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- Peptidasas Vegetales
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2. PEPTIDASAS VEGETALES
2.1. ESTRATEGIAS PARA EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE PROTENAS VEGETALES 2.1.1. Aislamiento de protenas
La metodologa empleada en la extraccin de protenas determina su naturaleza y estabilidad, permitiendo validar los resultados obtenidos en procedimientos posteriores. En particular, la extraccin de protenas vegetales presenta problemas inherentes a la estructura de la clula vegetal, pues comparada con los tejidos animales y las clulas bacterianas, tiene menor contenido de protenas y contienen en sus vacuolas peptidasas, alcaloides y compuestos polienlicos (flavonoides, taninos) que pueden interferir en la actividad proteica. En consecuencia, la estrategia de extraccin depende de las caractersticas especficas de la protena en estudio y de su localizacin (Michaud & Asselin, 1995). La primera etapa en el aislamiento de una protena es su liberacin de las clulas que la contienen. El mtodo elegido depende de las caractersticas mecnicas del tejido de procedencia, as como de la localizacin celular de la protena de inters. Como mtodos de ruptura mecnica de las clulas vegetales para liberar sus protenas se pueden mencionar: 1) trituracin con arena o almina, 2) trituracin en mezclador de alta velocidad, 3) homogeneizador a pistn, 4) prensa francesa, 5) sonicacin y 6) congelacin con nitrgeno lquido y macerado (Voet & Voet, 1992). La diversidad de protenas involucradas en procesos de crecimiento, desarrollo y defensa impide la formulacin de un procedimiento de extraccin universal que permita recuperar todas las protenas de un tejido vegetal. Sin embargo, la solubilidad de las protenas de plantas, que est relacionada con la localizacin intracelular, permite formular diferentes mtodos de extraccin. Ellos incluyen: 1) extraccin con buffer acuoso, 2) extraccin con detergentes, 3) precipitacin directa con TCA, 4) precipitacin con acetona y 5) precipitacin con TCA-acetona (Michaud & Asselin, 1995). Para prevenir la protelisis durante la extraccin se debe utilizar alguno/s de los procedimientos siguientes: 1) extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), 2) extraer con TCA fro al 10 % (p/v), 3) adicionar un cctel de inhibidores de peptidasas al buffer de extraccin, 4) trabajar a baja temperatura durante perodos cortos de tiempo, 5) usar buffers de pH por encima o por debajo del ptimo, 6) adicionar agentes protectores como dimetil sulfxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores
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como ditiotreitol (1mM), L-cistena (5 mM) o -mercaptoetanol (1mM)) o 7) adicionar agentes quelantes como EDTA (2 mM) o EGTA (2mM) para remover cationes bivalentes que son cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas sernicas (Michaud & Asselin, 1995). Los compuestos fenlicos pueden inactivar las protenas al formar puentes de hidrgeno con los tomos de oxgeno de los enlaces peptdicos y tambin cuando los fenoles son oxidados a quinonas pueden condensarse con los grupos -SH y -NH2 de las protenas. Estas interacciones qumicas determinan la formacin de dmeros y polmeros de protena entrecruzadas por polifenoles, afectando la calidad del patrn proteico observado en los geles. Para evitar la accin de los compuestos fenlicos se pueden usar varias estrategias: 1) precipitar todas las protenas triturando los tejidos en TCA fro (no permite medir actividad biolgica), 2) adicionar polivinilpirrolidona (PVP) que compleja los fenoles y alcaloides, 3) en combinacin con PVP, inactivar la fenoloxidasa con agentes reductores como ascorbato, -mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), dietilditiocarbamato de sodio, metabisulfito de sodio o tiourea, 4) agregar EDTA que secuestra el cobre que es un cofactor necesario para la expresin de la polifenoloxidasa, 5) usar un buffer de extraccin de bajo pH que ayuda a prevenir la formacin de quinonas y favorece la unin de PVP a fenoles y 6) remover fenoles y alcaloides por gel filtracin (Michaud & Asselin, 1995).
2.1.2.1. Solubilidad
Los mltiples grupos cido-base de una protena determinan que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentracin de las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura (Voet & Voet, 1992).
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Las ventajas de estos mtodos son las siguientes: a) no se necesitan reactivos radiactivos, b) no se requieren precauciones especiales para mantener la conformacin nativa de la protena y c) regiones de la protena que estn ocultas en la conformacin nativa pueden exponerse durante la electroforesis desnaturalizante, lo que permite usar anticuerpos antipeptdicos (Scheidtmann et al., 1997).
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a ese pH estn prcticamente inactivas; frente a la captura de la presa, se secretan protones y se inicia la actividad digestiva. En Pinguicula las peptidasas se acumulan en las clulas glandulares superiores, mientras que el HCl lo hace en las clulas basales y se libera despus de la estimulacin (Boller, 1986). Plantas parsitas Las plantas parsitas presentan rganos diferenciados, los haustorios, que penetran en el husped estableciendo un contacto directo con las clulas del xilema y/o del floema y toman sus nutrientes. La penetracin y el desarrollo de los haustorios parece requerir de la accin de peptidasas (Boller, 1986).
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al., 1980), trigo (Belozerski et al., 1989), cebada (Kervinen et al., 1993; Sarkkinen et al., 1992), cacao (Biehl et al., 1993) y colza (D'Hondt et al., 1993). Tambin Voigt et al. (1997) asocia las altas actividades de peptidasas asprticas encontradas en semillas no germinadas de varias angiospermas a funciones biolgicas durante la maduracin. La movilizacin de reservas de la aleurona de cebada se encuentra bajo control hormonal. El cido giberlico (GA3) derivado del embrin estimula la secrecin de enzimas proteolticas y su accin es antagonizada por el cido abscsico (ABA). Esto se debera a que el GA3 incrementara la sntesis y transporte de peptidasas (cistenicas y asprticas) hacia las vacuolas que almacenan protenas y/o a la disminucin del pH del lumen de esta organela, lo que activara dichas enzimas. Se comprob que el tratamiento con GA3 incrementa la actividad de tres peptidasas cistenicas, mientras que no estimula significativamente a las APs (Bethke et al., 1996; Swanson & Jones, 1996; Swanson et al., 1998).
2.2.4. Senescencia
Es conocida la participacin de peptidasas en los procesos de muerte celular de animales y plantas. La senescencia es un proceso programado dentro del desarrollo de la planta que involucra una serie de cambios enzimticos y metablicos que tienen lugar de forma simultnea o secuencial en los diferentes tejidos que envejecen. Se produce una movilizacin y exportacin masiva de carbono, nitrgeno y minerales con un eficiente reciclaje de los nutrientes (Kaur-Sawhney & Galston, 1986). En general, los estudios sobre la enzimologa de los procesos degradativos en plantas adolecen de rigor tcnico y han sido realizados en circunstancias experimentales muy diferentes que han llevado a resultados conflictivos. Un elemento de confusin adicional es que si bien el 95 % de las pptido-hidrolasas se encuentran en las vacuolas de las clulas del mesfilo, la mayor degradacin de protenas en la senescencia ocurre en el interior del cloroplasto. Actualmente, parece claro que el cloroplasto tiene sus propias peptidasas que seran codificadas en el ncleo, pues no se ha identificado en el ADN cloroplstico ninguna secuencia homloga a las peptidasas conocidas. El control de la actividad de estas peptidasas durante la senescencia podra ocurrir bien por sntesis de novo de la protena, por activacin de enzimas preexistentes en forma de proenzimas o por compartimentalizacin, es decir co-localizando enzima y sustrato (Valpuesta et al., 1993). Ejemplos de un posible rol en la senescencia lo constituyen las APs encontradas en hojas de naranjo (Garca-Martnez & Moreno, 1986), de cebada (Kervinen et al., 1995) y de flores de cardo (Heimgartner et al., 1990, Cordeiro et al., 1994a).
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