Biomol Diagnostica II Recordando.... Os Nucleotdeos so formados por: base nitrogenada + acar (desoxirribose - pentose) + fosfato.

ligao fosfodister

Base nitrogenada
As bases nitrogenadas so unidas por pontes de hidrognio

Grupo fosfato
Extremidade 5

Acar (pentose)
Todo grupamento novo de nucleotdeo adicionado aqui na hidroxila (extremidade 3) se tivesse um oxignio aqui RNA (ribose)

As fitas de DNA so ligadas atravs das pontes de hidrognio. As bases nitrogenadas ficam na parte interna e o grupo fosfato para fora. O grupamento fosfato ligado a hidroxila do acar por meio da ao da DNA polimerase, formando a ponte fosfodister.
A nova fita sintetizada sempre ser no sentido (fosfato) 5 adicionado hidroxila livre do acar. 3 (OH livre do acar), assim o novo nucleotdeo ser

Condies das enzimas in vitro: Toda e qlq enzima necessita de um tampo apropriado para agir, esse tampo precisa conter: tampo mantm a protena dentro de uma faixa de pH. sal (NaCl) que estabiliza a PTN. ons divalentes (Mg++) requeridos para a atividade enzimtica. glicerol (para estoque), vem na enzima estabiliza a estrutura da enzima, no deixando que a estrutura primaria seja perdida pela formao de cristais de gelo. EDTA agente quelante de ons positivos (vem dentro do tubo da enzima), quelar se ligar a uma substancia roubando-a da soluo.

Condies das enzimas em vivo temperatura, pH, cofator ou coenzima.

Enzimas modificadoras do DNA Nucleases fragmenta a molcula de DNA de maneira aleatria Ligases unem fragmento de DNA (dupla fita) refazendo a ligao fosfodiester Polimerases sintetizam novas molculas de DNA (utilizando um molde) Fosfatases e quinases adicionam ou removem grupamento de fosfato.

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I)

Nucleases rompem pontes fosfodiester, ocorre nas duas fitas de DNA. a) Exonuclease removem nucleotdeos das extremidades de fita de DNA, essas enzimas so tempo dependente, qto mais expor a enzima ao DNA mais nucleotdeos sero retirados. b) Endonucleases rompem pontes fosfodister de dentro da cadeia de DNA (enzimas de restrio). Obs.: As bactrias no tem seu DNA quebrado por essas enzimas pois ele metilado, as enzimas de restrio reconhecem as duas fitas para corta-las (fitas so parlindromes).

figura 1.1 Fatores que influenciam a atividade das enzimas de restrio: composio do tampo, concentrao da enzima, temperatura, metilao do DNA. o Endonucleases sem especificidade (quebra pontes fosfodiesteres aleatoriamente), ex.: DNAse I

II)

Ligases a) Ligases restabelece as pontes fosfodiester (na presena de ATP)

Todas as DNA ligases requerem um fosfato no terminal 5 e um OH livre no terminal 3 para formao da ponte fosfodister.

b) Polimerase promove replicao do DNA a partir de um molde (fita simples). S ocorre no sentido 5 o 3da fita de DNA. DNA polimerase I Holoenzima (mais de um domnio cataltico e mais de uma atividade enzimtica, 1 atividade polimerase 5 3, 2 e 3 atividade exonuclease 5 3 e 3 5 reparo erros do DNA).

Biomol Diagnostica II o Klenow fragment:

- Preenchimento da extremidade simples de DNA qdo vc fornece os nucleotdeos prevalece o dominio de polimerase completando a fita simples. - Digesto de extremidade fita simples qdo vc no coloca os nucleotdeos o domnio de exonuclease prevalece retirando os nucleotdeos de fita simples. O que determina a funo de uma enzima sua estrutura espacial (tridimensional). As Taqs diferem entre si pela estrutura tridimensional.

o o

DNA polimerase III - 5-3polimerase DNA polimerase termoestvel (Ex: TaqDNA polimerase)

Quinases Transferem/adicionam grupamento fosfato para uma molcula de DNA. Sempre 5 preparao do DNA para a ligao e na marcao de DNA.

3. So usadas na

Fosfatases - Catalisam remoo de fosfatos das extremidades 5 do DNA. Ao remover o grupo o DNA desforilado e assim impedido de realizar novas ligaes. Usado no tratamento do vetor antes da ligao com o inserto, assim ele no se ligar sozinho sem o inserto.

Corrida de gel O gel de poliacrilamida bem mais delgado, em comparao com o de agarose, e produz poros bem menores (malha mais fina). Assim o gel de poliacrilaminda tem uma resoluo maior, isto , capaz de diferenciar mais as pb de bases, de at 1 pb. Tambm utilizado na corrida de gel de RNA. O DNA marcado com brometo de etdeo na corrida de gel; O brometo se intercala nas pontes de hidrognio. possvel purificar os fragmentos de DNA direto do gel. Corta-se o pedao desejado com um bisturi e aplica-se uma substancia capaz de digerir a molcula de agarose. SMEAR o padro de corrida arrastado. Muito comum no DNA genmico, por causa do tamanho do DNA. Por ser um DNA muito grande, e sua digesto produz muitos diferentes tamanhos fica difcil diferenciar um do outro por estarem muito prximos.

Clonagem gnica insero dos vetores na clula hospedeira

Clonagem: Proporciona a produo de copias de uma molcula de DNA em larga escala. feito a partir de um DNA recombinante DNAs de origens diferentes. Utiliza um vetor, que identificao, replicao e estabilizao do inserto.

Biomol Diagnostica II Passos necessrios para a clonagem: a) b) c) d) e) f) Isolar o fragmento desejado (por PCR ou digesto com enzimas de restrio). Seleo do vetor apropriado (plasmdeo, fago, clulas eucariticas). Ligao de vetor-inserto (DNA vetor + DNA inserto = DNA recombinante). Escolha da clula hospedeira. Insero do vetor na clula hospedeira. Seleo dos clones recombinantes

Porque clonar um fragmento ao invs de utilizar o PCR ? Armazenamento - por meio da clonagem possvel armazenar o DNA para utilizar futuramente. Enquanto o mesmo DNA em um tubo de PCR com o tempo ir se deteriorar. Sequenciamento para a realizao do sequenciamento a molcula de DNA precisa estar clonada (ligada a um vetor) Protena produto resultante do gene clonado O objetivo final da clonagem dificilmente apenas obter um nmero grande de cpias de um fragmento de DNA, seu emprego mltiplo. O mtodo de clonagem se baseia na replicao da fita utilizando a maquinaria existente em uma clula hospedeira. O Vetor deve: - Permite a estabilizao da molcula na clula hospedeira - Permite a replicao da molcula na clula hospedeira - Permite a identificao da molcula na clula hospedeira Os vetores podem ser de clonagem ou de expresso. Os de expresso apresentam toda a parafernlia do de clonagem com alguns extras que permitem a expresso do produto gnico.

Caractersticas essenciais nos vetores: Polylinker ou s o de restrio (regio que contm vrios stios para enzimas de restrio) Origem de replicao pra DNA polimerase Mtodo de seleo da bactria recombinante, por exemplo, gene de resistncia a algum antimicrobiano b.Vetores 1. Plasmdeos 2. Fagos 3. Cosmdeos 4. Bacteriofagos 5. Outros vetores (BAC e YAC)

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Os vetores de clonagem molecular so molculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cpias, a informao gentica que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades que lhe so prprias.

1)PLASMDEOS Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA de cadeia dupla, que contm os elementos necessrios sua replicao e um gene que confere resistncia a um antibitico. Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmdeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, so utilizados como vetores de clonagem. Para isso, tm que possuir certas propriedades: Ter uma origem de replicao, que consiste numa sequncia de DNA que permite a replicao do vetor na clula hospedeira; Figura 1 - Plasmdeo. Plasmdeo com Possuir Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), ou seja, vrios locais sequncias que conferem resistncia nicos de clivagem para endonucleases de restrio, os quais ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicao (ori) e stios de constituem o stio de insero no vetor de clonagem; restrio para a EcoRI, SalI e PstI. Conter um gene que codifique uma substncia que possa distinguir uma clula transformada de uma no transformada. Muitas vezes, so utilizados genes que conferem resistncia a um antibitico, destacando-se, devido sua grande utilizao, o gene que confere resistncia ampicilina. Assim, as clulas que possuem este gene so capazes de crescer em meios com ampicilina, enquanto que as restantes no sobrevivem.

Estes vetores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessria a atuao das enzimas de restrio para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vetor, atravs da produo de extremidades coesivas complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molcula hbrida resultante inserida numa clula hospedeira, muitas vezes bactrias, por um processo denominado transformao. O vetor pode assim sofrer replicaes e proceder consequente amplificao do nmero de cpias. Como foi referido anteriormente, estas clulas so identificadas devido a novas caractersticas concedidas pelo plasmdeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um dado antibitico para o qual o plasmdeo confere resistncia). Figura 2: Clonagem em plasmdeos. Um plasmdeo uma pequena molcula circular que contm uma origem de replicao (ori), gene que confere resistncia a um antibitico (no exemplo ampicilina, Amp) e stio(s) de restrio (no exemplo, stio de restrio para a EcoRI), o qual pode ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido ligado ao vector e os plasmdeos recombinantes so transformados em bactrias, tais como aE. coli. As bactrias so plaqueadas em meios contendo o antibitico para o qual o plasmdeo confere resistncia, como forma de seleccionar as bactrias resistentes

Biomol Diagnostica II (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se ento colnias de bactrias com o plasmdeo recombinante.

2)FAGOS O fago mais utilizado na clonagem molecular o bacterifago que se comporta como um vrus da E. coli. assim, uma partcula viral constituda por protenas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como uma molcula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). injetado na clula hospedeira por possuir a particularidade das suas extremidades (stio cos) serem de cadeia simples, constitudas por cerca de 12 nucletidos que, sendo complementares na sequncia de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma circular antes da sua insero. O genoma do fago codifica para 50 protenas, aproximadamente.

Figura 3: Clonagem em bacterifagos . O vector contm um stio de restrio (por exemplo, para EcoRI) para insero do DNA clonado. Adicionalmente, stios cos, necessrios para o empacotamento do DNA nos fagos, esto presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O DNA inserido ligado ao vector e as molculas recombinantes so empacotadas nos fagos. Os fagos recombinantes so ento usados para infectar bactrias, tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um fragmento nico do DNA clonado, forma uma placa nica no interior da cultura bacteriana.

O fago usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens: O DNA inserido empacotado in vitro. A eficincia do empacotamento somente de 10% aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficincia de insero na clula E. coli hospedeira de 100%;

Mais eficiente que a transformao bacteriana com plasmdeos, pois esta na melhor das hipteses tem 108 transformantes por g de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos so transformados.

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3)COSMDEOS O aparecimento da clonagem em cosmdeos deu-se para ultrapassar algumas limitaes da clonagem em fagos e plasmdeos. No fago , os fragmentos de DNA a serem inseridos no podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de, por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequncias limitadoras, na maior parte das vezes, os genes so de maiores dimenses (35 a 40 kb) o que torna impossvel a sua insero. Os cosmdeos so assim, plasmdeos (com origem de replicao e genes que conferem resistncia a antibiticos), que contm um fragmento de DNA do fago incluindo o local cos. So utilizados como veculos de clonagem molecular atravs do empacotamento in vitro (tcnica j referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstitui a estrutura do fago em cabea e cauda, sendo assim utilizado para infectar a clula hospedeira). As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distncia de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passveis de serem empacotados. Assim, o DNA clivado com uma enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA que se vo ligar ao cosmdeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa situao ideal, cada fragmento de DNA genmico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o empacotamento, vo ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distncia de 49 kb). Seguidamente, uma vez injetado no interior da clula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmdeo normal, sem exprimir qualquer funo do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistncia adquirida a um antibitico especfico.

Figura D4: Esquema de clonagem em cosmdeo. 4. Bacterifagos Parasitos celulares - para se reproduzirem precisam infectar uma clula. Interao clula-vrus especfica. Bacterifagos - vrus que infectam bactrias Vrus vegetais ou animais - infectam clulas animais ou vegetais. A informao gentica dos vrus pode estar contida em molculas de DNA ou de RNA. Exemplos: RNA - R17, MS2, f2, Q DNA circular ss - X174, M13 DNA circular ds - T4, T5, T7, P1, Os bacterifagos podem ser: Virulentos: ciclo ltico Temperados: ciclo lisognico + ciclo ltico

Biomol Diagnostica II 5)OUTROS TIPOS DE VECTORES

BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmdeos naturais de E. coli, denominado de factor F. A origem de replicao e as outras sequncias do factor F, permitem a sua replicao enquanto plasmdeosestveis, possuindo inseres de 120-300kb. Devido sua estabilidade, capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, so agora os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos. YAC ( cromossoma artificial de levedura): contm origens de replicao de leveduras e outras sequncias (centrmeros e telmeros), que permitem a sua replicao como molculas lineares do tipo cromossmico em clulas de levedura. Figura 5: YAC. Os YAC (Yeast Artificial Chromossome) permitem a clonagem de molculas de DNA relativamente grandes. TEL, CEN e ORI correspondem a telmero, centrmero e origem de replicao, respectivamente, para a levedura Saccharomyces cerevisiae. BamHI e EcoRI correspondem a stios de restrio para as respectivas enzimas de restrio. As sequncias A e B codificam enzimas que servem como marcadores de seleco, permitindo um fcil isolamento das leveduras que apresentarem o cromossoma artificial.

c. Ligao de vetor-inserto A reao de ligao entre vetor (ex.: plasmideo) e inserto (o fragmento de DNA) feito atravs de uma enzima chamada DNA ligase(pag.2) que ira unir o vetor e o inserto. Para que essa ligao ocorra disponibilizamos de alguns artifcios, as extremidades do inserto e vetor podem ser coesivas e blunt (ver pagina 2, figura 1.1), a fim de evitar ligaes inespecficas (extremidades coesivas). A ligao com extremidade blunt requer mais gasto de energia para que ocorra. A reao de ligao feita em um termociclador com temperatura, tampo ideais para o funcionamento da enzima.

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O plasmideo vem fechado ento precisamos abri lo com uma enzima de restrio, a escolha dessa enzima abri-lo baseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fabricante nos fornece o mapa do plasmideo(figura 1.3).

Se vc tiver um vetor com a extremidade coesiva e seu inserto for blunt ou vice-versa podemos fazer uso de adaptadores para que essa ligao ocorra(figura 1.4). Para essa reao (figura ultilizado a enzima T4 DNA ligase. Figura 1.4

Figuras 1. 2 Passos para inserir o inserto no vetor.

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ligao Para evitar a re-ligao do vetor depois de ser digerido pela enzima de restrio, o vetor pode ser tratado com uma enzima a fosfatase, ela desfosforila (tira fosfatos) evitando assim sua religao. ma

Figura 1.3 Mapa de um plasmideo.

d. Clulas hospedeiras Tipos de clulas hospedeira:

- Clulas eucariticas: leveduras, clulas de ou organismos tecidos variados - Clulas procariticas: bactrias rias

d. Insero do vetor na clula hospedeira Para inserir o vetor recombinante na clula hospedeira essa precisa de um tratamento que pode ser: Transformao - a clula hospedeira tornada quimicamente competente para o vetor de clonagem ser spedeira introduzido. Se as DNAs polimerases da clula hospedeira reconhecerem os stios de replicao do DNA exgeno, a bactria vai replicar o DNA exgeno junto com seu prprio DNA. As bactrias e o vetor so misturados com uma soluo de cloreto de clcio e sofrem um choque trmico. Os on clcio tm a funo e ons de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque trmico a trmico.

Figura 1.5 Os pontos vermelhos representam o cloreto de clcio que se ioniza ( (em Cl- e Ca2+), o Ca2+ ser atrado pela parede bacteriana (que neg), formando uma pelcula que promove a aproximao do DNA exgeno (plasmideo) que possui carga neg.

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Crescimento em meio lquido de cultura - Incubao 37C com agitao durante 1 hora, Sem antibitico. No tubo, crescero todas as bactrias viveis (com e sem plasmideo recombinante).

O meio slido contm: Antibitico,X-Gal, IPTG, Incubao durante 18 horas a 37C. Placa com os clones, colnias azuis sem o plasmideo recombinante, colnias branca presena do plasmideo recombinante

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Eletroporao - a clula submetida a um campo eltrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido A eletroporao uma inserido. tcnica na qual se misturam bactrias e o vetor num nico tubo e aplica-se um choque e se eltrico na mistura, com o objetivo de desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor na bactria. Ela ento tivo rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37C para que se possa recuperar aps o choque.

Transfeco - quando o vetor de clonagem tem caractersticas de vrus, a clula hospedeira pode ser caractersticas transfectada para receber a molcula recombinante So utilizados fagos geneticamente modificados recombinante. utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reproduo viral.

Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisa ado estar dentro do fago. Um vrus precisa ser montado em volta do DNA in vitro (figura ao lado). Aps isso coloca-se as bactrias em meio de cultura liquido se juntamente com os fagos, e induz o ciclo lisognico , (integrao do DNA recombinante do fago no DNA da bacteria) essa induo feita com a temperatura a 37C 37C. Depois essa cultura de meio liquido plaqueado em meio de cultura semisslido pois assim tem maior motilidade motilidade.

Infeco ou transfeco 1. O fago injeta o DNA na bactria. 2. Esse DNA replicado 3. Dentro da cel comea a ser montado as partculas fagicas, e o DNA recombinante encapsulado. 4. Com isso ocorre a lise da clula hosp e a liberao dos fagos no meio de cultura (semi (semi-solido) e eles podem infect outras bactrias. infectar

Essa figura oq ocorre no meio de cultura semi solido. O ciclo ltico (lise da semiclula bacteriana) induzido por temperatura a 42C.

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Nessa figura podemos observar que aps o crescimento das bactrias + fagos vc tem um tapete de bactrias(A). Depois de um certo tempo possvel observar mais halos na placa isso mostra que esta ocorrendo o ciclo ltico (B). C e D mostra o ciclo ltico com o passar do tempo. O fago recombinante produzir durante a cultura placas de lise com o centro claro morfologicamente fcil de ser visualizada. Aps isso possvel recortar os halos com uma ponteira, purifica-los e utilizar o DNA recombinante dos fagos.

Aps a transformao, as bactrias so incubadas em condies adequadas para que se possam multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio slido, para que se possam isolar colnias. A identificao das colnias recombinantes feita utilizando as caractersticas conferidas pelos plasmdeos. Assim, se foi utilizado um plasmdeo que confere resistncia ao antibitico A, podem isolar-se as colnias que foram transformadas simplesmente plaqueando-as num meio de cultura com antibitico A (as bactrias no transformadas no tero resistncia ao antibitico e morrero). Uma vez identificadas as bactrias que contm o vetor recombinante de interesse de entre as vrias colnias plaqueadas, basta transferir a colnia para meio lquido para que se obtenham milhes de cpias da bactria e, consequentemente, do vetor recombinante desejado. Atravs da reao de extrao de DNA chamada mini-prep.

Expresso de protenas recombinantes em cels hospedeiras

Uso de uma clula para produo de uma protena de outro organismo Por que produzir protenas recombinantes? Pesquisa em estrutura e prots, imunizao, produo de AC, farmacos (vacinas, hormnios, fatores de coagulao etc).

Justificativa da expresso de protenas recombinantes Dificuldade de se purificar do tecido original Protenas do tecido podem estar contaminadas Protenas recombinantes podem ser engenheiradas (modificadas) Processo completamente controlado Especificidade Quantidade

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Como preparar um sistema recombinante a. Isolar e preparar o DNA ou cDNA - Por clivagem com enzimas de restrio ou PCR, fazer a reao de transformao ou transfeco

Escolher o sistema apropriado escolher o vetor de expresso (que contenha origem de replicao, promotor, sitio polylinker, sitio de ligao do ribossomo, sitio de poliadenilao - terminador, marcadores seletivos antibiticos e um gene reporter).

b. Escolher o sistema apropriado Caractersticas avaliadas em cada sistema de expresso Taxa de crescimento celular, Complexidade do meio de cultura, Custo do meio de cultura, Nvel de expresso, Capacidade de expressar extracelularmente, Capacidade de produzir as modificaes ps-traducionais tais como: dobramento correto, formao das pontes dissulfeto, glicosilao, fosforilao, acetilao.

Vantagens dos sistemas de expresso eucariticos Dobramento das protenas mais semelhantes

Desvantagens dos sistemas de expresso eucariticos Nveis de expresso mais baixos

Adequado para protenas ricas em cisteinas-pontes Poucos vetores disponveis dissulfeto Pode produzir grandes quantidades de protenas com o Necessita de equipamentos adequados uso de equipamentos prprios (fermentadores)

Vantagens dos sistemas de expresso Bacterianos Facilidade no crescimento e purificao Vrias cepas e plasmdeos comerciais Comparativamente barato Sistemas de expresso bem conhecidos Tecnologia relativamente simples

Desvantagens dos sistemas de expresso Bacterianos No h modificaes ps-transducionais (glicosilao, ribosilao, acetilao) Tamanho do cDNA limitado No realiza secreo de protenas Algumas protenas so txicas para as bactrias. Dobramento incorreto das protenas

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Escolha do sistema hospedeiros Bactrias Gram-negativas E. coli Bactrias Gram-positivas Bacillus subtilis Leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Fungos filamentosos Aspergillus e Trichoderma Clulas de mamfero Plantas e animais transgnicos

c. Transformar hospedeiro -Eletroporao, transformao, transfeco etc. Eletroporao,

d. Selecionar hospedeiro transformado

Seleo Antibiticos: Ampicilina , Kanamicina, Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina, Higromicina .

e. Checar se a protena foi expressa e se est solvel Atravs de gis de poliacrilamida vc verifica a produo da protena Se a protena no for expressa sequenciar o inserto e alterar os nveis de induo de expresso.

Biomol Diagnostica II f. Purificar

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izar desnatura-las conferindo carga Fazer um extrato proteico solubilizar as protenas (dissolvidas em soluo aquosa) desnatura negativa. Selecionar o clone de expresso e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a protena, fazer o extrato proteico (protenas totais) correr o gel em a acrilamida. Vetor de expresso possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda na purificao por cromatografia de afinidade (gruda na resina-prot reprter). prot GST a Vem antes da protena recombinante, a resina tem afinidade (AC GST ou glutationa), serve para protenas , completas pGEX Glutationa S-Transferase - agarose agarose-glutationa 7X His his histidina Fica depois da proteina recombinante, no uma protena completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo nquel. a Uso de protenas em fuso ou reprter: prter: Existncia de um gene em regio anterior ao inserto que servir como isca na purificao Existncia, na regio posterior ao inserto, de uma cauda de Poli Poli-histidina pQE, pET tag de Histidinas - coluna de nquel

Gel de poliacrilamida Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da tamanho da protena (gene reporter + inserto) nho Seu controle negativo ser o extrato celular sem o vetor de expresso para saber se sua protena foi expressa. Seu controle positivo ser a protena purificada (Inserto + gene reprter)

Purificao - Passar as protenas - Lavar a coluna - Eluir a protena de interesse - Digestao com a protease trombina que separa o gene reporter da protena de interesse - Passar na coluna novamente e eluir (protena de interesse) - Correr um gel para ver se deu certo

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Construo de bibliotecas genmicas uma coleo de DNAs recombinantes Para isso necessrio isolar as sequencias de interesse do gene + as regies responsveis pelo controle da sua expresso. Os fragmentos so clonados em uma nica clonagem Pode ser de 2 tipos: Biblioteca genmica Total: representativa de todo o contedo gentico do tipo celular que se deseja estudar Parcial: contm parte do contedo gentico do tipo celular que se deseja estudar Biblioteca de cDNA

Finalidade - O isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. Tamanho - O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma.

passos necessrios Isolamento e digesto do DNA fragmentar a sequencia com enzimas de restrio ou mecanicamente (fragmentos aleatorios) Utilizao de vetores apropriados grandes fragmentos (YACs, BACs, cosmideos e fagos) Ligao dos fragmentos no vetor os diferentes fragmentos so clonados na mesma clonagem (colocar uma boa quantidade do vetor e inserto). Calcula-se a probablilidade de cada fragmento diferente ser ligado. Ex.: 10.000pb quebra-se em 10 partes, 5xn de fragmentos -> 5x10= 50 clones Insero na clula hospedeira transformao ou transduo

Construo de biblioteca de cDNA Vc pega o RNA total do organismo, seleciona o RNAm (que contem o oligo DT, para isso vc utiliza primers que tem cauda de poli A, dessa maneira s ira selecionar os RNAm), a partir do RNAm faz um RT-PCR com a enzima transcriptase reversa, obtendo assim cDNA (sem introns informao certa para codificao de prots), a partir do cDNA vc pode liga-lo no vetor de expresso apropriado. Obs.: cada clone obtido ira expressar uma protena diferente. Vantagem vc so ter oq codificante s xons, sem introns.

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Caracterizao dos clones recombinantes de bibliotecas genmicas de DNA Identificar os clones de cDNA (biblioteca genomica) 1 seleo ocorre durante a elaborao da clonagem (dupla seleo antibitico e X-gal e IPTG).

2 seleo a. biblioteca expresso (protena) selecionada reao Ag-AC (western blot) b. biblioteca DNA somente identificao com hibridizao de DNA (sourthern blot)

Disso depende o modo de screening

a. biblioteca expresso clones numa placa feita a replica da placa com uma membrana de nitrocelulose (marca a membrana com furos pra saber qual colnia foi), depois trata a membrana com soluo de SDS (detergente) para lisar as bactrias e as protenas se aderirem a membrana, a partir disso fazer o imunoblot. b. biblioteca DNA Utiliza-se uma membrana de nylon fazendo uma replica da placa, lisar as bactrias na membrana (para que o DNA grude),colocar uma soluo desnaturante na membrana (DNA simples fita), hibridizar com uma sonda (radioativa ou fluorescente), e revelar.

Sequenciamento do DNA Mtodo de Sanger - manual O sequenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra. Existem vrios mtodos disponveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizado o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de terminadores de cadeia ou de Sanger; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratgia consiste em identificar,continuamente e sequencialmente durante o processo, o ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reao devero tambm portar uma marca que permita detecta-los na etapa de anlise. Resumidamente, o processo realizado a partir de uma cadeia simples (no dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servir de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hlice. Isto obtido pela desnaturao da molcula nativa (fig 1). FIG 1

A reao de sntese se processa em condies inicas e de pH apropriadas, na presena da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotdeos sob a forma de 3-desoxinucleotdeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e

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dTTP sendo um deles marcado radioativamente com P ou ; um dos mais utilizado o dATP P (fig 2a). Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente necessrio tambm, a presena na reao, de um pequeno fragmento de DNA sinttico (XXX) complementar a uma regio conhecida (YYY) na extremidade 3 do DNA molde; estas caractersticas permitiro sua hibridizao no local mencionado, e fornecero um ponto de partida para a replicao do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou primer", quando marcado, poder ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recm sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo que ele executado em quatro reaes separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de anlogo, 2, 3-didesoxinucleotdeo trifosfatos (ddNTPs) (fig 2b). FIG 2

Estes anlogos conhecidos como terminadores quando incorporados cadeia nascente, por no apresentarem 3OH que permita formar ligao com o prximo dNTP a ser adicionado, bloquear todo processo. Como todos os nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o alongamento da cadeia prosseguir at que a enzima DNApolimerase insira um anlogo (ddNTP). Consequentemente, haver parada imediata da reao de sntese no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molcula estar marcada com P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reao o anlogo foi adicionado, so separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de anlise para cada reao. O gel transferido para um Fig. 3 suporte de nitrocelulose (filtro). Aps auto-radiografia a ordem dos nucleotdeos, na cadeia de DNA recm sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta complementar da molcula sequenciada: que serviu de molde. Levando estas observaes em considerao, possvel conhecer a sequncia de nucleotdeos do DNA sequenciado de 3para 5 partindo-se da parte inferior para a superior do gel. O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias nos livros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3. Mtodo automatizado O mtodo pode ser automatizado atravs de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com softs que lm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitir executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotdeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescncia fig 4a. Como

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cada reao (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um nico canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, aps iluminao com um feixe de laser, identificar os produtos baseado na diferena de comprimento de onda. A luz emitida detectada por escaneamento do gel e a sequncia deduzida por computador fig 4c. Variveis mais modernas, consequentemente mais rpidas e poderosas, incluem a robotizao total do processo com a incluso das etapas de purificao e da reao de sntese da cadeia do DNA
FIG 4

Organismos geneticamente modificados X transgnicos

- Organismo geneticamente modificado - Todo o organismo cujo material gentico foi manipulado de modo a favorecer alguma caracterstica desejada, Isolamento (melhoramento gentico clssico) de caractersticas desejveis de espcies afins e tambm de espcies distintas. - Organismo transgnico - Qualquer organismo que, por meio de engenharia gentica, recebe e expressa genes provenientes de outros organismos.

Organismo geneticamente modificado: - H registros, de 4 mil anos, da produo organismos geneticamente modificados, principalmente na cultura do milho . - Insulina 1982 - Produzida por uma bactria geneticamente modificada

Aplicao dos transgnicos PESQUISA BSICA: estudo e regulao e funo de sequncias genticas especficas PESQUISAS BIOMDICAS: criao de modelos animais com doenas humanas PESQUISAS DE DOENAS GENTICAS: animais com mutaes

Biomol Diagnostica II INDSTRIAS BIOTECNOLGICAS: produo de protenas, enzimas, hormnios e fatores de crescimentos por animais domsticos

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Padro de integrao e eficincia do processo: A integrao do DNA ao genoma da clula parece ser aleatria Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes, 40% apresentam o DNA exgeno integrado

Padres de expresso dos transgenes: Geralmente corresponde ao padro do gene endgeno Pode ser direcionada padro endgeno, a tecidos especficos.

Riscos X Benefcios Provocar mutaes genticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo. Elevar o valor nutricional dos alimentos Plantas resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produo de 15 a 30% insetos Vegetal capaz de produzir uma protena animal at mesmo humana (hormnio, insulina, vacinas, enzimas) para fins farmacuticos

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ANEXO1 VETORES UTILIZADOS NA CONSTRUO DE UMA BIBLIOTECA GENMICA Atualmente, os vetores mais utilizados na construo de bibliotecas genmicas so fagos e cosmdeos. Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentao aleatria, ligam-se ao DNA do vetor para poderem ser empacotados em partculas de fago . As bibliotecas construdas com vetores so armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou brao esquerdo, codifica as protenas da cpsula, e o brao (fragmento) direito, tem a origem de replicao do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos esto os stios de restrio usados na clonagem, orientados inversamente SalI, BamHI, EcoRI . A extremidade de cada brao apresenta um segmento de cadeia simples (cos). Estes segmentos so complementares entre si, permitindo assim a recircularizao da molcula e consequente replicao do fago dentro da clula hospedeira.

Figura D6: Estrutura do vector EMBL3. S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Este tipo de vetor chamado vetor de substituio porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA do fago substituda pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molcula recombinante. Os fragmentos clonados so ligados aos braos do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura empacotada in vitro em partculas vricas. Para se selecionar apenas os fagos recombinantes, estes so infectados numa bactria lisognica. A suspenso de fagos resultante pode ser armazenada durante vrios anos num frigorfico, com algumas gotas de clorofrmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentrao do nmero de partculas infecciosas v baixando gradualmente. A biblioteca tambm pode ser armazenada por congelamento da mistura de ligao (fragmento de DNA/vetor). Na clonagem em cosmdeos, as partculas virais servem apenas como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactria e uma vez dentro dela o cosmdeo comporta-se como um plasmdeo grande. Os cosmdeos podem aceitar inseres de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inseres clonveis num fago . Assim, quando um cosmdeo utilizado como vector, apenas so necessrios 350.000 recombinantes para se atingir 99% de probabilidade de uma sequncia de cpia nica estar presente numa biblioteca genmica de mamfero. No entanto, as bibliotecas de cosmdeos so mais difceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos. Assim, os cosmdeos so utilizados quando o gene de interesse muito grande ou quando se deseja uma regio extensa de DNA; o uso de vectores mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes.

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O mtodo utilizado para isolamento de clones genmicos especficos tem sido frequentemente o de rastreio por hibridizao com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificao direta de fragmentos de DNA por PCR agora igualmente comum.

VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA Aps ter sido obtido o cDNA, necessrio prepar-lo para ser inserido num vetor de clonagem, processo que depende do vetor escolhido: plasmdeo ou fago. O fago mais utilizado devido sua elevada eficincia: comparativamente com os plasmdeos, requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vector para produzir um nmero equivalente de clones recombinantes; As bibliotecas de fagos so mais fceis de manipular que as bibliotecas de plasmdeos; No entanto, os fagos no so favorveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagnese dirigida.

Para ultrapassar esta limitao idealizaram-se os fagemdeos que so plasmdeos contendo pores do genoma do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vetores. Para efetuar a ligao entre o vetor e o cDNA so necessrios alguns procedimentos preparatrios, como por exemplo polir as extremidades das molculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem blunt e ligadas a locais blunt de vetores de clonagem. No entanto, este processo no se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do cDNA em extremidades coesivas, compatveis com a ligao ao local de clonagem de um vetor. Estes processos consistem na adio de adaptadores, sendo o seguinte mtodo um exemplo destes: 1- Metilao dos stios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de S-adenosil metionina. essencial para proteger os stios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digesto da EcoRI, que se vai realizar uns passos frente; 2- Adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores so pequenos oligo-nucleotdeos que tm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se s extremidades do cDNA, e tm outra extremidade coesiva, igual produzida por uma enzima de restrio, permitindo a ligao a um vector preparado com a mesma enzima de restrio. Esta adio de adaptadores resulta na obteno de molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas; 3- Apenas produzido um stio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digesto com EcoRI, libertando o excesso de adaptadores ligados na molcula. No ocorre digesto interna do cDNA devido metilao previamente efetuada; 4- Atravs da filtrao em colunas de Sephadex, o cDNA separado do excesso de adaptadores, antes de ser inserido no vetor; 5- A T4 ligase permite a ligao das molculas de cDNA ao vetor; 6- O produto da ligao junta-se com as protenas que formam o capsdeo do fago; 7- Os fagos assim produzidos vo infectar bactrias de uma linhagem que favorea o crescimento dos recombinantes; 8- A biblioteca obtida aps infeco da bactria com os cDNA recombinantes, devendo conter cpias de todas as sequncias de mRNA da populao original.

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9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de interesse. Considerando que as molculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido especfico expresso gentica estas bibliotecas so muito teis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso, procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estdios especficos de desenvolvimento ou em determinadas condies ambientais. Pode-se assim construir bibliotecas atravs de hibridizao subtrativa. Estas bibliotecas so enriquecidas em genes expressos diferentemente em determinadas condies selecionadas: Obtm-se preparaes de duas populaes de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, clulas do mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes;

A primeira cadeia de cDNA de uma das populaes de mRNA preparada e depois hibridada com um excesso da outra populao de mRNA;

Ocorre a formao de hbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duas populaes; A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente molculas de cadeia dupla, permitir a remoo dos hbridos;

O cDNA especfico da primeira populao permanece em cadeia simples e no se liga coluna; Depois utilizado para a preparao de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genes especficos ou marcado radioativamente para ser utilizado diretamente como sonda, para se proceder ao rastreio de uma biblioteca de genes.

BIBLIOTECA GENMICA Uma biblioteca genmica deve conter vrias cpias/clones representativos de cada fragmento de DNA para aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cpia nica, ou seja, a maior parte dos genes codificantes de protenas. A utilizao de uma biblioteca o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada poro de DNA. A separao da poro do DNA genmico que contem toda a unidade de transcrio com as regies limitadoras onde esto localizados os elementos controladores da expresso desse gene, permite-nos obter informaes acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas. O ponto ao qual se d mais relevo na construo de uma biblioteca genmica a obteno aleatria de um elevado nmero de clones contendo fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, necessrio estimar o tamanho necessrio da biblioteca atravs do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do genoma. Para isso utiliza-se a seguinte frmula, com base na distribuio de Poisson: N=log (l-P) /log (l-l/n), em que P a probabilidade de se encontrar um fragmento nico e n representa a razo entre o tamanho do genoma do organismo e o tamanho da insero de DNA clonado. N (nmero de clones independentes que precisam de ser separados para se isolar uma sequncia especfica) diretamente proporcional probabilidade e ao tamanho do genoma, em pares de bases (G) e inversamente proporcional ao tamanho mdio dos clones, em pares de bases (I).

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Considera-se aceitvel uma probabilidade acima de 95%. O seguinte exemplo ilustra a situao referida: partindo de uma biblioteca cujas inseres de DNA so de 20 kb, para isolar um gene humano de cpia nica, torna-se necessrio fazer o rastreio de cerca de um milho de clones recombinantes (o tamanho total do genoma humano aproximadamente 3x109. Deste modo, para termos 99% de probabilidade de isolar uma dada sequncia presente numa nica cpia de um gene de mamfero, temos que analisar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa como vector o fago : N= ln (1-0.99) /ln [1- (2x104/3x109)] = 690.000 Assim, na construo destas bibliotecas o objectivo bsico procurar reduzir o nmero de clones necessrios, aumentando o mximo possvel o tamanho dos fragmentos de DNA clonados, e, utilizando vectores de clonagem baseados no fago , maximizar a eficincia da clonagem. A construo de uma biblioteca genmica envolve basicamente os seguintes passos: 1 isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor.

Figura B1: Bibliotecas genmicas. Biblioteca de plasmdeos (a) e biblioteca de fagos (b) .

2 ligao desses fragmentos ao vector e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.

PREPARAO DO DNA A SER INSERIDO Para que no haja excluso sistemtica de nenhuma sequncia, a representatividade de uma biblioteca genmica est muito dependente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados. O mtodo que permite obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA o fracionamento mecnico. No entanto, este no muito utilizado pois implica uma complicada manipulao para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Aplicando os cuidados necessrios, possvel ultrapassar este obstculo atravs de digestes parciais de DNA usando enzimas de restrio. Este processo apresenta uma vantagem pois permite obter fragmentos com pontas coesivas, o que facilita a insero direta do vetor. Para ter a garantia que esta digesto atinge todo o genoma, so utilizadas enzimas de restrio que cortam frequentemente o DNA, no apresentando desvios de preferncia de stios. Com este fim, a enzima Sau3A I utilizada frequentemente pois reconhece o stio de 4 bases GATC, gerando fragmentos compatveis com stios de clonagem de vrios fagos e cosmdeos(estatisticamente, uma sequncia de 4 nucleotdeos aparece, em mdia, cada 256 pares de bases). H seces de DNA que possuem as sequncias de conhecimento muito espaadas, especialmente as de enzimas que cortam menos frequentemente, o que leva a uma maior probabilidade de gerar fragmentos de certas zonas de DNA, muito grandes para serem clonados e os genes a existentes no estariam representados na biblioteca genmica. O corte parcial do DNA feito em condies (relao enzima/DNA baixa ou tempo de digesto limitado) que maximizem a obteno de fragmentos com um tamanho de cerca de 20 kb, um tamanho razovel para substituir

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o fragmento central do fago. Como resultado deste corte parcial so gerados fragmentos de DNA parcialmente sobrepostos. Estes precisam de ser tratados para evitar que fragmentos pequenos se liguem entre si, produzindo falsos recombinantes e clones artificiais que no correspondem verdadeira estrutura genmica. Para impedir essas ligaes pode-se tratar o DNA com fosfatase, ou efetuar um fracionamento. Este ltimo evita tambm que, fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago, se liguem aos braos deste, o que alteraria as relaes entre as quantidades de DNA inserido e vetor. Um mtodo que frequentemente utilizado o fracionamento por centrifugao em gradiente de sacarose, no qual a soluo de DNA anteriormente digerida, aquecida para que ocorra a dissociao de possveis fragmentos agregados. Depois aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta salinidade. Este gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente que contem o DNA de maior molecular, aspirada primeiro. Aps a centrifugao, as fraces desse gradiente so coletadas e analisadas por eletroforese num gel de agarose e as fraes contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao com o vetor.

Figura B2: Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro. Garante-se assim, com todo este processo, a aleatoriedade dos fragmentos clonados, pelo que a probabilidade de uma dada sequncia estar presente numa biblioteca genmica pode ser estudada estatisticamente - pelo mtodo que foi acima referenciado.

APLICAES A elaborao de bibliotecas de genes de diferentes organismos/tecidos permitiu grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes eucariticos bem como uma revoluo tecnolgica na indstria farmacutica e de alimentos e produo em massa de polipeptdeos importantes na rea de pesquisa e na rea aplicada. Os clones so usados para produzir produtos, para estudo ou mesmo visando a alterao fenotpica de um dado organismo. Na rea da terapia mdica uma importante aplicao consistiu na transformao de bactrias E. coli com plasmdeos que lhe conferem a capacidade de segregar os dois polipeptdeos usados para obter insulina humana; analogamente, podem inserir-se em vrus animais clones de determinados genes responsveis pela produo de protenas membranares patognicas quando o vrus utilizado como vacina, o hospedeiro desenvolve imunidade para o agente patognico.

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Figura E1: Transformao de E. coli com plasmdeos recombinantes dotados de sequncia que codifica para o gene da insulina. O plasmdeo cortado com enzimas de restrio e misturado com uma amostra contendo fragmentos de restrio (que contm o gene que codifica para a insulina) produzidos por clivagem de DNA com a mesma enzima de restrio. Formao de plasmdeos recombinantes, com auxlio de uma DNA ligase. Transformao bacteriana e produo de insulina pelas bactrias.

Surgem ainda diversas aplicaes cientfico-mdicas, nomeadamente com o aumento da compreenso sobre o DNA, genetic fingerprinting e terapia gnica; sequenciao de nucleotdeos com o auxlio de mquinas (com expoente mximo no Projecto Genoma Humano); descoberta de mutaes responsveis por doenas hereditrias em humanos, atravs de screening, recurso terapia gnica para curar doenas genticas, substituindo o gene com defeito (ou ausente); por recurso a Southern blotting, aproveitamento do DNA fingerprinting para comparar DNA recolhido em cenas de crime com as do(s) suspeito(s); uso de sondas de DNA para efectuar diagnsticos e identificar os agentes patognicos no sangue ou alimentos. Algumas aplicaes agrcolas consistem na recolha das clulas de plantas com caractersticas desejveis e posterior clonagem; engenharia gentica de plantas para aumentar qualidade e quantidade de produo: por exemplo, Rhizobium foi trabalhado de forma a obter uma fixao de nitrognio melhorada; Pseudomonasfoi trabalhada para produzir Bacillus thuringiensis, um insecticida natural. Resumindo, todo um desenvolvimento no sentido da obteno de plantas resistentes aos stresses biticos e abiticos (vrus, herbicidas, seca, pestes, nemtodes). No domnio da pecuria, a E. coli foi utilizada para produzir hormonas de crescimento bovino. As bibliotecas de genes permitiram ainda o o aparecimento de uma nova estratgia de investigao, chamada gentica reversa (reverse genetics). De facto, actualmente possvel comear no "gene" e alcanar a "protena" e vice-versa, atravs da obteno de clones e determinao das sequncias dos genes que estes apresentam. Estas sequncias de DNA permitem deduzir as sequncias das respectivas protenas. Estas, por sua vez, podem ser comparadas com as sequncias de outras protenas para inferir a sua funo, ou podem ser expressas em quantidades que permitam a sua caracterizao experimental.

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A gentica reversa comea com um gene ou uma protena, s vezes hipotticos, cuja funo pode ser completamente desconhecida. De facto, a sequenciao completa de genomas tem revelado muitos genes que no tm semelhana com qualquer outro gene conhecido. Por outro lado, uma protena pode ter sido isolada em funo de uma actividade ou por pertencer a uma qualquer estrutura celular. Com base na sequncia da protena, mesmo que parcial, possvel desenhar e sintetizar oligonucleotdeos correspondentes sequncia do gene. Estes oligonucleotdeos podem ser utilizados como sondas para isolar o gene. Finalmente, para alm de outras caracterizaes como a sequenciao de DNA, o gene pode ser alterado para induzir mutantes e caracterizar o seu efeito fenotpico. Fonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliogenom.htm