Universidad Autnoma Del Estado De Hidalgo

Instituto de Ciencias Bsicas e Ingeniera

rea Acadmica de Biologa

Licenciatura en Biologa Protenas Anticongelantes
Asignatura: Bioqumica Catedrtico: Q.F.B. Zurisaddai Betanzos Palmeros Ponentes: Oscar Dimas Martnez Yesenia Ramrez Aviles Josefina Ramos Fras Segundo Semestre , Grupo uno. Ciclo: Enero Julio 2005
Pachuca de Soto, Hgo. Mayo de 2005

BIOQUMICA DE LAS PROTEINAS ANTICONGELANTES EN PECES RESUMEN Cuatro macromolculas anticongelantes distintas han sido aisladas y

caracterizadas de diferentes especies de peces marinos, stas incluyen a las glicoprotenas (Mr 25-33K), anticongelantes , las cuales son construidas por la repeticin del tripptido (Ala-Ala-Thr)n, con un disacrido enlazado a los residuos de treonina, existen 3 tipos de protenas anticongelantes (AFP).- El tipo I es rico en alanina, anfiflico, con hlice , (Mr 3-5K). El tipo II es una protena grande (Mr14K), con un alto contenido de giros inversos a la hlice y cinco puentes de disulfuro. El tipo III es de medida intermedia (Mr.-6-7K), sin distincin de caractersticas de estructuras secundarias composicin de aminocidos. A pesar de sus marcadas diferencias estructurales, los cuatro tipos de anticongelantes aparecen en funcin de la misma va uniendo las caras de los prismas de los cristales del hielo e inhibiendo el crecimiento a lo largo de los ejes A. (en una sola direccin). Esto sugiere que el tipo I de AFP se enlaza preferencialmente a las caras de los prismas que resultan de las interacciones entre la hlice del macrodipolo protenico y los dipolos en la molcula de agua del hielo enlazado. sta unin es estabilizada por puentes de hidrgeno de carcter anfiflico de las hlices resultantes en la fase hidrofbica de la hlice que est siendo expuesta al solvente. Cuando la temperatura de la solucin es disminuida, el crecimiento de los cristales de hielo ocurre primordialmente en el plano basal no cubierto ni ordenado, resultando en la formacin de cristales bipiramidales. La estructura caracterstica de las AFP tipo I podra contribuir a que este

mecanismo de accin sea revertido. Cuando sea resuelta e interpretada la estructura de otros anticongelantes, podra aparecer un mecanismo de accin comn.

Porque algunos peces tienen anticongelantes macromoleculares? El suero de los telesteos marinos est en relacin hipoosmtica con el agua de mar, teniendo aproximadamente una tercera parte de la molaridad de los solutos. Las propiedades coligativas de los solutos en el agua de mar (~0.45 M) bajan el punto de congelacin bajo ~ -1.9C, mientras que el tpico suero del telesteo ser congelado a 0.7C. sta discrepancia de ~ 1C en los puntos de congelacin significa que los telesteos no protegidos en temperaturas polares podran tener un riesgo de congelacin e incluso muerte cuando su temperatura cayera bajo -0.7C. Si bien existe evidencia de que algunos peces pueden sobrevivir en estas temperaturas en aguas profundas en un estado sper congelado, esto no es posible en aguas superficiales, donde el contacto con hielo no permite el enfriamiento . Cuando Scholander y colaboradores iniciaron sus investigaciones sobre este problema usando un pez rtico observaron un inusual suero capaz de soportar temperaturas de congelacin (~ -1.4C). La naturaleza de el anticongelante responsable de esta depresin en el punto de congelamiento escap de estos investigadores. Sin embargo en 1969 DeVries y Wohlschlag, reportan que el anticongelante presente en la sangre del pez nototheniid, era una macromolcula proteincea soluble en cido tricloroactico al 10%. Una caracterizacin ms especializada , revel que este anticongelante consta de un juego de glicoprotenas construidas a partir de la repeticin de un tripptido (Ala-Ala-Thr)n con un fragmento de un disacrido enlazado a los residuos de treonina. Como han sido estudiados ms especies de peces por su actividad anticongelante, se han identificado tres distintos tipos de protenas y una glicoprotena anticongelantes. Estas son ricas en alanina, la cadena helicoidal de las AFP encontradas en lenguados y sculpins (tipo I), la AFP rica en cisteina de los animales que habitan las profundidades marinas composicin y secuencia(Fig.1). (tipo II) y una AFP (tipo III) encontrada en anguilas, las cuales carecen de caractersticas distintivas en su

Fig.1 Representaciones esquematicas de cuatro estructuras de AF(G)P muestran la repeticin estructural del glucopeptido; Tipo I: AFP de la platija invernal mostrando su estructura terciaria en una hlice, el tamao de la molcula se indica en la cantidad de aminocidos.

La interaccin de las protenas y glicoprotenas anticongelantes con hielo. A pesar de las marcadas diferencias en la composicin de aminocidos y estructura proteica entre esos tipos de anticongelantes macromoleculares, todos ellos parecen interactuar con el hielo de la misma manera. Tienen un efecto favorable en el punto de fusin del hielo formado en su presencia y alguna depresin de el punto de fusin es completamente explicable por las propiedades coligativas de las protenas en solucin. Este es el punto de congelacin de sus soluciones es bajado ms all del valor predicho desde los efectos coligativos. La diferencia entre los puntos de fusin y congelacin es determinado por

histeresis trmica. Su valor es en funcin de la concentracin de protenas y

glicoproteinas anticongelantes (AF(G)P). La relacin entre la histeresis trmica y la concentracin de AF(G)P, propone linearidad solo en valores muy bajos, posteriormente empieza a dibujar curvas hiperblicas (Fig.2).

Fig 2.- Comparacin de las curvas de histeresis trmica en diferentes especies de organismos. (SR) cuervo marino Mr 14000,(OP) ocean pout Mr 6000, (SH) sculpin Mr 4000, platija de invierno (F) Mr3300 y cod atlntico (C) Mr 2600. la curva patrn se identifica en AFGP-5.

Valores de la histeresis trmica para la mayora de las AF(G)P en peces proponen un valor estable en mas de 1C en concentraciones saturadas. La observacin microscpica del crecimiento de cristales de hielo muestra que la presencia de AF(G)P no solamente baja el punto de congelacin de la solucin, sino que tambin altera el habito y ritmo de crecimiento de los cristales de hielo. En ausencia de AF(G)P, el hielo crece ms rpidamente a lo largo de ejes que para dar una forma hexagonal a los cristales (Fig.3). Este crecimiento es inhibido por AF(G)P. Cuando la temperatura de la solucin es bajada , el crecimiento de los cristales de hielo eventualmente vuelve a empezar, pero en un ritmo ms acelerado y primariamente a lo largo de los ejes C para dar cristales con formas bipiramidales. En concentraciones altas de AF(G)P, se forman cristales similares a agujas.

El tipo I de AFP de lenguados y sculpins es las ms extensivamente protena anticongelante caracterizada, es la nica por la cual una estructura cristalina es conocida como rayos X y por los cuales han sido propuestas detalladamente las relaciones funcionales estructurales.

Fig 3.-Crecimiento de los cristales de hielo en presencia y ausencia de AFP. A) cristal hexagonal formado en ausencia de AFP. B)Cristal formado en presencia de AFP, muestra inhibicin de la expansin del eje A dando formas bipiramidales. C) Cristal formado en una concentracin alta de AFP, muestra formas aciculares.

Presencia de un dipolo pptido macromolecular El dicroismo circular (CD) en las medidas del tipo I de AFP sugieren que en una estructura helicoidal , por lo menos las bajas temperaturas donde las AFP son operativas. A -1C, fueron reportadas con 85% ms contexto de hlice, pero este valor decrece rpidamente conforme la temperatura es aumentada, siendo 47% a 25C, formando un anillo al azar, por encima de 70C. La estructura cristalina en rayos X de las AFP de los componentes de la platija de invierno muestra que la protena es una simple hlice en estado slido. Hol ha puntualizado que las hlices son macrodipolares. Asociadas con cada enlace peptdico en el pptido de unin forma un significativo dipolo elctrico . Cuando ordenado en una hlice , esos dipolos empiezan a alinearse cerrando el eje de la hlice, primero resultando un macrodipolo a lo largo del eje de la hlice.

Este dipolo es equivalente a una media unidad aislada, cargada en cualquiera de los polos de la hlice orientada tal que la carga positiva es en el NH 2 terminal y la negativa en el COOH inicial. Sin embargo la fuerza del campo elctrico de la hlice ms hlices mayores a quince residuos es solamente marginalmente de la parte de trece residuos que dependen. Estos investigadores sugirieron que los macrodipolos peptdicos juegan un importante papel en la unin de sustratos cargados con coenzimas tales como NAD, NADP y otros compuestos que contienen fosfato, un largo rango de atraccin de sustratos cargados y la aceleracin de severas reacciones enzimticas. Recientes estudios de modelos peptdicos han ayudado a definir el papel del dipolo en la estabilidad de la hlice, si bien como algunas caractersticas estructurales que contribuyen a reforzar el dipolo. Basados en esos encuentros, el tipo I de AFP en lenguados tiene varias caractersticas estructurales que pueden estabilizar la conformacin de la hlice por la interaccin favorable con el dipolo de la hlice, estos incluyen la carga negativa del aminocido terminal NH2 (Asp); el cual es realizado por la amidacin en el COOH terminal surgiendo por el procesamiento de la proAFP a AFP. Los puentes salinos intramoleculares tales como los presentes entre Lys18 y Glu22 en la platija de invierno, la AFP (HPLC6) y entre Lys19 y Aps23 y Lys30 y Asp34 de la platija de cola amarilla AFP (Fig.4) son conocidas para fortalecer la hlice , pero su polaridad (se invierte la carga positiva hacia la carga negativa, NH2-terminal Asp; carga negativa hacia carga positiva, COOH-terminal Arg), sugiere que ellos pueden tambin reforzar la hlice dipolar. Anfificidad de la hlice Las dos mayores AFPS-A(HPLC-6) y B(HPLC-8) en platijas invernales son cada uno de 37 aminocidos de largo y contienen tres series de 11 aminocidos

repetidos en la secuencia ThrX2AsxX7 donde la X usualmente es alanina algn otro aminocido que favorezca la formacin de una hlice , esta estructura repetida es obviamente cuando las AFPs de la platija de invierno y la de cola amarilla son comparadas, las ltimas protenas contienen una adicin de 11 aminocidos repetidos. A nivel de DNA hay evidencia de secuencias de AFP en la platija invernal que contiene cuatro a veces cinco repeticiones pero no evidencia de que sus productos genticos si fueran expresados hagan una contribucin significativa en los niveles de anticongelantes en sangre. El efecto de esta serie de estructura repetida es para generar una hlice con caractersticas anfifilicas. Esta estructura helicoidal es estabilizada por la interaccin dipolar con aminocidos terminales y por intraencadenamiento de la formacin de puentes salinos como fue indicado arriba. Porque la presencia de algunos residuos de alanina en el polo hidrofilico de la hlice y algunos residuos hidroflicos en el lado hidrofobico, la protena anticongelante AFP no es estrictamentes anfifilica, de hecho,los momentos hidrofbicos (M rangos desde 0.1 a 0.27)son bastante pequeos. Una proyeccin circular indica que la Ser4, Lys18 y Glu22 en HPLC-6, son residuos con proyecciones en la cadena hidroflica, de lado hidrofobico de la hlice. El ltimo de dos lados de dos cadenas formadas por los puentes salinos intramoleculares. Mientras tanto el papel de la Ser4 es actualmente desconocido.

Fig 4.- estructura secundaria del tipo II de AFP de sculpins y lenguados.

Interacciones del hielo a lo largo del aminocido encadenado a la protena anticongelante (AFP). Desde la construccin de un modelo existen nueve cadenas potencialmente unidas al hielo formadas por aminocidos en cadenas largas en HPLC-6: Asp1, Thr2, Asp5, Thr13, Asn16, Thr24, Asn27, Thr35, y Arg37 (Fig.4). Estudios cristalogrficos con rayos X indican que existe suficiente libertad torsional de las cadenas laterales para acomodar la unin de las cadenas laterales de aminocidos en diversas superficies del hielo. La sntesis de la fase solida de las formas acortadas han demostrado que Thr2-Arg37 y los ASP5-Arg37 son anticongelantes activos, aunque son menos eficaces en la inhibicin del crecimiento del hielo en un eje. Esta ultima forma carece de dos residuos potenciales para la union del hielo, Asp1 y Thr4. Las formas ms cortas de HPLC6 con solamente dos repeticiones de 11-aminoacidos (26 aminocidos) estn inactivas, lo cual es constante en observaciones anteriores que limitan la proteolisis de la destruccin de la actividad anticongelante. La AFP de la platija de cola amarilla (fig. 4) es ms larga que HPLC-6 por una repeticin 11-aminoacidos pero esta contiene un poco (ocho) potencial para unir el hielo a la cadena lateral. Su actividad anticongelante es similar a las tres repeticiones de AFPs de la platija del invierno cuando se calculo en una base molar.

Mecanismos de accin

La presencia de AFP como una sola -hlice propuesta por Yang postula que el momento dipolar creado por la hlice es la fuerza conductora inicial para el reconocimiento especfico de la interaccin AFP-hielo. Cuando AFP acercan a los ncleos del hielo al azar difusiona, el dipolo del pptido induce a una alineacin antiparalela de las molculas de agua en la rejilla (fig. 5). La examinacin de un modelo de cristal de hielo indica que los dipolos de todas las molculas de agua estn orientados en una de dos direcciones: o inclinado a 55 del eje-c y a 30 del eje-uno, o bien inclinado a 55 del eje-c y a 90 del ejeuno. El resultado de estos dos vectores est inclinado a 51 del eje-c y a 60 del eje-uno (< 211 >, Fig. 5) Lo nico que ocurre naturalmente en los planos del hielo que son paralelos al vector resultante del dipolo (< 211 >) son las caras del prisma. El AFP puede mantener su alineacin con el vector del dipolo < 211 > y la ubicacin en la cara plana del prisma. Esta alineacin preferencial dirige la union de AFP a la cara del prisma, y su absorcin inhibe el crecimiento del eje-uno por la absorcin del modelo de inhibicin.

Fig 5.- Representacin esquemtica del tipo I de AFP en su interaccin con el hielo.

La amplificacin de la hlice, con la alineacin de sus cadenas laterales hidroflicas, proporciona los puentes de hidrogeno necesarios para la interaccin con la rejilla del hielo, mientras que el conjunto de cadenas laterales hidrofbicas sirven para impedir el crecimiento adicional de los ncleos del hielo. Los dipolos del agua dentro del cristal de hielo y la superficie de la base plana estaran desordenadas, y la nucleacin y el crecimiento del hielo en la base plana podran continuar ocurriendo. La formacin nuevamente desordenada del frente del hielo en la base plana se conservara cuando este avanza en el arreglo de la capa externa o est limitado por otras AFPs en la solucin. Esta alteracin habitual en el crecimiento provoca el desarrollo de cristales bipiramidales de hielo (fig. 3 y fig. 5) la frecuente alteracin del crecimiento del hielo en AFP sugieren que las soluciones que unen a las AFP a las caras de los prismas lo hacen con mayor afinidad que a la base plana. El complejo de la cara del prisma del AFPhielo es estabilizado por ambos dipolos y por enlaces de puentes de hidrgeno, mientras que el complejo de la base plana estabilizado sobre todo por puentes de hidrgeno.

AFP Tipo I de sculpins La otra AFP tipo I que ha sido descrita viene de los sculpins (fig. 4). De acuerdo a la composicin de sus aminocidos, en particular de alanina contenido en ms del 60% de los residuos, secuencia, y una estructura secundaria de -hlice, no hay problema en clasificar este con la AFP de la platija. Sin embargo, no est claro si estas protenas son similares porque son homlogas o porque se han evolucionado convergentemente (tendencia comun, dirigirse a un mismo punto). Los componentes de AFP del sculpin son an ms amplificados que AFPs de la platija. Por ejemplo, AFP SS-8 del sculpin tiene un momento hidrofbico de 0.26 comparado con un valor de 0.13 para la AFP HPLC-6 de la platija. La formacin de un puente de sal de las cadenas laterales en SS-8 es factible en Lys22 y Asp26, y en los residuos apropiados en SS-3 y GS-5 (fig. 4), aunque la prueba de su existencia requerira confirmacin por medio de tcnicas fsicas. Las AFPs del

Sculpin difieren significativamente de AFPs de la platija en que en sus extremos terminales tiene un grupo amino NH2-. Otra diferencia es que en AFPs del sculpin tiene una repeticin estructural interna que no esta bien demarcada mientras que si esta determinada en AFPs de la platija. La AFP tipo I ms pequea es SS-3 que naturalmente aparece en la parte ms corta del sculpin . Este peptido tiene 33 aminocidos de largo con un contenido de la hlice de el 45% con 4C. Tiene una hlice rompiendo una prolina en la posicin 4, la cual puede reducir efectivamente la longitud de la hlice a 29 residuos.

GLUCOPROTENAS ANTICONGELANTES Las primeras macromoleculas anticongelantes que se caracterizaron

bioqumicamente fueron los AFGP del nototheniids del ocano antrtico. Este tipo de anticongelante se construye encima de un tripeptido que repite las unidades (Ala -Ala-Thr) al cual se liga el disacrido B-D-galactosa (1 3) - - N acetil-Dacetil-D-galactosamina a travs del hidroxido del oxigeno del residuo de la treonina. La purificacin de AFGPs ha sido facilitado por su superabundancia en nototheniid serum y su solubilidad en cido tricloroacetico al 10%. Tanto asi como ocho componentes han sido detrminados por la electroforesis de gel. Estos han sido enlistados como componentes del 1 al 8 de acuerdo al orden de aumento en la movilidad electroforecica y disminucin en el tamao. Su rango molecular de masas va a partir de 2.600 a 33.000. En algunas de las repeticiones del tripeptido de los componentes de AFGP ms pequea, la prolina substituye a la alanina en el lado terminal COOH de la treonina. El anlisis detallado de la secuencia demuestra que el componente 8 del Pagothenia borchgrevinki es en s mismo una mezcla de secuencias en las cuales las substituciones de la prolina ocurren en diversas partes donde se repete el tripeptido. La AFGPs (que contiene prolina) ms pequeas, son menos activas como anticongelantes que las ms grandes. Este mismo tipo de anticongelante se encuentra en los bacalaos de climas templados y regiones polares del hemisferio norte. Esto es sorprendente, en vista

de la distancia evolutiva que existe entre los nototheniids y los bacalaos y es que el nmero y el tamao de los componentes de AFGP son similares en ambos grupos de pescados. La sustitucin alanina/prolina tambin ocurre en AFGPs ms pequeas de los bacalaos. En estas dos especies, Microgadus tomeod (frostfish) y Eleginus gracilis (bacalao del azafrn), la arginina aparece como sustituto de los residuos de la treonina en algunas de las repeticiones del tripeptido. No est claro si estas substituciones de aminocidos sean los responsables de la actividad anticongelante ms baja del de los componentes ms pequeos. En este sentido es quizs significativo que la divisin enzimtica, de los componentes de la AFGP ms grande, en fragmentos de 11 o menos unidades de glicotripeptidos dan lugar a la prdida considerable de la actividad. Otras manipulaciones que dan lugar a la prdida de actividad son modificaciones de los disacridos de los moieties por la acetilacin, peroxido de oxigeno, formacin compleja con boro, o su retiro por la Beliminacion. Estas reacciones resultado de la prdida de puentes de hidrogeno (que ha sido postulada por DeVries, Feeney, y compaeros de trabajo) estan implicados en la union de AFGP a la rejilla del hielo. Aunque se han realizado numerosos estudios fsicos con AFGP desde su descubrimiento (repasado recientemente por Ananthanarayanan,), la conformacin de estas glucoprotenas no han estado inequvocamente definidas. El modelo ms plausible para su estructura es uno en el cual la espina dorsal del polipptido forma un poliprolina Il como una estructura helicoidal zurda con tres residuos por vuelta, y los disacridos se organizan en una conformacin planar con sus grupos hidroflicos expuesto al solvente acuoso y sus caras hidrofbicas adyacente a la cadena del polipptido. Este modelo es notablemente similar en principio a la -helice amfifilica de AFP tipo I, y puede describirce por la funcin tan semejante de tales tipos de anticongelantes tan diferentes.

TIPO II AFP

El tipo II AFP esta caracterizado por su alto contenido de cistena (8 por 100 residuos) e inactivacin por los reactivo sulfhidrilo. Este tipo de AFP ha sido actualmente reportada en una especie de pescado solamente, (Hemitripierus arnericanus). Aunque se han encontrado protenas termales de la histresis ricas en cisteina/cisteina adentro de algunos insectos, no se sabe lo suficiente sobre sus caractersticas para indicar si se clasifican como AFPs tipo II. La presencia de cinco cisteinas en una protena relativamente pequea ha complicado su caracterizacin bioqumica, y una combinacin de la protena y la secuencia del DNA necesita proporcionar la informacin estructural definitiva. El producto primario de la traduccin del mRNA de AFP del mar raven fue secuenciado por Edman la degradacin revela la localizacion de los primeros cuatro residuos de leucyl. Referente a la secuencia reproducida del DNA de AFP el precursor de AFP tiene por lo tanto 163 aminocidos. El anlisis de los aminocidos y la secuencia del peptido NH2-terminal desbloqueado de la forma circular madura de la AFP indic que la glutamina en la posicin 35 es el residuo de NH2-terminal. As la forma madura tiene129 aminocidos largos y no contiene cisteinas libres. Segn el algoritmo calculado por von Heijne (50), el sitio ms probable del peptide seal est despus de alanina en la posicin 17. Si es as, AFP tipo II tendra una forma de la proteina precursora, cuya funcin es desconocida. El grado de heterogeneidad en la AFP del mar raven no esta claramente establecido aun. Hay una cierta evidencia para el mltiplo, componentes similares del anlisis de la cromatografa (HPLC) en el lquido de alto rendimiento o funcionamiento. Comparacin de una secuencia del cDNA con la una copia de un genoma demuestra si ambos fueron expresados, las protenas maduras serian diferentes por un solo aminocido en la posicin 4 (Gly- Pro.). En conjunto hay 12-15 copias del gene de AFP en el genoma del mar raven. Estos que no han sido demostrados traz alguna evidencia de diferencias importantes en la regin codificante. Esto parece probablemente, por lo tanto, la AFP del mar raven es producida por los mltiples genes y sa heterogeneidad limitada existe en forma de uno o varios reemplazos de aminocidos.

Las predicciones de la estructura secundaria indicaron una falta de la -helice y capa pero un alto contenido de vueltas inversas. Los estudios del dicroismo (propiedad de ciertas sustancias cuyo color varia con las circunstancias de observacin) circular confirman el bajo contenido de -hlice y el enriquecimiento en -estructuras de vueltas inversas. Tambin sugieren la presencia de residuos aromticos en un ambiente asimtrico, lo cual consta de una estructura terciaria doblada.

AFP Tipo III

Las AFP tipo III no contienen cistena y su composicin de aminocidos est perfectamente balanceada. Fueron aisladas por primera vez de la anguila Macrozoarces americanus, de la familia Zoarcidae, y mas recientemente de otros tres miembros de la familia, Rhigophila dearboni y Austrolycicthys brachycephalus, ambas anguilas antrticas, y Lycodes polaris, una anguila rtica. Trabajos recientes de G. L. Fletcher (resultados sin publicar) han mostrado que la AFP tipo III se distribuye de una manera an mas amplia apareciendo en al menos, otras tres familias de Zoarcoide, adems de Zoarcidae. La AFP de ocanos de Terranova comprende un juego de protenas relacionadas, de las cuales, los mayores componentes son separables por cromatografa de intercambio inico y HPLC de fase reversa. AFPs de 8 de los 12 picos definidos de la HPLC, HPLC 1, 4, 5-7, 9, 11 y 12, han sido secuenciados con secuenciacin protica convencional (Fig 6). El residuo terminal NH2- de la HPLC 4, 5 y 6 es glutamina, que ha sido ciclizada del cido pirolidino carboxlico, y es por lo tanto, resistente a la degradacin Edman. Estas protenas tienen de entre 62 a 56 aminocidos, aunque hay algunas diferencias en la longitud del procesamiento de las terminales NH2- y COOH-, solo un componente (HPLC-5) puede ser producto de otro (HPLC-6). Todos los otros componentes tienen diferencias de aminocidos

internos. Basadas en su secuencia de aminocidos, las AFPs tipo III pueden ser divididas en dos grupos. El grupo mas grande, comprende a los componentes que se unen a SP-Sephadex. Su secuencia de identidad es ~90%, y la mayora de las sustituciones de aminocidos son conservativas. El otro, menos comn grupo de AFPs tipo III, se unen a QAE.Sephadex. Aunque muestran ~75% de secuencia de identidad dentro del grupo, esta cifra cae al ~50% cuando son comparadas con la serie SP. Esto es de acuerdo a estudios inmunolgicos de Hew, que indic que los dos grupos, aunque realizan reacciones cruzadas, son inmunolgicamente distintos.

Fig 6.- Compendio de secuencias para el tipo III de AFP. Fueron derivadas de de diversas especies de peces rticos marinos.

Comparaciones entre AFP genmico y clones de cDNA escogidos al azar para secuencias de codificacin de protenas que encajan en las series SP o QAE, confirman la existencia de secuencias proticas o muestran variaciones menores. Obviamente existen otros genes activos, aparte de los que hacen surgir los componentes proticos mayores, que, en cambio, pueden ser componentes mayores porque estn codificados por mltiples copias de genes. En efecto, dos clones de cDNA que difieren muy poco en su secuencia de nuclticos en posiciones silenciosas, ambas codifican para HPLC-6. En concordancia con estas

observaciones, se ha estimado que el ocano de Terranova tiene ~150 copias del gen AFP. La misma especie encontrada en las aguas de New Brunswick tiene menos copias (entre 30 y 40) del gen y produce AFP en menores proporciones. A pesar de la abundancia de datos de la secuencia de aminocidos de las AFPs tipo III, se conoce muy poco acerca de su estructura o mecanismo de accin. Un anlisis espectral de ambos componentes, QAE y SP, mostraron que este anticongelante tiene una estructura secundaria y una terciaria bien definidas. En la regin lejana del espectro ultravioleta (190-250nm), es espectro CD es cualitativamente similar al producido por la AFGP. Sin embargo, en la regin ultravioleta mas cercana (250- 300 nm), existen bandas que indican un arreglo asimtrico de aminocidos aromticos. Tambin la transicin sigmoidal termal observada en el calentamiento de la AFP sugiere la presencia de interacciones cooperativas que actan para estabilizar su estructura secundaria. Estas caractersticas no se encuentran en la AFGP. Un estudio espectral en el componente de tipo QAE de L. polaris confirma la poquedad de -hlice y plegada originalmente indicados por predicciones de estructuras secundarias, y confirma adems la presencia de una estructura terciaria doblada. Existe una variabilidad en los extremos NH2- y COOH- de las AFPs tipo I de los platijos, donde estas terminales y sus modificaciones se cree que juegan un papel clave en la estructura y por lo tanto en la actividad del anticongelante. Recientemente estudios de expresin han mostrado que la AFP tipo III producida en E. coli con una extensin terminal NH2- de Met-Lys, y la producida en Drosophila melanogaster, con siete extensiones terminales NH2son completamente activas y funcionales. Todas las AF(G)P de peces parecen interactuar con el hielo de manera similar. Es, por lo tanto, comn pensar que la AFP tipo III presenta un grupo de residuos hidrofilicos en un lado de la molcula que son capaces de formar puentes de hidrgeno con el hielo, como se propone para el lado de la cadena con asparagina

y treonina, junto con la cara hidroflica de la AFP tipo I -helicoidal y los grupos de carbohidratos de la AFGP. De ser as, existe un nmero de residuos hidroflicos altamente conservados en la secuencia de la AFP tipo III que cumplen esta funcin. Estudios preliminares usando mutagnesis de sitio dirigido, han mostrado que hay una disminucin del 25% en la actividad cuando Glu21 o Glu34 son substituidas por alanina. Proyecciones para el futuro, relaciones estructura / funcin. An a nivel protico, existen muchas preguntas sin contestar acerca de las molculas anticongelantes, Una de las observaciones mas fascinantes es que cuatro estructuras completamente diferentes parecen interactuar con el hielo de manera similar y si es as, tal vez operen con el mismo mecanismo de accin para bajar el punto de congelacin. Como es que tales estructuras diferentes presentan fundamentalmente sitios de unin similares que interactan especficamente con las caras prismticas del hielo? Caracterizaciones de las estructuras de la AFP tipo I y de la AFGP han llevado a la hiptesis de que tal vez se requieren molculas anfipticas para unir el hielo al extremo hidroflico y excluir el H2O en el lado hidrofbico. Estas caractersticas son reconocibles en ambos anticongelantes. Detalles del modelo como la importancia de la hlice macrodipolo o el espacio entre los puentes de hidrgeno siguen sin ser establecidos. Pueden ser probadas y refinadas al menos para la AFP tipo I, por un estudio de estructura de sntesis peptdica de fase slida o de mutagnesis de sitio dirigido en conjuncin con biosntesis. Las AFPs tipo II y III son estructuras mas complejas que parecen tener un elemento de estructura terciaria. La solucin de estas estructuras por cristalografa de rayos X y la NMR. Bidimensional es una prioridad obvia al ver si tambin tiene una estructura anfiptica y tal vez un espacio regular entre sus puentes de hidrgeno. El reconocimiento de un motivo estructural comn en las cuatro

estructuras de la AF(G)P recorrer un largo camino para confirmar el modelo de interaccin con el hielo y complementar los estudios de estructura / funcin. El descubrimiento de cuatro estructuras anticongelantes diferentes en teleostos con muy poca lgica en su distribucin dentro del esquema filogentico aceptado actualmente lleva a la sugerencia de que su elaboracin como anticongelantes es un evento relativamente reciente en la escala de tiempo geolgico. Ya que ellas tienen un origen claramente no monofiltico, existe la posibilidad de que tipos adicionales de anticongelantes se descubrirn en peces. Hoy en da, protenas anticongelantes ricas en cistena han sido caracterizadas en el arenque y el esperlano. An no es claro si pertenecen a la categora de tipo II o representan un tipo diferente. Tambin otros tipos de AFP pueden ser descubiertos mientras se estudian otras especies. Protenas anticongelantes han sido descritas en insectos. Estas protenas no han sido debidamente caracterizadas para comenzar su clasificacin. Una de las dificultades ha sido obtener suficiente material para trabajar. Sin embargo, con el avance de la electroforesis capilar, la HPLC y el incremento en la sensitividad de la fase gaseosa de secuenciacin de protenas, estas dificultades difcilmente retrasarn la caracterizacin de anticongelantes en insectos por mucho tiempo. Debido a que los insectos terrestres invernales usualmente encaran temperaturas mas abajas que las de un pez, ser interesante ver si sus AFPs provocan un descenso en el punto de congelamiento menor que de 1 C+, que parece ser el valor mximo para el anticongelante en peces. Los valores de histeresis termal de varios grados ha sido reportada para la hemolinfa cruda de insectos, pero falta ver si estos valores son atribuidos a un solo componente. Si pueden, entonces su mecanismo de accin puede ser diferente a las AF(G)Ps de los peces. ltimamente el conocimiento acerca de la relacin estructura / funcin puede permitir el diseo de un anticongelante macromolecular mejor y mas eficiente, eso es, uno con valor mayor de histeresis termal por unidad de concentracin. Una

AFP con esta propiedad sera particularmente til para estudios transgnicos diseados para conferir resistencia al fro o a travs de transferencia de genes.

Bibliografa

Davies, Peter L. And Choy L. Hew.

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