Sunteți pe pagina 1din 12

MICROSCOAPE FOTONICE Definiie Instrument optic de mrit care utilizeaz ca surs de radiaie FOTONUL.

. Puterea de rezoluie (PR) distana ntre dou puncte care se pot vedea separat 0,2 m (microni). Pentru ochiul normal, PR este de 0,2 mm iar pentru microscopul electronic, PR este de 0,2 nm (nanometri). MICROSCOPUL FOTONIC CLASIC Pri componente: 1. parte mecanic a. talpa microscopului n care este sursa de lumin i o oglind b. coloana microscopului la care sunt ataate: i. platina (msua microscopului) ii. sistemul de punere la punct a imaginii format din macroviz i microviz, alturi de urubul condensorului iii. capul microscopului cu oculare superior i obiective (5) inferior 2. partea optic: a. sistemul obiectivelor 5 obiective care mresc de 6x (nu l folosim), 10x, 20x, 40x i 100x (obiectivul cu imersie) b. sistemul ocular dou oculare care trebuie reglate ca la binoclu, pentru a vedea o singur imagine cu ambii ochi, simultan. c. sistemul condensor sistem de lentile sub platin, util pentru focalizarea luminii pe preparat.

Pri componente ale microscopului fotonic (figura de mai jos) : A. Pri mecanice a. Statice [1]. Coloana [2]. Piciorul / soclul [3]. Platina sau msua microscopului b. Mobiles [4]. Macroviza [5]. Microviza [6]. Surub de deplasare anteroposterioar a msuei/probei [7]. Surub de deplasare lateral a msuei/probei [8]. urubul condensorului (deplasri sus-jos) B. Pri optice [9]. Ocular [10]. Port-ocular [11]. Revolver support pentru obiective [12]. Obiective [13]. Preparat biologic (lama i sectiune de tesut acoperit cu lamela) [14]. Condensor [15]. Diafragm [16]. Lamp neon / LED [17]. ntrerupator

Pri componente ale microscopului fotonic

Tehnica de lucru etape - se conecteaz sursa de fotoni la transformator i transformatorul la priz - se rotete sistemul cu obiective i se aduce n axul optic obiectivul de 10x - se privete prin oculare i se ridic sau coboar condensorul pentru o iluminare corect a preparatului. Dac doresc o iluminare mai bun, ridic condensorul, dac iluminarea e prea puternic, voi cobor condensorul. Cu ct voi folosi un obiectiv mai mare, cu att condensorul va trebui ridicat, fiind nevoie de o iluminare mai bun. Iniial, pentru obiectivul de 10x este suficient o poziie la 1 cm sub platin. - se aeaz lama cu preparatul biologic colorat pe platin i se fixeaz cu ajutorul cavalerilor - privind DIN LATERAL se coboar tubul microscopului cu ajutorul macrovizei ct se poate de mult. Coloana se va opri automat cam la 1 cm de platin - acum, privind prin oculare, se ridic tubul cu ajutorul macrovizei pn se obine o imagine clar i colorat - pentru o punere la punct de finee se utilizeaz microviza - pot examina acum cu obiectivul 20x. ATENIE. Examinarea cu obiectivul 20x se poate face numai dup ce am obinut o imagine foarte clar cu obiectivul 10x. Dup ce am obinut aceast imagine, nu mai umblu la macroviz sau microviz! - Aduc n axul optic obiectivul de 20x - Pun la punct imaginea NUMAI cu microviza - Apoi pot examina cu obiectivul de 40x - Aduc n axul optic obiectivul de 40x - Pun la punct imaginea NUMAI cu microviza - Obiectivul cu imersie se utilizeaz numai cu o pictur de lichid de imersie pus pe lam ntre preparat i obiectiv. Se va folosi la frotiu. - dup utilizare, se scoate lama de pe platin, se aduce obiectivul de 10x n ax, se deconecteaz de la priz i se acoper microscopul cu o hus de protecie. MICROSCOPIA PRIN FLUORESCEN Fluorescena reprezint o emisie luminoas spontan, indus de variate forme de excitaie asupra materiei, mai puin cldura (de unde i denumirea de lumin rece). Emisia luminoas spontan are loc atunci cnd substana fluorescent a absorbit un fascicul luminos sau alt radiaie electromagnetic de o lungime de und diferit. De obicei radiaia

emis are o lungime de und mai mare i implicit o energie mai redus dect radiaia absorbit. Dac ns intensitatea radiaiei absorbite este mai mare, este posibil ca un electron s absoarb doi fotoni iar aceast absorbie s determine emisia unei radiaii cu lungime de und mai mic dect cea a radiaiei absorbite. Cel mai evident exemplu de fluorescen este proprietatea unor substane care, iradiat cu un fascicul de ultraviolete (lungime de und 300-400 nm), emite alte radiaii cu lungime de und mai mare, implicit n spectrul vizibil. Din punct de vedere fotochimic, fluorescena apare cnd un orbital electronic al unei molecule, atom sau nanostructuri se relaxeaz pentru a ajunge n stadiul energetic zero prin emisia unui foton, dup ce a fost excitat printr-un tip oarecare de energie. Mai precis, fluorescena este un fenomen prin care moleculele sensibile emit fotoni (emit lumin) atunci cnd ajung n stri de excitaie electronic, induse prin factori fizici (absorbia unei radiaii electromagnetice), mecanici (frecare) sau mecanochimici. Moleculele capabile de a realiza fenomenul de fluorescen conin grupri chimice numite cromofori care determin aceast proprietate. Clasificarea fluorescenei: Fluorescen primar sau autofluorescen substane care emit spontan n spectrul vizibil dac sunt iradiate cu ultraviolete (UV). Exemple: clorofila, petrolul, colagenul, elastina, fibrilina, flavinele, indolaminele, pigmenii, aminoacizii etc Fluorescen secundar substane care devin fluorescente numai dup ce sunt tratate cu o alt substan, normal fluorescent, denumit fluorocrom exemple: acridin orange, DAPI (46diamidino-2-fenil-indol). Se pot detecta astfel substane care devin fluorescente acizi nucleici (ADN fluorescen albastr cu DAPI), colagen, fibre elastice Aplicaii microscopice ale fluorescenei Scopul microscopiei n fluorescen este de a identifica i deosebi pe un preparat biologic substane care nu pot fi deosebite n mod normal prin coloraii uzuale. Astfel, pentru a identifica o substan care este natural fluorescent i care nu se poate observa diferit printr-o coloraie obinuit, vom examina preparatul care o conine n microscopul cu fluorescen. La acest microscop, pe un fond negru, vor aprea spoturi luminoase, colorate diferit, care vor arta prezena substanelor fluorescente (fie cele care sunt natural fluorescente, fie cele care sunt tratate cu un fluorocrom secundar fluorescente).

Microscopia prin fluorescen se adreseaz att seciunilor de esut fixat ct i celulelor vii, n culturi primare sau secundare. Microscopul cu fluorescen este un tip de microscop convenional la care se adaug diferite componente i proprieti care i amelioreaz funciile. Spre deosebire de alte microscoape optice care speculeaz caracteristicile elementelor preparatului biologic (absorbia luminii, gradieni de faz, birefringen), microscopia prin fluorescen poate forma imaginea distribuiei speciilor moleculare simple care emit fluorescen (primar sau secundar). Limite. Datorit difraciei luminii, puterea de rezoluie n microscopia prin fluorescen este de circa 200 nm. Aplicaii practice ale marcrii fluorescente Spectrul vizibil (spectrul optic) reprezint domeniul spectrului electromagnetic ce poate fi detectat de ochiul uman. n condiii normale, ochiul uman percepe n aer lungimile de und din domeniul 380 - 750 nm. Substane cu fluorescen primar: 1. pigmeni a. porfirine fluorescen roie apar ca spoturi roii pe fond negru b. pigmeni carotenoizi fluorescen verde apar ca spoturi verzi pe fond negru c. cromolipidele fluorescen galben-verde apar ca spoturi galben verzi pe fond negru d. lipofuscina fluorescen rou-maro 2. aminoacizi a. fenilalanina i tirozina fluorescen albastr 3. bacilul Koch factorul etiologic al tuberculozei fluorescen verde strlucitoare 4. dintele natural 5. amine biogene adrenalina, noradrenalina fluorescen verde Substane cu fluorescen secundar (care devin fluorescente dup tratarea cu fluorocromi variai acridin-orange-AO sau DAPI, de exemplu): 1. acizi nucleici a. ADN fluorescen verde / albastr cu DAPI b. ARN fluorescen roie 2. fibre de colagen i reticulin fluorescen verde 3. mucinele fluorescen verde 4. nucleii leucocitelor fluorescen verde

Marcarea simpl pentru fluorescen secundar se realizeaz prin afinitatea unui fluorocrom pentru molecula de marcat (de exemplu, DAPI se cupleaz pe molecula de ADN determinnd o fluorescen albastr). Fluorocromii difer prin spectrele de absorbie i emisie. Fluoresceina (FITC Fluoresceine-Iso-Thio-Cyanate) absoarbe radiaiile de culoare albastr (max 541 nm) i red o fluorescen verde (max 520 nm). Rhodamina (TRITC Tetra-methyl Rhodamine Iso-Thio-Cyanate) absoarbe radiaiile de culoare verde (max 541 nm) restituind o fluorescen roie (max 572 nm). Rezultatele marcrii fluorescente variaz n funcie de elementele subcelulare implicate. Aplicaii speciale 1. Delimitarea precis a componentelor intracelulare marcate cu fluorocromi specifici (fluorescen secundar), coeficientul de difuziune al acestor substane, caracteristicile mecanismelor lor de transport, interaciuni posibile cu alte biomolecule. Modificrile de fluorescen induse de variaia unor parametri biochimici locali permite investigarea variaiilor de pH, viscozitate, indice de refracie, concentraii ionice, potenial de membran sau polaritatea celulelor vii. 2. Imuno-fluorescena identificarea unei substane cu ajutorul unui anticorp marcat fluorescent.

substana de identificat mpotriva creia se sintetizeaz anticorpi pe o alt specie

+
anticorp marcat fluorescent complex antigen-substan de identificat

Anticorpii sunt sintetizai specific pentru a se fixa numai pe substana de identificat. Dup aplicarea pe preparatul biologic a anticorpilor marcai cu fluorocrom, acetia se vor fixa pe seciunea de esut numai acolo unde gsesc substana de identificat cu care se cupleaz specific. Apoi se examineaz la microscopul cu fluorescen i apar spoturi luminoase (fluorescen secundar) numai acolo unde anticorpul marcat s-a cuplat cu substana de identificat. Metoda este util n diagnosticul diferitelor tumori maligne.

MICROSCOPIA N CONTRAST DE FAZ Contrastul de faz este o tehnic utilizat pe scar larg i care permite amplificarea diferenelor dintre indicii de refracie sub forma diferenelor de contrast. Tehnica a fost pus n practic de fizicianul olandez Frederik Zernike n anul 1934 (primind premiul Nobel n anul 1953). Tehnica de contrast de faz utilizeaz faptul c lumina care traverseaz o parte transparent a preparatului microscopic va fi ncetinit n raport cu lumina a crei traiectorie nu este modificat. Aceast diferen de faz nu este vizibil pentru ochiul uman. Sistemul imaginat de Zernike accentueaz defazarea la jumtatea unei lungimi de und prin intermediul unei plci de faz, transparent, care transform defazarea n diferen de amplitudine a undei i deci de luminozitate. Obiectul transparent devine mai luminos dect mediul ambiental. Principiul microscopiei prin contrast de faz. Preparatele biologice necolorate care nu absorb lumina se numesc obiecte de faz, deoarece modific uor faza luminii difractate de preparat, realiznd de obicei o defazare de din lungimea de und fa de lumina direct, nedeviat, care trece nemodificat pe lng preparat. Ochiul uman este sensibil numai la culorile spectrului vizibil (variaii n frecvena undei incidente) sau la diferenele dintre nivelele de intensitate (variaii de amplitudine a undei). Pentru obiectele de faz, raza ordinar trece direct i nedeviat prin sau pe lng acest obiect. n acelai timp, razele difractate de preparat este ncetinit cu aproximativ din lungimea de und i ajunge defazat la planul imaginii fa de raza ordinar, dar fr a fi diminuat ca intensitate. Microscopul cu contrast de faz accelereaz raza ordinar cu din lungimea de und; astfel diferena de faz ntre raza ordinar i cea difractat pentru un obiect de faz devine din lungimea de und. n consecin, undele directe i cele difractate ajunse la nivelul ocularelor sunt capabile de a produce fenomenul de interferen distructiv. Astfel, detaliile apar mai ntunecate pe fond luminos, iar contrastul de faz se numete pozitiv. Dac unda direct este defazat cu din lungimea de und, atunci unda difractat i unda direct ajung n acelai timp la ocular iar interferena este constructiv; acum imaginea este luminoas pe fondul mai ntunecat; contrastul de faz este negativ.

Principiul de funcionare al microscopului prin contrast de faz

Aplicaii practice Contrastul de faz este o metod excelent pentru a studia evenimente celulare n dinamic, n special n celulele vii, nefixate, necolorate. Tehnica microscopiei n contrast de faz este aplicat la scar larg n cercetarea biomedical, n special n citologie i histologie. Putem examina astfel: - celule vii, - esuturi nefixate, necolorate, - microorganisme transparente la iluminarea pe fond luminos, - organite celulare, - membrane celulare, - nuclei, - mitocondrii, - fusul de diviziune i cromozomii, - aparatul Golgi - granulaii citoplasmatice ale celulelor vegetale i animale Microscopia n contrast de faz este utilizat pentru evidenierea celulelor tumorale, dinamica i comportamentul celulelor n cultur. Celulele n cultur se examineaz cu un microscop inversat cu contrast de faz.

Hematii n microscopia cu contrast de faz (x400) exemplu: o granul de colesterol n snge, printre hematii

MICROSCOPIA N LUMIN POLARIZAT Microscopul polarizant sau microscopul polarizor analizor reprezint un tip de microscop optic care folosete dou filtre polarizante: unul polarizor i unul analizor. Este util n special n mineralogie i de asemenea n biologie i cercetarea biomedical. Principiul microscopiei n lumin polarizat. Lumina natural sau artificial are o natur dubl ondulatorie i corpuscular. Este o und electromagnetic care vibreaz n toate direciile, ntr-un plan perpendicular pe traiectoria de propagare. Dac aceast lumin este filtrat cu un filtru polarizant, ea va vibra pe o singur direcie i devine lumin polarizat.

Microscop polarizant Lumina trece prin filtrul polarizant i devine lumin polarizat neanalizat; este format numai din unde care vibreaz n acelai plan. Un al doilea filtru (analizor) las s treac lumina i undele care vibreaz ntr-un singur plan. Planul polarizorului i analizorului sunt perpendiculare. n absena probei de examinat, lumina traverseaz polarizorul i pstreaz un singur plan de vibraie. Odat polarizat, lumina nu mai poate traversa analizorul. n absena unei probe care s posede proprietatea de birefringen, lumina nu mai ajunge la ochiul observatorului. Preparatul birefringent este plasat ntre polarizor i analizor. Lumina polarizat este deviat de proba biologic astfel nct, la ieirea din acesta, vibraiile au loc din nou n toate direciile.

Birefringena reprezint fenomenul de dedublare a luminii polarizate n dou unde de polarizare diferit care se propag cu o vitez diferit. Acest fenomen este descris ca o rotaie a polarizrii. Ca i exemplu, avem descoperirea lui Erasmus Bartholin, n anul 1669. Acesta a remarcat dedublarea imaginii formate ntr-un cristal de spat de Islanda (CaCO3).

Exemple de birefringen (dubl refracie) Fenomenul de dedublare a luminii este cunoscut sub numele de dubl refracie (birefringen). Dac rotim cristalul, o imagine rmne staionar iar cealalt se rotete n jurul celei dinti. Una dintre unde, numit raz ordinar trece direct prin cristal (genereaz imaginea staionar) n timp ce raza cealalt este refractat diferit. Raza refractat se numete extraordinar i se rotete n jurul celei ordinare. Birefringena poate fi: - pozitiv: dac raza ordinar este transmis mai rapid dect raza extraordinar (ex. colagen, fibre mielinice, fibre ale muchiului striat) - negativ: dac raza extraordinar este transmis mai repede dect raza extraordinar (ex. calcit, fibre nucleoproteice) - birefringena intrinsec: descrie materialele naturale care au un indice de refracie asimetric, pe direcii diferite. Exemple : cristale anizotrope, minerale, produi chimici normali sau sintetici - birefringena de structur: depinde de structura probei de analizat i este de asemenea dependent de variaiile indicelui de refracie al mediului. Caracterizeaz structuri macromoleculare cum ar fi cromosomii, fibrele musculare, microtubulii, ADN, proteine fibrilare (caracteristice firului de pr). - birefringena cristalin, caracteristic pentru cristale proteice sau lipidice - birefringena de tensiune: apare n structuri supuse unor tensiuni mecanice (muchi, esuturi embrionare, polimeri, lentile de plastic) APLICAII Acest tip de microscop este utilizat n mai multe domenii: medicin, biologie, geologie, tiina materialelor, industria alimentar.

Ca i avantaj, microscopul cu lumin polarizat poate deosebi materialele izotrope de cele anizotrope. Materialele isotrope, cum ar fi cristalele cu simetrie cubic, lichidele i gazele, nu au limitri n termeni vibraionali referitor la lumina care le traverseaz. Invers, materialele anizotrope au o gam larg de proprieti refringente. n medie, 90% dintre substanele solide sunt materiale anizotrope. Pentru microscopia n lumin polarizat putem utiliza lumina reflectat sau lumina transmis prin preparat. Lumina reflectat este util pentru studiul materialelor opace cum ar fi ceramicele, oxizii i sulfurile minerale, metalele, aliajele, compozitele. 1. examinarea fibrelor de colagen, fibrelor musculare 2. studiul membranelor biologice 3. examinarea pentru detectarea granulelor de lipide, colesterol

colesterol

colagen