SUBIECTE EXAMEN SCRIS 1.

Clasificareabacteriilordupa forma sidispunere n funcie de form, bacteriile se pot grupa n mai multe categorii i pot avea: a) form cocoidal, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor i stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolai, gonococii i meningococii pot fi reniformi. Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultur n care se dezvolt, de vrsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum i de modul n care are loc diviziunea n cursul procesului de cretere i multiplicare (planul de diviziune). Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.: - stafilococii sunt coci sferici dispui n grmezi (ciorchine); - pneumococii sunt coci lanceolai dispui doi cte doi, eventual nconjurai de o capsul comun (n diplo); - streptococii sunt coci dispui n lanuri etc.; b) form de bastona (bacili, rods), drepi cu capetele uor rotunjite (enterobacterii), drepi cu capetele tiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuite (Fusobacterium nucleatum), dispui uneori ntr-un mod caracteristic (de exemplu n palisade, ca i scndurile dintrun gard - bacilii pseudodifterici); c) aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus); d) actinomicete, care n culturi tinere formeaz filamente lungi, ramificate (asemntor mucegaiurilor); aceste filamente se fragmenteaz i rezult aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli); e) forma spiralat (bacili curbi - V. cholerae, spirili i spirochete - T. pallidum). Unele bacterii, chiar i atunci cnd rezult prin multiplicarea unei singure celule mam prezint un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.). n culturi vechi sau sub influena unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice etc., pot aprea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fr experien sau care nu face o examinare innd cont de context. Dac are loc repicarea acestora pe mediu de cultur proaspt iar examinarea ulterioar se face la timpul potrivit (avnd n vedere durata optim de multiplicare) vor rezulta forme tipice pentru specia respectiv. 2. Enumerati elementele constant si facultative ale celulei bacteriene Att din punct de vedere structural ct i funcional, exist o serie de asemnri ntre celula procariot i celula eucariot. Bacteriile prezint att elemente structurale interne ct i structuri externe care pot i merit a fi studiate avnd implicaii n relaiile dintre celula bacterian i organismul gazd. Exist dou tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind ntlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind ntlnite numai n anumite condiii i doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative). Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de: - perete, - membran citoplasmatic, - citoplasm (cu ribozomi i facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) i de - nucleu.

Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsul, cili (flagelii), fimbrii (pili) i spori (forme de rezisten). 3.Structura peretelui la bacteriile Gram (+) si (-) Bacteriile Gram-pozitive conin aproximativ 80-90% murein (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al crui schelet este format din lanuri polizaharidice. Aceste lanuri sunt formate prin polimerizarea, alternant, a 2 structuri zaharidice: - acidul N-acetil-muramic (NAM) i - N-acetil-glucozamina (NAG). Fiecare molecul de NAM are substituit un tetrapeptid alctuit din D i L-aminoacizi. Se consider c aminoacizii n form D confer un grad de protecie fa de enzimele proteolitice. ntre tetrapeptidele substituite, la lanurile polizaharidice alturate, se stabilesc legturi peptidice prin gruparea terminal COOH a unui tetrapeptid i grupri terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formeaz structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care nconjoar ntreaga celul bacterian. Bacteriile Gram-pozitive rein violetul de metil (violet de genian n coloraia clasic) i au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reeaua de baz este acoperit de reele suplimentare cu specificitate antigenic, alctuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat i glicerol fosfat), legat de regul covalent la peptidoglican. n cazul n care structurile fosfat se gsesc n cantiti limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem ntlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc. n cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular n general mai subire dar mult mai complex. Peretele este alctuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membran extern. Spaiul dintre membrana citoplasmatic i membrana extern (include peptidoglicanul) reprezint spaiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana extern este alctuit din fosfolipide, proteine i cantiti variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se afl la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are n componen dou structuri eseniale: lipidul A i polizaharidul O. Bacteriile Gramnegative se decoloreaz cu alcool-aceton i se recoloreaz cu fucsin diluat (au culoare roie la coloraia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc. 4. Rolul peretelui bacterian Rolurile peretelui bacterian: - prin rigiditate asigur forma caracteristic bacteriei (coci, bacili etc); - asigur rezistena bacteriei (de exemplu la variaii ale presiunii osmotice i la presiuni interioare care pot ajunge pn la 20 atm.); - flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicat att prin flexibilitatea membranei ct i prin grosimea redus a peptidoglicanului; - are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, n cazul bacteriilor Gram-negative etc); - prezint receptori, de exemplu pentru bacteriofagi; - are rol n diviziunea bacterian participnd la formarea septului transversal; - la nivelul lui pot aciona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, Dcicloserina); 2

- la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate n spaiul periplasmic i la nivelul membranei externe). 5. Coloratia Gram.Interpretare, timpi, exemple Dilum ntr-un recipient fucsina (9 pri ap distilat / 1 parte fucsin) acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genian din punct de vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime) ndeprtm colorantul acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute ndeprtm lugolul acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton (1 parte aceton / 3 pri alcool de 96) pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet acoperim frotiul cu fucsina diluat 1/10 pentru 1 minut splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm In cazul n care frotiul a fost realizat din cultur pur putem vizualiza microorganisme cu aceeai form, aceleai dimensiuni (excepie Proteus spp.), o anumit dispoziie, cu sau fr capsul (halou necolorat), gram pozitive (colorate n violet) sau gram negative (colorate n rou), levurile se coloreaz n violet In cazul n care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul i citoplasma apar n diverse nuane de rou, bacterii gram pozitive i / sau gram negative, fibrin i levuri care se coloreaz n violet etc 6.Coloratia Ziehl-Neelsen Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool rezisteni (BAAR), solubiliznd peretele bacterian prin creterea temperaturii, facilitnd penetrarea colorantului. punem frotiul uscat i fixat pe un suport situat deasupra tviei de colorare acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat (filtrat extemporaneu) trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperit de fucsin, pn ncepe emiterea de vapori (nu atingem temperatura de fierbere). n cazul n care lama nu mai este acoperit complet cu fucsin, adugm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioad n care repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn la emiterea de vapori. splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet adaugm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95), pentru 2-3 minute splm cu ap distilat sau ap de la robinet recolorm cu albastru de metilen, 1 minut splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Putem vizualiza: bacili de culoare roie, relativ fini (n cazul prezenei BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii de culoare albastr (toate 3

structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; n cazul colorrii unui frotiu din cultur pur vom evidenia numai bacili de culoare roie. 7.Ribozomii.Structura,rol Ribozomii au form aproximativ sferic, pot fi vzui la microscopul electronic. Mrimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraia ionilor Mg2+ i K+. Unii ribozomi sunt liberi n citoplasm, n timp ce alii apar legai de faa intern a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 uniti Swedberg dar sunt constituii din dou subuniti de cte 30S i respectiv 50S. n subunitatea mic intr o singur molecul de ARNr, 16S i 21 de tipuri de proteine ribozomale. n subunitatea mare intr mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). ntre cele dou subuniti se formeaz canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) n cursul sintezei proteice. Se apreciaz c ntr-o bacterie cu dimensiuni medii, aflat n faza de cretere activ, se sintetizeaz circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens. Ribozomii au rol esenial n procesul de biosintez proteic. Au tendina de a se grupa n polisomi (poliribozomi) cu eficien sporit n biosinteza proteic. n aceste condiii, la un moment dat pe aceeai molecul de ARNm se afl n scopul traducerii mesajului genetic mai muli ribozomi, care constituie un ansamblu care poart numele de polisom. Biosinteza proteic Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi este necesar ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei proteine. Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controleaz sinteza unui polipeptid poart numele de cistron. ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza mai multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast situaia particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i metabolismului intens care are loc n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur molecul de ARNm policistronic. De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este controlat de ARN polimeraza ADN-dependent. Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi exist una sau mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice fiecrui tip de aminoacid care controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului. ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare. 8. Flagelii bacterieniStructura, rol, localizare Cilii sau flagelii confer mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evideniat n preparatul proaspt (ntre lam i lamel) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observat pe orice mediu de cultur solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvolt (fenomenul de invazie). Flagelii sunt formaiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alctuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca dou perechi pe o structur care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat n perete i membrana citoplasmatic. Din punct de vedere chimic flagelul este de natur proteic (flagelina). Roluri: - n mobilitate (cu o vitez de circa 50 m / secund); cilul are o micare de rotaie, asemntoare unei nurubri n mediu i ca atare corpul bacterian este mpins n direcia opus; motorul rotaiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obinut din ATP; - antigenic (datorit structurii proteice - antigenul H, specific de tip); - n clasificarea bacteriilor (prin numr i distribuie), bacteriile putnd fi - monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa; - lofotriche (cu un mnunchi de flageli dispus la o extremitate); - peritriche (cu mai muli flageli dispui de-a lungul suprafeei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. 9.Sporibacterieni Structura, rol, localizare Fenomenul de sporogenez este mai des ntlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium i Bacillus). Pe sol, n condiii de uscciune, la adpost de lumina solar direct, endosporii persist zeci i poate sute de ani. Materialul genetic este concentrat i, mpreun cu apa legat, lipide, Ca++, Mg++, este nconjurat de un strat protector (membrana sporal, cortexul sporal, nveliurile sporale). Smburele sporal mpreun cu membrana citoplasmatic formeaz protoplastul sporal. Roluri: - form de rezisten i conservare a speciei (n condiii favorabile un spor se poate transforma ntr-o bacterie / forma vegetativ; procesul de formare a sporului ar putea fi considerat una dintre cele mai primitive forme de difereniere, dar nu este un proces de reproducere celular aa cum se ntmpl la fungi sau parazii); - rezist la cldur, uscciune, la anumite substane chimice i antibiotice, raze UV etc. Sporul poate fi localizat: - central sau subterminal, mai mic dect celula (ex. la Bacillus anthracis); - central sau subterminal, mai mare dect celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc); - terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de b de chibrit). Poate fi evideniat prin coloraii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraia Gram (locul sporului rmne necolorat). Este sensibil la formol, propiolacton etc. Este distrus prin autoclavare. 10.Nutritia principalelor bacterii studiate. Tipuri de nutritie

Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile n energie i n diferite componente celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea i multiplicarea celular. n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n: bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin (photobacterii) i bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic i triesc la ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se difereniaz: bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic i bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici. Nutriia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se difereniaz n funcie de tipul respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a cror energie trebuie oferit de gazd. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de o gazd vie). Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de ctre celulele n cretere (sunt necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP). Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr-un numr relativ redus de precursori metabolici. Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule este determinat fie dup un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai i lipide. Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte bine reglate (exist o permanent balan a biosintezei). Microorganismele reprezint un grup de celule vii care utilizeaz o mare diversitate de ci metabolice; de exemplu, mai multe ci diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singur cale metabolic pentru benzoat poate fi reglat de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru cile metabolice este acela al organizrii unui numr relativ mic de tipuri de reacii biochimice, ntr-o ordine specific. Multe dintre cile biosintetice se pot deduce avnd n vedere structura chimic de la care se pornete, produsul final i eventual unul sau doi metabolii intermediari. Principiul determinant al reglrii metabolismului este acela c enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este necesar. Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acioneaz. n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor efectori specifici (metabolii care moduleaz activitatea enzimatic). De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial este (poate fi) inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu poate depinde de competiia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct i unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui 6

efector de situsul su duce la o modificare conformaional a enzimei, astfel nct afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau crete (activare allosteric). Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun, rezultnd o deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb direcia (flagelii se dau peste cap). Acest comportament face posibil chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de sursa atractantului chimic i schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una care se apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant. Spre exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de receptori specifici localizai pe membrana celular (de multe ori acelai receptor particip i la transportul membranar al acelei substane). Celula bacterian este prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena unui gradient chimic (n spaiu), dar s-a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n timp (de exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz de surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs). Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un mecanism care ar explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i respectiv demetilarea unei proteine specifice din membran, care depinde de GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a demetilrii acestei proteine. Respingtorii stimuleaz demetilarea. Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca rspuns la o modificare de mediu poart numele de transducie senzorial. Aceasta pare s fie responsabil de: chemotaxie; aerotaxie (deplasarea ctre concentraia optim de O2); fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe ctre lumin); deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 11.Clasificarea bacteriilor in functie de temperatura optima de dezvoltare.Exemple n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: mezofile (temperatur optim 30-37C), psichrofile (temperatur optim n jur de 20C) i termofile (temperatur optim 50-60C). Prin aciunea cldurii procesele chimice i fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce dup atingerea temperaturii de 50-60C prin ruperea legturilor intramoleculare, mai ales a punilor de hidrogen care menin proteinele i alte macromolecule n stare nativ. Ca urmare protoplasma se denatureaz. Celulele bogate n ap sunt mult mai sensibile la aciunea cldurii dect microorganismele care conin puin ap sau sunt liofilizate. Apa din compoziia microorganismelor absoarbe cldura proporional cu volumul su. Sterilizarea prin cldura are loc n dou variante principale: prin cldur uscat i umed. Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc. n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor;

b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG). 12. Definiti notiunea de mediu:selectiv,electiv si de imbogatire Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric). Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent): agar-snge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac Conkey, Tinsdale cu telurit de potasiu, medii cu antibiotice etc. Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv: ap peptonat alcalin, bulion selenit, O.C.S.T. etc. 13. Definiti notiunea de mediu diferential.Exemple Mediul diferenial conine un indicator de pH i un anumit substrat (de exemplu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea pH-ului i a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenierea bacteriilor lactozo-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). 14. Ce este o colonie bacteriana si cum se pot obtine colonii bacteriene izolate? Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1) Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (asigurat n termostat) pentru c timpul de generaie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaie de 12-27 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s subliniem c dac transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai obine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate

15.Fazele dezvoltarii unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin (Figura nr. 13). Faza de lag Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. (2) Faza de multiplicare logaritmic (exponenial) Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore. Faza staionar Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul. Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile. Faza de declin Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 23 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte intens.

16. Definiti notiunile de asepsie si antisepsie.Exemple de antiseptice.Aplicatii Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergeni cationici etc). Decontaminarea reprezint utilizarea agenilor fizici / chimici pentru a ndeprta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiionat patogene sau patogene de pe suprafee sau obiecte, astfel nct acestea s nu mai poat reprezenta o surs de infecie sau de transmitere a infeciei, iar obiectele sau suprafeele s poat fi manipulate i / sau utilizate n siguran. 9

Sanitizarea reprezint totalitatea msurilor pentru asigurarea sntii publice. Prezervarea presupune prevenirea multiplicrii unor microorganisme n produse farmaceutice, vaccinuri, alimente etc. Curarea reprezint utilizarea agenilor fizici i / sau chimici pentru a ndeprta murdria (materie organic i anorganic) de pe suprafee (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregtind astfel suprafeele sau obiectele pentru utilizare n siguran sau, pentru trecerea la o alt etap de decontaminare. 17. Definiti notiunile de sterilizare si dezinfectie.Exemple de dezinfectante.Aplicatii Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor gazdei). mpiedic rspndirea bolilor infecioase. Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei rezidente. Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra florei rezidente. Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate. Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile. Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite de timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un potenial sterilizant chimic (Figura nr. 2). Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu n form gazoas), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale critice, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic distruge toate categoriile i formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6(probabilitatea prezenei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egal sau mai mic cu 1/1.000.000). Termenul de valabilitate reprezint perioada de timp n care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraiei substanei active i eficacitii antimicrobiene. Timpul de contact (timp de aciune) reprezint perioada de timp n care produsul dezinfectant este n contact direct cu suprafaa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp n care produsul antiseptic este n contact direct cu esuturile vii. Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: - Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed); - Metode de sterilizare prin filtrare; - Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i - Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie. 10

Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat, respectiv: splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Sticlria de laborator este colectat n recipiente speciale i se sterilizeaz prin autoclavare; pipetele vor fi meninute n amestec dezinfectant pn a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile i acele (dei este necesar utilizarea pe scar larg a seringilor i acelor de unic ntrebuinare) contaminate se vor introduce n baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria n soluie de 1-2% detergent cationic i se vor spla cu jet de ap pentru ndeprtarea substanelor chimice (Figura nr. 3). Instrumentele de unic utilizare sunt, n general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutur mecanic toracic, abdominal, vascular etc) sau pot fi furnizate n seturi de instrumente de unic utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unic utilizare (disposable) confer un plus de siguran, n pofida unui pre relativ ridicat. Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacitii sterilizrii cu ajutorul radiaiilor, pot fi utilizai spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) 18+19. Sterilizarea prin caldura umeda - Metode.Parametrii.Aplicatii Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. b1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2). Exist mai multe tipuri de autoclave: - autoclave cu perete simplu verticale orizontale - autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite 11

evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat (Figura nr. 9). Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel: verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat); aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor; nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie; conectm sursa de cldur; deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) ; nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori; presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) ; dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; deschidem lent robinetul de vapori; deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului; lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis; atunci cnd temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate. b2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. b3-4. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii.

12

Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de aciune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. 20.Sterilizarea prin caldura uscata Metode.Parametrii.Aplicatii Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. Amintim cteva dintre variantele tehnice: a1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul (Figura nr. 5, Film nr. 2). Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint sterilizare. a2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie (Schema nr. 1). Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte variante, de exemplu n funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat. Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. a3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu (Figura nr. 7). Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, n Romnia au existat astfel de incineratoare n structura unitii sanitare respective. Odat cu procesul de aderare la Uniunea European i respectiv necesitatea aplicrii unor reguli impuse pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost nchise. Modul n care s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor incineratoare nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc. 21+22+23. Bacteriofagii Definitie.Structura.Tipuri de interactiuni fag-bacterie Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate pentruE. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperii n 1915. Prof. Mihai Ciuc obine n anul 1921 primele tulpini lizogene. n 1949 se nfiineaz n Romnia un Centru naional pentru bacteriofagi. Fagii au o structur mai complex dect cea a virusurilor obinuite. Se descriu (Figura nr. 14):

13

1. capul fagului are form de prism hexagonal bipiramidal. Conine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN nconjurat de capsida format din capsomere (nveli proteic); fagii ARN pot avea un numr mic de gene (ex. 3) n timp ce fagii ADN pot avea pn la 150 gene; 2. coada fagului are structur proteic, simetrie helicoidal; are rol de adsorbie, ajutnd fagul s penetreze bacteria. Se descriu urmtoarele formaiuni: - cilindrul axial; - teaca cozii; - placa bazal (cu croetele de fixare); - fibrele cozii (formnd un strat n jurul tecii cozii). Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de anticorpi, descoperire utilizat n studierea nrudirii dintre diferii bacteriofagi. Relaii bacteriofag-bacterie ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili dou tipuri de relaii: - de tip litic sau productiv (Figura nr. 15); - de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16). Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori. Ciclul litic are mai multe etape i anume: 1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele cozii), apoi ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene. 2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea ADNului fagic n citoplasma bacterian; 3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i preluat de ADN-ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un numr nsemnat de proteine virale. 4. Maturarea (ansamblarea) fagului 5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea bacteriofagului matur, virulent. Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la realizarea lizei celulei bacteriene. Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de minute (uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului; pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de liz, clar, bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie; dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz nclzit putem transfera suspensia ntr-o plac Petri; bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz fagii; acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia; o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se multiplic iar cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n comparaie

14

cu plajele mai puin clare produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleai etape, iniial. Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic: fie se integreaz liniar n cromozomul bacteriei gazd i se replic sincron cu aceasta, fie se circularizeaz i ataat de membrana citoplasmatic se replic sincron cu diviziunea bacteriei. Bacteria a devenit lizogen, se reproduce i transmite descendenilor fagul latent (profag, fag temperat). n anumite condiii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12). Proprietile bacteriei lizogene: 1. este imun fa de un fag omolog profagului; 2. pot aprea fenomene importante din punct de vedere genetic: transducia; conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C etc); recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii, elibereaz la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz unele din proprietile celor doi fagi parentali) etc.; inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul i rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective). Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi profagului gzduit. Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz). Aplicaii practice ale fenomenului de bacteriofagie: fagii viruleni sunt un element de echilibru ecologic n mediul natural de via al bacteriilor (n nia ecologic respectiv); fagii temperai pot avea un rol deosebit n reasortarea materialului genetic al bacteriilor, ntruct atunci cnd se detaeaz (inducie) de cromozomul bacterian pot antrena poriuni din ADNul bacterian; fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorit specificitii relaiei fag-bacterie); anumite mutante ale fagilor se folosesc n ingineria genetic drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda); fagii reprezint un model pentru studii teoretice i practice privind virusurile i oncogeneza, precum i alte aspecte ale biologiei moleculare; s-au evideniat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic i antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilitii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic i epidemiologic, pentru identificarea lanurilor de transmisie a germenilor i pentru determinarea originii unei epidemii. 24.Mutatiile la bacterii Definitie.Tipuri.Clasificare Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepiile prezentate anterior), au un singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesar transferarea de material genetic de la o tulpin (donoare) la tulpina receptor (acceptoare). n mod clasic poate 15

avea loc un transfer pe orizontal ntre tulpini care fie fac parte din aceeai specie fie fac parte din specii foarte nrudite, chiar dac genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrat posibilitatea unor schimburi genetice ntre tulpini din specii diferite (ex. n ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacterian presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenilor ei i pot exista n principiu dou variante: - variabilitatea fenotipic i - variabilitatea genotipic; Variaiile fenotipice reprezint modificri morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variaiile genotipice reprezint modificri definitive ale materialului genetic (cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenilor. Mecanismele variaiei genotipice sunt reprezentate de: - mutaie; - transfer genetic urmat de recombinare genetic. Mutaia Mutaia reprezint o modificare accidental n secvena nucleotidic a unei gene, ducnd la modificri ale mesajului genetic. Mutaiile pot aprea la nivelul materialului genetic prin: - substituii; - inversii; - inserii; - deleii. Mutaia spontan Mutaiile care apar n condiii de mediu obinuite i fr intervenia unui factor decelabil se numesc mutaii spontane. Mutaia indus Mutaiile care se produc sub aciunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenii alchilani), care acioneaz ca ageni mutageni, se numesc mutaii induse. Rata mutaiilor induse este semnificativ mai mare dect rata mutaiilor spontane. Mutaia punctiform are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon. Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon, putnd afecta secvene mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie poligenic). Mutaiile regresive (retromutaii) afecteaz celule mutante, determinnd revenirea acestora la tipul iniial, restabilind secvena nucleotidic originar. Mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o modificare a secvenei bazelor nucleotidice persist. Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor sunt: - transformarea; - transferul mediat de bacteriofagi (transducia); - conjugarea. Transformarea Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria accept ADN liber provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie s fie competent n a accepta ADN-ul de la bacteria donor. 16

Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n experimente referitoare la virulena pneumococilor fa de oarecele alb. Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza staionar a ciclului celular. Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate nlocui (prin recombinare genetic) o secven nucleotidic omolog, bacteria receptoare dobndind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice). Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care nu sunt natural competente, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesar tratarea chimic a acestora, de ex. cu ioni de calciu. Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin: - transducie; - conversie lizogenic. Transducia reprezint transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numete transductor. Bacteria receptoare se numete transductant. Transducia specializat (restrictiv) este caracteristic fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un numr restrns de gene bacteriene situate n imediata apropiere a situsului de legare a profagului n cromozomul bacterian. Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi ncorporate n mod accidental n particula viral matur pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducia generalizat poate fi realizat de un mare numr de fagi neintegrai n cromozomul bacterian atunci cnd acetia intr n ciclul litic. Conversia lizogenic reprezint apariia unui caracter nou la bacteriile care gzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizat numai de ctre C. diphtheriae purttor al fagului temperat (profagul care deine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibil numai n cazul n careStreptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Exist i fagi care sunt integrai n regiuni care codific un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integreaz ntr-o gen care codific leucina). 25.Conjugarea bacteriana Conjugarea bacterian reprezint un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legturi intercelulare directe. Este condiionat de prezena factorului F n celula donoare. Receptorii specifici Pentru realizarea legturii intercelulare este necesar existena unor receptori de suprafa att la celula donoare, ct i la celula receptoare. Acetia vor permite recunoaterea reciproc. Fiziologia conjugrii bacteriene Dup un numr de alipiri ntmpltoare, bacteriile F+ formeaz cu bacteriile F- perechi de recombinare i ntre celulele alturate se formeaz un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizeaz transferulunidirecional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parial sau total n genomul celulei receptoare, ducnd la apariia unor proprieti noi ale acesteia, manifeste sau nu. 26.Clasificarea substantelor antimicrobiene dupa mecanismul de actiune.Exemple Substanele antiseptice i dezinfectante se pot clasifica n funcie de mecanismul de aciune, dup cum urmeaz: 17

a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea concentraiei corespunztoare. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele *srurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide+, gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii *acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc+, detergenii *anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle ntermenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz). 27.Antibiograma difuzimetrica Principiu.Interpretare Antibiograma face parte din prima categorie de metode menionate. Reprezint metoda de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltai de la bolnavii cu infecii bacteriene, dup cultivare pe medii mbogite, care s permit dezvoltarea optim a microorganismului pentru care se efectueaz testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton). Pentru antibiograme trebuie s folosim culturi pure (reprezentnd o singur tulpin bacterian), chiar n cazul infeciilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt: Tehnicile calitative o antibiograma difuzimetric comun (cu discuri) o antibiograma difuzimetric comparativ o antibiograma difuzimetric standardizat o antibiogramele difuzimetrice rapide Tehnicile cantitative o metoda diluiilor n mediu lichid o metoda diluiilor n agar o metoda microdiluiilor n agar o metoda punctelor de ruptur 18

o testul E o metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc. Antibiograma difuzimetric comun Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar MuellerHinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu prin inundarea plcii urmat de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (exist i alte variante tehnice). Dup circa 20 minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea becului de gaz, aprins) se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice n concentraie standardizat. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, n condiii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator automat (la minim 30 mm distan ntre ele i minim 15 mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm plcile peste noapte n termostat, la 28 sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de inhibiie n care coloniile microbiene nu se dezvolt (Figura nr. 3). Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se dezvolt colonii, mutani rezisteni, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4). Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active, pentru c tehnica nu este standardizat. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal) Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm. Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se examineaz comparativ). n cazul n care cunoatem CMI (concentraia minim inhibitorie) a microorganismului de referin, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat. Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente. Plasm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm peste noapte la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm rezultatele. (Figura nr. 5) Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer, NCCLS) Din punct de vedere tehnic se realizeaz asemntor cu prima metod prezentat, dar este standardizat, fiind singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, care permite obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile ntre laboratoare diferite (Film nr. 1). 19

Elementele necesare standardizrii sunt: mediul (n majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru c are o valoare nutritiv corespunztoare i nu conine substane cu aciune inhibitoare) o exist elemente minerale care trebuie adugate n cazul testrii anumitor microorganisme (ex. Mg2+ i Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci cnd este testat sensibilitatea la aminoglicozide); o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins ntre 7,2 i 7,4); o exist suplimente nutritive care trebuie adugate n cazul testrii unor microorganisme pretenioase; o grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm (25 ml de mediu/plac de 9 cm); inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s aib o turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor; timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de 2-3 plci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare; concentraia substanelor antimicrobiene din microcomprimate i dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru); alegerea substanelor antimicrobiene pentru care se face testarea; pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utilizrii (maxim 7 zile, n pungi de polietilen, la +4C); utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate; interpretarea rezultatelor (se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziie de productori i/sau centrele de referin). Metodele difuzimetrice au dezavantajul c nu permit aprecierea concentraiilor eficace ale antibioticului la nivelul focarului infecios. 28.Definiti:CMI,CM Acest tip de metod ofer informaii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, fa de microorganismul testat. CMI = concentraia minim inhibitorie, reprezint cea mai mic concentraie de agent antimicrobian, exprimat n micrograme/ml, care mai exercit o aciune bacteriostatic asupra germenului testat. Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton n concentraii descrescnde (diluii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml i pn la 0,125 micrograme/ml, n total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (cantitatea final va fi de 1 ml n fiecare tub). Preparm un inocul standardizat turbidimetric i n condiii aseptice inoculm toate cele 10 tuburi cu cte 1 ml de inocul. Agitm pentru a omogeniza. Incubm cele 8 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub martor l meninem pentru aceeai perioad la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizm i un ir de tuburi pe care le inoculm cu o tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare citim i interpretm rezultatele. Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu cantitatea de mediu, concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost de 16 mg/ml, diluia final va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor meninut la +4C ar trebui s nu fie prezent creterea, n tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie s fie prezent (Figura nr. 7). n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatul corespunztor datelor pe care le cunoatem privitor la respectiva tulpin.

20

n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n funcie de specia microbian) c microorganismele n cazul crora CMI este 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilin n cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (i practic aceasta semnific rezisten in vivo) pentru Bacteroides fragilis iar n cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sauChlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente. Este necesar o plac Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi mprit n sectoare, numrul de sectoare fiind corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian. nsmnm n condiii aseptice din fiecare tub fr cretere microbian, fiecare n sectorul de plac corespunztor (Figura nr. 9). Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C. CMB va corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii) (Figura nr. 10). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB. Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea eficacitii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infeciilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este indispensabil. 29.Definiti notiunile de:simbioza,comensalism,parazitism Simbioza: asocierea de vieuitoare din specii diferite care i duc viaa n comun. Orice organism viu poate deveni habitat pentru alte forme de via mai mici. Cu o parte din microorganismele ntlnite organismul stabilete relaii de simbioz, convieuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care particip unii coliformi intestinali). Comensalismul: adpost i nutrieni oferii de gazd. Foarte multe din microorganismele care alctuiesc microflora normal se afl n relaii de comensualism cu organismul, germenii depinznd nutriional de gazd, creia nu i creeaz prejudicii. Aceast convieuire exprim ns un echilibru instabil, care poate fi uor tulburat. Diferii factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaii, astfel nct unele microorganisme din flora normal pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiionat patogene. Parazitismul: beneficiu unilateral al microorganismului n defavoarea gazdei. Relaia de parazitism tipic apare ns doar atunci cnd microorganismele se dezvolt n detrimentul gazdei, cu manifestri clinice mai mult sau mai puin evidente. Astfel, n cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta dect n organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putnd tri i libere n natur, dar o dat ptrunse n organism stabilesc cu acesta relaii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

21

30. Definiti notiunile de:contaminare,colonizare,infectie Contaminare, este un termen utilizat n instituiile sanitare (deosebit de contaminarea radioactiv) care se refer, n general, la contactul cu microorganisme condiionat patogene sau patogene (capabile s produc infecii sauboli infecioase ). infectie - Invazie a unui organism viu de catre microorganisme patogene care actioneaza prin multiplicarea lor (virulenta) si eventual prin secretarea de toxine. Colonizarea reprezinta procesul de populare a unei anumite zone din organism de catre anumite microorganisme patogene. Rezultatul colonizarii bacteriene este infectia.

31.Definiti notiunile de :exotoxina,endotoxina,anatoxina,antitoxina.Exemple Germenii se multiplic la poarta de intrare i elaboreaz exotoxine care produc alterri celulare i distrucii tisulare la distan, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote (toxikon era otrava n care erau nmuiate sgeile lupttorilor greci). Exotoxinele Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi lizogenizai (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legrii de receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu i exercit efectele toxice dect dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt secretate n timpul vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei botulinice). Au afinitate diferit n funcie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi n cazul bacilului difteric). Manifestrile clinice apar dup o perioad de laten (cnd toxina este deja fixat pe celulele int). Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecii i reprezint urgene medicale, toxina putnd fi neutralizat numai dac este liber n circulaie. Au putere antigenic mare, fa de ele aprnd anticorpi antitoxin. Antitoxinele Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare specific cu toxina. Se pot obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific. De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului). Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai pe cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai curnd posibil. Tratamentul acestor entiti clinice este complex i nu reprezint subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie fcut dup o testare a unei eventuale hipersensibiliti i n 22

cazul c aceasta exist se recurge la desensibilizare i abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxin). O alternativ ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dac acestea sunt disponibile. Anatoxinele Exotoxinele pot fi detoxifiate ntr-un anumit interval de timp sub aciunea conjugat a temperaturii i formolului. Prin acest procedeu i pierd puterea toxic, dar i menin puterea imunogen i devin anatoxine. Anatoxinele se utilizeaz n profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (n cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum i pentru hiperimunizarea animalelor n scopul obinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc). Endotoxinele Endotoxinele au fost evideniate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de acetia i apoi incluse n peretele bacterian, eliberndu-se n urma distrugerii germenilor. Au structur lipopolizaharidic (LPZ sau LOZ), n constituia lor intrnd acizi grai, un lipid A i lanuri de polizaharide. Au efecte toxice la nivelul celulelor majoritii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacterian care le elibereaz. Toxicitatea lor este ceva mai redus (n comparaie cu exotoxinele), dar pot aciona la mai multe nivele inducnd apariia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilitii vasculare, hipotensiunii arteriale pn la colaps, sindromului de coagulare intravascular diseminat etc. Sunt implicate ntre altele n apariia ocului endotoxic (se elibereaz o cantitate de endotoxin proporional cu numrul germenilor distrui). Studiile arat c mortalitatea n ocul endotoxic este n relaie destul de direct cu cantitatea de endotoxin / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identific 100 uniti endotoxin / ml de plasm. Aa cum am menionat n capitolul privind structura bacterian, componenta toxic este reprezentat de lipidul A; totui, i polizaharidul O (structur antigenic) contribuie la patogenitate s-a dovedit c bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uor distruse prin mecanisme care implic sistemul complement. LPZ aflat n circulaie se cupleaz cu proteine plasmatice (LPSbinding plasma proteins) i apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de ctre monocite i macrofage. Se activeaz rspunsul inflamator, coagularea intravascular, apariia de hemoragii i n final poate rezulta ocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 i TNF- care la rndul lor stimuleaz cutia Pandorei i respectiv producia de leucotriene i prostaglandine (cu efect de cretere a fenomenelor inflamaiei). Sunt activate att sistemele de coagulare ct i sistemul complement iar cascadele de reacii care apar sunt rareori reversibile n urma tratamentului. Puterea antigenic i imunogen este mai redus fa de exotoxine. LPZ n calitate de mitogen stimuleaz o activare policlonal a LB, cu secreia de IgG i IgM. n afara LPZ sau LOZ, mai sunt i alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive: - delta endotoxina prezent la Bacillus thuringiensis, toxin care nu afecteaz omul, deoarece acesta nu prezint enzime i receptori care s o proceseze; - Listeria monocytogenes produce o substan endotoxin-like etc.

23

32.Inflamatia Definitie.Factori ce o determina.Etape Inflamaia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative i proliferative i fenomene reparatorii. Inflamaia are drept principal scop limitarea aciunii i eventual neutralizarea agentului agresor (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutm despre fenomenul inflamator i n cadrul unor agresiuni microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaia reprezint un concept mult mai complex (apare n mult mai multe circumstane, dect n cele infecioase).. Inflamaia poate interesa esuturi, organe, sisteme sau chiar ntregul organism i are drept semne / simptome clasice, urmtoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, nroire local), calor(temperatur crescut n zona n care evolueaz fenomenul inflamator), dolor(durere), nsoite sau nu de functio laesa (tulburri funcionale mai ample sau mai puin ample, mergnd pn la impoten funcional, de ex. imposibilitatea deplasrii membrului inferior datorit unei inflamaii la articulaia genunchiului, n cadrul unei infecii diseminate cu Neisseria gonorrhoeae).

Exist o mare diversitate de ageni determinani ai unui proces inflamator, printre acetia putnd fi enumerai: - diferiii ageni fizici (radiaii, frig, cldur, curent electric, traumatisme etc.); - microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, parazii); - agenii chimici exogeni, (ex. ulei de croton, terebentin, caolin, dextran etc) i / sau -endogene (uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminrii lor din organism pe alte ci dect cele fiziologice (de exemplu n situaia apariiei unui reflux bilio-gastric). n rezumat, inflamaia reprezint reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care aparin diferitelor reele informaionale (de exemplu reeaua imun ce include organe ale sistemului imun, celule ale sistemului imun, substane sintetizate i eliberate n cursul reaciilor imune, interrelaii mediate celular sau umoral etc) ce declaneaz diferite tipuri de rspunsuri care urmresc, cel puin n stadiile iniiale, s realizeze o reechilibrare i aducere la normal, la situaia anterioar intrrii n contact cu agentul agresor. Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamaii proliferative la nivelul sistemului limfatic i respectiv inflamaii exsudative n parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaii alterative (la nivel pulmonar), inflamaii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaii proliferative (la nivel dermic). Din punct de vedere didactic, etapele inflamaiei sunt urmtoarele: 1.Etapa de declanare, n care agentul determinant produce modificri la nivelul esutului interstiial i n celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze. Factorii eliberai conduc la apariia rspunsului inflamator acut, respectiv: - vasodilataie capilar (eritem, nroire), - exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) i - acumulare de leucocite PMN. Principalele proteine care apar n aceast etap sunt componentele sistemului complement, dar i diferite citokine. Elementele celulare importante n realizarea procesului inflamator sunt reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular i celulele endoteliale. 2.Etapa efectoare, care la rndul ei se submparte n trei subetape: 24

A) Subetapa molecular, n care se activeaz: - cascada complementului; - sistemul de coagulare-fibrinoliz; - diferitele ci de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian n urma scindrii date de fosfolipaz), respectiv B) Subetapa vascular, n care au loc modificri ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaie a sngelui, ale permeabilitii vaselor mici din aria tisular lezat. Iniial se produce vasoconstricie, n decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub aciunea unor mediatori solubili eliberai din zona tisular afectat, care produc dou categorii de efecte: a) vasculare (dilataie arteriolocapilar cu creterea numrului de capilare active, hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zon a unor receptori de adeziune intercelular astfel nct celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial i n final o faz de staz vascular pasiv, cu hipoxie i creterea permeabilitii vaselor mici) i b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase ctre esutul lezionat i activate metabolic)..

C) Subetapa exsudativ, n care se formeaz exsudatul inflamator (plasma exsudat, bogat n proteine i LDH) la care se adaug elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local i produi rezultai din diferite modificri locale. Prin constituenii si celulari i moleculari, exsudatul asaneaz focarul inflamator i tinde s blocheze procesul infecios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitar. Consecinele activrii mecanismelor implicate n procesul inflamator n funcie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaie. Putem lua n discuie diferitele forme clinice evolutive (acut, subacut, cronic) precum i formele anatomoclinice. Evoluia spre cronicizare se datoreaz agenilor inflamatori care au proprietatea de a stimula n special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenei stimulului inflamator. Inflamaia cronic este din ce n ce mai mult privit nu numai ca o consecin a unui risc infecios continuu, dar i ca o parte integrant a multor boli neinfecioase, cum ar fi disfunciile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc. Astfel, nu este surprinztor c unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renin-angiotensin (SRA), care a fost descris prima dat n contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de reglare a rspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8).Evoluia spre vindecare presupune: - asanarea focarului inflamator (ncepe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare i cu ndeprtarea resturilor celulare i a eventualelor microorganisme care sunt ageni determinani); devine maxim dup acumularea de leucocite PMN i macrofage. - vindecarea propriu-zis ncepe relativ rapid n cursul procesului inflamator; vindecarea ncepe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde s le nlocuiasc pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menionate anterior..

25

33.Organele centrale si periferice ale sistemului imun Organele limfoide primare organele limfoide primare, numite i centrale, sunt situate n afara cilor de acces i circulaie antigenic. n aceste organe diferenierea apare precoce, n viaa embrionar, naintea celor secundare. Proliferarea limfocitar este intens i independent de stimularea antigenic. Organele limfoide primare au urmtoarele roluri: permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) i B (dependente de mduva roie hematogen / bone marrow - la mamifere). gzduiesc primele stadii de difereniere, pn la limfocitele T sau B mature, apte s recunoasc structurile antigenice i s fie stimulate de antigene. efectorii imuni nva la acest nivel s recunoasc i s tolereze constituenii propriului organism (auto-recunoatere i toleran fa de self). Un limfocit T sau B matur care a prsit timusul, respectiv mduva osoas hematogen, nu mai revine niciodat la acest nivel, cele dou organe fiind n afara cilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare. Timusul Timusul se formeaz n perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial. nc din stadiul de dezvoltare fetal, timusul este prezent n cavitatea toracic, fiind dispus retrosternal, ca un organ bine difereniat, deja funcional. Agenezia acestei regiuni duce la apariia unui deficit congenital rar, sindromul Di George(aplazia congenital timic sau boala pipernicirii), caracterizat prin tulburri ale imunitii celulare i implicit prin susceptibilitate crescut la infecii (respiratorii, digestive i cutanate, produse n special de fungi i virusuri i mai rar de ctre bacterii), tetanie neonatal (datorat absenei paratiroidelor) i malformaii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc). Timusul este un organ situat n mediastinul anterior i superior, retrosternal, format din doi lobi unii printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentai de septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alctuit din 2 zone: cortical (la exterior) i medular (la interior). Iniial se dezvolt zona cortical. Greutatea sa variaz cu vrsta (este bine dezvoltat la ft, greutatea crete pn la pubertate dezvoltarea maxim se realizeaz la vrsta de 10-12 ani, apoi sufer o involuie lent, fr s dispar total). n zona cortical, trama de-a lungul creia se plaseaz protimocitele (sosite n timus de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice i macrofage. Limfocitele mici, denumite i timocite corticale, sunt numeroase, grupate n grmezi, n jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structureaz n noduli limfatici. n zona medular, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formnd corpusculii lui Hassal (formaiuni de celule epiteliale care degenereaz, fiind mereu nlocuite cu alte celule similare), caracteristici timusului. Se consider c au rol fagocitar. Cresc att numeric ct i ca dimensiuni, probabil datorit contactului cu microorganismele din flora normal, dar i contaminrii cu alte microorganisme. Medulara mai conine i celule dendritice, macrofage i timocite. Timocitele

26

medulare sunt mult mai dispersate dect cele din zona cortical. La acest nivel are loc selecia negativ a timocitelor. Timusul are capacitatea de a elimina prin selecie pozitiv celulele care, odat eliberate n circulaie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non-self i prin selecie negativ celulele care ar fi dat reacii autoimune. Populaia limfocitar aflat n proces de multiplicare n timus, este foarte sensibil la aciunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaiei, trec n circulaie. Se pare c iniial are loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular i dintre acestea supravieuiesc cele 1-5% limfocite corticorezistente. Timocitele ajunse n zona medular sunt mai rezistente la aciunea cortizolului dect cele din zona cortical. (Figura nr. 1) Rolul timusului se manifest local i la distan: rolul local, const n transformarea limfocitelor nedifereniate n limfocite T mature, cu achiziia de receptori pentru antigene . Procesul de multiplicare i difereniere are loc, n principal, n regiunea cortical. Celulele achiziioneaz progresiv markeri ai limfocitului T adult. Urmeaz o dubl selecie, pozitiv i negativ. n selecia pozitiv, timocitele care recunosc antigenele strine fixate pe moleculele MHC pot prolifera n timp ce acele limfocite care nu i-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. n selecia negativ, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminndu-se astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariia unor fenomene autoimune imediat dup natere. n timus are loc multiplicarea, diferenierea i selecia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol n prevenirea bolilor autoimune (experienele realizate prin nlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sntoase a dus, pentru un timp, la dispariia semnelor de boal, dovedind astfel existena acestor celule timice). rolul la distan se realizeaz prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceti factori au funcii diverse, unii dintre ei influennd diferenierea limfocitelor T n ariile timodependente din organele limfoide periferice. Acioneaz att la nivelul timusului ct i la distan. Mduva osoas hematogen la mamifere Transformarea celulei stem n limfocit B matur are loc n mduva osoas hematogen (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat att de mduva din oasele late ct i din oasele lungi; ulterior, mduva de la nivelul oaselor lungi este nlocuit cu esut adipos, care mai trziu se fibrozeaz, iar mduva activ rmne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirm existena unei autonomii a acestei populaii. Transplantul de mduv osoas hematogenrestaureaz imunitatea umoral, ducnd la dispariia perturbrilor. Dintre funciile mduvei osoase hematogen n imunitate amintim: 1. meninerea unui procent de celule stem cu difereniere spre linia limfocitar i primele stadii ale seriei T i B; 2. maturarea i diferenierea complet a limfocitelor B n celule B mature, apte s colonizeze organele limfoide secundare. Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite i periferice sau efectoare, este tardiv fa de cea a organelor limfoide primare, atingnd dezvoltarea deplin numai dup stimularea antigenic. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina i organele limfoide 27

ataate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantoneaz limfocitele T provenite din timus i limfocitele B provenite din mduva osoas hematogen, migrate pe calea torentului circulator. n organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa n urma contactului cu antigenele. n anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splin, se gsesc grupuri de celule, constituite n special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici. naintea stimulrii antigenice, aceti foliculi primari sunt n repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinnd un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite naive, deoarece nu au avut contact cu antigenul. Dup circa 3-6 zile de la stimularea antigenic, foliculii primari se transform n foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, nconjurat de o zon mai ntunecat. n jurul foliculului exist o zon marginal puin vizibil, constituit din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persist cteva sptmni dup care redevine folicul primar. Organele limfoide secundare cuprind urmtoarele grupe: Ganglionii limfatici Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezint structuri imune, organizate, situate la interseciile traseelor limfatice. Au urmtoarele roluri: colecteaz structurile antigenice care traverseaz teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate de macrofage i/sau de celulele dendritice); induc un rspuns imun fa de antigenele de tip celular, n regiunea paracortical (dnd natere la limfocite T specifice) sau fa de antigene de tip umoral, n foliculii limfatici cu limfocite B active, maturate n mduva osoas hematogen i stocheaz informaiile imune datorit limfocitelor cu memorie dar au rol i n diseminarea rspunsului imun prin circulaia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, ctre torentul circulator i ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii. n seciune anatomo-patologic transversal remarcm la exterior o zon cortical (cuprinde n special limfocite B, instruite la nivel medular, aglomerate sub form de noduli limfatici. n mijlocul nodulilor se afl centrii germinativi. Foliculii cresc mult n dimensiuni dup infecie, iar ganglionii limfatici devin palpabili i dureroi. Sub zona cortical se afl zona paracortical (cuprinde n special limfocite T). n mijloc se afl zona medular, n care se gsesc att limfocite B ct i limfocite T. n ganglionii limfatici se mai gsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2) Splina Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, avnd ns i alte funcii: joac rolul unui filtru care n mod nespecific ndeprteaz/elimin complexele antigenanticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti); are o eficien remarcabil n ndeprtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum i celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.); eliminarea hematiilor degradate, mbtrnite; 28

reglarea volumului sngelui etc.

Pe seciune, splina are o culoare roie, cu formaiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi (foliculi splenici). Splina este compus din dou tipuri de esuturi: pulpa roie implicat n distrugerea hematiilor i pulpa alb, corespunztoare esutului limfoid. Aceasta din urm este organizat sub forma unor grupri de limfocite T dispuse n imediata vecintate a arteriolelor (manoane de limfocite T - teaca limfatic periarterial), iar spre periferia acestora se gsesc cordoane de limfocite B (zona marginal). Se consider c zona bogat n limfocite T este zona timo-dependent, n timp ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependent. Vascularizaia splinei are o serie de particulariti. Artera splenic intr prin hilul splenic iar ramificaiile sale, arterele trabeculare, urmeaz cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc ramificaii, arterele centrale nconjurate de manoane de limfocite T, vase care asigur irigaia foliculilor limfatici i artere penicilate care intr direct n contact cu sinusurile venoase ale pulpei roii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate n zona sinusului marginal. la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de ctre celulele reticulare. Dup 24 de ore, antigenul se regsete la nivelul centrului germinativ al foliculului sau n zona timo-dependent. La periferia foliculilor splenici se gsesc plasmocite. La acest nivel are loc sintez de anticorpi (n special dup stimuli antigenici solubili, venii pe calea torentului circulator). Dup sintez, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin i pot ajunge n tot organismul. Splina reprezint un organ n care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM i diferenierea spre LB cu memorie n cadrul RI primar. Splina are i rol n sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea enzimatic a poriunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rndul ei are rol n creterea funciei fagocitare a PMN i n chemotactism). Hipofuncia splenic i n special splenectomia favorizeaz apariia unor infecii grave, inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate i microorganisme care paraziteaz eritrocitele. Este necesar aplicarea unei strategii de prevenire a infeciilor, incluznd vaccinarea i uneori profilaxia cu antibiotice i chimioterapice. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue) Cile respiratorii, tractul digestiv i cel uro-genital sunt nconjurate pe toat lungimea lor de esut limfoid difuz (sau nodular), bogat n limfocite B i plasmocite care secret sIgA. Datorit particularitilor funcionale, MALT se subdivide n: Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringian, linguale) i structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregai i esut limfoid difuz n strns asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca i splina. Amigdalele au un rol protector important n regiunea esofagian, faringian i a arborelui traheobronic, constituind un prim obstacol mpotriva infeciilor. Cu toate c dup amigdalectomie nu rezult infecii severe, decizia privind aceast operaie trebuie luat numai dup o analiz critic, punnd n balan att beneficiile ct i posibilele urmri negative. Structurile adenoide se inflameaz frecvent n timpul copilriei (dup diferitele i frecventele infecii respiratorii) i deseori, crescnd n dimensiuni, trebuie extirpate;

29

 Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plcile Peyer i formaiunile limfoide ale apendicelui (secret IgA), limfocitele intra-epiteliale i limfocitele sub-epiteliale. Plcile Peyer reprezint aglomerri de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului i ileonului). Dup infecii bacteriene se mresc i se pot uni n adevrate cordoane limfoide. Nu au vase limfatice proprii; Sistemul imunitar asociat arborelui bronic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue); Sistemul imunitar asociat cilor uro-genitale, prezent n special la nivelul vaginului; Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue).

Laptele matern conine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul nscut fa de infeciile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentar, dar sIgA poate fi primit n timpul alptrii, asigurnd protecia nou-nscutului i sugarului fa de o serie de patogeni, n primele luni de via. n organele limfoide secundare, distribuia limfocitelor i a celorlalte celule imune este controlat de citokine i chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate n reacii inflamatorii) au un rol deosebit de important n dezvoltarea normal a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune n eviden care este rolul lor. Molecula MIP-3 face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezint receptori. Datorit acestei substane, limfocitele T se localizeaz cu strictee n zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3 se numete CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distrui s-a observat absena marcat a zonelor timodependente i un rspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3 i pentru c sunt prezente n zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent n proporie mic i la nivelul limfocitelor B, lucru care explic migrarea acestora prin zonele timodependente ctre foliculii limfatici.

34. Sistemul complement Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezint unul dintre principalii constitueni ai aprrii naturale, ai imunitii umorale i respectiv un element important al reaciei imune survenite ca urmare a formrii complexelor antigen-anticorp (are rol esenial n rspunsul inflamator). Sistemul complement are o serie de funcii importante: aprarea nespecific mpotriva infeciei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor strine) eliminarea complexelor imune i a celulelor apoptotice; reglarea fiziologic a RI, dar particip i la creterea permeabilitii capilarelor, stimularea contractilitii musculaturii netede etc. n cele mai multe mprejurri, sistemul complement are efecte benefice; totui sunt de menionat i unele efecte negative (ex. particip la reaciile anafilactice, este implicat n hipersensibilitatea citolitic-citotoxic etc).Componentele C' se gsesc n ser, n stare inactiv. Pentru a declana activarea lor este necesar un stimul. Pentru calea clasic, punctul de pornire este reprezentat de ctre complexele antigen-anticorp unde anticorpii sunt de tip IgM sau de tip IgG

30

35.Raspunsul imun I si II Caractere principale Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i anume: activarea limfocitelor, eliberarea a diverse molecule, multiplicarea celulelor specifice,

producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la eliminarea acestuia (direct sau indirect).

Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T i B dememorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiai antigen. Aa cum a fost menionat anterior, principala caracteristic a imunitii este specificitatea. Pentru a sugera ct de specific este rspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre potrivirea dintre cheie i broasc, ntre structurile Ag i Ac. O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen Raspunsul imun primar naintea primului contact cu un anumit antigen, nu exist anticorpi potrivii fa de acesta. Stimulul antigenic primar selecteaz LB care au receptori pentru respectivul Ag. Dup primul contact cu Ag se dezvolt RIP, cu urmtoarele caracteristici: Latena: reprezint perioada de la contactul cu Ag pn la prezentarea structurilor Ag ctre LB; variaz n funcie de natura antigenului, calea de administrare i doza administrat; dureaz ntre 2 i 3 zile; Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare (cteva zile), timp n care titrul anticorpilor serici se menine relativ constant; Ulterior are loc scderea progresiv a titrului anticorpilor serici.

De regul, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac dup 5-14 zile de la stimulul antigenic primar. Natura anticorpilor: examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM scade); n urmtoarele 2-3 sptmni, n ser predomin anticorpii de tip IgG; n urmtoarele luni, eventualii anticorpi care persist sunt de tip IgG.

Raspunsul imun secundar 31

Rspunsul imun secundar apare dup al doilea contact cu acelai antigen (sau dup contacte ulterioare). RIS are urmtoarele caracteristici: poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen; latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere logaritmic; anticorpii sunt de tip IgG; titrul Ac produi este mult mai nalt; persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile).

Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific. Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic: face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii).

Cunoaterea caracteristicile RIP i RIS are importan practic. Ne permite s nelegem i motivul pentru care reaciile Ag-Ac trebuie fcute, de regul, n dinamic.

36.Tipuri de Ig Exista cinci tipuri de imunoglobuline in sange: IgG, IgA, IgM, IgE si IgD. Ig A IgA reprezinta 10-15 % din totalul imunoglobulinelor. IgA sunt anticorpii secretori majori; se gasesc in lacrimi, saliva, secretii respiratorii, gastrointestinale si urogenitale. In forma dimerica (IgA2) contin suplimentar 2 lanturi oligopeptice: unul jonctional si altul secretor (o glicoproteina). IgA2 este rezistenta la actiunea proteolitica si are rol in aglutinarea bacteriilor, impiedicand astfel penetrarea mucoaselor. Concentratii crescute de IgA monoclonale apar in afectiuni limfoproliferative, in special mielomul multiplu IgA si limfomul mediteranean cu localizare intestinala. Un varf monoclonal > 2g/dL constituie un criteriu major de diagnostic pentru mielomul multiplu. Cresteri ale IgA pot fi intalnite in numeroase afectiuni ale suprafetelor mucoase. Scaderi ale IgA se inregistreaza la pacientii cu boala sinopulmonara cronica, ataxie-telangiectazie si deficit congenital. Unele deficite clinic semnificative de IgA sunt insotite de un deficit concomitent de IgG2 si IgG4. Pacientii cu deficit congenital de IgA sunt predispusi la afectiuni autoimune si pot dezvolta anticorpi fata de IgA, avand risc de anafilaxie daca sunt transfuzati cu sange ce contine IgA. Ig G IgG reprezinta 75 % din imunoglobulinele plasmatice. Sunt anticorpii majori produsi ca raspuns la un contact secundar cu un antigen. Strabat endoteliile si placenta si induc pasiv imunitatea la nou nascut. Neutralizeaza toxinele bacteriene si functioneaza ca opsonine (se leaga de suprafata bacteriana favorizand fagocitoza). 32

Scaderile semnificative de IgG, de cauza congenitala sau dobandita, cresc susceptibilitatea individuala pentru infectii bacteriene. Astfel, in cazul pacientilor cu infectii repetate trebuie verificat nivelul imunoglobulinelor serice deoarece, in cazul unui deficit, pot beneficia de tratament cu gamaglobuline. Pe de alta parte, niveluri crescute de IgG se intalnesc la persoanele imunocompetente, ca raspuns la o mare varietate de procese infectioase sau inflamatorii. Prezenta anticorpilor IgG specifici a fost demonstrata pentru numeroase organisme; impreuna cu determinarea IgM specifice contribuie la diagnosticul serologic de infectie acuta sau cronica. O cauza majora de crestere policlonala a IgG o reprezinta sindromul imunodeficientei dobandite. Cresteri policlonale ale IgG se inregistreaza de asemenea in scleroza multipla si in unele hepatite cronice. Cresteri monoclonale ale IgG se intalnesc in multe cazuri de mielom multiplu, un nivel > 3 g/dL constituind un criteriu major de diagnostic. Ig M IgM sunt anticorpii majori produsi in timpul raspunsului imun primar. Au o structura pentamerica, 5 molecule de IgM fiind legate printr-un oligopeptid jonctional. Factorul reumatoid (majoritatea cazurilor) si izoaglutininele (alfa si beta) de grupa sanguina ABO apartin acestei clase. IgM reprezinta tipul de anticorpi produsi initial in cursul raspunsului imun si prima clasa de imunoglobuline sintetizate de fat sau nou-nascut. IgM nu traverseaza placenta. Din aceste motive demonstrarea anticorpilor IgM specifici este utila in evaluarea stadiului infectiei (infectie acuta: sunt prezenti anticorpii IgM; infectie cronica: predomina anticorpii IgG) si a probabilitatii infectiei congenitale (un nou-nascut cu anticorpi IgM este infectat; un nou-nascut cu anticorpi IgG a dobandit pasiv, transplacentar, anticorpi materni). Sindromul imunodeficientei hiper-IgM se caracterizeaza prin absenta IgG si IgA din ser, asociata cu o crestere marcata a IgM. Macroglobulinele produse in boala Waldenstrm apartin clasei IgM si pot induce un sindrom de hipervascozitate a serului. Un nivel monoclonal > 2 g/dL reprezinta un criteriu major de diagnostic. Cresteri policlonale ale IgM se intalnesc in diverse conditii infectioase sau inflamatorii. Nivelul IgM este tipic crescut in ciroza biliara primitiva. Scaderi ale IgM se inregistreaza in hipogamaglobulinemia congenitala sau dobandita, caracterizata clinic prin infectii recurente. Ig E IgE sunt imunoglobuline fixate prin fragmentul Fc pe suprafata mastocitelor; cuplarea lor cu antigenul produce degranularea mastocitului cu declansarea reactiei alergice (tip I, imediat, anafilactic). In serul persoanelor normale concentratia IgE reprezinta mai putin de 0.001 % din totalul imunoglobulinelor. IgE detin un rol important in medierea reactiilor alergice care se produc in urma expunerii la alergeni a indivizilor susceptibili (atopici). IgE au o structura similara cu a celorlalte imunoglobuline, fiind alcatuite din 2 lanturi usoare si 2 lanturi grele. Lanturile grele ale fiecarei molecule de IgE contin o regiune variabila responsabila de specificitatea antigenica. Deoarece mielomul IgE este extrem de rar, utilitatea clinica a determinarii IgE se rezuma in general la rolul sau de mediator al raspunsului alergic. Majoritatea moleculelor de IgE din ser sunt fixate pe suprafata mastocitelor si a granulocitelor bazofile. Interactiunea alergenilor cu IgE specifice de pe suprafata acestor celule determina eliberararea de histamina si a altor substante vasoactive, initiand astfel reactia alergica. Aproximativ jumatate din indivizii cu rinita alergica sau astm prezinta niveluri crescute de IgE; restul, desi au concentratii crescute de IgE alergen specifice, prezinta niveluri normale de IgE totale. Studiile au indicat ca nivelul IgE totale este adesea crescut la pacientii cu dermatita atopica, iar nivelul IgE 33

tinde sa se coreleze cu severitatea eczemei. Concentratia IgE este de asemenea crescuta la pacientii cu infestari parazitare, aspergiloza bronhopulmonara alergica si intr-un anumit tip de imunodeficienta (sindromul Job) Ig D Imunoglobulina D (IgD) este o proteina cu masa moleculara de 180 kDa, ce reprezinta 0.25% din totalul imunoglobulinelor serice. Este o componenta importanta a proteinelor membranare de pe suprafata limfocitelor B la nou-nascuti, fiind de obicei co-exprimata cu o alta categorie de anticorpi (IgM). Rolul IgD membranare nu este pe deplin cunoscut, dar se crede ca aceasta este implicata in modularea diferentierii si proliferarii clonale a limfocitelor B. Forma serica este un monomer cu doua lanturi grele din clasa delta () si doua lanturi usoare (k sau ), ce devine detectabila abia dupa varsta de 6 luni. Concentratia serica a imunoglobulinei D prezinta valori crescute ca urmare a unor proliferari clonale inregistrate in boli hepatice, infectii acute sau cronice, afectiuni autoimune sau la nou-nascutii cu infectii in utero. 37. Ig M si Ig G Structura.Rol Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele exist n plasm, lichid interstiial i secreii i au capacitatea de a recunoate i de a se combina specific cu antigenul inductor al rspunsului imun. Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice: - recunosc i reacioneaz specific cu structura antigenic din cauza creia au aprut; - au funcie de anticorp, dar dac sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferit vor avea rolul de antigene pentru respectivul individ; - sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate dup un stimul antigenic; - pot activa sistemul complement etc. IgG IgG (prototipul de Ac) reprezint circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser i are o distribuie aproximativ egal n vase i esuturi. Exist patru subclase de IgG (molecule cu termorezisten mai mare), cu structur asemntoare, o mas molecular de 146.000 (excepie fcnd IgG3 cu o mas de 170.000), 3 domenii constante pentru lanul greu i un procentaj de hidrai de carbon de 2-3 %. Concentraia sanguin a IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% i IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentar (dup a 20-a sptmn de via intra uterin). Apare n RI secundar. IgM Sunt anticorpi aglutinani i reprezint cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producia lor fiind stimulat de ctre IL-4, care nu activeaz mecanismul de switch izotipic. IgM membranar (IgMm) este exprimat pe suprafaa LB. Are structur monomeric i se termin prin aminoacizii 556-597, cuprinznd n mod particular o parte intramembranar hidrofob i 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare molecul de IgMm este asociat cu 2 lanuri Iga i 2 lanuri Ig. Ansamblul formeaz BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T. IgM seric (IgMs) cuprinde un lan greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 Cm4 i un procent ridicat de hidrai de carbon (12 %). Molecula nsi este un pentamer cu un prim inel al punii disulfurice la sfritul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 i un lan J (joining 34

chain). Masa molecular este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraia seric este de 1,2 g / l. Reprezint circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Apare n RI primar.

38.Ce sunt Ag?Definitie.Tipuri.Exemple

Antigenul se definete drept o substan recunoscut specific de ctre sistemul imun. Ali autori consider c antigenul este o substan capabil s induc un rspuns imun (imunogenicitate) i s fie recunoscut de ctre sistemul imun (specificitate). Rspunsul imun (RI) tinde s neutralizeze i s elimine antigenul din cauza cruia s-a declanat. Antigenele (Ag) care pot declana RI sunt definite drept substane imunogene. Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana activarea limfocitelor (fr de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dac se combin cu macromolecule carrier. Aadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilin este o hapten. Pot aprea reacii de hipersensibilitate dup cel puin al doilea contact cu aceast structur i numai n condiiile n care gazda ntr n categoria persoanelor atopice, avnd structura genetic de codificare pentru o protein carrier, care cupleaz acidul penicilinoic stimulnd astfel RI. Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat. Orice bacterie trebuie vzut ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Clasificare: a)n relaie cu subiectul n care are loc RI: -Heteroantigenele sunt substane diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o alt specie. -Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeai specie -Autoantigenele sunt substane recunoscute prin rspunsul imun i prezente la animalul imunizat sau la om n contextul unei afeciuni autoimune. b) n relaie cu tipul de rspuns imun: -Antigenele timodependente-Antigenele timodependente sunt n general de natur proteic dar pot fi i de natur glucidic. Ele induc un rspuns primar iniial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un rspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. -Antigenele timoindependente- Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care au aceeai structur glucidic repetitiv dispus de-a lungul peretelui celular. flagelina, antigen proteic cu determinani antigenici repetitivi, face parte din antigenele timoindependente.

35

c) n funcie de repartiia antigenelor n natur: -Antigene ubicuitare(Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO) -Antigene restrnse(un exemplu fiind antigenele sanguine Rh) d) n funcie de natura chimic: -Polizaharidele ca i partea glucidic a glicoproteinelor sunt n general antigene. Exemplele sunt antigenele care definesc grupele sanguine i antigenele clasice ale diferitelor microorganisme. -Antigenele lipidice -Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene i imunogene. -Superantigenele . Se consider c superantigenele pot avea un rol n inducerea bolilor autoimune.

e) n funcie de potenialul de a stimula RI i de a reaciona cu Ac formai n cadrul acestui RI, antigenele pot fi: - Ag complete (majoritatea) care pot declana RI i pot reaciona cu Ac aprui; - Ag incomplete care nu pot declana RI dar pot reaciona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi izolai, nelegai de grupri purttoare (pot fi haptene). f) n funcie de specia microorganismului implicat -Antigenele bacteriene -Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din nveliul extern (ex. hemaglutinine) sau constituie proteine i glicoproteine structurale. -Antigenele parazitare -La o singur specie parazitar pot fi evideniate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum). 39.Reactiile de precipitare in mediu lichid Exemple.Utilizari

39.Reactiile de precipitare in mediu lichid Exemple.Utilizari A. Reacii de precipitare n mediu lichid Reacii de precipitare n amestec, reacii de floculare o titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc., o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), o RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, n diagnosticul serologic al sifilisului -Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac.

36

Reacii de precipitare n inel reacia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar). Reacii de precipitare n tub capilar o determinarea prezenei proteinei C reactive, determinarea prezenei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei proteinei C reactive (CRP).

Dozajul nefelometric etc.

Nefelometria se utilizeaz curent i determin cantitativ proteine specifice din ser i urin

40.Reactiile de precipitare in gel Exemple.Utilizari B. Reacii de precipitare n mediu gelifiat Imunodifuzia radial simpl (ex. metoda Mancini) Metoda permite determinarea cantitativ a imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc. Difuzia dubl

metoda Elek, Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. difuzia dubl radial (Ouchterlony) Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman.

41.Reactiile de aglutinare Principiu.Tipuri.Exemple n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

37

Tipuri: -1. Aglutinarea direct: 2. Aglutinarea indirect sau pasiv 3. Inhibarea aglutinrii 4. Aglutinarea n coloan 5. Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline

42.Reactiile de fixare ale complementului Principiu.Etape.Utilizari.Exemple Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. n diagnosticul serologic, cea mai cunoscut metod rmne nc RFC Bordet-Wasserman, utilizat nc n diagnosticul serologic al sifilisului. Principiul RFC: RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasic i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-antihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea C' i respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber.

Serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C' propriu. Aa cum am menionat anterior, principial, RFC are loc n 2 etape : o n prima etap se pun n reacie C', serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, C' rmne liber; o n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); exist 2 posibiliti: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei.

n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.

38

43.Reactiile de seroneutralizare Principiu.Tipuri.Utilizari.Exemple Reacia ASLO Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO.

Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n: diagnosticul microbiologic direct o identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate ( o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi anexa nr. 2); o toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi anexa nr. 2 i capitolul 50); diagnosticul serologic o reacia ASLO (vezi i capitolul 28); prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi i anexa nr. 4); o titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc); o testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreaciile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate fa de o infecie difteric sau scarlatinoas au intrat n istoria medicinii. tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

44.Hipersensibilitatea Definitie.Tipuri.Exemple n mod clasic, HS reprezint o stare de reactivitate crescut a organismului, pe baza unui mecanism imunologic, indus de expunerea (repetat) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvntul alergen a fost pentru prima oar utilizat de Riquet; desemneaz un antigen care d natere unei reacii de hipersensibilitate. HS se poate clasifica n funcie de tipul de rspuns imun n: HS mediat prin mecanism imun umoral (rol primordial LB i anticorpii) -HS de tip I (anafilactic, atopic), aa cum se nregistreaz n cazul ocului anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc; -HS de tip II (citotoxic), aa cum se ntmpl n liza celular prin anticorpi, complement dependent sau n citotoxicitatea anticorp dependent, complement independent (mecanisme ce pot fi implicate de ex. n patogenia reumatismului articular acut, n anemii hemolitice inclusiv dup infecii cu Mycoplasma pneumoniae, reacii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);

39

-HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aa cum se nregistreaz n reacia Arthus, boala serului, boala plmnului de fermier, glomerulonefrita extramembranar, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefrita i periarterita poststreptococic etc.

HS de tip IV mediat prin mecanism imun celular (rol primordial LT i citokinele), spre exemplu n -HS tuberculinic sau -HS n testrile intradermice care utilizeaz lepromin, candidin, histoplasmin, tricofitin etc i -HS n multe dintre infeciile virale.

40