Rep0blica Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanalisis C8tedra: Ana|Isis Instrumental

Esquema Definici6n de Centrifugaci6n Principios Ffsico-Qufmicos 1. 2. . ESedimentaci6n: Principio de Arqufmedes Principio de Stokes Fuerzas que intervienen en el proceso 3. . EFuerza Centrffuga . EFuerza Centrfpeta . EFuerza Friccional Componentes de la Centrffuga 4. . ERotor . EMotor . EC6mara de Vacfo . EControl de Velocidad, Tiempo y Temperatura Variables que afectan la Centrifugaci6n 5. . EMasa y densidad de la partfcula . EDensidad del medio . EAceleraci6n de la gravedad . ECoeficiente de Difusi6n . ETiempo . ETemperatura . EPresi6n y Velocidad 6. Tipos de Centrffuga . ECentrffugas simples . ECentrffuga de alta velocidad . EUltracentrffugas . EMicr6fugas 7. Tipos de Centrifugaci6n . ECentrifugaci6n Analftica . ECentrifugaci6n Preparativa: Diferencial y en gradiente de densidad 8. Importancia de la Centrifugaci6n en la separaci6n y an6lisis de muestras.

7. Definici6n de Centrifugaci6n

Es un m6todo por el cual se pueden separar s6lidos de Ifquidos de diferente densidad mediante Una centrlfugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con Una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentaci6n del s6lido o de las partfculas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas las partfculas, por poseer masa, se ven afectadas por cualquier fuerza (origen de Una aceleraci6n). La centrifugaci6n impone, gracias a la aceleraci6n centrffuga, un efecto parecido aI gravitacional: Las partfculas experimentan Una aceleraci6n que las obliga a sedimentar. La centrlfugaci6n puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analftica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que en la segunda se procede aI anal|sis de las macromol6culas en Una ultracentrifugaci6n. Existen diversos m6todos de centrifugaci6n y una extensa variedad de t6cnicas derivadas de esta. El objetivo de la centrifugaci6n es separar partfculas de diferentes caracterfsticas. Para ello, se aplica un fuerte campo centrffugo, con lo cual las partfculas tender6n a desplazarse a trav6s del medio en el que se encuentren con la aceleracl6n G. G=velocidad angular2 angular + radio x radio de giro. O otra formula es G=velocidad

8.Principles Fisice-Qufmices Todas las partfculas suspendidas en un Ifquido tienden a separarse espont6neamente, en funci6n del tiempo de Una manera natural, por accl6n de un fen6meno llamado sedimentaci6n, debido a la gravedad terrestre. Un soluto suspendido en un Ifquido por accl6n de la gravedad terrestre se separa y pasa a ocupar el fondo del reciplente que la contiene, quedando el Ifquido en la parte superior. Principle de Arqufmedes: es un principio ffsico que afirma que un cuerpo total o parcialmente sumergido en un fluido est6tico, ser6 empujado con una fuerza igual aI peso del volumen de fluido desplazado por dicho objeto. De este modo cuando un cuerpo est6 sumergido en el fluido se genera un empuje hidrost6tico resultante de las presiones sobre la superficie del cuerpo que actua siempre hacia arriba a trav6s del centro de gravedad del cuerpo del fluido desplazado y de valor igual aI peso del fluido desplazado. Esta fuerza se mide en Newtons (en el SI) y su ecuaci6n se describe como:

FM - E - mg - (pf - ps ~Vg
Donde pf y ps son respectivamente la densidad del fluido y del s6lido sumergido; V el volumen del cuerpo sumergido; y g la aceleraci6n de la gravedad.

Principio de Stokes: Algunos de los principles b6sicos en la teorfa de la sedimentaci6n se derivan de la Ley de Stokes. Para simplificar el problema se suele considerar que las partfculas a aislar en Biologfa son esferas; cuando 6stas se encuentran en un campo gravitacional y alcanzan Una velocidad constante, la fuerza neta sobre cada esfera es igual a la fuerza de resistencia que opone el Ifquido a su movimiento. En este caso particular de la ley de Stokes se comprueba qu6: -La velocidad de sedimentaci6n de cada partfcula es proporcional a tamaho, -La velocidad de sedimentaci6n es proporcional a la densidad de partfcula y a la del medio, -La velocidad de sedimentaci6n es nula cuando ambas densidades igualan, -La velocidad de sedimentaci6n disminuye al aumentar la viscosidad medio, y -La velocidad de sedimentaci6n aumenta al aumentar el campo fuerza. su la se del de

Si las partfculas estan cayendo verticalmente en un fluido viscose debido a su propio peso puede calcularse su velocidad de cafda o sedimentaci6n igualando la fuerza de fricci6n con la fuerza de gravedad. V _ 2_ r2g(pp - pl )

' s9 h
donde:
Vs es

Ia ve|ocjdad de cajda de las particulas (velocidad limite) g es la aceleraci6n de la gravedad, pp es la densidad de las partfculas y pf es la densidad del fluido. 3. Fuerzas que intervienen en el proceso: Fuerza centrifuge: Es la que tiende a alejar los objetos del centro de rotaci6n mediante la velocidad tangencial, perpendicular al radio, en un movimiento circular. La fuerza centrffuga es Una de las fuerzas ficticias que parecen actuar sobre un objeto cuando su movimiento se describe segdn un sistema de referencia en rotaci6n. La fuerza centrffuga surge cuando analizamos el movimiento de un objeto desde un sistema de referencia no inercial, o acelerado, que describe un movimiento circular uniforme. La fuerza centrffuga sere el producto de la masa por la aceleraci6n centrffuga, en un sistema de referencia no inercia/. Fuerza centripeta: Se llama asf a la fuerza que tira de un objeto hacia el centro de un Camino circular mientras que el objeto sigue dicha trayectoria a Una rapidez constante (siendo la rapidez la maqnitud de la velocidad).

El t6rmino centripeta proviene de las palabras latinas centrum (centro) and petere (dirigirse hacia...), y puede ser derivada a partir de las leyes descubiertas por Isaac Newton. La fuerza centrfpeta siempre actua en forma perpendicular a la direcci6n de movimiento del cuerpo sobre el cual se aplica. En el caso de un objeto que se mueve en trayectoria circular con rapidez cambiante, la fuerza neta sobre el cuerpo puede ser descompuesta en un componente perpendicular que cambia la direcci6n del movimiento y uno tangencial, paralelo a la velocidad. Fuerza friccional: La fuerza de fricci6n a veces tambi6n es conocida como resistencia aI rozamiento. Esta es la fuerza friccional que se genera en la superficie del tubo de ensayo (con Una muestra) causada por el movimiento del aire alrededor de esta. Es por ello que las muestras en Una centrffuga deben estar en un tubo de ensaye grueso, y liso (lo mas estable posible), porque si no estos se romper(an. Esto ayuda a minimizar la fuerza de fricci6n. Sobre Una macromol6cula en soluci6n, sometida a un campo de fuerza centrffugo o gravitatorio, actuan tres fuerzas: la fuerza del campo, el empuje del solvente y la fuerza de fricci6n (las dos ultimas se oponen a la primera) . 4. Componentes de la centrifuge Una centrifuge es un dispositivo para separar partfculas en Una soluci6n de acuerdo a su tamaho, textura, densidad, viscosidad del medio y velocidad del rotor. Sus componentes son:

Rotor: Dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos

Rotor basculante: Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, aI girar el rotor, se coloca en disposici6n perpendicular al eje de giro. Asf pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro. *Rotor de engulo fijo: Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se situa paralelo aI eje de giro. Este tipo de rotores es tfpico de ultracentrffugas y se emplea en separaciones de mol6culas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio). Motor: Es el6ctrico y capaz de girar a docenas de miles de veces por minuto. Permite que la t6cnica sea ejecutada. Camare de Vacfo: Es Una pieza c6ncava que sirve para contener dentro de eIIa el rotor y su respectivo soporte que lo une o conecta con el motor. Control de Velocidad, Tiempo y Temperature: Regula la velocidad del dispositivo aI igual que el dispositivo regulador de la temperatura necesaria para la centrifugaci6n de las muestras. 5. Variables que afectan la Centrifugaci6n . EMesa y densidad de la partfcula SOn propiedades ffsicas caracterfsticas que pueden afectar directamente la centrifugaci6n. La masa es conocida como la cantidad de materia contenida en un cuerpo o sustancia; mientras que la densidad es la cantidad de masa contenida en un volumen determinado.

EDensidad del medio

LOS medios muy densos o pocos densos afectan a la centrifugaci6n. La sacarosa, si su concentraci6n aumenta, esto hace que aumente la densidad del medio y la viscosidad del mismo. Si el medio es mucho m6s denso afectara en la determinaci6n del aumento de la densidad del medio por la sacarosa.

EAceleraci6n de la gravedad

Se relaciona con la fuerza de atracci6n de la tierra sobre los objetos. Al aumentar la gravedad aumenta la velocidad.

ECoeficiente de Difusi6n

Es la facilidad con que cada soluto en particular se mueve en un solvente determinado. Esto depender6 de la consistencia del medio Ifquido.

ETiempo

La centrifugaci6n debe hacerse en el tiempo justo, ya que en el proceso se pierden elementos de gran importancia para el estudio.

ETemperature

B6sicamente lo mismo que en el tiempo. Esto tambi6n depender6 del tipo de an6lisis que se desea realizar.

Presi6n y Velocided La presi6n viene siendo la relaci6n que existe entre Una fuerza y la superficie donde se aplica. La velocidad, en cambio, la magnitud con la que se cambia a posici6n de un objeto. Ambas afectan a la centrifugaci6n ya que el aumento o disminuci6n de las mismas pueden hacer perder componente importantes de lo que se quiere analizar. 9.Tipos de Centrifuges: Centrifuges de beje velocided, de sobremese o clinices (simples) .:. Pequeho tamaho. .:. Sin refrigeraci6n. .:. M6xima velocidad: 5000 rpm. .:. OtiI para partfculas grandes (c6lulas, precipitados de sales insolubles. . .etc.) Centrifuges de elte velocided. .:. Velocidad entre 18000 y 25000 rpm. .:. Refrigeradas, algunas con sistema de vacfo. .:. Otiles en la separaci6n de fracciones celulares. .:. Insuficientes para la separaci6n de ribosomas, virus o macromol6culas. ultrecentrifugas. .:. Velocidad:

.:. Presentan sistemas de alto vacfo. .:. 2 tipos: - Analfticas: obtenci6n de datos precisos de propiedades de sedimentaci6n (s, PM). -Preparativas: aislamiento de partfculas de bajo S (microsomas, virus, macromol6culas).

a partir de 50000 rpm. sistemas auxiliares: sistemas de refrigeraci6n,

Micr6fugas: variante de las anteriores. .:. Velocidades altas: m6s de 10000 rpm y tubos cortos. .:. Voldmenes muy pequehos. .:. Otiles en Biologfa Molecular. 10.Tipos de Centrifugeci6n Centrifugaci6n Anelitice Se pretende es estimar propiedades ffsicas (coeficiente de sedimentaci6n o peso molecular) de alguna partfcula en concreto: sus propiedades hidrodin6micas. Para poder aplicar la tecnologfa cumplirse Una serie de requisitos: de la centrifugaci6n analftica deben

Que se aplique a sustancias lo m6s puras posible, no a grandes mezclas. Que presenten Una mayor capacidad de giro, en torno a las 100.000 r.p.m. En cuanto aI tipo de rotores, se necesita que las paredes del tubo se encuentren alineadas con las Ifneas de fuerza y est6n provistos de sistemas 6pticos capaces de detectar la sedimentaci6n de la partfcula en cada momento. Las mol6culas se observan en un sistema 6ptico durante la centrifugaci6n, para detectar las macromol6culas en soluci6n a medida que se mueven en el campo gravitacional. Las muestras se centrifugan en celdas con ventanas que se disponen en el piano paralelo aI sentido de giro del rotor. A medida que el rotor gira, las im6genes de la celda, se proyectan en un sistema 6ptico sobre un film o una computadora. La concentraci6n de la soluci6n en varios puntos en la celda se determina por la absorci6n de luz de la longitud de onda apropiada. Centrifugaci6n densidad Preparative: Diferencial y en gradiente de

El objetivo de la centrifugaci6n preparativa es aislar partfculas especfficas. Existen dos m6todos de separaci6n Diferencial y En gradiente de densidad. en centrifugaci6n preparativa:

Centrifuqaci6n diferencial: Es el m6todo m6s comdn de separaci6n, y es rara la purificaci6n enzim6tica que no lo utiliza. En este m6todo, el tubo de centrffuga se Ilena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugaci6n se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. El m6todo es bastante inespecffico, y a priori no se puede saber si la partfcula buscada quedar6 en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos; sin embargo es Una t6cnica muy util, sobre todo para aislamiento de c6lulas y org6nulos subcelulares. Centrifuqaci6n en qradiente de densidad: Este m6todo es algo m6s complicado que la centrifugaci6n diferencial, sin embargo presenta ventajas que compensan el trabajo aadido. La t6cnica no solo permite la separaci6n de varios, si no todos, los componentes de la muestra, sino que tambi6n permite realizar medidas analfticas. El m( todo de gradiente de densidad implica la utilizaci6n de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se situa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separaci6n de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugaci6n en gradiente de densidad: -Centrifugaci6n zonal: La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrffuga

Colocaci6n d muestra Separaci6n en funci6n de

Centrifugaci6lCentrifugaci6n is arte superior de u a muestra se disuelve e radiente de densida na soluci6n isocr6tica. reformado. Masa de la partfcula.Densidad de la partfcula.

las partfculas comenzar6n a sedimentar a trav6s del gradiente, Rep0blica Bolivariana de Venezuela movi6ndose cada partfcula a diferentes velocidades dependiendo de su Universidad del Zulia masa. Facultad de Medicina -Centrifugaci6n de equilibrio en gradiente o isopfcnica: Separa las Escuela de Bioanalisis partfculas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser C8tedra: Ana|Isis Instrumental cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y la centrifugaci6n Ilevada a cabo. Mientras en la centrifugaci6n zonal la densidad del gradiente no debe exceder a la de las partfculas a separar, en la centrifugaci6n de equilibrio en gradiente la condici6n fundamental es que la densidad m6xima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partfculas. La centrifugaci6n de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son id6nticas, por lo cual tambi6n se le llama centrifugaci6n isopfcnica. En este punto no se producir6 Una sedimentaci6n posterior debido a que flotan sobre un "colch6n" de material que posee Una densidad superior que la suya propia.

8. Importancia de la Centrifugaci6n en la separaci6n y ana|Isis de muestras. La centrifugaci6n es muy importante en el area de la salud, especfficamente es utilizada para obtener suero de sangre comp|eta y asf obtener del mismo resultados veraces. Muches de los an6lisis no necesitan de suero y pueden realizarse sin necesidad de la centrifugaci6n, pero en el caso de los an6lisis de hormonas, qufmica sangufnea, electrolitos, inmunologfa, serologfa, entre otros, se utiliza 6sta t6cnica.