Sunteți pe pagina 1din 17

LP IMUNOLOGIE INTRODUCERE REACTII AG-AC IMUNOSEROLOGIE REACTIE AG-AC = asociere intre cele 2 molecule prin legaturi necovalente; aceasta

reactie nu determina modificari chimice ireversibile in nici una dintre cele 2 molecule. Ac = receptor specific, solubil pentru un anume Ag. Legaturile necovalente (legaturi de hidrogen, legaturi ionice, legaturi hidrofobe, reactii van der Waals ) intre cele Ag si Ac se realizeaza intre epitopul antigenului ( determinantul antigenic ) si CDR ale regiunilor variabile ale lanturilor H si L ale Ig (VH si VL ) ( CDR = complementarity-determining regions, regiuni de determinare ale complemetaritatii ). Aceste legaturi necovalente sunt relative slabe (comparativ cu cele covalente) si se realizeaza daca moleculele se afla la distante mici una fata de cealalta; astfel ca o legatura puternica intre Ag si Ac depinde de o potrivire intre domeniile Ac si Ag = o complemetaritate care sa asigure aceasta distanta mica si care sa asigure realizarea unui numar mare de asfel de legaturi. Aceasta complemetaritate intre Ac si Ag determina specificitatea legaturii. Legaturile intre Ag si Ac nu sunt ireversibile. Reactia Ag-Ac poate fi influentata de mai multi factori: Afinitatea, aviditatea Ac fata de Ag Titrul Ac Concentratia Ag; starea Ag: Ag solubile/corpusculate Conditii de mediu: pH, temperatura AFINITATEA = puterea combinata a legaturilor necovalente intre un singur Fab al Ac si un singur determinant antigenic/epitop al Ag. Reactia dintre Ac si Ag este cu dublu sens, asociere si disociere: Asocierea intre Ac si Ag poate fi descrisa de : Unde este constanta ratei de asociere; unitatea de masura a Iar disocierea legaturilor intre Ac si Ag: este l/mol/s

Unde este constanta ratei de disociere, unitate de masura 1/s Constanta de asociere se noteaza cu Ka care este k/k; Ka poate fi calculate si din ecuatia:

Ka este o masura a afinitatii; cu unitatea de masura l/mol (M); poate fi masurata prin dializa de echilibru:
Se foloseste o camera de dializa - un vas separat egal in 2 compartimente printr-o membrana semipermeabila. Proba de control: intr-un compartiment se pune Ag (haptena) marcata radioactiv, care poate trece liber prin membrana; astfel concentratia Ag si respectiv radioactivitatea se echilibraza intre cele 2 compartimente. Proba in care se evalueaza afinitatea unui Ac: intr-un compartiment se pune Ac, in celalalt Ag marcat; Ag va trece liber in celalalt compartiment si o parte se va lega de Ac; Ag ramas liber se va echilibra de o parte si alta a membranei; diferenta de radioactivitate(= de concentratie a Ag) intre cele 2 compartimente e data de Ag legat de Ac. Cu cat afinitatea Ac e mai mare, cu atat cantitatea de haptena marcata legata va fi mai mare. K poate fi dedusa aici din ecuatia:

Unde r = ratia de haptena legata de Ac/concentratia totala de Ac, c = concentratia de haptena libera, iar n = nr. de situsuri de legare/molecula de Ac; se folosesc cantitati variabile de haptena la concentratii costante de Ac pentru calcul.

Reactia de disociere: Constanta de disociere: ; cu unitatea de masura a Kd de mol/l (M)

AVIDITATEA = suma afinitatilor intre situsurile de legare ale Ac si toti determinantii Ag pe care ii leaga. Este o masura mai buna de evaluare a capacitatii de legare a Ac in vivo. Aviditatea crescuta poate compensa pentru o afinitate scazuta: ex. IgM au afinitate mai scazuta de cat IgG dar avand mai multe situsuri de legare ( in forma lor pentamerica ) pot lega eficient Ag. SPECIFICITATE = Ac recunoaste in mod ideal un singur tip de antigen fata de care are complementaritate. CROSS-REACTIVITATE = in practica, uneori, un Ac[1] poate recunoaste un alt Ag[2] decat cel specific(Ag[1]), daca acest Ag[2] are un epitop identic sau asemanator cu Ag[1]. *De obicei aviditatea Ac[1] pentru Ag[2] este mai mica decat pentru Ag[1]. Evidentierea reactiei Ag-Ac: Reactii de precipitare Reactii de aglutinare Reactii de fixare a complemetului Reactii de neutralizare Reactii cu liganzi marcati IMUNOSEROLOGIA =domeniul imunologiei care studiaza reactiile Ag-Ac in vitro Aplicatii diagnostice: serotipie; dg imunologic. Componente esentiale ale reactiilor serologice Ag, Ac Ag Se utilizeaza pentru: - imunizarea animalelor de laborator in scopul obtinerii serurilor imune - reactii imune de serodiagnostic. Metode de preparare a Ag: Purificarea Ag prin electroforeza - SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) cu transfer ulterior pe nitroceluloza; dificil de extras proteinele de pe nitroceluloza; necesita reactivi de disociatie puternici si care pot contamina Ag; daca acest Ag este ulterior utilizat pentru imunizarea animalului de experienta pot apare reactii adverse importante la acesta din cauza reactivilor de disociere.

Purificarea Ag prin affinity chromatography: principiul metodei: Ac specific antigenului este fixat pe particule sintetic(e de Sepharose); aceste particule de sefaroza cu Ac specifici-Ag fixati se amesteca cu solutia in care se gaseste si Ag de extras; Ag se va fixa pe Ac, respectiv pe particulele de sefaroza; restul solutiei se va spala; ulterior legaturile Ag-Ac se rup prin modificarea pH-ului mediului. Producere de epitopi (peptide)/?Ag prin ADN recombinat in culturi de celule. Serurile imune Se pot obtine: - de la pacienti (bolnavi/convalescenti) - prin imunizarea animalelor (animale mari pentru utilizare pe scara larga, comercializare; de la animale mici pentru cercetare) Se folosesc pentru teste diagnostice, cercetare, terapie. Se pot obtine seruri policlonale/monoclonale: Ac/seruri POLICLONALI/e = prin imunizarea (unui animal de experienta) cu un Ag se obtine de obicei un ser policlonal = care contine mai multe tipuri de Ac, fiecare din ei specific pentru unul din mai multi determinanti antigenici al Ag respectiv. Serurile policlonale pot fi monospecifice = mai multi Ac impotriva a diversi epitopi ai aceluiasi Ag/polispecifice =pentru mai multe Ag Ac/seruri MONOCLONALI/e = Ac impotriva unui singur tip de epitop, secretat de o singura clona de LB; se folosesc pentru: - teste diagnostice - tehnici de cercetare - terapia unor afectiuni cum ar fi poliartrita reumatoida, diverse tipuri de tumori. Tehnica de obtinere a acestora in laborator: celule numite hybridomas = rezultate din fuziunea unei celule normale secretante de Ig (prelevate de la un animal imunizat in prealabil cu Ag specific) si celule tumorale de mielom multiplu; acesti hibrizi, spre deosebire de plasmocitele normale cresc si se inmultesc pe medii de cultura si pot avea o viata lunga; prin procese de selectie se obtine o clona care produce 1 singur tip de Ac. Avantaje/dezavantaje seruri poli/monoclonale: Daca epitopul specific unui Ac monoclonal a fost denaturat in cursul procesului de purificare, el nu va mai fi recunoscut de serul monoclonal. Folosirea unui ser policlonal, cu Ac care recunosc mai multi epitopi ai aceluiasi Ag e mai putin probabil sa fie afectata de aceasta conditie. Pentru a fi eficient un ser policlonal trebuie sa fie cat mai putin contaminat de Ac nenecesari si de o specificitate inalta. Un ser monoclonal obtinut dintr-un anume hybridom are proprietati standard in ceea ce priveste structura, specificitatea, afinitatea. Serurile policlonale variaza intre ele in ceea ce priveste specificitatea, afinitatea, aviditatea.

LP IMUNOLOGIE REACTII DE AGLUTINARE IMUNA


= reactii Ag-Ac vizualizate prin formarea de aglutinari ale Ag particulate de catre Ig; aglutinarea rezulta din cross-linkarea particulelor Ag de catre Ac. Avantaje: sunt relativ usor de realizat din punct de vedere tehnic, unele foarte rapide, sunt relativ sensibile si specifice.

Se folosesc: Ac = Aglutinina = Ac care produce aglutinarea Ag Ag: I) Ag corpusculate/particulate natural: celule = aglutinarea directa Ag corpusculat poate fi o hematie, o bacterie s.a. II) Poate fi utilizata si pentru Ag solubile care sunt adsorbite pe suprafata unei hematii sau pe particule de latex = aglutinare pasiva Cand Ag corpusculat este hematia/ cand epitopul este situat pe hematie se foloseste termenul de hemaglutinare. Se pot utiliza pentru detectia unui Ag necunoscut intr-un lichid biologic (ser, LCR, etc.) folosindu-se seruri diagnostice cu Ac cunoscut; sau se pot utiliza pentru evidentierea unui Ac intr-un lichid biologic folosindu-se un Ag particulat cunoscut. Pot fi calitative sau semicantitative (titrul Ac serici). Se pot efectua in tuburi/ pe lame/ pe microplaci iar reactia Ag-Ac este vizualizata prin formarea de mici agregate (vizualizate macroscopic sau microscopic, in functie de tehnica). Factori care influenteaza reactia de aglutinare: a) Tipul de Ig folosite: IgM sunt aglutinine mult mai eficiente prin forma lor pentamerica b) Excesul de Ac in reactie poate inhiba aglutinarea = efect prozone = la concentratii mari de Ac, situsurile de legare ale acestora depasesc numeric epitopii care pot fi legati astfel incat probabilitatea ca un Ac sa se lege doar la un situs de legare este foarte mare; daca Ac se leaga doar printr-un situs de legare el nu poate produce aglutinare; acest lucru se probeaza prin cresterea dilutiei solutiei in care se gasesc Ac: la concentratii mai mici de Ac se va produce aglutinarea. c) In serurile policlonale care contin mai multi IgG decat IgM aglutinarea poate fi scazuta/absenta din cauza legarii a unei mai mari cantitati de Ag de catre IgG care este mai slab aglutinant decat IgM (leaga mai greu 2 epitopi de pe particule diferite, mai ales vorba de eritrocite sau alte celule care se resping fiind incarcate electric la suprafata; insa daca se realizeaza conditii specifice, ex. modificarea concentratiei de ioni din solutie a.i. sa scada fortele de respigere dintre hematii si aceste Ig pot deveni aglutinanti). d) O limitare a reactiei de aglutinare apare in cazul unor epitopi ascunsi in buzunare membranare ale Ag corpusculat (bacterie de ex.). e) Temperatura la care se realizeaza reactia f) Miscarea tubului/ centrifugarea g) pH-ul mediului HEMAGLUTINAREA IMUNA A) Hemaglutinare directa = se folosesc hematiile cu epitopii proprii de suprafata; aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii hematiei. B) Hemaglutinare pasiva = Ag solubile (care nu apartin hematiei prorpiu-zise) sunt adsorbite pe hematii C) Hemaglutinare indirecta = aglutinarea nu e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii de pe hematie, ci de Ac secundari, care recunosc si leaga Ac primari. A) HEMAGLUTINAREA DIRECTA Se foloseste pentru determinarea grupelor de sange. Sistemul antigenic eritrocitar ABO (ABH)

Ag H gena pe cr. 19 Gena A, B,O pe cr. 9 alela A si alela B codifica pentru diverse glicozil-transferaze care transfera variate tipuri de molecule de monozaharide pe o substanta precursoare = Glu-Gal-NAGA-Gal. Alela O este este o alela silentioasa care lasa Ag H nemodificat. Aceste polizaharide care se formeaza sunt intens imunogene. Ag H = glicoproteina/glicolipid membranar-Glu-Gal-NAGA-Gal-Fuc Ag A = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - NAGA Ag B = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc -Gal Glu= glucoza Gal= galactoza NAGA= N-acetil-glucozamina Fuc = fucoza Transmiterea genelor ABO se face mendelian. Grup de sange O = ambele alele de tip O Grup de sange A = alele AA sau AO 2 subtipuri: A1 (~80% din toote persoanele de grup A) reactioneaza cu un Ac-anti A1; si A2 nu reactioneaza cu Ac anti-A1; atat A1 cat si A2 reactioneaza cu Ac anti-A Grup de sange B = alele BB sau B Grup de sange AB = alele AB Grup hh (Bombay) = lipsa homozigota de alela H normala; pacientii nu au Ag H; chiar daca au alele functionale A sau B , celulele lor nu expima nici Ag H deci nici Ag A sau Ag B. Exista si alte celule care exprima Ag din grupul ABO pe suprafata lor (in special celule epiteliale si endoteliale). Exista posibilitatea sa se excrete in unele secretii (saliva) aceste Ag la indivizii secretori. Ac anti-A si/sau anti-B apar ca urmare a cross-imunizarii cu Ag bacteriene ( enterobacteriaceae ) care poseda in membrana externa oligozaharide similare cu antigenele A si B. Se vor dezvolta Ac (in general de tip IgM; persoanele de grup O pot dezvolta si IgG) impotriva Ag care lipsesc de pe membrana hematiei gazdei ( clonele care produc Ac anti-Ag gazdei sunt deletate in cursul procesului de toleranta ). Grup Ag Ac-antiA O H + A A B B + AB A+B *** pacientii cu grup hh dezvolta Ac anti-A, anti-B si chiar anti-H. Ac anti-B + + -

Pentru aflarea grupei ABO a pacientului se pun in contact hematiile pacientului cu ser anti-A, anti-B, respectiv anti-A+B (test Beth-Vincent): Grupul pacientului O A B + ser anti-A (-) hemaglutinare (+) (-) + ser anti-B (-) hemaglutinare (-) (+) + ser antiA+B (-) hemaglutinare (+) (+)

AB (+) ***pacientii cu grup hh se comporta ca cei de grup O.

(+)

(+)

Test Simonin: serul pacientului se pune in contact cu hematii care contin antigene: H, A, B,A+B: Grupul de sange al pacientului O Ac prezenti in serul pacientului In contact cu hematii care au Ag de suprafata O(H) (-)hemaglutinare In contact cu hematii care au Ag de suprafata A (+)hemaglutinare In contact cu hematii care au Ag de suprafata B (+)hemaglutinare (+) (-) (-)

anti-A anti-B A anti-B (-) (-) B anti-A (-) (+) AB (-) (-) ***pacientii cu grup hh prezinta aglutinare cu toate tipurile de hematii folosite in test

Pentru transfuzii, grupele pot primi sange izogrup; toate grupele pot primi grup O; grupul AB poate primi sange de la toate grupele: transfuzie de la grup donor Grup primitor Grup O Grup A Grup B Grup O DA NU NU Grup A DA DA NU Grup B DA NU DA Grup AB DA DA DA *** pacientii cu grup hh nu pot primi sange decat de la alte persoane de grup hh.

Grup AB NU NU NU DA

Transfuzie de sange incompatibil grup ABO: Ex transfuzie de sange grup B la un pacient grup A: IgM anti-A prezenti in sangele pacientului vor recunoaste Ag B de pe suprafata hematiilor donorului si vor declansa liza hematiilor intravascular prin activarea cascadei complemetului cu formare de MAC. Manifestari clinice si paraclinice(se dezvolta rapid de la momentul transfuziei): stare de rau, febra, frisoane, dureri lombare, hemoglobinemie, hiperbilinemie neconjugata, hemoglobinurie, necroza tubulara renala ( prin precipitarea unei cantitati mari de Hb care ajunge la nivelul tubilor contorti; +/insuficienta renala), soc. Grup Rh Sistemul antigenic Rh = proteine transmembranare, exprimate strict pe membrana eritrocitelor; codificate de 2 gene: RhD si RhCE ( situate pe cr. 1 ). Gena RhD, alela D codifica pentru proteina D. (alela d = lipsa codificarii Ag D) Gena RhCE codifica proteinnele C/c si E/e. Exista variate subtipuri de proteine si combinatii. Lipsa expresiei pe hematii a Ag D = Rh (-) Daca Ag D este exprimat = Rh (+). Lipsa (codificata genetic) a unei proteine (ex. D) apartinand acestui grup face ca, in urma expunerii persoanei respective la eritrocite care au exprimata pe suprafata lor Ag D, in sangele primitorului sa apara Ac antiD. Acesti Ac sunt din clasa IgG.

Expunerea la hematii Rh(+) a unei persoane Rh(-) se poate face in urma transfuziilor, sau in urma sarcinii: femei Rh(-) cu fat Rh (+). Transfuzii cu sange Rh(+) la persoane cu Rh (-) Se dezvolta Ac anti-D. La transfuzii repetate cu Ac anti-D vor reactiona cu Ag D de pe hematiile Rh(+) ale donorului si vor opsoniza aceste hematii, care vor fi recunoscute de Mf splenice si indepartate din circulatie. Semnele apar de obicei la cateva zile dupa transfuzie: febra si anemie hemolitica ( extravasculara). Mame Rh(-) cu fat Rh(+) Daca mama nu a fost anterior imunizata prin transfuzii de sange Rh(+), ea va dezvolta Ac anti-D in cursul primei sarcini, cand va fi expusa la eritrocitele fatului ( mai ales in timpul nasterii, cand se separa placenta de peretele uterin, o cantitate din sangele fetal ajunge in circulatia materna). Se formeaza initial IgM care reactioneaza cu eritrocitele fetale ajunse in circulatia materna; apoi IgG (LB cu memorie). La urmatoarea sarcina IgG anti-D din sangele matern pot traversa placenta si ajung in sangele fatului si afecteaza eritrocitele fatului care dezvolta anemie forme variate, de la usoara la severa cand riscul de moarte intrauterina a fatului e crescut. Post-partum in cazurile de hemoliza severa la fat apare exces de bilirubina indirecta, lipofila, care se poate depune la nivelul structurilor cerebrale, cu afectarea acestora. Preventia aparitiei Ac anti-D la femeia insarcinata se realizeaza prin administrarea cu ~ 48 ore inaintea nasterii /avortului/amniocentezei unei doze de Ig anti-D care vor reactiona cu eritrocitele fetale si impiedica reactia materna la acestea. B) HEMAGLUTINAREA PASIVA Hematiile sunt tratate cu acid tanic sau clorura de crom ( care promoveaza adsorbtia Ag pe membrana hematiei), dupa care se amesteca cu o solutie ce contine un Ag solubil, Ag care va fi ulterior adsorbit pe suprafata hematiei. Serul pacientului care contine sau nu Ac specific pentru Ag adsorbit se pune in contact cu hematiile asfel tratate. Daca serul pacientului contine Ac se observa aglutinarea. C) HEMAGLUTINAREA INDIRECTA TESTUL COOMBS = testul antiglobulinei TESTUL COOMBS DIRECT = detecteaza prezenta pe hematiile pacientului a Ac anti-hematie si sau/a complementului. Se folosesc hematiile pacientului si un ser anti-Ig umana/ ser anti complement uman Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor Ac anti-hematie si sunt puse in contact cu ser anti-Ig umana atunci Ac anti-hematie sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea. Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor depuse componente ale complementului si sunt puse in contact cu ser anti-complement uman, atunci complemetul depus va fi recunoscut de Ac anti-complement uman si se produce aglutinarea hematiilor. TESTUL COOMBS INDIRECT = detecteaza prezenta in serul pacientului a Ac anti-hematie liberi Se folosesc hematii normale (din alta sursa); serul pacientului; ser anti-Ig umana Se incubeaza initial hematiile cu serul pacientului; daca serul pacientului contine Ac anti-hematie, acestia se vor depune pe suprafata hematiilor; ulterior se incubeaza hematiile cu serul anti-Ig umana; daca exista depusi Ac pe suprafata hematiilor, acestia sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umnaa si se produce aglutinarea. Test Coombs (in)direct pozitiv = se produce aglutinarea. Se foloseste pentru diagnosticul AHAI; dar si pentru tipizarea grupelor de sange (testul Coombs indirect se pot evidentia prezenta Ac anti-A, anti-B, anti-D etc. mai important de evaluat in plasma primitorului); pentru

evaluarea fetilor Rh(+) din mame Rh(-) ( se pot pune in evidenta IgG anti-D materni pe suprafata hematiilor fetale ). AGLUTINAREA BACTERIANA Met. tip Widal = detectarea Ac (in serul pacientului) Un pacient infectat cu o bacterie produce Ac specifici pentru determinanti Ag ai bacteriei respective. Din serul recoltat de la pacientul banuit infectat cu o anume bacterie se efectuaza dilutii seriate care se pun in contact cu bacteria respectiva. Daca pacientul prezinta infectia si Ac respectivi va apare aglutinarea bacteriana. In functie de cea mai mare dilutie la care apare aglutinarea se calculeaza titrul Ac aglutinanti ai pacientului; titrul se exprima ca inversul dilutiei respective; ex. daca aglutinarea apare la dilutie 1/320 si nu mai apare la dilutie 1/640 atunci titrul Ac aglutinanti este de 320; daca apare la dilutie 1/1280 si nu mai apare la dilutie 1/2560 atunci titrul este de 1280; etc. Se poate folosi pentru dg. febrei tifoide/paratifoide - Salmonella (para)typhi cu o modificare: serul pacientului se pune in contact cu antigene bacteriene separate: O, H, Vi obtinute prin prelucrare in laborator a unor culturi de germeni. Titrul semnificativ pentru diagnostic pentru adulti: >500 pentru aglutininele anti-O si > 1000 pentru aglutininele anti-H reprezinta Ac protectori care asigura imunitatea durabila dupa boala. Ac. anti-Vi apar tarziu in convalescenta si numai la cei care raman purtatori dupa boala ( rezervor) titru semnificativ > 40. Reactia Weil-Felix (1915) pentru diagnosticul unor Rickettsii; serul pacientului infectat aglutineaza cu unele Ag ale unor tipuri de Proteus: pentru Rickettsile care dau tifosul exantematic se foloseste Proteus vulgaris tulpina OX.19 (cross-reactivitate). Reactia poate fi adaptata cu alte tulpini de Proteus pentru alte tipuri de Rickettsii. Nu toate Rickettsiile pot fi diagnosticate astfel. Reactii fals (+) in infectiile cu Proteus!!! Met. Gruber = detectarea Ag: Se recolteaza de la pacient probe biologice din care se realizeaza culturi bacteriene; aceste culturi sunt ulterior ?transferate intr-un mediu lichid? si incubate cu Ac specifici pentru specie/tip de bacterie. Prezenta aglutinarii poate pune diagnosticul de specie, tip, etc. in functie de Ac folositi.

AGLUTINAREA PE PARTICULE DE LATEX (a) Particule de latex pe care sunt adsorbiti Ac cunoscut = reactie de aglutinare pasiva In acest caz se evalueaza prezenta unui Ac pe care vrem sa il evaluam calitativ/semicantitativ ( se folosesc dilutii seriate din serul pacientului se evalueaza astfel titrul Ac respectivi in serul pacientului) (b) Particule de latex pe care sunt adsorbiti Ag cunoscut = reactie de aglutinare pasiva reversa In acest caz se determina prezenta unui Ag pe care vrem sa il evaluam Ex. prin metode de latex-aglutinare se evidentiaza prezenta factorului reumatoid (FR) la pacientii cu PR. Pe particule de latex sunt adsorbite IgG (care aici joaca rol de Ag!) care se pun in contact cu serul pacientului. Daca FR este prezent se produce aglutinarea. FR = IgM anti Ig. Deasemenea s-au dezvoltat teste de evaluare rapida a infectiilor se folosesc particule latex pe care sunt adsorbiti Ac specifici.

REACTII DE AGLUTINOINHIBARE Sunt de tip calitativ; se evidentiaza prezenta sau absenta unui Ag intr-un produs biologic. Ex. unele teste de sarcina sunt pe acest principiu. In cursul sarcinii creste nivelul -hCG in plasma si se elimina si in urina. Un prim pas: se pun in contact Ac anti-Ag cu produsul biologic de evaluat: adica in exemplul nostru Ac anti- hCG cu urina persoanei. Daca in urina exista -hCG atunci acesta va fi legat de Ac anti- -hCG. Al II-lea pas: se adauga -hCG adsorbit pe particule de latex (exogen). Daca Ac anti- -hCG sunt deja legati de -hCG care a provenit din urina, ei nu se mai pot lega de -hCG de pe particulele de latex, si astfel nu se produce aglutinarea. Daca in urina nu exista -hCG atunci Ac anti- -hCG sunt liberi sa lege Ag de pe particulele de latex si astfel se produce aglutinarea. Deci un astfel de test se considera pozitiv daca nu se produce aglutinarea.

REACTII DE AGLUTINARE NON-IMUNA exista virusuri, toxine bacteriene, compusi chimici, care induc hemaglutinare non-imuna. HEMAGLUTINAREA VIRALA = Exista virusuri care pot determina aglutinarea hematiilor in absenta unei reactii Ag-Ac: vir. urlian, rujeolei, gripal datorita prezentei unor proteine de suprafata hemaglutinine. Acest tip de hemaglutinare poate fi inhibata de prezenta Ac neutralizanti ai virusului respectiv = HEMAGLUTINOINHIBARE VIRALA Reactie de neutralizare = o reactie Ag-Ac in care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus sunt blocate. Testul este folosit pentru subtipizarea virusurilor gripale.

LP IMUNOLOGIE REACTII DE NEUTRALIZARE


= o reactie Ag-Ac in care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus sunt blocate. Ex. hemaglutinoinhibarea virala, ASLO,etc. ASLO Streptolizine = exotoxine produse de streptococi; cu functie de hemolizina determina liza hematiilor (si a alor celule ex. leucocite). Streptolizina O (SLO) se leaga de colesterolul membranar, polimerizeaza si formeaza canale transmembranare. Streptolizina O produsa de streptococi -hemolitici grup A (=Streptococcus pyogenes), C, G; numita O pentru ca e inactivata de oxigenul atmosferic; este intens imunogenica. ( streptolizina S stabila in oxigenul atmosferic, mai slab imunogenica) Determinarea ASLO prin test de neutralizare Testul se bazeaza pe faptul ca, in vitro Ac anti-SLO blocheaza activitatea acesteia de hemolizina. metoda ? Rantz-Randall : se folosesc hematii ( de iepure/ oaie/ om grup O ) ? care se incubeaza cu extract de SLO? si cu ser de la pacient in dilutii seriate? ? Daca pacientul prezinta Ac anti SLO atunci nu se produce hemoliza pentru ca acesti Ac au activitate de blocare de actiune a hemolizinei respective?

? ultima dilutie la care nu apare hemoliza = invers proportional cu titrul ASLO la pacient. Testul (Todd): in eprubete se pune: ser in dilutii seriate, buffer, SLO ; se amesteca usor; se incubeaza 15 minute la 37C; apoi se adauga suspensie de hematii ( om grup O sau iepure) in concentratie de 5%, 0,5 ml; se amesteca usor; se incubeaza la 37C timp de 45 minute si apoi se contrifugheaza la 1.500 rpm timp de 1 minut. Titrul ASLO in unitati Todd = inversul dilutiei serului la care este neutralizata complet activitatea SLO = nu se mai produce hemoliza. 1 unitate Todd = cantitatea de Ac care blocheaza 2,5 din doza minima hemolitica de SLO Doza minima hemolitica = cant de toxina care hemolizeaza complet 0,5 ml de suspensie de hematii de iepure in concentratie de 5%. Se poate face si un test rapid pe particule de latex pe care e adsorbita SLO. Test pozitiv = aglutinarea particuleleor de latex de catre Ac din serul pacientului. Test martor (+) = un ser care contine un titru de 200 U/ml ASLO Test martor negativ = unser care contine un titru ASLO< 100U/ml Din serul pacientului se face initial un test cu ser nediluat; daca testul initial arata aglutinare = (+) + titrul ASLO al pacientului > 200 U/ml; daca nu apare aglutinare titru< 200U/ml In cazul testului pozitiv, se fac in continuare dilutii seriate din serul pacientului cu care se repeta proba de aglutinare, pentru aprecierea mai exacta ( desi semicantitativa?) a titrului ASLO. Dupa o infectie acuta cu streptococ titrul Ac antiSLO incepe sa creasca la 7 10 zile; ajung la titru maxim la ~ ~ 6 saptamani (~3 saptamani de la instalarea RAA); dupa aceea titrul ASLO scade progresiv; la 12 luni de la infectie doar 20% din cei infectati mai au titru ASLO peste normal. Titrul ASLO normal 200UI ? U/ml ; < 125 U Todd; pot exista variatii in functie de varsta, expuneri anterioare la streptococ grup A, capacitatea de reactivitate imuna; etc.

S. pyogenes determina afectiuni prin 3 mecanisme principale: supuratie ( facilitata de proprietatile antifagocitare ale proteinei M); elaborare de toxine ( scarlatina, STSS); inflamatie mediata imun nonsupurativa (RAA, GNA): - Infectii determinate de S. pyogenes: faringita*, amigdalita*, limfadenita supurata*, sinuzita, abces peritonsilar, retrofaringeal*, pneumonie, empiem pleural, impetgo*, erizipel, celulita, limfangita, fasceita necrozanta, meningita, septicemie, s.a. - Afectiuni mediate de toxine streptococice: scarlatina*, soc toxico-septic (STSS streptococ- toxico-soc sindrom). - Afectiuni post-infectie streptococica: RAA*, glomerulonefrita acuta(GNA)*. *mai frecvent/exclusiv copii, adolescenti. Alte proteine streptococice: - Proteinele M sunt proteine ale peretelui bacterian; impreuna cu acidul lipotecoic mediaza adeziunea S. pyogenes la fibronectina din celula epiteliala a gazdei. Sunt proteine stabile termic, sensibile la tripsina, formate din 2 lanturi; capatul N-terminal este hipervariabil determina specificitatea de tip a streptococilor. Proteina M reprezinta proteina majoritara de suprafata a tulpinilor virulente de S. pyogenes reprezinta factorul major de virulenta; inhiba depunerea de complement si astfel previne fagocitarea bacteriei.

Exotoxinele A si C ale lui S. pyogenis (SPE A si SPE C) superantigene care induc activarea LT, inhiba sinteza de Ac, potenteza socul endotoxic, induc aparitia febrei, induc eleberare prompta de citokine proinflamatorii. Enzime: 2 streptokinaze ( imunogenice) care activeaza plasmina si cliveaza C3 la C3a?, 1 pana la 4 DNA-aze ( cea mai comuna DNA-aza B care e si cea mai imunogenica), s.a. enzime ( hialuronidaze, neuraminidaze, fosfataze...).

Ac anti-streptococ: Protectivi = Ac anti-proteina M ( sunt insa specifici de tip - in functie de proteina M a tipului; grupul A de streptococi > 120 tipuri de proteina M); apar mai lent de cat alti Ac; persista ani, posibil chiar toata viata. Ac anti produse extracelulare: anti-SLO, anti-DNA-aza nu sunt protectivi, doar markeri ai infectiei. RAA (reumatism *poli+articular acut; febra reumatica) Manifestarea acuta apare de obicei la copii, adolescenti, tineri( rar< 4 ani, adulti ), la 2-3 saptamani dupa o angina streptococica cu S. -hemolitic grup A (uneori paucisimptomatica, dificil uneori de identificat in anamneza). Simptomele se instaleza tipic brusc: febra, stare de rau, paloare, artralgii si artrite migratorii ale articulatiilor mari ( de obicei genunchi, umeri, glezne, coate, RCC). Clasic manifestarea articulara este acuta, durereroasa, migratorie ( afectand de obicei > 5 articulatii). Rar manifestarea e monoarticulara, sau la nivelul articulatiilor mici; exceptional la nivelul CV. Artrita reumatismala se vindeca. O parte din pacienti prezinta si manifestari de cardita reumatismala: dispnee, palpitatii, tahicardie, dureri substernale, sufluri, frecaturi pericardice.. Afectarea cardiaca reprezinta cea mai serioasa manifestare a RAA; pot fi afectate valvele, miocardul si pericardul ( uneori toate in acelasi timp). O parte din pacientii care prezinta cardita la primul episod de RAA pot ramane cu sechele cardiace ( mai ales St.Mi.); o mare parte insa se vindeca, dar, fara profilaxie secundara au risc crescut de recurenta si deci de sechele. Manifestari cutanate si subcutanate: eritema marginatum, noduli subcutanati ( ami frecvent la nivelul genunchilor, cotului, umarului, occiputului). Coreea acuta ( Sydenham) debutaza de obicei mai tardiv decat celelalte manifestari ( la 6-8 saptamani dupa infectie); manifestarile dispar de obicei dupa 1-3 luni, dar pot recidiva. Laborator: teste care confirma infectia recenta streptococica: - exudat faringian ( insa la majoritatea pacientilor, dupa episodul acut de faringita acuta nu mai cresc culturi din exudatul faringian, mai ales daca au fost tratati cu AB) - Ac anti-SLO (ASLO), Ac anti-DNA-aza markeri inflamatori prezenti in perioada RAA (reactanti de faza acuta; VSH si CRP care pot ramane crescute saptamani, luni chiar dupa episodul RAA) modificari EKG: cel mai frecvent tulburari de conducere, dar si supradenivelare de ST in cazul pericarditei ecocord ( lichid pericardic, FE..)

Mecanismul aparitiei manifestarilor RAA: cross-reactivitatea datorita mimetismului molecular intre componente antigenice ale streptococilor -hemolitici grup A si proteine proprii ale organismului. Susceptibilitate genetica: HLA-DR2 ( albi), HLA-DR4 (negri); marker non-HLA - un marker al LB = D8/17 GNA poststreptococica: Poate apare dupa infectii faringiene ( la 10 zile dupa) sau cutanate ( la 3 saptamani dupa debutul piodermei) cu streptococ -hemolitic grup A ( de obicei alte tulpini decat cele care se asociaza cu RAA) Depunere de CIC la nivelul membranei bazale glomerulare ( contin IgG si Ag(?)) se activeaza complementul, eliberare de factori chemoatractanti, infiltrat inflamator celular. Clinic: de obicei sindrom nefritic = edeme, hematurie, frecvent HTA, oligurie. Paraclinic: - Urina: hematurie micro-/macro-scopica, +/- cilindri ( hialini, granulari, hematici), +/- piurie; proteinurie, uneori de rang nefrotic; de obicei functie tubulara pastrata. - Sange, plasma: CH50, C3; moderate uree, creatinina; CIC; VSH; hipoproteinemie cu hipoalbuminemie ( in caz de sindrom nefrotic ); in caz de disfunctie renala severa pot apare acidoza metabolica, hiperpotasemie, hipercloremie, hiponatremie, hipoalbuminemie, anemie de dilutie. De obicei autolimitanta. Diagnosticul se pune clinic+paraclinic+ evidenta de infectie Streptococica recenta : ASLO, Ac anti-DNA-aza B, eventual izolarea germenului din faringe/piele (vezi RAA + o cultura pozitiva nu face diferenta intre o infectie acuta si purtator cronic de streptococ, asa ca diagnosticul serologic este cea mai buna evidenta).

Alte teste de neutralizare: Testul Schick: se injecteaza intracutan o mina doza de toxina difterica purificata; daca pacientul nu are Ac antitoxina difterica circulanti, la locul injectarii, dupa 5 zile apare apare o zona rosie, indurata si dureroasa cu diametrul >? 10 mm; daca pacientul are respectivii Ac atunci acestia vor neutraliza toxina difterica si nu apare inflamatie locala. (exotoxina difterica inhiba sinteza proteica a celulelor organismului gazda, este citotoxica si produce necroze tisulare)

REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI


Se foloseste pentru evidentierea unor Ac specifici [1] in serul pacientului ( sau in LCR...) Principii: - Cand IgG sau IgM fixeaza Ag specific acestia fixeaza complementul. - Daca reactia are loc pe suprafata hematiilor => liza hematiilor.

Se foloseste un sistem-indicator: eritrocite preincubate cu Ac [2] specifici anti-hematie, in concentratii care nu produc aglutinare = eritrocite sensibilizate; sistemul indicator nu contine complement. Sistemul test: serul pacientului se incalzeste la 56C pentru inactivarea complementului pacientului; (apoi este adsorbit cu hematii de oaie spalate pentru a elimina din reactie eventualii Ac anti-hematie); apoi serul se amesteca cu Ag [1] purificat si o solutie de complement (ser proaspat diluat de porcusor de guinea). Amestecul se incubeaza 30 minute la 37C pentu a se lasa timp Ac [1] din serul pacientului sa reactioneze cu Ag [1] si sa fixeze complementul. Se adauga apoi sistemul-indicator = adica eritrocitele sensibilizate.
Daca in serul pacientului exista Ac [1] specifici atunci acestia se vor atassa de Ag[1] specific si vor fixa complementul; astfel incat nu mai ramane complement liber in sistemul test. La adaugarea sistemului indicator hematiile sensibilizate nu vor mai fi lizate.

Daca apare hemoliza eritrocitelor sensibilizate = in sistemul-test exista complement ( acesta e liber sa se fixeze pe Ac [2] anti-hematie fixati pe hematiile sensibilizate, se declanseaza cascada complementului care determina liza hematiilor) = in sistemul test nu exista Ac [1] specifici = in serul pacientului nu exista Ac [1] specifici.

Aplicatii: reactia Wassermann pentru sifilis; detectarea Ac anti-Mycoplasma, Bordetella, Ricketssi, virusuri, fungi (Cryptococcus, Histoplasma..).

LP IMUNOLOGIE REACTII Ag-Ac DE PRECIPITARE


Principiu: precipitarea implica interactiunea intre Ag si Ac in proportii de echivalenta, rezultand un precipitat vizibil. Ag folosite in reactii de precipitare = Ag solubile; trebuie sa aiba minim 2 determinanti antigeni (identici sau diferiti) astfel incat sa aiba posibilitatea sa lege macar 2 molecule de Ac. Ac folositi = seruri monoclonale/policlonale. Au 2 situsuri de legare ( forme monomerice, IgG); mai multe in cazul formelor pentamerice de IgM. Proportii echivalente = concentratii optime de Ac si Ag pentru formarea unei matrici(retele), formata din legaturi intre 1 Ag si mai multi (minim 2 molecule de) Ac si respectiv intre 1 Ac si 2/> molecule de Ag care determina formarea unei retele mari si mai insolubile si deci a unui precipitat vizibil. In cazul unui exces de Ac ( efect prozone) probabilitatea ca 1 molecula de Ac sa aiba ocupata mai mult de un situs de legare ocupat este mult mai mica astfel incat formarea unei retelei mari scade. In cazul unei cantitati prea mici de Ac/ excesive de Ag, chiar daca Ac leaga la ambele situsuri cate un epitop, numarul de molecule de Ag legate este prea mic; in plus, probabilitatea ca un Ag sa lege mai mult de o molecula de Ac este scazuta. Astfel, ca si in cazul excesului de Ac scade formarea de retele mari.

ZONA DE ECHIVALENTA

EXCES DE Ac

EXCES DE Ag

Reactiile de precipitare se pot realiza in mediu lichid sau semisolid (gel de agar). Reactii de precipitare in mediu lichid In trecut se folosea o metode de determinare cantitativa prin masurarea cantitatii de precipitat. Se folosesc mai multe eprubete in care se pune serul pacientului o cantitate fixa si necunoscuta de Ac si apoi cantitati de Ag cunoscute, variabile, din ce in ce mai mari. Dupa formarea precipitatului eprubetele se centrifugheaza, si concentratul obtinut din precipitat (supernatantul este scos) este masurat. Se face o curba cantitate de precipitat functie de cantitate de Ag = curba de precipitare.

Curba de precipitare:

Exces Ac Zona de echivalenta Exces Ag


(Imuno)Nefelometrie = o reactie de precipitare in mediu lichid in care se masoara numarul de complexe Ag-Ac prin evaluarea luminii dispersate de acestea. In practica se foloseste in general pentru evaluarea cantitativa unui Ag din serul pacientului prin folosirea unor seruri specifice anti-Ag standardizate. Peste serul pacientului in care se gaseste proteina de dozat se adauga serul specific anti-Ag; se formeaza complexe imune. Prin cuva in care se desfasoara reactia trece o raza laser cu lungime de unda cunoscuta; lumina este dispersata de complexele imune formate; aceasta dispersie este citita de un nefelometru si, prin comparatie cu valori ale unor probe standard, se cuantifica cantitatea de Ag din proba de ser. Proba se efectueaza in dinamica? Prin acest tip de reacti se pot doza Ig (inclusiv FR), componente ale complementului, complexe imune s.a. tipuri de protine serice ( ceruloplasmina, 1 anti-tripsina, CRP). Reactii de precipitare in gel Sistem de difuzie: proteinele difuzeaza in lichid/semisolid (gel) in functie de marime si concentratie (cantitate). Moleculele mari, ex. Ac, difuzeza mai greu. Imunodifuzia simpla = Ac este incorporat in gel iar Ag de determinat este lasat sa difuzeze in mediu Imunodifuzia simpla radiara (Mancini) Gelul in care se incorporeaza Ac specific este pus intr-o cutie Petri; apoi se fac mici gauri in gelul respectiv in care se pun probele biologice in care se gaseste Ag de determinat. Ag din proba incepe sa difuzeze in mediu. Acolo unde concentratia Ag in mediu atinge nivelul de echivalenta cu Ac se formeaza un inel de precipitare. Distanta parcursa de Ag depinde de timp, concentratie, marimea moleculei si concentratia Ac in agar. Aria inelului de precipitatie este direct proportionala cu concentratia Ag. Concentratia Ag se calculeaza in functie de aria inelului de precipitare si se evalueaza comparativ cu standardul pentru Ag respectiv. Este o metoda cantitativa. Se foloseste pentru dozarea IgG, IgA?, IgM; ( ? CRP, C3, transferina, FP ) Dubla difuzie (metoda Ouchterlony) 1. Pe o placa de mediu de gel se stanteaza 2 gauri in care se pun intr-o parte Ag si in cealalta Ac specific. Se standardizeaza marimea gaurilor, distanta intre ele, timpul si temperatura de incubatie. Cele 2 proteine, Ac si Ag incep sa difuzeze in mediu.

Daca in proba de evaluat exista Ag specific Ac, la locul de intalnire si in zona de echivalenta se va forma un arc de precipitare, ~ perpendicular pe axa dintre cele 2 gauri. Arcul se evalueaza comparativ cu un arc de precipitare standard (in care s-a folosit o cantitate cunoscuta de Ag). Aceasta metoda a fost prima care a evaluat AgHBs in hepatita virala B. Metoda Ouchterlony pentru 1 Ag

2. Prin aceeasi metoda se pot evalua in paralel 2 Ag pntru a evalua daca sunt similari sau nu? Ag 1 si Ag 2 sunt identice (dpv al determinantilor Ag) Non-identitate Identitate partiala = Ag 1 si Ag2 nu sunt identice dar au determinanti Ag comuni

Este o metoda calitativa ( eventual semicantitativa, grosimea bandei de precipitare putand sugera concetratia de Ag). Poate fi folosita pentru a diagnostica prezenta in serul pacientului a unor autoAc asocieti cu : PR, sd. Sjorgen, LES, sclerodermie, vasculite. Imunoelectroforeza Combina electroforeza cu dubla difuzie; metoda calitativa. Initial serul de evaluat se supune unui procedeu de electroforeza in gel, care separa proteinele in functie de incarcatura electrica si marimea moleculei. Apoi se face un sant in gel, paralel cu directia de migrare electroforetica, in care se pune Ac. Ag si Ac migreaza in gel (dubla difuzie) si la locul de intalnire + echivalenta se formeaza un arc de precipitare.

Acest arc de precipitare se poate compara cu un arc de precipitare normal ( sau investigatorul experimentat poate evalua daca arcul este corespunzator sau nu ). In functie de aspectul arcului de precipitare se evalueaza proteina de investigat: Proteina poate fi deficitara sau absenta: ex. deficit de 1 anti-tripsina Proteina anormala/in exces: lanturi usoare libere sau ; exces de IgG de ex intr-un mielom multiplu Contracurent imunoelectroforeza Este o dubla difuzie accelerata de punerea placii cu mediul de difuzie si a reactivilor intr-un camp electric care accelereaza difuzia; metoda calitativa. In functie de Ag analizat se ajusteaza pH-ul mediului ( de obicei > 8?). Ag migreaza spre anod (A+) si Ac spre catod (C-). In zona de echivalenta se formeaza un arc de precipitare. Se poate folosi pentru detectia unor autoAc ( impotriva ENA = extractable nuclear antigens; Ac anti-RNP [ribonucleoprotein], Ac anti Sm [Smith] apar in LES), Ac impotriva unor Ag bacteriene, unor Ag bacteriene, fetoproteina? Electrforeza-rocket Combina migrarea in camp electric cu imunodifuzia simpla. Metoda cantitativa, pentru Ag incarcate negativ. Mediul contine (pe langa gerul de agar ) Ac specifici pentru Ag de dozat. Se pune proba biologica de evaluat intr-o gaura standard care se face in gel. Se pune apoi in camp electric. Ag difuzeaza in gel, difuzie care e accelerata de campul electric. La locul de echivalenta se formeaza un arc de precipitare in forma de racheta. Inaltimea maxima a acestei rachete este proportionala cu concentratia Ag in proba de evaluat. Limitele probei: nu poate fi folosita pentru dozarea imunoglobulinelor; nu poate fi masurat decat un singur Ag/proba.

S-ar putea să vă placă și