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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE BIOTECNOLOGIA BIOLOGIA CELULAR

MORTE CELULAR
LEIDI D. PREICHARDT LIANA MACIEL MARTA E. DOUMER VANESSA GALLI

MORTE CELULAR

Interesse cientfico ltimos anos; Morte celular programada Apoptose

Classicamente 2 processos

Necrose

MORTE CELULAR

Mais recentemente ...


Apoptose Parapoptose, Autofagia, Mitose catastrfica Necrose

Estmulos e tipo de morte celular Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

A morte celular pode acontecer:

MORTE CELULAR

Em situaes fisiolgicas (Relgio Gentico)


Embriognese; Processos de metamorfose; Regulao do desenvolvimento e renovao celular

Em situaes patolgicas
Injria severa como Hipxia.

MORTE CELULAR

Sydney Brenner Prmio Nobel de Medicina e Fisiologia (2002) Estudos com Caenorhabtis elegans para entendimento do controle da morte celular

Caenorhabtis elegans modelo para estudo de morte celular

MORTE CELULAR

Apoptose
Remoo de clulas ou tecidos alterados, exercendo importante papel na manuteno da estrutura do rgo ou dos tecidos impedindo que suas funes fossem alteradas por fatores externos. Oposto de Mitose. Induo radiaes; drogas; choque trmico; metais pesados; agentes oxidantes; alcois; hipxia; jejum; inibidores metablicos; infeces vricas.

MORTE CELULAR

Apoptose
Clivagem do DNA por endonucleases

O mecanismo bioqumico fundamental da apoptose conservado ao longo da escala evolutiva, havendo genes homlogos regulando a morte celular em todos os organismos estudados, embora, nos mamferos, seja um processo mais complexo

Necrose

MORTE CELULAR

Falha nas respostas adaptativas genticas e metablicas (morte acidental). Alguns autores denominam oncose (do grego nkos: intumescimento) por considerarem o termo necrose seria melhor indicado para se referir a alteraes subsequentes morte celular propriamente dita Induo injrias severas hipertemia; privao de nutrientes; estresse oxidativo; sobrecarga intracelular de Ca2+

hipxia; altas concentraes de substncias txicas

MORTE CELULAR

Apoptose x Necrose

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Parapoptose
Forma ativa e regulada de morte celular; Apresenta inchamento mitocondrial e formao de vacolos citoplasmticos.

Autofagia
Morte celular ativa e regulada, caracterizada pela lenta degradao do citoplasma e organelas por autofagossomos, vacolos originrios do retculo endoplasmtico. observada em privao crnica de nutrientes e em algumas doenas neurodegenerativas

MORTE CELULAR

Distino das diferentes alteraes morfolgicas nos processos de morte celular por apoptose versus necrose. A necrose (a) caracterizada pela perda de integridade de membrana plasmtica, floculao da cromatina, inchao seguido de lise celular com extravasamento do contedo intracelular e desintegrao de organelas. O processo apopttico (b) envolve alterao de permeabilidade de membranas, condensao cromatnica, encolhimento celular, formao de corpos apoptticos sem desintegrao de organelas.

Apoptose
Formao de vacolos citoplasmticos

MORTE CELULAR

Permite reciclagem dos componentes orgnicos

Encolhimento e diminuio do Contato

Fagocitose por clula vizinha e macrfago

Colapso citoesqueleto

Superfcie celular alterada

Fragmentao M. nuclear Fragmentao Do DNA

Despolarizao M. mitocondrial

MORTE CELULAR

Maquinaria intracelular responsvel pela apoptose

aparentemente semelhante em todas as clulas animais Dependente de uma famlia de proteases que apresenta uma cistena no stio ativo clivando protenas-alvo em cido asprtico especfico.

CASPASES

MORTE CELULAR

As caspases so sintetizadas na clula com um precursor inativo, ou procaspases, que so ativados pela clivagem do cido asprtico por outras caspases.

Uma vez ativadas as caspases clivam e ativam outras procaspases, formando uma cascata de amplificao proteoltica.

Algumas clivam a lmina nuclear, outras uma protena que mantm a enzima degradadora do DNA ( DNAse) inativa, liberando-a para digerir o DNA.

A clula se desmancha de forma rpida e ordenada, sendo rapidamente digerida por outras clulas

MORTE CELULAR

Procaspases so ativadas por ligaes a Protenas Adaptadoras

Todas as clulas animais nucleadas contm as procaspases inativas, que ficam aguardando sinais para iniciar a destruio da clula.

A atividade das caspases especificamente regulada na clula para garantir que a morte celular esteja controlada at que seja necessria

Como so ativadas as procaspases para iniciar a cascata da caspase??

MORTE CELULAR

A ativao feita por protenas adaptadoras;

Mltiplas cpias de procaspases iniciadoras se unen em um complexo;

Quando foradas a entrar no complexo, sua proximidade faz com que uma clive a outra.

MTUA ATIVAO

MORTE CELULAR

H casos em que a agregao gera uma mudana conformacional, ativando as procaspases.

A caspase ativada no topo da cascata cliva a prxima procaspase para estimular o sinal de morte que estende-se para toda clula

MORTE CELULAR

Ativao da Apoptose por via extrnseca


Ocorre pela ativao de receptores da morte na superfcie da clula.

Linfcitos assassinos podem induzir apoptose produzindo a protena ligante Fas.

Ligante Fas

Receptor da morte

Superfcie Clula-alvo

MORTE CELULAR

Agrupamento protena Fas

Apoptose

Recruta adaptadores prot. intracelulares

Ativam as prximas procaspases

Ligam e agregam procaspases-8

Caspase-8 ativada

Clivam e ativam uma outra

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Quando as clulas esto estressadas ou danificadas podem matar a si prprias desencadeando a agregao das procaspases e a ativao dentro da clula.

Via intrnseca

MORTE CELULAR

Mitocndrias Cliva e desencadeia a cascata Liberam Citocromo c

Apaf-1 liga e agrega Citosol Procaspase 9

Liga e ativa Apaf-1

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Principais Reguladoras Intracelulares do Programa de Morte Celular

Protenas da Famlia Bcl-2

Protenas IAP

MORTE CELULAR

Famlia Bcl-2

So

protenas

intracelulares

que

regulam

ativao

das

procaspases.

Bcl-2 ou a Bcl-XL inibem a apoptose, bloqueando a liberao do Citocromo c da mitocndria.

Alguns membros da Bcl-2 no so inibidores da morte, mas sim ativadores das procaspases e a consequente morte celular.

MORTE CELULAR

Algumas protenas da famlia, promotoras da apoptose como a Bad funcionam por ligao e inativao dos inibidores da morte.

Bax e a Bak estimulam a liberao do citocromo c.

Se os genes que codificam Bax e Bak so inativados as clulas so resistentes a estmulos indutores da apoptose.

Bax e Bak podem ser ativadas por outros promotores da famlia Bcl2 como a Bid

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Famlia IAP
So protenas inibidoras da apoptose.

Inibem a apoptose por duas vias:

se ligam a algumas procaspases para evitar sua ativao

ligam-se as caspases inibindo sua atividade

MORTE CELULAR

O programa de morte celular intracelular regulado por sinais extracelulares que podem ativar ou inibir a apoptose.

Estes sinais moleculares atuam regulando os nveis ou atividade dos membros das famlias Bcl-2 e IAP.

Identificao da morte celular

MORTE CELULAR

Morfologia Apoptose Mudana no aspecto morfolgico clula Perda da integridade celular: Condensao e segregao da cromatina

MORTE CELULAR

Invaginao das membranas celular e nuclear Ruptura do ncleo Corpos apoptticos_circundados por envoltrio nuclear

MORTE CELULAR

Necrose
Aumento do volume total da clula e organelas Autlise:

Dissoluo das membranas Ruptura da clula Liberao de seus subprodutos

MORTE CELULAR

Estmulo a uma inflamao

O ncleo sofre desorganizao da cromatina, intumescimento e exibe estruturas vacuolizadas

MORTE CELULAR

Aspectos morfolgicos

Quadro esquemtico das alteraes morfolgicas com a apoptose (a) e a necrose (b) Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoqumica e imunocitoqumica
Reao de Feulgen: corante reativo de Schiff

Quantificao do DNA

Exibe morfologia de compactaes e descompactaes cromatnicas

MORTE CELULAR

Clulas em apoptose coradas podem ser estudadas em vdeo analisador Contracoradas com Fast Green indica presena e quantificao de microncleos

MORTE CELULAR

Aspectos genticos e bioqumicos


Clulas gigantes com ncleos de diferentes tamanhos originados por processo de mitose catastrfica (MC), presentes em culturas de clulas MCF-10. a) Reao de Feulgen e contracolorao com fast green. b) Mtodo de impregnao por prata. Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoqumica e imunocitoqumica

Reao de Felgen

Imagens de apoptose (A) em clulas epiteliais mamrias humanas e em culturas submetidas reao de Feulgen e contracoradas com fast green Fonte: Carvalho e ReccoPimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoqumica e imunocitoqumica

Reao de Felgen
Aspectos morfolgicos e citoqumicos de ncleos de clulas em apoptose (A) e necrose (N), cujo DNA identificado pela reaao de Feulgen. a) Clulas epiteliais de hemptero triatomneo em que se detectam imagens de clulas em necrose, alm de ncleos com aspecto normal usual (U); b) Clulas epiteliais mamrias humanas in vitro. Imagem de perfil absorciomtrico ao longo de um eixo traado sobre ncleo apopttico estudado em vdeoanalisador de imagem. Regies de cromatina condensada aparecem pseudcolonizadas em vermelho. Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Concentrao crtica de eletrlitos (CEC)


Identificao de nuclolos Clulas so coradas com azul de toluidina a pH 4,0 Tratamento com MgCl2 em baixa molaridade

MORTE CELULAR

DNA perde sua metacromasia: Cor violeta verde Concentrao Mg 2+ em molaridade

Ponto ou valor de CEC

MORTE CELULAR

RNA permanece em metacromasia CEC ocorre numa concentrao superior do DNA DNA com cromatina compactada

verde intenso

MORTE CELULAR

Identificao imunocitoqumica
Kits Identificam-se:

ncleos vesculas
fragmentao do DNA internucleossomal

MORTE CELULAR

Princpio
Resduos de nucleotdeos, ligados digoxigenitina, sero ligados ao DNA da clula apopttica por uma enzima, a TdT ( terminal deoxynucleotidyl transferase) Heteropolissacardeo, reconhecido pelo anticorpo anti-digoxigenina

MORTE CELULAR

O anticorpo traz ligado a si uma peroxidase, revelado pelo procedimento citoqumico

MORTE CELULAR

Citoqumica e imunocitoqumica de eletrlitos (CEC)

Concentrao crtica

Aspectos citoqumicos e imunocitoquimicos de apoptose e morte celular programada. a,b. Apoptose em clulas V79, submetidas ao mtodo CEC. (a) e a um mtodo imunocitoqumico para apoptose (b) (setas). c, d. Clulas epiteliais mamrias humanas in vitro em apoptose (setas), identificadas pelo mtodo CEC. e. Morte celular programada (setas) identificada em eritrcitos nucleados de tartaruga por mtodo imunoqumico. Fonte: Carvalho e ReccoPimentel (2007)

MORTE CELULAR

Teste TUNEL
Nucleotdeos iro se ligar as extremidades 3-OH do DNA fragmentado pela ao da TdT. Acham-se marcados com fluorescena:

Microscpio de fluorescncia

MORTE CELULAR

Tratado com anticorpos anti-fluorescena conjugados com peroxidase

Microscpio de luz comum

MORTE CELULAR

Teste Annexin V

Identificao por fluorescncia clulas nas fases iniciais da apoptose Grupamentos de fosfatidilserina so translocados da parte interna para a parte externa da membrana plasmtica meio extracelular

MORTE CELULAR

Protena anexina v tem alta afinidade pelas fosfatidilserinas

identifica externalizao promovida por apoptose

MORTE CELULAR

H testes imunocitoqumicos que identificam membros da famlia Bcl-2 e caspases especficas

MORTE CELULAR

Identificao em nvel bioqumico


Apoptose: DNA nuclear clulas em apoptose eletroforese em gel de agarose

Padro tpico de bandas com segmentos de 185 pares de bases e de seus mltiplos

MORTE CELULAR

Necrose

Fragmentao do DNA ao acaso

padro eletrofortico exibido: arrasto

MORTE CELULAR

Teste Cometa
Clulas em agarose e com protenas removida campo eltrico

Padro de habilidade de migrao do DNA (cauda)

Identificao da necrose ou apoptose

MORTE CELULAR

Citoqumica e imunocitoqumica bioqumico

Identificao em nvel

Imagens de eritrcitos de serpentes submetidos ao teste cometa. a. Controle. b. Apoptose. c. Necrose (experimental) Fonte: Carvalho Pimentel (2007) e Recco-

APOPTOSE
Estmulo externo
- Citocinas - Estresse oxidativo

MORTE CELULAR

Estmulo interno
Bcl-2 - mitocndria
- Ca - pH - leso do DNA (via gene p53)

TNF (Fas)
Antagnicos

Caspase-8, 10

Citocromo c Apaf-1

Caspase-3 1

Caspase-9

Caspases executoras

Apoptose
1- substrato especfico

MORTE CELULAR

Caspases
Caspases executoras:
clivagem de quinases protenas do citoesqueleto protenas de reparo do DNA subunidades inibidoras de endonucleases destruio das funes celulares housekeeping afetam regulao do ciclo celular e rotas de sinalizao manifestaes morfolgicas de apoptose condensao e fragmentao do DNA e rompimento de membranas

MORTE CELULAR

Fagocitose das clulas apoptticas

Phagocyte ?
PS Phosphatidylserine Receptors

Scavenger Receptors Oxidized LDL-like Site

C1q Binding Site C1q

Apoptotic Cell

Bridge ELMO

RAC-1 DOCK 180

C1q Receptor

Cytoskeletal Reorganization for Engulfment

CRKII

MORTE CELULAR

Cncer X Apoptose
Cncer Mutaes Ciclo Celular Oncogenes Seleo Natural Apoptose Supressores de Tumor

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Pr-apoptticos

Anti-apoptticos

Cncer e doena autoimune

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

CANCER X APOPTOSE
c-Myc superexpresso + p53 ou ARF ou ganho de funo de genes Bcl-2 = apoptose

MORTE CELULAR

CANCER X APOPTOSE
Cncer de mama: BRCA1 e BRCA2 se ligam a Rad51 para reparar quebras na fita de DNA p53 E1B codifica dois produtos, um que ativa Bcl-2 e outro que inibe p53 Sistema Ubiquitin/Proteosome P53 ativa Bax inibio da apoptose

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

NF-B induz processo inflamatrio pr-tumorignico

Autofagia

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Teraputica
ABT-737 - inibe Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w de clulas cancergenas Estratgias antisense e com molculas antagonistas para inibir membros da Bcl-2 Adenovirus com p53 Aivadores de TNF (Fas)

MORTE CELULAR

Teraputica

MORTE CELULAR

STAT3 - Regula negativamente clulas T-helper Ativador de genes de imunossupreso Bcl-xl, p53, c-Myc

miRNA

MORTE CELULAR

Teraputica
Molculas que se ligam a protenas oncognicas

MORTE CELULAR

Teraputica

MORTE CELULAR

Teraputica

MORTE CELULAR

Infeco viral

Vrus protenas inibidoras de caspases

MORTE CELULAR

Sistema imunolgico X Apoptose

Rejeio do enxerto - clula T citotxica induzem a apoptose das clulas alvo


glicocorticides, ciclosporina e tacrolimus - induzem a apoptose das clulas T

MORTE CELULAR

Apoptose no desenvolvimento

MORTE CELULAR

OBRIGADO!

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