1

2

I/ Introduction
Une bonne sparation en chromatographie liquide implique :
1. que les divers constituants du mlange soient retenus sur la colonne, donc prsentent
une affinit pour la phase stationnaire suffisante pour qu'ils apparaissent dans l'effluent aprs
un volume suprieur au volume interstitiel de la colonne
2. que les diffrents pics soient bien spars, ce qui pour deux pics successifs dpend de
la distance sparant les sommets et leur largeur.
3. que l'analyse soit aussi rapide que possible.
I I / GRANDEURS DE RETENTION
Si la quantit injecte est petite on obtient pour chaque compos lu un pic symtrique et
gaussien.

1- Courbe de Gauss
Les pics chromatographiques ont une allure gaussienne L'aire des pics est calcule en
assimilant le pic a un triangle.
La largeur d'une courbe de Gauss est dfinie paro, o, e:
o = cart type = Largeur du pic a la hauteur des points d'inflexion, 60,6% de la hauteur.
o
2
: Variance

3

o = 2,35 o = largeur mi-hauteur.
e = 4 o =1,7 o = largeur mesure 13,5% de la hauteur = largeur a la base du pic.

Courbe de Gauss
y = (1 / o) exp [- ( x m )
2
/ (2 o
2
) ]
Deux points d'inflexion x = m - o et x = m + o.
G(m) = 1 / o = h (hauteur du pic)
G( m - o ) = G( m + o ) = (1/o) exp (-1/2) = 0,6065 / o = 60,5 % de h
G( m - 2 o ) = G( m + 2 o) = 1/o exp (-2) = 0,1353 / o = 13,5 % de h
G( m - 1,1774 o) = G( m + 1,1774 o ) = 0,5000 / o = 50 % de h
Intgration = surface du pic
(de - +) G(x) dx = 2,507 = S (surface du pic)
(de m - 2 o m + 2 o) G(x) dx = 2,393 = 95,4 % de S
2- Le temps de rtention du solut (t
R
)
C'est le temps d'lution au maximum du pic mesur partir de l'injection.
t
M
= temps mort = t
0
= temps ncessaire pour que le pic d'un constituant non retenu par la
S

apparaisse

4


t
M
=temps mort = t
0
= temps ncessaire pour que le pic d'un constituant non retenu par la
S

apparaisse
t
R
= temps de rtention d'un constituant retenu par la
S

= temps coul entre l'injection et le moment ou le constituant sort de la colonne.
t
R
dpend du produit S et des conditions exprimentales (colonne, temprature, dbit de phase
mobile... etc.)
3- Le volume de rtention (V
R
)
Connaissant le dbit D de la phase mobile, suppos maintenu constant, on dfinit le volume
de rtention : V
R
= t
R
. D = t
R
. v. s
v : vitesse linaire de la phase mobile s : section rduite de la colonne
s = s'.c avec s' : section de la colonne et c = V
M
/ V
T
(porosit)
V
R
de chaque solut reprsente le volume de phase mobile ncessaire pour le faire
migrer dune extrmit lautre de la colonne.
4- le volume mort :
V
M
= t
M
. D
V
M
: le volume de phase mobile qui passe travers la colonne pour aller d'une extrmit
l'autre de la colonne (pendant le temps t
M
). Autrement dit, V
M
est le volume occup par la
phase mobile dans une colonne.
5- Temps de rtention rduit
On ne prend plus comme origine linjection mais le pic du temps mort.
Il est not t'
R
et est gal t'
R
= t
R
-t
M

Il correspond au temps de sjour du compos en contact avec la phase stationnaire.
5

6- Volume de rtention rduit
Comme pour le temps mort rduit, on dfinit le volume mort
Il est not V'
R
et est gal V'
R
= V
R
-V
M

Calcul de V
M
et t
M
:
On connat le dbit et les caractristiques de la colonne.
e = V
M
/ V
Int

V
M
= e V
Int

V
Int
= p d
int
2
L
V
M
= e p d
int
2
L
D = ( V
M
/ L ) u
u = D L / V
M
u : la vitesse moyenne dcoulement du solvant
t
M
= L / u = V
M
/ D
t
M
= V
M
/ D
t
M
= e p d
int
2
L / D
Application :
Le chromatogramme du Prozac (antidpresseur) a t enregistr dans les conditions
suivantes :

Chromatogramme du Prozac
HPLC. Colonne C18: 15cm x 4.6mm
Phase mobile: actonitrile / 25mM KH
2
PO
4
pH 7.0 (40:60)
Dbit: 2mL/min. Temprature: 30C
Dtecteur UV : 254 nm . Injection: 1L
t
M
= 1mn t
R
= 3mn t
R
= t
R
- t
M
= 2 mn
6

V
R
= t
R
D. = 3 2 = 6 ml
La
M
est caractrise par sa vitesse linaire u de dplacement dans la colonne de longueur L,
on a :
u = L / t
M
= 15 cm/mn)
V
M
= t
M
D. = 1 2 = 2 ml V'
R
= V
R
- V
M
= 4 ml
Les volumes et temps de rtention rduits sont indpendantes des volumes et temps morts,
elles dpendent donc moins de l'instrumentation (de la colonne).
7- Facteur de rtention k
Un compose de masse m
T
se repartit en m
M
dans la phase mobile et m
S
dans la phase
stationnaire. Si les conditions opratoires ne changent pas, m
M
et m
S
restent constantes au
cours de la migration dans la colonne. Leur rapport est indpendant de m
T
. Ce n'est pas une
constante.
k' = m
S
/ m
M
= C
S
. V
S
/ C
M
. V
M
= K
d
. V
S
/ V
M

avec le rapport de phase | = V
M
/V
S
: K
d
= | . k'
Si k' = 0, le solut migre aussi vite que le solvant; si k' = le solut reste sur la colonne.
On dmontre: k' = (t
R
- t
M
) / t
M
= t'
R
/ t
M
(donc K
d
= | . t
R
/ t
M
)

Remarque :
(2t
M
- t
M
) / t
M
= 1 donc si t
R
< 2t
M
alors k' < 1; lution trs rapide, difficile tudier.
Si k' > 20 ou 30; dure dlution trs longue.
En HPLC, la sparation est optimale pour 2 < k' < 10 afin que le temps de passage des
constituants ne soit pas trop long; k'=5=valeur "idale".
Le facteur de rtention exprime mathmatiquement la capacit plus ou moins grande de la
colonne retenir chaque constituant.
Pour une colonne donne V
S
et V
M
sont des constantes et le facteur de rtention ne dpend
donc que de la valeur de la constante de lquilibre de partage K
d
.
Il ne dpend en particulier ni du dbit, ni de la longueur de la colonne.
Si pour 2 analyses identiques (mme compos, mme phase mobile):
- on a 2 valeurs de t
R
identiques et 2 valeurs de k diffrentes, cela signifie qu'il y a une fuite
de phase mobile avant la colonne.
7

- 2 valeurs de t
R
et de k diffrentes indiquent des problmes au niveau de la phase mobile ou
de la phase stationnaire
Le facteur de rtention est dfinit suivant la relation : k = (t
R
-t
M
)/t
M .

K
d
varie avec la temprature T suivant l'quation classique , o G est la diffrence
d'nergie libre de dissolution du solut S entre les 2 phases. K
d
est >>1 donc G est
ngative.

En combinant cette expression avec l'quation
on trouve la relation entre le temps de rtention rduit et la temprature :

Plus G (dissol
m

s
) est petit (grand en valeur absolue), plus la constante d'quilibre
K
d
est grande, plus le produit est retenu sur la colonne, plus le t
R
est grand.
Daprs la figure prcdente, il apparat que pour avoir une sparation chromatographique, il
faut que :
G(dissol
m

s
) <0 soit G(dissol
s
) < G(dissol
m
) ou en valeur absolue
G(dissol
s
) > G(dissol
m
)
G(dissol
m

s
) est fonction de la temprature, en effet G = H - T S .
Si l'on suppose que H et S sont indpendants de la temprature, la formule
devient ln t
R
' = - H/RT + S/R - ln |+ ln t
M

Soit
8

o A et B sont des constantes pour un produit donn et une colonne donne.
Considrons deux tempratures T1 et T2 o T2>T1 avec les facteurs de rtention
correspondants k'1 et k'2, la formule) devient :

comme t'r
1
>t'r
2
, on voit que H est toujours <0.
Le temps mort tm, peut tre suppos indpendant de la temprature pour une colonne
donne et une pression donne.
En ralit, lorsque la temprature augmente, le mouvement brownien augmente, la viscosit
de la phase mobile diminue et sa vitesse augmente lgrement dans la direction de la colonne.
On observe exprimentalement une faible augmentation du temps mort avec la temprature.
EXERCICES D'APPLICATION
Les paramtres thermodynamiques des produits suivants ont t mesurs sur une colonne
capillaire ayant pour phase stationnaire un polysiloxane.
Les termes H et S correspondent aux variations d'enthalpie et d'entropie de dissolution
des produits entre la phase gazeuse et la phase stationnaire.
Quelle sera l'ordre d'lution de ces produits 120C ? Justifier votre rponse par un calcul
simple.
Dcane Butyl actate 1-Heptanol 1-Bromobutane
H Kj/mol -47,2 -34 -36.9 -31
S en u.e. -75.4 -58 -58 -51

8- Facteur de slectivit ou de sparation
Il dfinit la position relative de 2 pics, le pic du solut A sortant avant le pic du solut B: Il
est gal o = t
'
R(a)
/t
'
R(b)
= K
B
/ K
A
= k'
B
/ k'
A

pour le solut A: K
A
= [A]
S
/ [A]
M
et G
A
= RT.ln K
A

pour le solute B: K
B
= [B]
S
/ [B]
M
et G
B
= RT.ln K
B

G
B
- G
A
= RT. (ln K
B
-lnK
A
) = RT. (ln K
B
/ K
A
) = RT. ln o
G
B
- G
A
= RT. ln o
o = K
B
/ K
A
o = exp (G
A
- G
B
) / RT
Le facteur de slectivit mesure la diffrence de distribution thermodynamique des deux
composs.
9


La rsolution augmente quand augmente . La sparation n'est possible que si
=1.Le nombre de plateaux efficace (Nef ) ncessaires pour obtenir une rsolution donne en
fonction de
diminue trs vite quand > 1 (.Cette forte influence de justifie l'utilisation de phases
stationnaires ayant des groupements fonctionnels adquats.
exemple

facteur de rtention:
k'A = (tR - tM) / tM = t'R/ tM = 10/4 = 2,5
k'B = 15/4 = 3,75
facteur de slectivit ou de sparation:
o = t'R(B) / t'R (A) = 3,75 / 2,5 = 1,5
9- Facteur de rsolution

Il dfinit la plus ou moins bonne sparation de 2 soluts :

Pour des valeurs de Rs suprieures 1,5, les pics sont correctement spars.
On peut optimiser le facteur de rsolution en modifiant les dbits, les tempratures ou en
changeant de type de colonne.
10



Cette relation peut galement s'crire sous la forme

Plus Rs est grand, meilleure est la sparation
La rsolution va donc dpendre du nombre de plateaux N de la colonne, de la slectivit et
du facteur de rtention k.
On constate que R augmente si :
- on augmente le nombre de plateaux N
- on amliore la slectivit
- on augmente le facteur de rtention k