Sunteți pe pagina 1din 243

M S R M

USMF Nicolae Testemianu




CURS DE











CHIINU 2000
II


IGOR CEMORTAN
SVETLANA CAPCELEA
LARISA ARANOV
DUMITRU AMOAII





Curs de

BIOLOGIE MOLECULAR
















USMF NICOLAE TESTEMIANU
CHIINU 2000
III

CZU 577.1/2
C 95

Colectivul de autori
Colaboratorii Catedrei de Biologie molecular i Genetic uman USMF N.
Testemianu:
Igor Cemortan confereniar, doctor n tiine biologice
Svetlana Capcelea lector superior, doctor n tiine medicale
Larisa aranov confereniar, doctor n tiine medicale
Dumitru Amoaii confereniar, doctor n tiine medicale


Recenzeni:
Leonid Lsi profesor universitar , doctor habilitat , eful catedrei
de Biochimie, USMF N. Testemianu
Nicolae Eanu - confereniar universitar, doctor n tiine medicale,
eful Catedrei de Histologie i Embriologie, USMF N.
Testemianu
Galina Lupacu doctor habilitat n tiine biologice, eful
Laboratorului de Imunogenetic, AM

Manualul a fost aprobat de Comisia Metodic Central a USMF N.
Testemianu (2 noiembrie 2000). Cursul este elaborat conform Programului
Universitar pentru studenii Facultii de Medicin general USMF N.
Testemianu.

Coordonator tiinific:
Nicolae Barbacaru Confereniar universitar, doctor n tiine biologice,
eful Laboratorului de Biologie molecular, AM

Consultant:
Natalia Cherdivarenco Profesor universitar, doctor habilitat n tiine
medicale, Catedra de Biologie molecular i Genetic uman, USMF N.
Testemianu

Redactor:
Olga Tagadiuc - confereniar universitar, doctor n tiine medicale, Catedra
de Biochimie USMF N. Testemianu

Desene i tehnoredactare computerizat Valeriu Gudima, inginer
IV

Viaa este distinct, fa de celelalte fenomene naturale,
printr-o singur trstur: ea are un program (care este)
nscris ntr-o substan unic, substana genelor
Salvador Luria
genetician
Laureat al Premiului Nobel

Ultimele decenii se caracterizeaz printr-o dezvoltare rapid a
bazelor tehnologiilor biologiei moleculare. Descifrarea
genomului uman a produs un decalaj vizibil ntre informaiile
pe care le putem obine n baza microscopiei electronice
vizavi de mijloacele molecular-biologice. Ritmul intens al
acumulrii datelor las prea puin timp sistematizrilor,
analizelor critice i conceptualizrilor riguroase.
Medicina actual este o medicin molecular, avnd
urmtoarele realizri:
+ elucidarea mecanismelor patogenice ale bolilor genetice i
a celor cu predispoziie genetic (cancer, boala
coronarian);
+ diagnosticul genotipic: presimptomatic sau prenatal;
+ farmacologia genomic - blocarea expresiei sau replicrii
genelor mutante (SIDA);
+ terapia genic - introducerea de gene normale n celulele
somatice ale unor bolnavi cu gene mutante;
+ profilaxia individualizat a bolilor.

V

Cuprins
Cuvnt nainte ............................................................................. 1
SISTEME BIOLOGICE .............................................................. 6
Organizarea sistemelor biologice ........................................... 6
Nivele de organizare a sistemelor biologice ....................... 7
Formele acelulare de via .................................................... 9
Celula unitatea elementar structural-funcional a viului . 12
Metodele de studiu utilizate n cercetarea celulelor ......... 16
Unele realizri importante n biologia celulei ................... 18
Verificarea cunotinelor: ....................................................... 20
ORGANIZAREA CHIMIC A MATERIEI VII ..................... 21
Componenta neorganic a organismelor vii .......................... 22
Componenta organic a materiei vii ...................................... 24
ACIZII NUCLEICI ............................................................... 32
Acidul dezoxiribonucleic ....................................................... 32
Acizii ribonucleici .................................................................. 42
Verificarea cunotinelor: ....................................................... 45
MEMBRANELE BIOLOGICE ................................................ 46
Organizarea molecular a membranelor ................................ 47
Membrana plasmatic ............................................................ 51
Particularitile membranelor interne .................................... 51
Biogeneza i evoluia membranelor ....................................... 53
Transportul prin plasmalem ................................................. 54
Adeziunea celular ................................................................. 60
Verificarea cunotinelor: ....................................................... 62
VI

COMPARTIMENTARA CELULEI EUCARIOTE ................. 63
Reticulul endoplasmatic ......................................................... 64
Aparatul (complexul) Golgi. ................................................ 66
Lizozomii ............................................................................... 69
Peroxizomii ............................................................................ 71
Mitocondriile .......................................................................... 73
Citoscheletul .......................................................................... 76
Verificarea cunotinelor: ...................................................... 80
PROCARIOTELE ..................................................................... 81
nveliul celular al bacteriei .................................................. 82
Bacteriile Gram pozitive ..................................................... 82
Bacteriile Gram-negative ....................................................... 85
Flagelii i pilii ...................................................................... 86
Componente intracelulare ..................................................... 87
Aparatul genetic al celulelor bacteriene ............................. 88
Recombinarea genetic la bacterii ......................................... 90
Verificarea cunotinelor ........................................................ 93
NUCLEUL ................................................................................ 94
Anvelopa nuclear ................................................................ 96
Nucleolul ................................................................................ 99
Biogeneza ribozomilor ......................................................... 101
Cromatina = cromozomii interfazici .................................... 101
Nivelurile de organizare a cromozomilor ............................ 103
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 108
REPLICAREA I REPARAREA ADN ................................. 109
VII

Aparatul de replicare ............................................................ 109
Mecanismul replicrii .......................................................... 114
Etapele replicrii .................................................................. 116
Modele de replicare .............................................................. 117
Reparaia ADN ..................................................................... 121
Metilarea ADN ..................................................................... 123
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 125
GENA ...................................................................................... 127
Funcia genei ........................................................................ 128
Organizarea molecular a genelor ....................................... 129
Particularitile organizrii genelor structurale la eucariote 131
Particularitile organizrii genelor pentru ARNr i ARNt la
eucariote ............................................................................... 136
Particularitile organizrii genelor la procariote ................ 137
Particularitile organizrii genomului uman ....................... 138
Transpozonii ........................................................................ 143
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 146
TRANSCRIPIA. PROCESSINGUL ARN ........................... 147
Transcripia la eucariote ....................................................... 148
Transcrierea genelor de clasa II ........................................... 149
Processingul ARN ................................................................ 154
Editarea ARN ....................................................................... 159
Particularitile transcripiei genelor de clasa I i clasa III .. 159
Reglarea transcripiei la eucariote ........................................ 159
Nivelele de reglare ale transcripiei ..................................... 160
VIII

Transcripia la procariote ..................................................... 163
Verificarea cunotinelor ...................................................... 164
TRANSLAIA ........................................................................ 165
Proprietile codului genetic ................................................ 165
Aparatul de translaie ........................................................... 168
Mecanismul translaiei ......................................................... 173
Reglarea translaiei ............................................................... 178
Particularitile translaiei n mitocondrii ............................ 180
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 181
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT ............................... 182
Izolarea acizilor nucleici ...................................................... 183
Obinerea fragmentelor de interes ........................................ 184
Clonarea ADN .................................................................... 186
Biblioteci de ADN ............................................................... 189
Hibridarea acizilor nucleici .................................................. 192
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 193
TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR ................................ 194
Secvenierea ADN ............................................................... 195
Tehnica Southern-blot .......................................................... 198
Tehnica Northern-blot .......................................................... 199
Tehnica Western-blot ........................................................... 200
Tehnica PCR n analiza genelor ........................................... 200
Hibridarea in situ .................................................................. 202
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 203
CICLUL CELULAR ............................................................... 204
IX

Interfaza ............................................................................... 205
Mitoza i citochineza ........................................................... 206
Reglarea ciclului celular ...................................................... 208
Evoluia celulelor dup diviziune ........................................ 214
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 219
RECOMBINAREA GENETIC ............................................ 220
Recombinarea genetic la eucariote ..................................... 220
Mecanismul molecular al crossing-overului ........................ 232
Recombinarea genetic la procariote ................................... 233
Verificarea cunotinelor: ..................................................... 235
BIBLIOGARFIE ..................................................................... 236


1


Cuvnt nainte

Cursul de Biologie Molecular ofer studentuluimedic o
nelegere ampl privind funciile celulei n termeni moleculari.
Aceste cunotine vor fi utile i pentru nelegerea mai profund
a coninutului unor discipline tradiionale ca: histologia,
citologia, anatomia, embriologia, fiziologia, genetica i evoluia.
Cursul de Biologie Molecular prezint ntr-un mod
foarte sumar ipotezele privind structura morfologic i
molecular a celulei, organizarea i funciile componentelor
celulare n termeni moleculari i procesele genetice de baz
exprimate la nivel celular. O realizare important a cursului este
i redarea cunotinelor contemporane cu privire la unele aspecte
patologice ale celulei anomaliile membranelor i
citoscheletului i ontogenetice senescena i moartea celular,
ct i a elementelor de baz ce determin evoluia malign a
celulelor. Cursul prevede necesitatea ulterioar de integrare cu
informaiile ce vor fi prezentate mai detaliat la alte discipline,
cum ar fi: genetica, biochimia, fiziologia, virusologia,
microbiologia, histologia, anatomia etc.


2




***
Cu ocazia tipririi acestei cri avem posibilitatea s le
exprimm gratitudinea noastr tuturor care au contribuit la
realizarea acestui curs.
n primul rnd dorim s mulumim D-lui confereniar,
doctor n tiine biologice Nicolae Brbcaru, eful laboratorului
de Biologie Molecular la Institutul de Genetic a AM, care
ne-a inspirat interesul ctre aceast ramur a biologiei, ne-a
sftuit i ne-a coordonat partea tiinific a acestui curs.
Recunotina noastr este ndreptat spre prim-vice
Rectorul USMF N.Testemianu Profesorul Petru Galechi care
ne-a ncurajat editarea acestui curs.
n mod deosebit dorim s mulumim recenzenilor
Cursului dat D-lui Decan al Facultii de Medicin General
confereniar Nicolae Eanu, D-lui Profesor Leonid Lsi, D-ei
doctor habilitat n tiine biologice Galina Lupacu, efa
laboratorului de Imunogenetic la Institutul de Genetic a AM.
3

Elementele eseniale pe care studentul
trebuie s le cunoasc:

Biologia molecular este disciplina care studiaz organizarea
i structura moleculara a celulelor i cooperarea acestora
ntru realizarea unui organism att de complex ca fiina
uman.
Celula normal este o celul care recepioneaz i
coordoneaz semnale biologice complexe, provenite de la
surse foarte diferite, i la care ea rspunde printr-o expresie
corect a funciilor de difereniere i proliferare.
Substratul material al ereditii i variabilitii organismelor
vii este reprezentat de ADN principalul deintor de
informaie genetic pe care o realizeaz n procesul sintezei
proteinelor. Prin replicarea fidel a moleculelor de ADN
acest mesaj se transmite descendenilor, astfel asigurndu-se
continuitatea vieii.
Spre deosebire de celulele procariote care sunt construite
dintr-un singur compartiment limitat de o membran
plasmatic, celulele eucariote sunt constituite din multiple
compartimente funcional distincte, fiecare fiind delimitat de
membran proprie. Aceste compartimente care prezint n
fond o colecie de structuri subcelulare, au fost denumite
organite celulare. Fiecare organit joac un rol unic n
creterea i metabolismul celulei i conine o colecie
specific de enzime i alte molecule specializate.
Comunicarea ntre aceste compartimente se face printr-un
sistem complex de distribuie care asigur trecerea
produselor specifice dintr-un compartiment n altul.
Organismele multicelulare depind de capacitatea celulelor
eucariote de a-i exprima informaia ereditar ntr-un mod
diversificat (diferenierea celular), realizarea asocierii
4

celulelor i stabilirea unui sistem de conexiune intercelular.
La om ntlnim mai mult de 200 tipuri celulare, care apar n
mod net distincte. Acestea stau la baza formrii diferitor
tipuri de esuturi. Creterea i diferenierea celulelor se
realizeaz dup un program genetic bine stabilit. Unele gene
sunt activate sau represate n funcie de necesitile celulelor.
Diviziunea mitotic st la baza multiplicrii celulelor,
asigur creterea organismului pluricelular, determin
citologic biomasa organismului. La organismele cu
reproducere sexuat exist un tip deosebit de diviziune
meioza, proces prin care din celule cu nuclee diploide
rezult celule cu nuclee haploide gameii. Prin contopirea
gameilor haploizi se formeaz zigotul diploid (celul unic)
care st la originea dezvoltrii organismului. Declanarea,
derularea i succesiunea evenimentelor implicate n
diviziunea celular se afl sub controlul a numeroi factori
intra- i extracelulari: formarea i disocierea complexelor
ciclin-protein kinaze dependente de ciclin (cdk); proteine
senzor ale creterii celulare; factori de cretere; densitatea
celular; proteine inplicate n adeziunea celular; proteine
codificate de antioncogene (pRB, p53).
Pe lng proliferare i difereniere, n organism, celulele a
cror funcie este epuizat, sunt nlturate i nlocuite de
celule tinere. nlturarea este un proces fiziologic i a fost
numit apoptoz. n mod obinuit apoptoza asigur
homeostazia organelor prin participarea la turnover-ul
celular. Procesul apare n cursul dezvoltrii normale a
embrionului, involuia organelor provizorii, pierderea
celulelor interdigitale la embrionul uman, selecia clonal n
sistemul imun.
Capacitatea proliferativ a celulei normale este controlat de
gene care stimuleaz (protooncogene) i de gene care inhib
(antioncogene) multiplicarea celular. Cancerul apare din
5

cauza unui dezechilibru dintre cele dou seturi de gene,
favoriznd proliferarea nelimitat.
Biologia molecular s-a dezvoltat datorit apariiei unor noi
tehnici avansate de microscopie electronic, folosirii
culturilor celulare, realizrii anticorpilor monoclonali,
tehnologiei ADN-recombinant, manipulrii genice i tiinei
computerilor, factori care au demonstrat puterea lor
analitic i au permis unificarea experimentului biologic, a
substratului molecular i a terminologiei.

Importana practic
a cunotinelor acumulate de studeni la cursul de
BIOLOGIE MOLECULAR:

Cunoaterea organizrii i a funciilor celulei normale va
asigura studentului un suport substanial pentru nelegerea
cunotinelor necesare altor discipline i perceperea mai bun a
fenomenelor patologice la nivel celular i molecular. n plus,
studentul i viitorul medic sau cercettor va putea nelege i
chiar contribui (dac are i imaginaie) la elaborarea unor noi
medicamente cu aciune specific, unor noi strategii n
prevenirea, diagnosticul i terapia numeroaselor boli.
Descoperirea tehnicilor de analiz direct a genei -
tehnica ADN-ului recombinat - constituie o revoluie
tehnologic n biologie i medicin.
Pentru orice maladie, debutul, starea i finalitatea
alterrilor au un singur sediu celula cu infrastructurile sale
specifice n funcie de calitatea i topografia acestora. De aceea
viitorul medic urmeaz a fi neaprat familiarizat cu bazele
moleculare ale organizrii celulelor n norm i patologie.


6

SISTEME BIOLOGICE

Sistemul biologic la nivel molecular reprezint un
complex de biopolimeri (acizi nucleici, proteine, lipide, glucide)
ce interacioneaz ntre ei, asigurnd fluxul permanent de
informaie, energie i materie. Programul activitii sistemului
biologic este nscris n macromoleculele de ADN. Realizarea
acestuia se efectueaz prin intermediul diferitor tipuri de
proteine.

Organizarea sistemelor biologice
Sistemele biologice se caracterizeaz printr-o serie de
particulariti:
autoreproducerea proprietatea sistemelor biologice de a
forma sisteme noi prin divizarea unor sisteme iniiale (de ex.,
1 molecul ADN 2 molecule ADN; 1 celul 2 celule;
etc.). Are ca baz proprietatea moleculelor acizilor nucleici de a
se replica.
autoconservarea proprietatea sistemelor vii de a rmne
neschimbate n timp (de ex., existena speciilor de-a lungul
timpului). Se bazeaz pe capacitatea acizilor nucleici (ADN) de
a se replica, formnd molecule noi cu acelai coninut i
structur i pe cea de repartizare uniform a materialului
genetic n timpul diviziunilor celulare.
autoreglarea capacitatea sistemelor biologice de a se
regla singure. Se realizeaz dup un mecanism feedback prin
care rezultatul final al unor procese regleaz procesul n
7

ntregime (de ex., cantitatea de hormon n snge determin
activitatea glandei care elimin hormonul; numrul de indivizi
dintr-o populaie determin rata natalitii).
metabolismul reprezint schimbul de substane din
cadrul organismului. Metabolismul se caracterizeaz prin
selectivitate (preluarea din mediu nu a oricror substane, ci
doar a celor necesare) i specificitate (proprietate prin care
substanele nutritive preluate din exterior sunt transformate n
substane mai simple, din care apoi se sintetizeaz molecule
caracteristice organismului dat).
echilibrul dinamic nsuirea care explic n cel mai nalt
grad modalitile de pstrare a individualitii, organizrii i
funcionrii unui sistem n cadrul anumitor limite, n timp i n
spaiu. Meninerea echilibrului dinamic a strii de homeostazie
a sistemelor biologice se realizeaz n baza mecanismelor de
autoreglare.
integralitatea capacitatea sistemului de a funciona ca un
tot ntreg n raport cu mediul, fiind compus din subsisteme
ierarhizate (de ex., un organism este format din organe
subordonate, care la rndul lor constau din esuturi, formate din
celule etc.).

Nivele de organizare a sistemelor biologice
Materia vie are cteva nivele de organizare, enumerate
mai jos de la de la micro- spre macronivele.
Molecular reprezentat de moleculele din care sunt
formate organismele. n compoziia materiei vii sunt prezente
att substane anorganice (apa, ioni anorganici), ct i substane
organice. Dintre acestea o importan decisiv o au biopolimerii
(acizi nucleici, proteine, polizaharide), dar i substanele mai
simple, cum ar fi mono-, di-, oligozaharidele i lipidele.
8

Celular reprezentat de celule att procariote, ct i
eucariote; att cele ce duc o via solitar, ct i cele din
componena organismelor pluricelulare.

Scara obiectelor biologice
9

Tisular - celulele specializate cu funcii i structur
similare formeaz esuturi. Prin asocierea programat a diferitor
esuturi se formeaz organe i sisteme de organe ce asigur
fiziologia organismului pluricelular.
Individual reprezentat de organisme separate,
acelulare (virusuri), monocelulare (procariote i eucariote) i
pluricelulare.
Populaional grupuri de indivizii din aceeai specie,
separate geografic.
Biocenotic totalitatea comunitilor de organisme vii
ce convieuiesc pe un anumit teritoriu.
Biosfera ansamblul materiei vii de pe Pmnt.

Formele acelulare de via
Exist entiti biologice care nu se ncadreaz n definiia
viului i nu se caracterizeaz prin toate proprietile materiei vii:
autoreproducere, autoreglare, autoregenerare. Acestea sunt
virusurile i prionii, care nu au un metabolism propriu i nu se
nmulesc n afara gazdei pe care o paraziteaz. Aceti ageni
sunt nite parazii obligatorii care provoac boli la diferite
organisme. n timp ce virusurile ocup o poziie intermediar
ntre materia vie i cea nevie, prionii sunt doar nite ageni
infecioi i nu pot fi clasificai la organismele vii.

Virusurile
Din punct de vedere structural, virusurile sunt formate
dintr-o capsul proteic, numit capsid, n interiorul creia se
conine o molecul de ADN sau ARN mono- sau bicatenar (fig.
1.1). Uneori pot avea la suprafa o membran, care provine din
membrana gazdei distruse. Capsida viral poate avea cele mai
diverse forme: sferic, ixoedric, de bastona etc.
10

Dimensiunile virusurilor variaz n limitele 20-250 nm.
Atunci cnd virusurile se afl n afara celulei-gazd ele sunt
inerte din punct de vedere metabolic nu se nmulesc, nu
consum i nu elimin nimic n exterior. Astfel, virusurile
reprezint parazii genetici obligatorii. n momentul contactului
particulei virale cu celula-gazd, materialul genetic al
parazitului este injectat n interiorul gazdei. Utiliznd resursele
i aparatul enzimatic al gazdei are loc multiplicarea particulelor
virale, urmat de distrugerea celulei. Astfel de multiplicare
poart denumirea de ciclu litic. Unele virusuri pot rmne n
stare latent mai mult timp, fiind integrai n ADN-ul gazdei,
aceast stadie numindu-se profag. Sub aciunea anumitor
factori din exterior are loc inducia sau reactivarea virusului.
ADN viral se excizeaz din genomul gazdei i se transfer n
citoplasm. La aceast etap este cunoscut sub denumirea de
virus vegetativ. Particulele virale se multiplic pe baza
sistemului metabolic celular, dup care are loc distrugerea
Fig. 1.1. Structura unor virusuri
A virusul mozaicului tutunului
B bacteriofagul
11

gazdei. Acest tip de virusuri se numesc virusuri cu ciclu
lizogenic (fig. 1.2).

O trstur caracteristic pentru virusuri este
specificitatea nalt fa de celulele infectate, aceasta fiind
determinat att de specie, ct i esutul infectat. Totodat,
exist virusuri care pot infecta cteva specii nrudite. Virusurile
sunt ageni patogeni care provoac foarte multe boli: gripa,
rceala, SIDA, herpesul, hepatitele, poliomielita etc. De
asemenea, unele forme de cancer se asociaz cu infeciile virale.
Prin infecia diferitor organisme virusurile pot transporta
Fig. 1.2. Ciclul litic i ciclul lizogenic de dezvoltare a
bacteriofagilor.
1 celula-gazd; 2 ADN-ul gazdei; 3 capsula viral; 4
ADN viral; 5 ADN viral integrat n ADN-ul gazdei; 6
particule virale noi
12

informaia genetic de la un individ la altul, sau chiar ntre
indivizii diferitor specii.

Prionii
Prionii reprezint nite secvene de peste 250 aminoacizi,
dar spre deosebire de proteinele celulare obinuite, care se
sintetizeaz pe baza ARNm, pentru prioni nu este caracteristic
existena unor ARNm corespunztori. Ei prezint rezultatul
degradrii incomplete a unor proteine celulare normale. Ca
rezultat al aciunii acestor ageni patogeni, proteinele normale i
modific conformaia, ceea ce le face incapabile de a mai
funciona normal. Prionii sunt cauza unor boli
neurodegenerative i musculare. Adesea bolile reprezint nite
encefalopatii spongiforme care duc la degradarea creierului.
Astfel de maladii se ntlnesc att la oameni, ct i la animale
(mai ales bovine i ovine). Una dintre cele mai rspndite este
scarpia, ntlnit la vitele mari cornute. Dintre bolile umane
cauzate de prioni cea mai cunoscut este Kuru, ntlnit ntre
aborigenii din Papua Noua Guinee, la care este rspndit
canibalismul ritual, el fiind i mijlocul de transmitere a agentului
infecios. Bolile prionice pot fi de asemenea motenite cu
frecvena 1:1000000.

Celula unitatea elementar structural-funcional
a viului
Celula reprezint un sistem complex, caracterizat prin:
- autoreproducere;
- autoreglare :
- autorennoire.
Fiecare celul este delimitat de mediul extern printr-o
membran plasmatic care are o structur lipoproteic (fig.
1.3). Membrana plasmatic (plasmalema) permite
13

individualizarea celulelor, realizarea schimbului de substane
dintre mediul intern i cel extern, astfel autoreglnd compoziia
chimic a celulei. Toate celulele conin material genetic sub
form de ADN. n moleculele de ADN se conine informaia
despre organizarea i funcionarea fiecrei celule. Datorit
capacitii moleculelor de a se autoreproduce, celulele nou
formate conin acelai material ereditar. n celulele organismelor
pluricelulare se conine ADN cu acelai mesaj genetic. n
funcie de localizarea moleculelor de ADN n citoplasm sau
nucleu, toate celulele se clasific n procariote i eucariote.
Un alt component obligatoriu al celulelor este
reprezentat de citoplasm, n care se desfoar toate procesele
metabolice celulare sinteza i degradarea substanelor,
obinerea energiei etc. n citoplasm este localizat i aparatul
de sintez a proteinelor component obligatoriu al fiecrei
celule. Sinteza proteinelor se efectueaz n baza moleculelor de
ARNm cu ajutorul ribozomilor i a moleculelor ARNt .

Celulele procariote
Din procariote fac parte bacteriile, micoplasmele,
cianobacteriile (algele cianofite). Toate procariotele sunt
organisme monocelulare sau coloniale, aerobe sau anaerobe, cu
Fig. 1.3. Componentele principale ale celulelor
14

dimensiuni 110 m. Celulele procariote se caracterizeaz prin
lipsa nucleului bine evideniat, materialul ereditar reprezentat
prin molecule de ADN inelar (fig. 1.4), plasat direct n
citoplasm i numit nucleoid.
O alt nsuire distinctiv a procariotelor este lipsa
organitelor mebranare. Sistemele enzimatice sunt localizate n
citoplasm, pe plasmalem sau pe mezozomi. Sinteza
proteinelor la procariote se efectueaz cu ajutorul ribozomilor
cu coeficientul de sedimentare 70S (50S + 30S). Reproducerea
celulelor se realizeaz prin diviziune direct (amitotic). Multe
bacterii au un rol patogen important, fiind cauza numeroaselor
boli infecioase (tuberculoza, pneumonia, meningita, sifilisul,
holera, difteria). Unele bacterii (Escherichia coli) sunt utilizate
n biotehnologia modern: producerea medicamentelor,
obinerea unor substane biologic active, clonarea genelor.

Fig. 1.4. Structura general a unei celule bacteriene
15

Celulele eucariote
Eucariotele reprezint celule nucleate, de regul cu
dimensiuni cuprinse ntre 10-1000 m, care formeaz
organismele monocelulare, coloniale i pluricelulare. Nucleul
conine majoritatea ADN-ului celular i este principalul loc
unde se desfoar sinteza ARN-ului. Citoplasma din jurul
acestuia este format din citosol i organite celulare (reticulul
endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile, lizozomii,
peroxizomii) aflate n suspensie (fig. 1.5). Membranele,
organitele sau particulele din interiorul celulei au funcii
speciale, determinate de setul de proteine pe care l conin.
Celulele eucariote se nmulesc prin mitoz i meioz.
Metabolismul, de regul, se caracterizeaz prin respiraie
aerob. Celulele vegetale sunt autotrofe sau mixotrofe, iar cele
animale sunt heterotrofe.
Fig. 1.5. Schema celulei eucariote
16


Celulele organismelor pluricelulare se grupeaz formnd
esuturi, care alctuiesc organe cu funcii specifice n organism.

Metodele de studiu utilizate n cercetarea
celulelor

La studierea obiectelor mici apar dificulti, deoarece
capacitatea de rezoluie a ochiului omenesc este de ~0,1 mm
(100). De aceea, pe larg sunt utilizate metodele microscopice
i cele biochimice.
Microscopia n spectrul vizibil al luminii. Se
efectueaz cu ajutorul microscoapelor fotonice (optice). Pot fi
studiate organisme monocelulare, celule separate din culturi
celulare sau seciuni fine prin esuturi. Preparatele necesit a fi
fixate, apoi colorate n mod special. Mai rar se studiaz celule
vii. Spectrul vizibil al luminii cuprinde raze cu o lungime de
und = 400 700 nm, de aceea capacitatea de rezoluie
sporete pn la 200 350 nm (0,2 0,35).
Microscopia n ultraviolet (UV). Razele UV, avnd o
lungime de und mic ( = 260 280 nm), permit studierea
preparatelor cu o capacitate de rezoluie de 130 140 nm (0,13
0,14). Pentru realizarea studiului sunt necesare microscoape
cu lentile speciale, care permit trecerea razelor UV.
Microscopia n cmp ntunecat. Se realizeaz n
spectrul vizibil al luminii, la o iluminare lateral a obiectului.
Lumina nu trece prin obiectul de studiu, ci se reflect de la el.
Pot fi studiate celule vii. Capacitatea de rezoluie este sub 0,2.
Microscopia cu contrast de faz. Deoarece diferite
molecule i structuri celulare au o capacitate de refracie diferit,
pot fi studiate celule vii, fr o fixare i colorare prealabil.
17

Microscopia cu polarizare. Se utilizeaz pentru
studierea structurilor celulare care polarizeaz lumina (de ex.,
fusul de diviziune, miofibrilele).
Microscopia cu fluorescen. Fluorescena este
proprietatea unor compui chimici de a lumina n cazul
absorbiei luminii de o anumit lungime de und. Spectrul
luminii fluorescente este deplasat spre o lungime de und mai
mare. De exemplu, clorofila iluminat cu raze UV, apare de
culoare roie. Pot fi studiai de asemenea i ali pigmeni, ct i
vitamine, hormoni n celulele vii.
Microscopia histocitochimic. Se bazeaz pe fixarea i
colorarea specific a anumitor structuri sau molecule cu
colorani speciali (de ex., fuxina bazic pentru acizii nucleici;
sudanul negru pentru lipide etc.).
Citofotometria. Se efectueaz determinarea cantitii de
substane organice pe baza absorbiei luminii de o anumit
lungime de und specific pentru diferite clase de compui (de
ex., absorbia maxim pentru acizii nucleici = 260 nm;
pentru proteine = 280 nm).
Imunofluorescena. Permite studierea repartizrii
diferitor substane pe baza reaciilor imunochimice prin
utilizarea anticorpilor marcai cu ageni fluoresceni.
Autoradiografia. Iniial culturile celulare se cresc pe
medii speciale, care conin precursori radioactivi (nucleotide,
aminoacizi). Dup fixare i colorare, preparatele se acoper cu
un strat fin de emulsie fotografic, care permite identificarea
locurilor n care s-a incorporat precursorul radioactiv.
Microscopia electronic cu transmisie. Utilizeaz un
fascicul de electroni n locul luminii. Capacitatea de rezoluie
este de pn la 1, adic poate fi atins o mrire de 10
6
ori. Ca
obiecte de studiu servesc seciuni ultrafine prin preparatele
fixate i contrastate cu ageni speciali (sruri ale metalelor
grele).
18

Microscopia electronic cu scanare. Se caracterizeaz
prin obinerea imaginilor n volum, obiectul cercetat fiind
acoperit cu un strat subire de metal (Au). Puterea de rezoluie
este mai mic dect cea a microscopiei electronice cu
transmisie, ns poate fi evideniat configuraia exact a
structurii analizate.
Fracionarea componentelor celulare. Celulele
cercetate se distrug prin omogenizare mecanic sau cu
ultrasunet. Fraciile de organite se pot separa fie prin
centrifugare la diferite viteze, fie prin centrifugare utiliznd
gradiente de concentraie.
Analiza biochimic. Celulele, esuturile i lichidele
corpului pot fi analizate pe cale biochimic, punnd n eviden
componentele proteice, lipidice, glucidice.
Analiza molecular-genetic. Se realizeaz studiul
moleculelor de acizi nucleici n ce privete numrul de copii a
genelor per genom, nivelul de transcripie, structura primar,
detecia mutaiilor. Tehnicile de biologie molecular sunt bazate
pe manipulrile ADN-ului recombinat.

Unele realizri importante n biologia celulei

1590 Jansen a inventat microscopul, cu care mrirea
imaginii se realiza prin unirea a dou lentile
1665 Robert Hook, utiliznd un microscop perfecionat, a
studiat structura plutei i pentru prima dat a utilizat
termenul de celul pentru descrierea unitilor
structurale, din care sunt constituite acest esut.
1650
1700
Antoni van Leeuwenhoeck cu ajutorul unor lentile
simple bine lefuite (x200) a examinat embrioni i
diferite organisme unicelulare, inclusiv bacterii.
Pentru prima dat bacteriile au fost descrise n 1676.
1827 Dolland a mbuntit calitatea lentilelor, astfel a
19

crescut mult interesul fa de microscop.
1831
1833
Robert Brown a descris nucleul ca un corpuscul
sferic ce se prezint n celulele vegetale.
1838
1839
Botanistul Schleiden i zoologul Schwann au mbinat
ideile diferitor cercettori i au formulat teoria
celular, postulatul de baz al creia era, c unitatea
structural i funcional de baz a organismelor vii
este celula.
1840 Purkinje a propus denumirea de protoplasm pentru
coninutul celular, fiind convins c anume ea (dar nu
pereii celulari) reprezint substana vie. Mai trziu a
fost introdus termenul de citoplasm (citoplasma +
nucleu = protoplasma).
1855 Virchov a demonstrat c celulele se formeaz din alte
celule prin diviziune celular.
1866 Haeckel a determinat c pstrarea i transmiterea
caracterelor ereditare o realizeaz nucleul.
1866
1888
A fost studiat minuios diviziunea celular i au
fost descrii cromozomii.
1890 Au fost descoperite mitocondriile.
1898 A fost descoperit aparatul Golgi.
1887
1900
Perfecionarea microscopului, a metodelor de fixare,
colorare i preparare a seciunilor. Una din ramurile
citologiei devine citogenetica, ce studiaz rolul
nucleului n transmiterea informaiei ereditare.
Anii
1930
Apare microscopul electronic, ce permite posibiliti
mult mai mari n vizualizarea structurilor celulare.
Din
1946
Microscopul electronic este foarte rspndit n
biologie, ceea ce a permis cercetarea ultrastructurii
celulei.
1950 Descoperirea ribozomilor de savanii A. Claude,
K.R.Porter, G. Palade.

20

Verificarea cunotinelor:

1. Definii noiunile: sistem biologic, celul, virus, eucariote,
procariote, prion, autoreproducere.
2. Care este obiectul de studiu al biologiei moleculare?
3. Care sunt proprietile fundamentale ale sistemelor
biologice?
4. Care sunt nivelele de organizare a materiei vii?
5. Care sunt metodele de studiu a sistemelor biologice?
6. Care sunt particularitile celulelor eucariote?

21



ORGANIZAREA CHIMIC A MATERIEI VII

Elementele chimice cel mai frecvent ntlnite n materia vie
sunt H, C, N, O, P, S (numite elemente organogene) care
reprezint n medie 99% din masa organismelor i stau la baza
unui numr impuntor de compui, caracterizai printr-o
stabilitate nalt i interaciune lent ntre ele cu apa sau ali
componeni celulari. n tabelul 2.1este prezentat compoziia
elementar a unuia dintre cele mai studiate organisme vii
bacteria Escherichia coli.

Tabelul 2.1. Compoziia elementar a E. coli (concentraia
procentual raportat la masa uscat)
Elementul % Elementul %
C 50 K 1
O 20 Na 1
N 14 Ca 0,5
H 8 Mg 0,5
P 3 Cl 0,5
S 1 Fe 0,2

n compoziia materiei vii se conin att molecule
organice, ct i anorganice. n tabelul 2.2. sunt expuse
principalele tipuri de molecule i numrul aproximativ de
molecule per celul.

22

Tabelul 2.2. Compoziia molecular a organismelor vii
Substane din celula bacterian
% din masa
total a celulei
Numrul
tipurilor de
molecule
Ap 70 1
Ioni neorganici 1 20
Hidrai de carbon i precursorii lor 1 250
Aminoacizi i precursorii lor 0,4 100
Nucleotide i precursorii lor 0,4 100
Acizi grai i precursorii lor 1 50
Alte molecule mici 0,2 ~ 300
Macromolecule (proteine, acizi nucleici,
polizaharide)
26 ~ 3000

Componenta neorganic a organismelor vii

Apa i rolul ei n organismele vii
ntre componenii neorganici ai celulei cea mai ntlnit
este apa. Molecula de H
2
O reprezint un dipol electric, ceea ce
n mare msur determin proprietile sale unice i funciile de
baz care sunt enumerate n continuare.
Proprietatea de solvent. Moleculele solubile n H
2
O se
numesc hidrofile. La ele se refer compuii ionici (de ex.,
sruri, acizi, baze) care n ap disociaz n ioni, ct i unii
compui organici posesori ai unor grupuri funcionale
purttoare de sarcin (alcooli, glucide). Moleculele nepolare nu
se combin cu apa i sunt numite hidrofobe (de ex., grsimi).
n rezultatul combinrii apei cu diferite substane se pot
obine urmtoarele sisteme:
Soluii se obin la dizolvarea substanelor (de ex., ap +
sare, ap + zahr);
Suspensii se obin la combinarea apei cu substane
insolubile solide, care, n dependen de densitatea lor, se
las la fund sau se ridic la suprafa (de ex., ap + nisip, ap
+ sulf);
23

Emulsii se obin la combinarea apei cu substane
insolubile lichide. Fazele se separ prin decantare (de ex.,
ap + ulei; laptele);
Soluii coloidale se obin la combinarea apei cu substane
cu greutate molecular mare; decantarea nu are loc (de ex.,
albuul de ou ap + proteine).
Coeziune. Reprezentnd dipoli, moleculele de H
2
O se
lipesc ntre ele datorit legtorilor de hidrogen. Aceasta
determin temperatura nalt de evaporare i tensiunea
superficial nalt.
Adeziunea. Este capacitatea moleculelor de ap de a se
uni cu alte molecule. Aceasta provoac, n special, fenomenele
capilare, pe baza crora apa se ridic n sus prin tuburile
ultrasubiri.
Apa i reaciile chimice. Fiind un bun solvent, apa
prezint un mediu ideal pentru desfurarea diferitor reacii
chimice. Concomitent ea particip n unele procese chimice (de
ex., reacii de hidroliz, fotosintez). n celule apa se formeaz
n rezultatul respiraiei aerobe.
Capacitatea termic a apei. Datorit adeziunii
moleculelor, apa are o capacitate termic foarte nalt (este
necesar o cantitate mare de energie pentru a-i schimba
temperatura). Aceast proprietate face posibil existena vieii n
ap i explic stabilitatea celulelor n diferite condiii termice.

Substanele minerale
n dependen de coninutul n organe i necesitile
diurne, substanele minerale se clasific n trei grupuri:
macroelemente (K, Na, Ca, Mg, Cl, P, S), microelemente (Cu,
Co, Bi, I, Zn, Mn, Mo) i ultramicroelemente (U, Ra, Au, Ag,
Ce). Rolul substanelor minerale este divers. Ele particip la
meninerea presiunii osmotice (NaCl), asigur stabilitatea valorii
pH (Na+, K+, Cl-, H+), ndeplinesc funcii de susinere (Ca, P
24

intr n componena oaselor), asigur potenialul membranar de
repaus i cel de aciune (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-),
ndeplinesc funii de cofactori enzimatici (Mg2+, Mn2+), au rol
important n procesul de respiraie (Fe, Cu) i fotosintez (Mg).

Componenta organic a materiei vii
Organismele vii se caracterizeaz printr-o varietate mare
de substane organice dintre care putem deosebi patru clase
principale: hidrai de carbon (glucide), lipide (grsimi), proteine,
acizi nucleici. Substanele organice pot fi reprezentate prin
substane simple i polimeri.
Moleculele organice mici sau substanele simple prezint
compui cu masa molecular de la 100 la 1000 i conin pn
la 30 de atomi de carbon. Astfel de molecule de obicei se gsesc
n stare liber n citoplasm, fiind reprezentate de produse
intermediare ale cilor metabolice, care, la rndul su, pot sta la
baza formrii macromoleculelor.
Macromoleculele sau biopolimerii sunt substane cu
masa molecular mare, au funcii definite n celule i sunt
programate genetic. Toi polimerii sunt formai din monomeri,
unii n rezultatul reaciilor de polimerizare prin legturi
covalente. Scindarea lor are loc prin reacia de hidroliz.
Polimerii formai dintr-un singur tip de monomeri poart
denumirea de homopolimeri (celuloza, amidonul).
Homopolimerii se deosebesc ntre ei prin greutatea molecular
(numrul de resturi monomerice) i gradul de ramificare a
moleculelor. Ei ndeplinesc funcii structurale (celuloza), de
rezerv (amidon, glicogen), de semnalizare (receptorii celulari).
Polimerii formai din mai multe tipuri de monomeri se
numesc copolimeri sau heteropolimeri (ADN, ARN, proteine).
Diversitatea copolimerilor este asigurat de numrul, tipul i
modul de aranjare a monomerilor, toate fiind programate
genetic.
25

Hidraii de carbon.
Formula care caracterizeaz toi hidraii de carbon este
Cx(H2O)y, unde x i y pot avea diferite valori mai mari ca 3.
Dup numrul de resturi monomerice hidraii de carbon se
mpart n monozaharide, dizaharide, oligozaharide i
polizaharide.
Monozaharidele. Au formula general (CH2O)n, unde
9>n>3. n dependen de numrul de atomi de carbon deosebim:
trioze, tetroze, pentoze, hexoze etc.
- Trioze (C
3
H
6
O
3
) gliceraldehida, dihidroxiacetona sunt
compui intermediari importani n cile metabolice de
sintez i scindare.
- Pentoze (C
5
H
10
O
5
) riboza, ribuloza, dezoxiriboza. Riboza
i dezoxiriboza intr n compoziia acizilor nucleici, ATP,
NAD, NADP, FAD, FMN, CoA.
- Hexoze (C
6
H
12
O
6
) glucoza, fructoza, galactoza
reprezint surse importante de energie. Servesc n calitate de
monomeri n sinteza dizaharidelor (2 monomeri),
oligozaharidelor (pn la 10 monomeri) i a polizaharidelor
(peste 10 monomeri).
Dizaharidele. Dizaharidele se formeaz prin reacia de
condensare ntre 2 molecule de monozaharide, mai frecvent 2
hexoze. Legtura dintre monomeri se numete legtur
glicozidic.
Cele mai frecvente dizaharide sunt:
Maltoza (-glucoz + -glucoz)
Zaharoza (-glucoz + -fructoza)
Lactoza (-galactoza + -glucoza)
Polizaharidele. Reprezint molecule formate dintr-un
numr mare de resturi monomerice, unite prin legturi
glicozidice. Cel mai frecvent polizaharide sunt formate din
resturi de glucoz. Funciile principale ale polizaharidelor sunt
cele structurale (celuloza) i de depozitare (glicogen, amidon).
26

Lipidele
Lipidele sunt substanele organice insolubile n ap, dar
solubile n solveni nepolari (cloroform, eter, benzen). Conform
importanei fiziologice lipidele se mpart n: lipide de rezerv i
lipide structurale. Lipidele structurale particip la formarea
membranelor biologice, nveliurilor protectoare. n calitate de
exemple de lipide structurale pot servi sterolii i fosfolipidele, care
au rol major n realizarea ultrastructurii funcionale a celulei.
Funciile lipidelor:
- energetic la scindarea 1g lipide se degaj 39,1 kJ;
- structural n componena membranelor celulare
(fosfolipidele, colesterolul);
- de emulsionare emulgatorii se orienteaz la limita
ap-ulei, stabilizeaz emulsia, mpiedic stratificarea
lor (fosfogliceridele, acizii biliari - emulgatori pentru
acilgliceroli n intestin);
- mecanic protejeaz organele de lezri mecanice;
- termoizolatoare pstreaz cldura (esutul adipos
subcutanat);
- de solveni pentru alte substane de natur lipidic
(acizii biliari pentru vitaminele liposilubile);
- hormonal - toi steroizii (hormonii sexuali, hormonii
corticosuprarenali) sunt de natur lipidic;
- vitaminic - vitaminele liposolubile (acizii grai
nesaturai: A, D, E, K).

Proteinele
Proteinele sunt principalele molecule funcionale din
celule i sinteza lor este determinat genetic. Aceti compui
organici sunt alctuii din una sau mai multe catene de
aminoacizi, plicaturate i spiralate ntr-o structur spaial,
tridimensional, care le confer funciile lor biologice.
27

Monomerii
moleculelor proteice sunt
aminoacizii. Fiecare
aminoacid este format
dintr-o regiune constant,
comun pentru toi
aminoacizii i o regiune
variabil, care se
deosebete la diferii
aminoacizi (fig. 2.1).
Regiunea constant
conine la rndul su
grupele carboxil i amino
legat la atomul de carbon din poziia o. n dependen de
structura regiunii variabile aminoacizii pot fi acizi, bazici sau
neutri. Din cei peste 150 de aminoacizi cunoscui n natur, n
componena proteinelor intr doar 20 -aminoacizi.
ntre grupele funcionale ale aminoacizilor pot aprea
diferite legturi chimice. Cele mai frecvente sunt legturile
peptidice, care apar la interaciunea grupei o-carboxil a unui
aminoacid cu grupa o-amino din alt aminoacid. Aceste legturi
sunt nite legturi covalente trainice, determinnd formarea
Fig. 2.1. Structura general a
aminoacidului
Fig. 2.2. Structura primar a proteinelor
28

structurii primare a proteinei. Destul de numeroase sunt
legturile de hidrogen, care apar la interaciunea atomilor de
hidrogen din grupele OH sau NH cu oxigenul din grupa C=O.
Aceste legturi sunt destul de slabe, dar datorit numrului lor
mare formeaz structuri stabile. Dintre alte tipuri de legturi pot
fi specificate punile disulfidice, legturile ionice, legturile
hidrofobe etc.
Proteinele se caracterizeaz prin mai multe nivele de
organizare. Cel mai simplu nivel de organizare este structura
primar. Structura molecular a acestui nivel de organizare este
realizat cu ajutorul legturilor peptidice (fig. 2.2). n
dependen de numrul de aminoacizi din caten pot fi deosebite
dipeptide (2 aminoacizi), tripeptide (3 aminoacizi), oligopeptide
(pn la 10 aminoacizi), polipeptide (peste 10 aminoacizi). Se
consider c cea mai scurt protein conine 51 de aminoacizi.
Cu toate acestea, exist numeroase polipeptide naturale cu o
lungime mai scurt i care ndeplinesc diverse funcii n celule.

Fig. 2.3. Structura secundar a proteinelor. A formarea -spiralelor; B
reprezentarea grafic a -spiralelor; C schema formrii -structurilor; D
reprezentarea grafic a -structurilor
29

Urmtorul nivel de organizare a proteinelor, structura
secundar, este realizat cu ajutorul legturilor de hidrogen.
Structura secundar se caracterizeaz prin formarea diverselor
conformaii spaiale. Cele mai frecvente sunt -spiralele. ntr-o
spir se conin 3,6 resturi de aminoacizi. O alt conformaie este
reprezentat de -structuri, care apar la interaciunea a 2 regiuni
mai ndeprtate ale aceleai molecule, sau ntre molecule diferite
(fig. 2.3). Unele proteine cu structur fibrilar (de ex.,
colagenul) au conformaia spaial determinat de structura
secundar.
Un nivel superior conformaional, caracteristic
proteinelor globulare, este reprezentat de structura teriar o
alternare a -spiralelor, -structurilor i a regiunilor
nestructurate (fig.
2.4). Structura
teriar este asigurat
de legturile de
hidrogen care apar
ntre diverse grupe
funcionale din
radicali, ct i de
punile disulfidice,
legturile hidrofobe,
care apar ntre radicalii hidrofobi, legturile ionice etc. Unele
proteine cu structur teriar pentru a deveni active
interacioneaz cu molecule neproteice (de ex., hemul n
molecula de mioglobin pentru transportarea oxigenului).
Nivelul cel mai complicat de organizare a proteinelor
este reprezentat de structura cuaternar. n astfel de molecule
se conin cteva lanuri polipeptidice, care pot fi identice, sau
diferite. Astfel, n molecula de hemoglobin se conin 2 catene
de -globin i 2 catene de -globin (fig. 2.5). Structura
Fig. 2.4. Structura teriar a proteinei. A - Schema
alternrii -spiralelor i -structurilor; B Structura
globinei
30

cuaternar este determinat de legturile hidrofobe, legturile de
hidrogen i cele ionice.
Structurile teriar i
cuaternar asigur formarea
centrilor activi ai proteinelor,
regiuni prin care moleculele
proteice interacioneaz cu alte
molecule. O deosebit
importan o au centrii activi ai
enzimelor, care catalizeaz
modificarea substratului.
Aminoacizii care particip la
realizarea structurilor
tridimensionale, spaiale,
biologic active sunt deosebit de importani, formnd situsuri
funcionale. Substituirea lor ca rezultat al mutaiilor, duce la
pierderea activitii proteinei. Acelai fenomen pentru
aminoacizii, neimplicai n legtulile spaiale, este mai puin
important.
Secvena aminoacizilor dintr-o protein reprezint
elementul esenial al structurii sale, deoarece:
- este unic, constant i specific fiecrei proteine;
- determin caracterul ei funcional;
- este specific pentru o anumit specie;
- este determinat genetic (de informaia ereditar coninut n
ADN).
Sub aciunea diferitor factori ai mediului, legturile
dintre atomi se pot rupe, ceea ce duce la denaturarea proteinei.
Denaturarea poate surveni sub aciunea factorilor fizici
(temperatur, radiaie, factori mecanici), chimici (acizi, baze,
sruri ale metalelor grele). Denaturarea poate fi reversibil, dac
la nlturarea factorului proteina revine la structura iniial i i
poate ndeplini funciile i ireversibil, dac n rezultatul
Fig. 2.5. Structura cuaternar a
hemoglobinei
31

denaturrii proteina nu-i poate restabili structura i funcia.
Ruperea legturilor peptidice ntotdeauna duce la denaturare
ireversibil.
Dup compoziia chimic toate proteinele se mpart n
proteine simple i proteine conjugate.
Proteinele simple (holoproteinele) formeaz n urma
hidrolizei doar aminoacizi. Ele includ: proteinele globulare,
solubile n ap (de ex., histonele, actina, tubulina, majoritatea
enzimelor) i proteinele fibrilare majoritatea insolubile n ap
(de ex., keratina, colagenul, fibrina, laminina etc.).
Proteinele conjugate (heteroproteide) rezult din
combinaia unei proteine simple cu o alt substan sau grup
prostetic. Prin hidroliz se obin aminoacizi i un compus
neproteic: nucleoproteidele, glicoproteidele, lipoproteidele,
metaloproteidele etc.
Proteinele reprezint suportul biochimic al caracterelor,
realiznd urmtoarele funcii majore:
- catalitic accelerarea transformrilor chimice (ATP-
sintetaza, ADN-polimeraza);
- hormonal reglare a metabolismului (insulina);
- de recepie fixarea hormonilor, mediatorilor la suprafaa
membranei celulare sau n interiorul celulei (glicoforina);
- de transport (pompa Na
+
/K
+
, hemoglobina, mioglobina
transportarea oxigenului);
- structural intr n componena tuturor
compartimentelor celulare i extracelulare;
- de sprijin, mecanic determin forma i motilitatea
celular (colagenul, tubulina, actina);
- imunologic anticorpii (IgA, IgM, IgG) inactiveaz
antigenele;
- de dezintoxicare grupele funcionale ale proteinelor
leag metalele grele, alcaloizii (de ex.: albuminele);
32

- homeostatic formarea trombilor n procesul coagulrii
sngelui (fibrinogenul);
- de substrat energetic la scindarea 1g de protein se
degaj 17,1 kJ de energie.

ACIZII NUCLEICI
Acizii nucleici sunt biopolimeri reprezentai n celule
prin acid dezoxiribonucleic (ADN) i acid ribonucleic (ARN).
n calitate de monomeri servesc nucleotidele. Ambele tipuri de
molecule poart sarcin negativ i migreaz n cmpul electric
spre polul pozitiv. La fel ca i proteinele, acizii nucleici au
cteva nivele de organizare conformaional.

Acidul dezoxiribonucleic
Moleculele de ADN sunt alctuite din
dezoxiribonucleotide (fig. 2.6).
Fig. 2.6. Dezoxiribonucleozidtrifosfai monomeri ai ADN
33

n calitate de baze azotate n componena nucleotidelor
servesc adenina (A) i guanina (G) baze purinice, timina (T)
i citozina (C) baze pirimidinice. Pentoza din ADN este
reprezentat de 2-dezoxiriboz. Bazele pirimidinice se unesc de
pentoz prin N
1
, iar cele pirimidinice prin N
9
. Pentru a preveni
ambiguitatea n enumerarea atomilor n bazele azotate i
pentoz, atomilor din dezoxiriboz li se adaug prim ('). O baz
azotat mpreun cu pentoza formeaz nucleozidul (adenozina,
guanozina, timidina, citidina). La adugarea acidului fosforic se
obine nucleotidul.

Denumirea nucleotidelor provine de la baza azotat i
numrul de resturi de acid fosforic. Dac se conine un rest
Fig. 2.7. Structura primar a ADN polinucleotid (Secvena
de nucleotide unite prin legturi fosfodiesterice 3 5)
34

5' 3'
3' 5'

fosfat nucleozid monofosfat (de ex., dAMP dezoxiadenozin


monofosfat), dou resturi nucleozid difosfat (dADP
dezoxiadenozin difosfat), trei nucleozid trifosfat (dATP
dezoxiadenozin trifosfat). Resturile de acid fosforic se unesc la
captul 5' al dezoxiribozei i se numeroteaz prin , , .
Nucleotidele se unesc ntre ele prin legturi
fosfodiesterice n urma nlturrii resturilor fosforice i .
Captul 3' al unei dezoxiriboze este unit cu captul 5' al alteia
printr-un rest de acid fosforic, formnd lanuri polinucleotidice.
Secvena polinucleotidic (ordinea nucleotidelor n caten)
constituie structura primar a ADN (fig. 2.7). Ordinea
nucleotidelor este arbitrar, ceea ce permite obinerea unui
numr mare de molecule. Un capt al moleculei are liber grupa
P~P~P-5', iar al capt grupa 3'-OH, de aceea catena de ADN
este direcionat 5'3'.
Moleculele de ADN se caracterizeaz prin existena
structurii secundare specifice dublul helix, modelul cruia a
fost propus i argumentat n 1953 de James Watson i Francis
Crick. Molecula de ADN reprezint dou catene
polinucleotidice antiparalele , unite ntre ele prin legturi
de hidrogen, care apar la nivelul grupelor funcionale
din bazele azotate (fig. 2.8; fig. 2.9).
Fig. 2.8. Formarea legturilor complementare ntre bazele
azotate
35

S-a constatat c legturile apar ntre o baz purinic i
una pirimidinic. Legitatea prin care Adenina se unete cu
Timina prin 2 legturi de hidrogen, iar Guanina cu Citozina
prin 3 legturi de hidrogen poart denumirea de principiul
complementaritii (fig. 2.8).

Fig. 2.9. Structura secundar a ADN: 2 catene
complementare antiparalele
36

Aceast regul este universal, comun pentru toate
organismele vii i st la baza proceselor genetice fundamentale
replicaia i transcripia. Aceste legiti au fost observate pentru
prima dat de Erwin Chargaff, care a dedus c cantitatea de
Adenin este aproximativ egal cu cea de Timin, iar cantitatea
de Guanin cu cea de Citozin.
Deoarece legturile fosfodiesterice confer flexibilitate,
este posibil rotirea fiecrei perechi de baze cu ~36 n jurul
axei relative a helixului. Astfel, ntr-o spir complet (360)
ncap ~10 nucleotide. Rotirea unei catene n jurul alteia face ca
dublul helix s conin un an mare (cu un diametru de ~20 )
i un an mic (~12 ) (fig. 2.8; fig. 2.10).
Complementaritatea bazelor azotate (A=T i GC)
determin:
stabilitatea moleculei ADN;
mecanismul replicrii;
mecanismul transcripiei;
mecanismul recombinrii;
mecanismul reparrii leziunilor ADN.
Faptul c catenele ADN sunt antiparalele explic
mecanismul replicrii moleculelor de ADN, funcie prin care
este conservat informaia genetic n succesiunea generaiilor
de celule i indivizi.
n anumite condiii legturile de hidrogen dintre catene
se pot rupe, provocnd astfel denaturarea ADN. n calitate de
factori de denaturare servesc acizii, bazele i temperaturile
nalte. Cu ct o molecul este mai lung, sau conine mai multe
perechi GC fa de A=T, cu att molecula este mai stabil.
Dup denaturarea prin nclzire, la rcirea lent molecula poate
s renatureze prin restabilirea legturilor complementare ntre
bazele azotate. n cazul rcirii brute (de ex., introducerea
eprubetei n baie cu ghea) renaturarea n-are loc i moleculele
rmn monocatenare.
37

Structura secundar a ADN este reprezentat de mai
multe tipuri de spirale, care se deosebesc prin nclinarea bazelor
azotate fa de axa central, numrul de baze azotate ntr-o spir
complet, direcia rsucirii catenelor i ca rezultat
proprietile ADN. Se cunosc mai multe forme rsucite spre
dreapta, dintre care cel mai des se ntlnesc formele A, B, C.
Exist i o form rsucit spre stnga forma Z (tab. 2.3).

Tabelul 2.3. Parametrii unor forme de ADN

Parametrii helixului A
ADN
B
ADN
Z
ADN
Sensul helixului Dreapta Dreapta Stnga
Numrul de baze n spir 11 10,4 12
Distana dintre baze () 2,9 3,4 3,7
Diametrul moleculei () 25,5 23,7 18,4
Incidena cea mai nalt se remarc pentru forma B, care
este constatat n toate celulele (fig. 2.10). Anume forma B de
ADN a determinat modelul
Watson-Crick. Totodat, dup
cum s-a stabilit, n cadrul formei
B mai pot exista unele devieri n
ce privete numrul de
nucleotide per spir i care
poate varia n limitele 10,0
10,6.
Forma mai compact de
tip A este caracteristic n
special pentru moleculele de
ARN. Totodat, s-a constatat c
hibrizii ADN/ARN, de
asemenea, se caracterizeaz prin
forma A de conformaie.
Aceasta are o mare importan
Fig. 2.10. Structura moleculei de ADN,
forma B
38

n procesul de replicaie, cnd pentru iniierea sintezei fiecrei
catene se utilizeaz un primer ARN.
Forma Z se deosebete mult de toate celelalte n primul
rnd prin direcia de rotire a helixului. Denumirea provine de la
forma zig-zag a acestei conformaii. O alt caracteristic este
existena unui singur an, ceea ce o determin ca purttoare a
unei sarcini negative mai mari. Forma Z poate s se formeze in
vitro la o concentraie sporit de sruri n regiunile unde
alterneaz o purin cu o pirimidin (de ex.,
} {
} {
CG
GC
d sau
} {
} {
TG
AC
d ).
Se consider c forma Z se ntlnete i n sistemele in vivo n
cazul metilrii ADN-ului.
n toate sistemele in vivo moleculele de ADN sunt
cuplate cu proteine prin legturi de hidrogen sau electrostatice,
rezultnd o structur supramolecular structura teriar.
Proteinele au roluri diverse n complexele cu ADN: particip la
compactizare (histone), controleaz replicarea (ADN-
polimeraza) i transcripia (ARN-polimeraza, factori de
transcripie), particip la repararea moleculelor lezate (ADN-
ligaza). Avnd proprieti acide, moleculele de ADN se
asociaz cu proteine bazice, formnd nite complexe stabile. La
eucariote aceste proteine poart denumirea de histone. La
formarea structurii teriare particip histonele H1, H2A, H2B,
H3, H4. Structura care
se formeaz n urma
rsucirii ADN-ului n
jurul unui miez proteic
poart denumirea de
nucleozom mod de
organizare a ADN-
ului nuclear al
eucariotelor (fig.
2.11). La procariote
ADN-ul are form de
Fig. 2.11. Nucleozomul structura
teriar a ADN
39

inel. Datorit tensiunii intramoleculare ADN-ul procariotic, de
obicei, are form de supraspiral i este asociat cu proteine
bazice (fig. 2.12).

Proprietile moleculelor de ADN
Structura unical a ADN-ului determin i proprietile
unicale, cum ar fi autoreproducerea (replicarea) i autoreparaia.
Structura chimic i sarcina electric negativ asigur
interaciuni cu alte molecule, prezentnd posibiliti funcionale
diverse.
Replicarea reprezint sinteza unor molecule noi, identice
cu molecula iniial pe baza structurii secundare.
Reparaia este proprietatea ADN-ului de a-i restabili
secvena de nucleotide n cazul leziunilor. Se bazeaz pe
principiul complementaritii i previne apariia mutaiilor.
Denaturarea (topirea ADN) este ruperea legturilor de
hidrogen ntre catenele complementare; renaturarea
restabilirea structurii bicatenare proprieti importante n
procesele de replicare, reparare i transcriere, ct i n
manipularea ADN-ului in vitro;
Spiralizarea (fig. 2.11),
superspiralizarea (fig. 2.12),
despiralizarea sunt
proprietile dublului helix i
determin trecerea
macromoleculei de ADN de la
o stare funcional la alta.
Heterogenitatea secvenelor de ADN se exprim prin
aranjarea aperiodic a bazelor n molecul, unele secvene de
nucleotide se ntlnesc cu frecven diferit de-a lungul
moleculei de ADN ( 1 =

=
C G
T A
);
Fig. 2.12. Supraspiralizarea moleculelor
de ADN inelar
40

Flexibilitatea ADN este capacitatea dublului helix de a
trece de la o form conformaional la alta de ex.: trecerea de
la forma B la forma A se asociaz cu activarea ADN-ului pentru
transcripie, iar trecerea la forma Z cu inactivarea secvenei.

Funciile ADN-ului
ADN-ul deine, pstreaz, transmite i realizeaz
informaia genetic. Secvena (succesiunea) nucleotidelor din
molecula de ADN reprezint informaia ereditar codificat.
Codul genetic este universal pentru toate organismele vii i
determin succesiunea aminoacizilor n protein. Mecanismul de
transmitere a mesajului genetic este determinat de structura
bicatenar, complementaritate i se realizeaz n timpul
replicrii ADN, urmat de mitoz sau meioz. n procesul de
transcripie de pe ADN se sintetizeaz trei tipuri de ARN ce
particip la sinteza matricial a proteinelor. Proteinele sunt
substratul molecular a tuturor caracterelor i proprietilor unui
organism.

Heterogenitatea ADN-ului la eucariote
n urma investigaiilor s-a constatat c cantitatea de
ADN din celule este cu mult mai mare dect necesar. Acest
fenomen a fost numit paradoxul mrimii care se caracterizeaz
prin urmtoarele:
exist un exces de ADN n comparaie cu cantitatea necesar
pentru a codifica totalitatea proteinelor din organism;
exist variaii mari n ce privete cantitatea de ADN ntre
speciile care nu se deosebesc esenial din punct de vedere
structural; de exemplu: la diferite specii de amfibieni care nu se
deosebesc mult, mrimea genomului variaz n limitele 10
9
-10
11

pb (perechi baze nucleotide).
n dependen de reprezentativitate ADN-ul nuclear la eucariote
se clasific n mai multe categorii:
41

- secvene unicale 45-56%;
- secvene moderat repetitive 8-30%;
- secvene nalt repetitive 12-25%.
Tipurile de secvene pot fi determinate n rezultatul
ciclurilor de denaturare/renaturare a ADN-ului. Secvenele nalt
repetitive renatureaz rapid, cele moderat repetitive mai ncet,
iar cele nerepetitive (unicale) cel mai ncet.
Secvenele nerepetitive se ntlnesc n genom ntr-o
singur copie i, de obicei, reprezint gene, care determin
sinteza moleculelor ARNm. Lungimea total a secvenelor
nerepetitive este de ~2 x 10
9
pb.
Secvenele repetitive sunt cele care se repet n genom
de dou sau mai multe ori. Ele pot fi de dou tipuri: secvene
moderat repetitive i secvene nalt repetitive.
Secvenele moderat repetitive au o lungime total de
pn la 6 x 10
5
pb. Lungimea lor individual variaz n limite
mari, iar secvenele respective se repet n mediu de 350 ori.
Secvenele moderat repetitive formeaz familii de secvene, spre
exemplu genele pentru histone sau genele pentru ARNr. n
genomul uman cea mai mare parte de ADN moderat repetitiv
exist n form de secvene cu o lungime de ~300 pb, repartizate
ntre secvenele nerepetitive - familia Alu.
Secvenele nalt repetitive reprezint nite succesiuni
scurte de nucleotide (cteva zeci, mai rar sute de nucleotide),
care se repet de sute de mii de ori n genom i, de regul, nu se
transcriu. Datorit secvenei scurte care se repet ele se mai
numesc secvene simple de ADN sau ADN satelit. Prin tehnici
de hibridare s-a constatat c ADN satelit este localizat n
regiunile de heterocromatin, n deosebi, lng centromer. O
clas special de satelii o reprezint minisateliii repetri de
pn la 50 ori a unor secvene scurte. Aceste secvene sunt
foarte variabile ca lungime la diferite persoane i permit
identificarea molecular a indivizilor.
42

O clas special de secvene nalt repetitive este
reprezentat de palindromi. Palindromii reprezint succesiuni
de nucleotide inversate, care au proprietatea de a se uni
complementar pe aceeai caten, formnd agrafe sau bucle n
moleculele monocatenare de ARN sau ADN i structuri n form
de cruce n moleculele bicatenare de ADN (fig. 2.13). Aceste
secvene asigur interaciunea cu proteinele (de ex., reprezint
situsuri pentru enzimele de restricie sau suprafee de contact cu
proteinele iniiatoare ale transcripiei, replicaiei, semnal de
terminare a transcripiei).


Acizii ribonucleici
Molecule ARN sunt biopolimeri monocatenari, care
constau din nucleotide unite prin legturi fosfodiesterice 3
5. Spre deosebire de nucleotidele din componena ADN,
monomerii ARN-ului conin n calitate de pentoz riboza, iar
bazele azotate sunt Adenina, Guaniana, Citozina i Uracilul (U),
care substituie Timina din ADN (fig. 2.14). De regul,
Fig. 2.13. Structura palindromului n form de
cruce n molecula de ADN
43

moleculele de ARN sunt monocatenare, excepie fiind
moleculele de ARN viral, care pot fi i bicatenare.
Structura primar a moleculelor de ARN este
reprezentat de secvena nucleotidelor i determinat de
secvena de ADN, de pe care are loc transcrierea. Structura
secundar reprezint conformaia spaial a moleculei. Ea este
stabilizat cu ajutorul legturilor complementare care se
formeaz n cadrul aceleai catene datorit existenei secvenelor
inversate. Moleculele de ARN se pot asocia cu proteinele
specifice n scopul proteciei contra ARN-azelor (particulele
RNP ribonucleoproteice, care reprezint forma de export a
ARNm din nucleu n citoplasm) sau asigurrii funciei speciale
(ARNr n ribozomi).


n orice celul numrul moleculelor de ARN este mult
mai mare dect cel al moleculelor de ADN. Cantitatea de ARN
Fig. 2.14. Ribonucleozidtrifosfai monomeri ai ARN
44

variaz n dependen de perioada ciclului vital sau de tipul
esutului din care face parte. n celula exist mai multe tipuri
de ARN, dintre care cele mai reprezentative sunt ARN mesager
(informaional, matricial) ARNm, ARN ribozomal ARNr,
ARN de transport (de transfer) ARNt, ARN nuclear mic
(ARNsn), ARN heterogen nuclear.
ARNm se sintetizeaz n rezultatul transcripiei genelor
structurale i servete ca matri n procesul de sintez a
proteinelor. n celule exist o varietate mare de ARNm, care se
deosebete cantitativ i calitativ la diferite celule (vezi capitolul
9).
ARNr reprezint molecule cu lungime i succesiune de
nucleotide conservat (tab. 2.4), care fiind asociate cu proteine
formeaz ribozomii. ARNr particip la sinteza proteinelor,
asigurnd legtura dintre ribozom ARNm i ARNt.

ARNt sunt molecule mici, cu o lungime de ~80 baze,
care asigur transportul aminoacizilor spre ribozomi i
traducerea codului genetic. n celule se pot conine pn la 61
Tabelul 2.4. Tipuri de ARNr
Tipul
celulelor
Coeficie
ntul de
sedimen
tare
Lungim
ea
(baze)
Procariote
5S 120
16S 1540
23S 2900
Eucariote
5S 120
5,8S 160
18S 1900
28S 4700
45

tipuri de ARNt, sau cel puin 20 tipuri. Fiecare tip de ARNt este
capabil s transporte un singur tip de aminoacid. Structura
secundar a ARN de transport are o configuraie specific,
numit frunz de trifoi, format din trei bucle funcionale, care
se obin datorit secvenelor inversate de nucleotide (fig. 10.3).
ARNsn este reprezentat de secvene de cteva zeci de
nucleotide i intr n componena enzimelor ce catalizeaz
metabolismul acizilor nucleici (primaza, telomeraza,
splicesomul).
ARN heterogen nuclear este ntlnit doar la eucariote i
reprezint transcripii primari sau produii intermediari ai
processingului.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: polimer, monomer, structur primar,
structur secundar, polipeptid, nucleotid,
complementaritate, catene antiparalele, heterogenitate,
palindrom, nucleozom, histon, ARNm, ARNr, ARNt.
2. Care sunt constituenii chimici de baz ai materiei vii?
3. Care este rolul biologic al proteinelor?
4. Cum se formeaz structura primar i secundar a ADN?
5. Care este rolul sarcinii negative a acizilor nucleici?
6. Care sunt tipurile conformaionale ale helixului dublu?
7. Care sunt funciile i proprietile moleculelor de ADN?
8. Care este rolul biologic al ARN?


46







MEMBRANELE BIOLOGICE

Celulele ca sisteme biologice sunt delimitate de ambiant
prin membrane semipermeabile. Acestea asigur funciile:
- barier biologic;
- transport selectiv al ionilor i moleculelor;
- recepionarea i transmiterea semnalelor extracelulare i
intercelulare;
- suport pentru enzimele implicate n diferite procese
metabolice;
- compartimentalizare a mediului intern al celulelor eucariote;
- regleaz homeostazia intracelular i intercelular.
Fig. 3.1. Structura membranei plasmatice
47


Membranele biologice sunt formate din trei componente
moleculare de baz: lipide, care asigur funcia de barier
semipermeabil; proteine, ce asigur funcionalitatea
membranei; glucide cu rol de recunoatere i semnalizare.

Organizarea molecular a membranelor
Dup modul de aranjare a lipidelor i proteinelor cel mai
acceptat model este cel mozaico-fluid propus de Singer i
Nicolson (1972). Membrana celular e format dintr-un dublu
strat (bimolecular) lipidic strpuns total sau parial de proteine
(fig. 3.1). Acest model explic fluiditatea membranar, fuziunea
membranar, activitile enzimatice, proprietile electrice i
antigenice ale membranelor biologice.

Bistratul lipidic
Principalele lipide ntlnite n membranele celulare sunt
fosfolipidele (fosfogliceride i sfingolipide), colesterolul,
glicolipidele (situate spre exteriorul plasmalemei sau spre
lumenul organitelor) (fig. 3.2).

Fosfolipidele au structura amfifil avnd cap hidrofil
i coad hidrofob. Aceast proprietate permite aranjarea
specific a moleculelor de lipide la contactul cu apa: regiunea
hidrofil (polar) este ntotdeauna ndreptat spre ap, iar cozile
hidrofobe sunt maximal ndeprtare de ea. n cazul obinerii
emulsiilor moleculele lipidice formeaz nite structuri
globulare, numite micele, care respect aceeai regul de
dispunere a moleculelor (fig. 3.2, D). Structurile de tipul dublu
strat de lipide i glicolipide au tendina de a se nchide formnd
nite vezicule sferice, numite lipozomi. Deci, fosfolipidele se
48

pot autoasambla determinnd formarea barierelor ntre diferite
medii lichide. Totodat, membranelor le este caracteristic
fluiditatea, asigurat n mare msur de mobilitatea
fosfolipidelor care poate fi de mai multe tipuri:
- micarea n interiorul moleculei de fosfolipid;
- micarea ntregii molecule de fosfolipid;
- micarea de difuziune lateral, transversal, micarea
de rotaie n jurul axei longitudinale a moleculei;
- salturi extrem de rare de pe un strat pe altul (flip-
flop)
n consecin, bistratul lipidic are proprietate de barier
semipermeabil (doar unele molecule mici, nepolare,
liposolubile pot trece uor prin bistrat). Fosfolipidele sunt
heterogene i, interacionnd cu alte molecule (proteine,
glucide), asigur specificitatea funcional a membranelor.
Colesterolul din compoziia membranelor celulelor
animale asigur elasticitatea i rezistena mecanic, pstrarea
integritii celulei ca sistem biologic.
A B D
C
Fig. 3.2. Structura lipidelor membranare: A Structura moleculei de fosfatidilcolin
(fosfoglicerid); B Reprezenrarea grafic a fosfolipidelor; C Structura moleculei de
colesterol; D Structura micelei
49

Proteinele membranare
Proteinele constituie baza material a funciilor
principale ale membranei: transportul substanelor, cataliza unor
reacii biochimice, recepie. Cantitatea de proteine variaz la
diferite tipuri de celule. Astfel, n teaca de mielin proteinele
constituie 25% din greutate, n plasmalem n medie 50%, n
membrana intern a mitocondriei 75%. Dup localizare se
deosebesc dou categorii de proteine membranare (fig. 3.3):
- periferice (extrinseci) - sunt ataate la exteriorul stratului
dublu lipidic, unde interacioneaz n principal cu grupurile
polare ale lipidelor sau altor proteine.
- integrale (intrinseci) - ce trec prin stratul lipidic; aceste
proteine penetreaz parial sau total stratul dublu de lipide.
Proteinele care strbat bistratul lipidic de la o fa la alt se
numesc proteine transmembranare. Pot exista proteine cu
mai multe domenii transmembranare. Se consider c i
proteinele au poriuni hidrofile care proemineaz n afara
membranei pentru a contacta cu mediul apos i cu gruprile
polare ale fosfolipidelor. Partea hidrofob se gsete n interiorul
membranei i interacioneaz cu lanurile acizilor grai din
molecula fosfolipidelor.
Dintre proteinele membranei plasmatice ale eritrocitului
Fig. 3.3. Aranjarea proteinelor membranare
Citosol
50

pot fi menionate spectrina (asigur forma biconcav i
stabilitatea celulelor), glicoforina (are rol n recepia celular),
proteina banda 3 (meninerea i controlul pH al celulei).
Proteinele se pot deplasa i ele n cadrul membranelor.
Micrile lor sunt laterale, determinate de schimbarea
conformaiei spaiale. Totodat moleculele se pot roti n jurul
axei perpendiculare planului membranei.

Glucidele membranare
Glicolipidele i glicoproteidele formeaz un nveli periferic
la suprafaa celulelor animale numit glicocalix (fig. 3.4).
Funciile glicocalixului:
asigur recunoaterea i adeziunea intercelular servesc n
calitate de receptori moleculari;
asigur individualitatea celulei;
este un depozit de cationi;
ajut la orientarea corect a proteinelor n membran
Fig. 3.4. Structura glicocalixului
Citoso
l
51


Membrana plasmatic

Membrana plasmatic (membrana citoplasmatic,
plasmalema) are grosimea de 6-10 nm, separ celula de mediul
nconjurtor, permite desfurarea schimbului de substane
dintre celul i mediul extern, servete la comunicarea celulei
cu alte celule sau cu mediul nconjurtor.
Membrana plasmatic ndeplinete diverse funcii,
printre care evideniem:
- funcia de barier, prin delimitarea mediului intern al celulei
de cel extern;
- particip la metabolismul celulei, cataliznd procesul de
transport al substanelor i reglnd proprietile fizico-
chimice ale celulei (pH, presiune osmotic, potenial electric
etc.);
- controleaz fluxul de informaie dintre mediul extern i
celul, prin recepia i transmiterea semnalelor din mediu;
- intervine n recunoaterea i adeziunea celular;
- funcia de protecie imunologic a celulei i a organismului.

Particularitile membranelor interne
Membranele organitelor sunt asemntoare cu structura
membranei plasmatice. n funcie de tipul organitului difer
cantitatea de proteine i lipide. O caracteristic a membranelor
interne este lipsa glicocalixului, sau prezena acestuia orientat
spre lumenul organitelor (n reticulul endoplasmatic, aparatul
Golgi).
Reticulul endoplasmatic se caracterizeaz prin coninutul
nalt de enzime care particip la procesele de biosintez a
diferitor clase de substane. Totodat, n RE rugos are loc
mbogirea permanent cu proteine hidrofobe, care se
integreaz n membran i, ulterior, se transport la locul de
52

destinaie.
Veziculele endocitare i cele de secreie conin n
cantiti mari proteina clatrina, care faciliteaz procesul de
endocitoz sau, respectiv, exocitoz.
n cadrul organitelor bimembranare membranele intern
i extern se deosebesc att dup compoziia chimic, ct i
funciile exercitate. Funciile membranelor deriv din structur
i compoziie. Astfel, membrana extern a mitocondriilor
conine proteina porina, care asigur transportul unor molecule
mici, inclusiv a unor proteine cu greutate molecular mic.
Membrana intern se caracterizeaz printr-un coninut nalt de
proteine (80%), ce fac parte din lanul transportor de electroni
(succinat-dehidrogenaza, citocromii) i particip la procesul de
sintez a ATP (ATP-sintetaze), ct i lipide specifice, dintre
care se evideniaz cardiolipina (10%)

Anvelopa nuclear
Nucleul este delimitat de citoplasm printr-o membran
dubl, strbtut de pori, numit anvelop nuclear.
Fig. 3.5. Structura microscopic a anvelopei nucleare
53

Membrana nuclear intern se unete prin proteine
specifice de lamina fibroas a nucleului. Ea vine n contact cu
ADN-ul i ARN-ul transcris n nucleu (fig. 3.5).
Membrana nuclear extern continu cu membrana
reticulului endoplasmatic granulat. Pe suprafaa ei, la fel ca i pe
suprafaa RE rugos se gsesc ribozomi care particip la
biosinteza proteinelor.
ntre cele dou membrane ce alctuiesc anvelopa
nuclear se afl un spaiu perinuclear cu o lime de 20-40
nm. Proteinele sintetizate pe suprafaa nucleului nimeresc direct
n lumenul RE cu care comunic spaiul perinuclear.
Prezena a dou membrane alturate face imposibil
trecerea moleculelor de acizi nucleici n ambele direcii.
Transportul macromoleculelor se realizeaz prin intermediul
numeroilor pori nucleari, care strbat ambele membrane. n
medie se conin 3000 4000 pori per nucleu, ceea ce constituie
aproximativ 10% din suprafaa nucleului. Fiecare por este
format din complexul porului care const din opt seturi de
proteine plasate n trei starturi. Octamerul proteic mrginete un
canal cu diametrul de 9 nm i lungimea de 15 nm prin care
nucleul comunic cu citoplasma (vezi fig. 6.3). n mijlocul
porului se afl granula central cu rol de diafragm. Prin pori
trec particulele RNP, subunitile ribozomale, componentele
necesare pentru activitatea normal a nucleului.

Biogeneza i evoluia membranelor
Membranele biologice se formeaz prin completarea
membranelor preexistente. Astfel, componentele mebranare noi
se sintetizeaz pe suprafaa RE i ulterior pot suferi transformri
n AG (fig. 3.6).
Sinteza fosfolipidelor i etapele finale ale sintezei
colesterolului se realizeaz pe suprafaa RE neted sau AG.
Proteinele membranare se sintetizeaz pe suprafaa RE rugos
54

sau n citosol. Proteinele intrinseci, de regul, se sintetizeaz pe
suprafaa RE granular, conin regiuni hidrofobe i rmn
integrate n permanen n membrane. Conformaia spaial a
proteinelor poate fi stabil, sau poate fi modificat n RE neted
i AG prin glicozilare. Grupele oligozaharidice att pentru
proteine, ct i pentru lipide sunt adugate n partea ndreptat
spre lumenul RE sau AG.
Traficul de membrane se realizeaz prin intermediul
veziculelor, care se afl ntr-o micare continu. Veziculele se
insereaz ntr-o membran deja preexistent. Reciclarea
membranelor este un proces continuu, ceea ce asigur
funcionarea lor normal n permanen.

Transportul prin plasmalem
Plasmalema prezint o permeabilitate selectiv care
asigur transportul de materiale prin membrana plasmatic. Se
Fig. 3.6. Biogeneza, evoluia i traficul membranelor
Citosol
55

disting dou tipuri de transport: pasiv i activ.

Transportul pasiv
Transportul pasiv se face fr consum de energie,
substanele se deplaseaz n sensul gradientului de concentraie
sau n sensul gradientului electrochimic (pentru ioni). Gradientul
electrochimic e compus din gradientul de concentraie i cel
electric. Partea intern a membranei are sarcin electric
negativ, iar cea extern - pozitiv.
A) difuziunea simpl, are loc prin stratul dublu lipidic.
Ptrunderea substanelor liposolubile are loc conform
coeficientului de repartiie ntre ulei i ap. De asemenea
prin bistratul lipidic trec gazele i, ca excepie, unele
substane hidrofile din care face parte apa, ureea,
metanolul.

B) transportul ionilor prin intermediul unor substane numite
ionofori (ionofori - polipeptide produse de microorganisme).
Exist dou tipuri de ionofori: transportori mobili (de exemplu
Valinomicina), care se unesc cu ionul de o parte a membranei,
complexul strbate startul dublu de lipide, iar mai apoi ionul
este eliberat de partea opus; i de tip canal (de ex.,
Gramicidina) dou molecule de Gramicidin n stratul dublu
lipidic formeaz un canal.

C) difuzia facilitat se produce de la o concentraie mai mare
spre una mai mic (se oprete n momentul egalrii
concentraiilor de pe cele dou pri ale membranei), dar
substanele transportate trec mult mai rapid (100.000 ori),
dect ar fi de ateptat pentru dimensiunea i solubilitatea lor
n lipide. Substanele sunt transportate de ctre proteine
specifice, numite permeaze, care se comport ca nite
enzime legate de membran, fiindc difuziunea facilitat are
56

caracteristici comune cu cataliza enzimatic. Fiecare
protein transportoare are un loc specific de legtur a
substratului. Orice permeaz se poate uni i, respectiv, este
capabil de a transporta un singur tip de molecule sau o
anumit familie de molecule.
D) Exemple de difuziune facilitat: transportul anionilor,
ureei, glicerolului i a altor neelectrolii. Transportatorul
reprezint o protein transmembranar care sufer
modificri conformaionale reversibile. ntr-o anumit stare
conformaional pong, locurile de legtur se gsesc la
exteriorul stratului dublu lipidic. n cealalt stare
conformaional ping aceleai locuri snt expuse pe partea
opus a membranei, iar substana este eliberat. Acest
mecanism poart denumirea de pong - ping (fig. 3.7).

E) difuziunea simpl mediat de proteine canal - se
deosebete de difuziunea facilitat. Proteinele membranare
formeaz canale care sunt deschise n mod continuu -
canale de poart. Canalele se deschid :
- la legarea unui ligand de un receptor - canale cu poart
comandat de ligand;
- n dependen de voltaj - canale cu poart comandat de
Fig. 3.7. Schema difuziei facilitate
57

voltaj;
- canale care se deschid ca rspuns la creterea concentraiei
intracelulare a unor ioni.

Transportul activ
Transportul activ - transport contra gradientului
electrochimic, care necesit consum de ATP.
Transportul activ se efectueaz de proteine
transportatoare integrate n membrana plasmatic.
A) Transportul ionilor - pompa de Na
+
i K
+
reprezint o
protein-enzim (Na
+
- K
+
ATP-aza) ce scindeaz ATP n ADP
i fosfat anorganic i necesit Na
+
i K
+
pentru activitatea sa.
Pentru fiecare molecul de ATP hidrolizat se pompeaz la
exterior 3Na
+
i la interior 2K
+
(fig. 3.8). Proteina contribuie la
generarea potenialului electric de membran. Pompa de Ca
2+

menine concentraia sczut de Ca
2+
n citosol fa de
concentraia mai mare a Ca
2+
extracelular.
Fig. 3.8. Mecanismul funcionrii pompei Na
+
/K
+

Citosol
58

B) Transportul activ cuplat cu gradiente ionice e reprezentat
de transportul glucozei i al aminoacizilor prin plasmalem.
Glucoza este transportat de un cru al glucozei de care se
leag i Na
+
- sistem sinport. Na
+
tinde s intre n celul
conform gradientului electrochimic, antrennd n acelai sens
glucoza. Cu ct gradientul de Na
+
este mai mare i viteza
transportului e mare; dac se reduce gradientul de Na
+
se
oprete i transportul glucozei. Na
+
care ptrunde cu glucoza
este pompat n exterior de Na
+
/K
+
ATP-aza ce menine
gradientul de Na
+
.
Transportul aminoacizilor se face prin sistemul sinport
cu Na
+
, existnd cel puin cinci proteine diferite n plasmalema
celulelor animale.

Direcia de transportare a substanelor
Diferite tipuri de proteine transportoare asigur
transferul fie a unui singur tip de molecule (ioni), fie a mai
multor (fig. 3.9). Dac printr-un canal se transport un singur tip
de substane astfel de transport se numete uniport (canalele de
Ca
2+
n membrana reticulului sarcoplasmatic). Transportarea
mai multor substane prin acelai canal se numete cotransport.
Cotransportul poate fi de dou tipuri: sinport, n cazul dac
Uniport Sinport Antiport
Cotransport
Fig. 3.9. Tipurile transportului prin membrane
59

diferite moleculele (ioni) sunt transportate n aceeai direcie
(Na
+
- glucoz, Na
+
- aminoacizi) i antiport, dac substanele
se transport n direcii diferite prin membran (pompa Na
+
- K
+
,
Na
+
- Ca
2+
, Cl
-
- HCO
3
-
, Na
+
- H
+
).

Transportul macromoleculelor prin membrane
Macromoleculele (proteine, polizaharide, picturi de
grsimi, bacterii, fragmente celulare) nu pot trece liber prin
membrane pasajul lor fiind facilitat de anumite proteine. Pentru
ele este caracteristic transportul prin vezicule, care poate fi de
trei tipuri: endocitoz, exocitoz, transcitoz.
Endocitoza se clasific n fagocitoz i pinocitoz.
Fagocitoza este capacitatea unor celule de a ngloba
din exterior particule solide (proteine, fragmente celulare,
bacterii). Ea reprezint o modalitate de nutriie a protozoarelor,
iar la mamifere joac rolul de aprare a organismului datorit
capacitii leucocitelor de a fagocita. Prin fagocitoz snt
ndeprtate celulele senescente. Fagocitoza are cteva faze:
- chemotaxia - micarea dirijat a fagocitelor, spre locul
infeciei;
- recunoaterea i ataarea fagocitelor de particulele
strine se face cu ajutorul receptorilor din plasmalema
fagocitului ce recunosc liganzii de pe suprafaa particulei;
- nglobarea particulelor ntr-o vezicul;
- digerarea celulelor fagocitate.
Transportul macromoleculelor n procesul endocitozei este
realizat prin intermediul veziculelor ce se formeaz din
membrana plasmatic. Veziculele iau natere n regiuni
specializate ale membranei plasmatice ce au aspectul unor
depresiuni. Pe suprafaa citoplasmatic a depresiunilor se
gsete ancorat o reea proteic, cel mai bine caracterizat este
clatrina, care determin formarea veziculelor.
60

Pinocitoza - este capacitatea celulei de a ngloba din
exterior picturi de lichide (mai frecvent picturi de lipide),
procesul fiind similar fagocitozei.
Exocitoza se produce prin fuziunea unor vezicule din
citoplasm cu plasmalema i, astfel, materialul din vezicule este
vrsat n afara celulei. Acest proces are loc n cazul eliberrii
hormonilor i a neuromediatorilor n membrana presinaptic.
Transcitoza - o form de transport prin vezicule, cnd
macromoleculele sunt captate de o parte a celulei prin
endocitoz, traverseaz citoplasma i sunt eliberate n partea
opus prin exocitoz. Acest mecanism asigur transportul
macromoleculelor prin epiteliul intestinal i endoteliul capilar.

Adeziunea celular
n organismele pluricelulare celulele care ndeplinesc
funcii similare formeaz esuturi, n care, n majoritatea
cazurilor, se stabilesc contacte. Contactul intercelular este
realizat prin intermediul unor structuri specializate numite
jonciuni intercelulare. (fig. 3.10). Jonciunea se realizeaz
cu ajutorul complexului de macromolecule localizat n spaiile
intercelulare numit matrice intercelular.
Jonciunile strnse (jonciuni de ocluzie) se
formeaz prin apropierea puternic a dou membrane vecine.
Reinerea membranelor n apropiere se realizeaz cu ajutorul
unor proteine speciale, care sunt comune pentru ambele
membrane. Ele apar ntre celulele epiteliale ce delimiteaz
lumenul unor caviti (vezica biliar, unele glande endocrine).
Jonciuni de adeziune se ntlnesc, de asemenea,
ntre celulele epiteliale, n apropierea jonciunilor strnse. Astfel
de contacte se menin cu participarea citoscheletului
(filamentelor de actin), distana dintre membranele vecine
pstrndu-se de 15-20 nm.
61

Desmozomii asigur adeziunea celulelor n epitelii,
necesar pentru asigurarea rezistenei mecanice. Membranele
celor dou celule i pstreaz individualitatea, ntre ele exist
un spaiu de 15-20 nm. Contactele sunt meninute cu ajutorul
filamentelor intermediare din celulele vecine, care constituie un
tot ntreg. Componenta fibrilar a desmozomilor e prezentat de
exemplu prin keratin (ntre celulele musculare ale inimii).
Hemidesmozomii structural sunt asemntori cu
desmozomii, ns asigur contactul celulelor cu o structur
specializat a matricei extracelulare, numit lamin bazal.
Sunt proprii esuturilor epiteliale.
Jonciunile permeabile (jonciunile gap) se
formeaz ntre membranele a dou celule care comunic prin
canale cilindrice formate de o protein, numit conexin.
Distana dintre membrane este de 20-40. Canalele permit
trecerea substanelor cu greutate molecular mic dintr-o celul
Fig. 3.10. Tipuri de jonciuni celulare
62

n alta n mod direct prin puni citoplasmatice i formeaz un
sinciiu. Sunt ntlnite ntre celulele musculare netede din
intestin, sau ntre celulele embrionilor.
Sinapsa reprezint o jonciune specializat ntre
celulele nervoase, sau ntre celulele nervoase i cele musculare
prin intermediul crora are loc transmiterea impulsurilor
nervoase. n sinapsele chimice membranele celulelor vecine sunt
separate printr-o spaiu numit fant sinaptic, n care se
elibereaz veziculele cu neuromediator. n sinapsele electrice
impulsul electric este transportat prin intermediul ionilor, care
trec prin jonciuni de tip gap.

Verificarea cunotinelor:

1. Definii noiunile: plasmalem, glicocalix, receptor, ligand,
transport pasiv, transport activ, endocitoz, exocitoz,
transcitoz, clatrin, jonciune celular.
2. Care sunt funciile membranei plasmatice?
3. Care este structura molecular a membranei plasmatice?
4. Care sunt particularitile organizrii membranelor interne?
5. Care este organizarea molecular i funciile
glicocalixului?
6. Care este importana transportului membranar pentru
activitatea vital a celulelor?
7. Care sunt particularitile transportului pasiv?
8. Care este rolul biologic i particularitile pompei Na
+
-K
+
?
9. n ce const evoluia i interaciunea membranelor?
10. n ce const rolul biologic al contactelor celulare?



63

COMPARTIMENTARA CELULEI EUCARIOTE

Celulele eucariote conin membrane interne care separ
diferite medii fermentative, formnd organite membranare, care
ocup aproximativ o jumtate din volumul total al celulei (tab.
4.1). Principalele compartimente membranare sunt reticulul
endoplasmatic (RE), aparatul Golgi (AG), lizozomii,
peroxizomii, mitocondriile i nucleul. Fiecare dintre acestea
conine un set specific de proteine i ndeplinete o funcie
definit. Astfel, n celul se pot realiza multiple reacii chimice
care asigur vitalitatea: asimilarea substanelor din exterior,
sinteza substanelor proprii, metabolismul energetic,
autoreproducerea, rennoirea structurilor celulare, adaptarea la
condiiile de mediu, interaciunile cu alte celule. Numrul, forma
organitelor membranare i, n special, compoziia lor chimic
difer de la celul la celul, de la esut la esut.
Tabelul 4.1. Volumul relativ al compartimentelor celulare
dintr-un hepatocit
Componenta % din volum Numrul per celul
Citozolul 54 1
Mitocondriile 22 1700
RE rugos 9 1
RE neted i AG 6
Nucleu 6 1
Peroxizomi 1 400
Lizozomi 1 300
Endozomi 1 200
64

Reticulul endoplasmatic
Reticulul endoplasmatic reprezint un sistem complex de
membrane, organizate n canale i cisterne. RE reprezint
aproximativ 10% din volumul celular total.
Membranele RE au o organizare molecular similar
altor membrane (bistrat lipidic, proteine, hidrai de carbon).
Particularitile funcionale sunt determinare de proteinele
prezente (de ex., riboforinele sunt prezente doar n membranele
RE rugos i asigur asocierea ribozomilor). Spre deosebire de
membrana plasmatic n membranele din RE glucidele sunt
orientate spre lumen, iar enzimele - spre citozol.
Din punct de vedere morfologic i funcional se
deosebesc dou tipuri de reticul endoplasmatic: a) RE rugos i
b) RE neted. Ambele tipuri interacioneaz ntre ele, au
membran i lumen comune (fig. 4.1).
RE rugos. Are la suprafaa membranei numeroi ribozomi,
iar lumenul reprezint o continuare a spaiului perinuclear. Canalele
au un diametru de 20-30nm. n diferite celule apare sub diferite
forme: corpusculul Nissl n neuroni, corpusculii Berg - hepatocite,
ergastoplasm - celulele pancreasului.
Fig. 4.1. Schema i microfotografia reticulului endoplasmatic
65

RE rugos este responsabil de sinteza diferitor tipuri de
proteine:
proteine secretate;
plicoproteine pentru membranele:
plasmalemei;
nucleului;
RE;
aparatului Golgi;
enzime lizozomale;
enzime ale RE rugos;
Enzime ale aparatului Golgi;
proteine ataate pe suprafaa extern a membranei celulare:
colagenul, laminina etc.
RE neted. RE neted este conectat la cisternele formate
de RE rugos i reprezint o reea de canale cu un diametru de
30-60nm. Este responsabil de sinteza i metabolizarea acizilor
grai i a fosfolipidelor, sinteza colesterolului i a hormonilor
steroizi, ct i de detoxifierea xenobioticelor (pesticide,
medicamente, cancerigeni chimici). Enzimele implicate n
biosintez sunt proteine membranare integrate i au centrele
active ndreptate spre citozol.
n sintez RE exercit urmtoarele funcii biologice:
+ crearea n interiorul celulei a gradientelor ionice
transmembranare i a potenialului de membran;
+ biosinteza proteinelor;
+ glicozilarea proteinelor;
+ biogeneza membranelor;
+ detoxifierea substanelor endogene i exogene prin
neutralizarea efectelor lor nocive (hidroliza, oxidarea,
reducerea, conjugarea);
+ biosinteza lipidelor;
+ transportul substanelor organice sintetizate;
+ depozitarea substanelor organice.
66

Aparatul (complexul) Golgi.
Aparatul Golgi (AG) a fost pus n eviden de Camille
Golgi (1898) printr-o coloraie special, observat n celulele
sistemului nervos i reprezint un set de compartimente
funcional distincte, formate dintr-un sistem de cisterne turtite i
delimitate de o membran (5-11 compartimente per celul) (fig.
4.2). Proteinele sintetizate n RE trec n AG pentru a fi
prelucrate, sortate i exportate.


Funcional AG este format din trei regiuni distincte (fig. 4.3):
compartimentul cis (orientat spre RE) sau de intrare, n
care proteinele (sau componentele membranare) nou
sintetizate sunt transferate din RE n aparatul Golgi; aici
unele proteine sunt fosforilate sau/i glicozilate (se adaug
una sau mai multe molecule de manoz);
compartimentul median, n care se face glicozilarea
proteinelor i lipidelor: se adaug lanuri mari de manoz, se
adaug N-acetilglucozamin, galactoz i fructoz;
compartimentul trans, n care se ndeprteaz galactoza, se
adaug acid sialic, formnd acidul N-acetil neuraminic
(NANA). Compatrimentul trans continu cu o reea de
Fig. 4.2. Schema i microfotografia aparatului Golgi
67

tuburi ce formeaz reticulul Golgi trans sau reeaua Golgi
trans. Acest compartiment reprezint poarta de ieire, de
export a produselor procesate i sortate, destinate funciilor
bine determinate n interiorul (anumite organite) sau
exteriorul celulei. n jurul cisternelor proemineaz grupuri
de vezicule ce realizeaz traficul molecular de la RE la
aparatul Golgi, ntre compartimentele complexului, i
export pe diferite direcii molecule biologic active.



Fig. 4.3. Funcionarea AG
68

Sortarea i repartizarea moleculelor se face datorit
interaciunii lor specifice ligand receptor (fig. 4.4 ).
n general, complexul Golgi este considerat sediul central al
sintezei hidrailor de carbon i al modificrii specifice a
macromoleculelor. Proteinele i lipidele care trec prin aparatul
Golgi sunt supuse n mod dirijat unor modificri specifice.
Procesul cel mai important const n ataarea lanurilor de
oligozaharide sau grupri fosfat la proteine i lipide, care pot
servi i ca semnale de direcionare sau sortare.
Patologia AG:
boala von Geerke defect genetic enzimatic ce duce la
suprancrcarea celulelor cu glicogen;
sindromul adrenogenital sinteza deficitar a unor steroli;
Fig. 4.4. Sortarea moleculelor n aparatul Golgi
69

miopatii congenitale RE anormal n fibrele musculare
striate i cele cardiace;
tolerana la unele medicamente n cazul alcoolismului cronic
(alcoolul induce enzimele microsomale, ceea ce accelereaz
metabolismul medicamentelor i respectiv eliminarea lor
rapid din snge).
Lizozomii
Lizozomul a fost vizualizat ca organit celular doar prin
microscopia electronic (Cristian de Duve, 1950). El a fost
descris ca o vezicul, limitat de o membran, funcia lui
principal fiind digestia intracitoplasmatic a diverselor
molecule, componente celulare, corpusculi fagocitai. Sub aspect
biochimic, lizozomii au fost prevzui nainte de identificarea lor
morfologic, prin aciunea hidrolitic pe care o aveau
omogenatele
obinute din
celulele hepatice.
Dimensiunea i m-
rimea lizozomului
variaz n limite
foarte largi 0,05-0,5
m, ns nsuirea
comun a acestora
este faptul c
reprezint depozitul
cu enzimele hidro-
litice acide (enzime
de digestie) (fig.
4.5). n membrana
lizozomului se
gsesc proteine puternic glicozilate, ceea ce o face rezistent la
aciunea hidrolitic a enzimelor din lizozom.
Echipament enzimatic
lizozomal:

Hidrolaze acide:
Fosfataze
Nucleaze
Proteaze
Glicozidaze
Sulfataze
Lipaze
pH 5
Citozol
pH
7.2
ATP ADP
+P
i

H
+
H
+
ATP-
aza
0.05-0.5 m
Fig. 4.5. Structura lizozomului.
Enzimele lizozomale
70

Lizozomul conine aproximativ 40 enzime hidrolitice a cror
activitate optim are loc la pH ~5,0. Aceast dependen a
aciunii enzimatice de pH protejeaz componentele citozolului
(care are pH ~7,2) de o eventual lezare a membranei
lizozomale, deoarece enzimele devin inactive la pH 7,2.
n interiorul lizozomului pH-ul acid este meninut de o
pomp de H
+
(H
+
-ATPaza) prezent la nivelul membranei, care
folosete hidroliza ATP ca surs de energie. Astfel, ionii de
hidrogen sunt pompai continuu n lumenul lizozomal asigurnd
n permanen un mediu acid. Acest mediu este necesar pentru
denaturarea proteinelor, care le fac accesibile aciunii
hidrolazelor lizozomale.
Traficul materialelor spre lizozomi
Materialele care urmeaz a fi digerate sunt transportate
la lizozomi pe diferite ci (fig. 4.6).
Endocitoz, prin care materialul este transportat de la
endozomi la lizozomi.
Fig. 4.6. Traficul materiallor spre lizozomi
71

Autofagocitoza, prin care resturile celulare (prile de
celule) sunt transportate n lizozom pentru a fi distruse.
Crinofagocitoz, prin care se regleaz cantitatea de produse
secretate din celular (de ex., hormonii n celulele
endocrine).
Fagocitoza, care reprezint procesul n care particulele sau
microorganismele sunt incorporate n lizozomi i ulterior
digerate. Acest proces are loc numai n celule specializate
(macrofagi, neutrofile). Prin incorporarea acestor materiale
se formeaz fagozomii, care se transform n fagolizozomi.
Patologii lizozomale:
boala Tay Sachs se manifest prin ntrzierea dezvoltrii
mintale a copilului, perturbarea sistemului nervos central i
moartea pn la vrsta de 5 ani. Boala este cauzat de
alterarea unei enzime lizozomale necesare pentru
catabolizarea mucopolizaharidelor; ca rezultat, n membrana
celulelor nervoase se acumuleaz gangliozida GM2.
boala cu celule I este cauzat de incapacitatea atarii
gruprii manozo-6-fosfat la enzimele lizozomale, din care
cauz aceste enzime nu mai pot fi sortate i direcionate spre
lizozomi la nivelul AG. Ca rezultat majoritatea enzimelor
hidrolitice lipsesc din celule, avnd ca efect acumularea
incluziunilor nedigerate n citoplasm. La astfel de bolnavi
fibroblatii conin nite vezicule mari cu glicolipide i
componente extracelulare, care n mod normal ar trebui s
fie hidrolizate de enzimele lizozomale.

Peroxizomii
Peroxizomii au fost identificai prin microscopie
electronic de ctre Rhodin n anul 1954. Organitul are
dimensiuni de 0.5-1m i este nconjurat de o singur membran
cu grosimea de 6 nm. n interior se afl o matrice ce conine
oxidaze (urat-oxidaz, D-aminoacid oxidaz) i catalaza.
72

Peroxizomii utilizeaz oxigenul molecular pentru ndeprtarea
atomilor de hidrogen din D-aminoacizi provenii din bacteriile
intestinale. n felul acesta se obine apa oxigenat (H
2
O
2
), toxic
pentru celul, care este mai apoi utilizat de catalaz pentru
detoxificarea fenolilor, acidului formic, formaldehidei i
alcoolilor.
RH
2
+ O
2

Oxidaza
R + H
2
O
2


H
2
O
2
+ R'H
2

Catalaza
R' + 2H
2
O

Reaciile decurg, n deosebi, n celulele hepatice i cele
renale. n absena reaciilor de detoxificare apa oxigenat se
descompune pn la ap i oxigen molecular. n cazul dac
H
2
O
2
nu este descompus de catalaz pot aprea radicali liberi cu
efecte nocive pentru celul.
2H
2
O
2

Catalaza
O
2
+ 2H
2
O

Biogeneza peroxizomilor: membrana peroxizomilor
este generat prin rennoirea fosfolipidelor de la RE neted.
Proteinele peroxizomale sunt sintetizate de ribozomii liberi din
citozol. Se presupune, c catalaza are o secven semnal,
orientat spre citozol, ce recunote enzimele peroxizomale
ntegrndu-le n organit. Noii peroxizomi apar prin diviziunea
peroxizomilor preexisteni.

Patologia peroxizomilor:
sindromul Zellweger este cauzat de lipsa peroxizomilor,
ceea ce duce la disfuncii cerebro-hepato-renale, ca rezultat
copii mor pn la vrsta de 1 an;
adrenoleucodistrofii sunt cauzate de diminuarea funciei
peroxisomilor n oxidarea acizilor grai, ceea ce duce la
distrugerea progresiv a substanei albe din creier i a
corticosuprarenalei;
73

acatalazemia peroxisomii lipsesc n celulele tumorale, ceea
ce duce la creterea rapid a tumorii.

Mitocondriile
Mitocondriile sunt prezente n toate celulele eucariote i
sunt responsabile de conversia energiei eliberate din
metabolizarea glucidelor, acizilor grai i aminoacizilor n
legturile macroergice fosfoanhidrice ale ATP. Au lungime de
2-10 m, diametrul de 0.5-1 m i ocup aproximativ 25% din
volumul citoplasmatic. Orientarea i distribuirea lor se
realizeaz prin intermediul asocierii la microtubulii
citoplasmatici.
Structural mitocondriile constau din dou membrane (cu
grosimea de 6 nm fiecare), compartiment periferic (spaiu
intermembranar) i compartimentul central (matricea
mitocondrial) (fig. 4.7).

Membrana extern este alctuit din proteine (50%),
colesterol i fosfolipide. Are un aspect neted i ndeplinete
funcia de filtru ntre citozol i compartimentul periferic.
Proteina porina funcioneaz ca un canal ce permite
transportarea diferitor molecule cu dimensiuni mai mici de
10kD.
74


Compartimentul periferic (spaiul intermembranar) are
limea de 6-8 nm i servete la acumularea protonilor, ct i
transportarea substanelor.
Membrana intern este alctuit din proteine (80%) i
cardiolipin (difosfatdiglicerol 10%), care ofer
impermebialitate pentru mai multe tipuri de ioni. Proteinele
se clasific n:
proteine implicate n reaciile de oxido-reducere, ce se
realizeaz la nivelul lanului respirator;
proteine transportoare, ce asigur intrarea metaboliilor n
matricea mitocondrial sau ieirea lor n spaiul intermembranar;
complexul enzimatic ATP-sintetaza care asigur fosforilarea
oxidativ.
Membrana intern formeaz numeroase invaginri numite criste,
numrul lor fiind determinat de intensitatea metabolismului celular.
Compartimentul central (matricea mitocondrial) care este
format din:
+ genomul mitocondrial (ADN circular, se conine n mai
multe copii);
+ ribozomii mitocondriali (coeficientul de sedimentare de n
mediu 70S; la mamifere 55S);
Fig. 4.7. Schema i microfotografia mitocondriei
75

+ molecule de ARNm, ARNt;
+ granulaii cu densiti electronice diferite (depozite de
Ca
2+
);
+ enzime implicate n:
replicarea i funcionarea aparatului genetic al
mitocondriei;
oxidarea piruvatului i a acizilor grai pn la acetil-
CoA;
ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul Crebs).

Procesele metabolice mitocondriale
n mitocondrii se desfoar procese metabolice legate de
metabolismul energetic i plastic.
Metabolismul energetic (fig. 4.8):
oxidarea piruvatului i a acizilor grai pn la CO
2
, nsoit
de reducerea cofactorilor enzimatici NAD
+
i FAD;
transportul protonilor i electronilor prin lanul respirator
mitocondrial, nsoit de generarea unui gradient
electrochimic de protoni;
utilizarea energiei stocate n gradientul electrochimic de
protoni pentru sinteza ATP din ADP i fosfat anorganic;
combinarea protonilor cu oxigenul molecular i formarea
apei.
Metabolismul plastic:
autoreproducerea este determinat de prezena genomului
propriu, care este semiautonom fa de genomul nuclear;
expresia genelor mitocondriale cu participarea propriului
aparat de translaie: ARNm, ARNt, ribozomi;
importarea din citozol a proteinelor sintetizate pe baza
genelor nucleare (80% din proteinele mitocondriale sunt de
origine nuclear).
76


Patologia mitocondriilor.
n cazul defectului genelor mitocondriale boala poate fi transmis
doar pe linie matern. Bolile provocate se refer la miopatii i
neuropatii:
miopatia mitocondrial;
encefalopatia i encefalomiopatia familial;
neuropatia optic ereditar Leber;
sindromul Kearns-Sayre afeciune neuromuscular,
cauzat de alterarea enzimelor lanului respirator.

Citoscheletul
Una din particularitile celulelor eucariote este
capacitatea lor de a-i pstra forma, de a efectua micri
coordonate i direcionate, care se bazeaz pe existena unui
sistem de filamente proteice numit citoschelet.
Funciile principale ale citoscheletului sunt:
determin i menine forma celulei;
Fig. 4.8. Reprezentarea schematic a metabolismului
energetic n mitocondrie
77

asigur localizarea precis a organitelor;
asigur motilitatea celular:
micri de contracie muscular,
micarea de locomoie ameboidal,
micrile cililor i flagelilor,
micrile din microvli,
micrile din cadrul diviziunii celulare,
curenii citoplasmatici prin sistemul microtubul;
intervine n organizarea molecular i funcional a
membranei celulare, n chemotaxis i n adezivitatea
celular;
asigur transportul intracelular al macromoleculelor asociate
filamentelor.
Citoscheletul este alctuit, n principal, din trei tipuri de
structuri fibrilare: microfilamente de actin, microtubuli i
filamente intermediare.
Filamentele de actin (microfilamente) sunt polimeri
bicatenari formai din proteina actina. Reprezint nite structuri
flexibile cu diametrul de 5-9 nm. Dei filamentele de actin
sunt dispersate n celul, ele sunt concentrate mai mult n
regiunea cortical a celulei. Actina interacionnd cu miozina,
determin formarea miofilamentelor asigurnd contracia
muscular i motilitatea membranei plasmatice n timpul
fagocitozei sau deplasrii celulelor pe substrat.
Filamentele intermediare reprezint nite filamente
heterogene cu diametrul ~10 nm formate din proteine fibrilare.
Exist o specificitate nalt a filamentelor intermediare n
dependen de esut (de ex., keratina n celulele epiteliale,
desmina n celulele musculare, vimentina n fibroblati). Ele
intr n compoziia laminei nucleare, strbat citoplasma,
asigurnd rezistena la stresurile mecanice i particip la
jonciunea celulelor.
78

Microtubulii reprezint nite cilindri lungi formai din
tubulin (fig. 4.9). Ei au
diametrul de 25 nm i
sunt mai rigizi dect
filamentele de actin.
Microtubulii, de obicei,
sunt fixai cu un capt de
centrozom centrul de
origine a microtubulilor.
Fiecare microtubul este
format din 13
protofilamente, iar acestea la rndul lor sunt formate fiecare din
heterodimeri de tubulin (o i |) aezai cu capul spre coad,
ceea ce confer microtubulilor un caracter polar. n celul
microtubulii pot fi izolai, forma structuri provizorii (fibrele
fusului de diviziune) sau organite permanente (centrioli,
corpusculi bazali, cili, flageli) (fig. 4.10). Microtubulii
realizeaz numeroase funcii vitale pentru celul: distribuia
cromozomilor n mitoz sau meioz, transportul intracelular,
motilitatea celular.

Patologia citoscheletului:
patologia motilitii celulare:
- modificri complexe ale motilitii leucocitare sindromul Chediak-
Higashi (se caracterizeaz prin albinism parial, infecii piogene
severe i pancitopenie) ca rezultat al defectului de asamblare a
tubulinei n microtubul scade motilitatea neutrofilelor;
- diminuarea capacitii chemotaxice a celulelor sindromul
leucocitelor lenee (lazy-leucocyte syndrome);
- alterri moleculare i funcionale ale micrii ciliare sindromul
Kartagener (caracterizat prin triada: broniectazie bilateral,
inversiune visceral, polipoz nazal sau sinuzit maxilar +
sterilitate masculin din cauza pierderii motilitii
spermatozoizilor);

Fig. 4.9. Structura microtubulilor
79

modificri ale citoscheletului la nivelul celulelor canceroase; moleculele
suprafeei celulare sunt implicate n metastazarea tumorilor maligne;
cardiomiopatia familial ca urmare a anomaliilor discurilor intercelulare
din miocard;
anemia megaloblastic modificarea conformaiei spectrinei eritrocitare.


B
A
Fig. 4.10. A. Microfotografia i schema centriolului.
B. Structura corpuscului bazal al flagelului
80

Verificarea cunotinelor:

1. Definii noiunile: organit, endosom, hidrolaz, catalaz,
citoschelet, tubulin, centriol.
2. Care este rolul compartimentalizrii celulare?
3. Care sunt funciile reticulului endoplazmatic?
4. Care sunt particularitile de organizare ale AG?
5. Care sunt etapele sortrii enzimelor lizozomale?
6. Care sunt funciile peroxizomilor?
7. Care sunt procesele metabolice din mitocondrii?
8. Ce roluri ndeplinete citoscheletul n activitatea celulelor?



81



PROCARIOTELE

Celulele procariote se caracterizeaz printr-o
organizare relativ simpl, dar posed toate nsuirile de baz
ale unei celule vii: membran, aparat genetic, aparat enzimatic
pentru sinteza substanelor organice. Membrana plasmatic
formeaz un singur compartiment citoplasmatic, fr o structur
intern bine organizat. Conin un singur cromozom
(nucleoidul), constituit dintr-o singur molecul inelar de
ADN, fr a prezenta un nucleu bine conturat. Din acest motiv
ele au fost denumite procariote. Principalii reprezentani ai
acestei grupe de organisme vii sunt bacteriile i algele cianofite.
Bacteriile sunt procariotele care se ntlnesc cel mai frecvent n
mediul nconjurtor, fiind considerate cele mai mici entiti vii,
autonome, guvernate de informaia coninut n ADN.
n natur se ntlnesc diverse tipuri de bacterii. n dependen de
form se deosebesc:
bacili bacterii n form de bastona (Escherichia coli);
coci bacterii sferice (Micrococcus cerolyticus);
diplococi doi coci ntr-o capsul (Diplococcus pneumoniae provoac
pneumonia);
streptococi iraguri de coci (Streptococcus pyogenes provoac
angina i scarlatina);
stafilococi ciorchine de coci (Staphylococcus aureus provoac boli
ale cilor respiratorii);
spiril - spiral cu flagel (Spirrilum);
82

vibrion form de virgul, cu flagel (Vibrio cholerae provoac
holera).

nveliul celular al bacteriei
n dependen de structura nveliului celular se disting
bacterii Gram pozitive i bacterii Gram negative (fig.
5.1). Denumirea depinde de culoarea pe care o obin bacteriile n
rezultatul colorrii dup Gram (cu colorant bazic).
Celulele sunt nconjurate de un perete celular rigid
format dintr-un peptidoglican numit murein. Unele bacterii
sunt nconjurate de capsule mucilaginoase care asigur
formarea coloniilor. Capsulele, de rnd cu peretele celular, au
rol de protecie a celulelor. Astfel, suele (bacterii dintr-o
specie care se caracterizeaz prin anumite proprieti) de
pneumococi posesori de capsule sunt viruleni i provoac
pneumonia, n timp ce suele lipsite de capsule sunt avirulente,
deoarece sunt distruse de fagocii.

Bacteriile Gram pozitive
La bacteriile Gram-pozitive nveliul celular este alctuit
dintr-o membran plasmatic acoperit de un perete celular gros
la care sunt asociai acizii teihoici, lipoteihoici i polizaharidele.
Membrana plasmatic are o structur asemntoare cu
cea a eucariotelor. Bistratul de fosfolipide este asociat cu
proteine integrale (proteine canal) i semiintegrale (proteine
enzime). Enzimele bacteriene sunt asociate la suprafaa
citoplasmatic a membranei, cataliznd transportul activ al
substanelor, procesele lanului respirator, sistemele de
transformare a energiei. Membrana plasmatic conine H
+
-ATP-
aza, componentele necesare pentru sinteza fosfolipidelor,
peptidoglicanului, lipopolizaharidelor, conine de ancorare a
moleculelor de ADN. Membrana plasmatic bacterian
83

reprezint o structur multifuncional care combin funciile
realizate de diferite compartimente ale celulei eucariote.

Fig. 5.1. Structura bacteriilor Grampozitive i Gramnegative
84

n bacteriile Gram pozitive se pot depista nite structuri
membranare veziculare sau veziculo-membranare numite
mezozomi, care se formeaz prin invaginarea membranei
plasmatice. La moment se consider c mezozomii sunt nite
analogi ai mitocondriilor din celulele eucariote i particip la
procesele de respiraie aerob.
Peretele celular al bacteriilor este constituit din
murein, care prezint un polimer format din catene de N-
acetilglucozamin (NAG), acid N-acetomuramic (NAM), unite
ntre ele prin aminoacizi (fig. 5.2). Grosimea peretelui celular
variaz ntre 20-80 nm (la bacteriile Grampozitive), constituind
de la 5-10% i, respectiv, pn la 95% din masa uscat a celulei.
La suprafaa celulelor se afl i ali componeni:
- acizii teihoici care reprezint polimeri purttori de
sarcini negative i rein cristalele violete la colorare dup Gram.
Fig. 5.2. Structura peptidoglicanului
85

Acizii teihoici sunt strns legai de peptidoglican la bacteriile
Grampozitive, n timp ce la bacteriile Gramnegative lipsesc;
- Acizii lipoteihoici reprezint polimeri din glicofosfai
i glicolipide i sunt ancorai de plasmalem. Ei au rol antigenic,
citotoxic i adeziv (Streptococcus pyogenes).
La exterior peretele celular este acoperit cu un strat
subire de lipide care-l protejeaz de aciunea lizozimei enzim
capabil s hidrolizeze legturile dintre resturile de glucide,
distrugnd mureina. Stratul lipidic apr celula i de aciunea
penicilinei, care represeaz procesul de formare a legturilor
dintre componentele peretelui celular la bacteriile Gram
pozitive.

Bacteriile Gram-negative
Bacteriile Gramnegative se caracterizeaz prin existena
a dou membrane: membrana plasmatic intern - membrana,
care comunic direct cu citoplasma, i membrana plasmatic
extern cu grosimea de 7.5-10 nm, situat spre exteriorul
celulei. La majoritatea bacteriilor Gramnegative membrana
plasmatic intern este unit covalent de peptidoglican prin
intermediul lipopoproteidelor. La unele bacterii (E. coli),
membrana extern i cea intern comunic n mai multe locuri,
ceea ce provoac ntreruperea continuitii peretelui de murein.
Membrana plasmatic intern la bacteriile Gram-
negative are o organizare i funcii similare cu membrana
plasmatic a bacteriilor Gram-pozitive, cu deosebirea c nu
formeaz mezozomi.
n spaiul periplasmatic exist un strat de murein cu
grosimea de 3-10 nm, unit covalent cu membrana plasmatic
extern prin intermediul unor lipoproteide.
Membrana plasmatic extern are o structur asimetric
format de: fosfogliceride i cardiolipine din stratul intern al
acestei membarane i lipidele A (molecule hidrofobe) din stratul
86

extern asociate cu polizaharide, formnd stratul extern al
nveliui bacteriilor Gram-negative de natur lipopolizaharidic.
Lipopolizaharidele reprezint complexe formate din
lipida A cu funcie de ancor i lanuri de carbohidrai
(Antigenul O).
n componena membranei externe doar la bacteriile
Gramnegative intr o protein specific numit porina, care
formeaz canale pentru transportarea substanelor hidrofile.
Aceste canale au permeabilitate selectiv, astfel mpiedicnd
trecerea unor antibiotice (ampicilina) cu aciune contra
bacteriilor Grampozitive. O trstur specific pentru
membrana extern a bacteriilor este incapacitatea realizrii
transportului activ din cauza lipsei complexelor enzimatice
specializate.

Flagelii i pilii
De la suprafaa celulelor bacteriene pornesc nite
excrescene filiforme care pot fi de dou tipuri: pili i flageli.
Unele bacterii posed ambele tipuri de structuri.
Flagelii sunt prezeni de obicei la suprafaa bacililor, mai
rar a cocilor. Ei reprezint nite tubuli cu grosimea de 10-60 nm
formai din 3-11 filamente asamblate din proteina globular
flagelina. Spre deosebire de flagelii celulelor eucariote, flagelii
bacterieni nu sunt acoperii cu membran plasmatic. Ei se
unesc cu plasmalema i peretele celular prin intermediul unor
discuri, care la bacteriile Grampozitive sunt n numr de o
pereche, iar la bacteriile Gramnegative n numr de dou
perechi. Deoarece flagelina nu posed activitate de ATP-az,
flagelii nu sunt capabili s efectueze micri ondulatorii ca la
eucariote. Micarea lor se datoreaz rotirii flagelului n jurul
axei sale. Ca surs de energie pentru micare servete gradientul
H
+
de la suprafaa membranei plasmatice. Flagelii posed
proprieti antigenice (antigenul H).
87

n dependen de numrul de flageli deosebim
urmtoarele tipuri de bacterii:
monotrihi cu un singur flagel (Vibrio ohoterae);
lofotrihi cu un mnunchi unipolar (situat la un singur capt) de flageli
(Bartonella bacilliformis);
amfitrihi cu mnunchiuri bipolare (la dou capete) de flageli
(Spririllum serpens);
peritrihi cu flageli n jur (Escherichia coli).

Pilii reprezint nite excrescene subiri situate la
suprafaa celulelor Gram negative i sunt formai dintr-un grup
de proteine numite piline. Numrul lor variaz de la civa pn
la 200 per celul. Exist 2 tipuri de pili: numeroi pili scuri care
particip la adeziunea celular fa de substrat i 1-6 pili lungi,
numii pili de sex, sau F-pili, care particip la conjugarea
bacterian. n procesul conjugrii are loc schimb de material
genetic ntre celule. De asemenea, pilii confer proprieti
adezive acelor sue care triesc n interiorul altor organisme.

Componente intracelulare
Bacteriile nu conin organite celulare membranare aa ca
RE, AG, lizozomii, peroxizomii, mitocondriile. Unele specii
conin membrane fotosintetizatoare i sunt de asemenea,
descrise vezicule umplute cu gaze.
Celulele bacteriene conin ribozomi cu coeficientul de
sedimentare 70S (30S + 50S), responsabili de sinteza
proteinelor. Ribozomii pot fi dispersai n citoplasm sau pot fi
asociai la ARNm n preajma nucleoidului. n citoplasm se mai
pot gsi i substane de rezerv sub form de granule de
glicogen etc.
Numeroase specii bacteriene pot forma endospori
structuri care permit supravieuirea speciei n condiii
nefavorabile. Au fost descoperii spori care au existat n stare
latent peste 25 milioane ani, pstrndu-i capacitatea de
88

restabilire. Endosporii au un perete celular gros ce conine
proteine, iar citoplasma este deshidratat.

Aparatul genetic al celulelor bacteriene
Materialul genetic al celulelor bacteriene este reprezentat
prin nuocleoid i plasmide.
Nucleoidul constituie partea principal a genomului
bacterian i reprezint o molecul circular de ADN cu
lungimea de aproximativ 1 mm care conine aproximativ 5x10
6

perechi de nucleotide (pb). Nucleoidul este fixat de membrana
plasmatic prin punctul de origine a replicrii. Bacteriile se
divid foarte intens, astfel, ADN se replic permanent. Deoarece
bacteriile nu posed
microtubuli (fus de
diviziune) care ar asigura
migrarea cromozomului
bacterian, diviziunea
celular de tipul mitozei
este imposibil. Pentru a
asigura segregarea
nucleoizilor n celulele
nou-formate ei se
ndeprteaz n rezultatul
creterii membranei
plasmatice, iar dup
formarea peretelui
despritor nimeresc n
celule diferite (fig. 5.3)
Din punct de vedere chimic nucleoidul const din 80%
ADN (comparativ, la eucariote 40%), proteine i ARN.
Proteinele din cadrul nucleoidului au proprieti bazice i se
aseamn cu proteinele histonice ce asigur compactizarea
ADN-ului la eucariote. ADN-ul bicatenar se asociaz cu
Fig. 5.3. Etapele reproducerii
celulei bacteriene
89

proteinele bazice prin rsucire. La fiecare 40 mii nucleotide
(40kb) ADN-ul astfel compactizat formeaz nite bucle prin
asocierea fizic la alte proteine bazice (fig. 5.4). Mecanismul de
meninere a structurilor superspiralizate nu este deocamdat
cunoscut, dar posibil sunt implicate moleculele de ARN.


Sub aspect funcional, majoritatea secvenelor de ADN
reprezint secvene unicale gene structurale. Genele care
codific principalele clase de ARNr sunt grupate n tandem i se
repet de 7 ori n genomul E.coli.
Plasmidele reprezint molecule circulare de ADN
capabile s se replice independent de nucleoid i care constituie
0.05-10% din genomul bacterian. Ele sunt responsabile de
sinteza unor metabolii (aminoacizi, antibiotici, factori de
rezisten la antibiotici etc). Pentru replicare i transcripie
plasmidele utilizeaz produsele codificate de genele din
nucleoid, n timp ce iniierea replicrii este dirijat de gene
plasmidice. Dup numrul de copii per genom exist:
plasmide cu un numr mic de copii (1-5) - de obicei sunt
molecule mari, numrul i activitatea crora se afl sub un
control strict al nucleoidului;
Fig. 5.4. Etapele condensrii ADN-ului la procariote
90

plasmide cu un numr mediu de copii (10-50) - molecule de
dimensiuni medii, se afl sub control parial;
plasmide cu un numr nalt de copii (>50) - molecule mici,
semiautonome.
Dup genul de activitate n celul deosebim:
plasmide R - codific sinteza factorilor de rezisten la
antibiotice;
plasmide Col - asigur sinteza colicinilor proteine
capabile de a distruge bacteriile lipsite de aceste plasmide;
plasmide F (plasmide de sex) - asigur transferul de gene
n cadrul conjugrii bacteriene.

Recombinarea genetic la bacterii
Recombinarea materialului genetic ntre diferite celule
bacteriene reprezint sursa de variabilitate genetic, foarte
important pentru selecia lor natural n lupta pentru existen.
Exist trei mecanisme de transfer a materialului genetic
de la o celul bacterian la alta: conjugarea, transducia i
transformarea.
Fig. 5.5. Conjugarea bacterian i transferul factorului F
91

Conjugarea reprezint procesul n care dou celule
bacteriene fac schimb de material genetic prin intermediul
pililor. n acest scop contacteaz o bacterie purttoare de
plasmid F (F
+
) i una lipsit de plasmid (F
-
). Se consider ca
donor de material genetic celula F
+
, iar celula F
-
- acceptor de
material ereditar. Din celula-donor se transfer o copie
monocatenar a plasmidei F. n celula acceptor molecula
monocatenar se transform n bicatenar i obine form de
cerc. Ca rezultat ambele celule se transform n F
+
i n
continuare pot funciona ca donori de informaie genetic (fig.
5.5).

Fig. 5.6. Integrarea factorului F n genomul bacterian. Formarea
bacteriilor Hfr
92

n unele cazuri factorul F se integreaz n nucleoid, iar
suele respective se numesc Hfr (High frequency
recombination). Celula Hfr servete ca donor la conjugarea cu o
celul F
-
, transfernd n celula-recipient o copie ntreag a
nucleoidului (fig. 5.6). La fel ca i factorul F, n celula acceptor
trece o molecular monocatenar. n unele cazuri procesul de
conjugare se ntrerupe, ca rezultat are loc transferul doar a unui
fragment din nucleoid.
n unele celule
Hfr factorul F se
excizeaz din nucleoid,
purtnd cu sine i un
fragment al acestuia. n
acest caz molecula
recombinat poart
denumirea de factor F'
'

(plasmid F') (fig. 5.7).
Celulele cu plasmide F'
pot participa n procesul
de conjugare.

Transformare
a genetic se
caracterizeaz prin
ptrunderea n bacterie
a moleculelor de
ADN din exteriorul
celulei. Celulele
pregtite pentru
transformare poart denumirea de celule competente i pot fi
obinute n condiii de laborator prin incubarea la temperaturi
sczute n prezena ionilor de Ca
2+
, Cs
+
etc. Importana practic
a transformrii genetice const n posibilitatea introducerii unor
Fig. 5.7. Recombinarea ntre nucleoid
i plasmid. Obinerea factorului F
93

gene de interes (de ex., gena insulinei) n bacterii cu scopul
obinerii proteinelor ce pot fi utilizate n calitate de preparate
medicamentoase. n condiii de laborator pentru transformare se
utilizeaz n special plasmidele din familiile R i Col. n condiii
naturale s-a descris transformarea pneumococilor i a E.coli cu
ADN circular i liniar. Pentru ca moleculele de ADN s nu fie
hidrolizate de enzimele gazdei ele devin circulare, sau se
integreaz n genomul gazdei.
Transducia reprezint transmiterea informaiei
ereditare de la o celul bacterian la alta prin intermediul
bacteriofagilor. Bacteriofagii lizogeni sunt capabili s se
integreze n genomul celulei gazde. Sub aciunea factorilor
exogeni (radiaie, temperatur, pH), ei se excizeaz din nucleoid
purtnd un fragment al acestuia. Bacteriofagul excizat se
multiplic, ceea ce conduce la distrugerea celulei-gazd.
Infectnd alte celule, bacteriofagul transport i informaia
genetic de la celula distrus.
Recombinarea genetic la bacterii are i un rol medical. n
primul rnd, este vorba despre posibilitatea obinerii preparatelor
farmaceutice prin utilizarea bacteriilor transformate. Datorit
recombinrilor genetice n natur apar populaii de bacterii patogene
rezistente la preparatele medicamentoase, ceea ce pune n dificultate
vindecarea bacteriozelor.

Verificarea cunotinelor
1. Definii noiunile: procariot, murein, nucleoid, plasmid,
conjugare, mezozom, transducie, transformare.
2. Care sunt componentele celulei procariote?
3. Care sunt particularitile nveliului celular la bacterii?
4. Care este caracteristica genomului bacterian?
5. Care sunt tipurile de recombinare genetic la bacterii?
6. Ce rol biologic i medical are recombinarea genetic la
bacterii?
94









NUCLEUL

Nucleul este o structur intracitoplasmatic prezent n
toate celulele eucariote cu excepia hematiilor adulte (fig. 6.1).
Nucleul ndeplinete dou funcii importante:
Fig. 6.1. Poziia i conexiunile nucleului n celul
95

- depoziteaz majoritatea informaiei genetice din celul
(conine circa 98% din ADN-ul celular);
- controleaz i regleaz activitatea celulei.
Nucleul este alctuit din matrice sau suc nuclear,
cromatin sau cromozomi, nucleoli i anvelop nuclear (fig.
6.2.). n compoziia nucleului intr ADN, ARN, dou tipuri de
proteine (histone i non-histone), diferii compui organici i
anorganici. Lipidele i glucidele exist n cantiti foarte mici,
prezente doar n anumii componeni nucleari.
Nucleul este centrul coordonator al celulei eucariote,
funcionnd ca un computer chimic prevzut cu un program
(ADN) i memorie (ARN). Ca centru informaional, nucleul
coordoneaz toate reaciile chimice de desfurare a proceselor
vitale prin controlul sintezei proteinelor enzime celulare, iar
organizarea celulei prin sinteza proteinelor de structur. n
fluxul informaional exist trei puncte cheie: replicarea ADN,
transcripia ARN i traducerea mesajului genetic. Autoreplicarea
Fig. 6.2. Structura nucleului
96

i transcripia se efectueaz n nucleu, iar traducerea mesajului
n citoplasm.

Anvelopa nuclear
Anvelopa nuclear este o membran dubl prevzut cu
pori. Membrana extern a nveliului nuclear continu cu RE
rugos, membrana intern e lipsit de ribozomi. n locurile unde
foia intern continu cu cea extern se formeaz porii nucleari,
iar spaiul dintre membrane este numit perinuclear (20-40nm) i
comunic cu RE. Porii reprezint circa 10% din toat suprafaa
nveliului nuclear (la mamifere).

Complexul porului nuclear
Complexul porului este compus din porul propriu-zis de
form octagonal cu un diametru de 60 nm, trei inele (annulus)
cu diametrul de 120 nm. Inelul e format din opt granule proteice
globulare cu diametrul de 15 nm care dau form o octagonal. n
centru e prezent granula central cu rol de diafragm fin, care,
conform unor ipoteze, de fapt reprezint molecule sau particule
n tranziie. Canalul porului are lungimea de 15 nm i diametrul
de 9 nm. Porul nuclear interacioneaz cu matricea nuclear prin
intermediul unor filamente cu diametrul de 4-8 nm, care se
termin cu o extremitate pe inelul intern. (fig. 6.3).
Funcia porilor: prin intermediul lor se realizeaz n
special transportul macromoleculelor din nucleu n citoplasm i
invers:
(i) din citoplasm sunt importate n nucleu proteine ale
matricei nucleare, enzime de sintez a acizilor nucleici,
proteine ce fac parte din componena cromatinei, proteine
ribozomale;
(ii) din nucleu n citoplasm se export precursorii
ribozomilor, particule formate din complexe de ARNm cu
proteine speciale, ARNt.
97

Matricea nuclear
Matricea nuclear este denumirea atribuit scheletului
de natur proteic care nglobeaz cromatina i nucleolii i care
se sprijin pe membrana nuclear. Ea are un rol esenial n
organizarea nucleului i sinteza ADN sau ARN, n medierea
semnalelor hormonale, diviziune i alte funcii nucleare.
Matricea nuclear este compus din dou pri:
- matricea nuclear propriu-zis reprezentat de scheletul
sau reeaua proteic i alctuit din proteine stabile cu mas
molecular mare;
- fraciunea labil a matricei care este legat lax de reeaua
proteic i conine proteine solubile cu mas molecular
mic, molecule organice mici, substane anorganice i ap.
Cea mai mare parte din proteinele ce intr n alctuirea
matricei nucleare (att n matricea propriu zis, ct i n fracia
labil) este reprezentat de aa-numitele proteine nehistonice, la
care se adaug i enzimele nucleare. Proteinele nehistonice sunt
o familie de proteine foarte heterogene att ca mas molecular,
Fig. 6.3. Structura porului nuclear
98

ct i ca particulariti chimice. Spre deosebire de histone, o
mare parte din acest grup de proteine sunt bogate n triptofan;
ele au un turnover foarte rapid, fluctund n limite foarte largi de
la o stare funcional la alta. Enzimele nucleare catalizeaz n
mod special sinteza ADN, ARN i processingul.

Matricea nuclear propriu zis
Matricea nuclear propriu zis sau scheletul nuclear este
format din trei componente:
- matricea sau reeaua fibrilar intranuclear, intercromatic
i pericromatic;
- componentele nemembranoase ale nveliului nuclear,
formate din lamina densa (lamina fibroasa) intern i
complexele por;
- componenta nucleolar sau reeaua fibliral din pars fibrosa
i pars garanulosa a nucleolului.
Lamina densa interna se afl pe faa nuclear a membranei
interne din nveliul nuclear. Se prezint sub forma unei
reele fibrilare conexate la reeaua matricei nucleare, precum
i la componentele fibrilare ale complexului por.
Lamina densa intern a nucleolemei mpreun cu complexul
por formeaz partea scheletului nuclear denumit complex
lamina-por. Complexul este alctuit din fibrile ce realizeaz
trei reele:
(i) fibrile ale laminei densa interconexate cu fibrile ale porului,
formeaz o reea n planul membranei interne nucleare sau
imediat adiacent acesteia;
(ii) fibrile intranucleare ataate complexului por orientate
perpendicular pe nveliul nuclear;
(iii) fibrile intranucleare care structureaz regiunea ocupat de
heterocromatina periferic din nucleul intact. Aceast reea
99

difer de la o celul la alta dup cantitatea de
heterocromatin n nucleul respectiv.
Nucleoscheletul complexului lamina-por conine 2-3%
din totalul proteinelor din nucleu. Este alctuit n principal din
proteine nehistone (95%), ntre care predomin cele acide. Pe
faa intern a complexului lamin-por se realizeaz activitatea
nucleozid-trifosfatazei, considerat a fi implicat n transportul
ARN ctre citoplasm.
Rolul matricei nucleare
Matricea nuclear menine forma nucleului i stabilitatea
sa n interfaz. Modificrile matricei nucleare sunt strns cuplate
cu funciile nucleului: organizarea cromatinei, replicarea ADN,
transcripia i transportul intranuclear al ARN.
Matricea nuclear poate modula fluiditatea membranei
nucleare, fluiditate necesar la rndul ei funciei matricei
nucleare, n special n cea de transport al subunitilor
ribozomale prin porii nucleari.
Matricea nuclear poate modifica structura cromatinei,
fenomen important pentru realizarea replicrii ADN,
transcripiei ARN (activarea sau inactivarea genelor).
n timpul mitozei 95% din proteinele matricei nucleare
sunt distribuite n citoplasm. n refacerea nucleului dup
diviziune un rol important l joac glicozilarea acestor proteine
la nivelul AG.
n nucleol scheletul ar avea rol de suport pentru
depozitarea subunitilor ribozomale.

Nucleolul
Nucleolul e prezent la toate celulele eucariote cu
excepia celulelor blastomerilor, n care nu are loc biosinteza
proteinelor proprii (fig. 6.4). El conine trei componeni
principali: ADN - 3%; ARN - 7%; proteine - 90%.
100

Nucleolul nu este separat prin membran de restul
nucleului. Numrul i volumul nucleolilor depinde de etapa
funcional a nucleului (n celulele omului teoretic pot fi
maximal 10 nucleoli mici la nceputul interfazei i un nucleol
mare la sfritul interfazei). Nucleolii ocup circa 30% din
volumul nucleului. Exist un raport determinat ntre volumul
nucleului i cel al nucleolului numit volum nucleolo-nuclear.
Cu ct mai activ este celula n ce privete sinteza proteinelor cu
att acest raport este mai mare.
La microscopul electronic se disting 3 zone componente
ale nucleolului:
- componentul granular - particule cu diametrul 15-20 nm, ce
reprezint precursorii ribozomali;
Fig. 6.4. Structura nucleolului. Biogeneza ribozomilor
101

- componentul fibrilar - din fibre de ADN de 5 nm (pe care
se sintetizeaz ARNr) i fibre de transcripi;
- componenta amorf a spaiilor dintre fibre i granule, se
gsete la periferia nucleolului.
Rolul nucleolului este sinteza ARNr i asamblarea
precursorilor ribozomali. Segmentul de ADN (cromozom) n
care se conin gene ce codific pentru ARNr poart denumirea
de organizator nucleolar. La om exist 5 perechi de cromozomi
cu organizatori nucleolari care controleaz formarea nucleolilor
la sfritul mitozei (perechile: 13, 14, 15, 21, 22).

Biogeneza ribozomilor
n nucleol are loc sinteza a trei fracii de ARNr (5,8S;
18S; 28S) i stocarea precursorilor ribozomali. De pe ADN se
transcrie un precursor - ARNr 45S, care este procesat n trei
fracii mai mici (28S; 18S; 5,8S). ARNr 5S este sintetizat n
afara nucleolilor. Moleculele de ARNr se asociaz cu proteine
ribozomale sintetizate n citoplasm i importate n nucleu.
Particulele ribonucleoproteice (RNP) sunt transportate n
citoplasm sub form de subuniti ale ribozomilor (40S i 60S).

Cromatina = cromozomii interfazici
Cromatina este compus din ADN, proteine histone,
proteine nehistone i ARN. Astfel, cromatina poate fi
considerat o nucleoproteid n care proteinele histone i
nehistone interacioneaz att ntre ele, ct i cu ADN-ul.
Cromatina se caracterizeaz prin forma extins i
despiralizat a cromozomilor n interfaz.
La microscopul optic se pot fi observate granule, reele
de filamente i corpusculi numii cariozomi, care se coloreaz
cu colorani bazici. Din punct de vedere al interaciunii cu
coloranii bazici, cromatina se clasific n dou categorii:
- eucromatina care se coloreaz slab cu colorani bazici;
102

- heterocromatina care se coloreaz foarte intens cu colorani
bazici.
Eucromatina reprezint regiunea cromatinei care
conine gene structurale i este poriunea funcional activ a
ADN-ului, de pe care are loc transcripia. Aceasta este slab
condensat i, deci, se replic timpuriu, la nceputul perioadei S
a interfazei.
Heterocromatina reprezint segmente de cromatin
inactiv genetic, care nu se supune transcripiei. Este mai
puternic condensat i se replic tardiv n faza S. Se disting dou
tipuri de heterocromatin: constitutiv i facultativ.
Heterocromatina facultativ reprezint secvene care n
anumite condiii se pot despiraliza i transforma n eucromatin.
Heterocromatina constitutiv conine ADN repetitiv sau satelit.
Acest tip nu se transform niciodat n eucromatin.
Localizarea segmentelor heterocromatice n cromozomii
omologi este identic.

Organizarea molecular a cromatinei:
ADN (30%-40%) n cei 46 de cromozomi din setul
diploid al celulei somatice umane se conin 46 de molecule
liniare de ADN cu o lungime de 7 X 10
9
p.b.
Proteine histonice (40%) - polipeptide bazice, ce conin
peste 22% aminoacizi bazici, n special arginin i lizin. Exist
cinci fracii de histone: H1, H2A, H2B, H3, H4 (tab. 6.1)
.
Proteinele histonice nu au specificitate de esut.

103

Funciile histonelor
Proteinele histone stabilizeaz dublul helix de ADN,
inducnd o structur teriar nivel elementar de organizare a
ADN la eucariote. Din punct de vedere funcional ele represeaz
nespecific transcripia, mpiedicnd unirea ARN-polimerazei la
ADN.
Proteinele nonhistone - proteine acide (20%) cu un
coninut mrit de aminoacizi acizi (acid glutamic i acid
aspartic). Sunt heterogene, au o mobilitate mare, ndeplinesc
funcii catalitice n metabolismul ADN-ului i expresia
informaiei genetice (polimeraze, ligaze, topoizomeraze, SAR,
factori de transcripie). O cantitate mare a proteinelor
nonhistonice este prezent n esuturile active, pe cnd histonele
sunt prezente n cantiti egale n esuturile active i inactive.
ARN este prezent n cromatin fiind produsul de sintez de pe
ADN, n special transcripi primari i ARNsn (de ex., ARN din
compoziia primazei, telomerazei, etc.).

Nivelurile de organizare a cromozomilor
mpachetarea ADN-ului ntr-un cromozom presupune
existena ctorva nivele de organizare sau condensare, fiecare
fiind responsabil de un anumit grad de micorare a lungimii
ADN-ului.
Primul nivel nucleozomic este determinat de
asamblarea ADN-ului cu histonele, ce formeaz filamentul de
cromatin (DNP) cu diametrul 11 nm (fig. 6.5). n cadrul acestui
Tabelul 6.1. Caracteristica proteinelor histone
Tipul de
histon
Aminoacizii predominani
Numr
aminoacizi
Masa
molecular
H1 Lizina 215 21500
H2A Leucina, lizina 129 14000
H2B Serina, prolina, lizina 125 13775
H3 Arginina, conine cistein 135 15320
H4 Arginina, lizina 102 11280
104

nivel molecula de ADN se scurteaz de ~6 ori. Fiecare
nucleozom const dintr-un miez histonic (core) format din: 8
proteine: 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4

i o secven de ADN cu o
lungime de 146 pb.
ADN-ul nfoar de ~2 ori octamerul histonic, formnd
un complex stabil nucleozomul. ntre nucleozomi secvena de
ADN- linker are o lungime variabil, de la 8 pn la 114 pb.
Astfel filamentul polinucleozomic de cromatin are aspectul
unui irag de mrgele.


Al doilea nivel solenoidul este reprezentat de fibra
de cromatin de 30 nm ce rezult din superspiralizarea
Fig. 6.5. Structura nucleozomului
105

filamentului de cromatin (fig. 6.6). Acest nivel de compactizare
scurteaz molecula de ADN de 40-60 ori.
Solenoidul reprezint o superspiral de dreapta cu ase
nucleozomi per tur (fig. 6.6., B,C). Trecerea cromatinei de la
nivelul I la II i invers este determinat de modificrile chimice
ale histonei H1. Fosforilarea H1

se asociaz cu superspiralizarea
DNP, iar defosforilarea H1 cu despiralizarea solenoidului (fig.
6.6., A). Acest lucru este important n reglarea activitii
genelor. Histona H1 este asociat att cu miezul nucleozomic,
ct i cu segmentul ADN linker i are rol n stabilitatea
nucleozomului.
Al treilea nivel de compactizare este reprezentat de
mpa-chetri
suplimentare, formnd
structuri mai complexe
denumite bucle (300
nm,700 nm).
Acest tip
structural de cromatin
este bine legat ntr-un
suport structural n
nucleu denumit matrix
nuclear sau ax
cromozomial
(scaffold) prin
interme-diul unor
proteine acide SAR
(Scaffold Associated
Regions) (fig. 6.7 ).

Fig. 6.6. Formarea solenoidului al
II-lea nivel de compactizare a ADN
106

Al patrulea nivel reprezint condensarea i plicaturarea
buclelor ce
duce la
formarea
cromatidelor
cromozomului
metafazic.
Fiecare
cromatid are
grosimea de la
700 la 1200
nm, iar ADN
n cromosom
se scurteaz de ~ 10000 ori.
Datorit proprietii
cromatinei de a se compactiza n
nucleul celulei umane cu diametrul
de ~4um ncap 46 molecule de ADN
cu lungimea total de circa 2 m.
Cromozomul metafazic este
format din 2 cromatide surori
identice unite prin centromer la
nivelul constriciei primare (fig.
6.8). Constricia primar ct i
perechea de kinetocori (disc
trilamelar din fibre de cromatin
superior organizate) reprezint
situsurile de ancoraj ale
microtubulilor fusului de diviziune.
Centromerul reprezint punctul de unire a cromatidelor
i de asamblare a kinetocorilor.
Fig. 6.7. Asocierea buclelor la proteinele axei
cromozomiale (Scaffold)
Fig. 6.8. Aspectul unui
cromozom metafazic
107

Centromerul mparte cromozomul n dou brae: braul p -
proximal, mai scurt; braul q - distal, mai lung. Regiunea
centromeric a cromozomului este format din ADN i proteine
speciale. ADN centromeric conine secvene repetitive n
tandem i secvene repetitive dispersate cu localizare
pericentromeric, ce intervin n recunoaterea cromozomilor
omologi la conjugare, meninerea celor dou cromatide surori
pn la sfrit de metafaz i separarea lor n anafaz. La drojdii
centromerul are dimensiuni de ~120 pb (fig. 6.9). La eucariotele
superioare regiunea centromeric are dimensiuni mult mai mari,
de ordinul sutelor de mii de nucleotide.
Telomerii reprezint complexe din ADN i proteine
specializate care formeaz capetele cromozomilor eucariotelor.
La procariote toate moleculele de ADN sunt circulare
ceea ce previne degradarea lor enzimatic. La eucariote ADN
are structur liniar, de aceea pentru a asigura protecia de
exonucleaze i individualitatea cromozomilor (mpiedic
reanrajamentele cromozomice) apare o structur specific din
secvene scurte repetate de ADN (tab. 6.2).

Fig. 6.9. Structura centromerului la drojdii
108



Captul 3' al moleculei de ADN este mai lung, format
dintr-o secven conservat (GGGGTT)
n
i formeaz o bucl
prin legturi de hidrogen nespecifice G-G (necomplimentare)
(fig. 6.10).

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: por nuclear, organizator nucleolar,
eucromatin, heterocromatin, nucleozom, solenoid, histon,
centromer, telomer, cromatid.
2. Care sunt componenii structurali ai nucleului interfazic?
3. Care sunt particularitile organizrii anvelopei nucleare?
4. Ce rol ndeplinete complexul porului nuclear?
5. Care sunt etapele biogenezei ribozomilor?
6. Care sunt nivelurile de compactizare a cromatinei?
7. Care sunt componenii nucleozomului?


Tabelul 6.2 Varietatea secvenelor telomerice
Specia Secvena repetat
Macronucleul ciliatelor (Tetrahymena) CCCCAA
Minicromozomul la Trypanosoma CCCTA
Cromozomii drojdiei Saccharomyces C
2-3
A(CA)
1-3
Cromozomii plantelor (Arabidopsis) C
3
TA
3
Cromozomii umani C
3
TA
2
Fig. 6.10. Structura telomerului
109







REPLICAREA I REPARAREA ADN

Replicarea ADN este procesul molecular prin care se
realizeaz copierea exact a moleculelor de ADN (a secvenei
nucleotidice). Datorit replicrii are loc transmiterea exact a
mesajului genetic de la o generaie de celule la alta, astfel toate
celulele organismului pluricelular conin aceeai informaie
ereditar.
Procesul de sintez a ADN este, de regul, exact. Dintr-o
molecul de ADN se formeaz dou molecule identice att ntre
ele, ct i cu molecula parental. Acest proces are loc datorit
particularitilor de structur ale ADN:
- ADN este bicatenar;
- catenele ADN sunt complementare i antiparalele.
Principalele caracteristici ale replicrii sunt:
sinteza replicativ a ADN-ului este semiconservativ,
deoarece, cel mai des, fiecare din cele dou catene este folosit
ca matri pentru sinteza unei catene noi de ADN;
sinteza este bidirecionat;
polimerizarea nucleotidelor are loc doar n direcia 5 3;
procesul implic participarea mai multor factori proteici.

Aparatul de replicare
Aparatul de replicare include ADN-matri cu punctul de
origine, nucleozide trifosfai ct i proteine pentru despiralizarea
110

helixului de ADN, iniierea replicrii, polimerizarea
nucleotidelor etc.
Originea replicrii
Originea replicrii este reprezentat de o secven specific
de nucleotide numit secven autonom de replicare ori.
Unitatea capabil de replicare independent se numete un
singur replicon, la eucariote ADN conine mai multe puncte de
origine, deci mai muli repliconi. n tabelul 7.1. sunt prezentate
datele privind numrul de repliconi per genom, lungimea medie
a unui replicon i viteza de polimerizare la diferite organisme.


Secvena ori are urmtoarea structur :

ORE secvena ADN-ului la care se unesc proteinele situs-
specifice i proteinele replicrii;
DUE - situsul care uor se despiralizeaz, este sensibil la
nucleaze i nesensibil la mutaii;
A/T situsul ce regleaz activitatea helicazei;
AUX-2 i AUX-1 - situsuri ce se unesc cu factorii de iniiere ai
replicrii cu specificitate nalt.
La procariote punctul de origine este fixat de membrana
plasmatic, iar la eucariote se fixeaz cu metaloproteine de axa
proteic a cromozomilor (SAR).

Tabelul 7.1. Unele caracteristici ale repliconilor
Organismul Nr. de
repliconi
Lungime medie,
kb
Viteza replicrii,
pb/min
E. coli 1 4200 30000
S. pombe 500 40 3600
D. melanogaster 3500 40 2600
M. musculus 25000 150 2200
Homo sapiens 10
5
-10
6
100-1000 3000
111

Proteinele aparatului de replicare
Replicarea ADN implic aciunea mai multor factori
proteici i enzime (fig. 7.1).
ADN-helicazele realizeaz despiralizarea i denaturarea
local a moleculei de ADN prin hidroliza ATP. Datorit
existenei a dou furci replicative exist dou helicaze care se
deplaseaz n direcii opuse de la punctul de origine a replicrii.
Primaza este enzima cu activitae ARN-polimerazic
care iniiaz replicarea ADN prin sinteza unei secvene de 11-12
Fig. 7.1. Enzimele aparatului de replicare
112

ribonucleotide, care este numit primer (ARN-primer).
Helicazele mpreun cu primaza formeaz complexul primozom.
Topoizomerazele de tip I scindeaz legturile
fosfodiesterice ale unei catene, relaxnd dublul helix
previnindu-se supraspiralizarea ADN. Topoizomerazele de tip
II taie ambele catene ale duplexului.
Proteinele ce se leag de ADN monocatenar (proteine
SSB) - factori ce stabilizeaz catenele de ADN n regiunile
denaturate i mpiedic refacerea structurii dublucatenare prin
unirea celor dou catene, sau n cadrul aceleai catene n
regiunile cu secvene palindromice (fig. 7.2).


ADN-polimerazele sunt enzime capabile s sintetizeze
catene noi de ADN pe catenele matrie. Au fost descoperite mai
multe clase de ADN-polimeraze: o, |, , , la eucariote i
I,II i III - la procariote (tab. 7.2).

Fig. 7.2. Stabilizarea monocatenei de ADN n timpul
replicrii
113


Activitatea polimerazic are urmtoarele particulariti:
sinteza se produce doar n direcia 5' 3' prin adugarea
nucleotidului la gruparea 3'-OH a pentozei (fig. 7.3);
citirea are loc doar n direcia 3' 5';
pentru sintez se utilizeaz precursori trifosfai, care pierd n
reacie dou grupe fosfat;
ADN-polimeraza nu poate iniia sinteza unei catene noi de
ADN, ele au capacitatea doar de a extinde o caten
preexistent de ADN sau ARN-primer.
Tabelul 7.2. Caracteristica ADN-polimerazelor la
eucariote
ADN
polimeraza

Localizarea Nucleu Nucleu Nucleu Nucleu
Mitocon-
drii
Funcia sintetic
Sinteza
primerilor
Sinteza
ADN
Reparaie Reparaie Replicare
Funcii
suplimentare
-
Exonucle-
az

Exonucle-
az
-
Exonucle-
az
Fig. 7.3. Activitatea ADN-polimerazelor
114

De rnd cu activitatea sintetic, ADN polimeraza conine
subuniti care prezint activitate nucleazic pentru scindarea
ARN-primerului din fragmentele de ADN sintetizate sau excizia
nucleotidelor n procesul de corecie a erorilor introduse n
timpul replicrii.
ADNligaza este enzima ce leag capetele fragmentelor
de ADN sintetizate prin formarea legturilor 3' 5'
fosfodiesterice.

Mecanismul replicrii
Sinteza ncepe prin despiralizarea catenelor de ADN i
formarea furcii de replicare. Fiecare caten reprezint o matri
pentru catena nou format. Despiralizarea este necesar pentru
expunerea bazelor celor dou catene n aa mod ca noile baze s
le poat recunoate i s formeze perechea complementar.
Sinteza decurge bidirecional: de la fiecare punct de origine se
formeaz dou furci replicative n direcii opuse fa de origine
(fig. 7.8).
Replicarea necesit un complex proteic numit replizom
care recunoatere punctul de origine a acesteia i o iniiaz.
Proteina / proteinele de recunoatere (la drojdii sunt cunoscute
cinci proteine) se leag de ori i iniiaz despiralizarea local a
ADN n situsul DUE.
Complexul multifermentativ, numit replizoma, se mic de-
a lungul ADN-ului i efectueaz sinteza pe ambele catene ale
furcii. Replicarea ar putea fi vzut ca creterea continu a
celor dou catene de ADN n dublul helix. Este necesar de
accentuat c:
- citirea matriei se efectueaz doar n direcia 3 5;
- sinteza catenei noi se efectueaz doar n direcia 53.
n furca de replicare (fig. 7.4):
115

catena matri 3 5 de ADN se numete caten
lider, se citete n direcia 3 5; catena fiic este
sintetizat nentrerupt n direcia 53;
catena - matri 5 3 este numit caten ntrziat, se
citete la fel n direcia 3 5; catena fiic se sintetizeaz
la fel n direcia 5 3 discontinuu, pe fragmente,
cunoscute ca fragmente Okazaki,. Lungimea fragmentelor
Okazaki este de 1000-2000 de nucleotide la procariote i de
100-200 de nucleotide la eucariote.
Conform ipotezei lui Artur Cornberg, catena ntrziat,
este inversat la 180 (este aplicat pe sine nsi). Astfel
moleculele ADN-polimerazei unite cu alte proteine ale
repliconului determin sinteza concomitent a ambelor catene.
La ntlnirea a dou furci replicative procesul de
replicare se stopeaz. Enzima ADN-ligaza unete ntre ele
fragmentele Okazaki.

Fig. 7.4. Mecanismul replicrii ntr-o furca replicativ
116


Etapele replicrii
1. Iniierea include urmtoarele procese:
ataarea replizomului la punctul de origine al replicrii i
despiralizarea local a helixului ADN de ctre helicaze;
sinteza ARNprimerului o secven scurt de
ribonucleotide de ctre primaz (o enzim cu actrivitate
ARN-polimerazic);
adugarea dezoxiribonucleotidelor complementare matriei
la captul 3 al primerului realizat de ADN polimeraz.
2. Elongarea se caracterizeaz prin alungirea catenelor nou -
sintetizate nfptuit de ADN-polimeraz, ce se deplaseaz rapid
de-a lungul catenelor de ADN, fcnd posibil sinteza pe
ambele pri ale furcii ntr-un mod coordonat i eficient.
Evenimentele principale sunt:
creterea continu a catenei lider;
Fig. 7.5. Topografia replicrii conform ipotezei lui A. Cornberg
117

sinteza discontinu a fragmentelor Okazaki;
controlul erorilor de mperechere a bazelor n timpul
replicrii i nlturarea lor, nfptuit de o exonucleaza
35 din componena ADN-polimerazei.
3. Terminarea include urmtoarele procese:
nlturarea ARNprimerilor de ctre o component
enonucleazic 5 3 a polimerazei;
nlocuirea golurilor de ctre ADN-polimeraz;
unirea capetelor fragmentelor catenelor de ADN sintetizate
cu ajutorul ADN-ligazei.

Modele de replicare
Moleculele circulare ale procariotelor (nucleoidul,
plasmidele) se replic prin mecanismul replicrii de tip u. Din
situsul ori pornesc concomitent dou furci replicative, ceea ce
duce la formarea unor structuri asemntoare cu litera greceasc
u (teta) (fig. 7.6).
La unii virui, a unor celulele procariote i eucariote,
exist un alt tip de replicare: replicarea dup modelul inelului
rotitor (replicare de tip ). Nucleaza produce o ruptur
monocatenar cu formarea capetelor libere 5'-P i 3'-OH. ADN-
polimeraza sintetizeaz o molecul complementar n direcia 5'
3' prin rotirea matriei ADN. Captul 5' se deprteaz de
molecula inelar i servete ca matri pentru sinteza unei alte
catene de ADN. Concomitent se pot obine mai multe copii ale
Fig. 7.6. Replicarea de tip la procariote
118

genomului viral, care mai trziu se separ prin excizie cu
endonucleaze specifice (fig.7.7., A ).


n ADN mitocondrial, care are o structur inelar,
fiecare caten conine cte un situs de iniiere propriu. Sinteza
ncepe de pe catena H (catena grea). n momentul cnd furca de
Fig. 7.7. A. Replicarea de tip la virusuri.
B. Replicarea de tip D n mitocondrii
A
B
119

replicare ajunge la punctul ori al catenei L (catena uoar)
ncepe replicarea acesteia n sens opus. Astfel replicarea celor
dou catene este asincronic (replicare de tip D) (fig. 7. 7., B).

La eucariote ADN este reprezentat de molecule liniare
mari, cu diferit grad de compactizare, iar viteza de replicare este
de ordinul a mii de nucleotide pe min (spre comparaie la
procariote 30000 pb/min). Pentru asigurarea sintezei ntregii
Fig. 7.8. Mecanismul i etapele replicrii la eucariote
120

molecule ntr-un timp limitat (n celulele umane 7 x10
9
pb se
replic n 8-9 ore) replicarea ncepe n mai multe puncte ori
(cele 46 de molecule de ADN din celula uman conin 10
5
10
6

repliconi) (fig. 7.8).
La eucariote replicarea are loc numai n perioada S a
ciclului celular i este asincron: secvenele eucromatice se
replic mai timpuriu, la nceputul perioadei S, iar secvenele
heterocromatice la sfritul perioadei S.
O particularitate a replicrii ADN eucariotic este c
captul 5 al catenei noi este mai scurt, deoarece nu exist
posibilitatea completrii golului dup nlturarea primerului
ultimului fragment Okazaki. Astfel apare riscul ca n
succesiunea generaiilor de molecule s se scurteze cromozomii,
ceea ce ar putea cauza pierderea informaiei genetice de la
captul lor. Pentru prevenirea pierderilor de secvene terminale
de ADN captul cromozomului este prevzut cu o structur
special (telomerul) cu un mecanism propriu de sintez.
Regiunile telomerice ale cromozomilor se replic dup
un mecanism special, cu participarea enzimei telomeraza,
format dintr-o protein cu funcie de reverstranscripie ce
conine ARN n calitate de matri (fig. 7.9). n prima etap
are loc asocierea telomerazei la captul 3' al catenei lider din
regiunea telomeric. Ulterior enzima extinde catena, utiliznd ca
matri ARN telomerazic. Procesul de extindere a captului 3'
se repet de mai multe ori. Catena complementar a ADN
telomeric este sintetizat dup principiul catenei ntrziate de
ADN-polimeraz.




121

Reparaia ADN
Procesul de restabilire a leziunilor din moleculele de ADN care
asigur pstrarea intact a materialului genetic de-a lungul mai
multor generaii poart denumirea de reparaie. Acest proces
este caracteristic doar pentru moleculele de ADN i este
determinat de particularitile de structur a acestor molecule:
existena a dou catene complementare i antiparalele.
n structura moleculelor de ADN pot surveni dou tipuri de
schimbri:
Substituia unui nucleotid. Se afecteaz doar secvena
ADN-ului fr a ainfluena structura lui. Aceste schimbri nu se
reflect asupra proceselor de replicare sau transcripie. Ele pot
aprea ca rezultat al erorilor n cadrul replicrii din cauza
mperecherii necomplementare a bazelor (de ex., C::A) sau
datorit transformrilor chimice ale bazelor azotate: (de ex.,
dezaminarea citozinei duce la formarea uracilului).
Fig. 7.9. Mecanismul activitii telomerazei
122

Modificri structurale. Se formeaz ca rezultat al
apariiei legturilor covalente nespecifice ntre nucleotidele
aceleai catene sau din catene opuse. De exemplu, razele
ultraviolete (UV) duc la apariia dimerilor timinici legturi
ntre resturile de timin alturate, de pe aceeai caten. Astfel de
schimbri pot mpiedica replicarea i transcripia.
Sistemele reparative principale ntlnite la diferite
organisme sunt:
- reparaia direct se ntlnete foarte rar i const n revenirea
moleculei la starea iniial (de ex., prin aminare UC);
- fotoreactivarea este este larg rspndit n natur i const
n nlturarea dimerilor pirimidinici cu ajutorul unei enzime
dependente de lumin;
- reparaia prin excizie const n recunoaterea de ctre
enzime a fragmentelor denaturate i nlturarea fragmentului
monocatenar defect. Ulterior are loc restabilirea catenei lezate
cu ajutorul ADN-polimerazei, utilizndu-se ca matri catena
intact. ADN-ligaza unete fragmentul nou-sintetizat cu restul
moleculei, restabilind integritatea ei (fig. 7.10);
- reparaia prin recombinare const n excizia fragmentului
defectat, urmat de importarea secvenei corespunztoare
normale dintr-o molecul omoloag de ADN (fig. 7.11).
Dimerul pirimidinic dup recombinare este nlturat prin
mecanismul reparrii prin excizie (fig. 7.10, B);
- reparaia inducibil SOS - sistemul SOS funcioneaz ca
rrspuns la aciunea unor factori de stres. De exemplu, la E.coli
sub aciunea ocului termic sau a apariiei dimerilor pirimidinici
se sintetizeaz abundent proteina RecA-proteaza, cantitatea
creia este reglat de activitatea altei proteine LexA. Proteina
LexA este unit la o secven de ADN numit blocul SOS care
blocheaz sinteza enzimelor de reparaie. RecA-proteaza, fiind
n cantitate mare, hidrolizeaz proteina LexA, fcnd posibil
activarea unor gene ce codific proteinele de reparaie
123

(aproximativ 15 la numr). Rspunsul celulei se produce foarte
rapid n decursul ctorva minute. n a doua etap se
sintetizeaz n exces proteina LexA, care blocheaz sinteza
RecA-proteazei i peste 30-60 minute sistemul de reparare se
inactiveaz. Mecanismul de reparaie SOS intervine n cazul
leziunilor masive. Scopul lui este completarea golurilor prin
mecanisme de excizie sau recombinare. Acest tip de reparaie nu
este ntotdeauna foarte exact, iar principiul complementaritii
nu se respect n toate cazurile. Ca rezultat, moleculele reparate
prin SOS pot conine erori.
La eucariote au fost determinate mai multe gene incluse
n procesul de reparaie de exemplu familia RAD de la drojdii:
RAD3 reparaia prin excizie; RAD6 reparaia post-
replicativ; RAD52 reparaia prin recombinare.
La oameni cel mai bine a fost studiat sistemul
responsabil de maladia xeroderma pigmentosum (XP). XP este o
boal genetic cu transmitere autosomal recisiv i se
caracterizeaz prin hipersensibilitate la lumina solar, n deosebi
la radiaia UV. Boala este determinat de deficiena
mecanismelor de reparaie prin excizie.
Metilarea ADN
La procariote exist enzime care asigur metilarea
(adugarea grupelor metil CH
3
) citozinei i adeninei, din care
rezult metilcitozina i metiladenina. Secvenele metilate sunt
rezistente la aciunea unor enzime specifice endonucleaze de
restricie (restrictaze). La bacterii restrictazele digereaz
moleculele strine de ADN, n timp ce ADN-ul propriu care
este metilat nu se hidrolizeaz. La eucariote metilarea bazelor
azotate conduce la inactivarea genelor nefuncionale. Astfel,
regiunile heterocromatice din nucleu conin secvene de ADN
metilat.




Fig. 7.10. Reparaia prin excizie


Fig. 7.11. Reparaia prin recombinare
126

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: replicare, replicon, replizom, polimeraz,
fragment Okazaki, reparare, metilare.
2. Care sunt principiile ce stau la baza replicrii ADN?
3. Care sunt particularitile replicrii la pro- i eucariote?
4. Ce componeni intervin n procesul replicrii?
5. Care sunt particularitile sintezei catenei lider i catenei
ntrziate?
6. Ce modele de replicare a ADN cunoatei?
7. Cum se replic capetele cromozomilor?
8. Care sunt mecanismele ce intervin n stabilitatea moleculei
de ADN?
9. Care enzime intervin n procesul de reparaie?
10. Care este importana biologic a metilrii moleculelor de
ADN?

127


GENA

Prima ipotez despre structura i funcia materialului
genetic a fost formulat de Gregor Mendel (1865). Pentru a
explica geneza unor caractere fenotipice ereditare i modul lor
de transmitere la descendeni, el a presupus existena unor
factori ereditari. Aceste elemente, care iniial erau pur
ipotetice, au devenit, n timp, structuri reale, materiale. Dup
descoperirea i descrierea cromozomilor (Waldeyer, 1988)
Boveri i n special Sutton (1902) au emis i susinut ipoteza c
factorii ereditari sau genele (dup termenul introdus de Wilhelm
Johansen, 1903) sunt pri din cromozomi. Aceast idee a fost
confirmat de Thomas Hunt Morgan i colaboratorii si (1910-
1925). n felul acesta, gena nceteaz s mai fie o supoziie
logic, abstract, a geniului mendelian i capt un coninut
concret, material. Cercetrile ulterioare au demonstrat natura
chimic a cromozomilor i genelor. n 1944 Oswald Avery i
colaboratorii si au demonstrat c materialul genetic este
reprezentat de molecula de ADN. n 1953 Francis Crick i
James Watson au descoperit organizarea molecular a ADN i
au determinat c succesiunea de baze azotate (A, G, C, T)
reprezint codul genetic. Informaia genetic perpetueaz
datorit replicrii moleculelor de ADN i se realizeaz prin
transcripia ARN i sinteza de proteine.
n concluzie, gena reprezint un fragment din molecula
de ADN care conine informaia genetic despre sinteza unui
128

anumit tip de protein sau a unei molecule de ARN. Grupul de
gene alturate, localizate ntr-un cromozom formeaz un grup
de nlnuire (grup lincaj). n cadrul acestor grupri, gena
ocup o poziie delimitat de genele vecine. Gena nu este
delimitat de granie morfologice sau grupri chimice
particulare. Ea are o delimitare funcional, relevat de
semnificaia mesajului genetic nscris.

Funcia genei
Gena deine secvena de nucleotide ce controleaz
sintez diferitor molecule de ARN (ARNm, ARNr, ARNt,
ARNsn) i a
diferitor molecule
de proteine.
Fiecare gen are o
succesiune
specific de baze,
de regul de pe ea
se sintetizeaz un
singur tip de ARN.
Complexitatea structurii i funciei organismelor vii este
determinat de spectrul proteinelor pe care le conine. De aceea,
organismele simple (de ex., bacteriile) conin cteva sute de
gene, iar organismele mai complexe - cteva zeci de mii de
gene. n setul diploid de cromozomi umani se conin circa
125000 de gene diferite.
Genele care codific ARNm, tradus n lanuri
polipeptidice specifice, sunt denumite gene structurale. Pentru
acestea se utilizeaz frecvent termenul de cistron. Genele care
se transcriu independent poart denumirea de uniti
transcripionale monocistronice (caracteristice pentru
eucariote), iar mai multe gene ce se transcriu n comun uniti
transcripionale policistronice (caracteristice procariotelor).
129

Prin sinteza diferitor tipuri de proteine genele
controleaz structurile, funciile i proprietile celulei i a
organismului n ntregime. Produii genelor, interacionnd cu
factorii de mediu, pot modula activitatea organismului pentru
adaptarea lui n condiiile schimbtoare ale ambiantului.
Sub aciunea factorilor de mediu genele i pot modifica
structura chimic (apar gene mutante). Mutaiile determin
apariia diferitor variante alelice ale uneia i aceleai gene care
pot avea asupra fenotipului diferite efecte:
- neutre apar variaii individuale ale unuia i aceluiai
caracter (grupele sanguine i serice la om);
- folositoare gene de rezisten la anumite noxe;
- defavorabile apar caractere patologice letale sau
semiletale (de ex., deficiene enzimatice i blocarea unor
lanuri metabolice).
Totalitatea genelor din setul diploid de cromozomi al
unui individ se numete genotip. Totalitatea caracterelor i
proprietilor individului controlate de genotip n interaciune cu
mediul se numete fenotip.

Organizarea molecular a genelor

Genele sunt formate din regiunile transcrise i regiunile
reglatoare (fig. 8.1).
Fiecare gen (unitate de transcriere) conine promotorul
secvena recunoscut de ARN-polimeraza, care realizeaz
transcrierea genei, sau a setului de gene. Promotorul este o
secven obligatorie i se gsete n aval de regiunea transcris
Fig. 8.1. Structura general a genei
130

(la captul 5) (gene pentru ARNm i ARNr) sau se conine n
interiorul secvenei transcrise (gene pentru ARNt). Primul
nucleotid incorporat n molecula de ARN este notat cu +1;
nucleotidele din gen situate n faa punctului de iniiere a
transcripiei se noteaz cu (-), iar cele ce se gsesc spre captul
3' cu (+). Promotorul conine unele secvene consens care se
deosebesc la procariote i eucariote.
Terminatorul este plasat la sfritul unitii
transcripionale i reprezint o secven de nucleotide invertate,
urmat de secvena TTTT. Secvena invertat copiat n
molecula de ARN va condiiona formarea unei bucle, care
stopeaz naintarea ARN-polimerazei i determin terminarea
procesului de transcripie. Terminatorul are o structur
asemntoare la procariote i eucariote (fig. 8.2).

Fig. 8.2. Organizarea secvenei terminatorului genelor
131

Particularitile organizrii genelor structurale la
eucariote

Promotorul genelor eucariotelor const dintr-un segment
de cteva sute de nucleotide situate la extremitatea 5' a genei.
Aceast regiune conine o combinaie de secvene consens ce
constituie situsuri pentru factorii de transcripie (tab. 8.1).
Promotorul genelor structurale, recunoscut de ARN-polimeraza
II, prezint la distana de -20 -30 nucleotide de la situsul de
iniiere (+1) boxa Goldberg-Hogness sau boxa TATA la nivelul
creia se gsete secvena 5' TATA ATAAA-3'. Aceast
secven direcioneaz enzima ARN-polimeraza II spre situsul
de iniiere al transcripiei.
n poziia -75 se gsete boxa CAAT, caracterizat prin
secvena 5'-GGCCAATCT-3'. Boxa CAAT controleaz legarea
proteinelor de iniiere a transcripiei i eficiena acestui proces.
Mai proximal, la -90 nucleotide se gsete o alt
secven conservat boxa GC cu succesiunea 5'-GGGCGG-3'.
Boxa GC poate avea mai multe copii n promotor i intervine n
direcionarea procesului de transcripie.
Fig. 8.3. Organizarea promotorilor diferitor gene ce activeaz n celulele eucariote
132

n afar de aceste boxe mai sunt i alte secvene consens,
ce se leag de proteine reglatoare specifice pentru gena dat (fig.
8.3). Acestea sunt necesare pentru o expresie difereniat a
genelor n celule diferite i perioade diferite ale ciclului celular
(de ex., genele pentru globin se transcriu doar n celulele
precursoare ale eritrocitelor, gena pentru miozin n celulele
musculare, iar gena pentru insulin - n celulele specializate ale
pancreasului etc.).
Boxa Secvena Poziia
Fragmentul
de ADN
acoperit
Factorii de
transcripie
corespunztori
TATA-box TATAAAA - 30 10 p.n. TBP
CAAT-box GGCCAATCT - 75 22 p.n. CTF/NF1
GC-box GGGCGG - 90 20 p.n. SP1
Octamer ATTTGCAT 20 p.n. Oct1, Oct2


Secvene codificatoare
S-a demonstrat c la eucariote structura genei este
discontinu. Paradoxul valorii C confirm c din totalul ADN-
ului genomic doar o parte (10-15%) particip la sinteza
proteinelor. Secvenele neinformaionale au rol diferit:
separ genele (spacieri);
se conin n gene, dar nu sunt reprezentate n secvenele de
aminoacizi (introni);
au rol structural propriu-zis (telomeri, centromeri, satelii).
S-a constatat o discordan ntre dimensiune moleculei
de ARNm, cu cea a ARN precursor (transcript primar) i
dimensiunea secvenei de ADN care a servit ca matri pentru
transcripia ARN respectiv. P. Sharp (1977) a emis ipoteza
structurii discontinue, sau n mozaic, a genei la eucariote.
Tabelul 8.1. Caracteristica secvenelor consens din promotorii
genelor structurale la eucariote
133

Fig. 8.4. Structura discontinu (exon intron) a secvenei
codificatoare n genele eucariotelor

Fig. 8.5. Structura exon-intron a genei -globinei i relaia cu structura proteinei corespunztoare
134

Regiunea transcriptibil a genelor la eucariote cuprinde
secvene codificatoare denumite exoni i secvene
necodificatoare introni (fig. 8.4). Numrul de exoni i introni
este variabil i depinde de complexitatea proteinei pe care o
codific:
- gena -globinei conine 3 exoni i 2 introni (fig. 8.5);
- gena pentru precolagen conine 51 exoni i 50 introni;
- gena pentru Hemofilia A conine 26 exoni i 25 introni
(secvena de ADN const din 180000 p.b., iar molecula
ARNm respectiv are o lungime de doar 9000 b. i constituie
0,2%);
- gena care codific distrofina conine mai mult de 25000000
pb, iar ARNm - doar 14000 b.

Exonii
Exonii reprezint secvene codificatoare ale genei ce se
transcriu, sunt prezeni n ARN precursor, n ARNm i se
regsesc n secvena de aminoacizi a proteinei (fig. 8.4). La
captul 5 al primului exon este o secven scurt de cteva zeci
de nucleotide (secvena lider) cu rol de iniiere a translaiei care
este urmat de codonul universal de iniiere a translaiei ATG.
La captul 3 al ultimului exon se afl unul din cei trei codoni de
STOP informaional (TAA, TAG, TGA) ce determin
terminarea sintezei proteinei i o secven scurt netranslat.


Fig. 8.6. Numrul exonilor la diferite gene ale vertebratelor
135



Numrul exonilor la diferite gene este diferit. n fig. 8.6.
este reprezentat dependena dintre numrul de exoni i
frecvena lor n genomul vertebratelor.

Intronii
Intronii reprezint secvene necodificatoare ale genei ce
se transcriu, sunt prezeni n ARN-precursor, dar nu sunt
prezeni n ARNm (fig. 8.4). n timpul maturizrii ARNm
(splicing) intronii sunt eliminai din ARN-precursor.
Intronii au o lungime cuprins ntre 100 i 10000 pb i,
de regul, sunt mai lungi dect exonii (fig. 8.7). Majoritatea
intronilor prezint la extremitatea 5' secvena dinucleotidic GT
iar la 3' AG, astfel sunt recunoscui de enzimele ce i nltur n
timpul splicing-ului.

Tabelul 8.2. Funciile intronilor
Conceptul clasic Conceptul contemporan
Spaiatori ai exonilor
Reziduuri ale evoluiei
ADN
Codific biopolimeri
Realizeaz autoclivarea ADN
Particip la realizarea expresiei
genelor
Fig. 8.7. Lungimea exonilor i intronilor la diferite gene ale
mamiferelor
136

Particularitile organizrii genelor pentru ARNr i
ARNt la eucariote

Genele pentru ARNr (5,8S; 18S; 28S) sunt organizate
ntr-o unitate de transcripie ce se repet n tandem de cteva
sute de ori i formeaz organizatorul nucleolar (fig. 8.8).
Fiecare unitate de transcripie este separat de unitile
vecine prin secvene netranscriptibile - spaceri. Unitatea
repetabil conine ~12000 pb. Genele pentru ARNr de regul nu
conin introni, excepie fcnd genele protozoarelor. Promotorii
genelor pentru ARNr au o varietate mic i sunt recunoscui de
enzima ARN-polimeraza I. Promotorii au o structur bipartit: o
secven de baz localizat n regiunea -45 +20 ce controleaz
iniierea transcripiei i un element de control proximal n
regiunea -180 -107 (UCE upstream control element).
Genele pentru ARNr 5S sunt localizate n afara
nucleolului i sunt transcrise de enzima ARN-polimeraza III.
Aceste gene formeaz uniti transcripionale n care gena
pentru ARNr 5S se repet n tandem. Promotorul este localizat
n interiorul genelor n limitele +55 +80.
Genele pentru ARNt, de asemenea, sunt organizate n
uniti transcripionale n care secvenele codificatoare sunt
separate prin succesiuni necodificatoare. La drojdii genele
pentru ARNt pot conine introni de 10-30 pb. Genele pentru
ARNt sunt transcrise de ARN-polimeraza III, iar promotorul are
o structur similar cu cea a genelor ARNr 5S.

Fig. 8.8. Organizarea genelor pentru ARNr 5,8S, 18S, 28S
137

Particularitile organizrii genelor la procariote

Aparatul genetic al procariotelor este reprezentat de
molecule circulare de ADN (nucleoid i plasmide). Genomul
procariotelor conine puine secvene necodificatoare. Genele se
caracterizeaz printr-o structur mai simpl i sunt lipsite de
introni. Deoarece metabolismul este intens i necesit modificri
rapide n dependen de condiiile de moment ale mediului,
majoritatea genelor implicate ntr-un lan metabolic formeaz
uniti transcripionale numite operoni.
Operonul conine un singur promotor la captul 5, mai
multe gene structurale (numrul de gene structurale este egal cu
numrul proteinelor implicate n procesul metabolic dat), iar la
captul 3 se afl terminatorul (fig. 8.9). Unii operoni pot conine
i alte secvene reglatoare (secvene operatoare, secvene
atenuatoare etc.).
Promotorul la procariote conine secvenele specifice
caracterizate prin boxa Pribnow n poziia -10, responsabil de
iniierea denaturrii locale a ADN-ului i boxa TTGACA n
poziia -35, la care are loc asocierea primar a ARN-
polimerazei (fig. 8.10).
Fig. 8.9. Organizarea unui operon cu patru gene structurale
138

Celelalte clase de gene (pentru ARNr, ARNt) sunt
organizate n uniti transcripionale mixte, separate prin
spaceri. n fig. 8.11 este prezentat schema unui astfel de cluster
de gene.

Particularitile organizrii genomului uman

Genomul uman const din ADN nuclear (98%) i ADN
mitocondrial (2%). Genele acestor dou sisteme interacioneaz
ntre ele i controleaz activitatea organismului uman prin
controlul sintezei proteinelor de structur, enzimelor i
proteinelor reglatoare.
Genomul nuclear
Genomul nuclear al celulelor somatice este reprezentat
de 46 molecule de ADN, ce corespund celor 46 de cromozomi
monocromatidieni din setul diploid. n nucleul celulelor umane
se conin circa 125000 de gene. Acestea sunt repartizate de-a
lungul cromozomului. ntre gene sunt secvene necodificatoare,
reprezentate de spaceri, ADN-satelit. Fiecare cromozom conine
n mediu 3000 de gene (fig. 8.12). Sub aspect funcional genele
Fig. 8.10. Structura promotorului la procariote
Fig. 8.11. Operonii genelor ARNt i ARNr la procariote
139

nucleare pot fi clasificate n gene eseniale (comune pentru toate
celulele organismului), gene ce intervin n specializarea
celulelor i gene ce codific proteinele reglatoare. De aceea, n
diverse esuturi sau etape ale ontogenezei se exprim (se
transcriu) un numr diferit de gene.
n genomul nuclear pot exista mai multe copii ale
aceleai gene. Grupul de gene, exonii crora sunt asemntori,
codific proteine cu secven i proprieti similare, derivate de
la o gen ancestral, se numete familie de gene. Familiile de
gene pot fi repetitive, nerepetitive i pseudogene.
Familiile de gene repetitive - reprezint repetri ale
uneia i aceleiai gene de mai multe ori per genom. Pot s
funcioneze n acelai esut simultan, sau n esuturi diferite
(genele pentru histone, ARNr, ARNt etc.).
Familiile de gene nerepetitive sunt repetiii ale unor
gene cu efect similar, dar care se deosebesc att prin structur,
ct i prin modul de aciune (gene pentru globine, HLA etc.).
n fig. 8.13 este prezentat organizarea clusterului pentru
-globine. Familia const din patru gene funcionale (, 1, 2,
) i trei pseudogene (, , ). Globina ntr n compoziia
hemoglobinei embrionare, iar globinele n compoziia
hemoglobinelor embrionare, fetale i la adult.

Pseudogene sunt secvene rezultate prin duplicare, dar
care nu funcioneaz. Sunt genele care tac. Ele acumuleaz
mai multe mutaii i pot rezulta peste o perioad de timp ca
membru nou al familiei, cu proprieti distincte.

Fig. 8.13. Clusterul de gene al -globinei
140

Fig. 8.12. Relaia dintre localizarea, structura i funcia genelor n genomul uman
141

Genomul mitocondrial

Genomul mitocondrial este reprezentat de molecule
circulare de ADN cu lungimea de 16.6 kb. n fiecare
mitocondrie se conine un numr variabil de molecule n
dependen de necesitatea energetic a celulei. Aproape toate
nucleotidele aparin secvenelor codante, secvenele ADN cu
funcii reglatoare fiind foarte mici (ADN mitocondrial al
celulelor umane nu conine introni). Toate genele formeaz dou
uniti transcripionale: una pe catena grea cu promotorul HSP i
una pe catena uoar LSP (fig. 8.14). ADN mitocondrial deine
13 gene structurale, dou gene pentru ARNr i 22 gene pentru
ARNt.
Genele structurale codific enzimele implicate n
metabolismul energetic. O gen pentru citocromul b (cit b), trei
gene pentru subunitile 1-3 ale citocrom-c-oxidazei (COI-III),
ase gene pentru subunitile 1-6 i 4L ale NADH
dehidrogenazei (ND 1-6 i ND4L), dou gene pentru
subunitile 6 i 8 ale ATP-sintetazei (A6 i A8) (fig.8.14).
Genele pentru ARNr controleaz sinteza a dou tipuri de
molecule: ARNr 12S i 16S se asociaz cu proteinele importate
din citoplasm la formarea ribosomilor.
ADN mitocondrial codific doar 22 molecule de ARNt.
De regul, ARNt mitocondrial recunoate specific doar primele
dou baze ale codonului din molecula de ARNm. A treia poziie
a codonului poate fi ocupat de o alt baz din aceeai clas
(purinic sau pirimidinic).
Replicarea ADN mitocondrial nu este limitat la faza de
sintez a ciclului celular. Moleculele de ADN se replic
aleatoriu, unele de dou ori, iar altele - nici odat. Totui, n
fiecare ciclu celular, numrul moleculelor de ADN mitocondrial
se dubleaz, meninndu-se constant cantitatea de ADNmt per
celul. Genele mitocondriale se transmit pe linie matern.
142

Fig. 8.14. Genomul mitocondrial uman. Sgeile indic
direcia transcripiei i replicaiei. Segmentele haurate
reprezint genele ARNt

Cooperarea dintre genomul nuclear i cel mitocondrial
constituie un factor esenial att n funcia normal a celulei, ct
i a mitocondriei. Circa 90 gene nucleare codific proteine ce au
rolul de susinere a sistemului genetic mitocondrial: proteine
ribozomale, aminoacil-ARNt-sintetaze, ADN- i ARN-
polimeraze, enzime implicate n procesarea i modificarea ARN,
etc. O serie de proteine codificate de gene nucleare intervin n
reglarea numrului de mitocondrii per celul i a cantitii de
143

proteine sintetizate de aceste organite. Studii efectuate asupra
complexelor enzimatice din membrana mitocondrial intern au
evideniat faptul c acestea conin subuniti esut-specifice ce
acioneaz ca reglatori ai transportului de electroni i care sunt
codificate de gene ce aparin genomului nuclear.

Transpozonii

Secvenele de ADN capabile s migreze de sine stttor
i ocupa o nou poziie n genom poart denumirea de elemente
genetice migratoare sau transpozoni. Cei mai simpli
transpozoni au fost depistai la E.coli i constau din gena
transpozaza flancat de elemente repetitive invertate. Ele
formeaz o familie cu denumirea de IS (insertion sequences).
De obicei ele se insereaz n locuri int cu o secven specific
pentru fiecare transpozon (des. 8.15).



Fig. 8.15. Structrura transpozonului de tip IS
144

Unii transpozoni poart i alte gene, de exemplu gene de
rezisten la antibiotice sau alte preparate medicamentoase. Din
ei face parte familia Tn care conine o regiune central cu gene
specifice, iar regiunile periferice sunt reprezentate de elemente
IS (fig. 8.16).



Retrotranspozonii (de ex: Ty, copia, Alu) utilizeaz n
mecanismul de transpoziie reverstranscriptaza, de aceea, n
mod obligatoriu conin gena pentru aceast enzim, ct i gena
integrazei, care particip la integrarea moleculei de cADN ntr-
un alt loc. La capete retrotranspozonii conin secvene repetitive
lungi LTR (long terminal repeat) care asigur inserarea
fragmentelor. Transpoziia poate fi de mai multe tipuri:
transpoziie nereplicativ, transpoziie replicativ, transpoziie
conservativ i retrotranspoziie (fig. 8.17).
Transpoziia nereplicativ const n transferarea n
ntregime a unui fragment de ADN din poziia veche n una
nou, ca rezultat, adesea apar rupturi bicatenare ale moleculei
iniiale. Cantitatea de ADN, totodat, nu se modific.
Transpoziia replicativ se caracterizeaz prin replicarea
transpozonului, dup care copia obinut se transfer n loc nou.
Ca rezultat cantitatea de ADN crete.
Transpoziia conservativ se caracterizeaz prin
migrarea fragmentelor de ADN n ntregime fr a cauza
modificri n cantitatea de ADN i fr a produce rupturi.
Fig. 8.16. Structura transpozonului Tn
145

Retrotranspoziia are loc n dou etape. Mai nti
elementul migrator se transcrie, apoi de pe copia de ARN cu
ajutorul revertazei (ADN-polimeraz ARN-dependent) are loc
sinteza unei molecule complementare de ADN. Fragmentul nou
format se integreaz n locus nou. Ca efect are loc creterea
cantitii de material genetic.

Transpozonii pot cauza mai multe rearanjri genomice
dintre care cele mai importante sunt:
Fig. 8.17. Schema diferitor mecanisme de transpoziie
146

translocarea poate provoca deleii sau ntreruperi ale genelor,
ceea ce cauzeaz inactivarea genelor;
elementele migratoare servesc ca substrat pentru sistemele
de recombinare celular; dou copii ale aceluiai transpozon n
diferite poziii n cromozom pot cauza recunoaterea i
mperecherea incorect a cromozomilor pe parcursul crossing-
overului.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: gen, gen structural, cistron, promotor,
exon, intron, operon, transpozon.
2. Care este structura general a genelor?
3. Care sunt funciile secvenelor promotorilor la eucariote?
4. n ce const structura mozaic a genelor?
5. Ce reprezint operonul?
6. Care sunt particularitile genomului mitocondrial?
7. Prin ce se deosebesc transpozonii IS, Tn i
retrotranspozonii?

147







TRANSCRIPIA. PROCESSINGUL ARN

ADN deine, sub form codificat, informaia ereditar
necesar edificrii i funcionrii structurilor ce alctuiesc fiina
vie, precum i realizrii proceselor metabolice care
caracterizeaz viaa. Sinteza proteinelor este realizat pe baza
genelor de structur i are loc n citoplasm, pe ribozomi.
Informaia ereditar necesar secvenierii aminoacizilor din
protein se gsete n ADN nuclear. Aceast molecul nu poate
prsi nucleul i de aceea mesajul genetic ce corespunde unei
proteine va fi mai nti copiat, transcris, sub forma unei
molecule mai mici, ARNm, care va putea trece prin porii
membranei nucleare i transmite informaia n citoplasm.
Astfel, sinteza proteinelor se realizeaz n dou etape majore:
transcripia i translaia.
Prima etap este transcripia sau copierea mesajului
codificat n ADN, sub forma unei secvene specifice
complementare de nucleotide, intr-o molecul de ARNm. A
doua etap const n: translaia (descifrarea) informaiei copiat
de ARNm de ctre moleculele de ANRt (care fixeaz specific un
aminoacid), aezarea aminoacizilor n secvena indicat de
ARNm i legarea lor peptidic.
Sinteza proteinelor este precis controlat n funcie de
programul ontogenetic al organismului sau de necesitile sale,
impuse de anumite condiii metabolice sau de mediu.

148

Transcripia este realizat de enzimele numite - ARN-
polimeraze. Sinteza ARN pe baza matriei ADN se desfoar
n direcia 5'3' dup principiul complementaritii (A=U;
T=A; GC; CG). Procesul decurge n mai multe etape
(iniierea, elongarea, terminarea) cu participarea mai multor
componente. Transcripia este reglat de secvene de ADN
specifice ale promotorului, terminatorului i alte secvene
modulatoare (enhancer, silencer, operator). Secvenele consens
sunt recunoscute de proteine specifice reglatoare, ce
interacioneaz cu ARN-polimeraza, direcionnd, accelernd
sau ncetinind procesul.

Transcripia la eucariote
n funcie de ARN-polimeraza care realizeaz transcrierea, la
eucariote genele se mpart n trei clase:
Gene de clasa I gene ce codific ARNr 5,8S, 18S, 28S i
sunt transcrise de ARN-polimeraza I. ARN-polimeraza I
reprezint activitatea sintetic cea mai mare - aproximativ
50-70%.
Gene de clasa II gene ce codific sinteza lanurilor
polipeptidice, transcrise de ARN-polimeraza II (gene
structurale). Se apreciaz c 10% din ADN uman este
transcris n ARNm. Enzima mai transcrie cteva gene care
codific molecule mici de ARN nuclear (snRNA= smal
nuclear RNA). Activitatea relativ a ARN-polimerazei II
este egal cu 20-40%.
Gene de clasa III gene ce codific ARNr 5S i ARNt,
transcrise de ARN-polimeraza III. Activitatea relativ a
enzimei respective este egal cu aproximativ 10% din total.


149

Transcrierea genelor de clasa II

Aparatul de transcriere:
Gena cu secvene codificatoare i reglatoare (promotor,
terminator):
- regiunea promotorului include secvene consens:
boxa TATA, boxa CAAT, boxa CG, octamer etc.,
care sunt recunoscute de proteine reglatoare;
- secvena transcris a moleculei de ADN include: +1,
secvena lider, exonii, intronii, terminatorul (fig. 9.1).
Poziia secvenelor consens din promotor determin care din
cele dou catene de ADN va servi drept matri n sinteza
moleculei de ARN. Catena 5'3' poart denumirea de catena
codogen, netranscris. Catena 3'5' poart denumirea de
catena anticodogen, este transcris, deci servete drept matri
pentru activitatea ARN-polimerazei.

ARN-polimeraza II o enzim nucleoplasmatic,
responsabil pentru transcripia ARNm. n structura ei se disting
10 subuniti funcionale responsabile de recunoaterea
Fig. 9.1. Organizarea genelor structurale la eucariote
150

factorilor generali de transcripie, denaturarea i renaturarea
ADN-ului, catalizarea mperecherii bazelor azotate din ADN i
ARN. Polimerizeaz ribonucleotidele n direcia 5'3' dup
principiul complementaritii pe baza catenei 3'5' a moleculei
de ADN. Aceast enzim nu poate recunoate direct promotorul
i, respectiv, nu poate iniia transcrierea, de aceea activeaz n
complex cu proteinele reglatoare. Spre deosebire de ADN-
polimeraze, ARN-polimerazele pot iniia sinteza ARN pe loc
gol, n lipsa primerului (fig. 9.2). Ca uniti de polimerizare
utilizeaz ribonucleozid trifosfai NTP: ATP, GTP, CTP,
UTP;
Factori proteici de transcriere:
A. Factori de transcriere generali proteine care recunosc
secvenele consens ale promotorului, punctul de iniiere a
transcripiei (+1) i interacioneaz cu ARN-polimeraza II.
Aceste proteine sunt implicate n iniierea i direcionarea,
elongarea i terminarea procesului la toate genele de clasa II.
B. Factori de transcriere specifici proteine care recunosc
secvene specifice ale promotorilor genelor ce se exprim n
anumite esuturi (de ex., receptorii hormonali steroidici, care
transport hormonii ce regleaz sinteza anumitor tipuri de
proteine). Sunt implicai n activarea anumitor gene
(decondensarea cromatinei, eliberarea promotorului i
activarea factorilor de transcriere generali).
Fig. 9.2. Activitatea ARN-polimerazei
151

Secvene ADN modulatoare ale transctipiei ce regleaz
rata i viteza de transcriere prin intermediul unor proteine
reglatoare: secvene intensificatoare (enhanceri) i secvene
atenuatoare (silenceri). Aceste secvene pot fi localizate n
regiunea promotorului sau n afara genei, chiar la o distan
considerabil.
Mecanismul transcrierii
Transcripia este un proces ce se desfoar n mai multe
etape: iniierea, elongarea, terminarea. Produsul primar al
transcripiei este o molecul de ARNm-precursor. Aceast
molecul este rezultatul polimerizrii ribonucleotidelor dup
principiul complementaritii de pe catena 3'5' (catena
anticodogen) a moleculei de ADN.
Iniierea. Un factor decisiv pentru iniierea procesului de
sintez a ARN este recunoaterea primului nucleotid care va fi
citit (+1). Punctul de start al transcripiei este determinat de
poziia secvenelor consens ale promotorului, iar ARN-
polimeraza este responsabil doar de sinteza ARN. Promotorul
i punctul de start al transcripiei sunt recunoscute de factorii
proteici de transcripie (pentru iniierea transctipiei se formeaz
un complex din circa 20 proteine diferite). Pentru recunoaterea
promotorului genei care va fi transcris este necesar
decompactizarea secvenelor respective de ADN, care este
nrulat n jurul unor octamere de histone formnd nucleozomul.
Pentru a se realiza transcripia unei catene de ADN, aceste
structuri se modific, lund o dispoziie liniar, prin desfacerea
celor dou uniti simetrice ale miezului nucleozomului.
Moleculele histonice rmn ataate numai la una din catene,
permind desfacerea local a celeilalte catene de ADN i, deci,
producerea transcripiei. Aceasta se realizeaz cu ajutorul
factorilor specifici de transcripie.
Iniierea transcripiei se caracterizeaz prin succesiunea
urmtoarelor evenimente (fig. 9.3).
152

1. Formarea complexului de iniiere a transcripiei:
ataarea la promotor a factorilor specifici de transcriere;
legarea factorului de transcripie TFIID (TBP) la boxa
TATA (TF Transcription Factor, II gene clasa II;
TBP TATA Binding Protein);
legarea factorului de transcripie TFIIA proximal, care
stabilizeaz complexul TBP-boxa TATA;
n faa factorului TBP se ataeaz factorul TFIIB, care
avnd activitate ATP-azic, ajut la denaturarea ADN
fcnd posibil citirea matriei de ctre ARN-polimeraza
II;
pentru meninerea complexului de iniiere n stare activ
TBP interacioneaz cu o protein intensificatoare
aducnd enhancerul lng promotor (fig.9.4).
2. Ataarea la complexul proteic a enzimei ARN polimeraza
II, care este activat de factorul TFIIF. TFIIF ndeplinete
i funcia de helicaz ATP-dependent, denaturnd local
ADN-ul;
transcripia ncepe dup ataarea factorilor TFIIE i
TFIIH, care permite ARN-polimerazei s alunece de-a
lungul matriei;
are loc citirea primului nucleotid (+1) i incorporarea
primului ribonucleotid, care de regul este un ATP
Fig. 9.4. Interaciunea dintre enhancer i complexul de
iniiere
153

3. Iniierea se termin prin formarea primei legturi
fosfodiesterice n molecula de ARN.
Regiunea de ADN denaturat formeaz complexul deschis
(fig. 9.2).
Fig. 9.3. Complexul de iniiere a transcripiei
154

Elongarea. Primul eveniment al acestei etape const n
modificarea configuraiei complexului proteic de transcripie.
Astfel, se elibereaz de la ARN-polimeraza II factorii TFIIB i
TFIIE rmnnd ataat TFIIF i FTIIH. Factorul TFIIH este
considerat factor de elongare, avnd activitate de helicaz ATP-
dependent, kinaz i poate fi implicat n repararea ADN.
ARN polimeraza II citete catena de ADN 3'5' i
polimeraz n direcia 5'3' cu o rat de 30 nucleotide/sec.
La nceputul fazei de elongare la ARN- polimeraz se
ataeaz TFIIS care deine rol n prevenirea eliberrii premature
a ARN-polimerazei. n spatele ARN-polimerazei, de-a lungul
catenei de ARN se deplaseaz un factor proteic de eliberare.
La promotor rmn ataate urmtoarele proteine: FTIID,
FTIIA i proteina intensificatoare. Acestea sunt necesare pentru
ataarea altor molecule de ARN-polimeraz II care vor sintetiza
alte lanuri de ARN, pn la recepionarea semnalelor reglatoare
care blocheaz transcripia.
Terminarea transcripiei. Cnd ARN-polimeraza ajunge la
secvena terminatorului transcrie i secvena palindromic.
Molecula de ARN imediat formeaz o bucl care ncetinete
deplasarea ARN-polimerazei (fig. 8.2). n consecin, polimeraza
este ajuns de factorul de eliberare ceea ce condiioneaz
disocierea complexului ADN, ARN, ARN-polimeraz.

Processingul ARN
Produsul primar al transcripiei nu poate fi imediat
transportat n citoplasm. n primul rnd, ARNm precursor
conine secvene necodificatoare (introni), n al doilea rnd
poate fi uor scindat de ARN-aze. Pentru a preveni degradarea,
are loc prelucrarea capetelor moleculei, iar intronii sunt
nlturai. Totalitatea reaciilor de modificare a ARNm precursor
poart denumirea de maturizarea ARNm sau processing.
Aceste procese se desfoar n nucleu i sunt catalizate de
155

enzime specifice. Etapele processing-ului sunt urmtoarele:
prelucrarea captului 5' (cap-are), prelucrarea captului 3'
(poliadenilare), nlturarea intronilor (splicing) (fig. 9.5).

Modificarea capetelor moleculei de ARNm precursor
Prelucrarea captului 5'. Captul 5' al transcriptului
primar este modificat n timpul transcripiei. Dup sinteza unui
fragment de ARN cu lungimea 30 baze enzima guanilat
transferaza adaug o Guanin (GTP) metilat prin legtur 5'-5'
la primul nucleotid din ARN (de regul o adenin). Structura
7Me
G
5
ppp
5
N poart denumirea de CAP. De asemenea, pot fi
metilate i ultimele dou riboze n poziia 2' (fig. 9.6).
Funciile CAP-ului:
- asigur stabilitate moleculei de ARN datorit
legturii nespecifice 5' - 5';
- reprezint un situs de recunoatere pentru ribozomi n
iniierea translaiei.

Prelucrarea captului 3'
Captul 3' al moleculei de ARNm precursor conine
secvena palindromic n form de bucl. La 11-30 baze de la
situsul AAUAAA molecula este clivat de o endonucleaz. O
alt enzima poli(A)-polimeraza adaug 100-200 resturi de
Fig. 9.5. Etapele processing-ului genelor de clasa II
156

acid adenilic. ARNm ce codific histonele nu este supus
poliadenilrii.
Funciile secvenei poli-A:
- asigur stabilitatea captului 3' al moleculei de
ARNm;
- controleaz pasajul moleculei de ARNm din nucleu
n citoplazm.
Splicing-ul
nlturarea intronilor din ARNm precursor i unirea
exonilor are loc n nucleu, cu participarea unui complex
enzimatic denumit splicesom. Componentele acestui complex
sunt reprezentate de moleculele mici de ribonucleoproteide
nucleare (snRNP), notate U
1
U
6
. Intronii sunt recunoscui dup
Fig. 9.6. Structura CAP-ului ARNm
157

secvena GU la captul 5' i secvena AG la extremitatea 3'.
Procesul se desfoar n mai multe etape (fig. 9.7):
la situsul GU a intronului se leag ribonucleoproteida U
1
;
ribonucleoproteida U
2
se unete la nivelul unei adenine din
interiorul intronului (situsul buclei);
ribonucleoproteidele U
4
,U
5
,U
6
se asociaz cu U
1
, i U
2
formnd o bucl. Bucla se formeaz prin unirea captului 5'
al intronului cu adenina printr-o legtur nespecific 5'2';
eliberarea ribonucleoproteidei U
4
din complex duce la
clivarea captului 3' al intronului. Intronul este nlturat sub
form de lasou mpreun cu proteinele U
2
, U
5
, U
6
;
formarea legturilor fosfodiesterice 3' 5' ntre capetele
exonilor.
Fig. 9.7. Mecanismul splicing-ului ARNm
158

Ca rezultat al splicing-ului se formeaz un ARNm,
ulterior va fi transferat n citoplasm i va servi matri pentru
sinteza proteinei.
La eucariote exist mai multe tipuri de splicing.
Splicing constitutiv prin care se nltur toi intronii, iar
exonii sunt unii n ordinea n care erau dispui n gen.
Splicing alternativ are loc prin selecia exonilor i/sau
eliminarea difereniat a intronilor. Astfel, de pe un ARNm
precursor pot fi obinute mai multe variante de ARNm i
respectiv mai multe tipuri de proteine. n diferite esuturi
i/sau la diferite perioade de dezvoltare pot fi sintetizate
proteine diferite de pe aceeai gen (fig. 9.8).
Fig. 9.8. Splicing-ul alternativ al ARN pentru tropomiozine
159

Splicing prin amestec de exoni (exon shuffling)
moleculele de ARNm se pot forma prin schimbarea ordinii
exonilor. Se ntlnete foarte rar.
Trans-splicing formarea unei molecule de ARNm din cteva
molecule de ARNm precursor, sintetizate de pe gene diferite. Se
ntlnete la tripanosome, la unele nematode i trematode.
Editarea ARN
n urma processing-ului n ARNm pot fi adugate,
nlocuite sau nlturate unele nucleotide. Acest fenomen decurge
n nucleu cu participarea unor enzime specifice. Ca rezultat
informaia din molecula de ARNm nu coincide cu cea
corespunztoare din ADN. Procesul de modificare a secvenei
codificatoare din ARNm poart denumirea de editarea ARN.

Particularitile transcripiei genelor de clasa I i
clasa III
Genele de clasa I codific sinteza ARNr. Ele formeaz
uniti transcripionale repetate de mai multe ori n tandem cu
localizare n diferii cromozomi (vezi fig. 8.8). Aceste gene
formeaz organizatorii nucleolari. ARN-polimeraza I transcrie
o molecul de ARNr precursor cu coeficientul de sedimentare
45S. Ca rezultat al autosplicing-ului se formeaz trei fracii de
ARNr: 5,8S, 18S, 28S.
Genele de clasa III codific pentru sinteza ARNt i
ARNr 5S. La fel ca i genele de clasa I sunt organizate n uniti
transcripionale mari. Ca rezultat al processing-ului
transcriptului primar se obin molecule de ARNt i ARNr 5S.

Reglarea transcripiei la eucariote
Controlul transcripional determin posibilitatea de a fi
sau a nu fi transcris o gen. Pentru nelegerea mecanismelor de
control ale transcripiei genelor eucariote este necesar s se
cunoasc cteva particulariti ale genomului eucariot.
160

ADN are o structur supramolecular realizat prin
interaciunea puternic cu diferite tipuri de proteine. n
aceast stare transcripia este imposibil fiind blocat
nespecific de histone. Unele secvene sunt metilate, fenomen
asociat cu inactivarea ADN-ului.
La eucariote cea mai mare parte a genomului nu este
transcris. Majoritatea secvenelor ADN sunt repetitive,
necodificatoare (spaceri, ADN-satelit).
ntr-un organism eucariot pluricelular, celulele nu doar cresc
i se divid, dar i suport modificri morfologice, fiziologice
i metabolice, adic se difereniaz. Pentru aceasta este
necesar o expresie difereniat a genelor.
Programul general al dezvoltrii ontogenetice a unui
organism asigur desfurarea etapelor de baz ale vieii
pn la btrnee i moarte. Fiecare etap are anumite
particulariti i o anumit durat, iar existena unui individ
este limitat. Astfel, expresia genelor este difereniat i n
funcie de perioada de dezvoltare.
Transcrierea mesajului genetic se realizeaz n nucleu. De
aceea, ARNm pentru a fi transportat n citoplasm unde se
afl ribozomii necesit anumite modificri.
La eucariote ARNm poart informaia pentru sinteza unui
singur lan polipeptidic. Astfel, este necesar un mecanism de
reglare a expresiei genelor ce controleaz un lan metabolic.

Nivelele de reglare ale transcripiei
Controlul pretranscripional const n decondensarea
cromatinei, modificarea histonelor, ce permite accesul
factorilor transcripionali i denaturarea ADN. Au loc
demetilarea i schimbrile conformaionale n molecula de ADN
pentru asigurarea intreaciunii cu proteinele reglatoare.
Controlul iniierii transcripiei. Pentru iniierea
transcripiei este necesar activarea promotorului genei-int.
161

Elementele promotorului funcioneaz ca modul n reglarea
expresiei genei. Unele elemente promotoare (secvena TATA) sunt
absolut necesare pentru iniierea transcripiei. n schimb, alte
elemente stimuleaz sau mpiedic transcripia genei. Acestea sunt
secvene de ADN, de care se leag proteine specifice reglatoare (fig.
9.9). Dac transcripia a fost activat de legtura dat, elementul
promotor se numete element de reglare pozitiv, iar proteina este o
protein reglatoare pozitiv. Dac transcripia este blocat, elementul
promotor se numete element de reglare negativ.
Elementul reglator al promotorului este specializat
pentru fiecare gen pe care o controleaz, pentru c se leag de o
molecul semnal. O gen particular poate avea unul sau mai
multe elemente promotoare deoarece, n condiii diferite, pot
exista una sau mai multe proteine reglatoare care controleaz
expresia acestei gene (fig. 8.3).
Un model prin care elementele stimulatoare (enhancerii)
influeneaz transcripia de la distan este urmtorul: o protein
specific reglatoare se leag de secvena stimulatoare. ADN-ul
formeaz apoi o bucl n aa fel, nct proteina reglatoare, legat
de stimulator, s poat interaciona cu proteinele reglatoare i cu
ali factori asociai elementelor promotoare. Aceast
Fig. 9.9. Elementele reglatoare i modulatoare implicate n
controlul transcripie
162

interaciune dintre proteine determin activarea sau supresia
transcripiei (fig. 9.4; fig. 9.9).
De aceea, efectul unui element de reglare asupra
transcripiei depinde de combinaia diferitelor proteine legate.
Deci, combinaiile particulare dintre proteinele reglatorii
controleaz, n mod specific, transcripia genelor n diferite
tipuri de celule. Aceasta se numete reglare genic combinativ.
Genele care controleaz acelai proces i/sau lan
metabolic, de regul, conin secvene reglatoare similare i sunt
recunoscute de aceleai proteine reglatoare. De exemplu, genele
implicate n dezvoltarea embrionar conin o secven comun
numit homeobox. Astfel de gene sunt localizate pe acelai
cromozom n ordinea conectrii lor, formnd astfel o familie de
gene. Un al exemplu de expresie difereniat a genelor n timp i
spaiu este sinteza hemoglobinei la om (fig. 9.10). Hemoglobina
embrionar este format din dou polipeptide i dou i se
sintetizeaz iniial n sacul vitelin. Hemoglobina fetal ncepe s
se sintetizeze n ficat i n splin din dou polipeptide i dou
. La nou-nscut i adult sinteza hemoglobinei se transfer n
mduva osoas unde sunt sintetizate adevratele catene i ,
cu un % mic de polipeptide de tip .

Des. 9.10. Organizarea familiilor de gene pentru -globine
(pe cromozomul 16) i -globine (pe cromozomul 11)
163

Controlul sintezei ARN. Dup formarea complexului de
iniiere a transcripiei ARN-polimeraza II sintetizeaz molecula
de ARN pn la situsul de terminare. Viteza i rata de
transcripie este determinat de configuraia promotorului i de
interaciunea cu proteinele reglatoare. Sfritul procesului este
semnificat prin secvena palindromic i formarea buclei n
molecula de ARN.
Controlul posttranscripional. Pentru prevenirea
degradrii ARN i transportul lui n citoplasm are loc CAP-area i
poliadenilarea capetelor. Varianta splicing-ului decide structura
proteinei ulterior sintetizate. Astfel de pe aceeai gen pot fi
sintetizate diferite proteine. n consecin o gen poate controla
diferite perioade ontogenetice sau diferenierea celular.
Controlul transferului ARNm n citoplasm. ARNm
produsul processing-ului i splicing-ului se asociaz cu proteine
speciale, inracioneaz cu receptorii complexului porului nuclear
i se transfer din nucleu n carioplasm.

Transcripia la procariote
n capitolul 8 este descris structura i organizarea
molecular a genelor la procariote. Unitatea transcripional este
reprezentat de operon care este format din secvene reglatoare
(promotor/operator, terminator) i secvene codificatoare (gene
structurale) lipsite de introni (fig. 8.9).
La procariote exist o singur ARN-polimeraz care are
aceleai proprieti ca i ARN-polimerazele de la eucariote.
Structural, ARN-polimeraza procariotelor reprezint o
holoenzim format din mai multe subuniti funcionale. Astfel,
ea recunoate promotorul, este responsabil de denaturarea i
renaturarea ADN, catalizeaz polimerizarea ribonucleotidelor.
Moleculele de ARNm sunt policistronice i utilizate imediat ca
matri pentru sinteza proteinelor. Deoarece nu sunt protejate de
CAP, moleculele ARNm degradeaz rapid.
164

Transcripii de pe genele pentru ARNt i ARNr sunt
procesai, formnd molecule mature de ARNt i ARNr (fig.
8.11).
Reglarea transcripiei la procariote
Particularitile ciclului vital al organismelor procariote,
ct i organizarea simpl a aparatului genetic fac ca reaciile de
activare/inactivare a sintezei proteinelor s decurg rapid. Se
disting dou tipuri de control al genelor: control negativ i
control pozitiv.
Controlul negativ este mecanismul de inactivare a
genelor printr-o protein represor. Proteina represor este
controlat de o gen reglatoare, plasat n afara operonului. Ea
se unete la regiunea promotorului i mpiedic deplasarea
ARN-polimerazei. Proteina represor poate fi inactivat de un
inductor (factori de natur neproteic care poate fi substratul).
Controlul pozitiv reprezint mecanismul de activare a
genelor cu ajutorul unei proteine activator. De regul,
activatorul este n stare inactiv i nu are afinitate fa de
promotor. Inductorul condiioneaz legarea proteinei activator
la promotorul operonului ce va fi transcris. n aa mod ARN-
polimeraza recunoate regiunea promotorului i efectueaz
transcripia.
Verificarea cunotinelor
1. Definii noiunile: expresia genei, transcripie, promotor,
exon, intron, factor de transcripie, boxa TATA, ARN
polimeraza II, transcript primar, ARN precursor, ARN
mesager, splicing, splicesom, enhancer, silencer, control
pozitiv, control negativ.
2. Care sunt etapele transcripiei genelor structurale?
3. Cum se formeaz complexul de iniiere a transcripiei?
4. Care sunt particularitile activitii ARN polimerazei II?
5. n ce const processingul ARNm-precursor?
6. Care sunt nivelele de control al transcripiei la eucariote?
165









TRANSLAIA

Dup transcripia i transmiterea mesajului genetic din
ADN nuclear n citoplasm, secvena nucleotidelor din ARNm
este convertit ntr-o secven specific de aminoacizi n
protein. Procesul se numete translaie, ntruct limbajul
nucleotidelor este tradus n limbajul celor 20 de aminoacizi ce
alctuiesc proteinele. Catenele polipeptidice sunt sintetizate prin
aranjarea riguroas a aminoacizilor ntr-o anumit ordine,
asigurat de ctre codul genetic un sistem de corespondene
dintr-o anumit secven de trei nucleotide (codon) din ARNm
i fiecare din cei 20 de aminoacizi.
n procesul transcrierii ARNm a preluat mesajul genetic
din molecula de ADN despre succesiunea aminoacizilor din
lanul polipeptidic. Sistemul prin care succesiunea nucleotidelor
din molecula de ADN (sau ARN) determin ordinea
aminoacizilor n protein poart denumirea de cod genetic.
Proprietile codului genetic
Este alctuit din triplete, fiecare triplet formeaz un codon.
Exist 64 de codoni, dintre care 61 codific pentru anumii
aminoacizi, iar trei - sunt codoni de STOP informaional.
Este universal - la toate organismele exist acelai cod
genetic, cu unele excepii la procariote, protozoare i n
mitocondrii.

166


Fiecare codon codific un singur aminoacid. Prezint
ambiguitate doar codonii AUG, care specific metionina i
formil-metionin, ct i GUG pentru valin i formil-
metionin.
Este degenerat. Acelai aminoacid poate fi codificat de mai
multe triplete (triplete sinonime) - astfel serinei i corespund
6 codoni, prolinei - 4 etc.
Este colinear - ordinea tripletelor n molecula de ARN
corespunde ordinii aminoacizilor n lanul polipeptidic.
Nu este suprapus - tripletele vecine nu conin nucleotide
comune (fig. 10.1).
Este fr virgule - codonii urmeaz unul dup altul, fr
spaii.
Exist un triplet universal de iniiere - AUG. La procariote i
la unele plante n calitate de codon de iniiere poate fi GUG.
Exist trei codoni STOP - UAA, UAG, UGA.
U C A G
U
(Phe) (Ser) (Tyr) (Cys) U
(Phe) (Ser) (Tyr) (Cys) C
(Leu) (Ser) STOP STOP A
(Leu) (Ser) STOP (Trp) G
C
(Leu) (Pro) (His) (Arg) U
(Leu) (Pro) (His) (Arg) C
(Leu) (Pro) (Gln) (Arg) A
(Leu) (Pro) (Gln) (Arg) G
A
(Ile) (Thr) (Asn) (Ser) U
(Ile) (Thr) (Asn) (Ser) C
(Ile) (Thr) (Lys) (Arg) A
(Met) (Thr) (Lys) (Arg) G
G
(Val) (Ala) (Asp) (Gly) U
(Val) (Ala) (Asp) (Gly) C
(Val) (Ala) (Glu) (Gly) A
(Val) (Ala) (Glu) (Gly) G
167

Ordinea codonilor n molecula de ARNm se numete faz de
lectur. n fiecare molecul de ARNm exist trei faze de
lectur. Faza de lectur care ncepe cu AUG se numete faz de
lectur deschis (fig. 10.1).

Procesul de decodificare a informaiei cifrate n molecula
de ARNm se realizeaz pe ribozomi cu ajutorul ARNt. Aparatul
de translaie include numeroi factori proteici ce catalizeaz
traducerea corect a codului genetic, polimerizarea
aminoacizilor, asamblarea ribozomilor, controlul duratei de
via a ARNm, controlul numrului de polipeptide sintetizate de
pe aceeai matri.
Procesul de translaie este similar la procariote i
eucariote. Sunt diferii factorii proteici de translaie, tipurile de
ribozomi implicai i modul de iniiere a translaiei. De
asemenea, difer i structura moleculelor de ARNm. La
procariote ARNm, de obicei, este policistronic - conine
informaia despre sinteza mai multor proteine, iar la eucariote
conine informaia despre sinteza unui singur polipeptid. La
procariote procesele de transcripie i translaie pot decurge
Fig. 10.1. Proprietile codului genetic
168

concomitent. Aceasta este posibil deoarece ambele procese
decurg direct n citoplasm, iar viteza de sintez a proteinelor
(10 aa/sec) este comparabil cu viteza de sintez a ARN (30
b/sec). La eucariote aceste procese decurg separat: transcrierea
- n nucleu, iar translaia - n citoplasm. Realizarea mesajului
genetic n mitocondrii i plastide are loc integral n organitele
respective.

Aparatul de translaie
Aparatul de sintez a proteinelor este constituit din urmtoarele
componente:
ARNm matri pentru sinteza proteinei;
ribozomi sediu pentru asamblarea polipeptidului;
ARNt translator al codului genetic de pe ARNm;
aminoacilARNt sintetaze adaproti penru aminoacizi
la ARNt corespunztor;
aminoacizi monomerii proteinei;
ATP i GTP surse de energie;
Mg
2+
, Ca
2+
- cofactori ai enzimelor;
factori proteici, catalizatori ai translaiei reglatori
specifici ai procesului de decodificare a codului genetic
i sintezei proteinei.

ARNm la eucariote conine mesajul genetic pentru
sinteza unei molecule proteice, este monocistronic. Se
sintetizeaz i proceseaz n nucleu, apoi se transport n
citoplasm (ARNm este asociat cu proteine specifice,
recunoscute de complexul porului nuclear). Captul 5 este
protejat de CAP, care servete ca semnal de recunoatere pentru
ribozom n iniierea translaiei. CAP-ul este urmat de cteva
zeci de nucleotide netranslate secvena lider care reprezint
situs de legare a ARNm de ribozom (fig. 10.2).
169


Regiunea translabil conine secvena de baze ce
controleaz ordinea asamblrii aminoacizilor n polipeptid. La
captul 5 al secvenei translate se conine codonul de iniiere
AUG, iar terminaia este determinat de unul din cei trei codoni
STOP. La captul 3 al mesagerului se gsete o regiune de 100-
200 nucleotide netranslate coada poli(A).

ARNm procariotic este policistronic, produs al
transcripiei unui operon. Spre deosebire de ARNm de la
eucariote, la procariote mesagerul nu este procesat. Capetele
moleculei nu conin CAP i poli(A). Secvena lider este format
din circa 10 nucleotide netranslate i conine un hexamer
conservat (5'AGGAGG3') numit secvena Shine-Dalgarno.
Ea este complementar unei secvene conservate de la captul 3'
al moleculei ARNr 16S. ntr-o molecul de ARNm se pot
conine mai muli codoni de iniiere AUG (mai rar GUG sau
UUG).

ARNt. n procesul de sintez a proteinei sunt implicai
20 de aminoacizi. Ei sunt transportai la locul de sintez cu
ajutorul moleculelor de ARNt. Astfel, ARNt servete ca
translator (traductor) al codului genetic de pe ARNm i adaptor
pentru aminoacizii corespunztori. Fiecare molecul este
format din ~70-80 nucleotide care formeaz o structur
secundar specific - frunz de trifoi (fig. 10.3). Molecula
ARNt conine n afar de cele patru baze majore A, U, G, C i
Fig. 10.2. Organizarea ARNm la eucariote
170

cteva baze minore: pseudouracil (v), dihidrouridina (D), timina
(T) etc.
Regiunile funcionale ale ARNt:
- braul acceptor de care se unete aminoacidul (aa);
- bucla v care asigur recunoaterea ribozomului;
- bucla D care este centrul de recunoatere de ctre
aminoacil-ARNt-sintetaz;
- bucla anticodon care conine un triplet ce determin
tipul aminoacidului, transportat ulterior de ARNt i
are proprietatea de a se mperechea cu cele trei
nucleotide ale codonului din ARNm.
n total exist 61 tipuri de ARNt, n corespundere cu
numrul de triplete codificatoare.

Fig. 10.3. Structura moleculelor de ARNt
171

Aminoacil-ARNt-sintetaza. Selecia corect i legarea
aminoacidului la molecula respectiv de ARNt se realizeaz cu
ajutorul enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza. Aceast enzim are
specificitate pentru fiecare dintre aminoacizi, de aceea n total
exist 20 tipuri (fig. 10.4). Aminoacidul se unete la grupa OH
din poziia C2' sau C3' de la captul 3' al moleculei de ARNt.
Adiionarea se realizeaz n 2 etape:
1) Enzima + aminoacid + ATP
+ 2
g M
Enzima-aminoacil-
AMP + P~P
2) Enzima-aminoacil-AMP + ARNt Aminoacil-ARNt +
AMP + enzima.

Ribozomii. Ribozomii reprezint sediul de traducere a
ARNm i polimerizare a aminoacizilor. Ei constituie complexe
ribonucleoproteice i sunt formai din dou subuniti de mrime
inegal. n citoplasm, dac ribozomii nu sunt implicai n
procesul de translaie, subunitile ribozomale sunt disociate.
Formarea ribozomului are loc doar la unirea cu ARNm.
Structura ribozomilor, la fel ca i structura ARNr este similar,
ns nu identic, la toate speciile (fig. 10.5).
Fig. 10.4. Mecanismul interaciunii aminoacidului, ARNt i
ARNt-sintetatzei
172

Ribozomii eucariotici. Subunitatea 40S conine o
molecul de ARNr 18S i ~33 proteine. Subunitatea 60S conine
la rndul su, trei molecule de ARNr (5S, 5,8S, 28S) i circa 49
proteine. ARNr i subunitile ribozomale 40S i 60S se
formeaz n nucleol.
Ribozomii procariotici. Subunitatea 30S conine o
molecul de ARNr 16S i 21 proteine. Subunitatea 50S este
format din ARNr 5S, 23S i 31 proteine. Sinteza ARNr i
formarea subunitilor ribozomale are loc direct n citoplasm.


Fig. 10.5. Organizarea molecular a ribozomilor
173

Ribozomii au cteva centre catalitice:
Situsul A - aminoacil - este responsabil de unirea
complexului aminoacil-ARNt;
Situsul P - peptidil - este responsabil de unirea peptidil-
ARNt;
Situsul E este responsabil de eliminarea ARNt.
Legtura dintre ribozom, molecula de ARNt i molecula
de ARNm se realizeaz prin intermediul ARNr. Molecula ARNr
din subunitatea mic este responsabil de recunoaterea i unirea
la ARNm. Moleculele de ARNr din subunitatea mare sunt
responsabile de unirea celor dou subuniti ribozomale,
interaciunea ARNt cu subunitatea mare i cu molecula de
ARNm. Reaciile ce se desfoar pe ribozom sunt catalizate de
proteinele ribozomale.
Factori proteici de translaie. Fiecare etap a translaiei
este controlat de un complex de factori proteici specifici: IF
factori de iniiere; EF factori de elongare; RF factori de
terminare.

Mecanismul translaiei

Sinteza proteinelor se face prin aezarea secvenial a
aminoacizilor n ordinea impus de mesajul genetic preluat de
ARNm, n procesul sintezei sale pe matri de ADN. Descifrarea
mesajului se face n sensul 5'3' al moleculei de ARNm, deci n
aceeai ordine n care a fost copiat de ARNm n procesul de
transcripie.
Procesul de biosintez a proteinelor decurge n trei etape:
iniierea, elongarea i terminarea. Fiecare etap este controlat
de factori proteici specifici, care difer la procariote i eucariote.
Iniierea include reaciile care preced formarea legturii
peptidice ntre primii doi aminoacizi din protein. Ea necesit
legarea ribozomului la ARNm i formarea complexului de
174

iniiere care include primul aminoacil-ARNt. Aceasta este o
etap relativ lent a translaiei i determin rata cu care ARNm
este tradus (fig. 10.6).
Iniierea decurge n cteva etape:
(1) formarea complexului metionil-ARNt
met
(la procariote
formilmetionil-ARNt
fmet
);
(2) activarea complexului metionil-ARNt
met
prin adugarea
unei molecule de GTP;
(3) formarea complexului [metionil-ARNt
met
]

[GTP]
[subunitatea ribozomal mic]. Metionil-ARNt se
situeaz n situsul P (proprietate unic doar pentru ARNt
de iniiere);
(4) asocierea complexului format la ARNm i recunoaterea
codonului de iniiere AUG, cu consumul unei molecule
de ATP;
(5) asocierea subunitii ribozomale mari i disocierea GTP
n GDP i P
i
.

Fig. 10.6. Mecanismul iniierii translaiei
175

La eucariote mai nti se recunoate CAP-ul, apoi
subunitatea ribozomal mic migreaz pn cnd ajunge la
primul codon AUG. Primul aminoacid incorporat este
metionina (Fig 10.7).
La procariote se recunoate fiecare AUG care servete
drept semnal pentru iniierea translaiei. Primul aminoacid
incorporat este formilmetionina.

Elongarea include toate reaciile de la formarea primei
legturi peptidice, pn la adugarea ultimului aminoacid.
Aminoacizii se ataeaz unul cte unul n conformitate cu
succesiunea codonilor n molecula de ARNm. Este cea mai
rapid etap a translaiei (fig. 10.8).
Elongarea se caracterizeaz prin succesiunea
urmtoarelor evenimente:
(1) formarea complexelor aminoacil-ARNt;
(2) activarea complexelor aminoacil-ARNt prin adugarea a
cte o molecul de GTP;
Fig. 10.7. Particularitile iniierii translaiei la
procariote i eucariote
176

(3) transportarea complexului [aminoacil-ARNt] [GTP] la
situsul A al ribozomului i eliberarea GDP + P
i
;
(4) transferul aminoacidului iniiator din situsul P n situsul
A i formarea legturii peptidice ntre aminoacizi.
Procesul este catalizat de enzima peptidil-transferaza. n
etapele urmtoare ale elongaiei din situsul P se va
transfera n situsul A ntregul lan polipeptidic;
(5) eliberarea moleculei de ARNt din situsul P i asocierea
unei molecule de GTP la ribozom;
(6) translocarea ribozomului cu un triplet. Micarea
ribozomului se efectueaz n direcia 5' 3' al
moleculei de ARNm:
- tripletul decodificat nimerete n afara sectorului P;
- n situsul P se va deplasa ARNt cu polipeptidul
format (peptidil-ARNt);
Fig. 10.8. Mecanismul elongaiei lanului polipeptidic
177

- n sectorul A se situeaz urmtorul codon, iar n
situsul A urmtorul aminoacil-ARNt. n calitate de
energie servete GTP care se hidrolizeaz pn la
GDP + P
i
.
Procesul decurge pn cnd n sectorul A nimerete unul
din cei trei codoni STOP.
Terminarea cuprinde evenimentele necesare pentru
eliberarea lanului polipeptidic sintetizat i disocierea
ribozomilor de la ARNm.
Cnd n sectorul A se situeaz unul dintre cei trei codoni
STOP (UAG, UGA, UAA), la ribozom se unete factorul de
eliberare RF. RF condiioneaz disocierea complexului de
translaie. Subunitile ribozomale, ARNt, ARNm, RE, factorii
proteici de translaie pot fi reutilizai (fig. 10.9.).

Fig. 10.9. Terminarea translaiei i eliberarea componenilor
aparatului de translaie
178

Lanul polipeptidic sintetizat, de obicei, sufer unele
modificri posttranslaionale: nlturarea metioninei iniiale,
fosforilarea, glocozidarea, hidroliza specific etc.

Reglarea translaiei
Biosinteza proteinelor poate fi activat/inactivat de
diveri factori de natur proteic sau neproteic care
interacioneaz cu componeni aparatului de translaie.
n tab. 10.1 sunt enumerai principalii factori de
translaie la procariote i eucariote, mecanismul lor de aciune la
diferite etape ale iniierii, elongrii i terminrii biosintezei
proteinei.
La procariote este bine studiat mecanismul de aciune i
al altor factori ce pot modula translaia. Spre exemplu sunt
prezentate unele antibiotice i modul lor de blocare a sintezei
proteice la bacterii.
- Cazagamicina blocheaz iniierea translaiei prin legarea ei la
captul 3' al moleculei 16S, responsabil de interaciunea cu
ARNm.
- Puromicina blocheaz sinteza proteinei prin unirea ei la ARNt
n loc de aminoacid.
- Tetraciclina blocheaz legarea aminoacil-ARNt la situsul A al
ribozomului.
- Streptomicina mpiedic trecerea de la iniierea la elongarea
lanului polipeptidic.
- Cloramfenicolul blocheaz activitatea peptidil-transferazei.
- Eritromicina - blocheaz translocaia ribozomului.

Unele modificri (mutaiile) din structura ARNm pot
cauza dereglri n procesul de translaie. Mutaiile pot fi cauzate
de modificrile din structura ADN transcris sau pot aprea n
ARNm sintetizat.
Modificarea secvenei-lider poate mpiedica
recunoaterea i legarea ribozomilor la ARNm.
179

Tabelul 10.1. Factorii de translaie i mecanismul lor de aciune
I
n
i
t
i
e
r
e
a

Procariote
IF-1
Se unete la subunitatea 30S i stabilizeaz complexul de
iniiere pn la interaciunea cu ali factori proteici
IF-2
Se unete la ARNt de iniiere i controleaz ptrunderea lui
pe ribozom
IF-3 Controleaz unirea corect a subunitii 30S la ARNm
Eucariote
eIF-2 Activeaz complexul Met-ARNt
met

eIF-3 Asigur unirea subunitii 40S la CAP-ul ARNm
eIF-4A
Recunoate CAP-ul i asigur denaturarea palindroamelor
din secvena lider a ARNm
eIF-4B
Asigur stabilitatea moleculei ARNm i previne formarea
buclelor
eIF-5
Este o GTP-az ce asigur unirea subunitii 60S la
complexul de iniiere
eIF-6
Previne legarea prematur a subunitii 60S la subunitatea
40S
E
l
o
n
g
a
r
e
a

Procariote
EF-Tu Mediaz ptrunderea aminoacil-ARNt n situsul A
EF-Ts Asigur hidroliza GTP; regenereaz EF-Tu
EF-G Asigur translocarea ribozomului
Eucariote
eEF-1
Asigur unirea aminoacil-ARNt la ribozom; este omologul
EF-Tu
eEF-1 Asigur hidroliza GTP; este omologul EF-Ts
eEF-2 Asigur translocarea ribozomului; este omologul EF-G
T
e
r
m
i
n
a
r
e
a

Procariote
RF-1 Recunoate codonii STOP UAA i UAG
RF-2 Recunoate codonii STOP UGA i UAA
RF-3 Asigur specificitatea RF-1 i RF-2.
Eucariote
???
Mecanism asemntor ca la procariote; factorii de terminare
sunt nc puin studiai
180

Pierderea/adiionarea unui sau mai multor nucleotide
provoac decalarea fazei de lectur i modificarea secvenei de
aminoacizi n ntregul lan, dup locul de modificare. Substituia
nucleotidelor poate provoca apariia codonilor missens sau
nonsens. Mutaiile missens determin nlocuirea unui
aminoacid cu altul. n cazul formrii unor codoni STOP
prematuri (mutaie nonsens), are loc sinteza unor lanuri
polipeptidice mai scurte. nlocuirea unui codon STOP cu un
codon sens duce la alungirea lanului polipeptidic.
Numrul de polipeptide sintetizate de pe aceeai matri
ARNm este determinat de durata de via a mesagerului. La
procariote ARNm sintetizat este supus imediat translaiei i are o
durat de via de 2-5 min. La eucariote exist mai multe
mecanisme ce asigur stabilitatea ARNm, care au o durat de
via de la 20 min pn la 48 ore. Unul dintre ele este asociat
cu lungimea secvenei poli(A). n plus la eucariote exist
particule RNP ce pstreaz ARNm. Asocierea ARN cu
proteinele previne degradarea enzimatic a mesagerului. Date
recente pun n eviden existena unor molecule de ARN-
antisens, care se pot lega complementar cu moleculele de
ARNm, blocnd astfel degradarea i prevenind translaia
mesagerilor respectivi.

Particularitile translaiei n mitocondrii
Mitocondriile posed un aparat propriu de translaie care
include ribozomi proprii (n mediu 70S), ARNt propriu i
utilizeaz ca matri ARNm transcris de pe ADN mitocondrial.
Procesul de translaie se aseamn, n linii generale, cu cel
descris la procariote, avnd unele particulariti. ARNm este
policistronic i nu este supus CAP-rii sau poliadenilrii. n
mitocondrii exist doar 22 tipuri de ARNt, deoarece al treilea
nucleotid din bucla anticodogen respect principiul: G
181

recunoate orice pirimidin din tripletul codogen, iar U - orice
purin.
n mitocondrii sunt sintetizate doar o parte din enzimele
implicate n metabolismul energetic. Celelalte proteine
mitocondriale, inclusiv proteinele reglatoare ale replicrii,
transripiei, translaiei sunt codificate de genomul nuclear,
sintetizate n citoplasm i importate n mitocondrii. De aceea,
biosinteza proteinelor mitocondriale este reglat n mare parte
de activitatea genelor nucleare.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: translaie, cod genetic, codon, anticodon,
faz de lectur, situs A, situs P, aminoacil-ARNt-sintetaza.
2. Care sunt proprietile codului genetic?
3. Care sunt componentele aparatului translaional?
4. Prin ce se deosebete procesul de translaie la pro- i
eucariote?
5. Care sunt etapele procesului de biosintez a proteinelor?
6. Care sunt mecanismele de reglare ale sintezei proteice la
eucariote?

182








TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Descifrnd enigmele structurii genelor, savanii au
nceput s se preocupe de izolarea i sinteza lor. n urm cu 30
de ani cei care credeau n reuita acestor deziderate erau puini i
nimeni nu bnuia explozia actual a ingineriei genetice i
consecinele cu adevrat extraordinare pe care le va avea.
Primii pai au fost fcui de Beckwith i Shapiro, care n
1969 au izolat i fotografiat operonul lactozei. Un an mai trziu
G. Khorana reuete sinteza artificial a primelor gene de
procariote. Cu aceeai tehnic se sintetizeaz gena ce codific
somatostatina un hormon hipofizar (1977). Dup descoperirea
transcriptazei inverse se reuete sinteza altor gene de mamifere
(pentru hemoglobin, ovalbumin, insulin etc.). Genele
obinute nu erau ns active, deoarece nu aveau un sistem
propriu de replicare, nici secvenele necesare declanrii
transcripiei i apoi a sintezei proteinelor pe care le codific.
Aceste dificulti au fost depite, introducnd genele artificiale
n plasmidele unor bacterii sau virusuri. Pentru inseria genelor
n plasmide se folosesc enzime speciale care taie ADN n locuri
specifice enzime de restricie (Premiul Nobel, 1978).
Realizrile ingineriei genetice au un mare interes teoretic
i practic incontestabil. Izolarea sau sinteza genelor a dus la
obinerea artificial a unor produi naturali de mare valoare
(insulina, somatostatina, interferonul), dar speranele justificate
pe care savanii i le pun n acest domeniu sunt mult mai mari.

183

Nu este vorba numai de o nou industrie farmaceutic care s
produc antibiotice, hormoni, vaccinuri antivirale ci i de
posibilitile reale de a realiza o terapie cauzal terapie
genic, corectnd genele mutante sau nlocuindu-le i rezolvnd,
astfel, marea problem a incurabilitii bolilor genetice.
Actualmente exist toate posibilitile tehnice pentru
studierea direct sau indirect a acizilor nucleici purttori ai
mesajului ereditar. Gena de interes poate fi extras din
organism, supus unor modificri structurale, introdus n alt
organism, poate fi obinut produsul ei proteic. Toate procedeele
manipulrii acizilor nucleici se reunesc n termenul genetic
tehnica ADN recombinant.
Pentru studiul acizilor nucleici sunt necesare urmtoarele
procedee:
- extragerea i purificarea moleculelor de ADN (sau ARN)
din celule;
- izolarea fragmentului de ADN de interes;
- multiplicarea fragmentelor izolate;
- analiza secvenelor de interes (determinarea succesiunii
bazelor, determinarea expresiei, determinarea poziiei n
genom).

Izolarea acizilor nucleici
Pentru analiza ADN poate fi utilizat orice celul
nucleat, indiferent de esutul din care face parte (de ex., la om
pot fi folosite celulele dintr-o pictur de snge, din saliv, fire
de pr, esut epitelial, etc.).
Pentru izolarea fragmentelor de ADN se utilizeaz
metode biochimice care includ lizarea celulelor, denaturarea
proteinelor, nlturarea proteinelor prin prelucrarea cu proteaze,
centrifugarea difereniat, purificarea cu solveni organici.
Pentru izolarea unei anumite moleculele de ARNm se
utilizeaz celulele esuturilor n care are loc expresia genei
184

respective (de ex., ARNm pentru insulin poate fi izolat doar din
celulele | ale pancreasului; ARNm pentru globine din celulele
eritroblatilor etc.).

Obinerea fragmentelor de interes
n ADN genomic secvenele codificatoare alterneaz cu
cele necodificatoare. Pentru izolarea fragmentului ADN de
interes pot fi aplicate dou ci:
- direct, prin clivarea enzimatic a moleculelor de ADN
genomic i selectarea fragmentelor de interes;
- indirect, prin obinerea ADN complementar (ADNc) pe baza
ARNm.

Restricia ADN
Clivarea enzimatic a moleculelor de ADN se efectueaz
cu ajutorul unor enzime de restricie (ER) care recunosc
secvene specifice dublucatenare, numite situsuri de restricie.
Fig. 11.1. Clivarea ADN cu enzime de restricie. Producerea
fragmentelor cu capete adezive i neadezive
185

ER sunt enzime ntlnite la procariote care, n natur,
sunt responsabile de clivarea ADN-ului exogen (de ex., ADN
virual). SR reprezint nite succesiuni specifice formate, de
regul, din 4-6-8 pb ce formeaz palindroame (fig. 11.1).
Secvenele respective n ADN-ul gazdei sunt metilate i nu pot
fi recunoscute de ER proprii.
Ca rezultat al aciunii diferitor ER se pot obine
fragmente de ADN cu capete monocatenare adezive (lipicioase)
sau cu capete neadezive.
ADN-ul din genomul eucariotelor (inclusiv genomul
uman) conine diferite SR dispersate la ntmplare de-a lungul
macromoleculei. Utiliznd ER pot fi obinute fragmente de
ADN cu lungimi diferite. Comparnd fragmentele de restricie
se poate construi harta de restricie a moleculei de ADN
localizarea SR pentru diferite restrictaze.

Sinteza ADNc

Din esuturi se izoleaz setul de ARNm specific. Pe baza
ARNm cu ajutorul reverstranscriptazei (ADN-polimeraza-
ARN-dependent) se sintetizeaz molecule complementare de
ADN (ADNc). ADNc se deosebete de ADN genomic prin
lipsa intronilor i este identic cu secvena exonilor.
Sinteza ADN complementar include mai multe etape
(Fig. 11.2):
(1) izolarea ARNm;
(2) adugarea secvenelor oligo(dT) care servesc n calitate de
primer pentru polimerizare;
(3) enzima reverstranscriptaza sintetizeaz o caten
complementar de ADN pe baza matriei de ARN;
reverstranscriptaza formeaz o bucl la captul 3' al catenei
ADNc;
(4) hidroliza ARNm;
186

(5) sinteza catenei complementare a ADNc, bucla servind n
calitate de primer pentru ADN-polimeraz;
(6) nlturarea buclei cu ajutorul nucleazei S
1
.




Clonarea ADN
Procesul de obinere a unui numr mare de copii a
secvenei ADN de interes cu utilizarea tehnicilor ADN
recombinant poart denumirea de clonare. Procesul poate fi
realizat att in vivo , ct i in vitro (PCR).
Fig. 11.2. Obinerea ADNc
187


Clonarea ADN n vivo
Clonarea ADN n vivo const n izolarea unui fragment
de ADN, introducerea lui prin ligare ntr-un vector i
multiplicarea lui ntr-o celul gazd.
Vectorii de clonare sunt molecule de ADN care se
replic independent de cromozomul celular, chiar i atunci cnd
sunt introduse artificial n structura lor fragmente de ADN
strin. Pentru replicare vectorul are nevoie de dou elemente:
punctul ORI de iniiere a replicrii i gena pentru proteinele SSB
care pregtesc matria pentru replicare. n calitate de vectori se
utilizeaz plasmidele R, bacteriofagul , virusul simian SV-40,
cosmidele, cromozomii artificiali bacterieni (BAC), cromozomii
artificiali ai drojdiilor (YAC), etc. Selectarea vectorului de
clonare se face n funcie de dimensiunile fragmentului
multiplicat: fragmentele mici de pn la 15 kb pot fi clonate n
plasmide, fragmentele cu o lungime de pn la 50 kb n
cosmide i bacteriofagi, fragmentele mai mari de 300 kb pot fi
clonate n cromozomii artificiali BAC sau YAC.
n calitate de gazd de clonare sunt utilizate: celula
bacterian (pentru plasmide, cosmide, bacteriofagi, BAC),
celulele drojdiilor (pentru plasmide, YAC), celulele vegetale
(plasmide, virusuri), celulele animale (virusuri). Exist vectori
care se pot replica n mai multe gazde vectorii navet.
Moleculele hibride formate din ADN vector i ADN
pentru cercetare poart denumirea ADN recombinant. Obinerea
ADN recombinant necesit urmtoarele procese (fig. 11.3):
- izolarea ADN pentru clonare (o secven de ADN sau o
gen) i selecia vectorului de clonare;
- clivarea ADN de interes i a vectorului cu aceeai enzim de
restricie ce produce capete adezive;
- introducerea secvenei de ADN n vector prin ligarea
fragmentelor rezultate din digestia cu ER cu ajutorul enzimei
188

ADN-ligaza. ADN-ligaza unete complementar capetele
adezive ale fragmentelor prin legturi fosfodiesterice.
Moleculele recombinate se introduc n gazda de clonare.
Dup un anumit timp, datorit replicrii independente a
vectorului se obin copii numeroase ale genei de interes.
Moleculele recombinate sunt izolate din celula-gazd
purificate, dup care fragmentul de interes se extrage cu
ajutorul aceleai ER.
Clonele ADN obinute pot fi utilizate pentru
determinarea structurii primare, cartarea restrictiv, producerea
sondelor moleculare, analiza funciei genelor corespunztoare,
sinteza proteinelor solicitate (de ex., insulina, somatotropina,
interferonul etc.).

Fig. 11.3. Clonarea fragmentelor de ADN n vectori plasmidici
189

Amplificarea ADN in vitro

Reacia de polimerizare n lan (PCR Polimerase
Chain Reaction) reprezint tehnica de amplificare in vitro a
secvenelor de ADN aplicnd fenomenul de hibridare ADN-
ADN i proprietatea de replicare semiconservativ. Hibridarea
se produce dup recunoaterea specific a unor fragmente
nucleotidice de pe o caten a ADN-ului de interes, de ctre nite
secvene scurte de ADN, numite primeri. Primerii iniiaz
sinteza catenelor complementare de ADN care se realizeaz cu o
ADN-polimeraz termorezistent (Taq-polimeraza).
PCR decurge prin succesiunea ciclic a urmtoarelor
etape (Fig. 11.4):
1. denaturarea ADN prin nclzire la o temperatur ~96
0
C;
2. legarea primerilor la temperatura de renaturare ~50
0
C;
3. elongarea fragmentelor complementare la temperatura
72
0
C.
Aceste etape se repet de 25-35 ori. Produsele din ciclul
anterior servesc ca matrie pentru sinteza noilor catene (astfel
n I ciclu dintr-o molecul de ADN de interes se obin 2
molecule, n ciclul II 4 molecule, n ciclul 3 8 molecule
etc., dup 30 cicluri se obin peste 1 mlrd copii).

Biblioteci de ADN
Coleciile fragmentelor de ADN clonate dintr-o celul,
esut sau organism formeaz biblioteci de ADN. Acestea sunt
utile pentru identificarea genelor solicitate.

Biblioteca genomic
Colecia de clone ce conine cel puin o copie a fiecrei
secvene de ADN al genomului se numete bibliotec
190

Fig. 11.4. Principiul PCR
191

genomic. O bibliotec genomic este util pentru a gsi i izola
o gen de interes prin screeningul cu sonde specifice.
Bibliotecile genomice se obin prin dou tehnici:
1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim de
restricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un
vector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic.
2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunosc
secvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR este
tiat de ER.

Biblioteci cromozomiale
Dimensiunea genomului uman este att de mare, nct
sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom.
De aceea sunt obinute biblioteci ADN pentru fiecare cromozom
n parte biblioteci cromozomiale. Pentru om sunt necesare 24
de biblioteci diferite. Deci, dac o gen este localizat pe un
cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat
la biblioteca acelui cromozom.
Izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii
i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cu
ajutorul citometriei n flux. Acum sunt disponibile biblioteci
preparate din toi cromozomii umani.

Biblioteci de ADNc
Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar
se numete bibliotec ADNc. Fiind sintetizat pe matria
moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor
aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doar
genele funcionale specifice celulei respective. ADNc este
clonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai din
bacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin
digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive,
192

de aceea pentru introducerea n vector la moleculele de ADNc
se adaug adaptori care conin capete adezive.

Hibridarea acizilor nucleici

O proprietate natural a acizilor nucleici este capacitatea
de hibridizare. Hibridrile de acizi nucleici constau di unirea a
dou fragmente monocatenare n structuri bicatenare stabile n
condiii adecvate de temperatur, concentraie ionic i pH.
Hibridarea este condiionat de complementaritatea secvenelor
de baze azotate, componente ale celor dou catene. Din
complementaritate rezult i omologia de mperechere.
Tipuri de hibridare:
1. ADN ADN n care sonda este una dintre
monocatenele de ADN;
2. ARN ADN unde sonda este reprezentat de una din
cele dou catene ale heteroduplexului.
Una din cele mai importante aplicaii ale fenomenului de
hibridizare este obinerea sondelor moleculare. Sondele
moleculare sunt fragmente de ADN sau ARN marcate sau nu
(radioactiv), care prin fenomenul de hibridare pot recunoate n
mod complementar fragmente de interes, pe o molecul de
acid nucleic destinat cercetrii.
Din punct de vedere aplicativ, sondele nucleare
reprezint cile de acces direct la nivelul ADN, acestea putnd
detecta unele gene mutante, chiar n stadiul prenatal.
Tipuri de sonde moleculare:
1. sonde calde marcate radioactiv cu izotopi de
32
P sau
35
S
care sunt foarte sensibile, dar au o durat scurt de via i
sunt periculoase pentru cei ce le manipuleaz; se
vizualizeaz prin autoradiografie (impresie pe filmul
fotografic);
193

2. sondele reci fragmente de acid nucleic, marcate cu un
produs chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau
indirect, cu biotin. Se vizualizeaz n funcie de tipul de
marcaj. Dei sunt mai puin sensibile, au avantajul de a fi
inofensive pentru cercettor.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: ADN recombinant, clonare, vector de
clonare, enzim de restricie, situs de restricie, ADNc,
bibliotec ADN, fragmente de restricie, sond molecular,
hibridare.
2. Care sunt etapele obinerii genei de interes dintr-o celul?
3. Ce proprieti au enzimele de restricie?
4. Ce vectori de clonare cunoatei? Prin ce se deosebesc?
5. Care sunt etapele obinerii ADNc?
6. Ce importan are clonarea ADN?
7. Care este destinaia bibliotecilor ADN?
8. n ce const hibridarea ADN?
9. n ce scopuri se utilizeaz sondele moleculare?

194








TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR

Genele reprezint substratul molecular al ereditii.
Structura i localizarea genelor n genom controleaz
proprietile organismului. Ca rezultat al interaciunii
genomului cu diveri factori ai mediului, n ADN se pot produce
mutaii. Mutaia poate modifica metabolismul celular i tisular,
ceea ce conduce la dezvoltarea strilor patologice (boli
genetice). Tehnologia ADN recombinant a creat premisele
dezvoltrii unor metode de diagnostic molecular dotate cu
capacitate de rezoluie, grad de precizie i nivel informativ net
mai superioare celor ale metodelor convenionale. Superioritatea
absolut a abordrii moleculare rezult ns din faptul c spre
deosebire de toate celelalte metode de diagnostic, limitate la
determinarea exclusiv a trsturilor fenotipice, - analiza ADN,
destinat nemijlocit studiului genotipului este singura n msur
s obiectiveze alterrile primare (mutaiile) care se fac direct
responsabile pentru starea de boal.
Tehnicile ADN recombinant permit identificarea genelor
normale i/sau a variantelor lor mutante, stabilirea purttorilor
de gene mutante, diagnosticul prenatal sau presimptomatic al
patologiilor genetice, iar n viitorul apropiat apare posibilitatea
terapiei genice.
Studiul molecular al genelor poate fi realizat pe mai ci
n dependen de scopul propus:

195

1. secvenierea ADN pentru determinarea structurii
primare a genei;
2. tehnica Southern-blot pentru identificarea poziiei
genei n genom.
3. tehnica Northen-blot pentru determinarea expresiei
genelor (analiza ARNm);
4. tehnica Western-blot pentru determinarea produsului
proteic al genei;
5. tehnica PCR pentru identificarea genei normale sau
mutante.
n laboratoarele de biologie molecular se utilizeaz
diverse variante ale metodelor menionate.
Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici se utilizeaz
electroforeza macromoleculelor n gel de agaroz sau de
poliacrilamid. Purtnd sarcin negativ, moleculele acizilor nucleici
migreaz n cmpul electric cu viteze diferite, n dependen de
greutatea molecular. Fragmentele mai scurte migreaz mai rapid, n
timp ce fragmentele lungi migreaz mai lent. Pentru determinarea
dimensiunilor fragmentelor din gel, concomitent cu fragmentele de
interes sunt supuse electroforezei n trecuri vecine i fragmente-
marker ai lungimii. Moleculele acizilor nucleici pot fi vizualizate n
gel prin colorare cu ageni fluoresceni chimici, sau sunt marcate
radioactiv. n cazul marcrii radioactive fragmentele se identific cu
ajutorul autoradiografiei care const n suprapunerea gelului cu un
film fotosensibil.

Secvenierea ADN
Analiza secvenei bazelor azotate din structura primar a
ADN poate fi realizat prin dou ci: 1) calea chimic (Maxam-
Gilbert), n care se folosesc reaciile chimice de clivare a ADN-
ului n baze individuale (fig. 12.1), dar fiind o metod
complicat i laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz; 2)
calea enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in
vitro pe baza matriei ADN studiat, n aa fel nct reacia se
196

termin specific n poziia care corespunde unei baze anumite.
Pentru a determina o secven de nucleotide pe una din cile
menionate, ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate,
fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin
electroforez produii de reacie vor migra n patru curse
paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu band, poate fi
identificat ordinea nucleotidelor n ADN (fig. 12.2).

Tehnica SANGER (dideoxi)
Tehnica Sanger (dideoxi) utilizeaz sinteza enzimatic a
unei catene, complementar cu o matri clonat. n cadrul
acestei proceduri sinteza este stopat prin ncorporarea unui di-
deoxinucleozid trifosfat - un analog al dezoxiribonucleotidelor.
Dideoxinucleozidtrifosfaii conin n poziia 3' grupa H, dar nu
Fig. 12.1. Secvenierea ADN prin clivarea chimic
(Maxam-Gilbert)
197

grupa OH care mpiedic polimerizarea nucleotidelor (fig.
12.2).
Folosind patru analogi dedeoxi diferii n timpul sintezei
catenei noi de ADN, se poate de identificat fiecare nucleotid
normal din catena matri. Electroforeza fragmentelor obinute
permite stabilirea ordinii nucleotidelor n molecula de ADN.
n ultimii ani se utilizeaz o metod automat de
secveniere, bazat pe metoda dideoxi.

n scopuri de diagnostic al purttorilor de gene normale
sau mutante se compar rezultatele secvenierii cu datele
structurii primare normale a genei din bibliotecile de ADN. Spre
regret, nu se cunoate nc secvena tuturor genelor umane, de
aceea n diagnostic se utilizeaz metode indirecte: nlnuirea cu
markeri genetici apropiai (repetiii hipervariabile de ADN mini-
i microsatelitic), determinarea situsurilor de restricie
caracteristice genei date, hibridarea cu sonde specifice etc.
Fig. 12.2. Secvenierea ADN prin metoda dideoxi (Singer)
198


Tehnica Southern-blot

Pentru analiza unor gene e necesar s se
determine localizarea specific a situsurilor de
restricie. Aceast informaie e utila pentru compararea
genelor omoloage ale diferitelor specii, analiza
organizrii intronilor, clonarea ntr-un vector a prilor
unei gene. Succesiunea situsurilor de restricie ntr-o
gena poate fi determinat fr a fi necesar clonarea
genei, folosind sonde moleculare (secvene scurte de
ADN monocatenar, marcate radioactiv sau cu ageni
fluoresceni i care sunt complementare secvenei de
interes).
Analiza const din urmtoarele etape:
(1) extragerea ADN genomic cu greutate molecular
mare din celule;
(2) digestia enzimatic a ADN-ului cu diferite ER,
fiecare producnd fragmente de lungime diferit;
(3) separarea fragmentelor de restricie prin
electroforez n gel de agaroz;
(4) denaturarea fragmentelor bicatenare cu o soluie
alcalin;
(5) neutralizarea gelului cu o soluie tampon;
(6) transferul capilar al fragmentelor de ADN pe filtre
de nailon sau nitroceluloz;
(7) hibridarea cu sondele monocatenare radioactive;
(8) autoradiografia pentru vizualizarea hibrizilor
ADN cercetat / ADN sond.
Transferul pe filtru de nitroceluloz se realizeaz prin
tehnica Southern-blot (de la numele inventatorului Edward
Southern) (fig. 12.3).
199

Analiza poate determina prezena sau lipsa unor situsuri de
restricie caracteristice genei analizate care se asociaz cu
anumite mutaii. Diferenele dintre hrile de restricie obinute
de la doi indivizi este numit Polimorfismul Lungimii
Fragmentelor de Restricie (RFLP Restriction Fragment
Lenght Polimorphism). Acest polimorfism poate fi folosit ca
marker genetic n evaluarea genotipului.

Tehnica Northern-blot

Metoda Northern-blot const n transferul moleculelor
denaturate de ARN pe filtre de nailon sau nitroceluloz, urmat
de hibridarea cu sonde marcate. Aceast metod este similar
Fig. 12.3. Principiile transferului acizilor nucleici pe filtru i hibridarea cu sonde radioactive
(Southern-blot i Northern-blot)
200

tehnicii Southern-blot cu deosebirea c ARNm extras i purificat
nu este supus scindrii cu enzime, iar electroforeza decurge n
condiii de denaturare.
Tehnica Northern-blot permite identificarea transcripilor
genelor analizate, stabilirea lungimii lor.

Tehnica Western-blot
Aceast metod const n identificarea unei proteine specifice din
amestecul de proteine celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin
electroforez n condiii de denaturare n prezena SDS (Dodecil Sulfat de
Sodiu). Proteinele fracionate dup greutatea molecular sunt transferate pe
filtre de nailon sau nitroceluloz i supuse tratrii cu anticorpi specifici
marcai radioactiv sau fluorescent. Prin aceast metod se poate identifica
prezena/lipsa proteinei, dimensiunile ei, rata de expresie a genei.

Tehnica PCR n analiza genelor

Tehnica PCR poate fi utilizat pentru multiplicarea
selectiv a unei secvene dintr-o gen. Ca rezultat, se obin
populaii omogene de fragmente care pot fi utilizate n studiile
de n genetic molecular sau diagnostic (fig. 12.4, fig. 12.5).
Pentru a realiza amplificarea unei secvene este necesar
cunoaterea structurii genei normale sau mutante i sinteza
primerilor specifici complementari capetelor fragmentului de
interes. Primerii reprezint secvene oligonucleotidice
monocatenare de 20-30 baze care sunt obinute prin sintez
artificial. PCR se bazeaz pe hibridarea ADN cercetat - primer
i replicarea semiconservativ a ADN (Vezi cap. 11).
Avantajele tehnicii PCR sunt urmtoarele: suficiena
cantitilor mici de ADN, rapiditatea ei (n cteva ore se obin
milioane copii de ADN), specificitatea primerului permite
amplificarea selectiv a ADN, produsele de amplificare pot fi
utilizate n calitate de sonde pentru hibridri n alte tehnici.
201





Fig. 12.5. Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea
deleiilor
Fig. 12.4. Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea
mutaiilor punctiforme cu primeri specifici pentru gena
normal
202

Aplicaiile practice ale tehnicii PCR:
- detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i purttori;
- diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare;
- determinarea genelor de predispoziie la bolile comune
(coronaropatii, boala hipertonic, tulburri psihice etc.);
- diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor
canceroase;
- determinarea prenatal a sexului;
- identificarea agenilor patogeni (virui, bacterii);
- dactiloscopia genomic (identificarea persoanelor);
- analiza filiaiei (paternitate, maternitate);
- tipizarea HLA.

Hibridarea in situ

Hibridarea in situ reprezint o tehnic molecular , n
care o sond specific marcat poate identifica direct pe
preparatele celulare:
(1) un ARNm ntr-o celul particular sau esut;
(2) o gen pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom;
(3) numrul moleculelor de ARNm n dependen de perioada
ontogenetic sau tip tisular;
(4) ADN viral;
(5) deleiile cromozomiale submicroscopice;
(6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea i
nivelul lor de expresie.
Din motiv c sondele marcate radioactiv au unele
dezavantaje (tehnic laborioas, pericol pentru sntate) n
ultimii ani se utilizeaz metoda FISH (Fluorescence In Situ
Hibridization) care utilizeaz sonde fluorescent marcate (fig.
12.6). Metoda FISH este simpl, poate fi aplicat pe preparate
celulare arhivate, este rapid, nu modific morfologia celulelor.

203



Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: secvenierea ADN, hibridarea acizilor
nucleici, Southern-blot, Northern-blot, hibridarea in situ,
autoradiografie, primeri, sonde moleculare.
2. Ce tehnici moleculare se utilizeaz pentru studiul acizilor
nucleici?
3. Care sunt aplicaiile practice ale acestor tehnici?
4. Care sunt principiile secvenierii ADN?
5. Care sunt etapele tehnicii Southern-blot?
6. Care sunt avantajele i dezavantajele tehnicii Southern-blot?
7. n ce constau aplicaiile practice ale tehnicii PCR?



Fig. 12.6. Tehnica FISH
204


CICLUL CELULAR

Organismele vii sunt compuse din celule, a cror cretere
i diviziune necesit succesiunea programat a unor evenimente
i procese care formeaz ciclul celular. Unele din aceste procese
sunt continue, ca de exemplu sinteza proteinelor sau a lipidelor.
Altele, de exemplu sinteza ADN, din contra, sunt procese
discontinui i depind de procesul de diviziune celular. Fiecare
ciclu celular cuprinde dou perioade dinamic i calitativ
distincte: interfaza i mitoza (fig.13.1). Se accentueaz c
procesul multiplicrii celulare are la origine replicarea ADN-
ului cromozomial, replicare care are loc n perioada interfazic
S.

Fig. 13.1. Etapele ciclului celular
205

Interfaza

Interfaza ocup cea mai mare parte din durata ciclului
celular (90%), constituie perioada n care celula desfoar o
susinut activitate biosintetic (sinteza de ADN, ARN,
proteine), asigurnd condiiile necesare realizrii diviziunii
celulare. In cadrul acestei etape au fost descrise trei perioade
distincte:
- Perioada G1 perioada presintetic sau postmitotic, se
caracterizeaz prin:
- intensificarea transcripiei i a proteosintezei, procese
aproape blocate n perioada mitotic;
- decondensarea cromatinei proces important pentru
activarea transcripiei genelor;
- reorganizarea nucleolilor;
- cromozomii sunt monocromatidieni i se
caracterizeaz prin set diploid (2n = 2c).
- Perioada S perioada sintetic, se caracterizeaz prin:
- replicarea semiconservativ asincron a moleculelor
de ADN;
- dublarea cantitatii de ADN ;
- cromozomi bicromatidieni (2n = 4c);
- sinteza simultan de proteine histone i nehistone
implicate n sinteza i compactizarea ADN;
- dublarea centriolilor (fig. 13.2).
- Perioada G2 perioada postsintetic sau premitotic care
se caracterizeaz prin:
- transcripia i sinteza proteinelor cu aceeai
intensitate ca i n G1, asigurndu-se condiiile
necesare intrrii celulei n mitoz.



206

Mitoza i citochineza

Diviziunea celular debuteaz prin diviziunea nuclear
sau mitoza, se ncheie cu diviziunea citoplasmei sau
citochineza.
Mitoza i citochineza ocup o scurt perioad de timp
(10%) din durata desfurrii ciclului celular, numit perioada
mitotic (M). Mitoza, odat declanat, este un proces continuu.
Dar pentru studiu i descriere, a fost mprit n patru etape:
profaza, metafaza, anafaza i telofaza.
Profaza. Se caracterizeaz prin prezena n nucleu a
cromozomilor bicromatidieni (2n=4c). Aceste cromatide, unite
la nivelul centromerului, reprezint imaginea citologic a
procesului chimic de replicare a ADN-ului. Cromozomii se
condenseaz puternic, se ngroa i devin vizibili. Pe ambele
pri ale centromerilor se maturizeaz cte un kinetocor. La
sfritul profazei nucleolul dispare iar membrana nuclear
disociaz. Concomitent se organizeaz aparatul de diviziune:
centriolii se deplaseaz spre polii opui ai celulei, se formeaz
fusul de diviziune prin asamblarea microtubulilor.
Fig. 13.2. Ciclul centriolilor
207

Metafaza. Firele fusului de diviziune unesc centriolii i
cromozomii prin intermediul kinetocorilor. Cromozomii sunt
dispui n plan ecuatorial, formnd placa ecuatorial. La aceast
faz cromozomii sunt maximal condensai i prezint forma
optim pentru studiul citologic.
Anafaza. ncepe prin clivarea longitudinal a
centromerului fiecrui cromozom, separarea celor dou
cromatide surori i migrarea lor simultan spre polii opui ai
celulei (fig. 13.3). La aceast faz cromozomii devin
monocromatidieni, iar celula are un set tetraploid de cromozomi
(4n = 4c).
Telofaza. n telofaz se ncheie migrarea cromozomilor
fii ctre polii celulei, fiecare pol coninnd 2n cromozomi
monocromatidieni (set diploid). ncepe decondensarea
progresiv a cromozomilor i revenirea la starea cromatinei
Fig. 13.3. Mecanismul micrii filamentelor fusului de diviziune
208

interfazice a materialului ereditar. Fibrele fusului acromatic
disociaz. Se reasambleaz membrana nuclear n jurul fiecrui
grup de cromozomi. Reapar nucleolii.
Citochineza definete fenomenul de diviziune, n care
are loc separarea masei citoplasmatice n dou jumti i a
organitelor citoplasmatice n cele dou celule. La celulele
animale diviziunea citoplasmatic se realizeaz prin clivare.
Fiecare celul fiic motenete n urma citochinezei un
set de componente celulare. Deoarece, cu excepia nucleului,
organitele celulare nu se pot duplica n absena unei copii
preexistente, n celula parental are loc dublarea constituenilor
celulari naintea declanrii citochinezei. Duplicarea organitelor
celulare se realizeaz prin mecanisme diferite. Mitocondriile
cresc i se divid prin fisiune semiautonom. Aparatul Golgi i RE
se fragmenteaz n vezicule din care vor fi constituite noile
organite celulare, n timp ce ribozomii se multiplic prin
asamblarea elementelor constituente (ARNr i proteine
ribozomale). Se apreciaz c celula nu dispune de un mecanism
specializat de distribuire a organitelor celulare, astfel nct
celulele fiice nu sunt identice dup coninutul citoplasmatic.
Totodat replicarea ADN n interfaz i mitoza asigur formarea
celulelor identice genetic att ntre ele ct i cu celula mam.
Diviziunea mitotic st la baza nmulirii celulelor
somatice, asigur creterea organismului pluricelular, determin
biomasa organismului i regenerarea esuturilor.

Reglarea ciclului celular

Durata ciclului celular este variabil n funcie de
specie i tip celular, ba chiar i pentru celulelr aceluiai esut.
Exist celule n organism care se divid foarte rapid, parcurgnd
ntregul ciclu celular n 8 ore, pe cnd altele se divid rar, cu
ciclul celular de 100 zile sau chiar mai mult. La eucariotele
209

superioare ciclul celular dureaz 10-25 ore, din care diviziunea
celular dureaz o or. Perioada G1 are durata cea mai variabil,
n timp ce perioada S este cea mai constant pentru un anumit
tip celular.
Dup ce au depit perioada G1, timpul necesar pentru
perioada S i G2, deci pn la nceputul diviziunii este foarte
constant pentru diferite celule. De acea s-a introdus noiunea de
punct de restricie (punct R) pentru momentul imediat, urmat
de sfritul perioadei G1, care trebuie depit pentru ca celula s
poat parcurge etapele urmtoare ale ciclului celular (fig. 13.4).
Un alt punct de restricie se afl spre sfritul perioadei
G2. Inhibarea sintezei proteinelor n aceast faz mpiedic
intrarea celulei n mitoz. Se consider c o proteinkinaz
solubil (o enzim ce catalizeaz fosforilarea proteinelor) este
activat spre sfritul perioadei G2 i acioneaz asupra
proteinelor din lamina nuclear i asupra histonelor H1.
Fosforilarea proteinelor din lamina nuclear induce
dezasamblarea nveliului nuclear, pe cnd fosforilarea
histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen
caracteristic mitozei.

Reglarea succesiunii evenimentelor ciclului celular
Acurateea proceselor de replicare i segregare a ADN
depinde de succesiunea evenimentelor ciclului celular ntr-o
ordine strict, astfel nct, declanarea unui nou eveniment s
survin doar n urma ncheierii complete a evenimentului
precedent.
Exist mecanisme i factori reglatori, ce controleaz trei
evenimente cheie ale ciclului celular:
- iniierea sintezei ADN este controlat de complexul
activator al perioadei S;
210

- derularea replicrii materialului genetic nuclear este
controlat de alt factor semnal de ntrziere a perioadei
mitotice;
- declanarea procesului mitotic, n care are loc segregarea
materialului genetic, este dirijat de factorul de activare a
mitozei (M-phase promoting factor: MPF).

Factorii de cretere
S-au descris mitogene specifice ca: eritropoietina,
factorii de cretere ai unor celule (nervilor, fibroblastelor),
poliamine (putrescina), hormoni (n special estrogenii). Exist i
factori tisulari, care inhib diviziunile celulare cum sunt
chalonele (peptide sau glicoproteine) (tab. 13.1).

Tabelul 13.1. Factorii de cretere i aciunea lor asupra
celulelor int
FACTORII DE CRETERE ACIUNEA ASUPRA CELULELOR INT
Factorul de cretere
epidermal EGF
Stimuleaz proliferarea mai multor tipuri
celulare
Factori de cretere de tip
insulinic IGF1, IGF2
Stimuleaz proliferarea adipocitelor i a
celulelor din esutul conjunctiv
Factorul de cretere a
fibroblatilor FGF
Stimuleaz proliferarea: fibroblatilor,
celulelor endoteliale i mioblatilor
Factorul de cretere neuronal
NGF
Induce cretere axonal i viabilitatea
neuronilor simpatici i senzori
INTERLEUKINA 2 IL2 Stimuleaz proliferarea limfocitelor T
INTERLEUKINA 3 IL3
Stimuleaz proliferarea celulelor Stem i a
majoritii celulelor precursoare ale multor
celule difereniate
ERITROPOIETINA
Stimuleaz proliferarea celulelor precursoare
ale eritrocitelor
Factori de stimulare a
coloniilor granulocitare G-
CSF
Stimuleaz proliferarea: celulelor
precursoare ale macrofagelor i
granulocitelor, neutrofilelor
Factori de stimulare a
coloniilor de macrofage
M-CSF
Stimuleaz proliferarea celulelor precursoare
ale macrofagelor i granulocitelor
211

Competiia celulelor pentru factorii de cretere menine
constant densitatea populaiei celulare. n momentul n care
densitatea populaiei celulare depete o valoare prag,
concentraia factorilor de cretere scade i n consecin
diviziunea celular este oprit.

Ciclinele
Descoperirea ciclinelor i a protein-kinazelor
dependente de cicline (cdk) a permis interpretarea corect a
mecanismelor ce regleaz ciclul celular.
Ciclinele reprezint un grup restrns de proteine a cror
sintez se realizeaz ntr-un mod dependent de perioadele
ciclului celular. Ele activeaz cdk, formnd cu acestea complexe
ce prezint activitate kinazic. Pe parcursul formrii
complexelor, ciclinele induc modificri conformaionale i de
locaie a cdk ceea ce confer acestora specificitate n folosirea
diferitelor substraturi. Specificitatea activitii catalitice a
complexelor ciclina /cdk st la baza parcurgerii de ctre celul a
ciclului celular.
Evenimentele ce marcheaz intrarea celulei n perioada
mitotic sunt rezultatul fosforilrii directe sau indirecte a unor
proteine de ctre MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare,
MPF declaneaz dezorganizarea membranei nucleare.
Fosforilarea histonei H1, proces ce iniiaz condensarea
cromatinei, este catalizat de proteinkinaz, enzim activat prin
fosforilare de ctre MPF. Se consider c un mecanism indirect
similar de fosforilare st la baza asamblrii fusului de diviziune.
Ciclinele i protein-kinazele dependente de cicline constituie
componentele motorului ciclului celular (fig. 13.4).

Ciclinele se clasific n trei grupe (fig. 13.5):
1. ciclinele perioadei G1 ciclinele D i E;
2. ciclinele perioadei S ciclina A;
3. ciclinele perioadei G2 ciclina B.
212




Fig. 13.4. Reglarea ciclului celular
Fig. 13.5. Activitatea ciclinelor n ciclul celular
213

Gene implicate n controlul ciclului celular

Organismele multicelulare i-au dezvoltat sisteme
complexe de comunicare ntre celulele care le alctuiesc. Prin
intermediul acestor sisteme se asigur reglarea dezvoltrii i
organizrii esuturilor, controlul creterii i proliferrii,
coordonarea activitii celulelor, esuturilor i organelor. Sunt
descrise dou clase principale de gene care codific proteine
implicate n reglarea ciclului celular: protoncogenele i genele
supresoare de tumori (antioncogene).
Protooncogenele reprezint o clas eterogen de
secvene de ADN, aflate n celulele normale, ale cror funcii se
exercit n cadrul proceselor de cretere, proliferare i
difereniere celular. Acestea codific factori de cretere,
receptori ai factorilor de cretere, cicline i ali mitogeni.
Protooncogenele sunt active n celulele embrionare, iar la adult
doar n celulele esuturilor proliferative (celulele epiteliale,
celulele hematopoezei). Prin mutaii, eveniment accidental,
protooncogenele se pot transforma n oncogene (de ex., c-bcl, c-
myc, c-ras, c-jun etc.). Oncogena este, deci, forma anormal,
activat, a unei protooncogene, care se caracterizeaz prin
capacitatea de a induce i/sau promova proliferarea anormal (n
exces) caracter specific celulelor canceroase.
Genele supresoare de tumori (GST) au roluri cruciale n
fiziologia celulelor. Produii lor proteici alctuiesc reele de
semnalizare intracelulare cu funcii diametral opuse celor pe
care le ndeplinesc reelele formate din proteinele codificate de
protooncogene. GST funcioneaz inhibnd proliferarea i
diferenierea celular. Unele GST codific factori proteici ce
controleaz replicarea i reparaia ADN i stopeaz intrarea
celulei n mitoz att timp ct aceste procese nu iau sfrit.
Pierderea sau inactivarea GST (de ex., prin hipermetilarea unor
secvene ADN reglatoare ale unor uniti transcripionale)
214

confer celulelor capacitatea proliferrii autonome (de ex., p53,
Rb).
Adeziunea celular
La majoritatea celulelor organismelor vertebrate,
formarea adeziunilor intercelulare i celula-matrice este o
condiie important n depirea punctului de restricie. Dup
intrarea n perioada sintetic, pn la ncheierea mitozei, celulele
pierd parial legturile ce le stabilizeaz n esut i se rotunjesc
(fig.13.6).

S-a constatat c celulele cultivate n suspensie, supuse
unei agitri permanente, devin sferice i i pierd capacitatea
proliferativ, fenomen numit dependen de ancorare a
diviziunii celulare.

Evoluia celulelor dup diviziune

n dependen de perioada ontogenetic i tipul esutului
dup diviziune celulele pot avea o evoluie diferit, controlat
genetic. Celulele esuturilor proliferative se divid intens,
producnd populaii noi de celule. Alte celule prsesc ciclul
celular pentru o difereniere (specializare) terminal i rmn
ntr-o perioad de activitate metabolic de susinere G
0
. Celulele
Fig. 13.6. Configuraia celulelor n diferite etape
ale ciclului celular
215

care i-au epuizat programul de supravieuire sunt eliminate din
esut prin apoptoz. Pe lng proliferare i difereniere, n
organism, celulele a cror funcie este epuizat, sunt nlturate i
nlocuite de celule tinere. Procesul de nlturare este un proces
fiziologic i a fost denumit apoptoz sau moarte celular
programat.

Diferenierea celular
Toate celulele unui organism pluricelular pornesc de la o
celul zigot cu setul de gene capabil s asigure creterea i
dezvoltarea unui organism complex format din diferite esuturi.
Replicarea ADN i mitoza asigur transmiterea aceleai
informaii genetice tuturor celulelor care vor rezulta din
diviziunea zigotului. n diferite perioade ontogenetice celulele
i modific aspectul, compoziia i ca rezultat funciile.
Diferite celule se deosebesc ntre ele prin setul de proteine
necesare pentru activitatea celulei i setul specializat de proteine
necesare pentru ndeplinirea unor funcii specifice esutului dat.
De exemplu, n celulele dermului se sintetizeaz keratin, n
eritrocite hemoglobina, n celulele intestinului fermeni
digestivi, n celulele retinei opsine etc. Coninutul difereniat
de proteine n diferite celule este determinat de expresia
difereniat a genelor n timp i spaiu. Astfel, diferenierea
celular este determinat de conectarea sau deconectarea
unor gene cu expresie difereniat n timp i spaiu.

Apoptoza
Homeostazia tisular necesit un echilibru ntre moartea
i proliferarea celular. n general, sinuciderea celular este
activat pentru a elimina selectiv celulele devenite indezirabile
(nedorite). Acestea pot fi: celule lezate sau senescente
(polinucleare acumulate la nivelul situsului inflamator), celule
216

recunoscute ca strine sau preneoplazice (a cror apoptoz este
indus de celule citotoxice) sau celule care au pierdut contactul
cu mediul lor nconjurtor (de exemplu, celulele epidermice,
care au migrat, n urma unui traumatism n esutul subcutanat),
sau celule n exces care intr n competiie cu alte celule pentru
un semnal inhibitor.
S-a demonstrat c apoptoza are loc n:
- cursul dezvoltrii normale a embrionului;
- regresia organelor la larve n timpul metamorfozei;
- pierderea celulelor din spaiul interdigital al mnii la
embrionul uman;
- eliminarea celulelor senescente sau lezate din esuturi;
- eliminarea celulelor transformate (canceroase);
- n sistemul imun - prin apoptoz se realizeaz ndeprtarea
unor clone limfocitare i selecia altora.
Fiecare celul primete multiple semnale (hormoni,
citokine) prin intermediul receptorilor specifici. Aceste semnale
pot induce intrarea celulei n ciclul celular sau n apoptoz. De
exemplu, glucocorticoizii sau ionoforul de Ca
2+
induc apoptoza
n timocite. Acest proces este inhibat prin activarea protein-
kinazei C de ctre un ester forbol sau de ctre IL1. Alterarea
unui receptor specific ar putea determina apariia unei clone
maligne, dezechilibrnd aceast relaie ntre semnalele
inductoare i represoare ale apoptozei i ale proliferrii.
Caracteristica esenial a apoptozei este reprezentat de
clivajul ADN dublucatenar la nivelul linker-ilor
intranucleozomici (fig.13.7).
Modificrile din nucleu ce afecteaz n principal
moleculele de ADN, sunt produse n urma activrii sau induciei
unei endonucleaze care este dependent de ionii de Ca
2+
i
Mg
2+
. Aceast enzim este prezent n mod constitutiv, n unele
tipuri de celule (timocitele din cortex), ns ea apare indus n
alte tipuri de celule. Aceast endonucleaz cliveaz ADN
217

internucleozomal, dnd natere la o serie de fragmente formate
din 180-200 perechi de baze.

Dup clivarea ADN urmeaz fragmentarea nucleului
urmat de fragmentarea celulei i formarea corpilor apoptotici.
Acetia sunt fagocitai de celulele vecine sau de limfocte.
Fagocitarea corpilor apoptotici se realizeaz n urma
recunoaterii de ctre celulele fagocitare a noilor molecule, care
sunt expuse pe suprafaa membranei corpilor apoptotici (de ex.,
glicani bogai n reziduuri de N-acetil- glucozamin). n
mecanismul declanrii acestui proces au fost identificate o serie
de gene. Din categoria acestor gene s-a demonstratrolul a dou
grupuri principale: oncogenele (myc, ras, bcl-2) i unele gene
Fig. 13. 7. Schema evenimentelor din apoptoz
218

supresoare ale creterii tumorale (p53) care pot fi implicate n
iniierea sau blocarea apoptozei.
Unele proto-oncogene (c-bcl-2) blocheaz specific
moartea fiziologic a celulei (apoptoza). Supraexpresia
oncogenelor mutante c-ras poate produce acelai efect blocant,
chiar dac celulele au fost expuse la diferii factori de cretere,
la care ele sunt sensibile i care n condiii normale ar fi condus
la moartea lor prin apoptoz. n schimb, gena supresoare a
creterii tumorale, p53, are un efect opus, ea induce apoptoza n
celulele susceptibile.


Apoptoza i senescena

n timpul mbtrnirii (senescenei), s-a observat n
majoritatea organelor o scdere a numrului de celule, ca
rezultat al ncetinirii ritmului de cretere a celulelor i al
eliminrii lor prin apoptoz. Acestea ar putea fi consecine ale
unei deficiene de factori de cretere, a unor anomalii de
Fig. 13.7. Reglarea apoptozei
219

transmitere a semnalelor inter- i intracelulare i a modificrii
ciclului celular. Apoptoza intervine n eliminarea celulelor
senescente alterate. Dac apoptoza este perturbat, poate fi
antrenat eliminarea celulelor sntoase i pstrarea celulelor
anormale.
Deci, n cursul mbtrnirii apoptoza ar permite
eliminarea celulelor cu funcionare deficitar apoptoza
normal. Mecanismele reglatoare ale apoptozei ar fi activate de
ctre o leziune celular incompatibil cu supravieuirea celulei.
n alt caz, activarea acelorai mecanisme va avea drept
consecin dispariia celulelor normale apoptoza abuziv. De
exemplu, diminuarea progresiv a sintezei anumitor factori de
cretere i/sau de supravieuire o dat cu vrsta nu ar permite
meninerea dect a unei populaii celulare din ce n ce mai
redus numeric.
n alte cazuri, mecanismele de control ale apoptozei ar fi
ele nsei afectate de mbtrnire i activarea lor ar putea
determina deleia neadecvat a celulelor normale apoptoz
aberant. Activarea inoportun i/sau disfuncia mecanismului
apoptotic ar contribui la moartea celular n exces, fenomen
caracteristic senescenei.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: ciclu celular, mitoz, interfaz, kinetocor,
punct de restricie, cicline, factor de cretere, apoptoz.
2. Care sunt perioadele ciclului celular?
3. Ce procese au loc n interfaz?
4. Care este durata ciclului celular?
5. Ce factori controleaz evenimentele din interfaz?
6. Ce factori induc mitoza?
7. Care este rolul biologic al mitozei?
8. Care este soarta celulelor dup diviziune?
9. n ce const rolul biologic al apoptozei?
220






RECOMBINAREA GENETIC

Prin recombinare genetic se definete fenomenul
producerii unor combinaii genetice noi prin rearanjarea,
reasortarea sau redistribuia materialului genetic cuprins n dou
uniti genetice diferite.
Recombinarea genetic este un proces general n natur
i reprezint una din cheile mecanismelor prin care se formeaz
noi indivizi, proces important n selecia natural. Mecanismele
de recombinare genetic sunt diferite la procariote i eucariote.

Recombinarea genetic la eucariote
La eucariote recombinarea materialului genetic este
asigurat n general de procesele legate de nmulirea sexuat i
de fenomenele de transpoziie (vezi cap. 8). n dependen de
cantitatea de material implicat n recombinare deosebim:
- recombinare genomic recombinarea materialului ereditar
n procesul fecundaiei;
- recombinarea intercromozomic asortarea independent a
cromozomilor neomologi n anafaza I a meiozei;
- recombinarea intracromozomic recombinarea genelor
ntre cromozomii omologi n procesul crossing-overului;
- recombinarea prin transpoziie inserarea secvenelor
scurte de ADN ntr-un loc nou n acelai sau alt cromozom.


221

Recombinarea genomic
Eucariotele superioare se caracterizeaz printr-un
mecanism particular de nmulire nmulire sexuat, la care
particip dou celule specializate - gameii. De regul, gameii
sunt de origine diferit (matern i patern). Contopirea
gameilor haploizi poart denumirea de fecundare, iar celula
rezultat ce conine materialul genetic al ambilor gamei - zigot.
Participarea gameilor (unui organism) la fecundaie este
aleatorie, asigurnd formarea diferitor tipuri de zigoi, ceea ce
reprezint recombinarea genomic.
Fuziunea celor doi gamei haploizi reface setul diploid
de cromozomi, caracteristic speciei. Mitozele succesive ale
zigotului duc la creterea i dezvoltarea organismului
pluricelular. ncepnd cu zigotul toate celulele somatice vor
avea cromozomii n perechi de omologi identici ca morfologie i
structur genic, dar diferii ca origine.

Recombinarea intra- i intercromozomic
La animale formarea gameilor are lor n gonade. Din
celule precursoare (gametogonii), care sunt celule cu set diploid
de cromozomi i sunt identice genetic cu zigotul, se formeaz
gamei haploizi. Procesul de maturizare a gameilor este
reprezentat de meioz. Meioza este un mecanism complex ce
implic desfurarea succesiv a dou diviziuni, care se termin
cu njumtirea setului de cromozomi n celulele fiice. Din
fiecare celul cu un set de 2n (set diploid) cromozomi se
formeaz 4 gamei cu cte 1n (set haploid) de cromozomi
proces invers fecundaiei. Gameii rezultai din meioz sunt
produi ai recombinrii inter- i intracromozomice. Aceste tipuri
de recombinare au loc n diferite etape ale meiozei.
Meioza este precedat de o interfaz premeiotic n care are
lor replicarea ADN. ntre cele dou diviziuni exist o perioad scurt
interkineza n care nu are loc replicarea ADN.
222

I diviziune meiotic diviziunea reducional
Diviziunea reducional este responsabil de
njumtirea setului de cromozomi i de recombinarea inter- i
intracromozomic.
Profaza I
Profaza I a meiozei reprezint cea mai important i
complex faz, n care are loc conjugarea cromozomilor i
recombinarea intracromozomic. Aceast faz este divizat n
cinci etape n care are loc condensarea continu a cromatinei i
formarea aparatului de diviziune.
Leptotenul (leptonemul) cromozomii bicromatidieni
se condenseaz, devin vizibili i au aspectul unor filamente
subiri.
Zigotenul (zigonemul) reprezint momentulcheie n
care are loc conjugarea cromozomilor omologi (perechea de
cromozomi identic dup
lungime, form,
structur, dar de origine
diferit unul matern i
altul patern). Conjugarea
omologilor are loc
centromer - la centromer,
telomer la telomer,
gen alel la gen
alel, formnd bivaleni
sau tetrade (doi
cromozomi omologi
bicromatidieni) (fig.
14.1). Procesul
conjugrii este facilitat
de complexul
sinaptonemal, format
din proteinele axului
Fig. 14.1. Structura bivalentului
(tetrada)
223

cromozomic, care asigur apropierea cromatidelor i
stabilizeaz tetradele.
Cromozomii X i Y, nefiind omologi, n timpul
conjugrii se unesc prin capetele lor, formnd un bivalent
vezicula sexual.
Pachitenul (pachinemul) se caracterizeaz prin
schimbul reciproc de fragmente ntre cromozomii omologi
crossing-overul, care reprezint recombinarea intracromozomic
a materialului genetic. Astfel, fiecare dintre cromozomi va
conine material genetic de la ambii prini, iar noua combinaie
de gene va fi transmis generaiilor urmtoare.
Un rol
important n
realizarea
crossing-overului
l are complexul
sinaptonemal n
cadrul cruia se
formeaz un
complex catalitic
multiproteic -
nodul de
recombinare,
responsabil de
ruperea i
reunirea
ncruciat a fragmentelor omoloage (fig. 14.2).
Diplotenul (diplonemul) reprezint faza n care
cromozomii omologi ncep s se separe unul de altul prin
dezorganizarea complexului sinaptonemal. Omologii rmn
unii n punctele, n care a avut loc crossing-overul, formnd
chiasme (fig. 14.1). Numrul chiasmelor coincide cu numrul
nodulilor de recombinare.
Fig. 14.2. Complexul sinaptonemal
224

Diachineza se remarc prin fenomenul de terminalizare
a chiasmelor deplasarea chiasmelor spre extremitile
cromozomilor. Bivalenii rmn unii doar prin capete.

La sfritul profazei I au loc urmtoarele procese:
disocierea anvelopei nucleare, maturizarea kinetocorilor (cte
un singur kinetocor pentru fiecare cromozom), unirea
bivalenilor la fusul de diviziune.
Metafaza I
n metafaza I are loc aranjarea bivalenilor n plan
ecuatorial, formnd placa metafazic. Centromerii
cromozomilor omologi sunt orientai spre poli opui. La sfritul
metafazei I are loc disocierea chiasmelor terminale i eliberarea
cromozomilor omologi din bivalent (fig. 14.4).
Anafaza I
Anafaza I se caracterizeaz prin disjuncia cromozomilor
omologi din bivalent i migrarea cromozomilor bicromatidieni
spre polii celulei (fig. 14.4). Spre fiecare pol migreaz cte un
cromozom din fiecare pereche (la om se formeaz 23 bivaleni,
astfel la fiecare pol ajung cte 23 cromozomi bicromatidieni).
Cromozomii materni i cei paterni segreg independent unii de
Fig. 14.3. Succesiunea principalelor evenimente din profaza I
225

Fig. 14.4. Mecanismele de disjuncie
a cromozomilor n meioz
alii, nct are loc o
combinare independent a
cromozomilor neomologi
recombinare
intercromozomic.
Numrul de combinaii
posibile poate fi 2
n
(la om
2
23
= 83886068 combinaii).
Telofaza I
n telofaza I
cromozomii bicromatidieni
se gsesc la polii celulei i
are loc decondensarea lor
parial; se reorganizeaz
membrana nuclear, iar prin
citikinez se formeaz doi
gametocii secundari cu set
haploid de cromozomi
bicromatidieni.
Diviziunea II
diviziunea ecvaional
Dup interkineza
scurt, are loc diviziunea
ecvaional n ambele
celule rezultate din I
diviziune. Diviziunea II este
asemntoare cu mitoza i
asigur repartizarea egal i
identic a cromatidelor n
celulele gamei (fig. 14.4).
226

Mecanismul molecular al crossing-overului
n procesul crossing-overului particip dou molecule
omoloage de ADN, care sunt apropiate fizic prin intermediul
complexului sinaptonemal. Recombinarea are loc ntre secvene
nalt specifice i se bazeaz pe principiul complementaritii.
Este un mecanism foarte precis i se efectueaz cu o acuratee
strict.
Procesul de recombinare necesit ruperea duplexelor de
ADN, formarea monocatenelor i reunirea ncruciat a
secvenelor complementare. Ca rezultat al ncrucirii
moleculelor, se formeaz o configuraie cruciform specific,
numit structura Holliday (fig. 14.5).
Fig. 14.5. Modelul Holliday de recombinare
227

n dependen de modul de tiere a acestei structuri se
pot obine molecule recombinate de ADN de dou tipuri:
(1) molecule recombinate cu secvene heteroduplexe
(numai una din catene este recombinat);
(2) molecule recombinate, prin schimb reciproc de
fragmente bicatenare.
Crossing-overul nu este un proces obligatoriu la toate
eucariotele (de ex., la masculii dipterelor el n-a fost nregistrat).
Mecanismul molecular de reglare, inclusiv proteinele implicate
nu sunt deocamdat bine studiate. S-au gsit omologii ntre
unele proteine participante la crossing-over cu proteinele de
recombinare la E.coli.

Recombinarea genetic la procariote
La procariote exist mai multe tipuri de recombinare
genetic, bazate pe proprietatea ADN de a forma heteroduplexe
i capacitii de a insera fragmente strine de ADN.
Recombinarea natural se produce atunci cnd dou
molecule de ADN omoloage sunt prezente n aceeai celul. La
bacterii recombinarea genetic general se efectueaz prin
transferul unor fragmente de ADN de la o celul la alta prin
fenomenele de transformare, conjugare, sau prin transducie
(vezi cap. 5).
Recombinarea prin transpoziie se caracterizeaz prin
inserarea unor noi secvene de ADN ntr-o moleculgazd fr
existena omologiei ntre secvenele implicate (vezi cap. 8).
Recombinarea situs-specific se realizeaz ntre
succesiuni specifice de nucleotide ale moleculelor de ADN
bacterian i ADN fagic. Condiia pentru realizarea recombinrii
este prezena secvenelor omoloage n ambele molecule i a unui
complex enzimatic particular care asigur recunoaterea
secvenelor implicate n recombinare.

228

Mecanismul molecular al recombinrii la E.coli
Modelul cel mai accesibil pentru studierea recombinrii
genetice este E.coli. n procesul de recombinare particip:
- molecula ADN bicatenar recipient cu situsul chi (secven
conservat la bacterii, localizat la fiecare 5-10kb, format
din 8 perechi baze
' 5 ' 3
' 3 ' 5
CGACCACC
GCTGGTGG
);
- fragmentul ADN monocatenar donor (ADN fagic, ADN
plasmidic);
- complexul proteic RecBCD format dintr-o endonucleaz, o
exonucleaz i o ADN-helicaz;
- proteina RecA ce catalizeaz reacia de formare a
heteroduplexurilor (fig. 14.6);
- proteine SSB care stabilizeaz monocatenele.

Moleculele monocatenare donor se formeaz prin
denaturarea unor molecule de ADN sau rezult din replicarea
a ADN fagic (vezi cap. 7). Pentru formarea heteroduplexului din
molecula de ADN recipient se excizeaz una din catene, iar de
cealalt caten original se unete complementar ADN
monocatenar donor.
Etapele recombinri:
Fig. 14.6. Rolul proteinei RecA n recombinarea genetic la
bacterii
229

(1) Complexul RecBCD gsete n molecula ADN recipient
secvena chi. RecBCD denatureaz ADN bicatenar i
produce o ruptur n una dintre catene, obinndu-se un
capt 3' liber.
(2) Proteina RecA asigur recunoaterea captului 3' liber i
catalizeaz unirea complementar cu fragmentul de ADN
donor monocatenar.
(3) Catena donor nlocuiete una dintre catenele originale,
formnd un heteroduplex (ADN recombinat).
(4) Catena dislocuit este eliminat.

Exist recombinare cu fragmente bicatenare omoloage
de ADN, catalizat de complexul proteic RuvABC. Acest
proces este asemntor cu mecanismul crossing-overului
descris la eucariote.

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: recombinare genetic, complex
sinaptonemal, nodul de recombinare, bivalent, cromozomi
omologi, structura Holliday, heteroduplex.
2. Care este importana biologic a recombinrii genetice?
3. Care sunt tipurile de recombinare genetic la procariote i la
eucariote?
4. Cnd i cum are loc crossing-overul?
5. Care este importana biologic a anafazei I?
6. Care sunt condiiile pentru recombinarea genetic la
bacterii?


230

BIBLIOGARFIE

1. Adams, R.L.P. et al. (Eds) (1986) The Biochemistry of the
Nucleic Acids, 10th revised edn (Chapman & Hall, London).
2. Bayer, M.E. (1968) Areas of adhesion between wall and
membrane in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 53, 395.
3. Benga G. (1985) Biologia celular i molecular. Dacia,
Cluj-Napoca.
4. Bickmore, W.A. & Sumner, A.T. (1989) Mammalian
chromosome banding. Trends Genet. 5, 144178.
5. Blackburn, E.H. & Szostak, J.W. (1984) The molecular
structure of centromeres and telomeres. A. Rev. Biochem.
53, 163194.
6. Bloom, K & Green, M. (Eds) (1992) Nucleus and gene
expression. Curr. Opinion Cell Biol. 4, 377-567.
7. Brown, T.A. (1990) Gene Cloning, 2nd edn (Chapman &
Hall, London).
8. Burke, D.T. et al. (1987) Cloning of large segments of
exogenous DNA into yeast by means of artificial
chromosome vectors. Science 236, 806812.
9. Clarke, L. (1990) Centromeres of budding and fission yeasts.
Trends Genet. 6, 150-154.
10. Cormack, B.P. & Struhl, K. (1992) The TATA-binding
protein is required for transcription by all three nuclear RNA
polymerases in yeast cells. Cell 69, 685-696.
11. Covic M. (1981) Biologie i genetic medical. Ed.
Didactic i Pedagogic, Bucureti.
12. Darnell, J. et al. (1990) Molecular Cell Biology 2nd edn
(Scientific American Books, San Francisco, CA).
13. Dunderdale, H.J. (1991) Formation and resolution of
recombination intermediates by E. coli RecA and RuvC
proteins. Nature 354, 506-510.
231

14. Evans, W.H. & Graham, J.M. (1989) Membrane Structure
and Function (IRL Press, Oxford).
15. Felsenfeld, G. & McGhee, J.D. (1986) Structure of the 30-
nm chromatin fiber. Cell 44, 375377.
16. Felsenfeld, G. (1992) Chromatin as an essential part of the
transcriptional mechanism. Nature 355, 219224.
17. Gennis, R.B. (1989) Biomembranes (Springer-Verlag,
Berlin).
18. Giaever, G.N. & Wang, J.C. (1988) Supercoiling of
intracellular DNA can occur in eukaryotic cells. Cell 55,
849-856.
19. Goeddel, D. et al. (1979) Direct expression in Escherichia
coli of a DNA sequence coding for human growth hormone.
Nature 281, 544-548.
20. Greider, C.W. & Blackburn, E.H. (1985) The identification
of a specific telomere terminal transferase activity in
Tetrahymena extracts. Cell 43, 405413.
21. Hartwell, L.H. & Weinert, T.A. (1989) Checkpoints:
controls that ensure the order of cell cycle events. Science
246, 629-634.
22. Holliday, R. (1964) A mechanism for gene conversion in
fungi. Genet. Res. 5, 282-304.
23. Ingraham, J.L. et al. (1983) Growth of the Bacterial Cell
(Sinauer, Sunderland, MA).
24. Jeffreys, A.J. et al. (1991) Minisatellite repeat coding as a
digital approach to DNA typing. Nature 354, 204210.
25. Kuhlbrandt, W. (1992) Membrane proteins. Curr. Topics
Struct. Biol. 2, 503-510.
26. Lai, M.M.C. (1992) RNA recombination in animal and plant
viruses. Microbiol. Rev. 56, 61-79.
27. Landy, A. (1989) Dynamic, structural and regulatory aspects
of l site- specific recombination. Annu. Rev. Biochem. 58,
913-949.
232

28. Laskey, R. & Scott, M.P. (Eds) (1993) Gene expression and
differentiation. Curr. Opinion Genet, Dev. 3.
29. Lewin, B. (1997) Genes VI, Chs 1N7 (Oxford University
Press, Oxford).
30. Marsh, D. (1992) Lipids in membrane structure. Curr.Topics
Struct. Biol. 2, 497-502.
31. Matsumoto H. et al. (1989) A human centromere antigen
(CENP B)interacts with a short specific sequence in alphoid
DNA. J. Cell Biol. 109, 19631973.
32. McGhee, J.D. (1983) Higher order structure of chromatin:
orientation of nucleosomes within the 30tnm chromatin
solenoid is independent of species and spacer length. Cell
33, 831841.
33. Moyzis, R.K. et al. (1988). A highly conserved repetitive
DNA sequence (TTAGGG) present on the telomeres of
human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
66226626.
34. Murray, A.W. & Hunt, T. (1993) The Cell Cycle: An
Introduction (W.H. Freeman, New York).
35. Murray, A.W. & Kirschner, M.W. (1989) Dominoes and
clocks: the union of two views of cell cycle regulation.
Science 246, 614-621.
36. Nasmyth, K. (1993) Control of the yeast cell cycle by the
Cdc28 protein kinase. Curr. Opinion Cell Biol. 5, 166-179.
37. Neidhardt, F.C. et al. (Eds) (1987) Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology
(American Society for Microbiology, Washington, DC).
38. Nikaido, H. & Vaara, M. (1987) In Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology,
7-22 (American Society for Microbiology, Washington,
DC).
39. Norbury, C. & Nurse, P. (1992) Animal cell cycles and their
control. Annu. Rev. Biochem. 61, 441-470.
233

40. Oliver, S. et al. (1992) The complete DNA sequence of yeast
chromosome III. Nature 357, 3846.
41. Palecek, E. (1991) Local supercoil-stabilized DNA
structures.Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26, 151-226.
42. Rahmouni, A.R. & Wells, R.D. (1989) Stabilization of Z-
DNA in vivo by localized supercoiling. Science 246, 358-
363.
43. Rich, A. et al. (1984) The chemistry and biology of left-
handed Z-DNA. Annu. Rev. Biochem. 53, 791-846.
44. Richmond, T.J. et al. (1984) Structure of the nucleosome
core particle at 7 resolution. Nature 311, 532537.
45. Roman, L.J. et al. (1991) Rec BCD-dependent joint
molecule formation promoted by Escherichia coli RecA and
SSB proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3367-3371.
46. Saenger, W. (1984) In Principles of Nucleic Acid Structure
(Cantor, C.R., Ed.) (Springer-Verlag, Heidelberg/Berlin).
47. Schultz, M.C. et al. (1992) Variants of the TATA-binding
protein can distinguish subsets of RNA polymerase I, II and
III promoters. Cell 69, 697-702.
48. Schulze, D.H. et al. (1983) Identification of the cloned gene
for the murine transplantation antigen H2Kb by
hybridization with synthetic origonucleotides. Mol. Cell.
Biol. 3, 750-755.
49. Smith, G.R. (1987) Mechanism and control of homologous
recombination in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 21,
179-201.
50. Southern, E. (1975) Detection of specific sequences among
DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol.
Biol. 98, 503-517.
51. Stryer, L. (1988) Biochemistry, 3rd edn (Freeman, San
Francisco).
52. Svaren, J. & Horz, W. (1993) Histones, nucleosomes and
transcription. Curr. Opinion Genet. Dev. 3, 219-225.
234

53. Thomas, P.S. (1980) Hybridization of denatured RNA and
small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205.
54. Voicule N. (1997) Biologia Molecular a celulei. BIC ALL,
Bucureti,
55. Watson, J.D. et al. (1987) The Molecular Biology of the
Gene, 4th edn (Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA).
56. Watson, J.D. et al. (1992) Recombinant DNA, 2nd edn
(Freeman, New York).
57. West, S.C. (1992) Enzymes and molecular mechanisms of
genetic recombination. Annu. Rev. Biochem. 61, 603-640.
58. Zavel, L. & Reinberg, D. (1992) Advances in RNA
polymerase II transcription. Curr. Opinion Cell Biol. 4, 488-
495.
59. . . (1994) .
.