Actividad enzimtica de peroxidasas vegetales

Pre Lab http://www.doschivos.com/display.asp?ID=132&f=13547 Antecedentes Una enzima es un catalizador biolgico que lleva a cabo reacciones bioqumicas a muy altas velocidades y con un elevado grado de especificidad; en su ausencia, la mayora de las transformaciones qumicas requeridas para mantener activas las clulas tardaran mucho tiempo en efectuarse o simplemente no procederan. (Baudi 1999) Se conocen ms de 2000 enzimas, de las cuales muchas han sido aisladas, purificadas y cristalizadas, su estructura qumica es de carcter protenico globular. Su espeficidad de catlisis es nica pues es mucho mayor que la de la gran mayora de otros compuestos orgnicos e inorgnicos que se emplean en los distintos procesos industriales. Algunas de las enzimas tienen la capacidad de transformar ms de un milln de molculas de sustrato, por segundo, por molcula de enzima. Las enzimas slo aceleran la velocidad de reaccin que termodinmicamente son posibles. (Baudi 1999) Todas las enzimas son protenas, tienen una estructura tridimensional globular, estn formadas generalmente por una sola cadena peptdica, y slo logran ser activadas cuando los polmeros desarrollan una conformacin que permite establecer su centro activo. En muchos casos estn integradas por una parte protenica y otra que no lo es. La parte protenica se conoce como apoenzima y la segunda como cofactor. ste ltimo es un compuesto de bajo peso molecular, estable al calor, que presenta varios grados de unin con la apoenzima. Los principales cofactores son vitaminas, los cationes, los aniones y otras sustancias orgnicas. (Baudi 1999) Las enzimas son especficas al sustrato con el que puede interactuar. El sustrato debe reunir ciertas caractersticas para que pueda ser utilizado como tal. La especificidad puede ser estereoqumica (ismeros L o D como ustratos), baja especificidad (atacan un determinado enlace qumico), especificidad de grupo (un enlace y grupo qumico especfico al lado de ste) y especificidad absoluta (una sola sustancia). (Baudi 1999) En general las enzimas, se han nombrado de una forma poco sistemtica. Entonces se juntaban varias enzimas que actuaban sobre la misma sustancia con el mismo nombre. Por esto, la comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica desarroll un mtodo que identifica las enzimas con 4 dgitos. El primero se refiere a qu grupo pertenecen. (Baudi 1999) 1. xido-reductasas ( Reacciones de oxido-reduccin). Si una molcula se reduce, tiene que haber otra que se oxide 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcionales) Grupos aldehdos, acilos, glucsidos y fosfatos

3. Hidrolasas (Reacciones de hidrlisis) Transforman polmeros en monmeros. Actan sobre enlaces ster, glucosdico, peptdico y enlace C-N 4. Liasas (Adicin a los dobles enlaces) Entre C=O, C=C y C=N

5. Isomerasas (Reacciones de isomerizacin)

6. Ligasas (Formacin de enlaces, con aporte de ATP) Entre C-C, C-S, CN, C-C (Ruana 1998) El proceso de blanqueado en agua caliente ayuda a inactivar los sistemas de enzimas que descomponen las frutas y vegetales. Las peroxidasas deterioran el sabor de los vegetales en almacenamiento. Adems se usan como un ndice de tratamientos de blanqueado o de otros tratamientos de calor porque es muy resistente a la inactivacin trmica. Si la peroxidasa se destruye, se asume que ningn otro sistema enzimtico sobrevive. Existe relacin entre la actividad de peroxidasa y la produccin se sabor. (Reed 1975) Las peroxidasas son enzimas que catalizan la siguiente reaccin:

La reaccin importante de las peroxidasas es la anterior, sin embargo existen tres tipos de reacciones en las que puede intervenir: reacciones peroxidativas, oxidativas e hidroxilativas. Para la reaccin peroxidativa se requiere de un perxido orgnico o de agua. El nmero de compuestos que pueden ser aceptores de hidrgenos para algunas peroxidasas es pequeo. Los compuestos donadores de hidrgenos pueden ser fenoles, aminas u otros compuestos orgnicos. El mecanismo de la reaccin se basa en la formacin de complejos de enzima-donador de hidrgenos y dos pasos de oxidacin univalente. (Reed 1975) Hay tres clases de peroxidasas: Ferriprotoporfirina peroxidasa: color caf e incluyen peoxidasas de plantas grandes, animales y microorganismos. Todas estas peroxidasas contienen ferriprotoporfirina III como grupo prosttico. Las verdoperoxidasas de la leche, lactoperosidasa. El grupo prostetico de esta enzima es un ncleo de hierro de porfirina que no es ferriprotoferrina III. (Reed 1975)

 Las peroxidasas de flavoprotenas se han purificado de estreptococos y de algunos tejidos animales. El grupo prosttico es el FAD. (Reed 1975) La peroxidasa ms estudiada es la derivada del rbano picante Justificaciones Las hojas se trituran para extraer de ellas los lquidos vasculares. El buffer de fosfato se usa para extraer las enzimas en pH estable ya que como son protenas globulares son sensibles a los pH extremos. Esta solucin se homogeniza para que se pueda extraer todo el lquido de las hojas posible. Sin embargo, para los pasos posteriores en la prctica los residuos de hojas son una interferencia en los resultados y observaciones por lo tanto se separan del lquido donde estn disueltas las enzimas por centrifugacin. Las diferentes concentraciones entre el extracto y el perxido de hidrgeno modifica tambin la velocidad de reaccin. En un mismo volumen de solucin las variaciones entre los volmenes agregados modifica tambin la cantidad de sustrato que reaccione y resulte en producto. De los 4 tubos que se usan en la comprobacin de la esencialidad de los componentes, en parejas tienen pequeos cambios entre unos reactivos y otros lo que permite la comparacin de la reaccin y el efecto de las diferentes concentraciones de sustratos. La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente est determinada por las concentraciones de enzima y sustrato. La absorbancia a 470nm es un indicador del estado de la reaccin y su velocidad al medirse en 3 minutos cada 30segundos. Luego de modificar la estructura tridimensional de una enzima, sta no puede realizar su funcin fisiolgica ni catalizar reacciones. El pH de una solucin puede cambiar la estructura de la protena cambiando sus interacciones al protonar o desprotonar grupos R de las cadenas laterales de los aminocidos. El efecto en la estructura de las enzimas del cido tricloroactico y del sulfato de amonio se comparar, ya que aunque ambos son cidos dbiles, el amonio es un cido mucho ms dbil. Hay protena que precipita y es necesario determinar si la enzima peroxidasa est en el sobrenadante o en el precipitado. Bibliografa http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html Lourdes Luengo (1998) Badui S. QUMICA DE LOS ALIMENTOS. 3 ed. 5 reimpresin. Editorial Alambra Mexicana. Mxico (1999)648pp. Reed, G. ENZYMES IN FOOD PROCESSING. 2 ed. Academic Press. Inglaterra (1975) 573p.p. Post Lab

Enzimas: actividad enzimtica de peroxidasas en hojas de naranjo

Resumen En esta prctica se extrajo un extracto enzimtico macerando las hojas en buffer de fosfato y centrifugndolo. Este extracto se diluy en 1/3 y 1/6. Se realiz una prueba para comprobar la esencialidad de los componentes, es decir que en varios tubos se pusieron tampn fosfato, perxido de hidrgeno, guayacol y extracto 1/3 en diferentes proporciones donde en los primeros tres haca falta un componente. En el cuarto tubo, se observ reaccin porque all estaban presentes todos los componentes. Luego se comprob la linearidad de la actividad enzimtica de acuerdo a la concentracin tomando la absorbancia a 470nm cada 30 segundos por 3 minutos por cada tubo de ensayo donde la concentracin del extracto aumentaba 0.1mL y la concentracin de la enzima disminua 0.1mL manteniendo constante el volumen. Luego se observ el efecto de agentes precipitantes (sulfato de diamonio y cido tricloroactico) en la actividad enzimtica.

Resultados y Observaciones Tabla 1 Esencialidad de los componentes Tubo 1 2 3 4 Prueba +

Tabla 2 Linealidad entre actividad enzimtica y concentracin Tiempo (min) 0.5s 0 1 1 2 2 3 Tubo 1 ( 0.0005nm) 0.002 0.003 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010 Tubo 2 ( 0.0005nm) 0.007 0.012 0.016 0.021 0.025 0.026 0.026 Tubo 3 ( 0.0005nm) 0.024 0.043 0.057 0.067 0.078 0.081 0.087 Tubo 4 ( 0.0005nm) 0.037 0.073 0.092 0.110 0.118 0.125 0.128

Grfica 1

Grfica 2

Grfica 3

Grfica 4

Tabla 3 Efecto de agentes precipitantes ATC Sob Sed Discusin de Resultados Para que una reaccin enzimtica se lleve a cabo es indispensable la presencia del sustrato, la enzima y dependiendo del caso, del cofactor. Sin embargo en la prueba de la esencialidad de los componentes para la reaccin, el tubo 2 no mostr cambio a pesar de que estaban presentes el sustrato y la enzima. Lo que ocurre en esta reaccin es que el perxido de hidrgeno se convierte en agua y oxgeno. Aunque el Guayacol no interviene directamente en esta reaccin es importante para atrapar ese oxgeno que se libera, lo cual promueve el equilibrio de la reaccin hacia la formacin de productos. Adems al estar en presencia de oxgeno, el Guayacol reacciona y da una quinona que se le puede leer la absorbancia. En los tubos 1 y 3, haca falta o el sustrato o la enzima y de esta manera no hay reaccin. En el tubo 4, estaban todos los componentes presentes y a pesar de eso el color producido fue muy suave. Puede ser que la concentracin de enzima en el extracto fuera muy bajo. La velocidad de una reaccin enzimtica depende de varios factores. Entre stos est el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad enzimtica es ptima. Fuera de este rango la enzima por ser una protena empieza a desnaturalizarse por la protonacin o desprotonacin de sus aminocidos constituyentes. En la maceracin para la obtencin del extracto y para todas las pruebas de us el buffer fosfato para mantener el pH dentro del rango ptimo de la fosfatasa. SA

La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimtica. Se puede decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la reaccin hasta que llega un punto en el que la velocidad disminuye con el aumento en el calor. No vale la pena discutir acerca de la influencia del calor en la reaccin enzimtica realizada en el laboratorio ya que todas las pruebas se realizaron a temperatura ambiente, a una temperatura constante. Otro factor fundamental en la velocidad a la que se realiza una reaccin es la concentracin de enzima y de sustrato. Esto se sabe tericamente debido a que todas las reacciones cumplen con la reaccin de Michaelis-Menten, donde si la concentracin de sustrato o de enzima es muy baja, la velocidad aumenta proporcionalmente al aumento de concentracin. En la determinacin de la linearidad de la velocidad de acuerdo a la concentracin de enzima, la concentracin de perxido de hidrgeno era constante en todos los tubos y lo que cambiaba era la concentracin de enzima. En esta determinacin se us el extracto bien diluido 1/6 ya que como se iba a medir la absorbancia si estaba muy concentrado sta no se iba a poder medir. En las grficas y en la tabla 4 se puede ver cmo al aumentar la concentracin de enzima, la absorbancia aumenta. Si se toma como referencia cuando haban transcurrido 30 segundos de la reaccin, se puede ver que la absorbancia de todos los tubos va aumentado del 1 al 4 de la misma manera en la que aumenta la enzima. Conforme transcurre el tiempo se puede ver que la absorbancia aumenta, esto se debe a que la concentracin del guayacol que ha reaccionado con el oxgeno aumenta. Conclusiones El buffer de fosfato mantiene el pH en el rango ptimo de reaccin de la enzima, el perxido de hidrgeno es el sustrato, el extracto contiene la enzima y el guayacol forma un complejo colorido, por lo que todos los componentes son necesarios para la reaccin. A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reaccin aumenta conforme aumente la concentracin de la enzima. Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimtica por desnaturalizacin de la enzima.