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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO UNIDAD DE NIVELACION CICLO DE NIVELACIN: SEPTIEMBRE 2012 / FEBRERO 2013

INTRODUCCIN A LA INVESTIGACIN CIENTFICA

DATOS INFORMATIVOS - NOMBRES Y APELLIDOS: - DIRECCIN DOMICILIARIA: - TELFONO: - MAIL: Erika Paulina Carrazco Bonilla Barrio La Esperanza Lizardo Garca y Pasaje 3 2370032 CELULAR: 0939734183

erikacarrazco@hotmail.es

ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE LA HERENCIA DEL FUTURO Este artculo muestran los avances de la biologa molecular y las posibilidades que han generado el conocimiento detallado de un gen y el desarrollo de metodologas celulares y moleculares que permiten la modificacin in vivo de la expresin o funcin de un fragmento de DNA en particular. Los enfoques primarios de este artculo son familiarizar a las personas comunes con las tcnicas y limitaciones de la muta gnesis en ratn, y describir nuevas tecnologas que puedan sobrepasar estas limitaciones. La meta es dar la informacin necesaria para evaluar crticamente los estudios en los cuales los ratones mutantes han sido usados para estudiar problemas biolgicos y proponer nuevas metodologas que ayuden al conocimiento de la biomedicina. Son avances de la biologa molecular, en donde, utilizan animales de pruebas, en esencial a los ratones porque se puede manipulas la informacin gentica nueva dentro de la clula. El ratn es un animal manejable, pequeo y bien caracterizado. Estos sirven para realizar modificaciones genticas en animales que podran favorecer a la salud de los seres humanos. Las ventajas del ratn sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la informacin gentica nueva, dentro de la clula y de transmitirla a la lnea germinal, tiene un ciclo reproductivo muy corto y los tamaos de las camadas son muy grandes. Por otro lado, el ratn es un animal pequeo, manejable, bien caracterizado y muy usado en el laboratorio. Todos los organismos cuyo genoma tiene un gen aadido o alterado en sus clulas (incluyendo las clulas germinales), y portan el gen nuevo o alterado, son en el sentido estricto de la palabra, organismos transgnicos. Los ratones son organismos modelo que han contribuido enormemente al conocimiento de la biologa de mamferos y los humanos, posee un ciclo de vida corto, es fcil de manipular y de mantener en los laboratorios. Ratones knock-out que carezcan de protenas especficas pueden servir como modelos de enfermedades humanas.

ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE LA HERRAMIENTA DEL FUTURO En este captulo se muestran los avances de la biologa molecular y las posibilidades que han generado el conocimiento detallado de un gen y el desarrollo de metodologas celulares y moleculares que permiten la modificacin in vivo de la expresin o funcin de un fragmento de DNA en particular. Se describen los mtodos poderosos de transgnesis, para examinar la relevancia fisiolgica de cualquier protena. Se mostrar que los modelos de ratn transgnico y knock-out son particularmente tiles para estudiar problemas biolgicos complejos. Los enfoques primarios de este captulo son familiarizar al no especialista con las tcnicas y limitaciones de la mutagnesis en ratn, y describir nuevas tecnologas que puedan sobrepasar estas limitaciones. Para ilustrar mejor estos puntos se tomarn ejemplos representativos de la literatura, mostrando formas en las cuales los ratones, alterados genticamente, han sido usados para analizar la funcin de los distintos rganos y sistemas que componen a un animal. La meta es dar la informacin necesaria para evaluar crticamente los estudios en los cuales los ratones mutantes han sido usados para estudiar problemas biolgicos y proponer nuevas metodologas que ayuden al conocimiento de la biomedicina. ARTCULO Dentro de los avances ms importantes en la investigacin biomdica, podemos mencionar, sin lugar a dudas, la creacin y el desarrollo de organismos (animales, plantas, parsitos, bacterias y virus), a los que se les han agregado de forma permanente genes funcionales extraos a su genoma. Asimismo, ha sido muy importante el desarrollo de animales que llevan alterados uno o varios genes especficos e incluso animales en los que se ha eliminado o inactivado completamente un gen. Justo hace poco ms de una dcada, gracias a las tcnicas para lograr la transmisin en lneas germinales de material gentico en ratones, cambi drsticamente la forma de hacer investigacin en todas las reas biomdicas. La introduccin de un fragmento lineal de DNA dentro del proncleo de embriones unicelulares (o ms recientemente en clulas stem embrionarias), permite el estudio del patrn de expresin de ese gen y las consecuencias biolgicas de la sobreexpresin de la protena exgena codificada por el transgen en tejidos especficos. La mutagnesis de un gen blanco, por medio de recombinacin homloga en clulas totipotenciales stem embrionarias, ha permitido a los investigadores generar cepas de ratones que carecen de protenas individuales, suministrando modelos especficos de prdida de funcin. Con estas metodologas es posible, en la actualidad, amplificar, modificar o eliminar un gen. Esto nos permite construir, en teora, cualquier animal, de cualquier especie, con cualquier alteracin gentica. Los animales modificados, en particular los ratones, pueden ser usados en todas las reas biomdicas con un gran nmero de aplicaciones y propsitos, que van desde el conocimiento bsico del gen alterado en el contexto total de ese organismo, hasta el desarrollo de nuevas estrategias teraputicas para controlar alguna enfermedad. Estos animales, adems, han ayudado a clarificar los mecanismos de accin y sealizacin que ocurren en los procesos biolgicos y bioqumicos, tanto en el desarrollo embrionario, como en los procesos de malignidad generados en el cncer. Sin lugar a dudas, todas las reas mdicas y biolgicas se han enriquecido con el desarrollo de estas metodologas.

QU ORGANISMOS PUEDEN SER MANIPULADOS GENTICAMENTE? En teora, todos los organismos son susceptibles de ser manipulados genticamente. Existen trabajos en la literatura en los que las tcnicas transgnicas han sido usadas en plantas y en un nmero grande de animales, como son: la oveja, la cabra, el cerdo, el ganado vacuno, el conejo, la rata, el pez, los insectos, algunos parsitos e incluso el hombre. Sin embargo, la especie ms importante ha sido el ratn, ya que fue el primero que se utiliz y en el que se desarrollaron todas las tcnicas que han sido usadas exitosamente para la generacin de animales transgnicos. POR QU EL RATN? Las ventajas del ratn sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la informacin gentica nueva, dentro de la clula y de transmitirla a la lnea germinal, tiene un ciclo reproductivo muy corto y los tamaos de las camadas son muy grandes. Por otro lado, el ratn es un animal pequeo, manejable, bien caracterizado y muy usado en el laboratorio. Es una especie que cuenta con muchas cepas consanguneas diferentes. Adems, el conocimiento de la biologa del ratn es grande. Para el ratn existe un nmero abundante de anticuerpos y sondas de cDNA, se han construido bibliotecas genmicas y de cDNA para cada cepa de ratn. Los ratones son relativamente baratos en comparacin con otros animales experimentales su mantenimiento an en condiciones de alta seguridad es relativamente sencillo. Por otro lado, en la tcnica de clulas stem embrionarias, necesaria para crear ratones knock-out, las nicas clulas disponibles, hasta muy recientemente, han sido las clulas stem embrionarias de ratn. El ratn, tambin, con la tcnica de inyeccin usada en la gran mayora de casos para hacer animales transgnicos, es muy conveniente, debido a la disponibilidad de nmeros relativamente grandes de huevos fertilizados, y tambin a su tamao y resistencia. Es muy importante hacer notar que la conservacin evolutiva nos ha mostrado que tanto los ratones como otros mamferos son embarazosamente similares a los humanos. Por estas razones la dcada de los 1990's ha sido llamada "la dcada del ratn" por el Harvard Health Letter. En el futuro, la expresin transgnica en animales superiores permitir la produccin a gran escala de protenas recombinantes y otros estudios en los que el ratn no ha sido el mejor modelo. Tambin, la reciente posibilidad de mutagnesis dirigida en clulas stem embrionarias de rata, permitir desarrollar y estudiar modelos de enfermedades que requieren tcnicas quirrgicas inaplicables a los ratones. QU ES UN ANIMAL TRANSGNICO? Los animales transgnicos portan un fragmento de DNA exgeno en su genoma. Estos animales se fabrican usando una construccin transgnica (plsmido de DNA con la secuencia del gen que se piensa introducir). Con tcnicas de DNA recombinante y con tcnicas de micromanipulacin o transfeccin, se introducen en la clula blanco para que se inserte este nuevo gen al azar en el genoma celular. Todos los organismos cuyo genoma tiene un gen aadido o alterado en sus clulas (incluyendo las clulas germinales), y portan el gen nuevo o alterado, son en el sentido estricto de la palabra, organismos transgnicos. Es decir, todo gen insertado azarosamente y aadido al repertorio gentico de un organismo, con la consecuente ganancia de funcin otorgada por el transgen, recibe el trmino de animal transgnico. Que es un Animal "Knockout" o "Knock-in"? Una mutacin dirigida (mutacin en un sitio predeterminado) con frecuencia producir una delecin funcional del gen. A esta eliminacin especfica se le ha denominado "gen targeting" y el producto es un animal mutante que carece de la

expresin especfica de ese gen y recibe el nombre de animal "knock-out". Por otro lado, un organismo al que se le ha sustituido un gen normal por otro alterado, con mutaciones especficas, recibe el nombre de "knock-in". QU ES LA CLONACIN EN ANIMALES? Dentro de la manipulacin gentica de los organismos, existe la posibilidad de crear individuos que lleven la misma informacin gentica derivada de una clula diferenciada. Con esto, no es necesario crear a un individuo a partir de las clulas germinales haploides o huevos fertilizados, ni tampoco a travs de la utilizacin de clulas totipotenciales embrionarias. En estos casos, se utiliza el material gentico completo de una clula somtica y se introduce en un huevo no fertilizado. Este huevo es implantado en el tero de una hembra pseudopreada y el resultado es un individuo que cuenta con la misma informacin gentica que el donador. Se le ha denominado clonacin, ya que es posible generar un nmero ilimitado de individuos genticamente iguales, que llevan la misma informacin gentica. CMO SE HACE UN RATN TRANSGNICO? Los mtodos para hacer ratones transgnicos fueron desarrollados al final de los aos setenta y principios de los ochenta. La mayora de los ratones transgnicos fueron fabricados inyectando una construccin de DNA, que llevaba el gen transgnico en huevos fertilizados. Estos huevos se obtienen a travs de las hembras, que fueron inyectadas con hormonas de estro y posteriormente apareadas. Los huevos fertilizados se remueven del oviducto por medio de lavados con solucin salina. Finalmente, para la generacin del transgnico, unos cuantos cientos de copias del DNA que lleva al transgen, son microinyectados en un volumen de 2-5 picolitros, dentro del proncleo masculino, a travs de una pipeta de vidrio ultrafina. De esta forma, 10-20 huevos microinyectados son implantados dentro del oviducto de una madre adoptiva (en estado pseduopreante, despus de que ha sido apareada con un macho estril). Las cras de stos huevos microinyectados nacen 19-21 das despus, completando el ciclo normal de gestacin de un ratn. Aproximadamente entre el 10-40% de las cras tendrn el transgen integrado en su genoma. Los animales transgnicos son identificados por el anlisis de DNA. El DNA genmico del animal transgnico se asla a partir de un pequeo fragmento de la cola del ratn. Los ratones transgnicos pasarn el nuevo gen a sus descendientes, siguiendo las leyes Mendelianas. En cada generacin aparecern nuevos individuos que portarn el transgen, as como las caractersticas fenotpicas que le confiera la expresin del mismo. Estos individuos transgnicos heterozigotos, pueden ser apareados entre s, para generar individuos transgnicos homozigotos (Figura 1). De esta forma, es posible evaluar la dosis gentica del transgen, es decir, analizar de qu manera influye en el fenotipo del ratn, el grado de expresin del transgen. Un ratn desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA transgnico es llamado transgnico fundador, y sus descendientes (si son criados adecuadamente) son miembros de una lnea transgnica genticamente idntica. Los genes inyectados dentro de los huevos fertilizados se integrarn en el cromosoma por la llamada recombinacin homloga. Con la tcnica de inyeccin del zigoto es difcil controlar dnde y cmo se integrar el DNA exgeno dentro del genoma. Los genes no se integran dentro de un gen normal, ni tampoco tienen una localizacin nica. El nmero de copias gnicas por clula, vara de animal fundador a animal fundador. No obstante, un animal fundador y una lnea transgnica derivada de l, son, en principio, exactamente iguales. Por ejemplo, la rata transgnica, usada como un modelo para la enfermedad asociada al

complejo principal de histocompatibilidad HLA-B27, porta aproximadamente 55 copias del gen humano HLA-B27 por clula, y aproximadamente 66 copias del gen humano Beta2-microglobulina. El transgen HLA-B27 parece ser expresado en forma dependiente del nmero de copias, y la enfermedad resulta de la expresin de HLA-B27 sobre un nivel umbral crtico. Las dos principales partes de un gen, son la regin reguladora (promotor) y la regin codificadora de la protena. La expresin del gen es controlada por protenas reguladoras, unidas a sitios o secuencias de DNA especficas, presentes a lo largo de la parte promotora del gen. Esta unin activa la maquinaria de transcripcin y produce el RNA que, despus de ser procesado, saldr al citoplasma para servir como mensajero para la sntesis de una protena. En la construccin de animales transgnicos, se pueden usar promotores generales que permiten una expresin continua y generalizada del transgen, o bien, un promotor tejido-especfico que dar un patrn de expresin ms restringido. Un ejemplo dramtico de la expresin de un gen de rata en un ratn, se observa en una de las primeras lneas de ratones transgnicos producidas. Estos ratones portaban un gen con la regin reguladora de la metalotionena de ratn (expresada en la mayora de tejidos), unida a la regin codificadora del gen de la hormona de crecimiento de rata. Los ratones transgnicos crecieron dos veces ms que sus compaeros de camada, lo que ilustra que la hormona de crecimiento de la rata codificada por el transgen y producida por los ratones transgnicos, tena un efecto aditivo sobre el gen endgeno de la hormona de crecimiento de ratn. PARA QU SIRVE UN RATN TRANSGNICO? Los primeros usos que tuvieron los ratones transgnicos, fueron los estudios de los mecanismos de regulacin de la expresin gentica. Esto ha permitido analizar el cmo y el por qu un gen especfico es activado en algunos tejidos y desactivado en otros. Muchos genes son activos en uno o unos cuantos tejidos del cuerpo y en ciertas etapas del desarrollo. Esto pareciera estar en contra del hecho de que todas las clulas del cuerpo contienen un idntico conjunto de genes. Sin embargo, es esta diversidad de expresin de los genes, la que produce los distintos tipos celulares y tejidos del cuerpo. Esto es lo que hace, por ejemplo, a un linfocito diferente de un granulocito. Para determinar exactamente qu parte de la regin reguladora activa la expresin de un gen dado, en un tejido particular, se pueden disear construcciones con genes que pueden ser rastreados. A estos genes se les ha dado el nombre de "reporteros". Estas construcciones se realizan fusionando la regin reguladora del gen en cuestin, con la regin gen que codifica la protena reportera. Los genes reporteros son, muy frecuentemente, tomados de organismos que tienen muy poca similitud con el animal que ser transfectado. Por lo tanto, es muy probable que este tipo de genes no sea encontrado en el genoma del animal. Con frecuencia ha sido usado el gen de la betagalactosidasa de bacterias. Este gen codifica para una enzima que produce un color azul, cuando es expuesto a una sustancia cromognica llamada X-Gal. El color azul se desarrollar nicamente en el (los) tejido(s) apropiado(s), es decir, en aquellos tejidos de los ratones que recibieron la parte del gen regulador, necesaria para la activacin. Otro de los usos que han tenido los animales transgnicos, son los estudios toxicolgicos. Los ratones son modificados genticamente para incrementar su sensibilidad a alguna enfermedad. Se han producido, por ejemplo, ratones propensos a desarrollar tumores, como el transgnico que expresa al oncogen pim y los ratones deficientes en p53. La deteccin de eventos txicos puede ser mejorada, introduciendo "genes reporteros". Estos genes slo se activarn en presencia de un agente txico. De esta manera ayudarn a la deteccin de sustancias que afecten al organismo. Por ejemplo, para la deteccin de agentes genotxicos, se usan los ratones transgnicos Muta Mouse (lacZ) y

el Big Blue (lacI). Los mecanismos destoxificadores pueden ser alterados para crear animales mejor adaptados a los efectos txicos de algunas sustancias. Por otro lado, los genes humanos que codifican para enzimas o receptores, pueden ser introducidos en un ratn, para "humanizar" una lnea de clulas o tejidos, y, por lo tanto, aumentar la prediccin de los efectos txicos en los humanos. Para los estudios de mecanismos de accin, los genes pueden ser introducidos para promover manifestaciones de toxicidad, como los ratones transgnicos que desarrollan neoplasia, denominados oncoratones. En ocasiones, la observacin de los cambios en el fenotipo, en ratones modificados genticamente, puede llevar al descubrimiento inesperado de genes o mecanismos responsables de una enfermedad, con manifestaciones similares en el hombre. Este fue el caso del gen de la queratina, involucrado en una enfermedad de la piel, denominada epidermolisis bulosa simplex CMO SE HACE UN ANIMAL KNOCK-OUT? Las mutaciones gnicas sitio dirigidas (Knock-out), llegaron a ser posibles al final de los aos ochenta, debido a los avances logrados en las tcnicas de biologa molecular, as como por el mayor conocimiento de la biologa del desarrollo y la reproduccin. Un primer requisito importante para desarrollar esta tcnica, fue la estandarizacin de mtodos para cultivar y crecer clulas stem embrionarias totipotenciales de ratn. Cuando las clulas stem embrionarias son inyectadas en embriones de ratn en un estado suficientemente temprano de desarrollo, stas forman parte del desarrollo de todos los tejidos del ratn, incluso de los tejidos germinales. En la prctica, los embriones son aislados al tercer da de desarrollo, en el estado de blastocisto. Estos se microinyectan con 10 a 12 clulas stem embrionarias modificadas genticamente y posteriormente son implantados en madres pseudopreadas (Figura 2). Un avance clave en sta metodologa fue el desarrollo de tcnicas moleculares para causar mutaciones que bloqueasen la funcin de genes especficos en las clulas stem embrionarias, sin alterar la funcionalidad de stas. En primer lugar, se requiere de la clonacin del gen o de un fragmento del mismo, y su propagacin en una bacteria. Posteriormente, se disean las modificaciones genticas necesarias para inactivar la funcin normal del gen. En esta construccin, se aaden genes que confieren la capacidad de inactivar una droga txica (usualmente el gen de resistencia a neomicina neor), con el fin de seleccionar a aquellas clulas que han captado al transgen. Por otro lado, en la construccin se incorpora tambin otro gen que permite responder a las clulas transfectadas, al efecto txico de otra droga (tpicamente el gen de la timidina kinasa (tk) del virus herpes). El producto de este gen fosforila al ganciclovir, un anlogo de la guanina, y lo introduce a la ruta metablica de la sntesis de DNA. Las clulas que llevan este gen morirn por tener bloqueada la replicacin del DNA. La construccin gentica es introducida a las clulas por medio de electroporacin. El gen normal es reemplazado con el gen modificado, a travs de un proceso llamado recombinacin homloga. Para que este proceso se lleve a cabo, es necesario que el DNA, a ser insertado, contenga secuencias nucleotdicas homlogas al DNA del genoma blanco normal. Las molculas se alinean una con otra en la orientacin correcta. Una vez alineadas, las molculas de DNA son cortadas y unidas en los extremos que corresponden a las zonas de homologa. La secuencia intermedia es reemplazada en el gen endgeno y no sufre ninguna alteracin (Figura 3a y 3b). La maquinaria de la clula que tiene que desarrollar la recombinacin homloga, es impresionante, no slo por su precisin, sino tambin por su capacidad de buscar y encontrar la secuencia del DNA genmico que complementa el DNA recin introducido. Para darnos una idea de esta complejidad, hagamos la siguiente consideracin: si las letras que representan los

nucletidos en el genoma fueran escritas en una pgina con 3000 caracteres, el genoma de un ratn representara una biblioteca con 1000 volmenes de 1000 pginas cada uno. Es por esto, que no nos sorprende encontrar que nicamente en una pequea fraccin de las clulas transfectadas, se lleve a cabo la sustitucin gentica especfica, es decir, el reemplazo del gen blanco por el gen alterado. Por el contrario, lo que se observa con mayor frecuencia es la insercin al azar del transgen, en sitios no homlogos. Tambin se llegan a encontrar integraciones incompletas de fragmentos del transgen. Las clulas stem embrionarias que contienen al gen modificado son seleccionadas, en primer lugar, por su resistencia a una droga txica semejante a la neomicina (seleccin positiva), y, posteriormente, por seleccin negativa para aislar las clulas que carezcan del gen de susceptibilidad (tk) para la segunda droga, el ganciclovir. Se llama seleccin negativa, ya que todas aquellas clulas que expresen este gen morirn en presencia de la droga. El gen tk est colocado en una posicin tal que, en el proceso de la recombinacin, debe ser eliminado. Aproximadamente, una en un milln de clulas transfectadas, tendrn el reemplazo del gen especfico deseado. Las clulas recombinantes son inyectadas en los embriones de ratn. Estos son implantados en hembras pseudopreadas y algunos de los ratones que nacen son quimeras (ratones que tienen clulas genticamente diferentes en un tipo de tejido dado). Estos ratones presentarn dos tipos diferentes de clulas; aquellas que corresponden al genoma del ratn original microinyectado, as como las clulas derivadas de las clulas stem embrionarias manipuladas, que llevan el gen modificado integrado en su genoma. El esperma u vulo presente en los ratones quimricos, si provienen de las clulas microinyectadas en el blastocisto, portar los genes alterados. Cuando estos animales se crucen con animales sanos, heredarn una copia del cromosoma que lleva la mutacin y que proviene de la clula stem embrionaria microinyectada, formando as animales mutados heterozigotos. Es necesario que estos animales heterozigotos se crucen entre s para obtener ratones que tengan dos copias del gen mutado, formando as, animales homozigotos knock-out. Estos animales presentan una ausencia completa del gen normal (Figura 4). PARA QU SIRVE UN ANIMAL KNOCK-OUT? Ratones knock-out que carezcan de protenas especficas pueden servir como modelos de enfermedades humanas. Uno de los primeros genes blanco para generar un animal knock-out, fue el gen que codifica para el canal del cloro responsable de la fibrosis qustica. Estos ratones han sido muy tiles en el estudio de esta enfermedad. Son usados para comprender los mecanismos que llevan a la enfermedad, as como para probar tratamientos con drogas y desarrollar estrategias de terapia gnica. Publicaciones recientes indican que los antecedentes genticos del ratn, que lleva el gen mutado, influye en el fenotipo expresado. Es importante reconocer que un gen no trabaja solo, sino que es una parte de una cadena o sistema en cascada, en la que con frecuencia un evento dispara algunos eventos subsecuentes. Por lo tanto, las alteraciones genticas muy definidas pueden tener algunos efectos pleiotrpicos, los cuales explican la dificultad para interpretar el modelo.

LOS ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE Y EL MEDIO AMBIENTE Hablar del medio ambiente es hablar de toxicologa. Los ratones transgnicos han sido una herramienta importante en el descubrimiento de agentes que daan el medio ambiente. Los animales modificados genticamente han sido usados para estudiar enfermedades inducidas por el medio ambiente. La mayor parte de las alteraciones producidas por el medio ambiente recaen en mutaciones tejido-especficas y finalmente en el desarrollo de cncer. Es bien sabido que determinados factores ambientales, como ciertos agentes qumicos, pueden causar cncer en el hombre. Sin embargo, tambin ha llegado a ser claro por estudios en modelos experimentales, as como del anlisis de resultados derivados de humanos, que hay un fuerte componente gentico de la enfermedad. El componente gentico involucra algunos genes que influyen en la susceptibilidad y la progresin del tumor. El proceso es complejo, ya que involucra un nmero grande de eventos y en ellos estn varios genes involucrados. Esto ha impedido que se conozcan a detalle los mecanismos involucrados en la formacin de un tumor. Como una alternativa, la metodologa de los animales transgnicos ofreci la posibilidad de alterar la expresin y la regulacin de genes especficos contra un fondo gentico constante, abriendo la posibilidad de responder preguntas sobre el cncer en el mbito molecular. Est claro que una simple mutacin gentica, por s sola, no es suficiente para provocar el desarrollo de un tumor, y que se requieren eventos secundarios, tales como la activacin o induccin de genes cooperadores, que tambin juegan un papel esencial en el desarrollo del cncer. Estas preguntas pueden ser contestadas slo en el contexto de los animales transgnicos. ANIMALES TRANSGNICOS Y CNCER Hablando en un sentido amplio, se conocen dos clases de genes que influyen en la formacin de un tumor: los genes supresores de tumor, que actan en forma negativa para controlar el crecimiento celular, y los oncogenes que parecen funcionar en forma positiva. Uno de los genes que mejor ha sido estudiado por tcnicas transgnicas, es el gen supresor de tumores p53, cuyo producto parece estar involucrado en el mantenimiento de la estabilidad genmica. Aparentemente p53 acta como un guardin del genoma e impide que las clulas se dividan, hasta que haya sido reparado cualquier dao del DNA que est presente en el genoma. En una gran variedad de cnceres humanos, las alteraciones genticas ms comnmente detectadas, son mutaciones que inactivan al gen p53 (80% de todos los tumores). Los ratones que portan un transgen mutante, defectuoso de p53, son mucho ms susceptibles a la formacin de tumores, que los animales normales. No obstante, el trabajo con el modelo knock-out de p53 presenta resultados sorprendentes y aparentemente contradictorios. En la primera publicacin sobre ratones knock-out de p53 encontraron que, aunque estos ratones se desarrollaban normalmente, el 75% de ellos presentaron tumores mltiples a la edad de 6 meses. Adems, se han detectado una serie de alteraciones y anormalidades serias en el desarrollo, usando ratones similares a p53 generados de novo. Por otro lado, tambin se han hecho estudios con el uso de ratones portadores de algunos oncogenes que llevan secuencias reguladoras, que les permiten expresarse en tejidos especficos. Estos ratones han mostrado ser un modelo valioso, en el cual se pueden estudiar, tanto los aspectos genticos y epigenticos del desarrollo de neoplasias, como tumores malignos. Los ratones pueden ser tiles, no slo para el estudio del desarrollo de tumores, sino tambin para estudiar el uso de compuestos qumicos y drogas que tengan, ya sea un potencial promotor de tumores (carcinognicos), o bien, todo lo contrario. En los casos en los que

hay problemas con el modelo de tumor, por ejemplo, por una expresin constitutiva del oncogen a niveles relativamente altos, existe la alternativa de generar animales de expresin transgnica inducible. Los animales transgnicos tambin se han utilizado como biosensores de carcingenos potenciales. Por ejemplo, los ratones transgnicos "Big Blue" fueron desarrollados en una colaboracin entre el National Institute of Environmental Health Sciences y la Compaa Stratagene. En estos ratones, todas las clulas contienen al transgen de la beta-galactosidasa, el cual funciona como un gen reportero. Cuando las clulas de estos ratones mutan por exposicin a sustancias qumicas mutagnicas, se activa la expresin del transgen y se produce la enzima betagalactosidasa. Esta estrategia es una forma relativamente rpida y eficiente de seleccionar mutgenos qumicos in vivo. Es evidente que la capacidad para identificar mutgenos con potencial carcinognico, se incrementar con el uso de ratones diseados genticamente. La aplicacin de estos ratones en la investigacin biomdica aumenta cada da, con especial nfasis en el cncer, enfermedades producidas por microorganismos patgenos, enfermedades degenerativas, etctera. El uso de tales ratones transgnicos y knock-out ser valioso por los estudios mecansticos en muchas enfermedades. Por otro lado, la identificacin y clonacin de genes supresores de tumores se ha enfocado principalmente en los sndromes de predisposicin a cncer humano familiar. La manipulacin de las clulas stem embrionarias (ES) ha llevado a la generacin de modelos de ratn mutantes, que se asemejan en mucho a los sndromes humanos. Los ratones que carecen de uno o ambos alelos de genes supresores de tumores, han sido generados para evaluar la funcin normal de estos genes in vivo. Estos ratones han probado ser altamente susceptibles al desarrollo de tumores, indicando que el ratn es un potente sistema de ensayo in vivo para determinar la funcin de genes supresores de tumores. La iniciacin del desarrollo de un tumor gonadal en ratones, que carecen de las copias del gen alfa-inhibina, demuestran que este ensayo tambin es til para identificar nuevos genes supresores de tumor. En el futuro, las estrategias de las clulas stem embrionarias totipotenciales, continuarn usndose para identificar nuevos genes supresores de tumor y analizar sus papeles in vivo en el control del crecimiento. CONCLUSIONES Las tecnologas de los ratones transgnicos, knock-out, knock-in, de expresin inducible o tejido especfico, an se encuentran en las etapas ms iniciales de desarrollo. Estas tcnicas en sus inicios, fueron consideradas consumidoras de tiempo, difciles e ineficientes, pero en la actualidad se han vuelto fciles y muy poderosas. Parece que este campo de la biologa no tiene lmites en sus potencialidades. Cada animal diseado genticamente contiene una riqueza inmensa de nueva informacin y ofrece una mejor comprensin de las interrogantes ms enigmticas que existen en muchas reas de la biologa. Estas poderosas metodologas, se estn desarrollando ahora en otras especies animales, diferentes al ratn y pronto sern de uso ms amplio en el rea de la biomedicina. Ahora el lmite ser nuestra propia imaginacin.

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE LA HERENCIA DEL FUTURO POR QU ESCOG EL TEMA? El tema lo escog, porque es un artculo cientfico interesante; en el que se muestran avances en la ciencia y la tecnologa, para el bienestar de los seres humanos. IMPORTANCIA Son avances de la biologa molecular, en donde, utilizan animales de pruebas, en esencial a los ratones porque se puede manipulas la informacin gentica nueva dentro de la clula. El ratn es un animal manejable, pequeo, bien caracterizado y usado en los laboratorios. Estos sirven para realizar modificaciones genticas en animales que podran favorecer a la salud de los seres humanos. RESUMEN En este artculo se muestran los avances de la biologa molecular y las posibilidades que han generado el conocimiento detallado de un gen y el desarrollo de metodologas celulares y moleculares que permiten la modificacin en vivo de la expresin o funcin de un fragmento de DNA en particular. Se ha realizado pruebas en diferentes animales. Los ms utilizados son los ratones, las ventajas de los ratones sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la informacin gentica nueva, dentro de la clula y de transmitirla a la lnea gentica, tiene un siclo de vida muy corto y las camadas son muy grandes. Por lo tanto, el ratn es un animal pequeo, manejable, bien caracterizado y muy usado en los laboratorios. Los ratones transgnicos han sido una herramienta importante en el descubrimiento de agentes que daan el medio ambiente. Sirven de modelos para la prevencin de tumores. VOCABULARIO Transgnesis = Se conoce como transgnesis al proceso de transferir genes en un organismo. La transgnesis se usa actualmente para hacer plantas y animales transgnicos. Transgnico= Un organismo modificado genticamente, es aquel cuyo material gentico es manipulado en laboratorios donde ha sido diseado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna caracterstica especfica. Sobreexpresin= accin y efecto de sobre expresarse

Exgena= De origen externo, Dicho de un rgano: Que se forma en el exterior de otro, como las esporas de ciertos hongos. Transgen= "Paquete" de material gentico (ADN) que se inserta en el genoma de una clula mediante tcnicas de empalme de genes, incluida la transferencia de genes de especies distintas en el genoma de un organismo husped. Homloga= Que presenta la misma forma o comportamiento, [rgano o parte del cuerpo] semejante por su origen en el embrin, por sus relaciones con otros rganos y por su posicin en el cuerpo, aunque su aspecto y funcin puedan ser diferentes. Totipotencial= Totipotencial es utilizado en biologa para referirse a clulas que poseen la capacidad de dar origen a otros tipos celulares, incluso pudiendo una sola de estas clulas dar origen a millones de clulas, tejidos, rganos, hasta incluso embriones. Diferenciacin en cualquier tipo de clula. Consanguneas= unin, parentesco por descendencia de una misma raz o mismos genes. Mutagnesis= Mutaciones, mudar, transformar, transformacin de clulas embrionarias. Germinal= Relativo al germen (clula o parte de la semilla): brote germinal. Relativo al germen (origen o principio de una cosa): estado germinal, Concerniente al germen. Somtica= (somtico) Propio de o relativo al cuerpo de un ser vivo; Dicho de un sntoma o afeccin, que tiene su causa en condiciones fsicas y no psquicas Haploide= Dicho de un organismo, de un tejido, de una clula o de un ncleo: Que posee un nico juego de cromosomas. Somtica= Se dice del sntoma cuya naturaleza es eminentemente corprea o material, para diferenciarlo del sntoma psquico. Proncleo= ventaja del ncleo Mendelianas= Doctrina derivada de los experimentos de Mendel, botnico austriaco del siglo XIX, acerca de la herencia de los caracteres. Fenotpicas= Manifestacin visible del genotipo en un determinado ambiente. Homozigotos= Se dice de las clulas u organismos que poseen alelos idnticos de un gen en relacin con un determinado carcter. Codificar= Hacer o formar un cuerpo de leyes metdico y sistemtico. Transformar mediante las reglas de un cdigo la formulacin de un mensaje. Enzima= Protena que cataliza especficamente cada una de las reacciones bioqumicas del metabolismo.

ARTCULOS RELACIONADOS ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE INTRODUCCIN Los ratones desde hace ms de 100 aos son organismos modelo que han contribuido enormemente al conocimiento de la biologa de mamferos incluyendo al hombre. Este organismo presenta una similitud fisiolgica con el humano, posee un ciclo de vida corto, es fcil de manipular y de mantener en los laboratorios. Es por ello que diferentes cepas de ratones han sido herramientas importantes para descifrar los mecanismos biolgicos como los de la respuesta inmune y de enfermedades como el cncer. Sin embargo, con el desarrollo de herramientas moleculares ha sido posible manipular su ADN para generar ratones transgnicos y ratones knock-out. Un ratn transgnico es un organismo genticamente modificado el cual porta un gen nuevo. De esta manera insertando un gen de otro organismo podemos obtener ratones que produzcan protenas que antes no producan o bien que las produzcan en mayor cantidad. Por otro lado, un ratn knock-out carece de la expresin de un gen en particular y de esta manera eliminando un gen podemos averiguar qu funcin desempeaba la protena que codificaba. La obtencin de ratones transgnicos y ratones knock-out facilita el estudio de la funcin bsica de un gen y su regulacin ya que su efecto se puede analizar en el contexto de todo un organismo lo cual permite generar diferentes modelos de enfermedades humanas. Los ratones modificados genticamente (RMGs) son herramientas clave para el estudio de la funcin gnica y de las bases genticas de las enfermedades, as como para la generacin de modelos animales de mltiples patologas. A continuacin se resumen los diferentes tipos de ratones modificados genticamente que se pueden obtener mediante transgnesis y sus aplicaciones. En el ratn podemos diferenciar claramente dos tipos de modelos transgnicos: los ratones transgnicos convencionales y los modelos de "gene targeting" o de muta gnesis dirigida del genoma.

Ratones transgnicos Descripcin.- Son RMGs portadores de un transgn (material gentico externo) integrado al azar en su genoma. Son generalmente modelos de ganancia de funcin: conducen a la expresin de un nuevo gen o al sobre-expresin de un gen ya existente. En este tipo de modelos se puede controlar con total precisin la estructura del "transgn" pero no la posicin del genoma en ste que se integra. Generalmente se utilizan construcciones transgnicas compuestas por un promotor eucaritico y la secuencia codificante del gen de inters para expresar dicho gen, o sobre expresarlo, en todas las clulas del ratn (expresin ubicua) o en un tejido concreto (expresin tejidoespecfica) (Figura 1). Transgenes de mayor tamao clonados en cromosomas artificiales de bacteria (BACs) o de levadura (YACs) normalmente incluyen todas las secuencias reguladoras de la expresin del gen de inters y en general son menos sensibles a efectos posicionales reproduciendo ms fielmente el patrn de expresin deseado. Los sistemas de expresin condicional permiten, adems, controlar la expresin del transgn en el tiempo. El sistema ms utilizado en el ratn es el regulado por tetraciclina que tiene dos modalidades: tet-ON (la expresin del transgn slo ocurre cuando se administra doxiciclina al ratn en el agua de bebida) o tet-OFF (la doxiciclina impide la expresin del transgn). Tecnologa.- La tcnica ms utilizada para la generacin de ratones transgnicos es la microinyeccin del ADN transgnico directamente en uno de los dos proncleos del embrin de una clula (cigoto). Normalmente el ADN se integra en el genoma del 530% de los cigotos inyectados. Aplicaciones.- Los modelos transgnicos han sido ampliamente utilizados para la identificacin y el estudio de secuencias reguladoras de la expresin gnica en construcciones transgnicas en que estas secuencias se fusionan a una molcula fcil de detectar (lacZ o EGFP) dirigiendo su expresin. La sobre-expresin de un gen o la expresin de mutaciones dominantes mediante transgnesis es tambin una herramienta muy til para el estudio de la funcin gnica en el contexto del animal completo y para la generacin de modelos de enfermedades genticas causadas por dichas mutaciones.

Muta gnesis dirigida del genoma (gene targeting) Descripcin.- Estos modelos se diferencian de los anteriores en que la integracin del ADN que se introduce en el genoma se dirige a una posicin concreta del mismo, con el objetivo de generar una mutacin intencionada y previamente diseada en dicha posicin. En general se puede hablar de dos tipos de modelos generados mediante gene targeting: Ratones knock-out: Son ratones en los que se inactiva un gen determinado en el genoma, generalmente por delecin de toda o parte de su secuencia codificante. Tambin se puede interrumpir la secuencia codificante por la integracin de otro gen. Ratones knockin: Son ratones en los que se introducen mutaciones dirigidas en la secuencia de un determinado gen; por ejemplo la modificacin de un codn concreto en la secuencia codificante para generar un cambio de aminocido en la protena correspondiente o la sustitucin de la secuencia codificante de un gen, o de uno de sus dominios, por la de otro. Tecnologa.- Se basa en la utilizacin de las clulas madre embrionarias (clulas ES) como vehculo para introducir modificaciones genticas en la lnea germinal del ratn

(Figura 1). A diferencia de los modelos transgnicos, el ADN exgeno o "vector de targeting" se introduce en las clulas ES, no en el cigoto. El vector contiene dos fragmentos de ADN genmico llamados brazos de homologa (5y 3respectivamente) que pertenecen al gen que interesa modificar y que dirigen la integracin de dicho vector en el gen de inters mediante recombinacin homloga. Las clulas ES, una vez modificadas por recombinacin homloga se incorporan a un embrin husped donde compiten con las clulas ES del propio embrin para generar todos los linajes celulares embrionarios, incluida la lnea germinal. Los animales que nacen se denominan quimeras porque derivan del embrin husped y de las clulas ES introducidas (ver Figura). La recombinacin homloga permite tambin dirigir la integracin de sitios de reconocimiento de enzimas llamadas recombinases (Cre y Flp) a cualquier posicin en el genoma del ratn. Estas enzimas catalizan la recombinacin entre dos de sus sitios diana (loxP y frt respectivamente). La combinacin de tcnicas de recombinacin homloga y de los sistemas Cre/loxP y Flp/frt permiten introducir cualquier tipo de mutacin en el genoma y adems controlar el momento y el lugar dnde sta se expresa (modelos knockout y knockin condicionales y tejido especficos). Aplicaciones.- Un ratn knockout es el mejor modelo para estudiar la funcin de un gen en el contexto fisiolgico, analizando el fenotipo que resulta de la prdida de su funcin. Los modelos knockin se utilizan sobre todo para reproducir en el ratn alteraciones genticas tales como mutaciones puntuales o pequeas deleciones o inserciones que se encuentran en patologas humanas o que son relevantes para el estudio de la funcin gnica. Por ejemplo, mutaciones oncognicas identificadas en tumores humanos. La posibilidad de generar ratones knockout o knockin condicionales permite controlar el tipo celular y el momento del desarrollo en que se expresan estas mutaciones. Todos estos modelos son de gran utilidad en el desarrollo de nuevas y mejores terapias. RESUMEN Los ratones desde hace ms de 100 aos son organismos modelo que han contribuido enormemente al conocimiento de la biologa de mamferos incluyendo al hombre. Este organismo presenta una similitud fisiolgica con el humano, posee un ciclo de vida corto, es fcil de manipular y de mantener en los laboratorios. Los ratones modificados genticamente (RMGs) son herramientas clave para el estudio de la funcin gnica y de las bases genticas de las enfermedades, as como para la generacin de modelos animales de mltiples patologas. En el ratn podemos diferenciar claramente dos tipos de modelos transgnicos: los ratones transgnicos convencionales y los modelos de "gene targeting" o de muta gnesis dirigida del genoma. Ratones transgnicos En este tipo de modelos se puede controlar con total precisin la estructura del "transgn" pero no la posicin del genoma en ste que se integra.

Normalmente el ADN se integra en el genoma del 5-30% de los cigotos inyectados. Los modelos transgnicos han sido ampliamente utilizados para la identificacin y el estudio de secuencias reguladoras de la expresin gnica en construcciones transgnicas en que estas secuencias se fusionan a una molcula fcil de detectar (lacZ o EGFP) dirigiendo su expresin. Muta gnesis dirigida del genoma Ratones knock-out: Son ratones en los que se inactiva un gen determinado en el genoma, generalmente por seleccin de toda o parte de su secuencia codificante. Tambin se puede interrumpir la secuencia codificante por la integracin de otro gen. Ratones knockin: Son ratones en los que se introducen mutaciones dirigidas en la secuencia de un determinado gen; por ejemplo la modificacin de un codn concreto en la secuencia codificante para generar un cambio de aminocido en la protena correspondiente o la sustitucin de la secuencia codificante de un gen, o de uno de sus dominios, por la de otro. Se basa en la utilizacin de las clulas madre embrionarias (clulas ES) como vehculo para introducir modificaciones genticas en la lnea germinal del ratn

RESUMEN GENERAL En este captulo se muestran los avances de la biologa molecular y las posibilidades que han generado el conocimiento detallado de un gen y el desarrollo de metodologas celulares y moleculares que permiten la modificacin in vivo de la expresin o funcin de un fragmento de DNA en particular. Los enfoques primarios de este captulo son familiarizar al no especialista con las tcnicas y limitaciones de la muta gnesis en ratn, y describir nuevas tecnologas que puedan sobrepasar estas limitaciones. Los ratones desde hace ms de 100 aos son organismos modelo que han contribuido enormemente al conocimiento de la biologa de mamferos incluyendo al hombre. Este organismo presenta una similitud fisiolgica con el humano, posee un ciclo de vida corto, es fcil de manipular y de mantener en los laboratorios. La meta es dar la informacin necesaria para evaluar crticamente los estudios en los cuales los ratones mutantes han sido usados para estudiar problemas biolgicos y proponer nuevas metodologas que ayuden al conocimiento de la biomedicina. Las ventajas del ratn sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la informacin gentica nueva, dentro de la clula y de transmitirla a la lnea germinal, tiene un ciclo reproductivo muy corto y los tamaos de las camadas son muy grandes. Por otro lado, el ratn es un animal pequeo, manejable, bien caracterizado y muy usado en el laboratorio. Todos los organismos cuyo genoma tiene un gen aadido o alterado en sus clulas (incluyendo las clulas germinales), y portan el gen nuevo o alterado, son en el sentido estricto de la palabra, organismos transgnicos. Ratones knock-out que carezcan de protenas especficas pueden servir como modelos de enfermedades humanas.

Este artculo cientfico fue escogido con el fin de informarse de las nuevas metodologas de mejoramiento gentico en animales, centralizado especficamente en los ratones ya que son animales pequeos, manejables y son similares a la gentica de los humanos. Para conocer que los animales alterados genticamente son importantes para la biomedicina, ya que contribuyen al mejoramiento de la salud de los seres humanos.

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