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2. Biomolculas composio qumica, estructura e reactividade

AULA 8 BIOQUMICA

C I DOS NUC L EI C OS ( A DN E A R N)
TCNICAS DE GENTICA MOLECULAR OU BIOLOGIA MOLECULAR MANIPULAO DE DNA RECOMBINANTE

Separao de fragmentos de DNA por gel de agarose

Aplicao de amostras de DNA nos poos

Os gis de agarose tm um poro maior que os de acrilamida, e so apropriados para separar fragmentos de DNA desde os ~100 bp a >10 kb. A densidade da agarose determina o tamanho do poro e o intervalo ptimo de separao. 2 % agarose - <1 kb 1 % ou 0.8% - 1-10 kb A separao feita em funo do tamanho do DNA, pois todo ele tem igual carga (mesmo n

Aplicar voltagem para induzir migrao

de grupos fosfato por nucletido ou bp)

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Separao de fragmentos de DNA por gel de agarose

Aps a corrida, podem-se visualizar os fragmentos de DNA usando sondas ou qumicos que intercalam no DNA, p. Ex. Brometo de etdio, e que fluorescem com luz UV.

Luz UV

A migrao depende da voltagem e tempo de corrida, e do tamanho do DNA (log bp proporcional ao cm) Usam-se muitos marcadores chamados ladders escadas que tm tamanhos prdefinidos para determinar o tamanho dos produtos de DNA

fotografia

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Nas tcnicas de Gentica/Biologia Molecular usam-se muitos dos enzimas envolvidos no metabolismo do DNA

DNA polimerases que sintetizam uma nova cadeia de DNA, alinhando d-nucleotidos com de acordo com a sequncia complementar da cadeia molde pr-existente Endonucleases que hidrolisam ligaes fosfodister entre nucletidos no meio do DNA (enzimas de restrio) Ligases que reestabelecem ligaes fosfodister entre nt adjacentes

Caractersticas da DNA polimerase que permitem us-la para amplificar especificamente fragmentos de DNA
As DNA polimerases tm 3 caractersticas fundamentais: 1. No efectuam a separao das duas cadeias da dupla hlice de DNA 2. No iniciam a nova cadeia, apenas estendem uma nova cadeia a partir de um fragmento pr-existente (primer de DNA ou RNA) 3. Catalisam a adio de nucletidos extremidade 3OH livre da nova cadeia em crescimento

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A dupla cadeia pode ser aberta por aco de calor, um processo chamado desnaturao

Temperatura

Tm a temperatura de melting, o ponto em que 50% das cadeias esto desnaturadas. O Tm varia com o tamanho e com a % de resduos G/C

Caractersticas da DNA polimerase que permitem us-la para amplificar especificamente fragmentos de DNA
As DNA polimerases tm 3 caractersticas fundamentais: 1. No efectuam a separao das duas cadeias da dupla hlice de DNA 2. No iniciam a nova cadeia, apenas estendem uma nova cadeia a partir de um fragmento pr-existente (primer de DNA ou RNA) 3. Catalisam a adio de nucletidos extremidade 3OH livre da nova cadeia em crescimento

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Copiar um gene especfico usando a DNA polimerase e usando primers especficos escolhidos
Pode-se escolher a regio de DNA a copiar usando primers ou oligonucleotidos, pequenos segmentos de DNA de cadeia simples que emparelham no incio e no fim do gene alvo.

Upper primer

lower primer Os primers so molculas de DNA de cadeia simples sintticos.

A reaco de PCR, polimerase chain reaction para amplificar muitas cpias do DNA desejado
3 passos : desnaturao, emparelhamento e extenso

1 ciclo duas mlculas + 2 ciclo quatro molculas + 6 ciclos 26 A DNA polimerase usada nestas reaces normalmente a TaqI da bactria termfila Thermus aquaticus. Esta enzima no desnaturada pelas altas temperaturas e tem uma temperatura ptima de funcionamento a 72 C

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Esquema de uma reaco de PCR

Esquema de uma reaco de PCR

Um programa habitual de PCR 1x 95 2-5 min 94/5c 1 min 25 -30x Tann 1 min 72C 1min/kb 1x 72 C 7-10 min Tann temperatura de annealing a temperatura ptima a que os primers emparelham. Usual 55, ou 50 -60 C
Quanto mais baixa menos estringente, pode emparelhar noutras regies sem ser emparelhamento perfeito

Para amplificar um produto de 1 kb basta 1 min, um de 10 kb precisa de 10 min

Tann 52 55 58 60 C

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Esquema de uma reaco de PCR

Reagentes necessrios para fazer um PCR DNA template (molde) Primer upper/forward Primer lower/reverse Mistura de dATP,dGTP,dCTP, dTTP tambm chamados dNTPs Taq ou outra DNA polimerase Tampo adequado ao enzima (Mg2+)

Aparelho de PCR

Volume normal numa reaco de PCR 50 L

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Aplicaes da reaco de PCR sequenciao de DNA

Os ddNTP(di-desoxinucleotidos) so nucleotidos terminadores pois no tm o grupo OH para a ligao ao nucletido seguinte interrompem a sntese de DNA Usar um s primer para amplificar s uma das cadeias, com misturas de dNTPs e ddNTPs marcados (com sondas fluorescentes, cada um de sua cor

Aplicaes da reaco de PCR sequenciao de DNA

Ao fim da reaco foram feitos diversos segmentos de DNA de diferentes tamanhos, cada um deles com um determinado ddNTP no fim Ao separar os produtos pelo tamanho, e acoplando um detector para identificar a cor correspondente a cada tamanho, consegue-se obter um cromatograma que diz a sequencida de bases.

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Aplicaes da reaco de PCR sequenciao de DNA

Inicialmente eram feitas 4 reaces distintas, cada uma com um ddNTP marcado radioactivamente Corriam-se cada reaco num poo de um gel, e via-se aonde iam aparecendo sequencialmente os produtos menores.

Endonucleases Enzimas de restrio

Enzimas de restrio so endonucleases que reconhecem determinadas sequncias de DNA , palindrmicas e que cortam a dupla cadeia sempre no mesmo stio

O tamanho da sequncia reconhecida, a sequncia de bases reconhecida e a posio de corte variam entre enzimas

Pontas coesivas sticky e pontas blunt

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Endonucleases Enzimas de restrio

Molculas diferentes de DNA digeridas com o mesmo enzima (ou com outro enzima que deixe pontas equivalentes) podem ser unidas pela aco da DNA ligase usualmente a T4 DNA ligase Qualquer enzima que corte blunt compatvel para ligar DNA com outros fragmentos de DNA cortados por outro enzima do tipo blunt.

Produo de DNA recombinante - clonagem

Fragmento de DNA clonado no vector, p ex um plasmdeo

Digerir o vector e o insert (fragmento a clonar) com as enzimas de restrio

Ligar com DNA ligase

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Mapa de Restrio esquema que indica onde cortam diversos enzimas de restrio numa molcula de DNA
MCS multiple cloning site Regio de plasmdeos que contm muitos cortes de restrio nicos no plasmdeo Ter ateno sempre, na escolha do enzimas para clonar um fragmento de DNA, se eles no cortam dentro do insert De acordo com os enzimas escolhidos, os primers para amplificar o gene a clonar so desenhados inserindo locais de corte apropriados

Produo de DNA recombinante - clonagem

Clonagem Transformao introduo do DNA recombinante num hospedeiro Seleco dos clones positivos (que contm o DNA recombinante) Esquema de um vector plasmdico

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Seleco dos plasmdeos recombinantes usando o gene lacZ seleco de colnias azuis/brancas
Seleco com antibitico bactrias com o plasmdeo Seleco com IPTG e X-gal bactrias brancas tm o insert clonado no plasmdeo bactrias azuis, tm o vector vazio

Seleco dos plasmdeos recombinantes usando o gene lacZ seleco de colnias azuis/brancas

Extraco do plasmdeo a partir de uma cultura iniciada por um nico clone (colnia)

o/n 37C

Anlise do DNA em gel de agarose Kit de Miniprep

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Identificar a correcta insero do insert no plasmdeo recombinante

Existem diversos mtodos que podem ser usados para confimar uma clonagem: 1. Analisar o tamanho do plasmdeo linearizado (tem ser cortado com um enzima de restrio que corte num nico stio do plasmdeo recombinante). O plasmdeo recombinante deve ter o tamanho do vector aps digesto usada na clonagem mais o tamanho do insert (p.ex 3kb + 1,3kb = 4,3 kb) Ateno: um plasmdeo com 6,2 kb e um insert de 300 bp distinguir-se- mal do plasmdeo s. 2. Digerir o plasmdeo com dois (por exemplo os da clonagem) e verificar que o tamanho dos produtos corresponde ao previsto. Ateno: se o insert e o vector tiverem o mesmo tamanho, no conseguem distinguir do vector linearizado... Nesse caso melhor usar outro mtodo ou digerir com mais um outro enzima. 3. Fazer uma reaco de PCR usando os primers do insert ou da regio que circunda a MCS (ou polinker). 4. A reaco de PCR usando os primers do plasmdeo pode ser feita directamente nas clulas das bactrias, sem necessidade de extrair plasmdeo:

colony PCR

Clonagem de genes para produo de protenas recombinantes

ATG

gene
STOP

Nestes casos usam-se plasmdeos que foram criados para expresso, ou seja, que contm um Promotor forte e indutvel, antes da regio MCS Muitos destes plasmdeos apresentam tags que sero inseridas na protena recombinante, quer no N-terminal quer no C-terminal, o que facilita a posterior purificao da protena (His, Biotin, GST, GFP, etc... Protena GFP tag
No N-terminal No C-terminal

preciso especial ateno no desenho dos primers para garantir que o gene seja transcrito in frame, e a tag tambm. Quando as tags esto no C-terminal necessrio remover o codo STOP do insert, para unir tag.

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Clonagem de genes para produo de protenas recombinantes

Para clonar um gene com o objectivo de expressar a protena, Se o gene for procaritico, amplifica-se directamente o gene, criando primers que contm locais de corte para as enzimas de restrio escolhidas
Introduo de um corte ndeI junto metionina inciadora no upper primer

Ao clonar com NdeI a protena recombinante vai ter uma cauda (tag) de histidinas no N-terminal. Se fosse clonado com NcoI a protena no teria a tag.

Clonagem de genes para produo de protenas recombinantes

Se o gene for eucaritico, tem de ser clonado um fragmento de DNA que s tenha os exes do gene. Usa-se um enzima de virus, a Reverse Transcriptase (Transcritase reversa) que consegue sintetizar DNA a partir de mRNA (o processo inverso da transcrio. Ao DNA obtido pela RT chama-se cDNA ,coding DNA

clonar RT cDNA PCR

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Aplicaes que usam as propriedades de complementaridade do DNA

TCNICAS DE HIBRIDAO SOUTHERN E NORTHERN BLOTTING MICROARRAYS

Sequncias complementares de cidos nuclecos (DNA ou RNA) conseguem ligar-se ou hibridar

Tcnica de Southern e Northern Blot, respectivamente para DNA e RNA

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Microarrays - Transcriptmica
Chips so preparados com sondas para todos os genes de um organismo, tecido, etc. Uma sonda em cada spot, que corresponde ao DNA complementar do cDNA (Chips para cDNA) ou complementar ao mRNA (chips para RNA). Amostras marcadas com Cy3 ou Cy5 que so fluorescentes, so hibridadas no chip. Onde se ligarem, vai haver emisso de sinal (vermelho e/ou verde)

Com os microarrays possvel analizar ao mesmo tempo mais de 6000 genes

Podem ser usados para analisar a expresso transcricional ou para fazer hibridaes genmicas, para comparar a presena de genes diversos, como por exemplo genes de virulncia, entre vrias estirpes de bactrias patogneas. Verde condio 1 Vermelho condio 2

Spots verdes so mais expressos na condio 1 Spots vermelhos, mais expressos na condio 2, e spots amarelos igualmente expressos Razo da expresso = Log (Intensidade F. Verde) /Log (Intensidade F. Vermelho)

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Questes
1. O vector de clonagem pBR322 pode ser cortado com a enzima de restrico PstI. Um fragmento de DNA de um genoma eucariota foi obtido por digesto com PstI e ligado ao vector cortado. A mistura de ligao foi depois transformada para clulas hospedeiras de Escherichia coli. As bactrias que continham plasmdeo foram depois seleccionadas por crescimento em meio com tetraciclina. a) Para alm do plasmdeo recombinante desejado, que outros tipos de plasmdeos podero ser encontrados nos transformantes que so resistentes tetraciclina? b) Existem vrias formas para distinguir os transformantes com plasmdeo recombinante dos outros transformantes, falsos positivos. Escolha uma e explique. c) O fragmento clonado tem 1000 pbs (1 kb) e um local de restrico para EcoRI a 250 pb de uma das extremidades. Trs plasmdeos recombinantes (plasmdeo 2, 3 e 4) foram cortados com EcoRI e analizados em gel de electroforese (poos 2, 3 e 4, respectivamente). A digesto do vector original com EcoRI foi analizada no poo 5. Estime os valores das bandas do gel para cada poo. d) No vector original, os locais de restrico EcorI e PstI esto distanciados por 750 pbs e o plasmdeo inteiro tem 4.361 pbs. Desenhe o mapa de restrico para os plasmdeos recombinantes que resultaram nestes trs padres de digesto. 1 2 3 4 5
12 kbs 8 kbs 5 kbs 3 kbs 2 kbs
1000 pbs 800 pbs 500 pbs 300 pbs 100 pbs

Questes
2. Para expressar uma protena de uma bactria, um aluno desenhou primers para clonar o respectivo gene incluindo os locais de corte para as enzimas NdeI e HindIII no upper e lower primer. Escolheu fazer a clonagem no vector pET28a. a) Tendo em conta o mapa de restrio da regio MCS do pET28,a esquematize a protena esperada (presena de tags)

b) Quando efectuou a ligao, o aluno no obteve transformantes. Com base no mapa de restrio do insert explique porqu.

c) Que soluo prope para conseguir clonar o gene neste vector.

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Questes
3. Um fragmento de DNA resultante de um corte EcoRI foi clonada num plasmdeo. O plasmdeo resultante tem 8 kb. a) Com base no mapa de restrio diga o tamanho do insert. b) Se fizer um digesto do plasmdeo com HindIII quantos produtos obtm , e de que tamanho c) Diga a que digestes corresponde cada uma das linhas 1 2 3

Questes
4. Ao fazer a clonagem de um gene de Staphylococcus aureus com 2,7 kb usando BamHI e EcoRI em pUC18, defina a estratgia que usaria para: a) amplificar o gene a partir de DNA genmico de S. aureus (que tcnica, o que incluir nos primers, etc) b) Clonar o gene no vector (esquematize os passos) b) Selecionar transformantes de E. coli com o DNA recombinante c) Purificar o plasmdeo recombinante e confirmar a insero do gene, sabendo que tem disponvel os primers M13 Forward e M13 Rev, e os enzimas BamHI, EcoRI, ScaI, e XmnI. Preveja os resultados em caso negativo e positivo. d) O que obtinha se digerisse o plasmdeo recombinante com BamHI e EcoRI.

2000 XmnI

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Questes
5. O que so enzimas de restrio? 6. Explique o processo de clonagem de um fragmento de DNA num vector. 7. Explique o processo de amplificao de DNA pela reao de polimerizao em cadeia (PCR). 8. Descreva sucintamente uma aplicao para a tcnica de PCR.

Bibliografia
Ver no Moodle

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