LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA
AMBIENTAL
PROFESORA: BLGA. ALICIA R. CAARI M.

ALUMNO: ELMER PEPE MORALES GARCILAZO.

ESCUELA ACADMICO-PROFESIONAL INGENIERIA AMBIENTAL.

165 C NOCHE 2012- II

PRACTICA N3
EL MICROSCOPIO Y SU UTILIDAD EN MICROBIOLOGIA. COLORACIONES BACTERIANAS El microscopio ptico es una herramienta bsica para la investigacin microbiolgica de rutina ya que el examen microscpico de los microorganismos se realiza con microscopio ptico o microscopio electrnico En Microbiologa se han empleado varios tipos de microscopios pticos: de campo claro, de contraste de fases y de fluorescencia. El de mayor uso es el microscopio de campo claro OBJETIVOS -Conocimiento, identificacin y manejo del microscopio ptico y sus partes -Preparacin de muestras para su observacin FUNDAMENTO -Conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo ndice de refraccin que el agua, es indispensable emplear procedimientos de tincin que permita visualizar las bacterias -En esta prctica al empezar a tener contacto con las bacterias se hace necesario utilizar colorantes a fin de hacerlas ms visibles y que permita estudiar su morfologa, cuya informacin contribuye a la caracterizacin, identificacin y diagnstico de gnero bacteriano PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO

I.-PARTE MECANICA -Brazo: es de metal, en forma de C, por la parte superior, se une con el tubo ptico y por la parte inferior con el pie o base del microscopio -Cabezal: contiene los sistemas de lentes oculares, puede ser monocular o binocular. Interiormente se encuentra el tubo ptico, en cuya parte superior se encuentra el ocular y en la parte inferior el revolver, donde se encuentran los objetivos -Revolver: dispositivo giratorio, que posee dos, tres o mas roscas donde se atornillan los objetivos -Platina: plataforma de forma cuadrada y que se utiliza para colocar la preparacin a observarse -Tornillos de enfoque: el macromtrico y micromtrico, que permiten el enfoque de la muestra con el objetivo de menor aumento -Pie o base: tiene forma circular o de herradura y sirve de apoyo del microscopio

Platina y Base

Tubo y Cremallera de Enfoque

Tornillos macro micromtrico

II.-PARTE OPTICA -Oculares: cilindros cortos y huecos, que se colocan en la parte superior del tubo ptico. En la parte externa de estas lentes se indica el poder de amplificacin: 4X, 10X, 15X -Objetivos: tubos cortos atornillados al revolver. Sistema de lentes, cuyo poder de amplificacin puede ser: 4X, 10X, 20X, 40X, 100X -Condensador: se encuentra debajo de la platina y su funcin es concentrar los rayos luminosos sobre la preparacin -Diafragma: permite regular la intensidad de luz proyectada a la apertura de la platina -Luz: fuente de luz

Oculares intercambiables

Revolver

Objetivos intercambiables

Diafragmas

MANEJO DEL MICROSCOPIO

Las siguientes recomendaciones se debern tomar en cuenta para el uso correcto del microscopio 1.-Levante completamente el condensador 2.-Abra el diafragma completamente 3.-Haga girar el revolver de los objetivos y enfoque el objetivo de menor aumento 4.-Coloque la lmina portaobjetos sobre la platina y asegrela 5.-Mirando lateralmente, mueva el espejo hasta que la lmina portaobjetos sea iluminada, cierre el diafragma 6.-baje el objetivo hasta ms o menos medio centmetro de la altura de la lmina y empiece a subir lentamente hasta que focalice el frotis con el ocular 7.-Ajuste el espejo hasta que tenga usted una iluminacin extensa y uniforme. Centre la fuente luminosa 8.-Ajuste la altura del condensador para la posicin que le de la luz ms fuerte y uniforme 9.-Abriendo parcialmente el diafragma, tendr la luz adecuada para su observacin 10.-Para usar el objetivo seco de mayor aumento, haga girar el revolver despus de haber enfocado con el de pequeo aumento 11.-Para usar el objetivo de inmersin siga las instrucciones siguientes: Enfoque un campo apropiado con el objetivo de menor aumento Levante el condensador y abra el diafragma Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el frotis Cambie por el objetivo de inmersin procediendo con mucho cuidado y termine de enfocar usando el tornillo micromtrico 12.-Cuando termine de observar, limpie el lente de inmersin con papel lente, el objetivo de menor aumento deber estar en posicin cuando el microscopio se va a guardar 13.-Si el microscopio a usarse posee iluminacin directo, se obviaran los pasos 5 y 7

DETERMINACION DEL AUMENTO DE OBSERVACION Se consigue multiplicando el aumento del ocular por el aumento del lente objetivo en posicin de observacin y el producto es el aumento total Ejemplo: Ocular : 10X Objetivo: 10X Aumento: 100X

COLORACIONES MICROBIANAS La morfologa de las bacterias se puede examinar de 2 maneras: -Observando los microrganismos vivos en suspensin -Observando las clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin

OBJETIVOS -Diferenciar a los microrganismos por su capacidad tintoreal -Relacionar la diferencia en composicin de pared celular de acuerdo a la coloracin de Gram FUNDAMENTO Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes bsicos es manifiesta, si tomamos en cuenta su principal contenido de cidos nucleicos Los colorantes de mayor aplicacin son los derivados del alquitrn de hulla (anilinas): Cristal violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, safranina, azul de metileno y verde de malaquita y van a actuar mejor mediante la adicin de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmtica Para una buena tincin hay que tomar en cuenta: -La naturaleza de la bacteria -Edad del cultivo muestra y -Una buena aplicacin de la tcnica

COLORACION POR EL METODO DE GRAM Es uno de los principales mtodos de amplia utilidad para clasificar a las bacterias en 2 grandes grupos: Gram (+) y Gram (-). Las primeras toman el violeta de genciana tindose de azul violceo y las segundas pierden el violeta de genciana al ser lavadas con el diferenciador alcohol acetona; es necesario imprimirle un colorante de contraste: fucsina o safranina, para ser observadas tindose de rojo La teora aceptada, asocia la gram positividad con el complejo que se forma entre el cristal violeta y el ribonucleato de magnesio de la pared celular bacteriana en presencia del iodo, que acta como mordiente estimulando ciertas porinas de la pared de las bacterias resistiendo as la accin solvente del alcohol acetona

ETAPAS A SEGUIR 1.-EXTENSION O FROTIS La lmina debe ser transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es lquido, con el asa de siembra en aro esterilizada previamente al rojo, tomar 1 2 gotas y extender suavemente sobre el centro del portaobjetos. Si el cultivo es slido, primero colocar con el asa 1 gota de agua destilada estril sobre el portaobjetos y luego tomar el inculo, emulsionar y extender igual que en la anterior

2.-FIJACION Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado

3.-COLORACION -Cubrir la extensin fijada con la solucin colorante ensayada: cristal violeta por 60 segundos. Evitar evaporacin por el tiempo que debe actuar. Lavar con agua destilada -Agregar solucin iodada (lugol) por 60 segundos. Lavar con agua destilada

4.-DECOLORACION -Decolorar con alcohol acetona por un tiempo breve. Lavar con agua destilada

5.-COLORACION DE CONTRASTE -Colorear con solucin de safranina por 60 segundos. Lavar con agua destilada. Dejar secar al ambiente, colocando el preparado en plano inclinado para el escurrimiento y con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar el secado con el calor del mechero, evitando sobrecalentamiento.

6.-OBSERVACION Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de cedro COLORACIONES ESPECIALES OBJETIVO Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones especficas COLORACION DE ESPORAS Las especies de los gneros Bacillus y Clostridium, producen unas estructuras llamadas endosporas. La endospora es muy resistente y puede sobrevivir largos periodos de tiempo e incluso en medios desfavorables, altas temperaturas o sustancias qumicas. Cuando se colorea con Gram y colorantes simples, las esporas aparecen como huecos no teidos dentro del cuerpo bacteriano. Para ver mejor esta estructura, se usan mtodos especiales de coloracin. Ejemplo: coloracin de azul de metileno de Looflfler COLORACION DE ZIEHL NEELSEN Es llamada tambin coloracin de microrganismos cido resistentes. Es una coloracin diferencial que acta fuertemente sobre un grupo de microrganismos llamados cidoresistentes, porque toman el colorante en caliente y resisten a la decoloracin frente a alcoholes y cidos fuertes. Esta tincin se emplea para el diagnstico y estudio de Tuberculosis. Colorantes empleados: solucin de fucsina bsica fenicada al 5 % y solucin de azul de metileno COLORACION DE FLAGELOS La longitud de los flagelos bacterianos se encuentra por debajo de los lmites de resolucin de microscopios de luz, es necesario entonces hacerlos crecer para poder ser observados. En general las bacterias no mviles no poseen flagelos. Ejemplo; coloracin de Leifson, que utiliza: acido tnico, NaCl y fucsina bsica

COLORACION DE CAPSULAS Muchas bacterias estn rodeadas por una capa gomosa del grosor variable llamada cpsula, la cual se tie menos intensamente que la clula, la cpsula aparece a menudo como un rea sin teir. Ejemplo: coloracin de Hiss, que utiliza: fucsina bsica o cristal violeta y sulfato de cobre CUESTIONARIO N3 1.-Cronologa de la historia del Microscopio

1590: Compuesto realizado por Juan y Zacharias Janssen en Midelburg, Holanda.

1610: Se registra por primera vez su uso por parte de Galileo.

1665: Robert Hooke hace una observacin al microscopio, la cul era la observacin de clulas muertas.

1675: Antony Van Leeuwenhoek detect miles de diminutos seres vivos agitando el microscopio.

1827: El botnico ingls Brown observ el movimiento al azar de las partculas coloidales utilizando un microscopio para observar una suspensin acuosa de polen.

1931: Maz Knoll y Ernst Ruska inventaron el microscopio electrnico en Alemania.

1981: Se crea el microscopio de transmisin que est basado en la fsica cuntica u es capaz de revelar la estructura atmica.

1986: IMC da un buen ejemplo de negocio, el cual une exitosamente la poltica y el negocio. 2009: Antony Van Leeuwenhoek gracias al uso del microscopio da aportes a la medicina actual.

2.-Esquema del Microscopio y sus partes.

3.- Qu es un colorante y cules son sus propiedades? Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y animales. Los colorantes se han usado desde los tiempos ms remotos, emplendose para ello diversas materias procedentes de vegetales (crcuma, ndigo natural, etc.) y de animales (cochinilla, moluscos, etc.) as como distintos minerales. En qumica, se llama colorante a la sustancia colorida usada en tinciones para resaltar diferentes microorganismos. CLASIFICACION DE LOS COLORANTES: SEGN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmn y la orcena. SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G, etc.

SEGUN SUS PROPIEDADES QUMICAS: La mayora de los colorantes empleados en histologa actan como cidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos. Colorantes cidos: Como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acid filos, porque tienen afinidad por los colorantes cidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las protenas. Estas protenas pueden pertenecer al cito esqueleto de la clula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado

contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmtico. La eosina se une tambin a las membranas plasmticas, sin embargo, se desconoce la naturaleza qumica de esta unin. Las clulas que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retculo endoplasmtico liso, etc.) son sumamente acid filas, o sea, se tien intensamente con la eosina. Colorantes Bsicos: Como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque tienen afinidad por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al ncleo y ciertas regiones del citoplasma. Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teir un tejido se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es bsica y por lo tanto se une a cargas negativas de la clula o matriz extracelular. Colorantes Neutros: Son colorantes en los que la porcin cida y la bsica colorean. Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas de otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. el eosinato de azul de metileno. Colorantes Indiferentes: Tien aquellas estructuras o sustancias que los disuelven ms fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lpidos.

4.- Por qu se le llama a un colorante bsico o cido? Los colorantes bsicos son sales amnicas o complejos formados por cloruro de cinc o aminas. Algunos colorantes bsicos, de elevado peso molecular, son absorbidos por el algodn y el rayn. Los colorantes cidos son sales de los cidos sulfricos o carboxlicos que se precipitan sobra la fibra. La familia de los colorantes cidos se llama as, porque en la constitucin qumica del colorante se encuentran molculas de grupos cidos. Son colorantes solubles en agua y se aplican generalmente en fibras de lana, nylon y fibras acrlicas. Otros usos importantes son el teido de la piel y papel.

5.- A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria? La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.

6.-De que manera influye el pH en la coloracin

7.- Por qu es necesario utilizar mtodos de tincin para visualizar a las bacterias? El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

8.- Para qu se usa una solucin mordiente? Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.

9.- Por qu las bacterias Gram positivas se tien de azul y las Gram negativas de rojo?

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

10.- Si se lleva a cabo el examen microscpico de una preparacin de Estafilococo, convenientemente teida, es de esperar que todas las clulas estn agrupadas en racimos. Explique Los estafilococos son cocos GRAM positivos que se encuentran aislados, en parejas, en cadenas cortas, pero sobretodo en racimos de uvas. Son inmviles, no esporulados y pueden tener o no cpsula. La mayora son anaerobios facultativos, son bastante resistentes al calor, a la accin de las sales biliares, a la desecacin y al cloruro sdico al 9% y tambin a laoptoquina (Antibitico). Son catalasa positiva. Los inhibe el hexaclorofeno y es comn la produccin de b-lacta masa (enzima que acta sobre la penicilina rompiendo un anillo) pero son sensibles a la vancomicina (antibitico). Los estafilococos se engloban junto con otros gneros no patgenos como es e micrococo dentro de la familia micrococaceae. El gnero estafilococo se compone de muchas (27) especies, la mayor parte de las cuales son flora habitual del hombre. El hbitat normal de las mismas (flora normal) suelen ser la piel y las mucosas, tracto respiratorio, tracto intestinal que dependiendo de las especie se localizarn preferentemente en ciertas reas. Las especies de inters clnico son: Estafilococo aureus Estafilococo epidermidis Estafilococo saprophiticus (saproftico) Estafilococo haemolyticus (hemoltico) 11.- Qu caractersticas presenta la cpsula en las bacterias y quienes la presentan?
Son microorganismos unicelulares, de forma diferente y hbitat variable. Algunas son capaces de formarse una envoltura o cpsula. Todas se multiplican por divisin. Algunas bacterias son capaces de formar endosporas ms resistentes a las formas adversas de vida. El oxgeno es indispensable para las bacterias aerbicas y resulta nocivo para las anaerbicas que lo toman de compuestos oxigenados. Las bacterias son capaces de generar mutantes. Las bacterias dan origen a la enfermedad llamadas esquitomiasis, se caracteriza por abscesos y hemorragias

Vaina o cpsula bacteriana

Este componente no aparece en todas las bacterias. Est formada por polmeros glucdicos que no llegan a formar una estructura definida. Esta cpsula es capaz de retener agua, con lo que acta como reservorio de agua. Tambin sirve de sustrato para los desplazamientos de las clulas que la poseen, pues stas no disponen de flagelos. Sirve adems como matriz adherente entre las bacterias, sin llegar a formar una autntica colonia. Impide la accin fagoctica de otras clulas dificultando el reconocimiento de la bacteria, por lo que tambin cumple una funcin defensiva.

Bacilo

Vibrin

Espirilo

Coco

12.-Segn su disposicin en las bacterias. Cules son los tipos de flagelo? De ejemplos FLAGELO BACTERIANO El flagelo bacteriano es una estructura filamentosa que sirve para impulsar la clula bacteriana. Tiene una estructura nica, completamente diferente de los dems sistemas presentes en otros organismos, como los cilios y flagelos eucariotas, y los flagelos de las arqueas. Presenta una similitud notable con los sistemas mecnicos artificiales, pues es una compleja estructura compuesta de varios elementos (piezas) y que rota como una hlice. El flagelo bacteriano es un apndice movido por un motor rotatorio. El rotor puede girar a 6.000-17.000 rpm, pero el apndice usualmente slo alcanza 200-1000 rpm. 1-filamento, 2-espacio periplsmico, 3-codo, 4-juntura, 5-anillo L, 6-eje, 7-anillo P, 8-pared celular, 9-esttor, 10-anillo MS, 11-anillo C, 12-sistema de secrecin de tipo III, 13-membrana externa, 14-membrana citoplasmtica, 15-punta.

Tipos de bacterias, segn los flagelos Monotricas: bacterias que poseen un solo flagelo.

Bacteria de genero Vibrio- es Monotricas Anfitricas: bacterias que poseen dos flagelos, en posicin opuesta en la bacteria.

Flagelos en ambos lados de la bacteria

Peritricas: bacterias que poseen muchos flagelos rodeando su contorno.

Escherichia coli, una bacteria peritrica.

Lofotricas: bacterias que poseen varios flagelos que surgen de una misma zona de la pared celular, formando un penacho.

Bacilo E. Coli procarionte