TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE

ETUDE DES NON ENTEROBACTERIES

1. Présentation du TP

1.1 Objectifs du TP :
- Etudes des non Entérobactéries.
- Identification par Micro galeries API 20 NE.
1.2 Présentation de la micro galerie
-Voir fiche technique.

2. Manipulation

JOUR 1 : Analyser un mélange

1. Réaliser les observations microscopiques, Etat frais et Gram.
2. Réaliser un isolement sur : GTS et Drigalski.

JOUR 2 : Identifier le germe.

3. Réaliser l’analyse des milieux de culture : GTS et Drigalski ensemencés le jour 1
• Compléter le tableau de la fiche de résultat.
A partir du milieu Drigalski,
4. Réaliser un contrôle microscopique et le test enzymatique d’orientation afin de
confirmer une non entérobactérie (Bacille Gram -, Oxydase +)
• Compléter le tableau de la fiche de résultat.
5. Réaliser une suspension et effectuer les recherches suivantes :
- Type Respiratoire, Voie d’Attaque du Glucose.
- Ensemencer une gélose Ordinaire et une TCBS (voir doc annexe).
- Ensemencer la micro galerie suivante : API 20 NE afin d’identifier votre germe.

JOUR 3 : Identifier le germe.

6. Effectuer la lecture des résultats de la recherche de la voie d’attaque du glucose,
du type respiratoire et des isolements.
• Compléter le tableau de la fiche de résultat.
7. Effectuer la lecture de la galerie API 20 NE
• Compléter la fiche de lecture.
8. Identifier le germe.
 JOUR 1

Etat Frais : Gram :

- -

- -

JOUR 2
Analyse
GTS DRIGALSKI
Macroscopiqe

TYPE 1

TYPE 2

Gram de contrôle : Test enzymatique d’orientation :

Principe et conclusion

JOUR 3
HUGH
VF GO TCBS
LEIFSON

Lecture de la galerie API 20 NE : coller fiche API 20 NE

Identification : …………………………………………….
 T.C.B.S.
Thiosulfates Citrate Bile Saccharose

Composition : Rôle :

Peptone 10 g Permet l’isolement des Vibrio cholerae

Extrait de levure 10 g
Saccharose 20 g
Citrate de sodium 10 g
Citrate de fer III 1g
Bile de Bœuf 8g
BBT 40 mg
Bleu de thymol 40 mg
Thiosulfate de sodium 10 g v
Chlorure de sodium 10 g
Agar 14 g
Les colonies jaunes : ………………………………
pH= 8.6
Les colonies bleues vertes : ………………………..
Centre noir H2S +
Pas de centre noir H2S -
Les Vibrio cholerae apparaissent sous forme de ……
………………………………………………...

T.C.B.S.
Thiosulfates Citrate Bile Saccharose

Composition : Rôle :

Peptone 10 g Permet l’isolement des Vibrio cholerae

Extrait de levure 10 g
Saccharose 20 g
Citrate de sodium 10 g
Citrate de fer III 1g
Bile de Bœuf 8g
BBT 40 mg
Bleu de thymol 40 mg
Thiosulfate de sodium 10 g v
Chlorure de sodium 10 g
Agar 14 g
Les colonies jaunes : ………………………………
pH= 8.6
Les colonies bleues vertes : ………………………..
Centre noir H2S +
Pas de centre noir H2S -
Les Vibrio cholerae apparaissent sous forme de ……
………………………………………………...
TP 25 – Vibrio – Bacilles Gram- Oxydase+

1 – Ecologie :
1.1 – Habitat :
Ceux sont des bactéries de l’eau.
Elles sont saprophytes. βie halophiles et halotolérantes.

1.2 – Pouvoir pathogène :

Quelques espèces ont un pourvoir pathogène, certaines chez l’Homme d’autres
chez les animaux aquatiques (poissons).
L’espèce la plus connue comme pathogène est Vibrio cholerae qui est l’agent du choléra
responsable de pandémies (Épidémie qui s'étend à la quasi-totalité d'une population) sur
plusieurs continents. C’est une TI intestinale transmise par l’eau de boisson, les légumes
crus, les fruits. Cette pathologie se manifeste par des vomissements et des diarrhées
abondantes.
La perte d’eau conduit à une déshydratation intense et rapide ce qui entraîne la mort en 2
ou 5 jours.
Le pouvoir pathogène des vibrions s’explique par leur toxine cholérique qui agit au niveau
de l’intestin grêle. Cette toxine stimule la sortie d’eau au niveau des entérocytes.

2 – Morphologie et particularités :
Bacilles Gram-, oxydase+, très mobiles grâce à un flagelle polaire (donc
déplacement rectiligne), aérobie stricte et métabolisme oxydatif.
Bacilles généralement incurvés en virgule, fins.
Ce sont des bactéries non exigeantes et très tolérantes vis-à-vis des conditions de
culture (NaCl).
Croissance stimulée à pH alcalin : 7,6-9
La croissance peut s’effectuer sur gélose sélective des Entérobactéries.

3 – Critères d’identification :
3.1 – Gélose TCBS : Milieu riche
Peptone 10 g…………………………………….Milieu riche
Extrait de levure 10 g……………………………………
Saccharose 20 g……………………………..source C et energie
Citrate de sodium 10 g………………..……..Inhibiteur (forte concentration)
Citrate de fer III 1 g………………..……..Révélateur de la production d’H2S
Bile de Bœuf 8 g………………..……..Inhb Flore Gram +
BBT 40 mg………………..……..Indic Variation de pH
Bleu de thymol 40 mg………………..…….. Indic Variation de pH
Thiosulfate de sodium 10 g………………..……..Précurseur d’H2S
Chlorure de sodium 10 g………………..……..Inhibiteur et source de Minéraux
Agar 14 g
pH= 8.6 …………………………………………….sélection Vibrio

Rôle
Permet l’isolement des Vibrio cholerae
Les colonies jaunes : Saccharose +
Les colonies bleues vertes : Saccharose
–
Centre noir H2S +
Pas de centre noir H2S -
Les Vibrio cholerae apparaissent sous
forme de colonies jaunes (S+) sans
centre noir (H2S-).
3.2 – API 20 NE :Voir documents fournis.
 Le Choléra
Le choléra est une toxi-infection entérique épidémique contagieuse due à Vibrio cholerae,
ou bacille virgule, découvert par Koch en 1883, et caractérisée par des diarrhées banales ou
cataclysmiques. La forme majeure classique est fatale dans plus de la moitié des cas, en
l’absence de traitement (de quelques heures à trois jours).
La contamination est orale, d’origine fécale, par l’eau de boisson ou des aliments souillés.
Le choléra a été la première maladie pestilentielle à faire l’objet, dès le XIXe siècle, d’une
surveillance internationale.

Répartition géographique du choléra :

♦ endémique
♦ sporadique

En France, on compte quelques cas de choléra chaque année ; dans la plupart des cas, la
maladie a été contractée à l'étranger, on a dénombré cinq cas de choléra autochtone entre 1970
et 1996.

1 - Principales épidémies :
La première description historique par un Européen est faite en 1503 par un officier de
Vasco de Gama, qui décrit une épidémie de diarrhées cataclysmiques rapidement mortelles (en 8
heures) et provoquant 20000 morts à Calicut (Inde).
Limitées initialement à l'Asie (Inde, Chine et Indonésie), les épidémies se développent au
XIXe siècle en véritables pandémies qui atteignent le Moyen-Orient, l'Europe et les Amériques.
Il y a eu 7 pandémies recensées et c'est en Afrique, où le choléra sévit désormais de façon
endémique, que la situation est la plus préoccupante aujourd'hui.

2 - Prévention contre le choléra :

Il existe un vaccin dont l'efficacité est loin d'être absolue et qui n'est obligatoire dans aucun
pays. Ce vaccin est commercialisé en France à destination des voyageurs.
Dans les zones endémiques, la prévention du choléra consiste essentiellement en des
mesures d'hygiène, et notamment empêcher le croisement de la chaîne alimentaire avec la
chaîne des excréments.
En ce qui concerne la nourriture, il convient d'utiliser une eau saine pour l'hygiène, la
boisson et le lavage des aliments.

3 - Diagnostic et thérapie :
Dans les cas bénins, le choléra se manifeste par une entérite, qui n'est en général pas
diagnostiquée comme étant le choléra. Il se manifeste de manière aiguë par des vomissements
ainsi que des diarrhées liquides abondantes et fréquentes (50 à 100 par jour), qui entraîne une
déshydratation ainsi qu'une perte de sels minéraux et une augmentation de l'acidité du sang. Les
selles sont incolores et inodores (aspect « d'eau de riz »). Dans les cas graves, cette modification
métabolique peut entraîner la mort en un jour ou deux.
Le diagnostic exact se fait par culture de germes à partir de selles.
Le traitement consiste essentiellement en une réhydratation, qui maintient le patient en vie
le temps qu'il guérisse spontanément en quelques jours. La réhydratation est si possible associée
à des antibiotiques.