IMPORTANCIA NUTRICIONAL DE ALIMENTO VIVO

En los ecosistomas naturales acuticos, la continuidad de las especies depende del equilibrio establecido entre los diferentes niveles de la trama trfica. As, el desarrollo y supervivencia de larvas y juveniles depende de la presencia de organismos que conforman el fitoplancton y el zooplancton, quienes a su vez se producen en presencia de los nutrientes adecuados. Es de gran importancia el conocer la composicin qumica de los alimentos vivos, pues el utilizar un recurso pobre en nutrientes esenciales puede causar el desarrollo anormal y muerte masiva de las especies en cultivo. Existen estudios que as lo demuestran, como es el caso del desbalance nutricional que causa el uso de la levadura Saccharomyces sereviceae en la produccin masiva de larvas de especies marinas (Hirata, 1980). Se han hecho una gran cantidad de estudios para conocer la composicin de las especies de alimento vivo ms utilizados en Acuacultura en diferentes condiciones y con diferentes tipos de nutrientes (Tablas 3 y 4). Estos trabajos han revelado que el contenido nutricional de estas especies est en funcin directa de su alimento (Fogg, 1975; Watanabe et al., 1978a, 1983; Hirata et al., 1985). De acuerdo a lo anterior, es importante conocer y manejar las diferentes tcnicas de cultivo del alimento vivo para establecer las condiciones ms adecuadas, que permitan el obtener un alimento de alto contenido nutricional principalmente ricos en aminocidos y cidos grasos esenciales entre otros nutrientes, que favorezcan el desarrollo y supervivencia de las diferentes especies de crustceos, moluscos y peces que se obtienen por Acuacultura (Tabla 5 y 6). Existen diferentes tcnicas que permiten obtener este enriquecimiento que van desde la manipulacin de parmetros fsicos (Tabla 2), como son la temperatura y el fotoperodo; los parmetros qumicos como la concentracin y tipo de macronutrientes, y hasta la adicin de fuentes orgnicas (aminccidos, vitaminas, etc.) en bajas concentraciones. TABLA 3 COMPOSICION GENERAL DE ALGUNAS MICROALGAS UILIZADAS EN ACUICULTURA (Fogg, 1975) PROTEINA CARBOHIDRATO GRASA Tetraselmis 1.42 0.41 0.70 Dunaliella 1.43 0.80 0.15 Monochrysis 0.94 0.59 0.22 Chaetoceros 1.12 0.22 0.21 Skeletonema 1.38 0.79 0.17 Phaeodactylum 0.88 0.64 0.17 La composicin celular reportada, corresponde a resultados de cultivo en condiciones fsicoqumicas y nutricionales similares para las seis espcies (las cantidades de protena, carbohidratos y grasas estn expresadas en relacin a cantidad total de Carbono).

TABLA 4 COMPOSICION PROXIMAL Y MINERAL DE CINCO ESPECTES DE ALIMENTO VIVO DE MAYOR USO EN ACUACULTURA* ESPECIE S Brachionus plicatilis Tigriopus japonicus Acati Daphni a a sp sp 88.1 8.5 1.3 2.1 0.39 0.76 1.48 6.63 2.21 11.5 39.0 0.2 2.8 89.3 7.5 1.4 0.7 0.21 0.12 1.46 0.74 0.72 72.2 12.8 13.2 1.1 Moina sp LEVADUR A 87.2 8.8 2.9 0.12 0.12 1.85 1.09 0.92 46.4 10.0 0.5 5.8

MEDIO LEVADUR LEVADUR LEVADUR Chlorell DE A+ A+ A a CULIVO Chlorella Chlorella Humedad 89.6 Protenas 7.2 Lpidos Ceniza Ca mg/g P mg/g K mg/g Fe g/g Zn g/g Mn g/m Cu g/g 2.3 0.4 0.12 1.48 0.35 15.9 7.4 0.4 1.1 89.1 7.9 2.3 0.4 0.26 0.17 1.44 0.30 0.12 52.5 9.8 1.1 1.5 87.6 7.8 3.8 0.5 0.21 0.14 1.37 0.29 0.23 43.3 8.2 1.1 1.7 87.3 9.0 2.8 0.5 0.15 0.23 1.31 0.61 0.84 33.8 12.3 1.0 2.4

Mg mg/g 0.14 Na mg/g 0.41

* Watanabe et al., 1983.

TABLA 5. COMPOSICION DE AMINOACIDOS ESENCIALES EN CINCO ESPECIES DE ZOOPLANCTON DE MAYOR USO EN ACUACULTURA Artenia sp nauplios Isoleucina Leucina Metionina Cistina Tirosina 2.6 7.4 0.9 2.6 0.4 1.1 99 Brachionus Acartia clausi plicatilis 3.4 8.8 117 3.5 8.8 39* 1.5 3.8 59* 0.8 2.0 123 3.6 9.0 Tigriopus japonicus 89 Moina spp 2.5 6.6 88 50* 59* 100 135

117 2.5 6.7 70 74 98 1.1 2.9 0.7 1.9 3.5 9.3

6.1 17.3 128 6.1 15.8 117 5.5 13.8 102 5.0 13.3 99 48* 0.8 2.1 41* 0.6 1.6 96 70 98

6.0 15.9 118 0.6 1.6 3.6 9.5

54* 1.0 2.7

Fenilalanina 3.2 9.1

3.9 10.1 106 3.7 9.3

3.7 10.5 162 3.1 8.0

138 4.0 10.7 165 3.3 8.8

Treonina Triptofano Valina Lisina Arginina Histidina

1.7 4.8 1.0 2.8 3.2 9.1

45* 3.2 8.3 165 1.2 3.1 96

78

4.2 10.5 99

3.8 10.1 95 93

3.8 10.1 95 188 89 3.2 8.5

182 1.1 2.8

165 1.1 2.9

171 1.2 3.2

4.2 10.9 115 4.5 11.3 119 3.3 8.8 5.4 13.5 80 1.9 4.8

6.1 17.3 103 6.1 15.8 94 1.3 3.7 * ** 77 *** 1.5 3.9 81

5.7 15.2 90 90

5.8 15.4 92 1.6 4.2 88

5.0 14.2 122 4.6 11.9 103 4.3 10.8 93

5.2 13.9 120 5.1 13.5 116

100 1.6 4.3

* g/100 g protena cruda (Watanabe et al., 1978a) ** Expresado como total de aminocidos esenciales (a.a.e.) *** Registros basados en la composcin con a.a.e. requeridos para peces -el 100 indica los mismos requerimientos TABLA 6. ORGANISMOS MARINOS CULTIVADOS CON MICROALGAS EN JAPON (U. UMEBAYASHI, 1975) ESPECIE SUPERVIVEN MICROAL CONCENTRACI PRODUCCI REFERENCI CULTIVA CIA GA ON ON A DA % BIVALVOS 3,000 Ostrea Chaetoceros cel/da/larva 14,000 Sato & edulis calcitrans (estadio org/200 l Takeda. 1970 temprano) Monochrysi 10,000 s lutheri cel/da/larva Andara Chaetoceros 10,000 40,000 cel/ml 59.3% Ito et al., broughtonii calcitrans org/35 l 1968 Monas sp 10,000 cel/ml Meretrix Chaetoceros 30,000 cel/ml 20% Tanaka, 1968 lamarckii calcitrans Nitzschia 50,000 cel/ml closterium Spisula Chaetoceros 30,000 a 150,000 Akimoto et sachalinensi 100,000 org 61% calcitrans cel/ml al., 1964 s Patinopecte Chaetoceros 20,000 cel/ml 88% Takeda, 1965 n yezoensis calcitrans Skeletonem 20,000 cel/ml a costatum Ostrea Chaetoceros 12,000 2,000 cel/ml 4% Imai, 1967 edulis calcitrans org/ton

Monochrysi 15,000 cel/ml s lutheri CRUSTACEOS Penaeus Skeletonem 10,000 cel/ml japonicus a costatum Penaeopsis Skeletonem monoceros a costatum Chaetoceros calcitrans

56% 25% (naupliopostlarva)

Hudinaga, 1962 Funada, 1966

CULTIVO DE MICROALGAS
Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde organismos auttrofos hasta microflagelados y microciliados auxtrofos. Su posicin taxonmica ha sido de gran polmica entre botnicos y zologos, como ejemplo podemos mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros como protozoarios. En este trabajo no pretendemos apoyar o rechazar ninguna de las lneas en relacin a la sistemtica taxonmica pero mencionaremos los ejemplos ms representativos por su importancia en acuacultura de acuerdo con la clasificacin que se muestra en la Tabla 1, seguida por Guillard, 1973, 1975; Hirata, 1974 y Watanabe et al., 1978. Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustceos y moluscos, adems de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en produccin a gran escala con fines comerciales. 1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS Muchos factores contribuyen para el desarrollo ptimo de los cultivos de microalgas, algunos de stos afectan las caractersticas del crecimiento. Los recipientes de cultivo ms comnmente usados son de materiales no txicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plstico, madera y concreto son los ms recomendables, incluyendo los estanques rsticos en reas rurales son los sistemas ms econmicos. En cultivos masivos la aereacin es un factor muy importante para la homogenizacin de los nutrientes y para evitar la sedimentacin de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, sto tambin depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento.

Otro factor importante es la penetracin de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetracin de la luz es ms efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyeccin de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosinttico. Para muchas especies de Diatomeas la temperatura ptima oscila entre los 15 y 20C, pocas especies de esta familia crecen a ms de 28C, las cloroficeas pueden soportar altas temperaturas; un ejemplo es el cultivo masivo a la intemperie de Chlorella saccharophila, cuyas temperaturas oscilan entre 12.5 30C (Hirata et al., 1974, 1975, 1977; Torrentera, 1983). El crecimiento y la divisin celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperodo (horas de iluminacin y obscuridad) en relacin tambin a la temperatura, por ejemplo en Diatomees a 20C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable.

TABLA 7. CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE ALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983) GENERO Phaeodactylum (diatomea) Skeletonema (diatomea) Dunaliella (cloroficea) Chlorella (cloroficea) Tetraselmis (cloroficea) Monochrysis (crisoficea) Isochrysis (crisoficea) CICLO 10 h 13.1 h 24 h 7.7 h 18 h 15.3 h 30.2 h TEMPERATURA DIAMETRO OPTIMA MEDIO 25C 18C 16C 25C 18C 2025C 20C 10.4 >20 17.8 5 18.4 10 10.2

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, adems de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duracin del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son suceptibles de variacin mediante seleccin de variedades. TABLA 8. REQUERIMIENTOS PRINCIPALES DE LOS

Fsicos

CULTIVOS DE MICROALGAS COMPUESTOS REQUERIMIENTOS VALORES QUIMICOS 2,000 Luz 4,000 lux Temperatura 15 22C 0.37 Salinidad 79 CO2CO3 O2H2O N2NH4+ NO3 PO4 SO4 g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml mg/100 ml g/100 ml g/100 ml

pH Redox Nutritivos C O, H N P S

Na, K, Ca, Mg Sales Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Sales Al, et B12, tiamina, Vitaminas biotina

En esta tabla se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habr que estudiar los reqerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son slo orientacin (Kinne, 1979). El fotoperodo es un factor que regula la divisin celular, en diatomeas la reproduccin asexual (divisin) ocurre durante el perodo de luz y ste es acelerado bajo iluminacin continua. En contraste las especies formadoras de auxosporas (sporas sexuales), dan lugar a clulas del mismo tamao y sto ocurre en el perodo de obscuridad. Por lo tanto, el perodo de iluminacin puede ajustarse de acuerdo a los objetivos del cultivo: el fotoperodo continuo (horas de iluminacin prolongada) produce crecimientos rpidos, un fotoperodo con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperodo solar mantiene un crecimiente normal y saludable. En la Table 7 se muestran las caractersticas de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutricin de moluscos y crustceos. Adems del control de los parmetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de produccin de alimento vivo es importante el dominio de las tcnicas de aislamiento, purificacin y mantenimiento de cepas, as como el conocimiento de la fisiologa, ciclo de vida, bioqumica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para

poder llevarse a niveles masivos de produccin para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas. 2. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las frmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta sta, y el tiempo de almacenamiento de la misma. Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales frmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta frmulas especficas para familias como la frmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de produccin masiva (minerales, enriquecidos y orgnicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del medio. En trminos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades. Existen otros medios que incluyen en su composicin sustancias orgnicas (vitaminas, aminocidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxtrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.

TABLA 9. MEDIO CHU 10 (MODIFICADO POR GERLOFF) (0. UMEBAYASHI, 1975) (Recomendado para aislamiento de microalgas de hbitats oligotrficos y eutrficos) Ca(NO3)2 K2HPO4 Na2CO3 MgSO4.7H2O Na2SiO3 Citrato de Fierro Amoniacal 0.04% 0.01% 0.02% 0.025% 0.025% 0.005%

NOTA: Puede usarse para medio solidificado Agar-Agar 1.0%

TABLA 10. MEDIO ENRIQUECIDO MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910) Solucin KNO3 20. 2 g A: H2O 100 ml Solucin Na2HPO412H2O 4g B: CaCl26H2O 4g HCl conc. 2 ml FeCl3 2 ml H2O 80 ml Agregar 2 ml de la Solucin A y 1 ml de la Solucin B a un litro de agua de mar natural, y calentar a 70C por 20 minutos. MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b) NaNO3 10 mg Na2HPO412H2O 2 mg Extracto de suelo 5 ml Agua de mar 100 ml MEDIO ERD-SCHREIBER *Agua de mar 1 litro Extracto de suelo 50 ml NaNO3 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.03 g * Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada,y adicionar los ingredientes. TABLA 11. MEDIO DE YASHIMA (SISFFAA, 1964a) (Para cultivo masivo de cloroficeas marinas) Sulfato de Amonio (para la agricultura 21%) 100 g/t Superfosfato de Calcio (para la agricultura 15 g/t 21%) Urea (para la agricultura 21%) 15 g/t 3050 Clewat 32 g/t Componentes de Clewat 32: 0.385 FeCl2 (como fuente de Fe) % 0.166 ZnCl2 (como fuente de Zn) % MnCl2 (como fuente de Mn) 0.775 %

0.017 % 0.007 CuSO4 (como fuente de Cu) % 0.632 (NH4)6Mo7O24 (como fuente de Mo) % 2.470 H3 BO3 (como fuente de B) % 0.005 EDTA % MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975) Medio de Yashima (en la misma concentracin) Peptona 50 g/t 0.005 Peptidasa % 0.005 Diaminasa % (recomendado para cultivos axnicos) CoCl2 (como fuente de Co) TABLA 12. YANASE & IMAI (1968) PARA Monochrysis lutheri, Platymonas sp., Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans NaCl KC1 NaNO3 MgSO4 . 7H2O Ca (as Cl-) K2HPO4 18 mg 600 mg 500 mg 5g 100 mg 30 mg Metal Mix* Fe (as Cl-) Tris Vit.B12 Na2 SiO3 Vitamin Mix H2O 30 ml 100 g 1g 3g 80 mg 1 ml 1l

* Mezcla de metales 100 ml, contanido: Na2 EDTA, 100 mg; Fe, 1 mg; Zn, 0.5 mg; Mn, 4 mg;Co, 0.01 mg; Cu, 0.004 mg; B, 20 mg. Mezcla de vitaminas 50 ml, contenido: B12, 10 g; biotina, 50 g; B1, 5 mg TABLA 13. MEDIO DE GUILLARD & RHYTER (PARSONS & STRICKLAND, 1961) A. SOLUCIONES NUTRIENTES 1. Disolver 0.08 gr de clorhidrato de Cobalto CoCl2.6H2O y 0.8 gr de Sulfato de Cobre CuSO4.5H2O; en 100 ml de H2O destilada. 2. Aadir 1 ml de solucin A.1. a aproximadamente 800 ml de H2O destilada, que previamente se le ha adicionado:

3. 4. 5. 6. 7. 8.

0.2 gr de Tricloruro Frrico FeCl3.6H2O 0.06 gr de Sulfato de Zinc ZnSo4.7H2O 0.12 gr de Sulfato de Manganeso MnSO4.H2O 0.03 gr de Molibdato de Sodio Na2MoO4.2H2O Aadir 1.2 gr de Etilenodiaminotetracetato Disdico (EDTA) diludo a cerca de 900 ml de H2O destilada. Ajustar el pH de la solucin con Hidrxido de Sodio IN-Na(OH), hasta 7.5. Evitar la formacin de precipitado, el cual puede elevar la adicin de mucho alcali. Aadir 10 gr de Nitrato Potsico KNO3 y 1.4 gr de Fosfato Dihidratado de Potasio KH2PO4. Diluir la solucin a 1 litro y en autoclave a menos de 15 libras de presin por 15 minutos. Guardar la solucin en botellas de vidrio en la obscuridad. B. SILICATO DE SODIO

1. Disolver 10.5 gr de Metasilicato Pentahidratado de Sodio Na2SiO3.5H2O 14 gr de Na2SiO3.9H2O en 1 litro de agua destilada. 2. Esterilizar la solucin por filtracin a travs de un filtro de vidrio. 3. Guardarla en un envase de polipropileno esterilizado. C. ACIDO HIDROCLORHIDRICO 1. Preparar una solucin 0.1N-HCL. 2. Determinar por titulacin la cantidad de esta solucin necesaria para neutralizar 10 ml de la solucin B.2-Si ml de 0.IN-HCL han sido utilizadas para neutralizar 10 ml de solucin B.2, multiplicar por 100 y esta cantidad llevarla a 1 litro de H2O destilada. 3. Esterilizar la solucin cida por filtracin a travs de un filtro de vidrio. 4. Guardarlo en una botella de polipropileno esterilizado. D. SOLUCION DE VITAMINA 1. Disolver 10 mg de Tiamina hidroclrica y 10 mg de Biotina en 100 ml de H2O destilada. 2. Diluir 10 ml de solucin D.1 en 100 ml de H2O destilada. 3. Esterilizar solucin D.2 pasndola a travs de un filtro de vidrio. 4. Guardarla en porciones de 10 ml en tubos estriles de tapa enroscada a menos de 20C. TABLA 14. MEDIO DE GUILLAR F/2 (J. STEIN, 1979) Nutrientes Mayores NaNo3 7.5 NaH2PO4.H2O 0.5 NH4Cl 2.65 Solucin Primaria % w/v % w/v % w/v

Na2SIO3.9N2O 3

% w/v (calentar para disolver)

Usar un mililitro de estas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio F/2. Sugerencia: Preparar el NaNO3 junto con NaH2PO . H2O en 100 mililitros. Metales Traza CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MnO4.2H2O Solucin Primaria 0.98 % w/v 2.2 % w/v 1.05 % w/v 1.0 % w/v 18 % w/v 0.63 % w/v

Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual. y con una concentracin menor de 106 ms concentrada que en el medio F/2. Solucin Primaria de Metales Traza A. Con Secuestrante Frrico (Cloruro Frrico): Disolver 5 gr del Secuestrante Frrico en 900 ml de agua destilada y aadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente; aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. Use 1 ml de esta solucin por cada litro de agua de mar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5, 10, etc.) y de ser posible irradiada con UV. B. Con EDTA y Cloruro Frrico (FeCl.6H2O) Disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O 4.36 de EDTA (Na2) en 900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza y afore a 1 litro, asegure un pH de 2.0. Use 1 ml de esta solucin por litro de agua de mar para preparar el medio f/2. Solucin Primaria de Vitaminas

Solucin Primaria de Biotina: Se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de biotina en 96 ml de agua destilada. Haga esta solucin ligeramente cida para ser autoclavada y mantngase en un congelador. Solucin de Bitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 1000 mg/ ml solucin inyectable. Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solucin se acidifica para ser autoclavada y se congela.

Solucin Primaria de Vitaminas

Tomar 1 m de la solucin primaria de Biotina y 0.1 ml de la solucin stock primaria de B12, aforar a 100 ml con agua destilada y aadir 20 mg de Tiamina HCl. Se pueden preparar ampolletas de 2, 5 10 ml y almacenarlas estriles (acidificas) en el congelador. Use ml de esta solucin por cada litro de agua de mar para preparar el medio f/2.

Preparacin del Buffer Tris Tome 50 g de Tris y disulvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCL. Use de 1 a 5 ml por litro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH del medio es 7.98.2). TABLA 15. MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE) (Guillard, In: Stein, 1979) Guillard (comunicacin personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp. a. Macronutrientes: CaCl2.2H2O 36.76 g/l MgSO4.7H2O 36.97 g/l NaHCO3 12.60 g/l K2HPO4 8.71 g/l NaNO3 85.01 g/l Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l De esta solucin rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. b. Micronutrientes: Na2EDTA 4.36 g/l FeCl3.6H2O 3.15 g/l CuSO4.5H2O 0.01 g/l ZnSO4.7H2O 0.022 g/l CoCl2.6H2O 0.01 g/l MnCl24H2O 0.18 g/l Na2MoO4.2H2O 0.006 g/l De esta solucin rotulada como b, se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.

c. Vitaminas: Thiamine. HCl 0.1 mg/l Biotin 0.5 g/l Cyanocobalamina 0.5 g/l De esta solucin rotulada como c, se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. d. Tris: Tris 50.g/200 (Hydroxymethyl)ml H2O Aminomethano dest. (Cuando el cultivo se encuentra axnico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De esta solucin rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se est preparando el cultivo. Una vez preparado el medio de cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadsamente para no obtener el pH cido. TABLA 16. MEDIO MET 44 (SCHONE & SCHONE, 1982) (Para microalgas marinas de la Familia Bacilarioficea) NaNO3 3.4 mg Na2HPO4.12H2O 0.925 mg Na2SiO3.9H2O 10.14 mg Na2EDTA.2H2O 0.803 mg FeSO4.7H2O 60.0 g MnCl2.4H2O 14.4 g Vitamina B12 0.5 g Biotina 0.5 g Tiamina-HCl 0.5 g Para enriquecer un litro de agua de mar NOTA: La solucin stock de Fierro y Silicato debe de acidificarse un poco con una gota de Acido Sulfrico concentrado, y la solucin de EDTA debe acidificarse con Acido Clorhdrico. El EDTA puede ser adicionado antes que el Fierro. Para la produccin de microalgas a nivel comercial se usa el agua de mar enriquecida con fertilizantes agrcolas (Urea, Fosfato triple, Nitrato de Amonio, etc.) (Chu, 1942, y

Tamiya, 1957; SISFFAA, 1964a) y tradicionalmente la fertilizacin de estanques con abonos orgnicos, en cultivos de especies herbvoras como las carpas. 3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION Muchos mtodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecficos (de una sola especie) y axnicos (libres de contaminantes). A continuacin se brinda una breve descripcin de algunos de los principales mtodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1). 1) Aislamiento

Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10, mediante una pipeta construda con un tubo capilar, a travs del microscopio ptico se pesca las clulas y se separan en pequeas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados. Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeas gotas de plancton con una asa de siembra, extendiendo por estras (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solucin nutritiva para microalgas y con una relacin de 1 1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminacin a 1820. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estras o bien, se transfiere a medios lquidos en subcultivos sucesivos para su purificacin, de tal manera que en cada dilucin se reduzca el nmero de organismos en una gota, es recomendable combinar la tcnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtenr cultivos clonales (de una sola colonia o clula) y poder establecer el cultivo monoespecfico. Despus de 10 das, pequeas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Mtodo de Hocking o de la micropipeta a medios lquidos.

2) Purificacin Como ya se mencion al describir las tnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el ultivo a travs de las resiembras clonales sucesivas, pero adems es recomendable entre otros mtodos el uso de antibiticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estn contaminando el cultivo de microalgas de nuestro inters. En el inciso 5 de este mismo captulo correspondiente a Mtodos de Esterilizacin se amplian las alternativas. 3) Control Bacteriolgico Para determinar el desarrollo bacteriolgico realizamos lo siguiente: 1. Preparacin del Medio de Zobell: Trypticase Extracto de levadura Fosfato Frrico Agar Agua envejecida (3 meses)

1.0 gr 1.0 gr 5 mg 15.0 gr 1 litro

pH = 7.0 7.2

Fig. 1a) Mtodo de filtracin a travs de una columna empacada con algodn.

Fig. 1b) Aislamiento y purificacin de micr subcultivos repetidos.

Fig. 1c) Mtodo de aislamiento y purificacin de microalgas en placa de agar.

Fig. 1d) Aislamiento mediante micropipeta

Una vez preparado colocar en Cajas de Petri, una capa no muy gruesa. Someter a esterilizacin a 15 lbrs. de presin y 125C. Con una asa de Platino picar el agar con la muestra que se desea analizar y colocar a la luz y observando si hay crecimiento bacteriano. 2. Si el cultivo presentara bacterias es aconsejable someter a la accin combinada de diferentes tipos de penicilina, por ejemplo: Penicilina sdica Estreptomicina Agua destilada 400 mg 200 mg 10 c.c.

Filtrar en equipo estril, adicionar volmenes de 3.0, 2.0, 1.0, 0.5 y 0.25 que dan concentraciones de: Ejemplo: TUBO ml Penicilina ug/ml Estreptomicina ug/ml 1 3.0 8.000 2 2.0 3 1.0 4 0.5 5 0.25

12.000 8.000 4.000 2.000 500 4.000 2.000 1.000 250

4. DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE POBLACION DE LAS MICROALGAS Cuando el plancton es utilizado para alimentar larvas u organismos filtroalimentadores como los moluscos, el suministro constante y la concentracin de estos alimentos son factores que determinan la supervivencia y desarrollo de los organismos en cultivo. A continuacin se hace una descripcin breve de los mtodos que se utilizan para determinar el nmero de clulas presentes en una muestra de plancton. 1) Hematocitmetro o Cmara de Neubaver (Fig. 2) Mediante una pipeta Pasteur se toma una muestra de plancton y se desliza en la cmara que previamente tiene adherido el cubreobjetos, se deja pasar 5~10 minutos para que la muestra se estabilice; se procede a contar mediante un contador de mano, en algunos casos es necesario diluir la muestra cuando la densidad es alta y tambin fijada cuando el plancton es mvil, siguiendo los siguientes pasos: 1. Se toma un milmetro de la muestra. 2. Se aade un mililitro de agua de mar filtrada ya preparada con formaldehido todo al 4%. 3. Se deja reposar por tres minutos. 4. La muestra se homogeniza con una Pipeta Pasteur. 5. Se cuentan las clulas de cada una de las cmaras. Una vez que se tiene el promedio de clulas de las cmaras, el clculo total de clulas por mililitro se lleva a cabo de la siguiente manera:

Fig. 2a) Conteo celular en homatocmetro.

Fig. 2b) Cuadrantes de la cmara de conteo. a. Primero calcule el factor de dilucin

m = Muestra problema (ml) f = Agua de mar con formaldehido b. Se requiere tambin la profundidad del hematocmetro, la cual est incluida en el mismo en la parte inferior derecha. P.H. = Profundidad del Hematocmetro c. Todo el clculo se multiplica por 1,000 para convertir a mililitros. d. Se requiere el nmero promedio de clulas de la muestra problema. N.P. = Nmero promedio de clulas por ml Con todos los incisos anteriores se realiza el clculo de nmero de clulas de la muestra problema por ml y la frmula queda as: No. de Clulas = (F.D.) (P.H.) (1,000) (N.P.) 2) Densidad Optica Mediante un espectrofotmetro se determina la concentracin celular de la muestra por densidad ptica (calibrando con anterioridad el aparato, siguiendo las instrucciones del manual correspondiente), se determina la transmitancia (Nm), que se extrapola con la recta patrn antes determinada que corresponda a la especie problema (se construye graficando transmitancia vs. num. de clulas/ml). As en la interseccin de la recta conociendo la concentracin (Nm) se puede calcular la cantidad de microalgas de la muestra problema. Por otro lado, conociendo la ecuacin de la recta de cada grfica, segn la especie, se determina directamente la concentracin de clulas de la muestra sustituyendo el valor d la transmitancia en esta ecuacin. 3) Volumen Celular Por centrifugacin, se obtiene un paquete o pastilla celular que desechando el sobrenadante, puede ser pesado y determinado en unidades de peso W/v, la cantidad de clulas o biomasa de la muestra problema en peso hmedo o peso seco. 4) Composicin Qumica En algunos estudios se puede determinar la concentracin de clorofila A,B y otros pigmentos presentes en la muestra. Debe considerarse que la composicin qumica del fitoplancton vara de acuerdo al tipo de cultivo usado, medio nutritivo y otros factores por lo que es necesario realizar el estudio de la composicin qumica (anlisis proximal) de la especie de estudio en relacin al tipo de cultivo desarrollado. 5. METODOS DE ESTERILIZACION

Existen diferentes mtodos para lograr las mejores condiciones de desarrollo de las microalgas, libres de microorganismos contaminantes, tanto del aire como del agua. A continuacin se describen brevemente los mtodos ms comnes de esterilizacin que varan en los resultados de eficiencia, costos y tiempo invertido. 1) Esterilizacin Qumica Uno de los mtodos ms comnes dentro de este tipo de esterilizacin, es el uso del Hipoclorito de Sodio (Cloro comercial), resulta ser de bajo costo y brinda buenos resultados para desinfectar recipientes de cultivo, material de cristalera y adems podemos esterilizar el agua de mar con la que preparamos el medio de cultivo, utilizando 50 mg de Tiosulfato de Sodio por cada 1 ml de Hipoclorito de Sodio usado; es decir, se utiliza 416 ml de Cloro comercial (6%) y se afora sta a 1,000 ml (mantenga esta solucin en la oscuridad); de esta solucin agregue 0.25 ml por litro de agua, deje reposar por 12 h y aada 0.1 ml de una solucin de Tiosulfato (sta se prepara con 248.1 gr de Tiosulfato, Na2S2O3.5H2O aforado a 1,000 ml), y posteriormente introduzca aereacin al recipiente de cultivo (carboy o garrafon) y djelo as por una hora. Una vez esterilizado de esta manera, agregue los nutrientes y vitaminas previamente esterilizados. Esterilizacin con Formol Se recomienda su uso en los casos en que exista una contaminacin en las instalaciones o laboratorio por hongos y otros microorganismos. Se utiliza una concentracin de 0.1% al 10% (no se utilice para material de cristalera o recipiente de cultivo). Solucin de Alcohol Etlico al 70% Se recomienda para material de cristal (pipeta, cajas de Petri, tubos de ensayo, etc.). Se pueden utilizar otro tipo de alcoholes (Isopropanol, o Propanol e incluso el Fenol, pero ste ltimo es muy txico). 2) Esterilizacin Fsica Esterilizacin por Calor Hmedo Utilizando difusores de vapor a una temperatura de 100~110C, se recomienda para estanques y tuberas de agua y de aire, destruye microorganismos vivos e incluso destruye esporas. Se recomienda utilizarlo por tres das consecutivos. Este mtodo recibe el nombre de Tindarizacin. Autoclave Se recomienda para la esterilizacin de medios de cultivo, vitaminas, material de cristal. Tiene la desventaja del tiempo que se invierte y el volumen que se puede esterilizar. Filtracin Se utiliza para separar partculas orgnicas o microorganismos en los medios de cultivo o instalaciones del sistema de aereacin. Existen diferentes tipos de los que podemos

mencionar: filtros milipore (membranas, vidrio, celulosa, etc), filtros de fibra (algodn, vidrio, materiales sintticos), filtros de tierra de diatomeas, geles de acrilamida (esferas de diferentes tamaos en micras), empaques de algodn y carbn activado, y finalmente existen unidades comerciales de esterilizacin con cartuchos sintticos (0.45, 3, 5, 20) etc. Esterilizacin por U.V. Los efectos de la irradiacin ultravioleta son bacteriostticos y fungiostticos en logitudes de onda menores de 500 NM (Jerlov, 1970). Se recomienda para estos fines las longitudes de onda de 240 a 280 NM las mximas eficiencias se obtienen cerca de los 254 NM (Kinne, 1976). Los rayos ultravioleta desinfectan el agua. El dato ms importante y preciso sobre un tratamiento con rayos U.V. es la dosis de U.V. (normalmente expresada en W seg/cm2) requerida para matar a un determinado porcentaje de la poblacin de organismos contaminantes. Un antecedente importante son las experiencias reportadas sobre la utilizacin de unidades de U.V. para desinfectar criaderos de peces y ostiones, cultivos de microalgas, agua de mar almecenada (Fig. 3 y Tabla 4) (Kinne, 1976; Wheaton, 1977; Aguirre, 1981; Torrentera & Franco, 1988). 3) Criterios de Eficiencia para la Seleccin y Utilizacin de los Mtodos de Esterilizacin Mencionados a. Mtodo Indirecto: Se analiza el estado de salud y las tasas de supervvencia de los organismos en cultivo. b. Mtodo Directo: Se calcula el porcentaje de reduccin de microorganismos, analizando el nmero de stos presentes en muestras no tratadas y el nmero de los mismos presentes en muestras obtenidas despus de la aplicacin del tratamiento de esterilizacin seleccionado. Esto se puede determinar mediante anlisis bacteriolgicos (mtodo standard en placa de agar); cuantificando el nmero de colonias presentes en la caja despus de haber inoculado 1 ml de cada muestra por un perodo de revisin de 24 h, 48 h, 96 h. Para muestras de agua marina se recomienda el Medio de Zobell que selecciona el crecimiento de bacterias marinas; para Coliformes totales se recomienda el Medio McConkey, entre otros. En las Figs. 3 y 4 se muestran resultados de diferentes mtodos de esterilizacin. 6. EQUIPO E INSTALACIONES a. Sala o Laboratorio de Cultivo: Se recomienda para fines de mantenimiento de cepas, transferencias sucesivas de cultivos, crecimiento de cultivos en pequeos y medianos volmenes. Generalmente para fines de investigacin las siguientes caractersticas: Laboratorio con temperatura controlada 1820C. Paredes y pisos de azulejo en color blanco. Instalaciones para el cepario y cultivo intermedios con lmparas de luz blanca fra fluorescente (20W37W). Instalaciones tipo invernadero (ventanas de cristal o plstico con temperatura controlada). b. Cuarto de Siembra: Puede instalarse dentro del mismo laboratorio una cabina con campana de flujo laminar o bien una simple mesa de laboratorio con

instalacin de gas para dos mecheros para la inoculacin en condiciones acpticas. c. Sala de Produccin: Para volmenes de 200 l o ms, se requieren recipientes de materiales plsticos no txicos y de preferencia transparentes para el desarrollo a nivel masivo de las diferentes especies del plancton. En este tipo de instalacin es recomendable el uso de la luz solar, pues el uso de la luz artificial es de muy alto costo y se require adems, de equipo para mantener la temperatura a 18 20C. En zonas de clima templado para cultivos masivos se pueden desarrollar stos a la intemperie, cubriendo los recipientes en caso de lluvia. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de instalaciones para cultivo masivo, utilizando la luz solar.

FIGURA 3a Promedlo de las Bocterlas viables formadoras de Colonla (C.F.U.) por mllmetro despues de diversos tratamientos. (Barroso, 1987). <

FIGURA. 3b Rorcontajes do Reduccin (C.F.U.) obtenldos con dlversos tratamlentos. (Barroso, 1987)./p> TABLA 17. RESULTADOS REPORTADOS SOBRE EL USO DE ESTERILIZACION U.V. EN ACUACULTURA (TORRENTERA & FRANCO, 1988) AUTOR DENSIDAD % DE TIPO DE OBJETO DE FLWO (AO) DE U.V. REDUOCION CONTAMINANTE INVESTIGACION Okinami et al., Tratamiento de ? 90 W/cm2 90 Bacterias 1952 agua de mar. Shelton and ? ? ptimos Bacterias Cultivos de almejas. Green, 1954 Kowobata y Tramiento de agua ? 90 W/cm2 90 Bacterias Harada, 1958 de mar. Cultivos de 150 960 Kelly, 1961 99.96 Bacterias Crasostrea 1t/min W/cm2 Viroinica. 32 Sistemas de cultivo Wood, 1961 ? 100.00 Bacterias 1t/min cerrado.

Herald, et al., 32 1962 1t/min Burrows y ? Combs, 1968 Eagleton y ? Herald, 1968 Lasker y Vlymen, 1969 The Fishery Oceanography Center al La 1000 Jolla, (USA) 1t/min Sanders y ? Fryer, 1972 Murchelano, 3 1975 1t/min Kimura, et al., 8.5 1976 1t/min Bullock y 2 Stuckey, 1977 1t/min Bonnefoy, et ? al., 1978 Brown y Russo, 1979

? ? ?

100.00 significativa ptimos

Bacterias Bacterias Bacterias

Sistemas de cultivo cerrado. Cultivo de Salmn. Desinfeccin de acuarios marinos.

? 215,500 W/seg/cm2 ?

significativa 90 % ptimos

Bacterias Bacterias Bacterias Bacterias Bacterias Poblacin microbiana mezclada. Bacterias

Esterilizacin de agua de mar. Cultivo de peces. Cultivo de C. Crasostrea gigas. Tratamiento de agua de mar. Cultivo bivalvos. Tratamiento de aguas negras. Cultivos de Crasostrea virginica. Esterilizacin de medios de cultivos continuos de microalgas. Sistema de recirculacin para peces. Sistema de recirculacin para peces. Tratamiento de aguas negras. Cultivo de peces marinos. Cultivo de peces marinos. Tratamiento de agua de mar almacenada.

22,100 W 99.0 seg/cm2 13,100 W 99.99 seg/cm2 20,000 W 50.0 seg/cm2

32 30,000 W significativo 1t/min seg/cm2 3.751 60.95 W 1t/min seg/cm2

Aguirre, 1981

99.63

Bacterias Virus

Maisse, et al., ? 1981 Agratzek, et al., 1983 Sako, et al., 1985 Sako, et al.., 1985 Sako, et al.., 1985

10,000 W 90 % seg/cm2 91,900 W seg/cm2 161,600 W 99.9 seg/cm2 32,300 W seg/cm2 19,400 W 100 seg/cm2

? 31 l/min 15 l/min 25 l/min

Bacterias Hongos

Virus Bacterias Bacterias

Torrentera y 3.75 140,059 W 100 % Franco, 1988 l/min seg/cm2

7. TIPOS DE CULTIVO 1. Cultivo Esttico Desarrollo del cultivo hasta fase de crecimiento exponencial y la utilizacin del volumen total del mismo. Generalmente el uso de estos cultivos es para fines de bioensayo o bien para transferencia a volmenes mayores (ver la Figura 6, que ilustra la secuencia del cultivo). 2. Cultivo Continuo De acuerdo a Kubitschek (1970), un cultivo continuo es un sistema de flujo en el cual las clulas individuales estn suspendidas en un volumen constante en un estado de equilibrio dinmico, establecido por una remocin de cultivo y adicin de medio nutritivo por unidad de tiempo con tendencia al infinito. Se habla de una diferencia entre un cultivo semicontinuo y un cultivo continuo. Al parecer sto es incorrecto, ya que la diferencia estriba en el nmero de perodos de remocin del cultivo y adicin del medio nutritivo y en los sistemas continuos este perodo de remocin y adicin es generalmente automtico en aparatos llamados turbidostatos y Quimiostatos. Cuando se requiere de grandes cantidades de clulas a intervalos frecuentes para alimentar especies en cultivo (peces, crustceos, moluscos), los cultivos semicontinuos o continuos proveen un gran nmero con mayor consistencia en forma uniforme y constante. En estos cultivos es importante determinar la concentracin ptima de los nutrientes por unidad de tiempo en relacin a la tasa de dilucin o cosecha del cultivo. Cuando se establece el estadio de equilibrio del sistema, la produccin es mxima. En las Figuras 7 y 8 se muestran dos ejemplos de cultivo semicontinuo. 3. Cultivo Masivo Se considera cultivo masivo a aquellos que se utilizan como alimento vivo de peces crustceos y moluscos y cuya produccin es a gran escala en tanques u otros recipientes de volumen no controlado. Existen muchas alternativas para la produccin de microalgas en cultivo masivo, desde la utilizacin de tanques de plstico, madera, concreto hasta los estanques rsticos, as como la utilizacin de fertilizantes minerales de tipo agrcola hasta una gran variedad de escretas de ganado como fuentes de nutrientes. En relacin a la utilizacin de luz artificial o natural, sta depender del tipo de infraestructura con que se cuente. El control de la temperatura ser necesario en relacin del tipo de microalga en cultivo y de la regin climtica en donde se establezca el mismo. En la Tabla 17 se muestran algunas alternativas de produccin en cultivo masivo de microalgas.

Fig. 4a) Esquema del ivnernadero de Wachapreague (USA). Cultivo masivo con temperatura controlada en invernadero con ventilador.

Fig. 4b) Cultivo masivo a la intemperie de algas unicelulares en tanques de fibra de vidrio (la temperatura es controlada por enfriadores sumergibles. La Joya, San Diego, U.S.A).

Stock primario Obtenido de laboratorio (Cepario) (Agitar los recipientes 2 3 veces al da) Inoculacin ascptica de plancton on agua esterilizada filtrada y enriquecida. El plancton permanece en contendores de stock. Crecimiento de 4 das sin aire.

Contenedor Cultivo intermedio Garrafn de 20 its. Inoculacin ascptica de un stock de cultivo de agua marina esterilizada en outoclave, filtrada y enriquecida. Crecimiento de 4 das. Flujo bajo de aire.

Contenedor de 200 its. Cosecha o transferencia Inoculacin del garrafn de cultivo en agua marina filtrada, enriquecida e irradiada. Crecimiento de 2 das. Flujo bajo de aire.

Fig. 5) Secuencia de cultivo en sistema esttico. Cuando se ha alcanzado una densidad ptima de clulas, se utiliza todo el cultivo como inculo de la siguiente fase.

Fig. 6) Cultivo semicontinuo (R. Ukeles, en Stein, 1979). Esquematizacin diagramtica de un cultivo semicontinuo (1), cilindro de CO2, (2) botella colectora de cultivo, (3) cmara de llenado ascptico, (4) flujmetro de gas, (5) filtro de aire, (6) regulador de presin, (7) compresor de aire, (8) salida de gas, (9) campana de llenado ascptico sobre el inoculador, (10) sifn de cosecha, (11) vlvula de aguja para regular la presin del gas, (12) entrada de gas con filtros de algodn y difusores de aire, (13) regulador de voltaje, (14) unidad de crecimiento, (15) matraz Fernbach con inculo.

FIG. 7) Cultivo semicontinuo (Cceres, 1979; Aguirre, 1981). Sistama de cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica usando medio de cultivo esterilizado con autoclave. A) Reserva de medio de cultivo (20 1); B) Sifn para el medio de cultivo; C) Escape de aire; D) Recipiente de cultivo (bolsa de plstico); E) Dosificador de aire; F) Filtro de aire; G) Sifn de cosecha; H) Recipiente de cosecha. 8. MODELOS DE PRODUCCION Alrededor de 1960 se inici la modelacin de los cultivos continuos con bacterias (Fencl, 1966), basados en la teora bsica desarrollada por Monod (1950). En relacin a estas teoras matemticas se han desarrollado numerosos trabajos con microalgas bajo el sistema de cultivo continuo, con diferentes fines de estudios: bioqumicos, fisiolgicos, nutricionales, etc., como es el explorar los mecanismos de limitacin de nutrientes (Droop, 1966; Caperon, 1968). Ahora se llevan a cabo numerosos trabajos con microalgas en sistemas de cultivo continuo con el objeto de determinar la mayor produccin posible (Droop, 1975; Ukeles, 1973; Canzonier & Brunetti, 1975; Cceres, 1979; Aguirre, 1981; Pares & Leyva, 1982; Torrentera, 1983). Estos trabajos tambin han contribuido en la implementacin de sistemas de cultivo, algunos muy complejos usados para estudiar la

fisiologa y bioqumica de las microalgas en condiciones axnicas, otros menos sofisticados para producir las microalgas y as utilizarlas como alimento de invertebrados marinos y larvas de peces. Algunos de estos modelos se construyen con los datos de densidad (No. de cl/ml) u otros tipos de medicin, como la densidad ptica (Nm), en relacin a las tasas de dilucin (volumen/da). En el caso del Modelo de Monod (1950), la relacin entre la densidad y la dilucin describe una curva exponencial negativa, mientras que el Modelo de Droop (1966) asume esta relacin como lineal. En ambos casos la produccin se describe como una parbola simtrica (Droop, 1966) o asimtrica (Monod, 1950). En las Figuras 9, 10 y ll se muestran tres ejemplos de modelos de produccin de tipo parablico en donde el punto de inflexin de la curva describe la produccin mxima sostenible en la tasa de dilucin ptima para tres diferentes especies de microalgas en sistemas de cultivo semicontinuo. TABLA 18. ALTERNATIVAS DE PRODUCCION A GRAN ESCALA DE MICROALGAS PARA ALIMENTACION EN ACUICULTURA ALTERNATIVAS VENTAJAS INCONVENIENTES (granjas que las utilizan) Produccin controlada en Control de las especies de escala pequea (Conwy) 1010 algas A pequea escala no es Luz artificial clulas*/da caro Produccin controlada en Control de las especies de Luz artificial escala media (Horn-Point & algas Generalmente caro Ribadeo) 101112 clulas/da Produccin controlada y Control de las especies de masiva (Lewes) en algas Aprovechamiento de la Generalmente caro 13 invernadero 10 clulas/da luz solar Generalmente barato, poca Florecimiento natural en mano de obra, produccin invernadero (Wachapreague) Control limitado masiva, aprovechamiento de la 13 10 clulas/da luz solar Generalmente barato, Florecimiento natural en aprovechamiento de nutrientes, Control limitado sobre las piscina con aguas de desecho aprovechamiento de la luz especies de algas (Woods Hole) 1014 clulas/da solar Conwy (Inglaterra): 5106 Ostrea de 0.3 cm/ao Wachapreague (Virginia, USA): 200106 almejas de 0.5 cm/ao Ribadeo (Lugo, Espaa): 3106 Ostrea de 1 cm/ao Horn-Point (Maryland, USA): 15106 Crassostrea de 1 cm/ao Lewes (Delaware USA): 5103 Crassostrea de 6 cm/ao Woods-Hole (Massachusetts, USA): 2103 Crassostrea de 6 cm/ao * Clulas (Tetraselmis equivalentes)

FIG. 8a) Relacin entre la densidad y la dilucin para un cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica, donde se muestran las medias de los valores obtenidos con los lmites de confianza al 95% de una distribucin normal. La relacin se obtiene de acuerdo al Modelo de Monod (1950). Aguirre, 1981.

FIG. 8b) Relacin entre la produccin y la dilucin en el cultivo semicontinuo de Tetraselmis suecica. La dilucin ptima se encuentra en el punto de inflexin de la curva.

FIG. 9a) Relacin entre la densidad y la dilucin para un cultivo semicontinuo de Isochrysis galbana, donde se muestran las medias de los valores obtenidos con los lmites de confianza al 95% de una distribucin normal. La relacin se obtiene de acuerdo al Modelo de Monod (1950) (Pares & Leyva, 1987).

FIG. 9b) Relacin entre la produccin y la dilucin en el cultivo semicontinuo de Isochrysis galbena. La dilucin ptima se encuentra en el punto de inflexin de la curva (Pares & Leyva, 1982).

FIG. 10a) Modelo de Droop (1966) que asume la distribucin de los datos en forma lineal de la densidad (X) de Chlorella saccharophila en funcin de la tasa de dilucin (D) (Torrentera, 1983).

FIG. 10b) Modelo de produccin de Droop, para Chlorella saccharophila basado en los datos de la regresin lineal (Torrentera, 1983).

CULTIVO DE ROTIFFROS
En el phylum rotfera se encuentran especies muy importantes objeto de estudio de Zologos y Eclogos, pues son organismos muy activos considerados depredadores en el mundo del plancton pues consumen altas concentraciones de microorganismos, tienen una alta tasa de reproduccin y su afloramiento abate rpidamente la concentracin de oxgeno en el medio. Es por ello que su localizacin en los ambientes acuticos permiten indicar la presencia de materia orgnica (medios eutrficos) por lo que revisten gran inters en estudios de Ecologa y contaminacin. En la dcada de los 60's empezaron a considerarse seriamente como una alternativa de alimentacin en Acuacultura por sus caractersticas de desarrollo, facilidad de cultivo y aporte nutricional. Una de las especies seleccionadas para su uso en Acuaultura es Brachionus plicatilis del que presentamos sus alternativas de produccin en cultivo en los siguientes incisos. 1. CONSIDERACIONES CENERALES SOBRE LOS CULTIVOS DE ROTTFEROS Brachionus plicatlis es miembro de la Familia Brachionidae. El ciclo de vida de este organismo involucra una alternancia en la reproduccin sexual y asexual; la taxonoma de este organismo es descrita por Ruttner & Kolisko (1974). Este organismo ha sido tema de polmica sobre su sistemtica, ya que los datos aportados en cuanto a talla y forma concluyen que esta especie en relacin al hbitat es variable, ya que soporta amplios rangos paramtricos y est ampliamente distribuida, y esta distribucin se debe a la alta longevidad y resistencia de huevos latentes. Los rangos de salinidad que soporta van desde 1 a 97 ppm (Ruthner & Kolisko, 1974) con el lmite extremo de 200 ppm. Este mismo autor concluye que el agua de mar es el medio ptimo de este organismo. Es tambin importante mencionar que en dilucin rpida del agua de mar se obtiene un incremento en el nmero de hembras y produccin de huevos. El nmero de huevos producidos por hembra, es un indicador de las condiciones ptimas del medio. Su amplia distribucin indica que es una especie Euriterma (5~20C). La Figura 12 describe la anatoma de B. plicatilis (R. Huches, en: B. Pejler et al., 1983). B. plicatilis es una especie que no selecciona su alimento (polfago), es un filtroalimentador, se puede alimentar de microalgas: Cianoficeas, Chloroficeas, Pheoficeas, etc., bacterias y levaduras (Hirayama, 1973 y otros). Pejler (1983) seala que no se inlcuye en su dieta las Familias Cryptomonas y Chrysophytas. Otros trabajos demuestran que slo pueden ingerir partculas de 1215 en tamao (Hirayama, 1978). Existen diferentes trabajos que reportan tasas de ingestin de: 0.14 1/min de Chlamidomonas, 0.034 1/min de Olisthodiscus, 0.1 1/min de Chlorella, 0.025 1/min de Dunaliella (Hirayama et al., 1972, y otros. 2. CULTIVO MASIVO Y CALIDAD NUTRICIONAL La produccin masiva del rotfero Brachionus plicatilis se inici en Japn alrededor de los aos 60's. Estos se cultivaron inicialmente transfirindolos de un estanque a otro de Chlorella con una densidad de 10 a 20 106 c/ml (SISFFA, 1964a, b). Por lo imprctico de la tcnica se iniciaron una serie de investigaciones tratando de encontrar el mtodo

adecuado para la produccin continua de rotferos, sin depender de los cultivos masivos de Chlorella y otras microalgas; una de stas propuso el uso de la levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) como alimento (Hirata & Mori, 1963). Se pens que sta resolvera la produccin de rotferos, pues esta tcnica permite obtener densidades muy altas de ms de 100 rotferos/ml, despus de la publicacin de estos resultados, otros investigadores se interesaron en estudiar la composicin qumica de los rotferos alimentados con diferentes microalgas y levaduras (Fukusho et al., 1976; Hirata et al., 1980; Imada, 1980; Watanabe, 1978; Kitajima et al., 1980).

FIG. 11) Anatoma de Brachionus plicatilis (Rotfera) en: B. Pejler et al., 1983). En la Figura 13 se muestran los resultados obtenidos por Hirata et al., en relacin a la utilizacin de: a) Chlorella, b) Levadura y c) Levadura/Chlorella. Como se puede observar los resultados obtenidos con las dietas a y c, son densidades altas hasta de 100 R/ml. Por otro lado, se realizaron investigaciones en cuanto al aporte nutricional de los rotferos para el cultivo de larvas de peces y se observ que en las larvas de peces alimentados con rotferos producidos a partir de ladieta de levadura o la mezcla 95% levadura y 5% Chlorella ocurran altas mortalidades. Se identific la causa como un desvalance nutricional en cuanto a los cidos grasos esenciales (Fukusho et al., 1976; Kitajima et al., 1980ab; Watanabe, 1978). Otras investigaciones aportaron la utilizacin de una levadura mejorada con cidos grasos del tipo W3 altamente insaturados, la cual recibe el nombre de Levadura Omega (Imada, 1980; Watanabe, 1978; Kitajima et al.,

1980a,b, etc.). En la Tabla 18 se muestra la composicin de aminocidos en B. plicatilis con diferentes dietas. Los estudios comparativos de la concentracin de cidos grasos W3 que Chlorella (especies marinas) posee, es de 29%, la levadura de pan 1.3% y la Levadura Omega 34.7%. Esta ltima se produce comercialmente en Japn (Kitajima, 1980). Otros trabajos ms prcticos y baratos aportaron datos en relacin a la determinacin del contenido nutricional de diferentes especies del zooplancton: Acartia clausi, Tigriopus japonicus, Artemia sp y Moina sp. Se encontr que la abundancia y calidad de estas especies de zooplancton dependen de su nutricin, y que la eleccin de una especie de microalgas, levadura u otro microroganismo para alimentar a stos depende de la composicin qumica, temperatura, fotoperodo y tipo de cultivo al que est sometida esta especie de microorganismo. Por ejemplo, las especies de zooplancton alimentados con Chlorella obtienen un enriquecimiento en cidos grasos de un 12.7 a un 18.8% (Imada et al., 1979; Imada, 1980; Watanabe, 1978b, 1980). Para fines prcticos, la produccin masiva de microalgas y la utilizacin de levadura de pan aportan buenos resultados en la produccin masiva de larvas de peces y otros invertebrados, tomando en cuenta que esta utilizacin permita un enriquecimiento de los cultivos de zooplancton llamado tratamiento verde, (6 a 12 h en un cultivo de microalgas) despus de haber obtenido una alta densidad con levadura por tres a cuatro das (pueden ser obtenidos ms de 100 R/M). Esto permite que el zooplancton obtenga la concentracin necesaria de cidos grasos y aminocidos esenciales para el buen desarrollo de las diferentes especies de invertebrados y peces producidos mediante esta tcnica. En la Tabla 19 se muestra la composicin de aminoacidos en cuatro especies del zooplancton de uso en acuacultura.

FIG. 12) Densidad de rotferos con diferentes alimentos A) Chlorella; B) Levadura; C) Chlorella/Levadura; D) Control (Hirata, 1980). TABLA 19. COMPOSICION DE AMINOACIDOS EN Brachionus plicatilis, CULTIVADO CON DIFERENTES MICROALGAS Y LEVADURAS (g/100 g PROTEINA CRUDA) Nagasaki 1975
1 2

Gifu 1976 1975

Levadu 3 Levadur 3 1 Levadu ra + Chlorel Levadu Chlorel Levadu 4Chlorell a+ ra Chlorell la ra la ra a Chlorella a

Isoleucina Leucina Cystina

2.9 5.5 0.7

2.8 5.3 0.8 1.1 3.4 3.0 3.1 1.2 3.5 5.8 4.5 1.4 3.2 7.5 8.8 2.9 5.9 3.7 67.9

3.1 5.6 0.8 0.8 3.5 3.2 3.4 1.2 3.8 5.8 4.6 1.4 3.7 8.0 9.3 3.1 5.8 3.9 71.0

4.4 6.9 1.0 0.7 4.5 3.0 4.0 1.1 4.4 6.6 5.2 1.7 3.9 9.8 10.1 3.6 5.0 3.7 79.5

4.0 6.1 0.9 0.7 4.1 2.8 3.5 1.1 4.0 6.0 4.6 1.5 3.5 8.9 9.7 3.1 4.8 3.6 72.9

4.0 6.2 0.9 0.7 4.1 2.9 3.4 1.2 4.2 6.0 4.8 1.7 3.5 8.8 9.5 3.2 4.9 3.7 73.7

3.2 6.2 0.9 0.9 3.9 3.2 3.4 1.2 4.0 5.5 4.4 1.5 3.9 8.5 10.1 3.1 6.1 4.2 74.2

3.4 6.1 0.8 0.6 3.9 3.1 3.2 1.2 4.2 6.1 4.6 1.5 3.8 8.0 9.8 3.1 6.7 4.0 74.1

Methionina 0.8 Phenylalani 3.5 na Tyrosina Threonina 3.0 3.5

Tryptophan 1.1 o Valina Lysina Arginina Histidina Alanina Acido Asprtico 3.6 5.7 4.2 1.4 3.2 7.7

Acido 8.9 Glutmico Glycina Prolina Serina TOTAL 2.9 5.2 3.7 67.5

Muestra obtenida con Etanol al 80%, por hidrlisis con ter dietlico. 1. Rotferos cultivados con Chlorella minutissima. 2. Rotferos cultivados con levadura. 3. Rotferos cultivados con Chlorella marina y levadura (1 g de levadura/10 cel/ml agua de mar/da). 4. Rotferos cultivados con levadura y enriquecidos con Chlorella marinapor 36 horas (Watanabe, et al., 1978b; Hirata, 1983). TABLA 20. COMPOSICION DE AMINOACIDOS EN DIFERENTES MICROCRUSTACEOS (g/100 g PROTEINA CRUDA) (WATANABE et al., 1978b) Aminocidos Artemia salina1 Acartia clausi Trigriopus japonicus Moina sp.

Isoleucina Leucina Methionina Cystina Tyrosina Threonina Tryptophano Valina Lysina Arginina Histidina Alanina Acido Asprtico Acido Glutmico Glycina Prolina Serina TOTAL

2.6 6.1 0.9 0.4 3.7 1.7 1.0 3.2 6.1 5.0 1.3 4.1 7.5 8.8 3.4 4.7 4.6 68.3

3.5 5.5 1.5 0.8 3.7 3.6 4.2 1.1 4.5 5.4 4.3 1.9 5.4 9.0 9.5 4.6 4.6 3.3 76.4

2.5 5.0 1.1 0.7 3.5 4.0 3.8 1.1 3.3 5.7 5.2 1.6 4.9 9.0 10.8 4.5 4.8 4.3 75.8

2.5 6.0 1.0 0.6 3.6 3.3 3.8 1.2 3.2 5.8 5.1 1.6 4.9 8.3 9.8 3.7 4.2 4.0 72.6

Phenylalanina 3.2

1. Nauplios de Artemia recien eclosionados 3. TECNICAS ALTERNATIVAS DE PRODUCCION MASIVA Para el cultivo de B. plicatilis en condiciones ptimas se recomienda la utilizacin de agua de mar (32~35%), la temperatura ptima de 25C (Hirata & Mori, 1963; Watanabe, 1978, e Hirata 1980), y en cuanto a la seleccin del mejor mtodo de cultivo masivo a continuacin se describen esquemticamente, algunos ejemplos de sistemas de cultivo desarrollados por diferentes autores para la produccin masiva de rotferos. El primer sistema utilizado fue el llamado mtodo de estanque de transferencia en cultivos sucesivos de Chlorella (SISFFA, 1964a,b) (Figura 14). Posteriormente la produccin de B. plicatilis con levadura de pan (Hirata & Mori, 1967) (Figura 15) sustituye la transferencia sucesiva por tanques de recirculacin, mejorando el tanque con grava en el fondo y colocando un ascensor de aire en el centro.

La Figura 16 muestra un cultivo sistemtico, alternando la dieta de Chlorella y levadura llamado thinning out method (Fukusho et al., 1976). Este mtodo es el de mayor uso en cultivos masivos pues reporta una alta produccin de rotferos (300 R/ml). Y finalmente el mtodo desarrollado por Hirata et al. (1977), llamado sistema de retroalimentacin, semejando un ecosistema con la participacin de bacterias pseudomonas (produccin de nutrientes por biodegradacin) para Chlorella y sta como alimento de rotferos, los desechos de stos hacia un biodepsito, etc. (Figura 17) (Feedback System; Hirata, 1980). Las tasas de conversin de alimento de este tipo de sistemas diariamente se incrementan. Se puede concluir que los sistemas de retroalimentacin tienen dos ventajas al mismo tiempo: la purificacin del agua y la minimizacin de prdida de energa a travs de la alimentacin. Esto permite el establecimiento de un cultivo de produccin continua, como se muestra en las Figuras 18 y 19. 4. IMPORTANCIA DEL CULTIVO DE Brachionus plicatilis Las principales ventajas que ofrece el cultivo de Brachionus plicatilis son: rangos amplios de T y S%, y diferentes alternativas prcticas de cultivo masivo, su pequeo tamao (100300), lo que permite a las lavas de peces y crustceos ingerirlos cuando todava no pueden ingerir nauplios de artemia, su fcil y barata alimentacin con diferentes especies de fitoplancton, levaduras y dietas artificiales. Su alta velocidad de reproduccin bajo condiciones ptimas de cultivo, pudiendo duplicarse la poblacin en menos de 24 horas, lo que permite obtener altas densidades (Theilacker & McMaster, 1971; Amat, 1975; Funikowa & Idaka, 1973; Hirayama & Kusano, 1972; Hirata, 1975; Hirata et al., 1985; Watanabe et al., 1979; Kitajima et al., 1979; Imada et al., 1979; Yufera et al., 1983; Trotta, 1983). En cuanto a su contenido nutricional, como ya se mencion anteriormente B. plicatilis ofrece la gran ventaja de incrementar su contenido nutricional en relacin de su dieta como lo demuestran los trabajos de Watanabe et al. (1983) y cuyos resultados en relacin a contenido de cidos grasos esenciales se presentan en las Tablas 20 y 21. Para el buen manejo de la poblacin de rotferos en cultivo, es recomendable el uso de ecuaciones sencillas como las que se muestran en la Tabla 22, que nos permiten conocer la concentracin adecuada de alimento y la tasa de reproduccin y fecundidad, factores que nos indican el buen desarrollo del cultivo, que si son bien controlados nos permitirn el establecimiento de cultivos continuos y densos para su uso como alimento vivo.

FIG. 13) Mtodo del tanque de transferencia.

FIG. 14) Esquema del sistema de cultivo en tanque de recirculacin: A) Bomba de aire; B) Rotferos en el medio; C) Tubo de vinil (25 cm de dimetro); D) Filtro de recirculacin; E) Tina de policarbonato (Pan-light), cubierta de fibra de vidrio..

FIG. 15) Tcnica de cultivo desarrollada por la asociacin The Seto Inland Farming Fisheries Association (SISSFFA) y la Estacin de Maricultura de Nagasaki. Este mtodo es el ms comnmente utilizado y es llamado Thinning out method (Fukusho et al., 1976).

FIG. 16) Sistema de retroalimentacin de nutrientes (Feedback System) para el cultivo masivo de rotferos (Hirata, 1980).

FIG. 17) Variaciones en la densidad de rotferos en el sistema de cultivo de retroalimentacin (Feedback System) en tanque de 2,700 l (Hirata et al., 1980).

FIG. 18) Seccin del sistema de retroalimentacin del cultivo de rotferos: A) Tanque de 2,700 l; B) Biodepsito en zig-zag; C) Aereador mvil; D) Motor de reduccin; E) Regulador de automvil; F) Compresor. TABLA 21. TIPO DE ACIDOS GRASOS PRESENTES EN ROTIFEROS PRODUCIDOS EN VARIOS SUSTRATOS ROTIFERO ROTIFERO ACIDOS ROTIFERO ROTIFERO LEVADURA LEVADURA GRASOS Chlorella AGUA (S. + Chbrella CULTIVO marina DULCE cereviceae) marina 16:0 8.7 11.7 16.8 8.9 16:17 24.2 16.6 24.3 18.9 18:0 4.8 6.0 1.7 1.6 18:19 33.9 22.8 10.1 9.0 18:26 + 5.8 + 10.4 + 3.2 + 15.7 + 18:33 + 0.6 + 2.2 + 0.4 + 10.2 + 20:1 6.0 + 3.3 2.4+ 0.3 20:33 0.4 2.3 4.4 0.8 20:46 0.4 2.3 4.4 0.8 20:43 0.5 0.6 0.2 1.1 20:53 1.0 8.1 24.1 1.9 22:1 1.7 1.5 1.3 22:53 0.2 1.7 3.8 0.3 22:63 0.5 0.9 0.5 - 3HUFA 2.2 11.3 28.6 -

* Watanabe et al., 1983 Acido graso esencial para especies marinas + Acido graso esencial para especies de agua dulce TABLA 22. TIPO DE ACIDOS GRASOS PRESENTES EN ROTIFEROS ALIMENTADOS CON LEVADURA (Saccharomyces cerviceae) Y LEVADURA OMEGA (W) CULTIVADOS LEVADURA ACIDOS LEVADURA ROTIFEROS EN (S. GRASOS OMEGA LEVADURA LEVADURA cereviceae) OMEGA 16:0 16:17 18:0 18:19 18:26 18:33 20:1 20:33 20:46 20:53* 22:53 22:6 3 3 HUFA* -* -* -* 8.3 20.0 14.2 38.2 3.4 8.4 26.1 43.9 2.8 15.1 0.5 6.4 tr - 1.6 13.4 16.9 5.0 6.6 2.3 2.6 15.5 16.4 1.0 1.1 0.8 0.9 8.4 9.2 3.0 3.4 3.0 3.4 13.4 17.4* 0.9 1.4 12.8 15.6* 33.5 35.8* 34 12 12 12* 00.4 * 244* 67 2627 34 2630 79 10 12 10 11 23 22 24 24 0.7 0.8 8 10 34 34 9 12* 23 7 9* 25 26*

W La levadura W est enriquecida con una fuente de cidos grasos esenciales * Son cidos grasos esenciales TABLA 23. TASAS DE ALIMENTACION, REPRODUCCION Y FECUNDIDAD EN CULTIVOS DE ROTIFEROS Brachionus plicatilis donde: R = tasa de alimentacin S = suplemento alimenticio (g) Tb = peso total de la muestra de rotferos (g)

Reproduccin:

donde: P.H. = produccin de huevos NRh = nmero de rotferos con huevos T.R. = nmero total de rotferos de la muestra donde: D.H. = densidad de huevos D.R. = densidad de rotferos Indice de fecundidad: Tasa de recuperacin: donde: A = poblacin en momento t1 B = poblacin en momento t2

CULTIVO DE Artomia salina

1. CONSIDERACIONES GENERALES La Artemia salina es un crustcco que en estado adulto mide entre 1718 mm, posee un par de apndices prenciles, ojos pedunculados, 17 pares de apndices, una furca (rameada o bifurcada). La hembra adulta posee un ovisaco en el que incuba de 10 a 30 huevecillos generalmente y en condiciones ptimas hasta 70 huevecillos. Algunos autores reportan de 50200, segn la especie (Figura 20). Presenta un ciclo de vida sexual y asexual. Existen especies bisexuales y especies patenogenticas en ambas. Pueden presentarse dos alternativas de desarrollo del huevo: uno es el desarrollo de larvas (prenauplio, nauplio) o bien que en condiciones adversas se presente el fenmeno de Criptobiosis, en el cual se producen los quistes. Este fenmeno se debe a que la gstrula permanece en este estado en perodos de desecacin ambiental; esta gstrula enquistada en condiciones favorables se hidrata y continua su desarrollo hasta eclosionar el nauplio (Figura 21). Esta capacidad de la Artemia de la formacin de huevos resistentes es lo que la ha hecho ser uno de los recursos de alimentacin en Acuacultura ms importantes, pues los quistes pueden conservar su variabilidad durante varios aos hasta que se dan las condiciones necesarias para la eclosin. 1.1) Areas de Distribucin A finales de los 60's la demanda de quistes de Artemia era insuficiente, por lo que se encareci. Debido a esta gran demanda se incrementaron las investigaciones sobre este organismo, principalmente por el Reference Center de la Universidad de Ghent, Blgica, en colaboracin con laboratorios de Estados Unidos e Inglaterra, explorndose

varias zonas naturales de produccin de Artemia en Europa, Asia, Amrica y Australia (Sorgeloos, 1974) (Tabla 23). Aunque su distribucin es cosmoplita, la mayor abundancia ocurre en zonas tropicales y subtropicales. Existen dos categoras generales en cuanto a salinidad se refiere de las zonas de produccin natural de Artemia: Thalasso-halino donde la mayor concentracin de sales son de NaCl (menor nmero de localidades). Athalasso-halino con sales de Sulfatos, Carbonatos y Sales de Potasio (mayor nmero de localidades). Estas categoras son importantes, pues determinan las diferentes especies de Artemia. 2. OBTENCION Y CONSERVACION DE QUISTES Existen cinco etapas fundamentales para la preparacin de quistes que son: colecta en zonas naturales o en cultivos intensivos, filtrado, lavado, secado, envasado y almacenado. En zonas naturales (salinas, lagos, zonas estuarinas), los quistes se acumulan en las orillas mezclndose con arena, lo que permite variaciones del nivel del agua y stos estn sometidos a deshidratacin e hidratacin, lo que disminuye su viabilidad, por lo que al colectarlos deben de ser pasados por tamices, lavarse alternativamente con agua de mar y agua dulce, incluso se recomienda su centrifugacin para eliminar la mayor parte de quistes no viables, y su secado por varios mtodos, entre ellos corrientes de aire. Existen muchos mtodos para la obtencin de quistes y tcnicas de decapsulacin reportadas por la bibliografa, ya que A. salina es objeto de estudios muy intensos. En la Table 24 se muestra un ejemplo de la tcnica de decapsulacin de quistes de Soogeloos, 1982. FIG. 19. CICLO DE VIDA DE Artemia salina

FIG. 20a) Artemia salina (Ivleva et al., 1973): A) Hembra, B) Cabeza de macho, C) Cabeza de hembra, 1. Ojo nauplio, 2. antenuelas, 3. antena, 4. apndice torxico, 5. saco ovigero, 6. segmento abdominal, 7. furca, 8. ojo pedunculado.

FIG. 20b) Estados nauplio de Artemia salina. TABLA 24. ZONAS NATURALES DE PRODUCCION DE Artemia salina EN EL MUNDO (P. SORGELOOS, 1974)

NUMERO PRINCIPALES NUMERO DE CONTINENTE TOTAL DE PAISES LOCALIDADES LOCALIDADES ASIA 19 EUROPA 77 ESPAA 37 AMERICA 37 U.S.A. 34 DEL NORTE MEXICO 9 AMERICA *REGION 11 6 CENTRAL CARIBE AMERICA 19 ARGENTINA 7 DEL SUR** ASIA 19 URSS 15 AFRICA 18 Mxco (Baja California, Sonora, Sinaloa, Culiacn, S.L. Potos, Estado de Mxico, Hidalgo, Zacatecas, Yucatn). * (Bahamas, Puerto Rico, Santo Domingo, Martinica) ** (Argentina, Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, etc.) TABLA 25. TECNICAS PARA DESCAPSULAR QUISTES DE Artemia salina (P. SORGELLOS, 1982) 1. Hidratar el huevo de artemia una hora con aereacin. 2. Cerrar el aire de la incubadora y dejar reposar unos minutos. Los huevos que sedimenten sacarlos con un tamiz y los que floten desecharlos. 3. Pasar la artemia a la solucin descapsulante de siete a diez minutos como mximo. Evitar que suba la temperatura a ms de 35C (al terminar se ve el quiste de color anaranjado y transparente al microscopio). 4. Regresar los huevos al tamiz y lavarlos con agua de la llave hasta que pierdan el olor a cloro (unos diez minutos). 5. Lavar los quistes con HCl .1 normal (18 ~ 20 segundos). 6. Regresar la artemia al tamiz y lavarla con agua de la llave unos cinco minutos. 7. Pasar los huevos a la incubadora con agua de mar y esperar la eclosin en 24 horas. OBTENCION DE LA SOLUCION DESCAPSULANTE La solucin descapsulante est formada con agua marina, Hidrxido de Sodio e Hipoclorito de Sodio. 1. Volumen de solucin descapsulante 14 ml por gramo de quiste (71.88 ml) 2. Cantidad de Hipoclorito de sodio H.S. (10 g/68.12 ml)

3. A = .5 por gramo de quiste B = 3000 por ndice de refraccin del Hipoclorito - 4003 4. Cantidad de agua de mar Es igual a la diferencia que hay entre el volumen de la solucin descapsulante menos la porcin del Hipoclorito de Sodio. 5. Cantidad de Hidrxido de Sodio 0.15 g por g de quiste (1.5 g/10 g) a. Produccin de Quistes Es importante mencionar que a salinidades bajas (100 g/l), existe alta reproduccin. Este dato debe considerarse, pues permite un reclutamiento continuo, pudiendo partir de una pequea poblacin, se puede obtener en pocas semanas producciones altas. A salinidades muy altas no hay reclutamiento, se gener la produccin de quistes, acompaada de la muerte de los adultos. La produccin de quistes no slo se desencadena por altas salinidades, sino por alta temperatura y desecacin, niveles txicos de iones (K, Ca, etc.). La Artemia es un organismo osmoregulador, por lo que dentro de su cuerpo la salinidad es baja y deshecha constantemente sales. b. Produccin Comercial Los mayores productores a nivel mundial de quistes de Artemia son: Estados Unidos, URSS y Bulgaria. La Tabla 25 presenta los principales aislamientos de quistes y nauplios de Artemia correspondientes a nueve localidades geogrficas a nivel mundial de importancia comercial. Es sumamente difcil establecer un programa simple para controlar la produccin y cosecha de Artemia en zonas naturales, por todos los factores antes mencionados por lo que se recomienda: 1) Un monitoreo peridico de las poblaciones en estudio. 2) Caracterizar su ciclo de vida a travs del ao (nmero de organismos adultos, nauplios, quistes). 3) Lo anterior permitir conocer la concentracin de alimento adecuado y el tiempo idneo para fertilizar y el establecimiento de la cosecha. En las salinas, la introduccin del cultivo de Artemia contribuye a la precipitacin de la sal, ya que la Artemia controla la poblacin de algas disminuyendo la viscosidad. Al introducir Artemia, se contribuye a obtener mayor pureza de la sal por otros compuestos o partculas (Sorgeloos, 1982). 3. CULTIVO DE ARTEMIA 3.1) Parmetros Ambientales

Temperatura: En relacin a la temperatura, el lmite inferior es de 6C y el lmite superior de 37C. Despus de este rango hay alta mortalidad.

Composicin Qumica: La composicin qumica del medio debe de tener iones de Na, K, Mg en proporciones adecuadas. La relacin Na:P y Cl:SC4 es muy importante. Cabe mencionar que se han transferido especies de medios con sales de Carbonatos a medios con sales de Sulfatos, y se ha reportado que pueden adaptarse a ellos, observndose cambios de inters en la cepa adaptada diferente a la cepa original. pH: En relacin al pH, se considera adecuado el rango de 8.0 a 10.0. Oxgeno: El rango de O2 es amplio desde 1.0 mg/l hasta saturacin de O2.

3.2) Alimentacin Se han encontrado en anlisis del contenido del tubo digestivo desde algas y detritus hasta granos de arena, lo que demuestra que es un organismo filtrador no selectivo, por lo que puede ingerir materiales contaminados. Ingiere partculas de 1.2 a 50 . Slo se alimenta de partculas, no de alimentos solubles. La Artemia no regula su nutricin (se alimenta las 24 h). Estos factores deben de considerarse para la adecuada seleccin de las especies silvestres, y para calcular la concentracin y la dieta adecuada para fines acuaculturales. En las poblaciones silvestres es difcil determinar el rendimiento mximo sostenible (RMS), ya que ste depende de los factores ambientales. 3.3) Proceso de Eclosin El fenmeno de eclosin es un fenmeno qumico puro (intercambio inico), relacionado con la concentracin de glicerol que posee el embrin, a mayor produccin de glicerol hay mayor absorcin de agua; en etapas crticas de presin osmtica la membrana se rompe, y despus la concentracin de glicerol sbitamente baja a cero, el glicerol es liberado. Si bien se ha observado que en altas densidades de quistes la presencia de glicerol es importante, pues interviene en la sincrona de la eclosin (ya que no acta txicamente sobre las larvas). Es recomendable cambiar esta agua antes de que transcurran diez horas de la eclosin, ya que la presencia del glicerol incrementa las poblaciones bacterianas. 3.4) Parmetros que permiten la eclosin de quistes

Temperatura ptima de eclosin de quistes: 25 a 30C. Salinidad: 5 ppm (lmite variable). A mayor S de 30 ppm, los quistes no alcanzan el perodo crtico de ruptura o eclosin, y en tal caso no se consigue sta. Decapsulacin: En la decapsulacin se controla el proceso de osmo-regulacin. Permitindose la decapsulacin es ms fcil conseguir la eclosin (en el anexo se incluye la tcnica de decapsulacin recomendada por P. Sorgeloos). pH: A un pH de 8.0 hay una buena eficiencia de eclosin. Debajo de ste la eclosin disminuye. Se recomienda el uso de 2 g de NaHOO3/1 para asegurar una mayor eclosin. Oxgeno: En el metabolismo de Carbohidratos de Artemia, la presencia de O2 es relevante. Para conseguir una eclosin eficiente se recomiendan altos niveles de O2 (condiciones anaerbicas afectan la eclosin y el metabolismo de Carbohidratos).

En la Tabla 26 se muestran las concentraciones de sales recomendables para eclosin y para cultivo de Artemia. TABLA 26. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE AISLAMIENTO DE Artemia DE NUEVE LOCALIDADES GEOGRAFICAS (QUISTES Y NAUPLIOS) Localidad Baha de San Francisco (USA) 435.5 - B 24 24 24 24 29 27 31 29 29 1.63 1.92 1.74 2.43 2.47 2.04 3.08 3.09 3.33 Peso hmedo (80.2%H2O) Sorgeloos (1982) Tiempo de incubacin a 25C B - bisexual o P - partenogentica 474.6 509.0 515.0 443.3 Eclosin: mg Tiempo de nauplio/g de cosecha (h) quiste incubacin Nauplio en Longitud peso seco total del (g) nauplio (m)

Baha San 497.7 - B Pablo (USA) Macau, Brasil 529.0 - B Gran Lago 467.0 - B Salado (USA) Baha Snaik (Australia) 537.5 - P

Lago Chaplin 400.4 - B (Canad) Lavaldulc (Francia) Tientsin (China) 561.8 - P 400.5 - P

Margherita di Savoia 458.2 - P (Italia)

TABLA 27. CONDICIONES OPTIMAS EN CUANTO A COMPOSICION Y CONCENTRACION DE SALES REQUERIDAS PARA LA PRODUCCION DE Artemia EN CULTIVO Y PARA LA ECLOSION DE QUISTES (P. SORGELOOS, 1982) CONDICIONES QUIMICAS CONDICIONES QUIMICAS

PARA ECLOSION FUENTE NaCl MgCO MgCl2 CaCl2 KCl NaHCO3 3.5) Cultivo Intensivo CONC. g/l 50 13 10 0.3 0.2 2.0 31.08 7.74 6.09 1.53 0.97 2.00

PARA CULTIVO CONC.g/l O2 - 55 ppm pH - 8.0

Se han desarrollado diferentes sistemas para el cultivo de Artemia en condiciones de laboratorio para fines de investigacin sobre la Fisiologa, Bioqumica, los mecanismos de formacin de quistes, eclosin y el aporte nutricional de la Artemia, entre otros muchos estudios importantes, que han permitido el establecimiento de cultivos para la nutricin de larvas de peces y crustceos de importancia en Acuacultura. Estos cultivos se pueden clasificar en dos grupos: los llamados cultivos intensivos, en recipientes de volumen controlado (tanques de concreto, tinas de plstico, estanques rsticos, etc.). En estos sistemas las condiciones ambientales y los nutrientes estn controlados, por lo que se logran altas densidades de cosecha. En la Tabla 27 se muestran algunos ejemplos de dietas utilizadas para Artemia en condiciones de cultivo y en la Tabla 28 se muestran algunas caractersticas de los cultivos de Artemia, entre ellos el sistema intensivo. 3.6) Cultivo Extensivo El aprovechamiento de zonas naturales de produccin de Artemia (salinas, estuarios, lagos salinos), as como su buen manejo para incrementar su produccin, permite el establecimiento de los cultivos extensivos. En los cultivos extensivos puede esperarse una cosecha de 1020 kg org/m2/da, siendo una produccin anual mayor de 30 ton/ha/ao. En la Tabla 27 se muestran algunos ejemplos de sustratos utilizados para el cultivo extensivo y la Tabla 28 muestra algunas caractersticas de los diferentes tipos de cultivo de Artemia. Hay que esperar un ptimo en la poblacin para poder manipular los parmetros que inducen la formacin de quistes (S, Oxgeno, T). En relacin a la produccin de quistes por estacin, se calcula en 20 kg/Ha/estacin (cinco meses). 3.7) Recomendaciones para la optimizacin de la cosecha de quistes

Diseo de estanques bien orientados (contra el viento) para favorecer la acumulacin de quistes (lugares tropicales).

Construccin de barreras (bamb, plstico, etc.). Determinar la frecuencia ptima de cosecha (una vez al da, preferentemente por la maana). Diseo de redes colectoras de malla doble de l mm (exterior) y 50 de luz interior). Coleccin de los quistes en solucin saturada y aereacin continua (para deshidratacin de quistes). Aplicacin de tcnicas para provocar diapausa. Procesar los quistes (salado, desecado, empaque). TABLA 28. DIETAS UTILIZADAS PARA CULTIVOS DE Artemia (Coll-Morales J., 1983) TIPO DE ALIMENTO RECURSO TIPO DE CULTIVO

Microalgas

Chlorella, Chlamidomonas, Dunaliella, diferentes especies de Laboratorio e dinoflagelados (Ej. Anacystis sp., intensivo especies de diatomeas (Skeletonema, Thallassiosira, etc.) Spirulina (seca). Desechos de soya, salvado de arroz Intensivo

Dietas inherentes Fertilizacin

Gallinaza, abonos agrcolas minerales Extensivo

TABLA 29. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS DIFERENTES TIPOS DE CULTIVO DE Artemia (P. SORGELOOS, 1982) TIPO DE RECIPIENTE ALIMENTO OBJETIVO DENSIDAD CULTIVO Diferentes Bioensayos Acuarios, especies de y Cultivos de botellones microalgas, alimentacin 5g/10 l Laboratorio bolsas de salvado de a pequea plstico arroz escala INTENSIVOS Salvado de arroz+ S Obtencin Estanques, Cultivos rsticos, 35 ppm + alta de biomasa y Intensivos 10,000 org/l estanques de concentracin quistes para (por lote) concreto Acuacultura de O2 + Fe EDTA EXTENSIVOS* Manejo de Estuarios, Manejo de las Obtencin La zonas de lagos salinos, condiciones de biomasa y produccin produccin salinas naturales (S quistes para est en natural , O2,pH, Acuacultura funcin de la (depende de estacin nutrientes) las climtica condiciones naturales del

sistema) En salinas Introduccin estacionales Conocimiento de especies inoculacin y control de Obtencin (depende de Estuarios, de 100 a 500 condiciones de biomasa y las lagos salinos, g quistes/Ha. naturales (pH, quistes para condiciones salinas Salinas S,O2, Acuacultura naturales del permanentes nutrientes) sistema) 1015 g quistes / Ha.
*

1. Para favorecer la produccin en los cultivos extensivos es recomendable el uso de sales para la agricultura:200 kg/Ha de Monofosfato de Amonio100 kg/Ha de Nitrato de Amonio500 kg/Sales de Calcio (regula el pH) 2. Es importante el control del nivel del estanque para favorecer el desarrollo del fitoplancton y no el de planctonbentnico. 3. Puede usarse la tcnica de fertilizacin combinada usando 1.8 ton/Ha de gallinaza (cada tres das) despus dehaber fertilizado con fertilizantes minerales).

TABLA 30. COMPOSICION DE DIETAS MEZCLADAS USADAS PARA LA ALIMENTACION DE ROTIFEROS Y Artemia EN CULTIVO Y DIETAS ENRIQUECIDAS Ingredientes g/100 g Dieta para mezcla rotferos Polvo de espirulina seca Levadura IFP Pescado autolizado DL-Metionina D-Glucosa HCL Almidn de maz 0.5 9.9 0.5 9.9 4 1 0.5 7.9 4 1 3.2 2 0.3 0.1 3 2 0.5 0.1 3.2 2 0.3 0.1 3.2 2 0.3 0.1 9.6 4 1 0.4 10 4 0.8 0.2 9.4 4 10 10 1 Dieta para Mezcla Artemia enriquecida
+ 1 2 3

40 1 + 40 3 40 1 + 40 2 * 40 40 40 40

73 2

73 2

Aceite de hgado de 4 bacalao Colesterol Mezcla de vitaminasa) Cloruro de Colina CaHPO4 FeSO4.7H2O

+1 *2

Gatesoupe et al., 1977 Gatesoupe et al., 1981 3 Gatesoupe et al., 1981 a) Gatesoupe & Luquet (1981) - (mezcla de vitaminasde Halver (1972). 4. IMPORTANCIA NUTRICIONAL DE Artemia La Artemia es un excelente alimento vivo en la Acuacultura por sus caractersticas de desarrollo, su pequeo tamao de nauplio y metanauplio (adecuado para las larvas y juveniles de crustceos y peces) y fcil manejo, etc. El valor nutritivo de los nauplios recin eclosionados es muy alto; este valor decrece en ausencia de alimento. Si la Artemia (metanauplio y nauplio) es alimentada adecuadamente, podomos obtener un enriquecimiento de nutrientes esenciales en un sustrato de microalgas (vivas o secas), o en una mezcla artificial de nutrientes (lpidos, aminocidos, cidos grasos, etc.) (Tacon, 1987). Se ha calculado que se requiere entre un 2.5 a 5 g de la fuente, enriquecida para un milln de nauplios, y este enriquecimiento se logra en un perodo no menor de 6 h. En la Tabla 29 se presentan diferentes mezclas de nutrientes y mezclas enriquecidas que se utilizan para Artemia y rotferos. Los recursos nutricionales que posee Artemia (protenas, cidos grasos, etc.). Su composicin qumica y su concentracin varan de una cepa a otra, como se muestra en la Tabla 30. De estos nutrientes, las principales fuentes a considerar son los cidos grasos y aminocidos esenciales en los nauplios y metanauplios. Se ha mencionado ya en captulos anteriores, que la importancia de los llamados alimentos vivos (fitoplancton y zooplancton), radica en el aporte de cidos grasos y aminocidos esenciales que puedan brindar para el desarrollo larvario de peces y crustceos (Watanabe et al., 1983). En la Tabla 31 se muestra la composicin en cidos grasos de cuatro cepas de Artemia (nauplios recin eclosionados) de diferentes localidades. Para lavas de peces marinos, los nauplios de Artemia contienen una alta proporcin de cidos grasos esenciales de tipo W,(20:5W3 y 22:6W3) que son los ms nutritivos y que permiten el buen desarrollo y alta supervivencia de las larvas. Para especies de agua dulce, los nauplios de Artemia contienen una alta proporcin de los cidos grasos esenciales W3 (18:2W6 y 18:3W3) (Watanabe et al., 1983). La calidad nutricional de Artemia vara de un aislamiento a otro, de tal forma que en el mercado internacional alcanzan un alto valor aquellas cepas de Artemia cuyos quistes poseen concentraciones altas de aminocidos esenciales y cidos grasos. En Latinoamrica y el Caribe se reporta un gran nmero de localidades en donde se produce Artemia en forma natural en salinas y zonas estuarinas, de las que se conoce muy poco en relacin a su produccin, caracterizacin de la cepa (biologa bsica, anlisis proximal, ecologa), y potencialidad de industrializacin para ser utilizadas en

Acuacultura. Es importante el desarrollo de trabajos de investigacin que permitan la explotacin de este importante recurso en los pases latinoamericanos y del Caribe. TABLA 31. ANALISIS PROXIMAL Y MINERAL DE LA COMPOSICION DE HUEVOS Y NAUPLIOS DE Artemia DE TRES LOCALIDADES Huevos Artemia Compuestos Nauplios de Artemia (recin eclosionados)

San S. San S. Canada Canada Francisco America Franciso America 51.5 10.5 13.0 2.21 2.53 6.95 31.91 5.34 1277 96.0 50.9 9.1 47.5 4.8 15.3 1.41 5.59 7.63 28.58 7.12 1022 61.4 14.8 15.9 89.7 6.1 2.0 1.2 0.23 0.44 1.33 4.02 1.08 52.2 16.1 2.1 0.6 90.9 6.5 1.6 1.0 0.24 0.20 1.21 1.43 0.96 294.6 21.1 2.6 1.1 88.2 6.8 2.1 1.5 0.41 0.68 1.44 4.93 1.16 287.3 24.1 3.7 1.9 54.4 6.4 6.3 3.73 2.80 7.60 6.13 5.73 1298 91.2 98.3 10.6

Humedad % Protena % Grasa % Ceniza % Ca mg/g Mg " P K " " Na " Fe /g Zn " Mn " Cu "

* Watanabe et. al. (1983) TABLA 32. COMPOSICION DE ACIDOS GRASOS (%) DE NAUPLIOS (RECIEN ECLOSIONADOS) DE Artemia EN CUATRO LOCALIDADES Baha ACIDOS RAC de San Canad China Francia GRASOS Pablo 14:0 1.79 0.43 0.83 1.80 1.73 14:1 2.92 2.26 1.67 2.24 3.03 16:0 12.70 7.79 9.99 11.40 11.90 16:17 16.78 5.24 9.03 19.06 11.34 16:34/17:18 4:33 2.44 1.47 2.54 2.20 18:0 4.07 3.08 5.12 3.99 4.21

18:19 18:26* 18:33* 18:43 20:26/20:36 20:33/20:46 20:53**

30.37 29.15 9.62 4.60 2.55 33.59 nd 4.88 0.20 0.24 5.82 1.48 8.45 1.68

28.24 7.95 19.87 1.60 0.44 4.21 9.52

26.81 4.68 7.38 1.26 0.15 3.34 15.35

24.73 6.14 20.90 2.04 1.13 2.45 8.01

Datos de Klein-Macphee et al., 1982 * Acidos grasos esenciales para pecesde agua dulce ** Acidos grsos esenciales para pecesmarinos Todos los valores estn experesadoscomo % total de cidos grasos.

CULTIVO DE COPEPODOS
1. CONSIDERACIONES GENERALES Los coppodos son crustceos de pocos milnetros que son considerados entre las alternativas de alimentacin en Acuacultura. Se han logrado cultivos de Calanoideos (Calanus sp., Acartia sp., etc.) y de Harpacticoideos (un ejemplo es Tigriopus japonicus). Tigriopus japonicus es un coppodo Harpacticoideo, cuyo adulto mide alrededor de 230 m. Posee un desarrollo larvario con seis estadios nauplio. Los nauplios recin closionados miden alrededor de 120 m. El estadio de copepodito est dividido en seis subestadios; el sexto estadio de copepodito es el estado adulto. En la Figura 22 se muestra el desarrollo de este organismo. 1.1) Tcnicas de Cultivo El cultivo de coppodos an no disponde de tcnicas sencillas para considerarlos posibles substitutos de la Artemia. La principal especie que se ha cultivado masivamente es Tigriopus japonicus, que se ha utilizado para la nutricin de larvas de peces y camarones (Kitajima et al., 1980a,b; Koga, 1979 en: Hirata et al., 1985). Otras especies que se han cultivado en forma masiva son Tiste, Amphiascella, Calanus etc., pero la que ha ofrecido las mayores ventajas para su produccin masiva es T. japonicus por su resistencia a cambios ambientales, como son la temperatura (1027C), salinidad (018), concentracin y tipo de alimento, etc. A continuacin se brinda la informacin necesaria sobre el cultivo de esta especi. En condiciones de cultivo se ha alimentado con una gran variedad de microorganismos (becterias, fitoplancton) detritus o cualquier otro material orgnico de pequeo tamao. En la Tabla 32 se muestran las diferentes dietas que se han utilizado en el cultivo de T.

japonicus. La seleccin del alimento determinar el contenido nutricional que pueda aportar esta especie para la alimentacin de larvas de peces y crustceos. Las dificultades para su cultivo masivo no son en razn de un estricto control de parmetros ambientales como la temperatura y salinidad, pues como ya se mencion anteriormente, esta especie es may resistente a variaciones externas del medio ambiente. Las dificultades para su cultivo estn en relacin con el sustrato, ya que esta especie es bentnica, por lo que se ha experimentado con diferentes formas y materiales de sustrato artificial. En la Figura 23, se muestran algunos de estos materiales probados. Los mejores resultados de produccin se han encontrado cuando se utiliza como sustrato alguna especie de macroalga (Ulva, Enteromorpha, Porfira, etc.), pues no slo juegan el papel de sustrato sino que aportan material de alimento y constituyen en los sistemas de cultivo un filtro biolgico que purifica el agua del mismo. Investigaciones de Koga (1979) consideran que la temperatura ptima en cultivo es de 20C. En el cultivo de T. japonicus y de otros coppodos en general, es importante proporcionar la temperatura ptima, el pH, el tipo de alimento y su concentracin ptima, as como la preparacin de hbitats adecuados (para aquellas especies que as lo requieran). 1.2) Importancia de los Coppodos Existe an un largo camino por recorrer en la investigacin encaminada a la produccin en cultivo de diferentes especies de coppodos, tanto bentnicas como fltoplanctnicas, pues la lista de especies alternativas se encuentra en proceso de experimentacin en laboratorio. Es importante recordar que en el ambiente marino los coppodos ocupan un importante papel en las poblaciones que conforman el zooplancton, pues es este grupo uno de los recursos de alimentacin ms importantes para peces y crustcoos.

FIG. 21) Estadios de crecimiento de Tigriopus japonicus (Koga, 1979) 1 6: Estadios de Nauplio 1 6 7 15: Estadios de copepodito y adulto 7 9: Copepodito 1 3 10 11: Copepodito 4 5 (hembra) 12: Adulto hembra 13 14: Copepodito macho 4 5 15: Adulto macho

FIG. 22) Esquema de tres diferentes tipos de sustrato para el cultivo masivo de Tigriopus japonicus. A. Estructura tipo panal 1. Base de polivinil transparente 2. Tubos aereadores B. 1. Lmina acanalada de polivinil 2. Lnea de acero cubierta con tubo de silicn 3. Aereador C. 1. Tela de mosquitero de plstico (luz de 1.6 mm) 2. Aereador (Estacin Experimental de Pesca de la Prefectura Hyogo, Japn 1978). TABLA 33. CRECIMIENTO DE Tigriopus japonicus CON DIFERENTES DIETAS (KOGA, 1979) Tipo de alimento Tasa de Crecimiento

alimentacin Levadura de repostera 125625 g/t

(Ind/1) 4,000 6,000 4,000 8,000 3,000 9,000 6,000 36,000 4,000 12,000 18,000 17,000 36,000 28,000

Alimento sinttico 30g 7 para anguila y peces veces/t carnvoros Alimento sinttico para camarn Alimento sinttico para yellowtail Nitzchia sp Leche en polvo Levadura seca Fragmentos de Undaria sp 0.1 1.0 g/2 1/5 das 10 15g/t/3das 5 105 cel/ml/da 0.1 0.5g/2 1/5/das 1 mg/1/da 5 20g/1/20 das

Fragmentos de Ulva 5 20g/1/20 sp das Fragmentos de Enteromrpha sp 1 kg/t

CULTIVO DE MICRCORUSTACUOS DE AGUA DULCE

1. CONSIDERACIONES GENERALES Dentro de esta clase de organismos existen dos gneros de agua dulce de gran importancia en Acuacultura, que son Daphnia y Moina, las cuales se localizan en diversos medios. El gnero Daphnia comprende ms de 20 especies, de las cuales las ms conocidas son: Daphnia magna, D. pulex, D. longispina, D. strauss. En relacin al gnero Moina podemos mencionar a las especies: Moina rectirostris, M. macrocopa, M. brachiata y M. affinis. 1.1) Morfologa Estos organismos se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado (Figura 24); no se distinguen segmentos como en otros crustceos. Presentan

dimorfismo sexual marcado, la hembra es ms grande que el macho (Figura 25). Presentan un carapacho de quitina transparente, las antenas o apndices con numerosas setas; ojos compaestos y simples (ojo nauplio). Una cavidad embrinica con huevos y embriones situados en la parte dorsal, entre el carapacho y el dorso del cuerpo. Para la identificacin de especies son importantes los apndices torxicos en la forma y nmero de espinas y setas (Figura 24). 2. PARAMETROS AMBIENTALES 2.1) Hbitat Son organismos ampliamente distribuidos en lagos, reservorios artificiales, charcos temporales y aguas de desecho. Poseen huevos de resistencia llamados efipios con una envoltura quitinosa que el aire y los animales pueden distribuir. Son abundantes en ambientes con alta concentracin de materia orgnica en donde proliferan hacterias, levaduras y microalgas. Especies de Daphnia pueden cohabitar con Moina, Coppodos y Brachipodos. 2.2) Temperatura D. magna es especialmente resistente a cambios extremos de temperatura desde OC a 22C y se consideran 18C-20C como su temperatura ptima. D. longispina, D. pulex y Moina rectirostris no sobreviven a cambios extremos de temperatura, se desarrollan en temperaturas de 28C 29C. Moina macrocopa se desarrolla tambin en un rango amplio de temperatura desde 5C a 30C y se considera de 24C 26C como su temperatura ptima. Moina brachiata crece en temperaturas de 8C 13C. 2.3) Requerimientos de Oxgeno Estos organismos habitan en medios donde la concentracin de O2 es variable, ya que pueden crecer tanto en completa saturacin de O2 hasta concentraciones muy bajas. Estas concentraciones estn en relacin a temperatura, concentracin de materia orgnica, concentracin de microalgas, etc. La supervivencia en medios pobres de oxgeno depende de la capacidad de sintetizar hemoglobina. Este fenmeno est en relacin directa del oxgeno ambiental. Un incremento en hemoglobina est en razn directa de alta temperatura y excesiva densidad de poblacin. Incluso la hemoglobina est presente tambin en los huevos y la sntesis de hemoglobina tambin est relacionada con la concentracin de CO2 ambiental.

FIG. 23) Daphnia pulex (hembra) Vollmer, 1951 1. Antenula 2. Antena Msculos de las 3. antenas 4. Ojos compuestos 5. Ganglio ptico 6. Msculo del ojo 7. Cerebro 8. Procesos hepticos 9. Intestino 10. Corazn 11. Ovario 12. Cmara embrionaria 13. Embrios 14. Proceos abdominales 15. Postabdomen 16. Ano 17. Huevo torxico 18. Saco respiratorio 19. Seta filtradora 20. Carapacho 21. Glndula maxilar Primer par de 22. apndices 23. Mandbula

FIG. 24) Estructura de antenulas en macho y hembra de D. magna (Irleva, 1973).

FIG. 25) Huevo de resistencia efipios en D. pulex (a) y D. magna (b). (Irleva, 1973). 2.4) Requerimientos en pH El pH ptimo en estas especies es difcil de determinar. En trminos generales, el pH oscila entre 7.1 8 y por ejemplo en D. pulex el pH ptimo es de 5 a 6. 2.5) Otros Requerimientos Existe en estas especies una alta sensibilidad a cambios del equilibrio inico a diferentes concentraciones de cationes en el medio. Las reacciones de Daphnia a la presencia de sales de fosfatos y nitratos (0.5 mg/l) es interesante, pues estimula la reproduccin y la madurez sexual.

Los huevos contienen carotenoides y su sntesis requiere de la presencia de luz. Es importante mencionar que la madurez sexual tambin est influenciada por la presencia de luz. La abundancia y distribucin de estas especies depende de la variacin estacional pues el nmero y tamao de huevos de resistencia partenogenticos y la medurez sexual dependen de las variaciones de T, S, pH y luz, entre otros. Un exceso de luz solar reduce considerablemente una poblacin. En relacin a la produccin de huevos Ephippia (Figura 26) (huevos de resistencia partenogenticos) dependen de la temperatura principalmente. Por ejemplo, en Moina rectirostris stos se producen a 20~27C en M. macrocopa a 14C. La alimentacin en Daphnia y Moina es ms compleja que en Branchipodos, ya que estas especies se alimentan de bacterias, levaduras y microalgas. La Daphnia se adapta a cambios ambientales y puede adaptarse a ambientes nuevos en tres - siete das, reproducindose partenogenticamente. Las colectas de estos organismos de los medios naturales para su cultivo, deben hacerse en Primavera y Verano. 3. TIPOS DE CULTIVO La produccin de Daphnia y Moina en condiciones de cultivo es relativamente sencilla por su resistencia a variaciones ambientales y diversas dietas altenativas que se pueden usar como se ha mencionado en prrafos anteriores. Como en otras especies de alimento vivo, las alternativas de produccin de estas especies pueden ser: cultivo en laboratorio para fines de investigecin, cultivo intensivo y cultivo extensivo. La Tabla 33 muestra la produccin de microcrustceos de agua dulce con diferentes especies de microalgas y bacterias. 3.1) Condiciones Optimas de Cultivo TC - 15C a 25C O2 - 3 a 6 mg/l pH - (6.8 7.8) Grado de Oxidacin - 14.826.2 mg O2/l 3.2) Medios de Cultivo Recomendables

Medios minerales (sales de fosfatos y nitratos) Medios orgnicos (estircol de caballo, res, cerdo, gallina) Medios enriquecidos (combinacin de medios orgnicos e inorgnicos o estractos de suelo

Se recomienda cosechar estos organismos a intervalos regulares para mantener un equilibrio en el cultivo. En condiciones ptimas de cultivo para iniciar la cosecha (de 20 a 25 das despus del inicio del cultivo), se puede obtener una biomasa de 10 g/m3. Las Tablas 34 y 35 muestran los diferentes medios de cultivo recomendables para sistemas intensivos y extensivos. 4. IMPORTANCIA NUTRICIONAL

Las especies ms estudiadas en relacin de su aporte nutricional para la acuacultura son Daphnia y Moina. La Tabla 36 nos muestra el contenido nutricional reportado para Daphnia. Estas dos especies de cladceros de agua dulce han sido seleccionadas dentro del grupo de zooplancton que ofrece alto contenido nutricional y facilidades de produccin en cultivo. La Tabla 37 muestra la composicin mineral y proximal de cinco especies seleccionadas como alimento vivo; entre stas se encuentran Daphniay Moina. Es importante considerar que el contenido nutricional de estas especies est en funcin directa del sustrato en el que se desarrollan. La Tabla 5 muestra la composicin de aminocidos esenciales de estas cinco especies seleccionadas; dentro de stas, Daphnia y Moina tienen un buen aporte. Los cladceros en Acuacultura han sido objeto de estudios muy serios en pases desarrollados como el Japn y La Unin Sovitica. Estos trabajos han permitido conocer las condiciones ptimas para su produccin en cultivo masivo, as como las alternativas de produccin en diferentes medios de cultivo. TABLA 34. PRODUCCION DE MICROCRUSTACEOS DE AGUA DULCE CON DIFERENTES ALIMENTOS (IRLEVA I.V., 1973) ESPECIE ALIMENTO CONSUMO CONCENTRACION DE DE ALIMENTO TC REFERENCIA ALIMENIO ccl/ml. cel/hr 1,000 Daphnia magna bacterias coliformes 2,000 3,000 4,000 410 750 D. magna Chlorella pyrenoidosa 1,140 1,580 2,160 2,300 D. magna Soenedesmus sp D. magna Azotobacter y bacteria Coli 8 415 22 470 a 24 18 15 200 700 1,050 1,700 124 255 299 393 405 327 58 275 Vasilleva, 1953 Rodina, 1984a Sushchenya, 1958 Manuflcva, 1964

25 D. pulex Chlamydomonas 50 reinhardti 75 100 Moina affinis Soenedesmus dimorphus 6,000 200 Moina sp Soenedesmus sp 500

20

4.5 5.8 13.8 19.1 Richman, 1958

24.0 26.5 212 16.6 48.0

Shirota, 1966 Torrentera, 1986 (observacin personal)

TABLA 35. MEDIO DE CULTIVO PARA PULGA DE AGUA PARA SISTEMA INTENSIVO (SEPESCA-ACUACULTURA, 1983, COM. PERS.) -I1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pngase 6.6. gr de salvado de trigo en 1 litro de agua. Dejar fermentar en un lugar moderadamente caliente durante una semana. Diluir el litro a 100 litros de agua. Agregar 25 a 50 gr de Cloruro de Sodio (sal). Agregar 25 a 50 gr de Sulfato de Calcio. Colocar la solucin en un sitio donde le de bastante sol. Sembrar el medio con Pulgas de Agua. -II1. 2. 3. 4. 5. 6. Pngase 6.6 gr de salvado de trigo en 1 litro de agua. Dejar fermentar en un lugar moderadamente caliente durante una semana. Diluir 1.5 litros en 100 litros de agua. Agregar 25 a 50 gr de Cloruro de Sodio (sal). Agregar 25 a 50 gr de Sulfato de Calcio. Agregar 5 a 10 gr de hgado cocido en rebanadas de 1 mm de grueso. El hgado debe cocerse lo ms rpidamente hasta que las protenas se coagulen. 7. No es necesario poner la solucin al sol. 8. Simbrese el medio con Pulgas de Agua. 9. Si falta oxgeno disuelto en la solucin, debe retirarse un poco de agua (5 litros) y agregar la misma cantidad de agua limpia fresca y aereada. 10. Se aadir salvado fermentado e hgado cuando sea necesario. -III1. Mezclar hasta formar una suspensin uniforme 1/4 de paquete de levadura para pan fresca en 100 cc. de agua. 2. Adase la suspensin a 70 litros de agua. 3. Debe mantenerse burbejeo de aire en la solucin para evitar la falta de oxgeno disuelto.

4. Simbrese el medio con Pulga de Agua. 5. Se agregar la suspensin cada cinco o seis das.

TABLA 36. RESULTADOS DE CULTIVOS DE MICROCRUSTACEOS DE AGUA DULCE (CLA NUTRIENTES ORGANICOS E INORGANICOS - SISTEMAS INTENSIVO Y EXTENSIVO (IRLEVA, TIEMPO DE VO DOSIS DE NO. INICIAL DURACION BIOMASA MADU COSECHA TO FUENTE DE FERTILIZACION DE DEL MAX. RACION DIARIA DE NUTRIENTES POR m3 DE ORGANISMOS CULTIVO OBTENIDA DEL g/m3 CU AGUA g/m3 (DIAS) g/m3 CULTIVO M3 (DIAS) 1.5 kg (inicial) Excreta de 0.75 kg (cada 8 10 2025 40 caballo 10 das) 1.5 kg (inicial) Excreta de 0.75 kg (cada 8 10 612.5 caballo 10 das) Infusin de excreta de 10 litros 550 1016 945 250 25.8 30. caballo Infusin de 10 litros cada 4 34.4 (30 pasto (2 kg/100 1520 1519 2647 2501,500 5.5 das 38.5) 1) Infusin de 10 litros cada 24 excreta de 10275 1024 1442 2501,000 27.3 27. das (10:3) caballo y pasto 1620 g inicial 3040 1820 120130 8001,200 3050 25 Levadura proteolizada 810 g/5 das 1620 gr inicial 1040 2025 180270 16 280 Levadura 810 g/5 das 26 525 proteolizada 23 557 37.5 g nitratos (13 Fertilizantes mg N/l) 2 mg/l 2040 12 15 13.4 332 minerales superfosfatos 37.5 g nitrato de 2025 50 7 amonio y 20 gr de (verano) Fertilizantes levadura (al inicio) 100 5 2540 20 minerales 19 g de nitrato de 3545 amonio y 10 g de 150 34 (invierno) levadura c/5 das Excreta de caballo trozos 0.5 1 kg 28 de vegetales superfostatos y

sulfato de amonio Levadura 0.5 kg proteolizada y fertilizantes minerales 10:2

34

1015

106 a 110

TABLA 37. CONTENIDO DE AMINOACIDOS EN Daphnia (IRLEVA I.V., 1973) Tyrosina 4.27% Tryptophano 3.62% Arginina 10.92% Histidina 2.69% Cistina 1.17% Methionina 3.45% TABLA 38. COMPOSICION MINERAL Y PROXIMAL DE CINCO ESPECIES DE ALIMENIO VIVO SELECCIONADO Brachionus Tigriopus Plicatilis japonicus ESPECIE Acartia Daphnia Medio de Levadura Levadura Levadura sp sp cultivo Levadura + Chlorella + Chlorella Chlorella Mezcla% 89.6 89.1 87.6 87.3 88.1 89.3 87.2 Protena% 7.2 7.9 7.8 9.0 8.5 7.5 8.8 Lipidos% 2.3 2.3 3.8 2.8 1.3 1.4 2.9 Cenizas % 0.4 0.4 0.5 0.5 2.1 0.7 Ca mg/g 0.12 0.26 0.21 0.15 0.39 0.21 0.12 Mg mg/g 0.14 0.17 0.14 0.23 0.76 0.12 0.12 P mg/g 1.48 1.44 1.37 1.31 1.48 1.46 1.85 Na mg/g 0.41 0.30 0.29 0.61 6.63 0.74 1.09 K mg/g 0.35 0.12 0.23 0.84 2.21 0.72 0.92 Fe mg/g 15.9 52.5 43.4 33.8 11.5 72.2 46.4 Zn mg/g 7.4 9.8 8.2 12.3 39.0 12.8 10.0 Mn mg/g 0.4 1.1 1.1 1.0 0.2 13.2 0.5 Cu mg/g 1.1 1.5 1.7 2.4 2.8 1.1 5.8 * Watanabe et al., 1983