Transcripcin en Procariotas

RNA polimerasa
Durante la transcipcin un sistema enzimtico convierte la informacin gentica de un dsDNA a una cadena de RNA. El RNA es sintetizado por la RNA polimerasa la cual requiere: Molde de DNA Ribonucletidos: ATP, GTP, UTP, CTP como precursores de nucletidos Mg, Zn La ARN polimerasa es una de las enzimas ms grandes que se conoce. Consta de cinco sub-unidades: dos alfa (), beta (), prima () y sigma (). La enzima completa es denominada Holoenzima y se divide en dos componentes principales: La enzima central, denominada Core, formada por las sub unidades 2, y El Factor Sigma ( el polipptido )

beta

La Holoenzima reconoce un sitio de unin especfico en el ADN, este sitio es denominado Promotor . Como consecuencia de lo dicho, la ADN polimerasa puede encontrarse en dos estados: Un estado apropiado para la unin con el Promotor: estado de iniciacin u Holoenzima. Un estado apropiado para la elongacin: Core de la enzima 70 El par de bases donde se inicia la transcripcin es +1 que es generalmente un purina CAT. El factor interacciona con dos secuencias consenso en -10 (5 TATAAT 3) y -35 (5 TTGACA 3). Existe un tercer elemento de reconocimiento rico en AT llamado elemento up (up stream promoter) al cual se une la subunidad . La frecuencia de iniciacin de la transcripcin por la RNA polimerasa de E. Coli depende de su afinidad por la secuencia promotora. Existen promotores fuertes que incian la transcripcin con alta frecuencia, promotores dbiles los cuales inician la transcipcion con baja frecuencia, esto determina el nivel de expresin de un gen. Cuando la RNA polimerasa se une a la regin promotora se forma un complejo cerrado en el que las cadenas de DNA cerca del +1 tienen sus bases apareadas y para alargar la cadena, la RNA polimerasa debe separar los pares de bases unidos y formar un complejo abierto. 70 Despus de transcribir unos pares de bases, la subunidad se libera actuando solo como factor de iniciacin.

Iniciacin de la sntesis del ARN mensajero

La iniciacin se produce mediante la unin de la RNA polimerasa (Holoenzima) al ADN de doble cadena. Para que cadena molde est disponible para el apareamiento de con los ribonucletidos, las dos cadenas de ADN deben separarse. El desenrollamiento es local y se produce cuando Holoenzima contacta con la TATA Box. Una vez que el complejo promotor se encuentra abierto, la comienza la sntesis. La fase de iniciacin no se completa que se hallan polimerizado los primeros seis ribonucletidos. la bases la ARN pol hasta

Elongacin de la cadena
Despus que se han colocado los primeros seis ribonucletidos, la ARN polimerasa sufre un cambio en su conformacin, perdiendo la sub unidad . Se contina la sntesis en el estado de Core anteriormente descrito. El Core se mueve a lo largo del ADN colocando los ribonucletidos complementarios a la cadena de ADN molde, abriendo la hlice a medida que se desplaza. Los ribonucletidos se unen al extremo 3 de la cadena de ARN en crecimiento, formndose un Hbrido ARN-ADN en la regin desenrollada, el cual se mantiene estabilizado mediante enlaces puente de Hidrgeno. El hbrido tiene una longitud aproximada de 12 pb y el nuevo ARN es liberado de estas uniones cuando el ADN recupera su estado de doble hlice por desplazamiento del Core.

Terminacin y liberacin del ARN sintetizado

La terminacin ocurre en una secuencia determinada del ADN, denominada Secuencia Terminadora. En este punto, la enzima deja de aadir los ribonucletidos a la cadena de ARN en crecimiento, liberando el producto terminado y disocindose del ADN. La terminacin requiere que todos los enlaces Puente de Hidrgeno, que mantenan al Hbrido ARN ADN, se rompan volvindose a reconstituir el ADN dplex.

Terminacin Rho dependiente

Requiere la presencia de la estructura de horquilla (regin rica en GC). El factor rho, es una protena compuesta por seis subunidades idnticas de y tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energa liberada es capaz de mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se esta sintetizando en direccin de la burbuja de transcripcin. Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el hbrido ADN-ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al citoplasma

Rho independiente
La secuencia de terminacin Rho-independiente se caracteriza por la presencia de una secuencia rica GC seguido por residuos U. las regiones complementarias se aparean al ser sintetizadas formando una horquilla por la cola poli-U y al emerger la cola poli-U genera la liberacin de la de RNA del complejo de transcripcin.

seguida cadena

Subunidades en E.Coli y Regulacin

La sustitucin de los factores por otros, permiten regular la expresin en diferentes situaciones cambiando la afinidad de la RNA polimerasa. En E.Coli existen varios factores adems del 70 constitutivo; los otros que son activados en condiciones especiales y reconocen otros promotores especficos. Gen rpoD rpoS rpoH rpo E rpoN Flia A sigH Factor () 70 S 32 E 54 28 o F H Situacin de uso general estrs estrs trmico estrs trmico Metabolismo del N Metabolismo flagelar CTGGNA CTAAA AGGANPuPu 6 15 11-12 TTGCA GCTGAATCA GCTGAATCA CCCTTGAA 13-15 CCCGATNT Secuencia -35 TTGACA Separacin entre secuencias (pb) 16-18 Secuencia -10 TATAAT

La cuestin es cmo se cambia la expresin de manera que se exprese un factor u otro factor. Esto se da debido a seales del medio ambiente, las cuales desarrollan cascadas de sealizacin que terminan en cambiar la actividad celular y la expresin gentica. Estos cambios desarrollados por seales pueden expresar nuevos o activar los que se encontraban en el citosol desactivados. El cambio en la expresin tambin puede darse por cascadas dentro de la misma expresin. Un ejemplo es la de algunos bacterifagos que infectan a E.Coli (en algunos casos tambin a B.Subtillis). Una cascada de factores se produce cuando se requiere de un factor para transcribir el gen que codifica para el siguiente factor. El mecanismo sera:

Regulacin de la transcripcin
El modelo del opern
Tal como postularan Jacob y Monod, los grupos de genes que codifican para protenas asociadas se encuentran en unidades conocidas como Operones . Composicin del opern: Los genes estructurales: llevan informacin para polipptidos. Se trata de los genes cuya expresin est regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son polignicos o policistrnicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones eucariticos suelen contener un slo gen estructural siendo monocistrnicos. El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripcin. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra P. El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la protena reguladora. El operador se sita entre la regin promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra O. El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la protena reguladora que reconoce la secuencia de la regin del operador. El gen regulador est cerca de los genes estructurales del opern pero no est inmediatamente al lado. Abreviadamente se le denomina gen i. Protena reguladora : protena codificada por el gen regulador. Est protena se une a la regin del operador. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresin de los genes.

Opern Lac
Genes estructurales Lac Z codifica para la -galactosidada Lac Y codifica para la lactosa permeasa que permite la entrada de la lactosa al interior de la clula. Lac A codifica para la transacetilasa.

Elementos de control: Promotor: elemento de control que contiene la secuencia reconocida por la RNA polimerasa para inciar la transcripcin y se encuentra antes de los genes estructurales Operador (O): secuenca de DNA reconocida por la protena reguladora

Gen regulador (I): secuencia que codifica para la protena reguladora Inductor es capaz de inducir la expresin de los genes del opern y no son hidrolizados por la -galactosidasa. Un ejemplo de inductor es el IPTG el cual es til para estudios genticos del opern al difundir al interior de las clulas manteniendo constante su concentracin al no ser metabolizado.

a. Cuando la concentracin de lactosa es baja o la de la glucosa es alta , el gen regulador sintetizar una protena, el represor, que se unir al operador. Al quedar el operador ocupado, la ARN polimerasa se ver imposibilitada de unirse al promotor y, la transcripcin de los genes estructurales se ver inhibida. b. Cuando hay glucosa y lactosa , la frecuencia de iniciacin transcripcin es un muy baja lo que da como resultado la sntesis de tan solo bajos niveles de mRNA lac y de las protenas codificadas en el opern lac. Cuando la glucosa se agota del medio, se comienza a sintetizar AMPc y a medida que se incrementa su concentracin, ste se une a la subunidad de la protena dimrica CAP provocando un cambio conformacional le permite unirse al sitio CAP de la regin de control de la transcripcin de lac. El complejo CAP-AMPc unido interactua la polimerasa unida al promotor estimulando la frecuencia de iniciacin. (Control positivo) sitio

de la

que con

c. Cuando la concentracin de Glucosa sea baja y la de la Lactosa sea alta , el regulador se unir a una molcula inductora de la transcripcin de los genes estructurales para la sntesis de las enzimas degradativas de dicho disacrido. El represor entonces no podr unirse al operador. Por consiguiente, al quedar este ltimo libre, la ARN polimerasa formar el Complejo Promotor Abierto pudindose producir la mxima transcripcin de los genes estructurales.

E. Coli puede usar glucosa u otros sacridos como lactosa como nica carbono y energa. I. II. Se consume la glucosa y la lactosa se mantiene Se consume la lactosa y ya no hay mas glucosa.

fuente de constante

Tambin es conveniente recordar que los tres genes estructurales opern lactosa se transcriben juntos en un mismo ARNm, es decir los ARN mensajeros de bacterias suelen ser policistrnicos. Sin embargo, en eucariontes los mensajreos suelen sen monocistrnicos o monognicos, es decir, corresponden a la transcripcin de un solo gen estructural.

del que

Mutaciones Mutantes constitutivos

Los mutantes constitutivos son aquellos en los que siempre se expresan o transcriben los genes del opern lac, independientemente de si est o no el inductor. Mutacin constitutiva I : esta mutacin altera la estructura de la protena reguladora de manera que ya no puede unirse al operador. As, la regin promotora queda libre para la RNA polimerasa la cual transcribe los genes estructurales en ausencia del inductor (lac) Mutacin O : consiste en una alteracin en al secuencia de la regin operadora por lo que la protena represora producto del gen I ya no puede unirse, la regin promotora queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripcin de los genes estructurales en ausencia de inductor (lactosa). El estudio de diferentes mutantes del operador ha permitido determinar que el operador es una regin de 17 a 25 nucletidos situada justo antes del gen z y despus del promotor. Esta regin muestra una enorme especificidad por la protena represora. Es importante destacar que tanto la mutacin i- como la O actan simultneamente sobre los tres genes estructurales del opern lactosa. En la siguiente tabla se indica la expresin de los genes del opern lactosa en los dos mutantes constitutivos estudiados, en C el regulador constitutivo (i- ) y en el operador constitutivo (O ). Mutantes constitutivos Genotipo i PO z y a i PO z y a
+ C + + + + + + C c -

Expresin de los genes estructurales del Opern lactosa Ausencia de inductor (Sin lactosa) z
+

Presencia de inductor (Con lactosa) a

+

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

Mutantes del Promotor (OO)

Estos mutantes presetan una alteracin en la secuencia de bases nitrogenadas de la regin promotora, como consecuencia la ARNpolimerasa no reconoce la secuencia promotora y, por consiguiente, no se produce la transcripcin de los genes estructurales. A O estos mutantes se les ha denominado "Operador cero" (O ), pero es necesario recordar que afectan a la regin promotora.

Diploides parciales o merocigotos constitutivos

En estos diploides parciales, se ha comprobado que el operador constitutivo O/O es dominante en posicin CIS, es decir, su efecto solamente sobre los genes estructurales que estn en misma molcula de ADN que la mutacin del operador, pero no sobre los genes estructurales de otra molcula de ADN. Esto significa que el operador es una secuencia de bases en el ADN codifica para ninguna molcula difusible. En el siguiente diploide + + + + + C + + + parcial i P O z y a / i P O z y a tanto en ausencia como en presencia de lactosa se produce la expresin de los tres genes estructurales del opern. Esto se debe a que los genes estructurales que estn en la misma molcula de ADN que la C mutacin constitutiva O se van a expresar siempre. En el C siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial O/O en ausencia de inductor.
C

ejerce su acta que no

Sin embargo, en los diploides parciales con un gen regulador normal y un gen regulador mutante constitutivo , es decir, en baterias diploides parciales i /i el gen regulador normal i es dominante en posicin TRANS, es decir, ejerce su efecto sobre los genes estructurales de la misma molcula de ADN en que est la mutacin del gen regulador y tambin sobre los genes estructurales de
+ +

otra molcula de ADN diferente. Por tanto, el gen regulador codifica para una protena o producto difusible que puede ejercer su efecto en + diferentes molculas de ADN. En el siguiente diploide parcial i P O + + + + + + z y a / i P O z y a en ausencia de lactosa no hay expresin de los genes estructurales mientras que en presencia de lactosa si se expresan. Esto + se debe a que la protena represora normal producida por el gen i al ser difusible se puede unir a ambas regiones operadoras. En el siguiente + esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial i /i en ausencia de inductor de inductor.

En la siguiente tabla se indica la expresin de los genes del opern lactosa en los dos diplides parciales, uno con en el regulador C constitutivo (i- ) y el otro con en el operador constitutivo (O ). Diploides parciales Genotipo i POz y a /i PO z y a i POz y a /i POz y a
+ + + + + + + + + + + + C + + +

Expresin de los genes estructurales del Opern lactosa Ausencia de inductor (Sin lactosa) z
+

Presencia de inductor (Con lactosa) z

+

SI NO

SI NO

SI NO

SI SI

SI SI

SI SI

Mutantes sobre el gen regulador

Mutante i-: explicado arriba en diploides parciales. Mutante i-d: afecta al gen estructural de la protena represora en la regin que codifica para el extremo amino terminal (NH2). Esta regin es la encargada de reconocer la regin operadora. La protena represora mutante se une al inductor (al IPTG) pero no es + + -d capaz de unirse al operador. Esta mutacin es dominante sobre la i en los diploides parciales (i /i ). En los diploides parciales la protena represora mutante no se une a las regiones operadoras y se produce siempre la trasncripcin de los genes estructurales. Mutante iS : afecta al gen estructural de la protena represora modificando la parte central de la protena encargada de unirse al inductor (al IPTG). La protena represora mutante se une al operador pero no es capaz de reconocer al inductor (IPTG). Se trata de un mutante que est siempre reprimido en el que no se expresan los genes del opern lactosa ya que la protena represora est + permanentemente unida a la regin operadora y no se suelta a pesar de aadir el inductor. Este mutante es dominante sobre i en + S los diploides parciales (i /i ). En los diploides parciales el represor mutante se une a ambas regiones operadoras bloqueando la transcripcin de los genes estructurales.

Opern Triptofano
Genes estructurales: existen cinco genes estructurales en el siguiente orden trpE-trpD-trpCtrpA. Elementos de control: promotor (P) y operador El promotor y el operador estn al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden: P O trpE-trpDtrpB-trpA. Curiosamente, las enzimas codificadas estos cinco genes estructurales actan en la ruta metablica de sntesis del triptfano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma. Gen regulador (trpR): codifica para la protena reguladora. Este gen se encuentra en otra regin del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del opern. Correpresor: triptfano. trpB(O). trpCpor

En ausencia de triptfano , o cuando hay muy poco, la protena reguladora producto del gen trpR no es capaz de unirse al operador de forma que la ARN-polimerasa puede unirse a la regin promtora y se transcriben los genes del opern triptfano. En presencia de triptfano , el triptfano se une a la protena reguladora o represora cambiando su conformacin, de manera que ahora si puede unirse a la operadora y como consecuencia la ARN-polimerasa no unirse a la regin promotora y no se transcriben los genes estructurales del opern trp. regin puede

Por tanto, la diferencia esencial entre el opern lac (inducible) y el opern trp (represible) , es que en este represor del triptfano solamente es capaz de unirse al operador cuando previamente est unido al trp. ltimo el

Regulacin por atenuacin

Yanofsky aisl el ARN-m multignico del opern trp y secuenci la regin del extremo 5 encontrando una regin lder en el extremo 5 del mRNA que contiene 4 secuencias, las secuencias 3 y 4 forman la regin atenuadora (estructura rica en GC seguida por residuos U que actan como terminadores de la transcripcin) si se apareas las secuencias 2 y 3, la estructura atenuadora no puede formarse y contina la transcripcin.

Cuando los niveles de triptfano son altos , el ribosoma traduce la secuencia 1 rapidamente y bloquea la secuencia 2 antes de transcribir la 3. As se permite la formacin de la estructura atenuadora que produce la terminacin de la transcripcn. Cuando los niveles de triptfano son bajos el ribosoma se detiene secuencia 1 y la formacin entre las secuencias 2 y 3 impide la atenuacin debido a que la secuencia 3 no est disponible. As se permite la transcripcin. en la

Opern Arabinosa
La arabinosa es una pentosa que requiere ciertas enzimas para su metabolismo, las cuales estn codificadas por los genes estructurales ara A, ara B y ara D, Este opern contiene adems de los genes estructurales, Una regin reguladora con dos operadores ara O1 y ara O2 Ara I es un sitio de unin para la protena reguladora (araC) Un promotor adyacente araI Un sitio de unin para CAP-AMPc en el

La protena acaC est codificada por un gen arac proximidad. Esta protena ejerce un control dual (regulador positivo y negativo)

Control dual:
Cuando no hay arabinosa y la glucosa es abundante, la protena reguladora une tanto a araO2 como a araI por lo que se forma un lazo de DNA que no la transcripcin de los genes estructurales. Cuando hay arabinosa en el medio y la glucosa es escasa el complejo CAPAMPc es abundante y se une al sitio adyacente a araI. La arabinosa funciona como un activador, al unirse a araC altera su conformacin y al unirse sta a araI se combina con CAP-AMPc y aumenta la transcripcin. arac se permite

Mecanismos de censado Activacin de la RNApol conteniendo 54 en el promotor glnA por NtrC

Esta activacin depende del nivel de nitrgeno en el medio y de la taza de captacin del mismo. El nivel de N 2 en las clulas se ve midiendo por la relacin glutamato/glutamina. Est relacin est coordinada por la accin de la enzima GlnA, la cual es clave y cuya expresin se produce utilizando el factor .
54

La GlnA es inactiva cuando no est adenilada, pero se convierte en activa cuando es adenilada. En esa forma, la glutamina es sintetizada a partir del glutamato. Su 54 expresin depende de un promotor reconocido por . Su Opern tiene un enhancer (estimulador) a unos 150nt Upstream del promotor (secuencia reguladora), que se asocia con la protena NtrC. NtrB es una quinasa que activa C. El NtrC activado por NtrB forma un loop en el DNA que le permite unirse a la RNApol54 formando el complejo cerrado, no activo. Se necesita ATP para activar el complejo y pasar a tener el complejo abierto. A diferencia de un promotor, los enhancers activan en cualquier orientacin. Los promotores si los ubico hacia un lado, van a transcribir hacia ese lado.

Muchas bacterias son controladas por dos sistemas regulatorios. PhoR/PhoB son dos componentes del sistema regulatorio de E. coli

La expresin gnica requiere en ocasiones de un mecanismo de traduccin de seales que le permita censar las condiciones del entorno. Estimulo ambiental receptor del estmulo transmisin del estmulo hacia el interior El nivel de P se censa por una protena transmembrana que posee: Dominio de unin a P (fosforo) Dominio transmembrana Dominio citoplasmtico (H)

El fosforo no puede atravesar la membrana e ingresar a la clula, por lo cual solo puede interactuar con receptores transmembrana. Cuando hay fosforo en el medio, este est unido al receptor y el mismo no emite ninguna seal; frente a la falta de fosforo en el medio, la protena de membrana realiza una cascada de sealizacin que influir tanto a nivel metablico como bioqumico. El dominio citoplasmtico H de la protena receptora fosforila a phoB, activando su actividad de regulador de la expresin gnica como respuesta a seales. Este factor acta sobre diferentes genes y en diferentes lugares del cromosoma.

11