Aislamiento y caracterizacin del ADN polimrfico de Entamoeba histolytica.

Una brecha importante en nuestra comprensin de la epidemiologa de la amebiasis es lo que determina el resultado de Entamoeba histolytica infecciones. Para investigar la posible existencia de cepas invasivas y no invasivas como un factor, la capacidad para diferenciar los aislamientos individuales de E. histolytica es necesario. Dos nuevos loci que contienen repeticiones internas, locus 1-2 y 5-6 locus, se han aislado. Cada uno contiene un bloque de repeticin nica con dos tipos relacionados de repeticiones directas dispuestas en tndem. El anlisis de transferencia Southern sugiere que ambos loci son multicopia y pueden ellos mismos estar dispuestos en series en tndem. Otros tres se reportaron previamente, loci internos repetitivos contiene al menos dos bloques repetidos cada uno con una o ms unidades de repeticin relacionados tambin fueron investigados. PCR se utiliz para estudiar el polimorfismo en cada uno de estos loci, que se detect en diversos grados en cada caso. Variacin se observ en el nmero total de bandas obtenidas por aislamiento y sus tamaos. secuencia de nucletidos Comparacin de loci 1-2 y 5-6 en cinco aislados axnicos revel diferencias en el nmero de unidades de repeticin, que correlacionada con la variacin en el tamao observado del producto de PCR, y en secuencia de repeticin. El uso de mltiples loci colectivamente permiti la diferenciacin de la mayora de las 13 cepas estudiadas, y creemos que estos loci tienen el potencial para ser utilizados como marcadores moleculares polimrficos en la investigacin epidemiolgica de E. histolytica y la posible existencia de cepas invasivas y no invasivas genticamente distintas. La aceptacin de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar como especies distintas (2, 11) ha tenido un impacto importante en nuestra puntos de vista de la amebiasis, en particular, su manejo clnico y epidemiologa. Es probable que al menos el 90% de las infecciones previamente atribuida a E. histolytica son en realidad E. dispar, mientras slo el 10% restante est infectado con E. histolytica en su nuevo sentido. Sin embargo, tambin parece que muchos E. histolytica infecciones nunca evolucionar hasta convertirse en sintomticas y son espontneamente perdido. Esta observacin plantea algunas importantes preguntas. Son los organismos que producen sntomas invasiva, enfermedad genticamente distintos de los que dan lugar a infecciones asintomticas? O es que todos los aislados de E. histolytica tienen el potencial de convertirse en invasoras? Hacer ciertas cepas invasoras muestran tropismo por los rganos especficos, con un poco de forma preferente terminando en la pared intestinal, mientras que otros alcanzan extraintestinal sitios. Para hacer frente a la posibilidad de una relacin entre el parsito variacin y los resultados infeccin la capacidad para diferenciar aislados de E. histolytica es necesario.

Nuestro conocimiento actual de la variacin intraespecfica en E. histolytica es limitado. El anlisis de isoenzimas proporcionado los primeros marcadores (25), pero ahora parece que los patrones de isoenzimas no son fijos (5) y por lo tanto que las asignaciones de muchos "zymodeme 'no son confiables (16). Un nmero limitado de marcadores de ADN han sido mostrado que exhiben la diversidad dentro de una especie. Variacin se ha observado en el nmero de unidades de transcripcin presentes en el rRNA los crculos extracromosmicos de DNA ribosmico; slo una rRNA copia del gen se ha visto en algunas cepas, mientras que la mayora tienen dos (27). Variacin tambin se ha detectado en la no codificante familias de repeticiones en tndem cortas encuentran tanto aguas arriba y aguas abajo de los genes de ARNr (20, 21, 26). Sin embargo, variabilidad en la ocurrencia y la inestabilidad en la longitud de algunas de estas secuencias limita su uso para aislar identificacin (4). La amplificacin por PCR del gen especfico de una cepa (6) o Tr (27), que est presente aguas arriba de una transcripcin rRNA unidad y contiene repetidas en tndem elementos internos, ha variacin revelaron considerable en el nmero de repeticiones entre cepas de E. histolytica (8). Sin embargo, la completa ausencia de este locus en ciertas cepas (27) hace que sea un pobre candidato para escribir dentro de una especie. En la actualidad, el gen ms polimrfico de E. histolytica es que codifica la serina-rico E. histolytica protena (o SREHP K2) un antgeno de superficie con tndem de 8 - y repite 12-amino-cido (17, 28). Repita el nmero, la secuencia y la enzima de restriccin polimorfismos del sitio se han reportado entre diferentes Aislados de E. histolytica (8, 14). Sin embargo, ms de un tercio de los los aislados ensayados dieron el modelo de restriccin mismo fragmento (8). El gen de quitinasa tambin codifica repeticiones en tndem de un degenerado Secuencia de 7-amino-cido (10), y un informe sobre el uso de polimorfismos de repeticin de quitinasa para distinguir los aislados de E. histolytica ha sido publicada recientemente (14). Sin embargo, hay todava existe una necesidad de ms fiable polimrfico E. histolytica Marcadores de ADN. El uso de microsatlites anlisis locus ha ganado considerable popularidad como una herramienta para la deteccin intra-e inter variaciones en una serie de organismos, incluyendo los parsitos protozoarios tales como Trypanosoma (22), Leishmania (24), y Plasmodium (1) spp. El uso de un mtodo diseado para aislar microsatlites

loci, hemos obtenido dos ADN polimrficos nuevos que contiene secuencias repetidas en tndem de E. histolytica. Presentamos aqu la caracterizacin preliminar de los dos loci y las variaciones interstrain que mostrar. Adems, otros tres loci que muestran la presencia de repetidas en tndem secuencias han sido estudiados por su potencial como polimrficos marcadores para su uso en la investigacin de la epidemiologa molecular de E. histolytica.

MATERIALES Y MTODOS E. histolytica aislados. A excepcin de HM-1: IMSS clon 9, los aislados axnicos fueron proporcionada por John Ackers (London School of Higiene y Medicina Tropical) (Tabla 1). Todos los aislados axnicos se cultivaron en el medio libre de casena YI-S (12) con inactivado por calor al 15% suero de bovino adulto (Sigma-Aldrich). Xenic aislamientos se obtuvieron de dos fuentes (Tabla 1). Cuatro muestras fueron de Haque Rashidul del Centro Internacional de Investigaciones sobre Enfermedades Diarreicas, Bangladesh, a travs de Aura Aguirre (London School of Hygiene and Tropical Medicina), mientras que otros cuatro fueron proporcionados por Terry Jackson, de la Medical Research Council de Sudfrica, Durban. Los aislamientos sudafricanos fueron de un paciente que se haba recuperado de absceso heptico amebiano (39.0C) o cerrar contactos familiares de pacientes que estaban asintomticos en el momento del aislamiento. Todas las cepas se aislaron originalmente xenic en medio de Robinson (23), no hay evidencia de que las condiciones de cultivo o de los medios tiene ningn efecto sobre los marcadores estudiados. Aislamiento de cidos nucleicos. El ADN fue aislado como se ha descrito previamente (7, 9), disuelto en 10 mM Tris-Cl (pH 8,5) y se pasa sobre un Microspin S-200 HR columna (Amersham Pharmacia Biotech, Inc). ARN se elimin mediante la adicin de RNasa A (Promega) a 0,05 mg ML21. El aislamiento de secuencias de ADN repetidas que contienen. Un mtodo no radiactivo diseado para el rpido aislamiento de secuencias de microsatlites (13, 22) se adapt. El ADN genmico de aislar HM-1: IMSS (ca. 500 ng) se digiri durante 2 h con una enzima de restriccin, ya sea AluI o RsaI (10 reaccin U/20-ml) (Gibco-BRL), seguido de incubacin a 65 C durante 15 min para inactivar la enzima y el pasaje a travs de una columna S-200 para eliminar las sales. 59-24-mer fosforilada (59 pAGTCCGGATCCAAGCAAGAGCACA-39) y no fosforilado 20-mer (59-CTCTTGCTTG GATCCGGACT-39) oligonucletidos con la superposicin de secuencias complementarias que contengan un sitio BamHI se usaron para generar un adaptador. Entonces, 2,5 pmol de adaptador se lig al

aproximadamente 250 ng de ADN digerido con T4 ADN ligasa a 14 C. Fragmentos ligados (equivalente a ca. 50 ng de ADN) se hibridaron a 20 pmol de un oligonucletido biotinilado microsatlite [GATGATCCGACGCAT (CA) 12, GATGATCCGACGCAT (CT) 12, (CAA) 12, (CTT) 12, (CAT) 12, (CTA) 12, o (TAA) 12] por desnaturalizacin a 95 C durante 10 min y recocido a 60 C durante 1 min; la hbridos fueron obligados entonces a 100 mg de estreptavidina con perlas magnticas recubiertas (Dynabeads KilobaseBinder kit; Dynal). Despus de la incubacin a temperatura ambiente durante 3 h los complejos de ADN-Dynabead se lavaron dos veces (10 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA; 2,0 M NaCl) y se resuspendieron en 50 ml de tampn TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0). El producto capturado se utiliz como plantilla para la amplificacin por PCR utilizando el oligonucletido adaptador de 20-mer con arreglo condiciones estndar. Los productos amplificados se analizaron en un gel de agarosa 1,8% (Gibco-BRL) utilizando amplificado adaptador-ligated pero no seleccionado como un ADN digerido controlar. Despus de la electroforesis, los productos de PCR que aparece para ser enriquecido por la seleccin proceso se purificaron en gel y se clon en el vector pGEM-T Easy (Promega). Los plsmidos recombinantes se secuenciaron utilizando un ABI PRISM 377 (PerkinElmer) y Thermo Sequenase II-Dye Terminator ciclo de secuenciacin kit (Amersham Pharmacia Biotech). PCR polimorfismos de tamao de los productos y comparacin de la secuencia de nucletidos. Primers fueron diseados a partir de repeticin que flanquea secuencias de la regin de todos los loci. La ADN genmico de E. histolytica fue amplificado utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 2 y 30 ciclos de 1 min a 94 C, 1 min a la hibridacin de cebador dependiente temperatura, y 2 min a 72 C, con una extensin final de 5 min a 72 C. amplificado productos fueron analizados utilizando 2,4% geles de agarosa NuSieve 3:1 (FMC) en 13 Tris-cido brico-EDTA (TBE). Productos de PCR de todas las cinco cepas de E. histolytica axnicos se clonaron vector pGEM-T Easy (Promega) y se secuenci como se describi anteriormente. El anlisis de transferencia Southern. El ADN genmico de aislar HM-1: IMSS clon 9 fue digiri durante la noche con 10 U de cada una de las enzimas de restriccin AluI, DdeI, DraI, EcoRI, y RsaI (Gibco-BRL o Fermentas MBI), y los fragmentos se separaron por electroforesis utilizando geles de agarosa al 0,8% en tampn TBE 13 y se transfiere a membranas BiodyneA (Gibco-BRL) utilizando mtodos estndar. [a-32P] dCTP marcado con sondas de doble hebra de ADN se prepararon mediante el uso de la Rediprime II random prime sistema de etiquetado (Amersham Pharmacia Biotech). Los filtros se hibridaron durante la noche a 65 C en una solucin de sodio 1 M NaCl-1% dodecil sulfato-10% de sulfato de dextrano y luego se lava a una severidad final de

0,23 SSC (13 SSC es de 0,15 M NaCl ms citrato de sodio 0,015 M) -0,1% de sodio dodecil sulfato a 65 C antes de la autorradiografa a 270 C. Los datos de la secuencia de nucletidos reportadas aqu se han presentado a la Base de datos GenBank bajo los nmeros de acceso AF276055 AF276065 a. RESULTADOS El aislamiento de secuencias de ADN repetidas que contienen a partir de la E. histolytica genoma. Para tratar de obtener fragmentos de ADN que contienen microsatlites, se emple un mtodo no radiactivo basa en la captura por afinidad de fragmentos de restriccin de cadena sencilla recocido a oligonucletidos biotinilados de microsatlites, con unin a estreptavidina con perlas magnticas recubiertas (Dynal), seguido por PCR mediada adaptador (13, 22). Un total de veintids PCR fragmentos que varan en tamao de 250 a 700 pb Se purificaron en gel de los productos de amplificacin totales de AluI o fragmentos de restriccin RsaI recocido a una de siete biotinilado oligonucletidos. Estos fragmentos se eligieron sobre la base de su enriquecimiento aparente en comparacin con el control de amplificacin productos y se clonaron, se secuenciaron, y se examinaron la presencia de microsatlites. No hay productos contenan secuencias correspondientes a la microsatlite oligonucletidos utilizados en su captura. Adems, la mayora de las secuencias no revel ninguna tndem repetido AND. Sin embargo, dos clones (clon 1 y clon 4) derivado de un aproximadamente 480-bp fragmento, obtenido a partir de fragmentos de restriccin AluI recocidas a la (CTT) 12 oligonucletido, mostr la presencia de interna en tndem repite. Las repeticiones se observan en los clones 1 y 4 eran distintos. Dos otros clones (clon 19 y el clon 5) derivado de AluI fragmentos de restriccin hibridado a (TAA) 12 contena el mismo tipo de repeticiones como clon 4. Los clones 19 y 5 contenan fragmentos de aproximadamente 480 y 450 pb, respectivamente. Un anlisis ms detallado se llev a cabo en el clon 1, que representa locus 5-6, y clon 4, que representa el locus 1-2. Caracterizacin de los loci 1-2 y 5-6. La secuencia completa del clon locus 1-2 (Fig. 1A), sin incluir el adaptador secuencia, es 402 bp de largo y contiene un bloque de repeticin nica con dos repeticiones directas relacionadas dispuestos en tndem (Fig. 1B). en Adems del bloque de repeticin principal, las duplicaciones en tndem de 8 a 12 pb estn presentes en las regiones flanqueantes. La secuencia completa del locus 5-6 clon (Fig. 2A), no incluyendo el secuencia adaptadora, es 424 bp de largo y contiene una nica repeticin bloque (Fig. 2B). Como en el locus 1-2, las duplicaciones en tndem en otras las regiones que flanquean el bloque de repeticin son tambin evidentes. BLAST resultados de la bsqueda no revel ninguna identidad de cualquiera de locus 1-2 o locus 5-6 a las previamente reportadas secuencias de E. histolytica.

PCR polimorfismos de tamao de los productos en loci 1-2 y 5-6. Primers fueron diseados en las regiones que flanquean los bloques repetitivos tanto para el locus 1-2 y 5-6 locus, y la amplificacin por PCR productos se analizaron en 2,4% de geles de agarosa NuSieve al mirar para el polimorfismo fragmento tamao entre los 13 E. histolytica aislamientos (Fig. 3). La amplificacin del locus 1-2 dio el producto esperado de ca. 400 pb de aislar HM-1: IMSS clon 9 (Fig. 3A). Todos los de la E. aislados histolytica dio un importante producto nico. El Sur cuatro Aislamientos africanos dio a los patrones ms variables. La amplificacin del locus 5-6 dio el producto esperado de ca. 420 pb en aislar HM-1: IMSS clon 9 (Fig. 3B), pero otros dos bandas de ca. 480 y 520 pb tambin fueron vistos. Este locus es altamente polimrficos. Variacin se observa en el nmero total de bandas por aislar y sus tamaos, incluso dentro de la misma regin geogrfica rea. Anlisis de la secuencia de nucletidos y la caracterizacin de la observ polimorfismo tamao. Con el fin de estudiar la subyacente la naturaleza de los polimorfismos de tamao observadas, la amplificacin productos de las cinco cepas axnicas en el locus 1-2 y 5-6 locus fueron clonados y secuenciados. Este anlisis revel diferencias en el nmero y secuencia de las unidades de repeticin, as como variacin de secuencia en las regiones que flanquean la repeticin de bloques (Fig. 4). Haba muy poca variacin en el nmero total de repeticin unidades de entre las cinco muestras en el locus 1-2 (Fig. 4A). Es coherente con las ligeras diferencias en el tamao del producto de PCR observado en la figura. 3A. Sin embargo, existe una considerable variacin entre los aislados en el nmero relativo de unidades de repeticin de Tipo 1 versus tipo 2. En contraste con el locus 1-2, hubo considerable variacin en el nmero total de unidades de repeticin de una tipo entre las cinco cepas en el locus 5-6 (Fig. 4B). Esta alta grado de variacin tambin se refleja en el tamao del producto de PCR comparacin (Fig. 3B). El locus 5-6 productos de amplificacin de aislar H-303: NIH revel dos fragmentos distintos de ca. 320 y 450 pb, respectivamente. La clonacin de los productos de PCR de este locus tambin result en dos insertos que diferan en tamao por ca. 100 bp [designada H-303: NIH-(3) y 303-H: NIH-(4); fig. 4B]. Compartidas sola base de alteraciones dentro de los bloques de repeticin eran visto en dos posiciones en los aislados 200: NIH y H-303: NIH en locus 1-2 (Fig. 4A). Otros dos cambios de una sola base se observaron slo dentro del bloque de repeticin de aislar IULA: 1092:1 en el locus 1-2, y aislar este tambin faltaba una sola copia de un 12-pb duplicacin en la regin 39-flanqueo. Un solo cambio de base en

la regin 59-acompaamiento estuvo presente en aislar IULA: 0593:2. En locus 5-6 un solo cambio de base se observ dentro de la repeticin bloque (Fig. 4B) para aislar IULA: 1092:1. Adems, tanto aislar 200: NIH y 303-H: NIH-(4) pareca faltar los primeros 10 pb de la unidad primera repeticin de 12 pb (GTATGTTTC TAT). A diferencia tambin fue evidente en las regiones de acompaamiento de las unidades de repeticin en que aislar 200: NIH faltaba una sola copiar de una duplicacin en tndem 8-pb en el extremo 59. Si bien es posible que las diferencias de nucletidos individuales son la amplificacin por PCR artefactos, es muy poco probable que las diferencias de nucletidos compartidos entre los aislamientos y se repite o variaciones de repeticin de nmeros podra tener este origen. El anlisis de transferencia Southern. El anlisis de hibridacin Southern fue realiz con HM-1: IMSS clon 9 de ADN genmico digerido con cinco enzimas (Fig. 5) y ya sea locus 1-2 o 5-6 como locus sondas especficas. La especificidad de las sondas se asegur utilizando los productos de PCR producidos a partir de ADN de plsmidos (clon 4 y el clon 1, respectivamente). Con el locus 1-2 sonda especfica, la banda de ca. 400 pb el carril AluI (Fig. 5B) se esperaba ya que el clon se obtuvo a partir de un fragmento de restriccin AluI de aproximadamente el mismo tamao. Fue una sorpresa descubrir que la sonda dio intenso seales de hibridacin en A23 kb con el ADN digerido con DraI ya que esta enzima corta frecuentemente en E. histolytica ADN y por lo general produce fragmentos mucho ms pequeos, como se ve en la figura. 5A. lo Es de destacar que AluI, DdeI y RsaI dar fragmentos importantes de aproximadamente el mismo tamao y que DraI y EcoRI ambos dan muy fragmentos grandes. Del mismo modo, una banda de ca. 400 pb se esperaba en el carril AluI con la sonda especfica de locus 5-6 (Fig. 5C), ya que el clon era obtenido a partir de un fragmento de restriccin AluI de aproximadamente este tamao. Una vez ms, la hibridacin con esta sonda, dio fragmentos principales de aproximadamente el mismo tamao con AluI y DdeI y con DraI y RsaI. EcoRI de nuevo produce un fragmento muy grande de A23 kb. Tomados en conjunto, estos datos indican que los loci 1-2 y 5-6 existir en series en tndem largas. Caracterizacin de otros loci que contienen repeticiones internas. Un nmero de otros elementos de ADN que contienen en tandem repeticiones han sido reportados en E. histolytica. No hay intentos tienen han realizado para estudiar su potencial para la deteccin de intraspecies polimorfismos. Hemos seleccionado tres de ellos internamente loci repetitivos de estudio: un elemento 978-pb descrito por Michel et al. (19; GenBank nmero de acceso M77091; nuestro

designacin, locus 3-4), un elemento de DNA 931-pb aislado por J. Rosales-Encina y D. Eichinger (comunicacin personal; GenBank nmero de acceso AF265348, nuestra denominacin, locus 9-4), y un elemento de 964-pb reportado por Huang et al. (15; nuestro designacin, locus 16-17). Representaciones esquemticas de los rgimen de repeticin visto en estos loci se dan en la figura. 6A, B, y C, respectivamente. Hay un alto grado de identidad entre el repetir dos bloques de locus 3-4 y los de locus 9-4. El CTATT diez ATA repeticiones en tndem de locus 9-4 difieren de la CTTAT 11 TATA tndem repeticiones de locus 3-4 nicamente en ausencia de un de un solo nucletido (T) en la segunda posicin de cada unidad. La unidad de repeticin en CTTTATTATTAT locus 9-4 es idntica a la 12-bp unidades de repeticin de locus 3-4 con la nica diferencia el nmero total de unidades visto, es decir, locus 3-4 tiene ocho unidades, mientras locus 9-4 tiene slo siete. De hecho, este alto grado de la identidad entre los dos loci se puede comprobar en las regiones flanqueantes tambin. Las secuencias de las posiciones 1 a 540 y las posiciones 541 a 931 de locus 9-4 son muy similares a la de nucletidos se extiende a las posiciones que abarcan 401 a 977 y las posiciones de 1 a 400 en el locus 3-4, respectivamente (datos no mostrados). Al comparar las secuencias de los loci 1-2 y 5-6 con los de loci 3-4 y 9-4 se encuentra que la unidad de repeticin CTTTATTAT, que se produce un total de siete veces en el locus 1-2, es idntica a los tres 9-bp unidades presentes en los bloques de repeticin segundo de los dos loci 3-4 y 9-4. Las unidades de repeticin de locus 5-6, sin embargo, eran bastante nico, como son la repeticin de las regiones flanqueantes de ambos loci. La secuencia de nucletidos del locus 16-17 es completamente diferente de la de los otros loci. Hay seis tipos principales de interior repite, con algunos que estn dispuestos en tndem, mientras que slo otros existen como dos copias en tndem y solitarios (Fig. 6C). Adems de stos, la duplicacin de 5 a 8 pb tambin se ven intercaladas entre estas repeticiones (no mostrado). PCR polimorfismos de tamao de los productos en loci 3-4, 9-4 y 16-17. Los cebadores se disearon para amplificar todos los tres loci, y los productos fueron analizados en un 2,4% NuSieve geles de agarosa para buscar polimorfismos de tamao entre los aislados de E. histolytica 13. En cada uno de los cebadores se disearon tambin de casos en las regiones entre los los dos grandes bloques de repeticin para buscar, adems, para variaciones de tamao en cada mitad del locus (Fig. 6). Aislar HM-1: IMSS clon 9 dio una amplificacin doble

producto de ca. 900 pb en el locus 3-4 (Fig. 7A). La mayora de E. histolytica aislamientos dio solo los principales productos con variacin de tamao pequeo. Los aislamientos 200: NIH y H-303: NIH, sin embargo, muestran una segunda banda de igual intensidad en ca. 850 pb, mientras que los aislados 8691 y 37.0C mostrar una segunda banda de ca. 1 kb. La amplificacin de la dos medias loci presenta un patrn muy diferente, con mucho ms variacin que se observa que con el locus entero (Fig. 7B y 7C). La amplificacin del locus 9-4 tambin dio dos productos entre ca. 900 pb y 1 kb en aislar HM-1: IMSS clon 9 (Fig. 8A). Los aislamientos 200: NIH y H-303: NIH muestran de nuevo dos bandas de igual intensidad. Como antes, la amplificacin de los dos medio-loci (Fig. 8B y C) produjo una mayor variedad de patrones de bandas que fue visto en el locus entero. La amplificacin del locus 16-17 dio el producto esperado de ca. 900 pb de aislar HM-1: IMSS clon 9 (Fig. 9A). Muchos de los los aislados de E. histolytica dio individuales principales productos con poco variacin de tamao entre ellos, aunque aislar 4530 dio dos productos claros de igual intensidad, y algunos otros dio dos muy cerca de las bandas de tamao. La amplificacin de los dos medio-loci produjo de nuevo una matriz altamente polimrficos de bandas (Fig. 9B y C). DISCUSIN Tuvimos xito en nuestro intento de clonar microsatlite loci usando una modificacin de un mtodo que ha tenido xito en otros organismos. Lo hicimos, sin embargo, aislar dos nuevos loci que contienen internos de repeticiones en tndem (1-2 y 5-6). Si este refleja una ausencia o una poblacin reducida de la DIAND clsica microsatlites trinucletidos en el genoma de E. histolytica o simplemente su abundancia relativa en la actualidad es demasiado pronto para decirlo. La (GA) 27 se extienden en una etiqueta de secuencia expresada se ha informado por Azam et al. (3), lo que sugiere que no existen en microsatlites este organismo. Otros tres, se inform anteriormente internamente repetitivo loci tambin fueron estudiados. La organizacin genmica de los loci fue investigado por Southern Blot. Los grandes fragmentos generados por DraI y / o EcoRI detectado con el locus 1-2 y 5-6 especfica sondas y la presencia de fragmentos grandes del mismo tamao con enzimas de restriccin de dos o ms sugiere que ambos loci estn dispuestos en series en tndem largas. El hecho de que algunas enzimas generar fragmentos muy grandes tambin fue reportado por

Michel et al. (19) por 3-4 locus, y estos autores tambin sugirieron que se visti en tndem. Del mismo modo, la hibridacin Southern con locus 16-17 indica que este elemento era repetidas en tndem (15). El xito de la amplificacin del locus 9-4 usando el cebador de orientacin indicada en la figura. 6B sugiere que este elemento es en series en tndem tambin. Niveles significativos de identidad existir entre las secuencias de los loci 3-4 y 9-4, en los dominios de repeticin as como que flanquean el regiones. Similitud Tambin se ha observado entre algunos de los repetir unidades de locus 1-2 y los loci de 3-4 y 9-4. Dos otros elementos de ADN internamente repetitivas se informaron de forma independiente por Lohia et al. (18) y Willhoeft y Tannich (30) que tambin tienen similitud notable en sus dominios de repeticin a loci 3-4 y 9-4. Sin embargo, la alineacin de la secuencia completa de todas las secuencias de ADN de cinco muestra una variacin suficiente para sugerir que que son miembros distintos de la misma familia de repeticin que contiene Elementos de ADN (datos no mostrados). Que los loci 3-4 y 9-4 son de hecho distintos se ve claramente de la comparacin de la figura. 7B y La figura. 8B. Variaciones de tamao dentro de los dominios repetidos fueron estudiados, y todos los loci estudiados mostraron longitud del producto de PCR-polimorfismo. En la mayora de los loci, los resultados de amplificacin en dos o tres bandas al menos en algunos aislamientos. La evidencia actual sugiere que el Entamoeba genoma es tetraploide (29). Es posible que el mltiples bandas que observamos reflejan polimorfismo entre homlogos loci en los cromosomas allicas. Amplificacin mltiple productos tambin se han reportado para el gen SREHP en un nmero de aislamientos de E. histolytica (8), un hallazgo consistente con el aislamiento de ADNc que contienen nmeros variables de interior repeticiones en tndem (17). SREHP da el patrn esperado de un gen de copia nica cuando se analiza por transferencia de Southern indica que las diferencias de longitud son variaciones allicas. Alternativamente, la presencia de bandas mltiples en este estudio podra explicarse por la existencia de estos loci repetir en varias ubicaciones en el Entamoeba genoma, cada uno con una caracterstica del producto de PCR tamao. La variacin en el tamao observado se caracteriz adems por comparacin de la secuencia de nucletidos de cinco aislamientos en loci 1-2 y 5-6. Aislamientos 200: NIH y H-303: NIH son fcilmente diferenciados por PCR a partir de la mayora de los otros aislados pero no puede ser fiable separados unos de otros por electroforesis en gel. Sin embargo, Comparacin de la secuencia de ADN en el locus 5-6 revel que los dos

aislamientos se distingue por la ausencia de una copia de un 8-pb duplicacin en tndem de la cepa 200: NIH; esta diferencia es demasiado pequeos para ser detectados en electroforesis en gel. Por lo tanto, los productos PCR tamaos por s solos no pueden discriminar entre todos los aislamientos distintos, al menos bajo estas condiciones. A partir de nuestros resultados, parece que un nmero de loci que muestran polimorfismo de tamao estn presentes en E. histolytica. El grado de diversidad vista vara, con algunos loci que muestran polimorfismo ms y por lo tanto tiene un mayor potencial para la deteccin de interstrain polimorfismo entre los aislamientos de E. histolytica que otros. A pesar de ser de regiones geogrficamente restringido, el de Bangladesh y las muestras de Sudfrica podra diferenciarse con facilidad. Para las variaciones ms piezas en el tamao del producto de PCR parecen ser el resultado de diferencias en los nmeros de tndem repetir unidades. Aunque no solo locus discrimina entre todos las muestras, el uso colectivo de mltiples loci permite la diferenciacin de la mayora de los aislados de E. histolytica. Creemos que los polimorfismos que describimos aqu tienen potencial como herramientas para responder a muchas de las cuestiones pendientes que rodea a la epidemiologa de la E. histolytica. En estos momentos estamos el estudio de muestras procedentes de una amplia gama geogrfica para validar la utilidad general de estos loci y el examen se muestras de los grupos familiares infectados y los brotes de amibiasis para los polimorfismos compartidos. En el presente trabajo, todos los aislamientos procedan de personas que tenan la enfermedad invasiva o se infectaron probablemente por alguien que tena la enfermedad invasiva. Tanto las cepas invasivas y no invasivas de E. histolytica existe Queda por determinar, pero espero que los loci polimrficos descrito aqu ser til para responder a esta importante pregunta.