LE CELLULE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

2-2.

LINFOCITI B

I linfociti B usano molecole di IgM come recettore per l'antigene. Lelemento chiave per la loro identificazione quindi la presenza sulla superficie (s) di molecole monometriche di IgM (sIgM). Numericamente, i linfociti B sIgM+ rappresentano il 10-15% dei linfociti del sangue periferico, > 50% dei linfociti splenici, > 50% dei linfociti linfonodali e circa il 10% dei linfociti del midollo osseo. La loro funzione rispondere all'antigene differenziando a plasmacellule anticorpo-secernenti. Gli anticorpi secreti dalle plasmacellule hanno una specificit identica a quella del recettore IgM presente sulla membrana del linfocita B da cui la plasmacellula deriva e che ha riconosciuto l'antigene. Le IgM si legano direttamente agli antigeni solubili e intervengono nella difesa contro le infezioni batteriche e nella fase extracellulare delle infezioni virali. La differenziazione B-Iinfocitaria antigene-indipendente La fase antigene-indipendente della differenziazione B-linfocitaria (Fig. 2.2) inizia dalla cellula staminale indirizzata in senso linfoide e termina con i linfociti B vergini che esprimono sIgM e hanno quindi acquisito il recettore per l'antigene.

Fig. 2-2 Questa fase porta alla generazione di un gran numero di linfociti B clonalmente diversi e si realizza attraverso tre processi complementari: 1) il riarrangiamento dei geni che codificano per le regioni variabili delle Ig e assicurano la specificit anticorpale; 2) un'imponente proliferazione policlonale; 3) la progressiva e ordinata espressione di una serie di markers di membrana, citoplasmatici e nucleari. Il riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline (Ig). Il momento fondamentale della differenziazione B-linfocitaria antigene-indipendente il riarrangiamento dei geni VH delle Ig (Fig. 2-3). Questo inizia, nell'uomo, sul cromosoma 14 con la traslocazione di uno o pi dei 20 geni D (diversity) accanto a uno dei 6 geni JH (joining) e la delezione del DNA compresa fra i due geni. La traslocazione DJ si verifica su entrambi i cromatidi del cromosoma 14, mentre le tappe successive si realizzano in uno soltanto dei due cromosomi 14, dove uno dei 50 o pi geni VH (variable) viene traslocato accanto al DJ e forma un complesso continuo VDJ in grado di codificare per l'intera regione variabile della catena pesante . Si forma cos un trascritto VHDJH-

C che viene prima elaborato con eliminazione delle zone ridondanti (splicing dello mRNA) e poi tradotto in una catena pesante . Se al primo tentativo su uno dei due cromosomi il riarrangiamento VDJ non produttivo e le traslocazioni geniche risultano in una trascrizione abortiva, la cellula effettua un secondo tentativo utilizzando il secondo cromosoma. Questo meccanismo di controllo preclude la possibilit che una singola cellula produca due diverse catene , ognuna con una diversa specificit anticorpale, e impedisce la dispersione della specificit di riconoscimento.

Fig. 2-3 Il primo riarrangiamento o riarrangiamento VDJ si verifica in cellule grandi e attivamente proliferanti. Il risultato finale del riarrangiamento testimoniato dalla presenza dei linfociti preB, cio di cellule che presentano nel citoplasma catene pesanti non accompagnate da alcuna catena leggera. I grandi linfociti pre-B differenziano a piccoli linfociti pre-B che smettono di proliferare e si dedicano unicamente alla differenziazione iniziando a riarrangiare i geni che codificano per le catene leggere secondo una ben precisa gerarchia (Fig. 2-4). Si inizia dalla catena e quindi da uno dei due cromosomi 2, con un riarrangiamento VJ che segue le stesse regole utilizzate dal cromosoma 14 per le catene H (la differenza l'assenza del segmento D). Un riarrangiamento produttivo VJ porta ad un adeguato trascritto e alla successiva traduzione di una catena leggera . In un terzo circa dei piccoli linfociti pre-B, il riarrangiamento VJ improduttivo sia sul primo che sul secondo cromosoma. Il processo prosegue quindi con il riarrangiamento di uno dei due cromosomi 22 (catene leggere ). La catena leggera ( o ) immagazzinata in vescicole del reticolo endoplasmatico dove si lega alla catena pesante . Le molecole di IgM complete vengono portate nella regione del Golgi e successivamente inserite nella membrana. Il linfocita pre-B cos diventato un linfocita B vergine sIgM+ che, attraverso il meccanismo di splicing dello RNA, produce anche IgD con la stessa specificit antigenica delle IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B maturi pronti per essere esportati negli organi linfoidi periferici sono quindi sIgM+, sIgD+.

Fig. 2-4 Nel feto, i linfociti pre-B sono identificabili a partire dalla 8a settimana di gestazione e la loro presenza precede di una settimana circa la comparsa dei linfociti B vergini sIgM+. I linfociti B sIgM+ vergini neoformati sono sensibili alla stimolazione del loro recettore sIgM, venendo inattivati, a differenza di quanto si osserva nei linfociti B pi maturi che vengono invece attivati dallo stesso trattamento. Questa peculiare caratteristica considerata uno dei possibili meccanismi attraverso i quali gli autoantigeni possono inattivare i linfociti B autoreattivi formatisi durante la differenziazione e indurre cos la tolleranza nei confronti del self. Secondo riarrangiamento o switch isotipico o commutazione di classe Raggiunto lo stadio di linfocita B maturo, una singola cellula B esprime contemporaneamente sulla membrana due diverse immunoglobuline: una con catena pesante ed una con catena pesante (B-IgM-IgD), ma entrambe caratterizzate dalle stesse regioni variabili, cio con lo stesso sito combinatorio e quindi la stessa specificit. Questo fenomeno reso possibile dal fatto che i geni per le catene pesanti C e C sul cromosoma 14 sono molto vicini e possono quindi essere trascritti entrambi insieme al complesso genico riarrangiato VDJ. Durante il procedimento di splicing enzimi provvedono a tagliare e ricucire la lunga molecola di RNA messaggero dando origine ai due messaggeri separati per la IgM e per la IgD (Fig. 2-5). Gli stadi successivi della maturazione del linfocita B sono sotto il controllo dell'antigene. Un antigene si lega ad un recettore immunoglobulinico, che , tra milioni e milioni di immunoglobuline di superficie, il sito combinatorio migliore per esso. Grazie a questa interazione, la cellula B che presenta quella peculiare immunoglobulina pu procedere molto pi a lungo nel processo maturativo, pu proliferare e formare un clone di linfociti B che producono anticorpi e conservano memoria per quell'antigene. Nel corso di questo processo maturativo una cellula B pu smettere la sintesi di IgM e IgD e, al loro posto, esprimere sulla membrana e secernere IgG o IgA o IgE. Per ogni singola cellula B ognuna di queste classi di immunoglobuline possibili ha una diversa regione costante nelle catene pesanti, ma presenta le stesse regioni variabili, quelle cio formate nella cellula precursore e che hanno costituito il sito combinatorio scelto poi dall'antigene. Dato che ogni catena pesante conferisce ad un anticorpo una differente funzione effettrice, la stessa regione variabile (o sito combinatorio) pu essere coinvolta in differenti tipi di reazioni immunitarie, ma sempre specifiche per quel determinato antigene. Il processo per cui una singola regione variabile pu venire associata a diverse regioni costanti delle catene H si chiama switch isotipico o commutazione di classe.

Fig. 2-5 Questo fenomeno dipende da due meccanismi: uno, come gi detto, basato sulla trascrizione differenziale del RNA e sul processo di splicing del RNA in punti diversi; il secondo utilizza un particolare riarrangiamento del DNA che codifica per le diverse catene pesanti. Sul cromosoma 14 i geni per la parte costante delle catene H sono rappresentati in una singola copia per classe o sottoclasse immunoglobulinica e sono disposti secondo la sequenza indicata nella figura 17A, da , fino ad ed 2. Pertanto, ai fini della sintesi di un anticorpo, ad esempio, della classe IgA2, il DNA viene riarrangiato in modo da escludere la sequenza genica da a , avvicinando il gene per 2 alla regione VDJ. In alternativa, viene trascritto un lungo RNA messaggero da cui viene eliminato il segmento copia della sequenza che va da fino ad . Il messaggero ricucito porter cosi l'informazione codificata dai soli geni V, D, J ed 2 (Fig. 2-6). Attualmente non si conoscono tutti i meccanismi che inducono una cellula B ad attuare lo switch isotipico. Tale evento pu avvenire in maniera apparentemente casuale anche nelle fasi precoci della maturazione dei linfociti B, in modo apparentemente indipendente dalla proliferazione indotta

Fig. 2-6 dall'antigene o dalle cellule T. Tuttavia, l'aiuto dei linfociti T, sotto forma di fattori solubili (citochine), importante per l'innesco e la guida dello switch (Fig. 2-7).

Fig. 2-7 Il processo di rimaneggiamento del RNA viene utilizzato dalla cellula B anche per differenziare la sintesi di Ig da esprimere sulla membrana o da secernere. Le molecole secrete, infatti, differiscono da quelle di membrana appartenenti alla stessa classe per un breve segmento alla porzione C-terminale delle catene pesanti. La molecola secreta ha una terminazione idrofilica,

mentre quella espressa in membrana ha un peptide aggiuntivo idrofobico di 20 aminoacidi che ne permette l'inserimento nella membrana lipidica. Per le IgM, ad esempio, i geni per la catena comprendono 4 porzioni od esoni, quanti cio sono i domain o regioni omologhe della catena pesante (Fig. 2-8).

Fig. 2-8 In prossimit dell'esone 4, codificata l'informazione sia per il frammento idrofilo (S) che per il frammento idrofobico (MI, M2). Entrambe queste sequenze vengono trascritte in un unico segmento di RNA, che poi viene tagliato e ricomposto in due distinti messaggeri, uno che porta l'informazione S per la sintesi di IgM secretorie ed uno che porta l'informazione M1-M2 per le IgM di membrana. La proliferazione. Studi cinetici hanno permesso di calcolare che, nel topo adulto, il midollo osseo produce ogni giorno da 10 a 50 x 106 nuovi linfociti B. Estrapolando questi dati all'uomo appare evidente l'imponenza proliferativa del compartimento B-linfocitario midollare, sufficiente a sostituire l'intero pool B-linfocitario periferico nell'arco di una settimana. La intensa attivit proliferativa midollare risponde ad una ben precisa esigenza. Infatti, la maggior parte dei linfociti B periferici non sopravvive pi di una settimana. Soltanto i linfociti B che entrano in contatto con l'antigene entro breve tempo dal loro arrivo negli organi linfoidi periferici possono dare origine ai linfociti B memoria. Questo detta l'ovvia necessit di un continuo ricambio. I markers nucleari e di membrana della differenziazione. Uno degli aspetti pi oscuri della differenziazione B-Iinfocitaria costituito dalle sue prime fasi. Nell'uomo stata identificata una serie di molecole la cui espressione coordinata al progressivo differenziamento B-linfocitario (Fig. 2-9). Le cellule che per prime vengono riconosciute come appartenenti alla linea B-Iinfocitaria esprimono sulla membrana molecole MHC di classe II e gli antigeni CDl9 e CD24, nel citoplasma l'antigene CD22 e nel nucleo l'enzima terminal-desossinucleotidil-transferasi (TdT). Queste cellule acquisiscono sequenzialmente sulla membrana (sempre prima che compaiano nel citoplasma molecole di Ig) il CDl0 (CALLA nella vecchia nomenclatura), il CD20 e il CD73. Il CDl9 la prima molecola B-

specifica a comparire sulla superficie delle cellule indirizzate lungo la linea B-Iinfocitaria e si mantiene durante tutte le fasi differenziative per essere persa soltanto a livello plasmacellulare. Anche se la sua funzione sconosciuta, la struttura molecolare e le analisi funzionali suggeriscono che il CDl9 sia implicato nei processi di attivazione e proliferazione cellulare.

Fig. 2-9 Il CDl0 un metallo-enzima associato alla membrana, pi precisamente una endopeptidasi neutra (NEP, neutral endopeptidase) che usa lo zinco come cofattore. Il CD20 implicato nel flusso ionico trans-membrana e svolge un ruolo nella attivazione e proliferazione B-linfocitaria.. Meccanismi che influenzano la produzione di linfociti B midollari. La produzione di altre linee cellulari derivate dalla medesima cellula staminale sotto il controllo di meccanismi adeguatamente caratterizzati. Ad esempio, l'eritropoiesi regolata dalla produzione di eritropoietina, i cui livelli dipendono a loro volta dal livello di emoglobina circolante. Al contrario, il livello di linfociti B circolanti non modifica l'entit della linfopoiesi B. L'unico fattore capace di modificare la B-linfopoiesi la stimolazione antigenica. Animali cresciuti in un ambiente privo di microrganismi (animali germ-free), riducono significativamente la produzione midollare di linfociti B, mentre, al contrario, animali cronicamente immunizzati presentano un netto incremento della produzione midollare di linfociti B. La possibilit che il microambiente giochi un ruolo nella differenziazione B-linfocitaria antigene-indipendente nasce da due considerazioni: 1) le altre cellule che derivano dalla stessa cellula staminale pluripotente vengono commissionate dalla spinta induttiva di fattori di crescita prodotti dal microambiente: ad esempio, la mielopoiesi regolata dai colony stimulating factors - CSF prodotti dalle cellule stremali del midollo; 2) negli uccelli, le cellule staminali che entrano nella borsa di Fabrizio si indirizzano lungo la linea B-linfocitaria soltanto quando vengono a contatto con l'epitelio della borsa stessa. I rapporti topografici tra precursori B-linfocitari e cellule stromali nel midollo dimostrano come lo sviluppo dei linfociti B sia strettamente dipendente dalla presenza di cellule aderenti (cellule epiteliali, fibroblasti, cellule dendritiche, cellule mononucleate) capaci di produrre una serie di fattori di crescita e differenziazione o citochine capaci di consentire il progressivo sviluppo maturativo dei linfociti B. La IL-3 e soprattutto la IL-7 forniscono un potente segnale proliferativo ai linfociti pre-B. Il destino dei linfociti B vergini. I linfociti B vergini neoformati emigrano dal midollo osseo e, utilizzando gli homing receptors, emergono negli organi linfoidi secondari. verosimile che homing receptors differenti condizionino selettivamente l'accesso a organi linfoidi periferici diversi. All'interno di questi i linfociti B occupano aree precisamente demarcate, note come aree B-dipendenti che sono la corticale esterna, i follicoli corticali primari e secondari, i cordoni della midollare. Queste aree hanno caratteristiche e funzioni diverse. I follicoli primari sono compatti agglomerati di linfociti B aggregati intorno a cellule follicolari dendritiche e sono privi di centro germinativo. I follicoli secondari sono caratterizzati dalla presenza dei centri germinativi, in cui ha luogo l'espansione clonale dei linfociti B attivati dall'antigene e la formazione di linfociti B memoria, e da un

mantello o corona in cui si accumulano i linfociti B memoria. Nei cordoni midollari si osserva la presenza di una grande quantit di plasmacellule, verosimilmente la progenie effettrice delle cellule proliferanti nei centri germinativi. La zona paracorticale l'area T degli organi linfoidi: al suo interno, i linfociti B sono pi rari e dispersi intorno alle cellule interdigitate. I linfociti B vergini vanno ad arricchire i follicoli primari e, all'interno di questi, riconoscono l'antigene localizzato sulla superficie delle cellule follicolari dendritiche. Questa interazione d origine alla proliferazione clonale il cui risvolto morfologico la formazione di centri germinativi. Una possibilit alternativa, su cui convergono numerose osservazioni sperimentali, che i linfociti B vergini neoformati vadano a localizzarsi primitivamente nella zona paracorticale T, dove l'antigene viene presentato dalle cellule interdigitate in presenza di linfociti T helper. . I linfociti B cos attivati cominciano a produrre Ig che si complessano con l'antigene e filtrano progressivamente nei follicoli. Qui migrano anche i linfociti B attivati e, essendo continuamente esposti all'antigene presente sulla superficie delle cellule follicolari dendritiche, si trovano nelle condizioni ottimali per proliferare, espandersi +clonalmente e differenziare a cellule B memoria o plasmacellule. La differenziazione B-linfocitaria antigene-dipendente Lo scopo della differenziazione B-linfocitaria antigene-indotta ottenere una popolazione amplificata che produca anticorpi capaci di reagire con l'antigene con la massima efficienza possibile. Questo risultato si ottiene attraverso tre fasi: a) l'attivazione, b) la proliferazione clonale dei linfociti B attivati, c) la differenziazione a linfociti B memoria e a plasmacellule secernenti anticorpi diretti contro l'antigene che ha innescato l'attivazione. La complessa serie di modificazioni biochimiche e strutturali proprie dell'attivazione Blinfocitaria ha luogo nei centri germinativi dei follicoli linfatici ed ha un corrispettivo morfologico nelle diverse popolazioni B che costituiscono i centri germinativi stessi: immunohlasti, centroblasti e centrociti. I linfociti B attivati perdono le IgD di membrana, riesprimono il CD10/NEP e acquisiscono il CD23, il CD38 ed i recettori per le citochine attive nella proliferazione B-linfocitaria. Tra questi, il recettore meglio definito il CD25, cio la subunit di 55 kD del recettore per la IL-2. L'imponenza dei fenomeni proliferativi documentata dal fatto che occorrono almeno 12 divisioni mitotiche prima che una cellula attivata emerga dal centro germinativo (Fig. 2-10). Per quanto riguarda la differenziazione, gli immunoblasti possano differenziare direttamente a plasmacellula oppure trasformarsi in centrociti, dai quali deriveranno i B memoria. La generazione di B memoria offre due vantaggi. Innanzitutto, assicura la presenza di una popolazione che vive a lungo, ricircola ed immediatamente pronta ad entrare in azione, qualora l'organismo dovesse nuovamente confrontarsi con lo stesso antigene (risposta secondaria). In secondo luogo, la generazione dei B memoria accompagnata da mutazioni somatiche puntiformi che possono interessare anche le regioni V e contribuire cos a migliorare l'affinit dell'anticorpo per l'antigene. I linfociti con queste mutazioni presentano un evidente vantaggio e vengono selezionati per l'espansione clonale e la sopravvivenza. Sono considerati linfociti B maturi i linfociti B del sangue periferico e i linfociti B dei mantelli dei follicoli linfatici secondari. I linfociti B maturi sono sIgM+, sIgD+, CD19+, CD20+, CD22+ e presentano sulla membrana le strutture recettoriali necessarie alla vita di relazione: recettori per il frammento Fc delle IgG e le integrine della famiglia LFA-l. Tra i recettori dei linfociti B maturi hanno particolare importanza i recettori per determinati frammenti del complemento (C3d = CD21 e C3b = CD35); in particolare il CD21 ha anche un sito di legame per il virus di Epstein-Barr. quindi comprensibile come certi microrganismi e i loro prodotti (proteina A dello stafilococco, lipopolisaccaridi dei batteri Gram) possano legarsi ai linfociti B e stimolarli anche aspecificamente.

Fig. 2-10 La differenziazione a plasma cellula basata sullo switch isotipico (commutazione di classe), cio sulla giunzione del segmento VDJH al segmento genico CH di un altro isotipo. Questo comporta la sintesi di anticorpi con la stessa specificit antigenica delle sIgM del linfocita B di cui costituiscono la progenie, ma di isotipo diverso, il che conferisce all'anticorpo secreto propriet biologiche nuove e pi vantaggiose dell'isotipo IgM nel manipolare l'antigene. Le plasmacellule sono organizzate per produrre Ig in modo massimale; le Ig costituiscono oltre il 40% delle proteine da esse prodotte, cosicch una singola plasmacellula pu secernere migliaia di molecole di Ig al secondo. Le plasmacellule sono cellule generalmente terminali ed hanno una vita media di pochi giorni. I dati ottenuti nei pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo suggeriscono per anche l'esistenza di una popolazione di plasmacellule a lunga vita (> 1 anno). Una caratteristica importante delle plasmacellule la quasi totale assenza di molecole di membrana: hanno infatti perso le sIg, le molecole MHC di classe II e tutti i CD linfocitari Bspecifici e B-associati, tranne il CD38. La perdita delle strutture di membrana che consentono ai linfociti la vita di relazione assicura alle plasmacellule la possibilit di svolgere indisturbate la propria funzione (sintesi predeterminata di anticorpi), senza l'interferenza di segnali provenienti dall'esterno. La trasformazione da cellula sIg+ antigene-responsiva in plasmacellula sIganticorpo-producente passa attraverso lo stadio di plasmablasto (od immunoblasto). I plasmablasti secernono attivamente Ig anche se in quantit molto minore rispetto alle plasmacellule mature: tuttavia, i plasmablasti sono i principali produttori di Ig durante le fasi precoci della risposta immunitaria. Sottopopolazioni B-linfocitarie nell'uomo Una piccola percentuale di linfociti B circolanti presenta sulla membrana molecole di IgG o IgA da sole o accompagnate alle classiche IgM e/o IgD. Esiste anche una certa eterogeneit per

quanto riguarda la espressione dei diversi recettori per il frammento Fc delle Ig (, , , ). Non c' tuttavia alcuna evidenza che l'isotipo di membrana od il tipo di recettore Fc riflettano una diversa attivit funzionale. Lo stesso dicasi per talune differenze nella espressione di alcuni CD di membrana tra i linfociti del sangue periferico e quelli tessutali: tali differenze sono in genere quantitative e non qualitative. L'unica popolazione B-linfocitaria che pu aspirare al ruolo di sottopopolazione rappresentata dai linfociti B CD5+, cos definiti per la presenza sulla membrana del marcatore CD5, originariamente considerato T-specifico perch espresso da > 98% dei linfociti T. La molecola CD5 altamente conservata nella filogenesi ed i linfociti B umani CD5+ hanno almeno due aspetti particolari: a) l'ontogenesi ha caratteristiche uniche: i linfociti B CD5+ compaiono nei linfonodi (e nella milza) fetali intorno alla 17a-18a settimana di vita e si localizzano nei follicoli primari dove costituiscono oltre il 60% dei linfociti B, mentre non si osservano mai nel midollo osseo. verosimile che i linfociti B CD5+ derivino direttamente dal fegato fetale e abbiano la capacit di automantenersi. Nell'adulto, i linfociti B CD5+ sono circa il 10-15% della popolazione B-linfocitaria totale e sono elementi prevalentemente sessili, localizzati ai margini dei centri germinativi dei follicoli secondari; b) l'attivit funzionale peculiare: i linfociti B CD5+ normali producono spontaneamente autoanticorpi, soprattutto fattore reumatoide ed anticorpi anti-DNA a singola elica (ss-DNA). L' ontogenesi della risposta B-linfocitaria Lo switch isotipico comincia gi durante la vita embrionale, cosicch il neonato presenta un repertorio B-linfocitario completo con linfociti B capaci di differenziare a plasmacellule secernenti IgM, IgG od IgA. Tuttavia, una risposta anticorpale di tipo adulto viene acquisita soltanto dopo parecchi anni: livelli adulti di IgM sono raggiunti all'et di un anno, di IgG all'et di 5-7 anni e di IgA non prima della pubert. Analogamente, la risposta ai diversi tipi di antigene acquisita sequenzialmente. La risposta alla maggior parte degli antigeni proteici (generalmente T -dipendenti) presente gi nel neonato. Al contrario, la risposta agli antigeni polisaccaridici (spesso T-indipendenti) acquisita pi tardi, per cui abitualmente i vaccini polisaccaridici sono inefficaci prima dei due anni di et. L'acquisizione progressiva di una risposta B-linfocitaria adeguata dipende verosimilmente dal fatto che il pool dei linfociti B memoria si sviluppa gradualmente ed altrettanto gradualmente procede la maturazione dei linfociti T. In ogni caso, la relativa immaturit della linea B-linfocitaria alla nascita pu contribuire all'aumentata suscettibilit dei neonati a certe infezioni.