Sunteți pe pagina 1din 58

12/28/2010

Metabolismul nucleotielor A. Biosinteza


Nucleotide Biosinteza

structura & rol nucleotidelor purinice IMP, AMP, GMP

Proveniena atomilor nucleului purinic Localizarea enzimelor Etapele & reaciile sintezei IMP Inhibitori sintetici = medicamente citostatice & bacteriostatice Conversia IMP AMP & GMP Reglarea sintezei ribonucleotidelor monofosforilate Conversia nucleotidelor monofosforilate di- si trifosforilate Calea de recuperare a purinelor Conversia ribonucleotidelor difosforilate deoxiribonucleotide difosforilate Patologie: Sindromul Lesch-Nyhan Biosinteza nucleotidelor pirimidinice Proveniena atomilor nucleului pirimidinic Localizarea enzimelor Etapele & reaciile sintezei UMP Transformarea UTP CTP Transformarea dUMP dTMP Patologie: Aciduria orotic

Nucleotide Structura & Rol

Uniti de construcie a acizilor nucleici Surse de energie Activatori ai precursorilor glicogenului, lipidelor complexe, proteinelor Componente ale coenzimelor Efectori allosterici

12/28/2010

Proveniena atomilor nucleului purinic

Ribozo-fosfat

Atomii de azot provin din Asp, Gly, 2Gln Atomii de carbon provin din CO2, Gly, 2Formil-FH4

! Nucleul purinic se constituie pe ribozo-5-fosfat

Sinteza IMP Localizare & Precursori & Etape


Localizare
Toate enzimele = citoplasmatice Precursori
Ribozo-5-fosfat , aspartat (Asp), glicocol (Gly), glutamina (Gln), CO2, N10formil-H4F

Sursa de energie = 5 ATP (6 legturi macroergice!)

Etape
1. Sinteza 5-fosforibozil-1-pirofosfat-ului (PRPP) 2. Sinteza 5-fosforibozilaminei 3. Sinteza inozinmonofosfat-ului (IMP)

12/28/2010

Sinteza IMP Etapa 1


Transformarea ribozo-5-fosfat fosforibozilpirofosfat (PRPP)

PRN = Fosforibonucleotid = AMP, GMP, IMP

Sinteza IMP Etapa 2


Transformarea PRPP Fosforibozilamina

12/28/2010

Sinteza IMP Etapa 3

Sinteza IMP - Reacii

12/28/2010

Inhibitori = citostatice & bacteriostatice


Analogi ai acidului p-aminobenzoic (PABA): sulfonamide Inhib competitiv sinteza bacterian a acidului folic => se reduce sinteza purinelor & acizilor nucleici => efectul bacteriostatic Analogi ai acidului folic:

- trimetoprim
Inhib dihidrofolat reductaza => impiedic refacerea H4F => Inhib sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici => efectul bacteriostatic

- metotrexat
Inhib sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici => se previne multiplicarea celulelor canceroase => efectul citostatic
Sunt afectate toate celulele care se divid rapid, inclusiv cele din mduva osoas, piele, tractul gastro-intestinal, foliculii prului, sistemul imunitar => efecte secundare nedorite: anemie, cderea prului, imunodeficien etc.

Conversia IMP AMP i GMP

Acid micofenolic
Reduce sinteza acizilor nucleici din limfocitele B & T Medicament utilizat pentru a preveni rejecia grefelor

12/28/2010

Sinteza IMP& AMP& GMP Reglare

Enzime reglatoare
PRPP sintetaza
Retroinhibiie: AMP, GMP (efect maxim cnd ambele sunt n concentraie optim) Glutamin PRPP amidotransferaza Retroinhibiie: ATP, ADP, AMP la un centru reglator GTP, GDP, GMP la alt centru reglator Activare n avans: PRPP Adenilosuccinat sintetaza i IMP dehidrogenaza Retroinhibiie: AMP, respectiv GMP Activare: GTP, respectiv ATP (ca i cosubstrate)

Sinteza nucleotidelor di- & trifosforilate


AMP + ATP GMP + ATP GDP + ATP
Adenilat kinaza

2ADP GDP + ADP GTP + ADP

Guanilat kinaza

NDK

12/28/2010

Calea de recuperare a purinelor


= Cale de sintez a IMP, AMP, GMP pornind de la bazel purinice rezultate prin catabolimul nucleotidelor i PRPP Se bazeaz pe existena enzimelor: Adenin fosforibozil transferaza (APRT)

Adenina + PRPP AMP + PPi


Hipoxantin-Guanin fosforibozil transferaza (HGPRT)

Hipoxantina + PRPP IMP + PPi Guanina + PRPP GMP + PPi


AMP, IMP, GMP nu mai trebuie sintetizate de novo !

12/28/2010

Sinteza deoxiribonucleotidelor difosforilate


P

O CH 2

Baza

OH OH NDP N ADP+ SH Tioredoxina Rductaza


+ N ADPH + H

dATP _

SH S S

Ribonucleotid reductaza

Tioredoxina P O P O CH 2 O Baza

OH H dNDP

Patologie - Sindromul Lesch-Nyhan


Hi poxan ti n a HGPRT PPi IMP PRPP

HGPRT PRPP (substrat n sinteza de novo) IMP, GMP (inhibitori ai sintezei de novo) Sinteza de novo a nucleotidelor purinice

Gu an i n a

HGPRT PRPP PPi

Producerea acidului uric Forma sever de gut Litiaza renal GMP Manifestri neurologice caracteristice: - retard mental - automutilare - miscri involuntare

Automutilare a buzelor i degetelor

Cristale de urat pe scutece

12/28/2010

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice


Proveniena atomilor ciclului pirimidinic

CO2

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice


Localizare: citoplsm & mitocondrie (dihidroorotat DH) Etape
1. Sinteza carbamoil fosfat-ului 2. Sinteza acidului orotic 3. Transformarea acidului orotic n UMP

! La nceput se constituie ciclul piridinic i apoi acesta reacioneaz cu PRPP

Aspartat

Glutamina

12/28/2010

Sinteza UMP- Etape

Sinteza UMP Reacii & Reglare


CO2 + G lutamina + ATP + AT P & P RP P Carbam oil _ fosfat UT P sintaza II O O C Asp Trans+ H3N CH2 carbam oilaza + O C CH O P C arbam oi l fosfat (C AP) H3N Aspartat
+

O O C + HNH2 CH2
-

Didroorotaza COO
-

HN O C

O C N H

CH2 CH COO
-

O C NH

CH H2O

COO

C arbam oi l aspartat (C AA)

Aci d dih idro oroti c (DHO A) NAD


+

DH NADH+ H O HN O C C Decarboxilaza N Rib-5- P UMP CO2 Rib-5- P O MP HN O C O C Transferaza N COO


+

HN O C

O C N H
-

PPi

PRPP

COO

Aci d oroti c (O A)

Enzima reglatoare = carbamoilfosfat sintaza II (citoplasmatic)

10

12/28/2010

Sinteza UTP & CTP & TMP


NH2 UMP AK ATP ADP UDP NDK ATP ADP UTP CTP sintaza O ATP Gln N N Rib-5- P P CTP 5-Fluorouracil _ UMP Reductaza
+

dUDP
+

Fosfataza H2O Pi

dUMP

TMP sintaza O Metilen H4F H2F H4F

O C N

CH3

NADPH + H

NADP

dRib-5- P TMP

Reductaza + _ NADPH NADP Metot rexat

Transformarea dUMP dTMP

11

12/28/2010

Patologie Aciduria orotic


Deficiena UMP sintazei (cu cele 2 domenii: orotat fosforibozil transferaza & OMP decarboxilaza) => acumularea i eliminarea urinar a acidului orotic => cretere anormal & anemie megaloblastic Dieta bogat n uridin => ameliorarea anemiei i reducerea excreiei acidului orotic

12

Catabolismul acizilor nucleici & nucleotidelor


Digestia & absorbia acizilor nucleici exogeni Catabolismul acizilor nucleici endogeni Catabolismul nucleotidelor purinice Proveniena i soarta acidului uric Patologie: SCID, guta Catabolismul nucleotidelor pirimidinice Patologie: aciduria orotic

Digestia & absorbia acizilor nucleici

ADN ARN Stomac Denaturare


pH acid

Acizi nucleici denaturati Intestin subtire Nucleaze (pancreas)

Oligonucleotide Intestin subtire Fosfodiesteraze (pancreas)

Mononucleotide Urina Circulatie Intestin subtire Nucleotidaze (mucoasa intestinala)

Nucleozide Intestin Nucleozidaze (mucoasa intestinala) subtire Pentoze Purine & pirimidine

Acid uric

Intestin gros

Enzimele florei intestinale

Enterocit

Acid uric (fecale)

Catabolismul acizilor nucleici endogeni

Acizi nucleari

Nucleaze citoplasmatice H2O

Nucleotide

Catabolismul nucleotidelor purinice


Defosforilare nucleotid: AMP Adenozina;IMP Inozina; GMP Guanozina Dezaminare nucleotid: AMP IMP sau nucleozid: Adenozina Inozina Fosforoliza Inozinei & Guanozinei => Hipoxantina & Guanina + Ribozo-1P Transformarea Hipoxantinei & Guaninei Xantina Acid uric
AMP H2O 5'-Nucleotidaza Pi Ade n oz in a AMP deam inaza H2O NH3 IMP H2O 5'-Nucleotidaza Pi In oz in a Pi O N Ribozo 1-fosfat N N N Hi poxan tin a Xantin oxidaza O N O N N N O Acid u ri c H2O2 Xantin oxidaza O O2 + H2O N N N Xantin a O N Guanaza H2O N H2N O2 + H2O H2O2 O N N N Gu ani n a GMP H2O 5'-Nucleotidaza Pi Gu anoz in a Pi Fosforilaza Ribozo 1-fosfat

Adenozin deam inaza NH3

H2O

Fosforilaza

NH3

Catabolismul AMP & GMP

Proveniena & Soarta acidului uric


Sinteza de novo 300-600 mg/zi Purine exogene 600 mg/zi

Nucleotide purinice

Nucleotide tisulare

Baze purinice

Urina
600mg/zi

Acid uric 1200mg

Intestin
200mg/zi

Defectele metabolismului nucleotidelor purinice

Boala

Defectul PRPP sintetaza PRPP sintetaza

Natura defectului Activitatea Rezistenta la retroinhibitie Afinitatea pt. ribozo 5P Rezistenta la retroinhibitie Partial defecta Lipsa enzimei Lipsa enzimei Lipsa enzimei Lipsa enzimei Lipsa enzimei

Comentarii Hiperuricemie Hiperuricemie Hiperuricemie Hiperuricemie Hiperuricemie Hiperuricemie Imunodeficien Litiaz renal Hipouricemie Litiaz renal
PRPP purine

Guta

PRPP sintetaza PRPP amidotransferaza HGPRT

Lesch-Nyhan SCID Litiaza renala Xantinurie Von Gierke

HGPRT ADA APRT Xantin oxidaza Glucozo 6P-aza

Hiperuricemie

Patologie - Deficiena adenozin deaminazei SCID


(Severe Combined Immunodeficiency Disease)
AMP H2O 5'-Nucleotidaza Pi Ade n oz in a AMP deam inaza H2O NH3 IMP H2O 5'-Nucleotidaza Pi In oz i n a O N N N Riboza N

Adenozin deam inaza (ADA) NH3

H2O

Gena ADA este exprimat n citosolul tuturor celulelor n limfocitele umane ADA are cea mai intens activitate ADA conduce la adenozinei => dATP = inhibitor al ribonucleotid reductazei Sinteza deoxiribonucleotidelor Sinteza ADN i diviziunea celular

TRATAMENT Izolarea copilului ntr-un mediu steril


Transplant de maduv Terapie genic

Patologie - GUTA
Hiperuricemia primar
Determinat de mutaiile genelor:
PRPP sintetazei => creterea produciei de purine => creterea cantitii de acid uric HGPRT => reducerea reutilizrii hipoxantinei i guaninei => cresterea cantitii de acid uric

Hiperuricemia secundar
- insuficiena renal - chemoterapie - consum excesiv de alcool (de ce?) i alimente bogate n purine - boala von Gierke (de ce?) - intolerana la fructoz (de ce?)

Hiperuricemia primar Alterarea PRPP sintetazei


Vmax KM P O CH2 O OH OH OH Riboz o 5-fosfat ATP Ki PRPP sintetaza
Mg
+2

O CH2 O O OH OH PRPP P O P

AMP

Sinteza excesiva de nucleotide purinice

P roductie excesiva de acid uric

Hi pe ru ri ce m i e = Gu ta prim ara

Cristale aciculare de urat monosodic Depozitate n esuturile moi cristalele iniiaz un process inflamator Infiltrarea granulocitelor care fagociteaz cristalele de urat ROS alterarea esutului eliberarea enzimelor lizozomale rspuns inflamator Producerea lactatului n esutul sinovial scderea pH-ului depunerea de noi cristale de urat apariia tofilor gutoi

Guta Simptome & Tratament

Tof gutos

TRATAMENT
Inhibiia xantin oxidazei cu oxipurinol (alloxantina), catabolit al allopurinolului (xantina i hipoxantina fiind mai solubile n ap sunt mai uor de eliminat) Intensificarea excreiei acidului uric (probenecid, sulfinpirazona) Antiinflamatoare (aspirina) Antichemotactice (colchicina) pentru prevenirea acumulrii granulocitelor n zona afectat

Catabolismul nucleotidelor pirimidinice


Ex. Catabolismul timinei
hidrogenarea dublei legturi => dihidrotimina desfacerea ciclului dihidropirimidinic ndeprtarea gruprii amidice transaminare => metilmalonil semialdehida

Defectele metabolismului nucleotidelor pirimidinice


Boala Enzima defecta
Orotat fosforibozil transferaza & OMP decarboxilaza OMP decarboxilaza

Comentarii

Aciduria orotic Tip I

Defect de cretere Anemie sever cauzat de eritrocitele hipocrome Leucopenie

Aciduria orotic Tip II Aciduria orotic fr componenta hematologic

Ornitin transcarbamoilaza (ureogeneza)

Carbamoil fosfatul mitocondrial Biosinteza pirimidinelor => Encefalopatia hepatic

Aciduria orotica indus de medicamente

OMP decarboxilaza

Cataboliii alopurinolului & 6-azauridinei inhib OMP decarboxilaza

10/4/2010

REPLICARE = Sinteza ADN


Replicare la procariote - Caracteristici - Factori necesari - Etape

Replicare la eucariote
Modificri postreplicare Inhibiia replicarii Ageni mutageni. Mecanisme de reparare Sinteza de ADN pe matri de ARN
1

REPLICARE PROCARIOTE Caracteristici


Are loc n timpul diviziunii celulare Este semiconservativ Dintr-o molecul de ADN printe => 2 molecule fiice care conin un lan printe i un lan complementar, nou sintetizat.

Asigur stabilitatea genetic a fiecrui organism i conservarea informaiei genetice de la o generaie la alta, n cadrul aceleiai specii

10/4/2010

Dovada replicrii semiconservative


Experiena lui Meselson i Stahl (1957)

Dovada replicrii semiconservative

10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE Caracteristici


Este bidirecional
ncepe de la origine (ori C) prin separarea celor dou lanuri printe i formarea a dou furci de replicare. Cele dou furci de replicare se deplaseaz simultan, n direcie opus, pn cnd se ntlnesc (n punctul ter situat pe partea cealalt a cromozomului, opus originii) .

REPLICARE PROCARIOTE Caracteristici


Prin copierea continu a lanului sens (direcia 3-5) => lanul conductor, Prin copierea discontinu a lanului antisens (direcia 5-3) => fragmentele Okazaki (1000-2000 nucleotide), componente ale lanului ntrziat.

10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE Caracteristici


Direcia replicrii este 53

REPLICARE PROCARIOTE Factorii necesari


Matri (template) = fiecare lan al ADN printe, citit n direcia 3-5. Necesar pentru ghidarea legrii nucleotidului complementar n vederea formrii noului lan de ADN; Deoxiribonucleotide trifosforilate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (substrate ale ADN polimerazelor); Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP (substrate ale ARN polimerazei); Enzime: - ADN polimeraze ADN-dependente: I, II si III - ARN polimeraza (primaza): cu activitate 5-3 polimerazic care sintetizeaz primeri (oligoribonucleotide), folosind ca matri monolanul de ADN; - Helicaze: enzime care despiraleaz ADN printe (ex. Dna B, proteina rep); - Topoizomeraze: enzime care elimin suprahelicarea produs prin despiralare, fie prin tierea unui singur lan (tipul I), fie prin tierea ambelor lanuri (tipul II, ex. giraza); - ADN ligaza: unete captul 3 al unui fragment Okazaki cu fosfatul din captul 5 al altui fragment Okazaki (folosind ca surs de energie ATP); Proteine: - dna A: recunoate originea replicrii i iniiaz despiralarea ADN; - SSB (Single-strand binding protein): mpiedic reasocierea lanurilor i aciunea enzimelor de clivare a monolanurilor; - n, n, n, i, dna C: formeaz primozomul.
8

10/4/2010

ADN polimeraze ADN-dependente


Tip de polimeraz POl I POL II POL III
Activitate Activitate polimerazic exonucleazic Rol
ndeprteaz primerii Repar ADN Repar ADN Alungete primerii de ARN folosind dATP, dGTP, dCTP, dTTP

5-3 5-3 5-3

3-5 i 5-3 3-5 3-5

Activitatea exonucleazic 3-5 asigur fidelitatea replicrii, este responsabil de proof reading, respectiv de corectarea greelilor de citire; Activitatea exonucleazic 5-3 sau activitatea de excizie-reparare este esenial pentru ndeprtarea primerilor i pentru repararea ADN alterat

Activitile ADN polimerazei III


Functia polimerazica
ADN polimeraza
Nucleotidul trifosforilat este selectionat si fixat (prin legaturi de H) de baza complementara din lantul matrita, apoi este legat (prin legatura 3-5 fosfoester) la capatul 3 al lantului in curs de sinteza.

Functia corectoare
Daca ADN polimeraza imperecheaza gresit un nucleotid, foloseste activitatea 3-5 exonucleazica pentru excizarea lui.

Enzima avanseaza Activitate 53 polimerazica

Enzima revine Activitate 3 5 exonucleazica

ADN matrita

Lant nou sintetizat

Activitatea 3-5 exonucleazic permite ADN polimerazei III s corecteze (proofread) lanul nou sintetizat
10

10/4/2010

Primaza = ARN pol. ADN dependent


Are activitate 5-3 polimerazic => sintetizeaz primeri (oligoribonucleotide), folosind ca matri monolanul de ADN;

11

Rolurile helicazei & topoizomerazei


Helicaza (ex. Dna B, proteina rep) despiraleaz ADN printe; Topoizomeraza elimin suprahelicarea produs prin despiralare, fie prin tierea unui singur lan (tipul I), fie prin tierea ambelor lanuri (tipul II);

12

10/4/2010

Aciunea ligazei
ADN ligaza: unete captul 3 al unui fragment Okazaki cu fosfatul din captul 5 al altui fragment Okazaki (folosind ca surs de energie ATP);

13

REPLICARE - Etape
Iniiere Elongare Terminare

14

10/4/2010

REPLICARE Etapa de iniiere


Etapa de iniiere = Etapa de formare a replizomului
Recunoaterea secvenelor consens (AT)n din regiunea ori de ctre dnaA, urmat de mpachetarea (tasarea) regiunii i despiralarea duplexului n regiunea nvecinat, respectiv formarea celor dou furci de replicare; Inseria complexului dnaB-dnaC; Deplasarea furcii de replicare prin aciunea dnaB i expulzarea dnaA; Stabilizarea poriunii despiralate prin fixarea proteinei SSB; Constituirea primozomului prin ataarea proteinelor n, n, n, i i a primazei; Sinteza ARN primer (amors); Constituirea replizomului prin ataarea polimerazei III i a helicazei (proteina rep) la primozom.

15

REPLICARE - Etapa de elongare


Etapa de elongare = etapa de alungire a amorsei (ARN primer)
Legarea succesiv a deoxiribonucleotidelor de ctre ADN Pol III (catalizeaz atacul nucleofil al OH din captul 3al primerului asupra gruprii -fosfat al NTP complementar nucleotidului din lanul matri).
ADN Pol III are aciune 5-3polimerazic =>numai lanul sens (3-5) poate fi copiat continuu => lantul conducator (leading strand). Copierea lanului antisens (5-3) presupune formarea mai multor bucle (pentru schimbarea sensului) i sinteza mai multor amorse de ARN prin alungirea crora rezult fragmentele Okazaki (1000-2000 nucleotide).

Constituirea lanului ntrziat (lagging strand) prin aciunea Pol I (care nlocuiete primerii cu deoxiribonucleotide) i a ligazei (care unete fragmentele Okazaki); naintarea furcilor de replicare produce n amonte o suprahelicare pozitiv care necesit intervenia topoizomerazelor
16

10/4/2010

Copierea lanului antisens (5-3) presupune formarea de bucle pentru schimbarea sensului

Directia de deplasare a furcii de replicare Primozom ARN primer

ADN polimeraza

ADN polimeraza

Lant Lant conducator intarziat

17

REPLICARE - Etapa de elongare

Lanul ntrziat este sintetizat n direcia 5-3 dinspre furca de replicare i necesit mai muli primeri

Lanul conductor este sintetizat n direcia 5-3 ctre furca de replicare i necesit un singur primer

18

10/4/2010

REPLICARE - Etapa de terminare


Etapa de terminare = etapa n care proteina ter-binding se leag de secvenele de terminare ter situate pe partea opus a cromozomului => este oprit aciunea helicazei (Dna B).

INHIBITIA REPLICARII la procariote


Norfloxacina
= inhibitor al ADN girazei (topoizomeraza II) bacteriene = medicament utilizat pentru tratarea infeciilor bateriene
19

Recapitulare

ncepe la furca de replicare prin separarea lanurilor (facilitat de helicaz, SSB, ADN topoizomeraze) legarea ADN polimerazei ADN polimeraza sintetizeaza noile lanuri n direcia 53 folosind primeri sintetizai de primaz lanurile parentale de ADN ca matrie Rezult 2 lanuri complementare fiice (replicarea este semiconservativ): lanul conductor prin alungirea unui singur primer, n direcia 53 , ctre furca de replicare lanul ntrziat prin alungirea mai multor primeri, n direcia 53 , dinspre furca de replicare
20

10

10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
Are loc numai n faza S a diviziunii celulare
La eucariotele superioare se divid activ un numr restrns de celule (ex. celule din piele, cripte duodenale, foliculi piloi). Precursorii eritrocitelor (eritroblaste) se divid de un numr limitat de ori, apoi si pierd nucleul (se transform n eritrocite) i prsesc ciclul celular. Majoritatea celulelor sunt reinute, dup mitoz, n faza G0 de nondiviziune (resting phase). Reintrarea n ciclul celular poate fi determinat de condiii de stress i este controlat de kinazele ciclindependente (CDK). Aceasta explic regenerarea rapid (cteva sptmni) a ficatului distrus n proporie de 90%.

21

REPLICARE - Eucariote
Eucariotele au mai multe polimeraze
Tip Activitate exonucleazic Rol Sinteza primerilor i a fragmentelor Okazaki (200 nucleotide) Repararea ADN Repararea ADN Replicarea ADN mitocondrial Sinteza lanului conductor Repararea ADN
22

3-5 3-5 3-5

11

10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
Decurge de 10 ori mai ncet (100 de pb/sec) datorit gradului nalt de condensare; Accesul la ADN a proteinelor i enzimelor necesare replicrii este facilitat prin desfacerea cromatinei (etapa limitant de vitez), proces iniiat de metilarea n poziia 5 a citozinelor (sub aciunea ADN-metil transferazei). Exist mai multe origini (aproximativ 100 pentru fiecare cromozom); Mai multe (20-80) origini situate ntr-o anumit zon a cromozomului formeaz o unitate de replicare (replicon); repliconii se activeaz treptat pe parcursul fazei S a ciclului celular;
23

REPLICARE - Eucariote

Mai multe origini Bidirecional

24

12

10/4/2010

REPLICARE - Eucariote

Telomeraza faciliteaz replicarea telomerelor (capetele cromozomilor)

25

Modificri postreplicare = Modificri epigenetice


Metilarea insulelor CpG Se transmite de la o generaie la alta Este specific fiecrui esut Este realizat de metilaze SAM-dependente Vizeaz doar citozinele din secvene 5'-CpG-3 ( 30000 insule CpG 1-2 kb ) Demetilarea insulelor CpG determin expresia genelor asociate

Organism Animale Plante

5'-metil citozina (mC) 2-7% >25%

5'- mC => expresia genei 5'- mC => expresia genei

26

13

10/4/2010

REPLICARE - Inhibiie
Elongarea ADN poate fi blocat prin incorporarea analogilor de nucleotide provenii din analogi de nucleozide (fosforilai de enzimele de salvare ) care conin: 2deoxiriboz modificat: - lipsa OH din pozitia 3
ex. Dideoxiinozina = didanozina = ddI

- nlocuirea OH din poziia 3 cu azido


ex. Azidotimidina = zidovudina = AZT= antiviral

2deoxiriboza nlocuit cu arabinoza (epimer)


ex. citozin arabinozid = citarabina = araC = citostatic adenin arabinozid = vidarabina = araA =antiviral

Analogii de nucleozide ncetinesc multiplicarea ADN-ului celulelor care se divid rapid (canceroase) i a virusurilor!

27

Alterarea ADN- Efectul fumatului

28

14

10/4/2010

Alterarea ADN- Efectul UV

29

REPARARE ADN - Etape

Xeroderma pigmentosum = cancer de piele cauzat de acumalarea mutatiilor datorita 30 absentei excinucleazei UV-specifice

15

10/4/2010

Sinteza de ADN pe matri de ARN

31

Rolul revers transcriptazei n infecia cu retrovirus

32

16

10/3/2010

TRANSCRIERE
Definiie Localizare (timp, spaiu) Factori necesari ARN polimeraza caracteristici Unitate transcripional Etape Procesare transcript primar Inhibitori Control & Reglare. Operonul Lactoza Transcriere la eucariote
1

TRANSCRIERE - Definiie
Transcriere = sinteza de ARN (ncepnd cu captul 5) folosind ca matri lanul
3-5 al ADN care corespunde unei gene (nu se transcrie tot ADN-ul !).

Viteza = 20-50 nucleotide /sec; Frecvena erorilor = 10-4 (1 baz din 104 baze)

10/3/2010

TRANSCRIERE - Scop
Scopul transcrierii = Sinteza moleculelor de ARN necesare traducerii:
- ARNm = matri - ARNt = transportori ai aminoacizilor - ARNr = componente ale ribozomilor La procariote, spre deosebire de eucariote, sinteza proteinelor ncepe nainte de a se finaliza sinteza ARNm!

TRANSCRIERE
Cnd are loc?
- unele gene (constitutive) sunt transcrise constant - unele gene (inductibile/represabile) sunt transcrise la nevoie

Factori necesari ( la procariote)


- Matria = lanul 3-5 al ADN-ului ce corespunde unei gene - Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP - Enzime: ARN polimeraza ADN-dependent, giraza - Proteine: factorul (ro)

10/3/2010

ARN polimeraza - Structura


Holoenzima = factor + miez (2)
Factor de iniiere sigma () -recunoaste promotorul i astfel asigur poziionarea corect a ARN polimerazei pe ADN n vederea iniierii transcrierii

Holoenzima

2 +

Miez = (2) -necesar pentru reconstituirea miezului -leag factorii transcripionali -conine centrul activ polimerazic -confer susceptibilitatea la inhibitori (ex. rifampicina) - conine sarcini pozitive care faciliteaz fixarea enzimei pe ADN (cu sarcini -)
5

Promotor (promoter) - Definiie


= Regiunea recunoscut de subunitatea de tip (sigma) a ARN polimerazei, situat naintea secvenei codificante (poziia -1-70)

10/3/2010

Tipuri de factori sigma din E.coli


Tip 70 32 28 38 54 Promotor recunoscut
Majoritatea genelor Gene induse de ocul termic Gene pentru motilitate i chemotaxie

Secvena consens promotor Regiunea -35


TTGACAT TCTCNCCCTTGAA CTAAA

Regiunea -10
TATAAT CCCCATNTA CCGATAT ? Regiunea -12 TTGCA

Gene pentru faza staionar i ? rspuns la stres Regiunea -24 Gene pentru metabolismul azotului i alte funcii CTGGNA

D.N. Amosti, M.J. Chamberlain, 1989, Pro.NatlAcad Sci USA 86: 830 R. Hengge-Aronsis, 1996, Mol. Microbiol. 21:887
7

Unitate transcripional - Definiie


Unitatea transcripional = fragmentul de ADN care se extinde de la promotor terminator
GENA

Promotor +1 Transcriere ARN Produsul transcrierii = transcript primar

Terminator

10/3/2010

TRANSCRIERE - Etape
INIIERE

ELONGARE TERMINARE

Etapa de INIIERE
Fixarea ARN polimerazei pe regiunea promotor => complex promotor deschis i formarea primei legturi fosfodiester
-40 Promotor ARN pol +20

Secvene nespecifice

-40 ARN pol

+20

Complex promotor nchis

-9

+2
ARN pol

Complex promotor deschis

10

10/3/2010

Etapa de ELONGARE
= Sinteza ARN n direcia 5-3, cu eliberarea factorului

11

Etapa de ELONGARE (continuare)


Pe msur ce ARN polimeraza nainteaz pe matria de ADN i catalizeaz formarea de noi legturi fosfodiester se formeaz un helix hibrid ADN-ARN scurt;

Concomitent are loc:


un proces de rersucire (rewinding) a dublului helix de ADN, n urma polimerazei un proces de desrsucire (unwinding) a dublului helix de ADN, n faa polimerazei

12

10/3/2010

Etapa de TERMINARE
Eliberarea ARN sintetizat i a ARN polimerazei
Independent de factorul
semnalizat de formarea structurii n agraf (rezultat al transcrierii palindromului din terminator) care ncetinete deplasarea ARN Polimerazei.

Dup structura n agraf, transcriptul conine o secven UUUUU care faciliteaz eliberarea ARN din hibridul ADN-ARN
13

Etapa de TERMINARE (continuare)


Dependent de factorul (ro) care se leag de secvene bogate n C de lng captul 3 al ARN nou sintetizat i migreaz n spatele ARN polimerazei, n direcia 5-3, pn cnd ajunge n regiunea terminator

14

10/3/2010

Procesare transcript primar


Transcript primar = copia liniar a unitii transcripionale (fragmentul de ADN cuprins ntre secvenele de iniiere i terminare). La procariote (spre deosebire de eucariote), ARNm este identic cu transcriptul primar, care posed la extremiti 2 secvene suplimentare (leader & trailer) care nu se vor exprima n protein. +1 5 Secvena conductoare leader Secvena care va fi tradus Gena ADN 3 Secvena remorc trailer

Transcript primar ARNm


15

Procesare transcript primar


Att la procariote ct i la eucariote transcriptul primar al ARNr i ARNt sufer modificri post-transcripionale catalizate de ribonucleaze (excizia unor fragmente).

ARNt sufer modificari suplimentare (=> nucleotidele minore) care confer identitate fiecrui tip de ARNt.

Trancript primar (45S) din care se formeaz toate tipurile de ARN cu excepia ARNm

16

10/3/2010

Inhibitori ai transcrierii
Inhibitori care se inser ntre 2 perechi GC ale ADN => blocheaz elongarea Ex. actinomicina D (dactinomicina) Inhibitori care inhib giraza => mpiedic naintarea ARN polimerazei Ex. acidul nalidixic, norfloxacina Inhibitori care se leag de ARN polimeraz, inhibnd elongarea

Ex. rifampicina (rifampin)


Analogi ai ribonucleotidelor (inhib elongarea) Ex. 3-deoxiadenozina (cordicepina)

17

CONTROLUL TRANSCRIERII
Controlul transcrierii se realizeaz, la nivelul etapei de iniiere, modificnd afinitatea ARN polimerazei pentru promotor prin:
schimbarea tipului de subunitate sigma modificarea miezului polimerazei (ex. ataarea ppGpp) intermediul proteinelor activator (ex. CAP) sau represor

18

10/3/2010

REGLAREA TRANSCRIERII
La bacterii genele structurale care codific enzime implicate n aceai cale metabolic sunt adiacente i mpreun cu unicul promotor formeaz un operon. => Prin transcrierea genelor structurale se formeaz un singur ARNm policistronic. Transcrierea genelor structurale este reglat de gena reglatoare care codific proteina represor.

19

REGLAREA TRANSCRIERII (continuare)

Prin exprimarea genei reglatoare => represorul inactiv. Ca urmare a legrii corepresorului => un complex activ care se leag de operator (secven specific din promotor), i blocheaz accesul ARN polimerazei la promotor. 20

10

10/3/2010

OPERONUL LACTOZA (Lac)

21

Reglarea operonului Lac

Allolactoza (izomer al lactozei)

n prezena glucozei => adenilat ciclaza inactiv => nivel sczut AMPc => nu se formeaz complexul CAP-AMPc necesar pentru accesul i legarea ARN polimerazei la promotor. n prezena lactozei, se formeaz allolactoza (cantitate mic) care se leag specific de represor i, prin modificri conformaionale, determin desprinderea represorului de pe operator, fapt care 22 nu este suficient pentru iniierea transcrierii genelor structurale!

11

10/3/2010

Reglarea operonului Lac

n absenta glucozei adenilat ciclaza este activ => nivel ridicat AMPc (hunger signal) => se formeaz complexul CAP-AMPc apt s se lege de locusul specific din promotor => este facilitat accesul ARN polimerazei la promotor. n prezena lactozei operatorul este liber i ARN polimeraza poate transcrie genele structurale permind bacteriei s utilizeze lactoza ca surs de energie C. Dac este prezent doar glucoza => AMPc => complexul CAP-AMPc este absent 23 => ARN polimeraza nu se leag de promotor i genele nu sunt sunt transcrise, indiferent dac operatorul este ocupat de represor!

Reglarea operonului lactoza - Recapitulare

24

12

10/3/2010

Transcrierea la eucariote
Mai complex dect la procariote
Exist polimeraze diferite pentru sinteza fiecrui tip de ARN:

- Polimeraza I pentru ARNr 45S (n nucleoli)


- Polimeraza II pentru ARNm (n nucleoplasm) - Polimeraza III pentru ARNt i ARNr 5S (n nucleoplasm) - Polimeraza mitocondrial pentru ARN-urile mitocondriale (matrice)

Fiecare din cele 4 tipuri de polimeraze utilizeaz promotori diferii ARN polimeraza II utilizeaz o diversitate de promotori care conin secvene consens: - caseta TATA (poziia -32) reprezentnd semnalul unde ncepe transcrierea
- casetele CAAT i GC (n amonte fa de +1) reprezentnd semnalul cnd ncepe transcrierea

Pe lng secvenele consens (recunoscute de factorii de iniiere) exist - secvene situate la distan de promotori (n amonte sau n aval de punctul de start) care mresc (enhancer) sau reduc (silencer) viteza de iniiere a transcrierii ca urmare a interaciunii cu factorii de transcriere - elemente de rspuns la hormoni liposolubili
Elemente de rspuns Enhancer & silencer Caseta CAAT Caseta TATA Gena structural

Expresie reglabil

Expresie bazal
25

Inhibitori ai transcrierii la eucariote


ARN polimerazele animale (mai ales polimeraza II) sunt inhibate de amanitin, produs de ciuperca otrvitoare Amanita phalloides

26

13

10/3/2010

Sinteza ARN pe matri de ARN


Unele virusuri au ca material cromozomial ARN care se replic n celula gazd sub aciunea ARN polimerazei ARN dependente (replicaza) sintetizat n organismul gazd. Dup infecie se sintetizeaz, pe matria de ARN (+), o replic complementar (-) rezultnd un duplex ARN. Catena ARN (-) va servi ca matri pentru sinteza a numeroase catene complementare (+). ARN-ul viral va funciona ca ARNm pentru sinteza proteinelor virale
+ +-----

ARN viral

Duplex ARN

Molecule fiice omoloage ARN viral


27

14

TRADUCERE
Definiie Cod genetic Factori necesari Etape Inhibitori Reglare Modificri post-traducere
1

TRADUCERE - Definiie
Traducere = sinteza unui lan polipeptidic, la nivel ribozomal, folosind ca matri ARNm citit n direcia 5-3

TRADUCERE - Factori necesari (la procariote)


Factori necesari
Matri: ARNm policistronic (citit n direcia 53) 20 Aminoacizi standard ARNt specific fiecrui Aa (>20) 20 Aminoacil-ARNt sintetaze Subuniti ribozomale: 30S, 50S Factori de iniiere:IF1, IF2, IF3 Factori de elongare: EF-Ts, EF-Tu, EF-G (translocaza) Factori de terminare (eliberare): RF1, RF2, RF3 (RRF) Surs de energie: GTP + Mg2+ Enzime: Met-ARNt formilaza, peptidil transferaza (localizat pe 50S) Donor grupare formil: acidul N10-formil tetrahidrofolic (N10-CHO-H4F)
3

TRADUCERE Caracteristici procariote


Traducerea nsoete transcrierea O molecul de ARNm este tradus simultan de mai muli ribozomi situai la o distan de 100 nucleotide (polizom) => mai multe lanuri polipeptidice

Viteza: 20-40 amino acizi/sec Este consumatoare de energie: 1GTP pentru iniiere, 2GTP pentru fiecare leg. peptidic

CODUL GENETIC - Caracteristici


Permite traducerea unui text scris ntr-o limb care utilizeaz 4 cuvinte: bazele A, G, C, U ntr-o limb care utilizeaz 20 cuvinte: cei 20 Aa standard Rezult prin combinarea celor 4 baze grupate cte 3 => 64 codoni Este universal, degenerat dar nu i ambiguu!

Khorana & Nirenberg

Citirea codonilor
Codonii se citesc ncepnd cu codonul de iniiere AUG, fr semne de punctuaie, pn la unul dintre codonii STOP (nonsens): UAA, UAG, UGA

Etapa de INIIERE
Etapa de initiere presupune:
Sinteza aminoacil-ARNt Formarea complexului de iniiere 30S Formarea complexului 70S

Etapa de INIIERE
Sinteza aminoacil-ARNt
La procariote Met-ARNtfmet este convertit n formil-Met-ARNtfmet sub aciunea transformilazei (donor formil-H4F)!

Etapa de INIIERE
Formarea complexului de iniiere 30S si apoi a complexului 70S Pe locusul Peptidil (P) se gsete formil-metionil-ARNt (fMet-ARNt) Locusul Aminoacil (A) este liber

Complexul 70S

Complexul de initiere 30S

Etapa de ELONGARE
Inseria

Aminoacil-ARNt urmtor (AA2-ARNt) pe locusul

Aminoacil (A) Formarea legturii peptidice

10

Etapa de ELONGARE
Inseria Aminoacil-ARNt urmtor (AA2-ARNt) pe locusul Aminoacil (A)
Hidroliza GTP asociat factorului de elongare Tu consfinete legarea corect a AA2-ARNt

Tu-GDP Tu-GTP prin intervenia factorului Ts


11

Etapa de ELONGARE
Formarea legaturii peptidice
Sub aciunea peptidil transferazei (din subunitatea 50S) se transfer fMet pe gruparea NH2 a aminoacil-ARNt2

Translocaza (EF-G) determin glisarea (cu un codon) a ribozomului spre captul 3 a ARNm Simultan ARNt-ul descrcat prsete locusul P

12

Etapa de ELONGARE

13

Etapa de TERMINARE
Recunoaterea codonului STOP (UAG) de ctre unul dintre factorii de eliberare (RF)

Hidroliza legturii ester catalizat de peptidil transferaza transformat de RF n hidrolaz

Eliberarea ARNt descrcat urmat de disocierea ribozomului

14

Diferene procariote-eucariote
Eucariote
Fixarea ARNm la subunitatea ribozomal mic
Captul 5 (CAP) al ARNm leag factorii eIF i subunitatea 40S care conine Met-ARNtmet; ARNm este scanat pentru gsirea codonului START Metionina >12 eIF 80S (40S + 60S)

Procariote
Secvena Shine-Dalgarno situat n amonte de codonul AUG se leag prin legturi de H de o secven complementar din ARNr 16S Formil-Metionina 3 IF 70S (30S + 50S)

Primul amino acid Factorii de iniiere Ribozomi

15

Traducere - Inhibitori
Puromicina blocheaz elongarea substituindu-se unui aminoacil-ARNt
Analog structural al extremitii 3 a tirozil-ARNt

Efectele altor medicamente:


tetraciclina mpiedic inseria aminoacil-ARNt pe locusul A
cloramfenicolul inhib peptidil transferaza eritromicina inhib translocarea

16

Modificri post traducere


ndeprtarea gruprii formil a fMet terminale (procariote)
ndeprtarea Met sau a unor fragmente peptidice Acetilare ADP-ribozilare Carboxilare Acilare cu acizi grai Glicozilare

Hidroxilare
Metilare Fosforilare S-farnezilare (ex. oncoproteine)
17

Sinteza proteinelor membranare & secretate


ncepe cu sinteza peptidei semnal Peptida semnal este recunoscut de SRP (signal recognition particle)=> este sistat temporar sinteza proteinei SRP este legat de receptorul specific de pe membrana reticulului endoplasmic Peptida semnal ptrunde n lumenul reticulului prin porul nvecinat receptorului i este clivat de semnal peptidaz Continu sinteza proteinei

18