28-03-2011

2. Biomolculas composio qumica, estructura e reactividade

AULA 5 BIOQUMICA

PR OTE NA S
MTODOS DE SEPARAO, PURIFICAO, QUANTIFICAO E CARACTERIZAO DE PROTENAS.

Mtodos de separao e purificao de protenas

Tcnica Electroforese em gel SDS Page Electroforese em gel 2 dimenses

Separao por Carga / Peso molecular Ponto isolctrico/ Peso molecular

Aplicao Escala analtica Escala analtica

Cromatografia por filtrao em gel Cromatografia de permuta inica Cromatografia de afinidade Cromatografia de HPLC

Peso molecular Carga Afinidade por um ligando especfico Diversos

Escala preparativa Escala preparativa Escala preparativa Escala analtica

Dilise Efeito salino

Peso molecular Solubilidade

Escala preparativa Escala preparativa

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Mtodo de separao: Electroforese

o Movimento de uma partcula carregada num campo elctrico o Velocidade de migrao (V) depende da carga total do io (z), do campo elctrico aplicado (E) e do coeficiente de frico (f) V = Ez/f o Movimento das partculas ocorre num meio lquido, que suportado e estabilizado por uma substncia slida (p.e., papel ou gel) . O gel um suporte mais robusto, e para protenas usado o gel de poliacrilamida . PAGE poliacrilamida gel electroforesis A quantidade de acrilamida e proporo acrilamida/bis acrilamida definem a malha do gel

Mtodo de separao: Electroforese SDS-PAGE

Na presena de SDS que um detergente aninico, capaz de ligar fortemente protenas, desnaturando-as
As amostras so fervidas na presena de DTT ou mercaptoetanol para reduzir as pontes S-S A migrao d-se em funo do peso molecular

As amostras de protenas so carregadas em poos na extremidade superior do gel de acrilamida. As protenas movem-se dentro da malha do gel quando a corrente elctrica aplicada.

As protenas so visualizadas por tratamento com corantes (ex. azul de Coomassie, nitrato de prata) que se liga s protenas mas no ao gel. Cada banda representa uma protena diferente; possvel determinar a massa molecular da protena por comparao com a migrao de protenas de pesoconhecido (log MW!!!)

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Extractos brutos de E. coli a sobrexpressar uma protena, resolvidos por SDS-PAGE

Fraces da protena aps purificao, resolvidos por SDS-PAGE

Mtodo de separao: Electroforese de focagem isoelectrica (IEF)

Focagem isoelctrica.
Separao de protenas de acordo com o ponto isoelctrico. Um gradiente de pH estvel estabelecido no gel usando os amflitos apropriados. A mistura proteca colocada no gel e um campo electrico aplicado. As protenas migram at atingirem o pH equivalente ao seu pI.

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Mtodo de separao: Electroforese em gel 2D

1. As protenas so primeiro separadas por focagem isoelctrica numa tira de gel. 2. O gel depois colocado no topo de um gel SDS PAGE. A separao horizontal reflecte os diferentes PI e a separao vertical reflecte os diferentes pesos moleculares

Cada spot uma protena

Resultado de extracto celular total de E. coli resolvido por electroforese 2D.

Separao de protenas por cromatografia

Caractersticas comuns a todos os tipos de cromatografia:
- Coluna, suporte slido usualmente de vidro. -Enchimento da coluna com um material slido especifico, chamado matrix ou resina fase estacionria. -Soluo tampo que flui constantemente atravs da resina chamado eluente fase mvel.
A soluo que sai da coluna o eludo. A amostra com a mistura de protenas a separar Aplicada no topo da coluna e gradualmente empurrada pelo eluente atravs da matriz. medida que as diferentes protenas migram atravs da coluna, so retardadas diferencialmente devido s interaces com o material da matrix. No exemplo, as protenas A, B, e C, so gradualmente separadas umas das outras, formando bandas distintas. O grau de separao aumenta (maior resoluo) com o comprimento da coluna. No entanto, cada banda especfica alarga com o tempo por difuso, dimuindo assim a resoluo. A protena A ficou bem separada da B e da C, mas a difuso impede a separao das B e C.

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Cromatografia de permuta/troca inica

As diferenas de sinal e magnitude de carga so exploradas nesta tcnica. A resina contem grupos carregados; A. Troca catinica - com grupos aninicos so chamados permutadores catinicos p.e., SP ou CM A. Troca aninica com grupos catinicos so chamados permutadores aninicos. p.e., Q ou DEAE B A

Cromatografia de permuta/troca inica

As diferenas de sinal e magnitude de carga so exploradas nesta tcnica. A afinidade de cada protena para os grupos carregados da coluna afectada pelo pH (que determina o estado de ionizao da molcula) e pela concentrao dos ies livres salinos da soluo, que competem pela ligao matrix. A separao pode ser optimizada por: alterao gradual do pH e/ou da concentrao salina da fase mvel, de forma a criar um gradiente de pH ou um gradiente salino.

Na imagem est descrita uma cromatografia com permutador catinico.

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Cromatografia de excluso molecular (filtrao em gel)

Separao de protenas de acordo com o tamanho.
A matrix da coluna (fase estacionria) um polmero reticulado com poros de tamanho especfico. As protenas maiores migram mais depressa pois so demasiado grandes para entrar nos poros da matrix e portanto so menos retidas dentro da coluna. As protenas menores migram mais devagar pois entram nos poros da matrix e so retidas fazendo um percurso mais longo.

Permite determinar o peso molecular de uma protena Permite analisar os estados oligomricos de uma protena (monmero, dmero, trmero, etc) Com uma resina de poro muito pequeno, pode ser feita troca de tampo ou desalting de solues de protenas.

Cromatografia de afinidade
Separao das protenas atravs da sua especificidade de ligao. As protenas retidas pela matrix so as que se ligam especificamente ao ligando associado malha da matrix. As protenas que no se ligam ao ligando so eludas da coluna pelo tampo e as protenas que ficam associadas so posteriormente eludas usando uma soluo de ligando livre.

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Separao por dilise

Separao de molculas por tamanho atravs de difuso selectiva usando uma membrana semi-permevel (o tamanho do poro da membrana de dilise definido). Normalmente, a amostra com a protena de interesse contm compostos de baixo peso molecular como sais, redutores (DTT) ou preservantes (azida de sdio) usados nos passos anteriores de purificao.

A amostra a dializar colocada dentro de uma membrana de dilise. A membrana imersa em tampo de dilise que cria um diferencial de concentrao atravs da membrana. As molculas vo ter tendncia a difundir am ambas as direces atravs da membrana at atingirem o equilibrio (concentrao idntica em ambos os lados). O processo de dilise pode ser optimizado substituindo o tampo por tampo fresco aps algum tempo, criando-se novo ponto de equilbrio.

MTODOS DE IDENTIFICAO E ANLISE DE PROTENAS

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Mtodos de quantificao de protenas

Espectroscopia Doseamento por

mtodos colorimtricos

Biureto Lowry BCA

Mtodos de quantificao de protenas por espectroscopia

Absorvncia de protenas a 280 nm

Absorvncia dos aminocidos aromticos

Tirosina

Triptofano

Abs

c
Abs280 280

l - Percurso ptico (cm)

protena ( M )

Absorvncia a 280 nm vai depender do n de cada um destes aminocidos

280nm (M-1cm-1) = (#Trp)(5500)+ (#Tyr)(1490)+(#Cys)(125)

O mtodo fivel para protenas puras desde que no haja outras contribuies

espectrais a este cdo, ex, a presena de grupos de Fe no hmicos

Para misturas de protenas, no possvel calcular um , pelo que no bom. Pode ser usado para concentraes de protena de 20 a 3000 ug/ml

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Mtodos colorimtricos de quantificao de protenas mtodo do biureto

Este mtodo baseia-se na

quelatao pela cadeia polipetdica do io Cu2+ num meio fortemente alcalino adequado quantificao total de protenas vrias. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de qualquer protena
A sensibilidade baixa (mg) Medem-se as ligaes peptdicas

(Abs a 550 nm)

Mtodos colorimtricos de quantificao de protenas mtodo do lowry

Este mtodo colorimtrico baseia-se na reduo do io Cu2+ a Cu+ em

soluo alcalina, quando reage com a protena. O io Cu+ e o grupo fenol da tyr, indolo do Trp e SH da Cys ento reagem com o reagente FolinCiocolteau, produzindo um producto instvel tipo azul-molibdenio
adequado quantificao total de protenas vrias Mas depende para cada protena, do nmero de resduos Trp, Tyr e Cys. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de protena A sensibilidade grande (~microgramas) Varivel entre protenas Mede-se a A 650 nm.

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Mtodos colorimtricos de quantificao de protenas mtodo do BCA

BCA biscinchonic acid, um mtodo colorimtrico que se baseia na

reduo alcalina do io Cu2+ a Cu+ pelos resduos aromticos da protena, seguido da sua quelatao e desenvolvimento de cor pelo reagente BCA
adequado quantificao total de protenas vrias Depende da presena de resduos aromticos. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de protena A sensibilidade grande (~microgramas) Varivel entre protenas Mede-se a A 562 nm.

Mtodos colorimtricos de quantificao de protenas mtodo de Bradford

Baseia-se na ligao do Coomassie (Brilliant Blue G250) proteina .

Liga-se aos resduos de aminocidos aromticos da protena, e lisina, arginina e histidina.

adequado quantificao total de protenas vrias Depende da presena de outros aminocidos para alm dos aromticos. necessrio fazer uma curva de calibrao

com soluo padro de protena

mais fcil de usar que os outros, mas mais

sensvel a outras substncias, pex detergentes.

Varivel entre protenas Mede-se a A 595 nm.

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Sequenciao de um polipptido
6M HCl Free amino acids HPLC ou troca ionica Composio dos aminocidos Determinao do tipo e da quantidade relativa dos amino cidos

Identificao do residuo amino-terminal

Identificao do residuo aminoterminal; purificar e reciclar o polipeptido resultante atravs do processo de degradao de Edman

Mtodo est automatizado podendo ser feita a sequenciao at 50 aminocidos do N-terminal

Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados

2- quebra de pontes persulfureto

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Quebra das ligaes persulfureto

Reduo pelo ditiotreitol (DTT) leva formao de dois residuos de cistena. Para prevenir a formao de nova ligao de dissulfureto, o grupo reactivo OSH tem de sofrer nova modificao, como acetilao pelo iodoace

Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados

2- quebra de pontes persulfureto 3- Fragmentao com diversos tipos de mtodos e sequenciao pelo mtodo Edman dos fragmentos pptidicos

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Alguns mtodos especficos de fragmentao de polipeptdeos

Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados

2- quebra de pontes persulfureto 3- Fragmentao com diversos tipos de mtodos e sequenciao pelo mtodo Edman dos fragmentos pptidicos 4- conjugao de toda a informao para obter a sequencia da protena Espectrometria de massa base de dados de pptidos

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Interaces anticorpo antignio Elevada especificidade

A reaco especfica anticorpo/antignio a base de vrias tcnicas de identificao e quantificao de protenas.

Mtodos de identificao que se baseiam nas interaces anticorpo-antignio

ELISA. Usado para testar e quantificar a presena de uma dada protena em amostras complexas. Ex. Teste para a presena de anticorpos contra virus herpes simplex (HSV) em amostras de sangue. Os poos contm antignio de HSV ao qual os anticorpos do sangue se ligam ou no. O anticorpo secundrio, IgG anti-humano ligado enzima horseradish peroxidase, vai ser responsvel pela cor amarela.

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Mtodos de identificao que se baseiam nas interaces anticorpo-antignio

Imunoblot ou western blot Poos 1 a 3: amostras dos passos de purificao successivos de uma dada protena, separadas em gel SDS Page. Poos 4 a 6. mesmas amostras, aps terem sido transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana depois hibridada com anticorpo especfico contra a protena previamente purificada.

Mtodos de identificao que se baseiam nas interaces anticorpo-antignio

imunocitoqumica. Anticorpos especficos e marcados com corantes so introduzidos nas clulas para identificar a localizao celular de protenas. Ex. Anticorpos fluorescentes foram usados para localizar microtbulos em clulas de Drosophila (DNA em azul).

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ASPECTOS RELEVANTES NA PURIFICAO DE UMA PROTENA

Esquema de uma purificao

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Condies que devem ser controladas na manipulao de protenas

Factor
pH Fora inica Temperatura Ies metlicos Proteco contra oxidao Degradao de protenas Solubilidade das protenas
Trabalhar em meio tamponado Controlar a fora inica, deve ser mantida a nveis

perto do fisiolgico (mnimo 50 mM NaCl)

Trabalhar a temperaturas baixas (4C- gelo) Usar agentes quelantes 0,1 -1 mM EDTA, para

inactivar metaloproteases... Ateno a protenas que necessitem de metal. No usar nesse caso. Usar agentes protectores de grupos sulfidrilo, 1mM DTT ou 5-20 mM b-mercaptoetanol.
Usar inibidores de protease Usar glicerol, ou detergentes para estabilizar

protenas insoluveis ou membranares

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Avaliar a pureza de uma protena (Actividade enzimtica)

Actividade enzimtica

Ovo (albumina, lysozyma, gema) Clara do ovo (albumina, lysozyme) Lisozima pura

Unidade: quantidade do enzima que transforma 1umol de substrato por minuto a 25 C Actividade especfica Unidades de enzima por mg de protena total

Avaliar a pureza de uma protena (gel SDS-PAGE)

Extractos brutos de E. coli a sobrexpressar uma protena, resolvidos por SDS-PAGE

Fraces da protena aps purificao, resolvidos por SDS-PAGE

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Questes
1. Um estudante desenvolveu vrios passos para purificar a ribonuclease, uma protena que possui massa molecular aproximadamente de 13 000 Da. Quando analisou uma fraco precipitada com sulfato de amnio por electroforese em gis de poliacrilamida contendo SDS, observou a presena de dois polipptidos contaminantes. O polipptido A com massa molecular de 14 000 e o polipptido B com massa molecular 75 000. A anlise dos polipptidos por focagem isoelctrica revelou que o polipptido A possui um ponto isoelctrico 4 unidades mais acdico do que o da ribonuclease, enquanto que o polipptido B possui um pI idntico ao da protena que se pretende purificar. Que tcnicas sugeriria ao seu colega para a separao eficiente da ribonuclease das protenas contaminantes? Fundamente a sua resposta com base nos princpios das tcnicas que escolheu.

Questes
2. Um estudante pretende repetir a experincia de um colega em que se tinha separado a urease (pI = 5,0) da mioglobina (pI = 7,0) por cromatografia de troca inica, cujo cromatograma se encontra na figura.

No entanto, as condies de pH do tampo no se encontram especificadas e o aluno encontra-se indeciso quanto ao pH a utilizar. Que tampo utilizaria, a pH 3, pH 6 ou pH 9? Explique porqu.

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Questes
3. A massa molecular duma protena desconhecida foi analisada por cromatografia de excluso numa coluna de Sephacryl S-300. Como padres utilizaram-se as seguintes protenas: albumina de soro bovino (66 000), aldolase (158 000), catalase (210 000), ferritina (440 000) e tiroglobulina (670 000). Os volumes de eluio (em ml) obtidos foram: 13,6 16,2 18,4 20,0 22,5 a) Faa a correspondncia entre os volumes de eluio e os padres que lhes correspondem. b) O volume de eluio da protena Desconhecida de 19,0 ml. Calcule a massa molecular relativa desta protena

Questes
Aps purificao parcial de uma protena, encontraram-se na amostra analisada por electroforese bidimensional quatro spots com as seguintes caractersticas
Polipeptido A B C D Massa molecular 15 kDa 15 kDa 53 kDa 22 kDa pI 4 8 6,6 6,6

Faa um esquema com o arranjo relativo que estaria espera de encontrar no gel bidimensional.

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Questes
5. Um grupo de investigao em fisiologia vegetal descobriu uma nova protena que expressa nos cotildones do termoceiro. Isolaram a protena e produziram anticorpos policlonais especficos contra essa protena em coelho. Um dos problemas cientficos que um novo estagirio tem para resolver descobrir se esta protena tambm expressa nos cotildones de outras espcies vegetais. Qual o mtodo que melhor se adequaria a fazer tal estudo?

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