STRUCTURA MATERIALULUI EREDITAR Dup un secol de la experienele lui Mendel, descoperirea rolului genetic al ADN (Avery,1944) a concentrat atenia

cercettorilor asupra structurii sale, ntruct descifrarea ei reprezenta singura cale pentru nelegerea naturii i funciei genei. n anul 1953, J. Watson i Fr. Crick au imaginat un model al moleculei de ADN cu dou catene polinucleotidice, legate complementar prin bazele azotate, nfurate plectonemic, pentru a forma o elice dubl. Acest model, universal valabil n lumea vie, corespunde funciilor genetice ale ADN; deoarece explic cea mai important reacie care se desfoar n lumea vie, replicarea ADN i n al doilea rnd, felul n care ADN deine, sub form codificat, informaia ereditar necesar sintezei proteinelor. Gena nceteaz astfel s mai fie o entitate misterioas i ADN devine nu numai esena geneticii, ci i un veritabil simbol al vieii. Structura primar a ADN ADN este un polimer de dezoxiribonucleotide (N-dR-P)n. Lungimea i greutatea sa molecular sunt foarte mari, permind stocarea unei cantiti uriae de informaie ereditar. Bazele azotate se leag la C1 al dR formnd patru tipuri de nucleotide (adenozin, guanozin, citidin i timidin); acidul fosforic se leag apoi la C5 al dR i n felul acesta se formeaz dezoxiribonucleotidele, monomerii ce intr n alctuirea moleculei de ADN, nalt polimerizat. n molecula de ADN nucleotidele sunt polimerizate n lanuri foarte lungi, prin legturi 3- 5 fosfodiester, formate ntre C3 al dR unui nucleotid i P fixat la C5 al dR nucleotidului urmtor; se realizeaz astfel o caten glucido-fosforic, n care dR alterneaz regulat cu P (inute laolalt prin legturi fosfodiesterice). Carbonul 1 al dR formeaz o legtur -N-glucozidic cu azotul 1 al unei baze pirimidinice sau cu azotul 9 a unei baze purinice.Cele dou capete a unei catene ADN nu sunt echivalente: la un capt se afl un grup hidroxil liber la C5 a unei 2-deoxiriboze terminale, iar la extremitatea cealalt este un grup hidroxil liber la C3. Atomii de carbon a 2deoxiribozei sunt numerotai cu prim () ca s se deosebeasc de atomii de C i N a bazelor azotate i astfel, vorbim de captul 5 i de captul 3 a catenei ADN. Acizii nucleici au o polaritate care ne amintete de polaritatea polipeptidelor cu grupul amino terminal i grupul carboxil terminal. Prin convenie, captul 5 a unei catene ADN (sau

ARN) este scris n extremitatea stng a unei secvene, iar captul 3 n dreapta. Secvena din fig. 2.4. se va scrie ca o secven de baze, astfel, tetranucleotidele se vor nota ca ATGC i nu CGTA. Chiar i o simpl oligonucleotid ne arat c variabilitatea n structura ADN rezid n secvenele sale de baze azotate. Cu 4 baze diferite putem construi 42 (16) dinucleotide diferite i 43 (64) trinucleotide diferite; 4100 posibiliti exist pentru o secven de 100 nucleotide. Configuraia astfel obinut, prin polimerizarea nucleotidelor ntr-un singur lan continuu, reprezint structura primar a ADN. ntreaga biologie molecular inclusiv genetica molecular, se bazeaz pe relaia care exist ntre acizii nucleici i proteine, respectiv pe mecanismul prin care informaia genetic existent n ADN dirijeaz secvena de aminoacizi din proteine i prin aceasta realizarea diferitelor caractere ereditare la confruntarea dintre genotip i mediu. Capacitatea ADN de a stoca informaie este uria, ntruct moleculele de ADN a genomului uman au n total 3200 milioane perechi de baze (Mb)/celul, (1 Mb (Megabaz) = 1.000.000 perechi de baze azotate). Lungimea ADN per complement haploid (n = 22A+X) este de 1 m, dac moleculele de ADN de la fiecare din cei 23 de cromozomi ai complementului cromozomal ar fi puse una n continuarea celeilalte i ar fi n stare extins, nu compact, superspiralat cum se afl ele n mod normal n cromozomi. Dac am considera lungimea moleculelor de ADN din cromozomii tuturor celulelor umane (aproximativ 70.000 miliarde de celule) n stare extins, lungimea ADN uman ar depi de cteva ori distana de la Pmnt la Soare. Structura secundar a ADN ADN-ul celulelor vii este ntotdeauna prezent sub form bicatenar. Cele dou catene polinucleotidice se leag ntre ele prin baze azotate, n mod complementar: o baz purinic se leag ntotdeauna cu o baz pirimidinic, A = T i G = C (legtura se realizeaz prin 2-3 puni de hidrogen, de natur electrostatic) (fig. 2.5.). n felul acesta, structura unei catene determin cu necesitate structura celeilalte catene: fiecare dintre ele reprezint o copie negativ a celeilalte, deci cele dou catene sunt complementare i strict codeterminate. Replicarea i repararea ADN n-ar fi posibil fr aceast complementaritate a secvenelor de baze.

Legturile stereochimice (spaiale) A = T i G = C fac ca secvenele nucleotidice a celor dou catene s se dirijeze n sensuri opuse, iar catenele s fie antiparalele, nfurate plectonemial n jurul unui ax virtual comun i avnd una direcie ascendent iar cealalt o direcie descendent. n felul acesta catenele se ruleaz dextrogir (ca un tirbuon), formnd o dubl spiral helicoidal (10 nucleotide pentru o spir, adic dup 34 ). Caracteristicile structurale finale ale dublului helix ADN sunt dictate de moleculele de dezoxiriboz care se odat ce cu oxigenul inelului orientat n sus n cadrul unei catene i orientat n jos n cadrul catenei complementare. Din cauza acestui aranjament opus al moleculelor de dR n cele dou catene i deoarece zahrul se leag la o poziie excentric a bazei azotate, ntreaga molecul de ADN este obligat s se rsuceasc, s se spiralizeze, n care fiecare pereche succesiv de baze azotate se ntoarce cu 3600 n direcia acelor de ceasornic, dublu-helixul fcnd un tur complet (3600) la fiecare 10 perechi nucleotide. Pe baza datelor de structur a ADN se poate deduce funcia sa de molecul informaional i se poate defini gena la nivel molecular: gena reprezint un segment din macromolecula de ADN, de lungime variabil, care deine informaia ereditar ce dirijeaz sinteza unei catene polipeptidice sau un produs ARN. 2.1.3. Structura teriar a ADN Macromoleculele de ADN se organizeaz n celul n structuri specifice, diferite la procariote (virusuri i bacterii) i la eucariote (plante, animale). Procariotele nu au materialul genetic separat de celelalte structuri ale celulei, ntruct nu prezint un nucleu distinct. Virusurile i bacteriile posed o singur molecul de ADN bicatenar (excepie bacteriofagul 174 care este monocatenar), linear sau circular, neasociat cu proteine: denumit genofor. Unele bacterii pot avea un plus de material genetic, adiional la genomul normal, fie liber n citoplasm (plasmide), fie inserat n genofor (episomi). Eucariotele au marea majoritte a ADN (99%) localizat n nucleu (n cromozomi), organit ce formeaz elementul esenial din aparatul genetic al celulei; o cantitate mic de ADN (2%) se afl n mitocondrii (37 de gene, 13 codific polipeptide pentru cele 5 complexe respiratorii angajate n producerea de ATP, restul de 24 de gene mitocondriale codific 22 tipuri de ARNt i dou molecule de ARNr ce face parte din aparatul de sintez proteic mitocondrial).

Structura molecular de ADN nuclear este heterogen n genomul uman. Termenul de genom uman este folosit pentru a descrie informaia genetic total (coninutul n ADN) din celulele umane. Primele rezultate a explorrii genomului uman nu au confirmat mrimea lui de aproximativ 100.000 de gene ct se credea c are. Deocamdat s-a estimat c numrul genelor umane sunt n jur de 30.000, iar secvenele codificatoare nu reflect dect 1,1 1,5 % din ansamblul genomului. Explorarea genomului uman confirm o alt caracteristic : bogia sa n secvene repetate care reprezint cel puin 50% din secvenele totale. Proiectul genomului uman a fcut cunoscut i alte tipuri de secvene care se repet: regiuni ntinse din genom, ce msoar pn la 200 Kb sunt duplicate, pe acelai cromozom sau pe cromozomi diferii, aceste secvene se acumuleaz n special aproape de centromer i de telomer. Ele reprezint aproximativ 5% din genom. Circa 20% din genom cuprind regiuni cu peste 500 Kb lipsite cu totul de gene. Pierdute ntr-un ocean de secvene necodificatoare, genele sunt n plus, discontinuie, fragmentate, n regiuni codificatoare numite exoni, separate de regiuni interpuse, necodificatoare, introni, care pot avea dimensiuni foarte mari. Deci, la eucariote numai o parte din gen (exonii) se exprim; intronii ar avea rolul de a regla buna funcionare a exonilor. Una din caracteristicile cele mai frapante ale peisajului genomic la scar mare o reprezint existena regiunilor mai mult sau mai puin bogate n bazele GC, care sunt legate de densitatea genelor. Datorit conexiunii ntre harta fizic (care a constituit proiectul de lucru a genomului uman) i harta citogenetic a cromozomilor umani, care inventariaz benzile clare i ntunecate ce alterneaz de-a lungul cromozomilor n urma coloraiei, s-a confirmat c regiunile bogate n bazele GC corespund n marea lor majoritate benzilor clare. Pe de alt parte, s-a verificat c acestea sunt n medie mai bogate n gene. Un criteriu nc i mai interesant pentru identificarea genelor este coninutul n dinucleotidul CpG (succesiunea unei citozine i a unei guanozine de pe o caten ADN, astfel notat ca s ilusreze legtura 3- 5 fosfodiesteric dintre cele dou baze i pentru a le distinge de perechea GC). Datorit metilrii frecvente a citozinei (adugarea grupului metil CH3 la C5 al citozinei) i a dezaminrii spontane (pierderea gruprii amino-NH2) transformnd-o n timin, dinucleotidul CpG este sub-reprezentat n genomul uman, innd cont de proporia C i a G. Cu toate acestea, se observ insulele de CpG, de aproximativ 1-2 Kb lungime, adesea asociate la

regiunile amonte sau 5 a genelor transcrise n mod activ. Aceast corelaie se datoreaz faptului c aceste regiuni nu sunt metilate. Metilarea ADN de la vertebrate este corelat cu o represie general a transcripiei i implicat n mecanisme de represie selectiv a anumitor gene. Aproape 30.000 insule de CpG au fost detectate n lungimea genomului, distribuia lor pe diferii cromozomi verific estimrile cu privire la densitatea genelor, cu toate c nu toate genele posed insule CpG. Cele peste 100 de tipuri diferite de celule umane rezult din modelul de expresie a genelor din celul. Anumite celule, n mod special, cele din creier, exprim un numr mare de gene diferite. n alte tipuri de celule, o mare parte a genelor sunt inactive transcripional, ele sunt constitutiv metilate. Evident, genele care se exprim sunt acelea care definesc funciile celulei. Unele din aceste funcii sunt comune tuturor tipurilor de celule i sunt specificate de gene eseniale (housekeeping genes) care funcioneaz n toate celulele i codific proteinele ce sunt eseniale pentru vitalitatea celular, controlnd dezvoltarea ontogenetic a organismului uman, precum i sinteza enzimelor implicate n metabolismul intermediar i n respiraia celular. Distincia dintre regiunile active i inactive transcripional a ADN celular este reflectat n structura cromatinei. Cromatina inactiv transcripional adopt n general o conformaie nalt condensat i este adesea asociat cu regiuni ale genomului care se replic trziu n faza S a ciclului celular (telomerele i regiunea pericentromeric) i cu legturi strnse prin molecula H1 a histonelor. Prin contrast, ADN activ transcripional adopt o conformaie mai deschis i mai puin condensat avnd mult ADN nerepetitiv, se replic timpuriu n faza S iar legtura lui cu moleculele histonelor H1 sunt relativ slabe. n plus, n cromatina activ transcripional regiunea promotor a genelor sunt caracterizate prin absena metilrii citozinelor. Factorii de transcripie pot detaa nucleosomii i astfel conformaia deschis a cromatinei active transcripional poate fi deosebit experimental pentru c de asemenea ofer acces nucleazelor. Genomul nuclear este distribuit n cele 22 de tipuri de cromozomi autozomi i cele dou tipuri de cromozomi de sex (X i Y), tipuri, care pot fi cu uurin difereniai prin tehnica de bandare cromozomial. Mrimea medie a unui cromozom uman are o cantitate enorm de ADN, aproximativ 130 Mb, dar variaz ntre 50 Mb la cromozomii mici i 250 Mb la cromozomul 1. O band cromozomial de mrime medie dintr-un preparat metafizic cu 550 benzi corespunde la aproximativ 6 Mb de ADN (1 Mb = 1.000.000 baze azotate).

O alt caracteristic a ADN la eucariote este asocierea obligatorie cu proteine bazice (histone) i acide sau neutre (hertone sau nonhistone ce cuprind enzime ale metabolismului cromozomal cum ar fi ADN-polimerazele, ARN-polimerazele, nucleaze, etc.). Ele au un rol structural, n organizarea supramolecular a ADN n cromatin i cromozomi, precum i un rol funcional, intervenind n reglarea funciei genelor.