuate pe sisteme-model, att dup variaia [NO2], ct i dup [NMOR], confirm formarea NMOR. Viteza
procesului de formare a NMOR crete odat cu mrirea concentraiei componenilor din sistem, iar viteza iniial de nitrozare n funcie de pH trece prin maximum la pH 3,4.
Constanta vitezei de consum a ionilor nitrii n procesul de nitrozare a MOR a fost determinat pentru pH2,6 dup viteza de consum a nitriilor n sistem (k = 0,65 M
-1
s
-1
). n intervalul de pH1-
4, mrimea constantei vitezei de consum a NO2
-
n sistemul NO2
-
MOR variaz n limitele (0,37-1,23) M
-1
s
-1
, fiind maxim la pH 3,4 (k = 1,23 M
-1
s
-1
).
Constanta vitezei de nitrozare a MOR, determinat dup viteza de formare a NMOR, este de 0,41 M
-1
s
-1
. Aceast diferen este determinat de transformarea ionilor nitrii n produi
intermediari ageni de nitrozare, care, la rndul lor, nitrozeaz amina, iar stadia limit n proces este interaciunea acestor ageni cu amina.
Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitrii (dup formarea NMOR, determinat prin metoda ATE) a fost studiat n prezena diferiilor inhibitori: DFH4, DFH3Na, EDMT, EDMD,
pigment caratenoidic din spirulin. S-a constatat c aceti compui inhib procesul de nitrozare a MOR, iar gradul de inhibiie este determinat de natura i concentraia inhibitorului.
Randamentul reaciei de formare a NMOR fr inhibitor (n condiiile date) este de 10% i scade pn la 1,6% n prezena DFH4 de 1 mM, iar n cazul PC se micoreaz
pn la 1,36% pentru [PC] = 2,5 mg/ml. Activitatea inhibitorului crete de la 0 (fr inhibitor) pn la 83%, iar n cazul PC pentru concentraia maxim (2,5 mg/ml) este de
91%.

0
20
40
60
80
100
R
a
n
d
a
m
e
n
t
,

%
0,8 1,2 1,6 2,4 3,2
[PC]o, 10^2 mg/ml

Fig. I.2.13. Dependena Wini. de [PC]o;
[NO2
-
] = 110
-4
M; [MOR] = 110
-3
M;
pH 2,6, t = 37C.

Fig. I.2.14. Dependena randamentului reaciei
de transformare a NO2
-
n f[PC]o; n sistemele
NO2
-
PC i NO2
-
PC MOR, [NO2
-
] = 110
-4
M; [MOR] = 110
-3
M; pH 2,6, t = 37C.
S
NH
N
O O
Cl
S
NH
2
O
O
H
+ N O
+
S
NH
N
O O
N H O
S
Cl
O
O
NH
2
- H
+
S
NH
N
N O
O O
S
Cl
O
O
NH
2
n absena MOR n prezena MOR

29

S-a studiat influena unui ir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR dup viteza de consum a ionilor nitrii. S-au elucidat particularitile EDT i ale EDMD n acest
proces. Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare dup consumul ionului nitrit n prezena EDET indic o activitate mai mic cu 32,1%, iar pentru EDED cu 19%
comparativ cu sistemul fr inhibitor. Din rezultatele obinute se constat c n prezena acestor inhibitori reacia predominant este interaciunea lor cu MOR, dar nu cu agenii de
nitrozare. Astfel, inhibiia procesului se realizeaz prin diminuarea concentraiei substratului de nitrozare n rezultatul protonrii cetotautomerului EDMD, urmat de interaciunea lui
cu aminele.
n baza constantei de vitez a procesului de nitrozare a MOR cu NO2
-
, calculat experimental, i datelor cinetice obinute la inhibiie s-au calculat constantele de inhibiie
pentru diferii inhibitori:
4
DFH
k inh = 1,74 M
-1
s
-1
,
3
DFH Na
k inh = 0,74 M
-1
s
-1
, k
ct
inh = 1,01 M
-1
s
-1
(la pH 2,6), k
EDMT
inh = 0,25 M
-1
s
-1
i k
EDMD
inh = 0,34 M
-1
s
-1
,
4
DFH
k inh =
1,84 M
-1
s
-1
(la pH 3,4).

I.3. Nitrozarea amidelor
I.3.1. Precursori ai N-nitrozometilureei
N-nitrozometilureea (NMU) aparine unei clase de compui cancerigeni, cum sunt N-nitrozoamidele, care sunt instabili n soluii apoase la pH > 5. De aceea, este foarte puin
probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide s fie depistate n alimente n concentraii apreciabile. Totui, este posibil ca N-nitrozoureele s se formeze in vivo n stomac prin ingestarea
precursorilor (amide i ioni nitrii), deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacie. n prezent, formarea intragastric a N-nitrozocompuilor n organismul
uman este bine stabilit i are un rol important n apariia cancerului gastric [114,118,121]. De rnd cu aceasta, cancerigenitatea NMU se manifest asupra sistemului nervos central i
periferic, cailor respiratorii, pielii, rinichilor etc. [120].
Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitrai, nitrii i substrate de nitrozare). Ca precursori ai formrii N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree i
alchilguanidine [138] (de ex., citrulina, arginina, N,N-metilenbisacrilamida i metilguanidina). La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formeaz 35% NMU (Fig. I.3.1) [141].



Fig. I.3.1. Structura chimic a NMU i MGD.

Produsele din pete uscat conin 20-180 mg metilguanidin/kg, a crei nitrozare produce NMU, ns cu o vitez mai lent dect nitrozarea metilureei [141]. Transformrile au loc
dup urmtoarea schem:
Metilguanidin1-metil-1-nitrozoguanidinN-metilnitrozocianamid
N-nitrozometiluree
Principalul precursor al metilguanidinei ce ptrunde n organismul uman este creatinina i creatina, care sunt constitueni caracteristici ai extractului de carne [117, 120]. Creatina
este prezent n carnea i petele proaspt, iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec. I.3.1) i se formeaz la prepararea petelui i a crnii n timpul proceselor de uscare, prjire, afumare.
H3C CH3
\ \
N CH2 N CH2
/ \ / \
HN = C COOH
2
H O
HN = C C = O (I.3.1)
\ \ /
NH2 NH
Creatin Creatinin

n studiile sale anterioare S.Mirvish [125] a indicat c creatinina, ce este prezent n concentraii destul de nalte (30-1400 ppm) n carne, pete i produse de mare, poate fi nitrozat
cu formarea NMU. Pn la 4g/kg de creatinin apar n carnea prjit i petele srat, uscat, care este produs prin deshidratare [118,120].
n rezultatul tratrii creatininei cu ioni nitrii se formeaz metilureea care, n continuare, se nitrozeaz formnd NMU. Formarea metilureei are loc conform urmtoarei scheme
[118]:
Creatinin5-oxo-creatinin 5-oxim1-metil-hidantoin-5-oxim
N-nitrozometiluree
Prima etap din acest lan este limit. Unele studii epidemiologice din SUA au presupus c ar fi o legtur ntre consumarea crnii tratate cu ioni nitrai, nitrii i apariia leucemiei
la copii i a tumorilor la creier [126].
Ca substrate de nitrozare, cum s-a menionat mai sus, pot servi i alchilureele. Ele pot fi uor transformate n alchilnitrozourei [125,126]. n China, n sosurile de pete s-a constatat
prezena N-nitrozometilureei, care se acumuleaz la pstrarea n timp a produselor [119] .
n trecut se considera c pot fi nitrozate doar aminele secundare. Studiile efectuate n continuare au indicat c N-nitrozoaminele se pot forma i la nitrozarea aminelor teriare, a
compuilor cuaternari de amoniu, care se gsesc n mediul nconjurtor, alimente i droguri.
Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimic sau microbiologic. Nitrozarea pe cale chimic depinde de mai muli factori: bazicitatea aminei, pH-ul mediului de reacie,
concentraia substratului i prezena catalizatorilor i inhibitorilor. Unul dintre catalizatorii importani n procesul de nitrozare a substrailor sunt tiocianaii, care sunt prezeni n saliv n
cantiti de la 12 la 33 mg/100 ml [119,140]. n cantiti mai mari aceti ioni se gsesc n saliva fumtorilor.
Aminocompuii slab bazici (de exemplu, amidele, derivaii ureei i unele amine aromatice) nu interacioneaz cu oxidul de azot N2O3. Aceti compui interacioneaz la pH mai
sczut i se nitrozeaz pe alt cale, care include interaciunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat:
Y-NO + RNHCOR

RN(NO)CO R

+ H3O
+
(I.3.2)
N-nitrozamida
De obicei, aceste reacii sunt foarte lente la pH>3, dar ele decurg cu o vitez mai mare cu creterea aciditii.

I.3.2. Cinetica i mecanismul nitrozrii metilureei
S-a studiat experimental nitrozarea metilureei, care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne i pete. Ca precursor al agenilor de nitrozare s-
a utilizat nitritul de sodiu [127-129].
Procesul de nitrozare s-a studiat dup variaia concentraiei de NMU format, utiliznd metoda spectrofotometric-extracional. n calitate de extragent a fost utilizat eterul
dietilic. La fel, s-a studiat viteza acestei reacii dup variaia [NO2
-
]0 n sistem. Intervalele de concentraii n sistemele-model au fost urmtoarele: [NO2
-
]0 = 0,05-1,0 mM, [MU]0 = 0,03-1,0 mM;
pH 1-4.
Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat n celule termostatate. Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea i nitritul de sodiu. La fel, a fost studiat nitrozarea
N,N-bisacrilamidei [138]. Volumul total de soluie a alctuit 20 ml. ndat dup introducerea nitritului, se stabilete timpul reaciei. La intervale de 10, 20, 30, 60, 90 min. se iau probe a cte 3
ml, care se trec n eter dietilic i se nchid ermetic. Extracia se efectueaz de dou ori: prima dat cu 3 ml de solvent, a doua oara cu 2 ml. n extractul obinut a fost determinat
concentraia NMU la = 235 nm i 325 nm.
Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37C, iar cinetica reaciei de nitrozare s-a studiat dup variaia densitii optice (DO) la = 235 nm, care s-a determinat cu ajutorul
spectrofotometrului SF-46 n cuve de cuar de 10 mm. Concentraia NMU a fost calculat utiliznd coeficientul de extincie pentru NMU, a crei mrime la = 235 nm n solvent
organic este egal cu 8x10
3
l/molcm.
Cinetica nitrozrii metilureei
Deoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importani, s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU n funcie de pH-ul mediului.
S-au modelat urmtoarele intervale de pH: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0. Concentraia [MU]o = = 0,1 mM i [NO2
-
]0 = 0,1 mM. S-a observat c concentraia NMU formate crete cu micorarea
pH-ului. Dac pentru pH 1 la t = 10 min. [NMU] = 1,8810
-5
M, atunci pentru pH 4 [NMU] = 0,3410
-5
M la acelai interval de timp. La nitrozarea amidelor, viteza procesului nu trece prin
maximum, dar scade cu creterea pH-ului (Fig. I.3.2). Din datele prezentate se observ c viteza procesului este destul de lent la pH > 2. Cu micorarea pH-ului de la 2 la 1, viteza crete mai
mult de dou ori (de la 13,83 10
-9
M
-1
s
-1
31,3310
-9
M
-1
s
-1
) [130,131]. Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min., pn cnd n sistem s-a instaurat un echilibru. Dac calculm
concentraia NMU la echilibru, constatm c, n funcie de pH, concentraia NMU crete cu micorarea pH-ului de la 0,04510
-4
M (pH 4) pn la 0,3510
-4
M (pH 1). S-a calculat coninutul
format de NMU (n %) fa de concentraia total a amidei. S-a constatat c cota-parte a NMU crete de la 4,5% pentru pH 4 pn la 35% (pH 1) (Tab. I.3.1).
Tabelul I.3.1
Dependena concentraiei NMU formate i constanta de vitez (k1) n funcie de pH
pH [NO2
-
]x10
4
, M [MU] x10
4
, M [NMU]Ex10
4
, M NMU, % k1, M
-2
min
-1
1,0
1,0 1,0
0,35 35,0 416,6
2,0
1,0 1,0
0,17 17,0 1923
CH
3
NH C
NH
NH
2

30

3,0
1,0 1,0
0,09 9,0 7,510
3

4,0
1,0 1,0
0,045 4,5 7,0510
4
Fig. I.3.2. Viteza de formare a NMU n funcie de pH; [NO2
-
]0 = 1 10
-4
M , [MU]0 = 1 10
-4
M.

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat n funcie de concentraia [NO2
-
]0 i [MU]0. Rezultatele experimentale indic la faptul c viteza de nitrozare a MU crete n intervalul
(2,78-7,47)10
-8
Ms
-1
odat cu mrirea [NO2
-
]0 de la 510
-5
M pn la 110
-4
M [102]. Nitrozarea s-a efectuat la pH 1. Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul I.3.2.
Tabelul I.3.2
Dependena vitezei de nitrozare a MU n funcie de [MU]0 i [NO2
-
]0
V = f [MU], [NO2
-
]0 = 1x10
-4
M, pH 1,0; V = f [NO2
-
], [MU]0 = 1x10
-4
M, pH 1,0
[MU]0x10
4
M Vx10
8
M s
-1
[NMU]10
5
M [NO2
-
]0 x10
4
M Vx10
8
M s
-1
[NMU]10
5
M
1,00 3,13 1,93 0,50 2,78 1,67
0,65 2,60 1,56 5,00 5,03 3,02
0,30 2,08 1,25 10,00 7,47 4,48

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel dup variaia [NO2
-
] n sistem n funcie de pH-ul mediului, n urmtoarele condiii: [NO2
-
] = 110
-4
M, [MU] = 110
-4
M, pH 1,0-4,0, t =
37C. Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaia concentraiei NO2
-
n procesul de nitrozare. n rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat c viteza procesului de nitrozare, calculat
dup variaia [NO2
-
], la fel scade cu creterea pH-ului (Tab. I.3.3).
Tabelul I.3.3
Dependena [NO2
-
] la echilibru, n funcie de pH; [NO2
-
] = 1x10
-4
M,
[MU] = 1x10
-4
M, pH 1,0-4,0, t = 37C
pH
[NO2
-
]x10
5
M
(la echilibru)
[NO2
-
]x10
5
M
(consumat)
1,0 0,5 9,5
2,0 2,5 7,5
3,0 6,5 3,5
4,0 7,0 3,0

Datele experimentale obinute, cuprinse n Tabelul I.3.3, coreleaz cu cele prezentate n Tabelul I.3.1, n care viteza a fost calculat dup variaia [NMU]: cu ct este mai mare [H
+
]0
n sistem, cu att este mai mic [NO2
-
] neconsumat, adic viteza de nitrozare crete cu creterea [H
+
].
Viteza de nitrozare a MU (dup variaia [NO2
-
]) n funcie de [MU]0 n intervalul (1,07,5)10
-5
M i [NO2
-
]0 n intervalul (1,07,5)10
-5
M este o linie dreapt ce trece prin centrul
de coordonate. Astfel, constatm nc o dat c reacia de nitrozare este de ordinul unu dup [NO2
-
]0 i [MU]0.
Mecanismul de nitrozare a MU. Din datele experimentale de mai sus s-a obinut expresia pentru viteza experimental de nitrozare a MU:
Vex. = [NO2
-
] [CH3-NH-CO-NH2] [H
+
] (I.3.3)
Dup cum am menionat (ec. I.1.1-I.1.3), n sistem se pot forma diferii ageni de nitrozare (N2O3 i NO
+
), al cror coninut, conform ecuaiilor (I.1.1), (I.1.2), (I.1.6), depinde de
pH-ul mediului:
[N2O3] = K4 [HNO2]
2
/ [H2O] (I.3.4)
[NO
+
] = K5 [HNO2] [H
+
] / [H2O] (I.3.5)
Nitrozarea MU poate avea loc dup urmtoarele reacii:
CH3-NH-CO-NH2 + N2O3
6
k
CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I.3.6)

CH3-NH-CO-NH2 + NO
+

7
K
CH3-N(NO)-CO-NH2 + H
+
(I.3.7)
Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pH<2, determinm expresia vitezei reaciei de nitrozare. Viteza experimental pentru reacia de nitrozare a MU poate fi redat
prin expresia:
V'NMU = 1 [MU] [NO2
-
] [H
+
] (I.3.8)
[MU] concentraia total a MU
V"NMU = 2 [CH3NHCONH2] [NO2
-
] [H
+
] (I.3.9)
[CH3NHCONH2] concentraia formei neprotonate a MU
La nitrozarea MU n funcie de pH poate participa NO
+
sau N2O3. Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiiile date, scriem ecuaia vitezei de nitrozare a MU
cu N2O3 i cu NO
+
:

31

V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I.3.10)
V7 = k7 [NO
+
] [CH3NHCONH2] (I.3.11)
Viteza sumar a procesului de nitrozare a MU poate fi determinat ca suma V6+ V7:
WNMU =
2 3
H O
6
V + V7
NO+
= k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO
+
] [MU] (I.3.12)
nlocuind din (I.3.4) i (I.3.5) expresia pentru concentraia N2O3 i NO
+
obinem expresia vitezei din care calculm constantele de vitez pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) i NO
+
(k7).
2 4 6 5 7
NMU 2 2
2 2
K K K K
W [MU] [HNO ] [HNO ][H ]
[H O] [H O]
+

= +
`
)
(I.3.13)
unde: K4 = 3 10
-3
, dm
3
M
-1
K6 = 8,37 10
6
, M
-1
s
-1
K5 = 3 10
-7
, dm
3
M
-1
K7 = 4,36 10
8
, M
-1
s
-1

Astfel, constatm [133,134] c la procesul de nitrozare a MU cu NO2
-
n intervalul de pH:1-2 n calitate de agent de nitrozare particip cationul de nitrozoniu (NO
+
), deoarece K7
>>K6, iar cu micorarea pH-ului are loc creterea [NO
+
]:

CH
3
NH C
O
NH
2
+ NO
+
CH
3
N C
NH
2
+ H
+
N O
O

Reacia de nitrozare a MU decurge dup mecanismul caracteristic compuilor slab bazici. Conform proprietilor acestor compui, ei nu sunt att de activi ca s se combine cu
oxidul de azot N2O3. La pH<2, MU se nitrozeaz prin interaciunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO
+
) sau cu cationul hidratat H2ONO
+
, adic procesul de nitrozare a MU
are loc n rezultatul catalizei acide [135,136].

I.3.3. Inhibiia procesului de nitrozare a metilureei
n lucrrile experimentale s-a studiat influena compuilor de natur reductoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei n sistemul NO2
-
i MU. n procesul de
nitrozare a MU n prezena hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraii de inhibitor n intervalul (510
-5
- 110
-4
) M i controlul (fr inhibitor). Curbele cinetice
de formare a NMU s-au obinut la pH 1, [NO2
-
] = 1x10
-4
M, [MU] = 1x10
-4
M (Fig. I.3.3).
Din datele obinute constatm [134,137] c DFH3Na are un efect inhibitor n sistemul dat i cu creterea concentraiei lui scade coninutul de NMU format, adic se micoreaz
viteza procesului de nitrozare (Tab. I.3.4). Dac calculm cota-parte de MU nitrozat, reieind din concentraia total iniial (adic forma protonat i neprotonat), constatm c coninutul
de NMU format scade de la 33% la 16% la creterea [DFH3Na]0 pn la 110
-4
M (Tab. I.3.4).
Tabelul I.3.4
Dependena vitezei de nitrozare a MU i [NMU] la echilibru
n funcie de [DFH3Na]0, pH 1,0, t = 37C
[DFH3Na] x10
4
M
[MU]
x10
4
M
[NMU]
x10
4
M
[NMU],
%
Vx10
8
M s
-1

k,
M
-2
s
-1
1,0 1,0 0,16 16 1,875 147
0,5 1,0 0,21 21 2,40 125
0,1 1,0 0,29 29 3,125 70
0,0 1,0 0,33 33 3,54 55
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
timp, min
[
N
M
U
]
,

*
1
0
^
-
5

M
[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 1*10^-5 M
[DFHNA]o= 5*10^-5 M [DFHNA]o= 1*10^-4 M

Fig. I.3.3. Curbele cinetice de formare a NMU n funcie de [DFH4]0;
[NO2
-
]0 = 1 10
-4
M , [MU]0 = 1 10
-4
M , pH 1,0.

n acelai mod a fost studiat cinetica procesului de inhibiie, sub aciunea (+)-Ct, utiliznd metoda extracional spectrofotometric (la = 235 nm); concentraiile substratului i
agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10
-4
M. Rezultatele experimentale obinute au demonstrat c cantitatea format de NMU la echilibru i viteza iniial scade odat cu creterea
concentraiei de inhibitor (Fig. I.3.4, Tab. I.3.5).

Tabelul I.3.5
[Ct]x10
5
M [NMU], % Vx10
8
M s
-1

(I.3.14)

32

50
30
8
15
3.5
4.5
16.7
6
0
10
20
30
40
50
60
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
[NO2-] remanent WNO2-
Dependena vitezei de nitrozare
a MU de [Ct]0, pH 1,0, t = 37C,
[NO2
-
] = 10
4
M, [MU] = 10
4
M

Fig. I.3.4. Randamentul reaciei de nitrozare a MU n funcie de [Ct]0;
[NO2
-
]0 = 1 10
-4
M, [MU]0 = 1 10
-4
M, pH 1,0, t = 37C.

Mecanismul de inhibiie ce are loc n prezena (+)catehinei sau DFH3Na n procesul de
nitrozare a MU include interaciunea agenilor de nitrozare cu inhibitorii. n rezultat, are loc
transformarea agentului de nitrozare (NO
+
) n oxid de azot II, care nu posed astfel de proprieti (ec.
I.3.15):

Dac comparm vitezele pentru aceiai parametri n prezena DFH3Na i (+)-Ct (Tab. I.3.4, I.3.5), constatm c viteza de nitrozare a MU n prezena (+)-Ct este mai mic. Cota-
parte de NMU format n sistem scade odat cu creterea pH-ului n intervalul 1-4, datorit creterii vitezei de nitrozare a MU odat cu creterea [H
+
]0, iar NMU la echilibru scade odat cu
creterea [Inh]0 (Fig. I.3.4).
Inhibiia procesului de formare a NMU a fost studiat la fel dup consumul nitriilor n sistem n funcie de natura reductorilor. S-a constatat c concentraia remanent de ioni
nitrii este minim n cazul DFH4, iar viteza de consum NO2
-
este minim n cazul cnd [Inh]0 = 0.









Fig.
I.3.5.
Viteza
de
consum a NO2
-

i [NO2
-
]
reman., n
funcie de natura
Inh; [MU]0
= 1x10
-4
M, [NO2
-
]0 = 1x10
- 4
M,
pH 2,6, t = 37C.

Viteza de consum a ionilor nitrii este mai mare ca viteza de formare a NMU. n sistemul NO2
-
MU activitatea inhibitoare crete n irul:
DFH3Na < (+) Ct < DFH4
0 100 3,50
1,0 92 2,47
5,0 80 1,90
10,0 50 1,61
W
x
1
0
7
,

M
s
-
1

[
N
O
2
-
]

r
e
m
,

%


(I.3.15)

33

I.3.4. Denitrozarea N-nitrozometilureei
Proprietile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douzeci de ani. Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice n mediul apos.
Exist un ir de mecanisme de hidroliz, care determin viteza proceselor i compoziia produselor. Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul, compoziia ionic i organic a
mediului, structura chimic a compusului, prezena grupelor hidroxile. Hidroliza este catalizat de prezena att a acizilor, ct i a bazelor.
Pentru mono- i bisubstitueni ai ureei, ca prim etap a descompunerii hidrolitice, se consider ruperea protonului amidic de la atomul de azot de ctre baz (B
-
), iar anionul format
se rupe formnd diazotat i izocianat [140,141]:

Diazotaii formai la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importan, deoarece n rezultatul unor transformri au loc procese ce duc la transferul compuilor alchil formai asupra
centrelor nucleofile. n calitate de intermediari electrofili alchilici formai sunt posibili diazocianii, acizii alchilcarbonici .a. [140], care n continuare pot interaciona cu ADN.
Izocianaii formai la fel sunt reageni electrofili, dar ei sunt mai stabili i nu interacioneaz cu ADN. Ei mai des interacioneaz cu proteinele dect cu acizii nucleici.
n medii acide, principala cale de descompunere hidrolitic este denitrozarea, catalizat de prezena acizilor i care are loc conform unui mecanism ionic [141]. Etapa limitativ,
care determin viteza procesului, este protonarea substratului.
Descompunerea N-nitrozometilureei catalizat de acizi are loc cu formarea NO
+
i metilureei, dup urmtorul mecanism [142]:
H3O
+
+ CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N
+
H(NO)CONH2 (I.3.17)
CH3N
+
H(NO)CONH2 + X XNO
+
+ CH3NHCONH2 (I.3.18)

NO
+
+ CH3NHCONH2
n cercetrile cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimic a NMU a fost utilizat lampa cu mercur DRSH-50.
Fotoliza NMU a fost studiat la lungimi de und monocromatice diferite ( = 235 nm, = 360 nm) i la iradiere total. Investigaiile cinetice ale descompunerii NMU n funcie de
diferii parametri fizico-chimici au fost efectuate n urmtoarele intervale de concentraie: [NMU]o = 110
-5
-2 10
-4
mol/l, T = 10-60C, pH 1,0-10,0.
Denitrozarea NMU
Din rezultatele cinetice prezentate n Figura I.3.7 constatm c procesul de denitrozare a NMU se intensific odat cu creterea temperaturii. Viteza procesului de denitrozare
depinde de intensitatea razelor UV i de concentraia ionilor de hidrogen.
Conform [142,143], momentul de dipol al unui ir de NNA alifatice este de 3,94,4 D. Fapt ce atest polaritatea acestor molecule, determinat de delocalizarea perechii de electroni de
la azot, ceea ce atrage dup sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuni:
R R
R' R'
Structura i mobilitatea relativ nalt a -electronilor n moleculele de NNC determin reactivitatea lor nalt. n condiii acide viteza de descompunere a
NMU se mrete datorit deplasrii echilibrului (ec. I.3.20) n dreapta:
2 2 2
O N NCO NH H [H O N NCO NH ] HN CO NH NO
+ + +
= + = +

CH3 CH3 CH3
n rezultatul formrii cationului de nitrozoniu, care este un agent de nitrozare, poate avea loc procesul invers de nitrozare i, n consecin, odat cu creterea [H
+
] viteza de
reacie sufer o variaie nensemnat (Fig. I.3.6).
n condiii bazice, reacia devine ireversibil i viteza de descompunere a NMU se mrete brusc. Cationul NO
+
(n forma H2NO2
+
) este legat de particulele ncrcate negativ B
-
,
conform reaciei:
H2NO2
+
+ B
-
NO
+
B
-
+ H2O (I.3.21)
Aceste circumstane pot fi evideniate la examinarea relaiei dintre pH i viteza de descompunere a NMU (Fig. I.3.6). Dup cum se observ, viteza minim de descompunere
corespunde pH 3,4. Dac la pH < 4 viteza de descompunere a NMU sufer o variaie nensemnat la micorarea pH, atunci la pH > 5 viteza crete exponenial [115, 127,130].



Fig. I.3.6. Viteza de descompunere a NMU n funcie de pH; [NMU] = 1x10
-4
mol/l,
t = 25C.

Fig. I.3.7. Viteza de descompunere a NMU n funcie de temperatur; [NMU] = 1x10
-4
mol/l,
pH 5,7.

Ecuaia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinat de relaia:
W = -d[NMU]/dt = {(kn + kH [H]
+
+ kOH [OH]} [NMU]o, (I.3.22)
unde: kn
-
este constanta de vitez pentru descompunerea NMU la pH 5,7, egal cu 0,2x10
-5
s
-1
; kH
-
constanta de vitez pentru descompunerea NMU n mediu acid, egal cu 2,7210
-9
l/mols;
kOH constanta de vitez pentru descompunerea NMU n mediu bazic, egal cu 5,35 10
-2
l/mols [115,130]. Influena temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrat n
Figura I.3.7, iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate n Tabelul I.3.6.
Tabelul I.3.6
Constantele vitezei de descompunere a NMU n f(t
o
)
t, C 1 15 25 40 50 60
(I.3.16)
(I.3.19) N N = 0 N
+
N =0

(I.3.20)

34

ko x10
5
, s
-1
0,1 0,68 1,59 2,56 4,18 6,36

Rezultatele prezentate n Figura I.3.7 i n Tabelul I.3.6 demonstreaz creterea vitezei i a constantei de vitez pentru procesul de descompunere a NMU, odat cu mrirea
temperaturii. Energia de activare calculat, Ea, este de 59,80 kJ/mol. Descompunerea NMU sub aciunea radiaiei UV are loc cu mult mai rapid dect sub aciunea luminii solare obinuite.
Aceasta este cauzat de ruperea legturii >N-N< sub aciunea razelor UV. Folosind ecuaia lui Arenius, la construirea dependenei kn n funcie de t (
o
C) n coordonatele ln kn n f(1/t) a fost
calculat energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV, care este de 47,61 kJ/mol [130].
Este cunoscut c N-nitrozoureele se supun uor descompunerii fotochimice. n medii aprotonate prima etap n procesul de denitrozare fotochimic este ruperea homolitic a
legturii ntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) i a radicalului ureei [140]. n lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontan.
Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU i ali derivai denot c n forma redus anion-radicalic legtura ntre atomii de azot este mai slab dect n starea de
baz. innd cont de acest fapt, s-a presupus c reducerea monoelectronic trebuie s duc la ruperea gruprii nitrozo- , ceea ce a fost constatat prin metodele RES i RMN [143]:

Viteza de descumpunere a NMU n funcie de concentraia acesteia n cazul iradierii cu raze UV (spectru complet), cu raze = 360 nm i cu raze = 235 nm este prezentat n
Figura I.3.8.
N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitic a legturii N-NO i la ruperea heterolitic produc NO
+
. Realizarea acestor produi formai la descompunere din NNA n
soluii poate fi stabilit cu utilizarea metodei Griess [143]. n spectrul vizibil ( = 535 nm) are loc formarea diazocompuilor la interaciunea reagentului Griess cu NO2
-
, ultimul formndu-se
la oxidarea speciilor NO i NO
+
.


Fig. I.3.8. Viteza de transformare fotochimic a NMU sub influena razelor UV,
n funcie de [NMU]0; pH 5,7, t = 20C.

Astfel, denitrozarea NMU a fost studiat dup acumularea ionilor nitrii, care se pot forma n rezultatul oxidrii NO cu oxigen. Valorile vitezelor de descompunere a NMU,
stabilite pentru diferite tipuri de iradieri n aceleai condiii experimentale (concentraii de NMU, pH i temperaturi), pot fi aranjate conform irului [130]:
W1 > W2 > W3 > Wo , (I.3.24)
unde: W1 viteza de descompunere sub aciunea spectrului UV complet; W2 viteza de descompunere sub aciunea razelor UV cu = 235 nm; W3 viteza de descompunere sub aciunea
razelor UV cu = 360 nm; Wo viteza de descompunere n lipsa iradierii. n Tabelul I.3.7 sunt prezentate constantele de vitez pentru procesul de descompunere a NMU sub aciunea razelor
UV [130]:
Tabelul I.3.7
Constantele de vitez n procesul de descompunere a NMU
Constantele transformrii NMU Condiiile experimentale Valoarea constantei
ko, 1/s Lipsa iradierii 1,5910
-5

k1, 1/s Spectrul UV complet 2,30 10
-5

k2, 1/s = 235 nm 9,1 10
-5

k3, 1/s = 360 nm 2,4 10
-5


Din rezultatele prezentate n acest Tabel constatm c NMU se descompune mai rapid sub aciunea razelor UV cu = 235 nm.
Prin analogie cu procesul de nitrozare, s-a studiat influena diferitelor adaosuri asupra denitrozrii NMU, i anume: a ionilor metalelor Fe(II), Cu(II), Mn(II), a reductorilor (acidul
ascorbic, dehidroxifumaratul de sodiu, reductonul trioz), a oxidanilor (peroxidul de hidrogen, reagentul Fenton). Concentraiile ionilor metalelor au fost variate n limitele 1,0 10
-7
5,0 10
-5

mol/l. Efectul reductorilor i al oxidanilor a fost investigat n limitele 1,0 10
-6
5,0 10
-4
mol/l [116].
n limitele concentraiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU. S-a constatat c n absena catalizatorilor (acizi, baze) NMU nu se reduce cu
astfel de reductori cum este ascorbatul, ditionitul. n organismele vii, rolul principal n denitrozarea alchilureelor l are NADP-H citocrom-P450-reductaza, enzim (transfer monoelectronic)
ce posed activitate de reductaz, iar n calitate de donor de electroni este NADP-H.

Concluzii
Principala contribuie n procesul de nitrozare a metilureei o are reacia ce implic ionul de nitrozoniu NO
+
. Agentul de nitrozare N2O3 reacioneaz mai lent. Constantele
experimentale de vitez ale interaciunii NO
+
i N2O3 cu metilureea sunt egale cu 4,36 10
8
M
-1
s
-1
i 8,35 10
6
M
-1
s
-1
, respectiv.
Viteza de formare a NMU se mrete (spre deosebire de aminele secundare) odat cu mrirea concentraiei H
+
. n diapazonul de pH de la 1,0 la 4,0 viteza are valoarea maxim la
pH 1,0.
(I.3.23)

35

Utilizarea acidului dihidroxifumaric i a (+)catehinei n procesul de nitrozare a MU cu NO2
-
duce la micorarea cantitii de NMU format. Activitatea inhibitoare a acidului
dihidroxifumaric este mai nalt dect cea a (+)catehinei.
La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparin atomului de azot cu rupere ulterioar a legturii >N-N< sub influena temperaturii i iradierii cu
raze UV.
Au fost calculate constantele de descompunere a NMU n funcie de pH, temperatur i pentru diferite domenii de iradiere. S-a constat c constanta vitezei de descompunere a
NMU n procesul fotochimic este mai nalt dect n procesul ce are loc n lipsa iradierii. Acest fapt demonstreaz influena benefic exercitat de razele UV asupra procesului de
distrucie a N-nitrozoamidelor puternic cancerigene. Un efect similar asupra descompunerii NNA exercit mrirea pH-ului i mrirea temperaturii.
n baza datelor cinetice au fost calculate mrimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 59,8 kJ/mol) i fotochimice (Ea = 47,61 kJ/mol).
Datele cinetice obinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicitii mediului apos i a produselor alimentare, cauzat de prezena N-nitrozoaminelor.