Sunteți pe pagina 1din 10

1. INTRODUCERE Folosirea enzimelor in calitate de catalizatori pentru transformarea unor compusi nenaturali este cunoscuta de peste 100 de ani.

Enzimele erau folosite: - neseparate (in celule sau organite) - izolate ca substante purificate sau nu. Obiectul cercetarilor de acum 100 de ani era elucidarea cailor metabolice si determinarea mecanismelor reactiilor enzimatice. In anii 1970 a inceput utilizarea enzimelor ca si catalizatori pentru transformarea compusilor organici si a cunoscut o dezvoltare deosebita pana in 1990. Ca rezultat al acestor cercetari s-au publicat peste 13000 de articole in diverse domenii ale sintezei chimice organice. In acest fel chimistii organicieni puri au facut pasul greu de a accepta sa paseasca peste prapastia dintre stiintele biochimice si chimia organica clasica, iar medodele biochimice sunt o cale anexa pentru sinteza clasica a unui compus organic. In acest fel numarul articolelor privind sinteza asimetrica a unor compusi organici enantiomeri puri utilizand metode biocatalitice a crescut de la 0 in 1970 la aproape 15% din articolele publicate in 1990.

Frecventa utilizarii enzimelor in biotransformari schema urmatoare:

este prezentata in

(1) lipaze utilizate pentru esterificare, aminoliza, hidroliza (2) esteraze pentru hidroliza de esteri (3) proteaze pentru hidroliza amidelor, esterilor si sinteza de peptide (4) nitrilaze pentru hidroliza nitrililor (5) alte hidrolaze pentru hidroliza epoxizilor, derivatilor halogenati, esterilor fosforici (6) oxidoreductaze pentru reducerea aldehidelor, cetonelor (7) peroxidaze si oxigenaze pentru biohidroxilare, sulfoxidare, epoxidare, dihidroxilare, peroxidare (8) liaze pentru sinteza cianhidrinelor, aciloinelor si condensarilor aldolice (9) transferaze pentru grupe glicozil (10) izomeraze pentru zaharuri, racemizari si rearanjari tip Claisen

2.1 AVANTAJELE BIOCATALIZATORILOR a) Enzimele sunt catalizatori foarte eficienti Viteza de reactie pentru transformarile catalizate de enzime creste de 10 1010 ori in comparatie cu reactia neenzimatica. Pentru unele transformari se observa si cresteri mai mari (1012) iar aceste cresteri sunt mult peste cele obtinute cu catalizatori neenzimatici. Ca urmare, cantitatea de enzima folosita este foarte mica (de ordinul 0.1 1% respectiv 10-3 10-4% moli) ceea ce face ca acesti catalizatori sa fie mult mai convenabili din punct de vedere economic.
8

b) Enzimele sunt acceptate din punct de vedere al protectiei mediului Biocatalizatorii sunt reactivi care sunt total biodegradabili, neafectand mediul inconjurator. c) Enzimele actioneaza in conditii blande Enzimele reactioneaza la pH cuprins intre 5 si 8, majoritatea preferand pH = 7, iar intervalul de temperatura fiind 20 - 40oC. Temperatura optima la care functioneaza enzimele este 30oC. In acest fel sunt reduse reactiile chimice secundare ca exemplu: descompunerea, izomerizarea, racemizarea sau rearanjari de schelet, care au loc in mod curent in prezenta catalizatorilor traditionali. d) Enzimele sunt compatibile intre ele In acelasi balon pot avea loc o serie de reactii enzimatice care au nevoie de conditii de reactie similare. Astfel, reactiile secventiale (in care produsul de reactie al primei reactii devine substrat pentru a doua reactie catalizata de alta enzima) sunt posibile utilizand sisteme multienzimatice evitand degradarea unui intermediar instabil care in aceste conditii nu mai trebuie separat. Mai mult, un echilibru chimic nefavorabil poate fi deplasat spre formarea produsului dorit daca se lucreaza cu un sistem multienzimatic corespunzator. e) Enzimele nu sunt legate de mediul lor natural Multe enzime pot fi catalizatori pentru transformarea unor compusi organici nenaturali si nu este necesar ca mediul de reactie sa fie apa. Daca este
3

avantajos pentru procesul enzimatic, mediul apos poate fi adesea inlocuit cu unul organic. f) Enzimele pot cataliza un spectru larg de reactii Ca si ceilalti catalizatori, enzimele accelereaza o reactie chimica, dar nu actioneaza asupra echilibrului termodinamic al reactiei. Enzima accelereaza in egala masura si reactia directa si reactia inversa a echilibrului chimic. Astfel, procesele enzimatice sunt echivalente reactiilor organice cunoscute. De exemplu: hidroliza / sinteza esterilor, amidelor, lactonelor, lactamelor, eterilor, anhidridelor acide, epoxizilor sau nitrililor; oxidarea / reducerea alcanilor, alchenelor, hidrocarburilor aromatice, alcoolilor, aldehidelor si cetonelor, etc aditia / eliminarea apei, amoniacului, acidului cianhidric; halogenarea / dehalogenarea alchilarea / dealchilarea carboxilarea / decarboxilarea, etc. Sunt cunoscute cateva exceptii importante pentru care nu s-au gasit reactii echivalente in natura: exemplu: rearanjarea Cope. Dar sunt cunoscute rearanjari [3,3] sigmatropice (ex. rearanjarea Claisen). Pe de alta parte, unele enzime catalizeaza reactii imposibile in conditii clasice: exemplu: hidroxilarea hidrocarburilor alifatice. Enzimele prezinta trei tipuri majore de selectivitate: - Chemoselectivitatea: Are loc atunci cand o enzima actioneaza asupra unei singure grupe functionale lasand netransformate celelalte grupe functionale (fapt adesea imposibil in prezenta catalizatorilor obisnuiti). In acest fel nu se obtin produsi secundari si purificarea produsului de reactie este mai simpla. - Regio- si diastereoselectivitatea: Datorita structurii lor tridimensionale, enzimele pot sa faca distinctie intre grupele functionale care sunt situate in regiuni diferite ale aceleiasi molecule substrat. - Enantioselectivitatea: Toate enzimele sunt formate din L-aminoacizi si din aceasta cauza sunt catalizatori chirali. Ca urmare, orice tip de chiralitate prezent in molecula substrat este recunoscuta la formarea complexului enzima-substrat. Astfel un substrat prochiral poate fi transformat intr-un produs optic activ printr-un proces de desimetrizare cand ambii enantiomeri ai unui amestec racemic reactioneaza cu viteze diferite, obtinandu-se produsi in proportii diferite.
4

Aceasta proprietate a enzimelor numita specificitate reprezinta cea mai importanta caracteristica pentru utilizarea in reactii selective si asimetrice. Aceasta proprietatea a enzimelor a fost remarcata inca din 1898 de Emil Fischer (care a fost preocupat foarte mult de stereochimia zaharurilor). Toate transformarile biochimice care se desfasoara intr-un organism viu sunt catalizate de enzime. Majoritatea dintre ele prezinta o selectivitate inalta si respecta chiralitatea substratului. Este clar ca un compus bioactiv (de uz farmaceutic sau agrochimic) va avea efecte biologice diferite daca prezinta activitate optica. Cei doi enatiomeri se vor comporta ca doua substante diferite. Izomerul cu activitatea cea mai ridicata este numit eutomer, in timp ce enantiomerul sau cu activitate redusa este numit distomer. Activitatea distomerului poate fi si toxica sau nula. Raportul intre activitatile celor doi enantiomeri este definit ca raport eudismic. In Tabelul 2.1 sunt prezentate activitatile unor enantiomeri. Tabelul 2.1: Efecte biologice ale unor enatiomeri Nr.crt. 1 Numele compusului Penicilamina Enantiomer R
COOH R C NH2 C SH CH3 CH3

Actiune toxic

Enantiomer S
COOH S H2N C H H3C C SH

Actiune antiartritic anticisteinurie

H H3C

acid (2S)-2amino-3metil-3sulfanil butanoic miros de liliac


CH3

Alcool terpenic

CH3

miros de pipa

H3C

H CH3 OH

H3C

H CH3 OH

3 Asparagina

COO R H C NH3 CH2 CONH2


5

gust amar

COO S H3N C H

gust dulce

CH2 CONH2

De aceea trebuie sa fie privite cu suspiciune medicamentele sau pesticidele care se vand ca racemice. In 1990, pe piata se vindeau ca amestecuri racemice peste 89% din cele 537 de medicamentele chirale, iar in cazul pesticidelor 92% din cei 480 de agenti chirali. Ca urmare, in 1992 US Food and Drug Administration (FDA) a adoptat o legislatie prin care obliga companiile farmaceutice producatoare sa separe compusii chirali obtinuti ca racemice, astfel incat sa se comercializeze numai enantiomerul activ farmaceutic. 2.2 DEZAVANTAJELE BIOCATALIZATORILOR

A) Enzimele sunt intr-o singura forma enantiomera Deaorece nu este posibila obtinerea unei enzime imagine in oglinda din D-aminoacizi, este imposibil sa se schimbe mersul reactiei enzimatice prin alegerea unui catalizator chiral clasic. In acest caz este de urmat o cale complexa si incerta pentru a gasi o enzima cu selectivitate stereochimica inversa. Totusi, uneori acest lucru e posibil. B) Enzimele necesita parametrii limitati de operare Avantajul de a lucra cu enzime in conditii blande de reactie devine uneori un dezavantaj. Daca reactia decurge foarte lent in conditiile optime de temperatura si pH, este necesara o alta abordare. Tehnica obisnuita de a creste selectivitatea prin scaderea temperaturii de reactie este limitata in cazul transformarilor enzimatice. In cazul unor enzime, activitatea catalitica este buna chiar si in gheata. C) Enzimele au activitate catalitica maxima in apa Apa este putin utilizata ca solvent in sintezele organice datorita punctului de fierbere ridicat si caldurii de vaporizare foarte mari. In plus, majoritatea compusilor organici au o solubilitate mica in apa. Exista totusi o cale si anume utilizarea unor solventi organici compatibili cu enzimele. D) Enzimele sunt legate cu cofactori naturali Este iarasi un paradox de neexplicat: desi enzimele sunt extrem de flexibile pentru a accepta substrate nenaturale, ele sunt legate exclusiv de cofactorii lor naturali care servesc ca si transportori redox, exemplu NAD(P)H sau de energie chimica (ATP). Majoritatea reactivilor biologici sunt molecule relativ instabile si sunt foarte scumpe. De aceea utilizarea lor in cantitati stoechiometrice este dezavantajoasa. Din pacate, ei nu pot fi
6

inlocuiti cu compusi mai ieftini obtinuti prin sinteza. Pentru a eficientiza astfel de procese enzimatice se incearca reciclarea cofactorilor acolo unde este posibil. E) Enzimele sunt predispuse la inhibitie Multe reactii enzimatice sunt predispuse la inhibitie cu substratul (prin saturare) sau cu produsul de reactie, astfel ca scade eficienta enzimei. Daca inhibitia cu substratul poate fi controlata prin mentinerea unei concentratii joase a substratului prin modul de adaugare, inhibitia cu produsul de reactie este foarte greu de controlat. Este necesara eliminarea graduala a produsului de reactie prin metode care sa nu afecteze celelalte etape biocatalizate. F) Enzimele produc alergii Enzimele pot produce reactii alergice, dar daca sunt privite ca si substante chimice obisnuite si manevrate corespunzator, pot fi utilizate cu succes in biotransformari. 2.3 UTILIZAREA ENZIMELOR versus SISTEME CELULARE Starea fizica a biocatalizatorilor care se folosesc in biotransformari poate fi foarte diversa. Trebuie stabilit daca se foloseste enzima izolata, mai mult sau mai putin purificata, enzima sau microorganismul in care se gaseste, in stare libera sau imobilizata. Aceasta decizie depinde de mai multi factori: a) tipul reactiei; b) daca cofactorii trebuie reciclati; c) scara la care are loc biotransformarea. Este nevoie de o echipa multidisciplinara (biochimist, microbiolog si inginer biotehnolog) pentru a stabili caile de sinteza enzimatica pentru diferite produse finale pornind de la diverse substante chimice. Astfel de sinteze, care necesita multe etape biochimice, se refera la etape fermentative sau procese de sinteza enzimatica completa (novo syntheses) in sens biologic. Argumentele pro si contra referitoare la o biotransformare sunt prezentate in Tabelul 1.2. Biotransformarile care au loc in prezenta unor microorganisme pornesc de la molecule organice relativ complexe care sunt transformate printr-o etapa sau cateva etape biochimice in produsul final utilizand potentialul enzimatic al microorganismului de a transforma un compus organic nenatural.

Tabelul 2.2: Argumente pro si contra pentru folosirea enzimelor izolate versus siteme celulare Biocatalizator Forma Argumente Pro aparatura simpla, prelucrare simpla, productivitate mai buna activitate ridicata a enzimei in Argumente Contra este necesara reciclarea cofactorului posibile reactii secundare, substratele lipofile sunt insolubile, prelucrarea necesita extractie enzime reduse cu activitati

Enzime izolate dizolvate apa

suspendate in reactie usor de solventi condus, usor de organici prelucrat, substrate lipofile solubile, recuperarea usoara a enzimei imobilizate recuperarea usoara a enzimei nu este necesara reciclarea cofactorului Celule cultura in crestere activitati mari

pierderea activitatii timpul imobilizarii

in

echipament scump, necesita lucrul cu volume mari la prelucrare, productivitate mica, toleranta redusa la solventi organici, reactii secundare date de un metabolism necontrolat cantitate mare de biomasa, multi produsi secundari, dificultate de a controla procesul

celule in prelucrare usoara, activitati catalitice reduse repaos putini subprodusi celule posibilitatea activitati catalitice reduse imobilizate refolosirii celulelor
8

Pentru a distinge intre un astfel de proces si fermentatia tipica, unde sunt implicate mai multe enzime, se utilizeaza termenul de enzimare (enzymation). Caracteristicile enzimarii versus fermentatie sunt prezentate in Tabelul 2.3. Tabelul 2.3: Caracteristicile enzimarii si fermentatiei microorganism tipul reactiei Enzimare celule in repaus scurta, catalizata Fermentare celule in crestere lunga, proces vital multe multe surse de carbon si de azot numai natural scazuta complicata multi

numarul etapelor de cateva reactie numarul enzimelor cateva active materia prima substrate produsul toleranta concentratiei izolarea produsului de reactie subprodusi natural sau nenatural ridicata usoara cativa

3. Clasificarea enzimelor. Nomenclatura Clasificarea enzimelor n funcie de reacia pe care o catalizeaz este prezentat n Tabelul 3.1. Tabelul 3.1: Clasificarea enzimelor n funcie de tipul reaciei pe care o catalizeaz Numele enzimei Dehidrogenaze Hidroxilaze Kinaze Mutaze Oxidaze Oxigenaze Fosfataze Sintetaze Transferaze Reacia catalizat Dehidrogenarea unui substrat cu transferul hidrogenului la o molecul diferit de oxigen Hidroxilarea unui substrat la care particip oxigen molecular ca donor Transferul unei grupe fosfat de la o trifosfatnucleotid (ATP) la un substrat Migrarea unei grupe fosfat de la o poziie la alta n aceeai molecul Oxidarea unui substrat cu oxigen molecular ca donor Incorporarea unei molecule de oxigen cu ruperea oxidativ a unei legturi C - C Hidroliza unui ester fosforic Condensarea a dou molecule simultan cu hidroliza unei trifosfonucleotide (ATP) Transferul unei grupe funcionale de la un substrat la altul

Nomenclatura enzimelor se face n mai multe moduri: a) Denumire comun Se pstreaz denumirile comune dei acestea nu precizeaz aciunea enzimei ntr-un anumit tip de reacie. Exemplu: pepsina, tripsina, ureaza, etc. b) O alt denumire puin mai precis const n folosirea numelui substratului + numele reaciei catalizate + sufixul az: Exemplu: malatdehidrogenaza

10