Determinao da cafena de uma bebida energtica por HPLC/UV

Mtodos Instrumentais de Anlise 5 Ano do Mestrado Integrado em Bioengenharia

Elisabete Marina Nunes Pires (bio10072@fe.up.pt) Joana Rita Ferreira dos Santos (bio10074@fe.up.pt)

PORTO, 21 de Dezembro de 2012

Sumrio A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) uma tcnica de separao que, nos ltimos anos, passou a ser um dos mtodos analticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razes que sustentam a sua ampla utilizao esto relacionadas com a sua adaptabilidade para determinaes com boa sensibilidade, possibilidade de separar espcies no-volteis e termicamente instveis, com destaque para a indstria farmacutica, ambiental, alimentar, e em muitos outros campos da cincia, como o da medicina. Este trabalho est integrado na unidade curricular Mtodos Instrumentais de Anlise (MIA), cujos objectivos so o estabelecimento de uma resposta apropriada para a determinao do teor de cafena numa bebida energtica por HPLC/UV. Ou seja, pretendeu-se implementar, compreender e validar a metodologia analtica de HPLC/UV, e ainda avaliar o desempenho da cromatografia. Para anlise por HPLC/UV, a amostra e os padres foram preparados a partir de uma bebida energtica e de uma soluo me de cafena, respectivamente. Para tal, foi utilizado um cromatgrafo HPLC/UV, com uma coluna de fase C18 cuja fase ligada octadecilslica (250-4, com partculas 5m) e uma fase mvel composta por trietilamina, cido fosfrico, acetonitrilo e gua. O caudal do eluente utilizado foi de 1mL/min e um loop de 20L. Uma vez que, se pretendeu analisar a cafena, o comprimento de onda de deteco no UV foi de 273 nm. A separao cromatogrfica mostrou-se ideal, pois o factor de capacidade foi de 1,520,02. Foi, ainda, avaliado a qualidade da separao pela eficincia (N=233438). Atravs da reta de calibrao determinou-se a concentrao da amostra (3,37 0,24 mg/L), considerando-se o factor de diluio, o teor de cafena na bebida energtica foi de 337 24 mg/L, valor este prximo do valor rotulado. Relativamente validao do mtodo analtico, obteve-se uma gama de linearidade de 0,5 mg/L a 10 mg/L e um limite de deteco e de quantificao de 0,24 mg/L e de 0,79 mg/L, respectivamente. Quanto ao estudo da exatido, avaliada pelo erro relativo (Er), obteve-se um Er 5%. Apresenta ainda um coeficiente de correlao de 0,999 e o desvio padro do relativo do declive de 2% Estes parmetros mostraram que o mtodo adequado para o fim a que se destina.

ndice
1. Introduo 4

2. Materiais e Mtodos

2.1. Equipamento

2.2 Fase mvel

2.3. Preparao dos padres e da amostra

2.4. Anlise por HPLC/UV

3. Resultados e Discusso

3.1. Cromatograma

3.2. Desempenho da separao cromatogrfica

10

3.3. Teor da cafena na amostra

11

3.4. Validao do Mtodo analtico: Parmetros de quantificao e de fiabilidade (Exatido)

12

4. Concluses

13

5. Referncias

14

6. Apndice

15

1. Introduo Terica A cromatografia uma tcnica poderosa e verstil, que num processo nico capaz de separar e identificar os componentes de uma mistura e, simultaneamente, proporciona uma estimativa quantitativa de cada constituinte da mistura [1]. O processo de separao obtido pela distribuio dos componentes entre duas fases, a fase mvel e a fase estacionria. Isto , a mistura introduzida na fase mvel e transportada por esta ao longo de uma coluna que contm a fase estacionria [2,3]. A fase estacionria estabelece as possveis interaes de afinidade com os componentes da amostra. Assim, quanto menor for a afinidade de um componente da mistura para a fase estacionria, menor ser o tempo a percorrer a coluna, ou seja, menor o tempo que ficam retidos [3]. A classificao da cromatografia depende do estado das fases (mvel e estacionria). A fase mvel poder ser um gs ou um lquido, dando origem a dois a tipos de cromatografia: cromatografia gasosa, em que a fase mvel gs e cromatografia lquida, sendo a fase mvel um lquido. Da mesma forma, a fase estacionria ser normalmente um lquido ou um slido, o qual d origem a quatro subgrupos de cromatografia: cromatografia de gs-lquido; cromatografia de gs-slido; cromatografia lquido-lquido; e cromatografia lquido-slido [2]. A cromatografia pode ainda ser classificada, segundo o modo de separao (adsoro, partio, excluso molecular e troca inica) [4] Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC, sigla inglesa de High Performance Liquid Chromatography) distingue-se da cromatografia lquida convencional pelo uso de instrumentao sofisticada e colunas de alta eficincia. As principais vantagens da HPLC recaem sobre a reduo do tempo de anlise, elevada resoluo, sensibilidade, seletividade e reprodutibilidade [5]. A HPLC pode ser dividida em dois grupos, cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa. Quando a fase estacionria (normalmente slica) polar a cromatografia de fase normal. Na situao inversa, ou seja, quando a fase estacionria apresenta menor polaridade que o eluente a cromatografia denominada de fase reversa. Nesta, fase estacionria normalmente constituda por substncias polares quimicamente ligadas a grupos funcionais apolares. de salientar que a cromatografia em fase reversa a mais recorrida para anlises por HPLC [6]. Um sistema de HPLC consiste, essencialmente, nos seguintes constituintes: uma bomba, um sistema de injeo, uma coluna de separao e um detetor (Figura 1) [6]. A bomba tem como finalidade superar a resistncia exercida pela coluna ao escoamento da
3

fase mvel, permitindo um fluxo contnuo e constante da fase mvel, independentemente da sua viscosidade e da contrapresso da coluna [7]. O constituinte seguinte, o injetor, baseia-se essencialmente num sistema de vlvulas que permitem introduzir a amostra num volume preciso e exato, loop, sendo o excesso de amostra descartado. Ou seja, no necessrio que o volume seja preciso. A injeo conseguida pela rotao da vlvula da posio de carga (load) para a posio de injeo (inject) [8]. Relativamente coluna, pode afirmar-se que esta o corao do equipamento HPLC, porque aqui que a separao ocorre [7,8]. A coluna instalada entre as vlvulas do injetor e o detetor, sendo o espao onde se d o contacto entre a fase mvel e a fase estacionria. As colunas mais comuns em HPLC so de enchimento, quer de partculas slidas (cromatografia de adsoro) ou de partculas revestidas com filme lquido (cromatografia de partio) [4]. No que diz respeito ao detetor, este equipamento regista continuamente propriedades, fsicas ou fsico-qumicas, medida que os componentes da mistura saem da coluna. Um detetor apropriado tem de ter a capacidade para detetar a presena de um composto e enviar o sinal eltrico correspondente para um sistema de aquisio de dados. A escolha do detetor feita de entre diferentes tipos de detetores (seletivos e universais), dependendo das caractersticas e concentraes dos compostos que tm de ser separados e analisados. Dos detetores existentes destacam-se, pela sua basta aplicao, os detetores ultravioleta (UV), de ndice de refrao e de fluorescncia [7,8].

Figura 1 Representao esquemtica dos constituintes do HPLC [9].

Resumidamente, na anlise por HPLC, a amostra injetada no sistema de injeo e arrastada pela fase mvel, sendo forada a percolar atravs da coluna cromatogrfica, com o auxlio de uma bomba. Os componentes deslocam-se ao longo da coluna com velocidades diferentes e, medida que saem da coluna a sua passagem registada por
4

um detetor que vai transmitir um sinal eltrico necessrio para gerar o cromatograma. O cromatograma obtido relaciona a resposta do detetor com o tempo de reteno de cada componente [9]. A partir de um cromatograma podem obter-se vrios parmetros que iro permitir caracterizar a separao cromatogrfica. O primeiro pico de um cromatograma corresponde eluio do componente no retido, e ao tempo que este demora a sair da coluna designa-se por tempo morto (t0). Por outro lado, o tempo que os componentes retidos na coluna demoram a sair denota-se por tempo de reteno (tr). de salientar que este tempo permite a identificao dos compostos. Uma outra informao a retirar do cromatograma a largura do pico (w) ou a largura do pico a meia altura (w1/2), referente ao componente retido [6,7]. O desempenho de uma cromatografia pode ser avaliado pelo fator de capacidade (K), eficincia (N), seletividade () e resoluo (R) [6,7,8]. Sendo que o fator de capacidade e a eficincia so determinados para caracterizar os parmetros cromatogrficos referentes a um componente. Por outro lado, a resoluo e seletividade relacionam caractersticas entre dois componentes da mistura. O K obtido pela equao 1, definido como a medida da reteno de um componente na fase estacionria, um parmetro adimensional, caracterstico de cada componente eludo para uma determinada fase e independente de outros parmetros [7].

A eficincia avalia a qualidade de separao e expressa a eficincia de uma coluna cromatogrfica. Quanto menor for a banda cromatogrfica, isto , quanto mais estreito for o pico do componente, maior ser a capacidade de separar um maior numero de componentes num determinado tempo, e mais eficiente a coluna. Considerando que o pico representa uma distribuio aproximadamente gaussiana, a obteno experimental da eficincia dada pela equao 2.1 e 2.2 dependendo da largura de banda [4,8]. ( ) ( )

A seletividade (equao 3) descreve a capacidade do mtodo separar dois componentes de uma mistura, depende da temperatura, da natureza do analto, da fase estacionria e fase mvel sendo independente do fluxo [6].
5

Por fim, a resoluo mede como dois picos adjacentes so separados, considerando as larguras dos picos na linha de base, bem como os respetivos tempos de reteno (equao 4) [4,7].

A HPLC aplicada em vrios ramos da cincia, nomeadamente, na indstria alimentar, por forma a determinar a composio real de uma dada substncia num produto. A cafena (1,3,7-trimetilxantina), presente na dieta humana, pode ser encontrada em diversos produtos: ch, caf, coca-cola, bebidas energticas, entre outros [10,11]. Este trabalho, integrado na unidade curricular de Mtodos Instrumentais de Anlise, tem como objetivo, primeiro, implementar, compreender e validar a metodologia analtica de HPLC/UV, aplicada na determinao do teor de cafena numa bebida energtica. O segundo objetivo consiste em avaliar o desempenho da cromatografia, atravs do clculo do fator de capacidade e da eficincia.

2. Material e Mtodos 2.1. Equipamento As amostras foram analisadas por HPLC (figura 2). Utilizou-se um HPLC com um detetor UV-Vis (Knauer, modelo A0293) de comprimento de onde varivel, ligado a um sofware de aquisio e processamento de dados. Possu uma bomba de alta presso(Knauer, Well chrom Maxi-Ster K-1000). A coluna cromatogrfica usada foi uma coluna C18, LichoCart , cuja fase ligada de octadecilslica com tamanho de partcula de 5 m, 250mm de comprimento e 4,6 mm de dimetro.

Figura 2 Fotografia do equipamento de HPLC/UV do laboratrio de MIA do DEQ.

2.2. Fase mvel A fase mvel, composta por trietilamina, cido fosfrico, acetonitrilo e gua, j tinha sido previamente preparada. Esta soluo encontrava-se filtrada e tinha sido desgazificada durante 15 minutos. 2.3. Preparao dos padres e da amostra Para a preparao dos padres de calibrao, fizeram-se os clculos de diluio necessrios e procedeu-se preparao dos padres em bales volumtricos de 100 0,1 mL, medindo os volumes necessrios de soluo me com uma micropipeta (figura 3). A soluo me de cafena de concentrao 500 mg/L, j preparada antes da elaborao deste trabalho experimental, deu origem aos padres de concentraes 0,5 mg/L; 0,75 mg/L; 1,00 mg/L; 5,00 mg/L e 10,00 mg/L.

V=0,10 mL

V=0,50 mL

V=0,20 mL

V=1 mL

V=2 mL

Soluo me (500mg/L)

0,50mg/L

0,75mg/L

1,00mg/L 5,00mg/L

10,00mg/L

Figura 3 Representao esquemtica da preparao dos padres de calibrao

A amostra foi preparada num balo de 1000,1 mL, a partir de uma bebida energtica, numa diluio de 1:100 (figura 4). O volume da amostra foi medido com auxlio de uma micropipeta. Por fim, a amostra e os padres foram filtrados por uma membrana com porosidade de 0,45 m.

V=1 mL

Bebida energtica

Amostra

Figura 4 Representao esquemtica da preparao da amostra a partir de uma bebida energtica.

2.4. Anlise por HPLC/UV Inicialmente houve o cuidado de efetuar a purga da fase mvel para eliminao de eventuais bolhas de ar no sistema cromatogrfico, bem como garantir uma linha de base estvel. Este processo tambm foi sucedido antecipadamente. Antes da injeo a seringa foi lavada com gua destilada e, posteriormente, lavada vrias vezes com a soluo que se pretende analisar. Iniciou-se a injeo dos padres, por ordem crescente de concentraes, de modo a obter a curva de calibrao. Por fim, injetou-se a nossa amostra, soluo diluda da bebida energtica. A anlise cromatogrfica, tanto dos padres como da amostra, foi feita por injeo das solues com a vlvula na posio load. Para que introduzir a amostra na coluna mudou-se a posio da vlvula para inject e, simultaneamente inicia-se o registo do cromatograma. Este fornecido pelo programa de aquisio e tratamento de dados. O volume de soluo injetado no necessitava de ser exato, uma vez que apenas passava para a coluna o volume do loop, 20L. O caudal de eluente foi 1 mL/min e o comprimento de onda de deteo no UV foi 273 nm. A escolha deste comprimento esta intimamente relacionado com o espetro de absoro da cafena, onde a sua absoro mxima a 273 nm [10].

3. Resultados e Discusso 3.1 Cromatograma medida que os componentes da mistura saem da coluna, j separados, chegam ao detetor, onde registada a sua passagem gerando um cromatograma (figura 5). Como foi dito anteriormente, o primeiro pico num cromatograma alusivo dos compostos no retidos, neste caso o primeiro pico do cromatograma obtido relativo gua (solvente). O outro pico presente no cromatograma identifica a cafena pelo tempo de reteno que lhe caracterstico.

Figura 5 Cromatograma da amostra obtido por HPLC/UV.

A partir do cromatograma, o programa permitiu que se retirasse informao referente ao tempo de reteno, ao tempo morto e largura do pico a meia altura (tabela I). de salientar que o tempo de reteno mdio para a cafena foi de 7,10 min, e com base em seis determinaes, o desvio padro do tempo de reteno foi de 0,07 min.
Tabela I Informao fornecida pelo programa de aquisio e processamento de dados. tr (min) Mdia Desvio padro 7,10 0,07 t0 (min) 2,81 0,01 W1/2 (min) 0,35 0,01

Alm do valor mdio do tempo morto obtido experimentalmente, foi possvel estimar o seu valor teoricamente. O valor terico para o tempo morto foi calculado tendo em conta o caudal usado, a rea e o comprimento da coluna (Apndice 1. Clculo do tempo morto terico). O valor obtido para o tempo morto terico foi de 3,14 min. Comparando o valor terico com o valor obtido experimentalmente verifica-se que estes so semelhantes. Este facto poder levar a concluir que a coluna muito porosa, assim o caminho percorrido experimentalmente semelhante ao comprimento da coluna. Ou seja, pressupem-se que o trajeto percorrido aproximadamente linear devido elevada porosidade da coluna. 3.2 Desempenho da separao cromatogrfica O desempenho da separao cromatogrfica foi avaliado pela determinao do factor de capacidade e da eficincia. Pelos valores da tabela I foi possvel calcular o factor de capacidade e a eficincia, tendo em conta a equao 1 e a equao 2.1, respectivamente (Apndice 2. Clculo factor de capacidade e eficincia). Na tabela II apresenta-se os respectivos valores mdios e o desvio padro associados.
Tabela II Factor de capacidade (K) e eficincia (N) cromatogrfica. K Mdia Desvio padro 1,52 0,02 N 2334 38

O factor de capacidade descreve a migrao dos componentes da amostra ao longo da coluna, se este valor for muito baixo (inferior a 1) significa que a eluio d-se de uma forma rpida que torna difcil determinar qual o tempo de reteno, por lado se K for superior muito elevado (superior a 20) a o tempo de reteno muito elevado, levando a uma anlise excessivamente demorada. Assim define-se como um factor de capacidade ideal compreendido entre 1 e 10 [12]. O valor de K obtido (1,520,02) nesta anlise encontra-se na gama ideal. Comparando a eficincia obtida (233438) com a eficincia terica da coluna fornecida pelo fabricante (12500), verifica-se que o valor obtido experimentalmente muito inferior em relao ao esperado teoricamente. Uma possvel explicao para este facto incide sobre a reduo do tempo de anlise para que fosse possvel fazer a anlise cromatogrfica no tempo de aula.

10

3.3. Teor da cafena na amostra Alm dos parmetros fornecidos, j referidos (tr, t0, W 1/2), tambm fornecido a rea do pico. Assim, para cada concentrao padro associada uma rea do pico, permitindo traar uma reta de calibrao que relaciona a rea do pico (uv.min) com a concentrao (mg/L) (figura 6).

300000 250000 200000 rea(uv.min) 150000 100000 50000 0 0,00

Reta de calibrao da cafena por HPLC/UV

y = 25482x + 3231,8 R = 0,9979

2,00

4,00 6,00 Concentrao(mg/L)

8,00

10,00

Figura 6 Representao grfica da reta de calibrao da cafena por HPLC/UV.

Calculou-se o desvio padro associado ao declive e ordenada da origem da equao da reta de calibrao (Apndice 3. Clculo dos erros associados ao declive e ordenada da origem da reta de calibrao). A equao da reta, com os seus erros associados pode ser rescrita na seguinte forma (equao 5):

Onde, o valor de y tem como unidades uv.min, o declive uv.min/ (mg/L), o x mg/L e a ordenada da origem uv.min. Com base na equao da reta (equao 5), e sabendo a rea do pico da amostra de concentrao de cafena desconhecida, foi possvel determinar o teor de cafena da amostra (X0), e posteriormente, considerando-se o fator de diluio, determinar a concentrao da cafena na bebida energtica (C). A concentrao da cafena na amostra e a respectiva incerteza (S x0) obtidas foi de 3,370,24 mg/L. Por sua vez, concentrao de cafena na bebida energtica obtida por
11

HPLC/UV, foi de 33724 mg/L, este um valor prximo do teor de cafena rotulado, 320 mg/L. (Apndice 4. Clculos da concentrao e incerteza associada).

3.4. Validao do Mtodo analtico: Parmetros de quantificao e de fiabilidade (Exatido) A informao retirada da reta de calibrao permite obter os parmetros de quantificao que possibilitam a validao do mtodo. Estes parmetros, o seu limite de validao e os valores obtidos esto apresentados na tabela III. (Apndice 5. Clculos para o limite de quantificao e para o limite de deteo)
Tabela III Validao do mtodo analtico: Parmetros de quantificao

Validao Recta de calibrao: pontos Gama de concentraes Limite de deteo Limite de quantificao( Ordenada da origem Coeficiente de correlao ) 0

Obtido

5235,54

Analisando a tabela acima, verifica-se que apenas um dos parmetros no vlido, ordenada na origem. Esta no validao pode ser devida ao rudo instrumental. de salientar que o valor do limite de quantificao, valor mnimo do analto que possvel medir, muito mais baixo que a concentrao de cafena quantificada na amostra (X 0). Sendo por isso, o limite de quantificao vlido para a para o nosso objetivo, bem como o limite de deteo. Alm disso, foi averiguado a fiabilidade do mtodo, atravs da exatido, nomeadamente, do erro relativo. (Apndice 6. Clculo da exatido (erro relativo)).A exatido mede o grau de proximidade entre o resultado obtido e o resultado esperado, o erro relativo associado ao mtodo analtico foi de 5%. Considera-se um erro aceitvel para o objectivo em questo. Posto isto, pode afirma-se que o mtodo analtico vlido para o fim a que se destina.
12

4. Concluso A HPLC tem um elevado poder de separao para amostras complexas. A sua aplicao encontra-se dependente de um mtodo de deteco sensvel e selectivo. A associao do HPLC com a deteco ultravioleta (UV) permite a obteno de resultados de elevada selectividade. Este trabalho incidiu sobre a determinao do teor de cafena de uma bebida energtica por HPLC/UV. O desempenho da separao cromatogrfica foi avaliado pelo coeficiente de capacidade, concluindo-se que a separao ideal (K=1,520,02), uma vez que o seu valor se enquadra na gama (1-10) referenciada como ideal pela literatura. Foi ainda averiguado a qualidade da separao cromatogrfica pela eficincia. A eficincia obtida experimentalmente (N=233438) menor que a eficincia fornecida pelo fabricante (N= 12500). Com esta tcnica foi possvel quantificar a concentrao da cafena de uma bebida energtica, 337 24 mg/L, tendo-se obtido valores de acordo com os valores rotulados 320 mg/L. Atravs da avaliao e determinao de um conjunto de parmetros, de quantificao e de fiabilidade, que caracterizam um mtodo, conclui-se que o mtodo vlido para o objetivo do trabalho. De um modo geral, este trabalho permitiu que se adquirisse conhecimentos tcnicos sobre o modo de funcionamento de um HPLC/UV e aptides para caracterizar a qualidade da separao cromatogrfica.

13

5. Referncias [1] Scott Raymond P.W., Principles and Practice of Chromatography, kindle edition, Cap 1, Reese-Scott Partnership, 2012. [2] Love Jonathan, Process Automation Handbook: A Guide to Theory and Practice,1st Ed, Cap 18, Springer, 2007. [3] Li Dongqing, Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, Springer,p 260-264, New York, 2008. [4] Portal de Laboratrios Virtuais de Processos Qumicos,

http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_content&task=view&id=10 3&Itemid=451#2, Acedido em Dezembro de 2012. [5] Rosenberg Ian M., Protein Analysis and Purification, 2nd Ed, Cap 10, Springer, 2005. [6] Gomes Sara, Determinao de Antioxidantes por Cromatografia Lquida de Alta Presso com Deteco Electroqumica, Tese de Mestrado, Universidade de Coimbra, 2010. [7] Meyer Veronika R., Practical High-Performance Liquid Chromatograph,5th Ed, Cap 6,Wiley, 2010. [8] Kazakevich Yuri V., LoBrutto Rosario HPLC for Pharmaceutical Scientists, 1st Ed, Cap 1, Wiley-Interscience, 2007. [9] Waters, http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_PT&cid=10049055,

Acedido em Novembro de 2012. [10] Bispo M. S. et al. Simultaneous Determination of Caffeine, Theobromine, and Theophylline by High-Performance Liquid Chromatography, J. Chromatographic Science, 40,45-48, 2002. [11] Thomas J. B., Yen J. H., Schantz M. M., Porter B. J., Sharpless K. E., Determination of Caffeine, Theobromine, and Theophylline in Standard Reference Material 2384, Baking Chocolate, Using Reversed-Phase Liquid Chromatography, J. Agric. Food Chem., 52, 3259-3263, 2004. [12] Dong Michael W., Modern HPLC for practicing scientists, 1 st Ed, 19-21, WileyBlackwell,2006.

14

6. Apndice Apndice 1. Clculo do tempo morto terico

rea

Velocidade Caudal

Apndice 2. Clculo factor de capacidade e eficincia K mdio:

N mdio:

)
( )

Apndice 3. Clculo dos erros associados ao declive e ordenada da origem da reta de calibrao
Xi(mg/L) 0,50 0,75 1,00 5,00 10,00 Mdia Soma Xi2(mg/L) 0,25 0,56 1,00 25,00 100,00 yi(uv.min) 14286,75 22027,50 26258,00 138852,25 254303,00 yi^(uv.min) 15972,95 22343,51 28714,06 130642,94 258054,04 (yi-yi^)2 (uv.min) 2843278,39 99860,58 6032241,18 67392765,98 14070285,95 (xi-xmed)2 (mg/L) 8,70 7,29 6,00 2,40 42,90

3,45 91145,50 17,25 126,81 90438432,08 190,44 Nota: yi^ representa o valor de y calculado pela reta de calibrao para cada xi. Equao da recta a b n m 25482,22 3231,84 5,00 1,00 15

Substituindo-se os valores da tabela na equao acima obteve-se Erro associado ao declive:

5490,55.

Erro associado ordenada na origem

Apndice 4. Clculos da concentrao e incerteza associada Atravs da equao da reta:

Sendo o factor de diluio 100 (1:100):

Incerteza associada concentrao

Incerteza associada ao resultado final da concentrao

Apndice 5. Clculo para o limite de quantificao e para o limite de deteo Limite de quantificao:

16

Limite de deteo:

Apndice 6. Clculo da exatido (erro relativo-Er) ( )

17