Universidade Federal de So Carlos Departamento de Gentica e Evoluo Disciplina Prticas de Gentica

Extrao de DNA e Amplificao por PCR

rique de Castro 405523, Victor Mart yn 405 612 , Wilson Lau Jnio r 405604.

Introduo A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) uma tcnica de Biologia Molecular que permite a replicao in vitro do DNA, de forma extremamente rpida. Com a PCR, sequncias mnimas do material gentico podem ser amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida e vivel dos marcadores genticos de doenas infecciosas, doenas genticas, e outras muitas utilidades. A PCR trabalha com o princpio natural de replicao do DNA. Consistindo em um processo de trs passos bsicos, que se repete em ciclos inmeras vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nas seguintes etapas: Desnaturao com calor; Hibridizao ou Annealing : hibridiza-se nas extremidades das sequncia alvo primers (um em cada simples fitas produzida); Extenso: a adio da Taq polimerase na soluo faz com que esta enzima inicie o processo de sntese da nova dupla fita, na regio do primer, incorporando os nucleotdeos complementares.

Alguns componentes so essenciais para que ocorra a PCR: Presena de uma DNA polimerase termoestvel, como por exemplo, Taq (Termus aquaticus) a ou Tfl (T. flavus); Presena de um par de primers, oligonucleotdeos que funcionam como ponto de incio da polimerizao; Ctions divalentes, como MgCl2; Deoxinucleotdeos trifosfatados (dNTPs), com quantidades iguais de dATP, dCTP, dTTP e dGTP; DNA molde, podendo ser fita simples ou fita dupla; Tampo para manuteno do pH, geralmente entre 8,3 e 9 temperatura ambiente.

O resultado da PCR observado atravs da eletroforese. A eletroforese em gel uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa iro migrar mais rapidamente que as de maior massa. A eletroforese normalmente utilizada para separar protenas e molculas de DNA e RNA.

Objetivo O objetivo desta prtica consiste em demonstrar os processos e mtodos de extrao de DNA, assim como a amplificao por PCR usando diferentes primers, e a observao do resultado atravs da eletroforese. Materiais e Mtodos
1. Extrao do DNA por Tiocianato de guanidina Antes da extrao em si, necessrio a preparao de um tampo para a lise celular e um uma soluo para a precipitao proteica. O tampo foi preparado com as seguintes substncias e concentraes: 100 mM NaCl 100 mM Tris-HCl pH 8.0 25 mM EDTA pH 8.0 0.5% SDS Enquanto que para a preparao da soluo de precipitao proteica foi usado: 4M Tiocianato de guanidina 0.1M Tris-HCl pH 7.5 Com os procedimentos acima realizados pode-se ento iniciar a extrao do DNA, para isso o primeiro passo realizar a lise celular e o tratamento com RNAse. Colocou-se 10 mg de tecido com 300 l de cell lysis buffer e 1.5 l de proteinase K (20 mg/ml), o tecido (no caso uma mosca Anastrepha) foi macerada, seguida de uma incubao de 1h, a 57 C. Homogenizando ocasionalmente. Aps a espera de 1h o preparado foi levado centrfuga por 1min a 4000rpm para precipitar algum material no digerido e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo contendo 1.5 l de RNAse A (4 mg/ml). Homogenizando bem e incubado a 37C por 30 min. O intuito , alm de conseguir extrair o DNA, no permitir que enzimas DNAses degradem o material, eliminar as histonas que esto auxiliando no enovelamento da amostra,

eliminar cidos nucleicos no necessrios (RNA) e deixar o contedo mais purificado possvel (apenas as molculas de DNA). Segundo passo a precipitao das protenas, os mtodos utilizados foram: Adicionar 100 l de protein precipitation solution, em seguida homogenizar no vrtex por no mximo 5s. Aps isso centrifugar a 13000 rpm por 5 min. O sobrenadante transferido para um tubo novo. O terceiro passo a precipitao e lavagem do DNA: 2/3 de volume de clorofrmio adicionado no tubo, homogenizado por inverso durante 1 min e centrifugado a 13000 rpm por 1 min para separar a fase orgnica da aquosa. A fase aquosa transferida para um tubo novo. Foi adicionada 300 l de isopropanol 100% e misturado por inverso 50 x. E novamente centrifuado a 13000 rpm por 5 min. O sobrenadante descartado por inverso do tubo. 300 l de etanol 70% adicionado e o tubo invertido gentilmente 3x. Logo h uma nova centrifugao a 13000 rpm por 5 min. O sobrenadante descartado por inverso. Aps todo esse processo os tubos so deixados secando temperatura ambiente. O quarto passo a ressuspenso do DNA e estocagem: adicionado de 50 a 200 l de gua e por fim deixar temperatura ambiente por 1h, homogeneizando a cada 15 min. Alquotas de trabaho so separadas e levados ao estoque a 20 C. Para longa durao o estoque feito a -80 C. O resultado analisado atravs de uma eletroforese em gel. 2. Amplificao por PCR Os quatro grupos extraram o DNA de um indivduo e preparam uma soluo com um primer diferente, e cada grupo utilizou o DNA extrado por todos os outros grupos. Ento, no total, cada grupo fez 6 tubos de reao: quatros com cada DNA extrado, um com o controle positivo e um branco (sem amostra nenhuma). As reaes realizadas foram:

Reao 1: O Grupo 1 fez a Reao 1, essa primeira reao usou os reagentes abaixo e o DNA anteriormente extrado para preparao de uma solues. Reagentes L
gua Tampo 10 x

33.6 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 1.4 -

MgCl2 (15 mM) dNTPs (2 mM cada)

Primer dsx A56f (2

M)
Primer dsx 1016r

(2 M) CapeTaq (5U/L) DNA

Em seguida foram realizados os seguintes passos: 1. Aplicar 9 l da soluo me em microtubos: 200 ul. 2. Aplicar 1 l de amostras de DNA. 3. Incubar a reao em termociclador (Ivory) seguindo o protocolo abaixo: 94 C 1 min 94 C 30 s 47 C 30 s 72 C 45s Goto 2 35 x 72 C 10 min 4 C infinito

O Grupo 2, usou a mesma metodologia do grupo 1 para realizar a Reao 2, entretanto no foi usado o primer dsx A56f (2 M) e sim o primer dsc T56f (2 M).

Reao 3: O Grupo 3 fez a Reao 3, sendo que essa reao utilizou os componentes abaixo e o DNA anteriormente extrado para preparao das solues: Reagentes
gua Tampo 10 x

L 33.6 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 1.4 -

MgCl2 (15 mM) dNTPs (2 mM cada)

Primer dsx A100f (2 M) Primer dsx 1016r (2 M)

CapeTaq (5U/L) DNA

Em seguida foram realizados os seguintes passos: 1. Aplicar 9 l da soluo me em tubos de 200 l. 2. Aplicar 1 l de amostras de DNA. 3. Incubar a reao em termociclador seguindo o protocolo abaixo: 94 C 1 min 94 C 30 s 57 C 30 s 72 C 45s Goto 2 35 x 72 C 10 min 4 C infinito

O Grupo 4 realizou a Reao 4, utilizando o mtodo da Reao 3, mas alm de usar o Primer dsx A100f (2 M) utilizou o Primer dsx C100f (2 M).

Resultados

Figura 1 Eletroforese. 1 - Grupo 1. 2 - Grupo 2. 3 - Grupo 3. 4 - Grupo 4. Em branco - controle negativo. M - Controle positivo.

1. Extrao de D NA Os grupos conseguiram extrair o material gentico imprescindvel que a extrao seja precisa, j que h DNAses dentro das clulas que podem degradar o material gentico caso algo seja feito incorretamente. A qualidade da extrao vista a partir da eletroforese, j que boas amostras formam bandas fortes (Ex: G1), amostras que no formam banda houve algum tipo de erro no processo(Ex: G4). 2. Amplificao de DNA por PC R Aps a realizao da PCR so geradas grandes amostras de DNA, produtos de diferentes comprimentos, e estes produtos so analisados por transiluminao UV em gel de agarose, ou seja, atravs da eletroforese. O menor dos produtos migra ma is rpido e gera a banda mais a baixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser necessrio usar um gel de poliacrilamida. 3. Eletroforese em gel de agarose

No procedimento feito em sala, apenas o controle positivo apresento u bandas em todas as amostras utilizando os diferentes primers . O primer A56 teve a banda mais visvel nos trs primeiros grupos, o quarto grupo deve ter perdido material gentico durante o processo, j que banda nenhuma visvel, em nenhum dos primers.

Discusso
As bandas formadas que apresentaram cor forte no gel possuem grandes quantidades do ma terial analisado, j que o intuito da PCR justamente produzir em larga escala o fragmento de DNA desejado. Bandas inexistentes o u muito fracas so fruto da perda do material, durante o processo de extrao ou erro na PCR, logo, torna -se inconclusiva parte da anlise. A banda do primer A5 6 foi o nico com o qual a molcula de DNA hibridizou, logo apenas aquele fragmento foi polimerizado. No par de bases de nmero 56 a presena de Adenina na fita onde o primer se hibridiza o fez com que todo o fragmento con dizente fosse replicado inm eras vezes. Se a molcula apresentasse bandas relacionadas aos outros primers, o DNA destes conteria as bases nos respectivos lo cais (T57: Timina no par 57 na fita o nde o prim er se hibridiza seria replicado).

Concluso O primer e a fita devem apresentar complementa o para que, estes, se hibridizem e possam ser polimerizados. O primer A57 alm de possuir a Adenina na posio 57, possua complementao com a fita, mesmo se na fita complementar apresentasse Adenina na posio 57 no haveria a hibridizao de todos os nucleotdeos (como funcionaria numa banda que o primer T57 polimerizasse), por isso ocorreu a polimerizao em cadeia especificamente da fita correspondente ao fragmento observado na banda.

Referncias Bibliogrfic as WATSON, JD. Biologia molecular do gene. 5. ed. Porto Alegre, Artmed, 2006. MALECINSKI, GM. Fundamentos de Biologia Molecular. 4. ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2005. Sites: http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-dediagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/ (Acesso 05 Nov 2012) http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/eletroforese.htm (Acesso 06 Nov 2012)