UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN CAMPUS DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS LICENCIATURA EN BIOLOGA

Asignatura.

Manejo de Muestras Biolgicas en Reservorios Vectores de Zoonosis

Profesores.
Dr. Enrique Reyes Novelo Dr. Hugo Antonio Ruiz Pia

Alumnos:
Jorge Manuel Castaeda Gmez Arnulfo Cruz Gonzlez Dzib Flavio Antonio Abeytia Snchez Christian Prado

Tarea: Protocolo de obtencin, manejo, conservacin y uso de muestras biolgicas.

Mrida, Yucatn a 2 de Octubre de 2012

ndice Titulo....II Introduccin1 Objetivo...3 Metodologa....4 1. Seleccin del sitio de muestreo.....4 2. Protocolo para trampeo y procesamiento de Zarigeyas.4 2.1. Colocacin y control de trampas..4

2.1.1. Preparacin para la expedicin de trampeo5 2.1.2. Colocacin de trampas5 2.1.3. Recoleccin de zarigeyas capturadas7 2.2. 2.3. Recoleccin de ectoparsitos en Zarigeyas9 Liberacin de zarigeyas capturadas....11

3. Preparacin y diagnstico de la muestra biolgica..12 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. Preparacin de garrapatas..13 Diseccin13 Maceracin.14 Examen microscpico de macerado..14 Cultivo en medio BSK II...14 Extraccin de ADN: Amplificacin de ADN especfico (nested, PCR).15 Obtencin de cidos nucleicos...16 Amplificacin y deteccin del ADN especfico de B. burgdorferi..17

Nivel de bioseguridad requerido para el manejo de muestras...23 Bibliografa......25 Anexos.....27 Anexo 1. Descripcin de la enfermedad de Lyme...28 Anexo 2. Formato de registro de captura de zarigeyas....30 Anexo 3. Claves de identificacin de especies de zarigeyas......31 Anexo 4. Identificacin de garrapatas machos y hembras...34 Anexo 5. Tcnicas de tincin41 Anexo 6. Elaboracin del Medio BSK II..43

Procedimiento metodolgico de obtencin y manipulacin de muestras biolgicas para el diagnstico de la enfermedad de Lyme.

II

Introduccin.

En aos recientes, las zoonosis, enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales, han sido objeto de mayor atencin en todo el mundo. Los cambios sociales y demogrficos tambin han intensificado la importancia de adquirir y difundir el conocimiento sobre las zoonosis. Por ejemplo, a medida que las personas irrumpen en ecosistemas con los cuales tenan poco contacto y cuya fauna quiz no sea bien conocida, aumenta su exposicin a los animales y a las infecciones que estos transmiten (Acha Pedro & Szyfres Boris, 2003). A nivel mundial destacan mas de 200 enfermedades zoonticas, una de ellas es la enfermedad de Lyme, esta es causada por una bacteria del grupo de las espiroquetas de nombre Borrelia burgdorferi la cual es transmitida por la mordedura de garrapatas del gnero Ixodes. La enfermedad de Lyme esta ampliamente distribuida en Europa, algunos pases de Asia, Estados Unidos, Canad, Australia, Chile y Brasil (Gordillo-Prez et al., 2003; Gordillo Prez & Solrzano Santos, 2010; Acha & Szyfres, 2003). En Mxico las zonas noreste y centro de la republica tienen alta prevalencia a esta enfermedad (Gordillo Prez & Solrzano Santos, 2010). En Tamaulipas, Nuevo len y el Distrito Federal se ha encontrado esta bacteria en bancos de sangre (Skinner Taylor et al., 2007; Garca Cruz et al., 2011), aunado a esto Gordillo Prez & Solrzano Santos (2010) mencionan la presencia de casos clnicos a enfermedad de Lyme adquirindose en zonas forestales cercanas a la Ciudad de Mxico. En la Pennsula de Yucatn se tiene identificado al vector, sin embargo, no hay registro alguno de enfermedad de Lyme (Garca Cruz et al., 2011), el ciclo de transmisin involucra animales silvestres como el venado cola blanca, ratones pertenecientes al gnero Peromyscus, ardillas grises, zarigeyas y mapaches, tambin animales domsticos como perros, equinos y bovinos, los cuales permanecen asintomticos, asimismo, Reyes-Novelo et al., (2011) menciona que a pesar de no haber algn reporte de borreliosis en humanos, se tiene conocimiento de este a partir de tres casos humanos confirmados por pruebas de laboratorio y estudios clnicos en la regin, los cuales afirma mediante una conversacin personal con Zavala-Castro en la cita antes descrita.

El diagnstico de esta enfermedad se basaba exclusivamente en el cuadro clnico, sobre todo en antecedentes de eritema crnico migratorio (ECM) y en datos epidemiolgicos. El diagnostico en animales es similar que en el humano. El tratamiento temprano con antibiticos acorta la duracin de ECM y puede prevenir o disminuir las manifestaciones tardas de la enfermedad (Skinner Taylor et al., 2007). Dado que los animales hospederos de esta enfermedad se presentan en la Pennsula de Yucatn, siendo el venado cola blanca el ms propenso a adquirirla y la importancia de las zarigeyas por ser de caractersticas peridomsticas lo que las hace tener contacto indirecto con las personas, particularidad que los hace organismos de importancia para la transmisin de esta enfermedad. Por ello, ste trabajo tiene la finalidad de describir los pasos que se tienen que seguir, desde la captura en estado silvestre y manipulacin de las muestras biolgicas, incluyendo el procesamiento de las garrapatas en laboratorio para verificar la presencia de Borrelia burgdorgeri para el diagnostico de la enfermedad de Lyme.

Objetivo. Describir los mtodos a emplear en el diagnostico y manipulacin de muestras biolgicas para la presencia de Borrelia Burgdorferi causante de la enfermedad de Lyme.

Metodologa 1. Seleccin del sitio de muestreo Realizar los muestreos en comunidades donde se hayan reportado casos de borreliosis, o en su defecto donde se hayan reportado casos no identificados con una sintomatologa similar (consultar Anexo 1). Dentro de las comunidades, colocar las trampas en el patio de las casas, esta rea corresponde al peridomicilio. Ver los apartados siguientes para sus criterios de colocacin. 2. Protocolo para trampeo y procesamiento de Zarigeyas 2. 1. Colocacin y control de trampas Equipo y materiales Cebo (carne en descomposicin y frutas). Guantes de goma gruesa Trampas Tomahawk Cinta o bandera deslindadora Bolso o mochila Bolsas de plstico para la recoleccin Jabn de manos Agua para lavar Tablilla para sostener papeles Lpices Papel Repelente de insectos Cinta adhesiva para rotular Marcadores indelebles Formularios para control de trampas Formularios de evaluacin de hbitat

Procedimiento Este procedimiento fue una modificacin de un protocolo de trampeo y tcnicas de muestreo para pequeos mamferos (Mills et al, 1998), adaptado para su aplicacin en Didelphis sp. en el domicilio y peridomicilio del estado de Yucatn. 2. 1. 1. Preparacin para la expedicin de trampeo 1. Con bastante anterioridad al inicio de la expedicin de trampeo, se debern obtener los permisos necesarios y los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales; esta informacin puede encontrarse en la Norma oficial Mexicana NOM-126SEMARNAT-2000, en la cual se establecen las especificaciones para la realizacin de actividades de colecta cientfica de material biolgico de especies de flora y fauna silvestres y otros recursos biolgicos en el territorio nacional. Habr que obtener anticipadamente informacin sobre especies en extincin o protegidas en el rea de trampeo y aprender a evitarlas o liberar a estos animales de la captura; Las especies endmicas o que poseen algn grado de amenaza se encuentran registradas en la NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010. Tambin se contactar a los propietarios de las tierras para obtener autorizacin para realizar el trampeo. 2. Preparar cebo. Se puede utilizar pescado o carne de animales domsticos en estado de descomposicin reciente, ya que al aumentar la intensidad del olor, aumenta la eficacia del atrayente, frutas como sanda o meln tambin pueden ser efectivos. 3. El primer da, cargar el o los vehculos de campo de acuerdo a la lista de control de carga. Todos los equipos debern estar bien sujetos para evitar que se daen por derrame o deslizamiento de lquidos. 2.1. 2. Colocacin de trampas 1. Habr que planificar la salida para llegar al sitio de captura, colocar y cebar todas las trampas antes de que oscurezca. Si las trampas se colocan varias horas antes de la puesta del sol, o se dejan abiertas durante el da, habr que revisarlas frecuentemente, especialmente en poca de calor, para la captura de animales diurnos. 2. Colocar trampas, a intervalos de 250 m cada una, formando una cuadrcula que cubra la zona muestrear.

3. Al colocar cada trampa, se controlar el mecanismo disparador para comprobar su ajuste y sensibilidad. 4. Colocar el cebo. Debe estar despus del mecanismo disparador con el fin de atrapar al animal, pero no cerca de las paredes para evitar que la zarigeya u otro animal pueda extraer el alimento con sus patas. 5. Cuando sea posible, colocar las trampas cerca de pilas de lea, troncos cados, madrigueras, autos abandonados u otros lugares que provean refugio, en caso de no contar con ninguno, camuflar la trampa (Figura 1). Cuando se colocan trampas dentro o al lado de las viviendas, se pondrn paralelamente a las paredes u otras superficies verticales, prestando especial atencin a las reas donde haya evidencias de actividad de zarigeyas. 6. Colocar cada lnea de trampas en un solo tipo de hbitat (casa, alambrado, pastura, forestacin de pinos). 7. En estaciones calurosas, evitar colocar las trampas de manera que queden expuestas al sol directo. Si esto es imposible, las trampas pueden cubrirse con una lona. 8. Completar el formulario de evaluacin del hbitat para cada lnea de trampas o grupo de lneas de trampas en un hbitat distinto. Cuando est disponible, usar un sistema de posicin global (GPS, del ingls Global Positioning System) para registrar la latitud y longitud exactas. 9. Si es necesario conocer el sitio exacto de captura de una zarigeya especfico, es bueno tener un esquema del sitio de trampeo y de la ubicacin de las trampas. La ubicacin del sitio de trampeo puede registrarse sobre un mapa topogrfico local usando, si es posible, un GPS.

Figura 1. Colocacin y camuflaje de una trampa Tomahawk. (Foto: A. Vail). 2. 1. 3. Recoleccin de zarigeyas capturadas 1. Las trampas debern revisarse lo ms temprano posible en la maana, especialmente en tiempo clido o cuando llueve. 2. Los miembros del equipo debern usar ropa protectora, incluso pantalones largos y camisa de manga larga, medias, zapatos pesados y guantes de goma gruesa. Cada persona deber llevar un marcador indeleble y papel para tomar notas. 3. Cada miembro del equipo de campo deber controlar las trampas que l o ella haya colocado para obtener una mayor eficiencia y reducir la prdida de trampas. 4. Revisar cada trampa para ver si hubo captura o si fue visitada. Si una trampa parece haber sido visitada, pero no activada (contiene orina, materia fecal o el cebo fue ingerido), colocar la trampa en doble bolsa plstica para ser descontaminada y verificar su funcionamiento adecuado. Remplazar la trampa por una limpia.

5. Si no hay captura o no hay evidencia de visita, controlar el ajuste de la trampa y volverla a poner en la lnea correspondiente. Si se captura una especie distinta de la que se buscaba, cuidadosamente liberar al animal en el sitio de captura y luego volver a colocar la trampa o colocarla en una bolsa para descontaminacin. 6. Si la trampa contiene una especie de inters, proceder al apartado 2. 2. 7. Al mismo tiempo que se realiza el proceso anteriormente descrito, llenar el formulario de captura segn se vayan obteniendo datos de colecta (consultar Anexo 2). Los datos a registrar, son: Tipo de clima. Tipo de vegetacin. Localizacin. Coordenadas. Nmero de transecto. Fecha. Nmero de trampa. Colocacin: Hora en que fue colocada la trampa. Revisin: Hora en que fue revisada la trampa. Estadio: Si el ejemplar capturado fue juvenil, adulto o subadulto, indicar sexo. Especie: Si fue Didelphis Virginianus, Didelphis marsupialis o Philander opossum (vase Anexo 3 para identificacin de especie). Otro: si se captur otra especie, indicar cul. Marca: Nmero de marca del ejemplar. Recaptura: Si el ejemplar fue recapturado, colocar nmero de marca. Ectoparsitos: Si posea, y cules. Observaciones: cualquier peculiaridad en el ejemplar.

8. Si el xito de trampeo fue razonable (10% o mejor), las trampas pueden dejarse en el mismo lugar por una segunda noche; en caso contrario, pueden colocarse en otro lugar. NOTA: Si las trampas se dejarn en el lugar por una segunda noche, debern mantenerse cerradas durante el da o revisarse peridicamente (al medioda y antes de que oscurezca o ms frecuentemente si las trampas estn expuestas al sol o si hace calor) por si han capturado animales diurnos. Si es posible, estos animales debern ser

procesados inmediatamente. De lo contrario, se les puede proveer comida hmeda, guardarlos durante la noche (al aire libre, lejos de la gente) y procesarlos al da siguiente. 2. 2. Recoleccin de ectoparsitos en Zarigeyas. La extraccin de muestras se realiza a partir de las garrapatas que los parasitan. Para extraer las garrapatas es necesario tener presente los hbitos de las diferentes especies y grupos. Debe procurarse en cuanto sea posible recolectarlas en sus distintos estadios. De igual forma es conveniente matarlas antes de que mueran contradas. Material requerido: Charola blanca Mesa desplegable Pinza entomolgica Alcohol al 75% ter Algodn Guantes de ltex Frascos Etiquetas Plumn 1 persona de auxiliar

Procedimiento Procedimiento editado y tomado del libro, Tcnicas diagnsticas en parasitologa veterinaria, Rodrguez Vivas & Cob

Galera, 2005: 1. Colocar la mesa desplegable en un rea despejada que no dificulte la manipulacin, colocar encima la

charola para el retiro de ectoparsitos. Si el patio no cuenta con un lugar

Figura 2. Sujecin de un Zarigeya. (Foto: F. Abeytia).

sombreado, techar el sitio de procesamiento con una lona. 2. Colocarse guantes. 3. El auxiliar tambin deber ponerse guantes. Se requiere la presencia de otra persona, para ayudar en la manipulacin del animal mientras ste es revisado para presencia de garrapatas. 4. Sujetar a la zarigeya del cuello (Fig. 2), y retirarlo de la trampa. Lavar la trampa. 5. Se coloca la zarigeya sobre la charola blanca, se recomienda someter agarrando del cuello y parte de la cabeza con una mano y la otra mano colocarla a la altura de la cintura plvica, para evitar que el marsupial se levante. 6. Al hacer la recoleccin de las garrapatas se tendr especial cuidado en hacer una inspeccin de todas las regiones del cuerpo del animal. 7. Se impregna con ter un pedazo de algodn. 8. Se pasa por todo el cuerpo del animal en forma contraria del crecimiento del pelo, se pone mucha atencin a orejas y patas, ya que stas son las partes preferidas por los parsitos. Esto se hace con la finalidad de que las garrapatas se desprendan del hospedero. Se recomienda hacer la revisin de dos a tres veces. 9. Localizados los parsitos, si estn caminando se les retira sin problema alguno del animal. En caso que el parasito se encuentre fijado fuertemente a la piel, no se debe arrancar bruscamente. De hacerlo se romperan las piezas bucales, stas se quedan fijadas o separadas del cuerpo, o se desprende un pedazo de piel. En todos estos casos, los ejemplares recolectados resultan defectuosos e impropios para su estudio. En esta situacin se recomienda se auxilie de la pinza entomolgica, oprimiendo suavemente el cuerpo de la garrapata, se ejerce pequeos estirones de las patas, y movimientos en todos los sentidos para estresarlos y que voluntariamente se desprendan de la zarigeya. Si la garrapata de desprendi con ayuda del paso 7 haga caso omiso del paso 8, y pase directamente al paso 9. 10. Se recomienda deje caer una o dos gotas de salol, bencina, gasolina, cloroformo o ter en el punto de la piel donde se encuentren fijadas las garrapatas esto obliga a que el animal retraiga sus piezas bucales y se desprenda. 11. Desprendidas las garrapatas y retiradas de la zarigeya, se colocan en frascos que contengan alcohol. 12. A los frascos se les colocan las etiquetas 13. Las etiquetas tendrn anotado fecha y alguna clave para su fcil estudio. 10

2. 3. Liberacin de zarigeyas capturadas 1. Antes de manipularlo, el investigador debe cerciorarse de llevar equipado todo el equipo de seguridad. 2. Sujetar a la zarigeya del cuello (Fig. 2) y soltarlo en el sitio de captura o cerca de l. Si se desconfa del animal, colocarlo de nuevo en la trampa y estimular su escape desde la parte cerrada de sta (Fig. 3).

Figura 3. Liberacin incitada de ejemplar de zarigeya contenida en una trampa Tomahawk. (Tomada de www.anam.gob.pa).

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3. Preparacin y diagnostico de la muestra biolgica

Equipos y materiales para preparacin y diagnostico de muestra: Equipos Microscopio Jarra de Anaerobiosis Cmar de electroforesis Transluminador Jarra de Anaerobiosis Centrifuga Materiales Caja de Petri Reactivos Suero Fisiolgico estril diluciones al 35%, 70%, 95% Agua destilada

Aguja hipodermica esteril

Pinza esteril Portaobjetos Cubreobjetos Mortero esteril Tubos de plstico Tubos de vidrio de tapn de rosca Tubos de Microcentrifuga (Tubos Eppendorf) Pipeta Pasteur estril. Guantes Lentes Mascarilla de seguridad Bata de laboratorio

Tampn fosfato salino pH 8.2 Suero Inactivado de conejo Rifampicina Ciprofloxacino 5- Fluorocitocina Proteinasa K Te (1mM Tris - CIH pH 8: 0.5mM EDTA pH 7.5) Fenol- Cloroformo - isomilalcohol 25:24:1 Acetato amonico Bromuro de etilo TBE (Trisborato (EDTA)) Dodecilsulfato sdico Etanol Gel de Agarosa al 1% tampn 10 mM Tris-ClH pH 8,5 250 mM KCl2 2,5 mM MgCl2 0,2 mM de dNTPs 1 l del iniciador Bb1 (100 pmol) iniciador Bb2 (100 pmol) 12

3.1 Preparacin de garrapatas

1. Separar machos de hembras (vase Anexo 4 para su identificacin). 2. Se separan varios lotes en los cuales deben de haber el mismo nmero de garrapatas, respecto al nmero total de garrapatas colectadas. 3. Previamente a la diseccin y macerado de las garrapatas, descontaminar mediante una solucin alcohlica diluida en suero fisiolgico estril, introducindose sucesivamente y durante un minuto en diluciones al 95%, 70% y 35%. 4. Ahogar mediante inmersin en agua destilada estril durante 5 horas. 5. Lavar en tampn fosfato salino pH 8.2 3.2 Diseccin

Hembras: 1. Se colocan en Placa de Petri. 2. Realizar una incisin en el contorno del escudo con bistur o mediante aguja hipodrmica estril. Retirndose el mismo por traccin mediante unas pinzas estriles. 3. Se obtendrn dos formaciones arracimadas y blanquecinas correspondientes a las glndulas salivares, y un sistema tubular doble y negruzco identificado como los intestinos medios 4. Emplear este par de estructuras dobles para la preparacin de las diferentes extensiones o para el cultivo bacteriolgico, que en este caso se realiza de modo inmediato a su obtencin, debido a la labilidad de dichas estructuras. Machos: 5. En el caso de los individuos machos se realiza la seccin de la porcin anterior y medio anterior del escudo ya que contiene las glndulas salivales y los intestinos medios. Este procedimiento de corte es requerido por la extrema dificultad de una precisa diseccin debido al pequeo tamao del macho y por abarcar el duro escudo en todo el dorso del mismo. Las formaciones obtenidas son inmediatamente procesadas, tanto para la realizacin de tinciones como para cultivos bacteriolgicos.

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3.3 Maceracin

1. Lisar mediante traccin mecnica en mortero estril, debido a su dura consistencia. 2. Con el producto resultante, recoger mediante la tcnica de lavado de mortero con 2ml de suero fisiolgico estril, se recoge con tubos estriles de plstico y conservados a +4C hasta su procesamiento, emplendose tanto para la realizacin de las distintas extensiones en portaobjetos como para el cultivo en medio especfico. 3.4 Examen microscpico de macerados.

1. En cada lote y con una porcin del producto diluido y homogeneizado de los macerados, proceder a la realizacin de extensiones en portaobjetos (de 5 a 10 portaobjetos) colocando una pequea gota de la preparacin en el centro de estos. 2. Con las estructuras resultantes de las disecciones, y tras obtener una emulsin sanguinolenta del contenido de las mismas, se realiza igual nmero de extensiones. 3. Los portaobjetos con las extensiones se secan a temperatura ambiente, para posteriormente realizar la fijacin y tincin segn los distintos mtodos empleados. Se emplean cinco procedimientos distintos de tincin en todas las preparaciones con el fin de garantizar una adecuada observacin microscpica.

NOTA: Los portaobjetos para tincin simple con azul de metileno y tincin de Gram se fijan mediante calor. (Vase Anexo 5, Tcnicas de tincin). En todos los casos se realiza la tincin de acuerdo a los parmetros convencionales. El examen microscpico de todas las preparaciones, se efecta mediante microscopa ptica a 1000X.

3.5 Cultivo en medio BSK II

1. Posteriormente realizar un cultivo en Medio BSK II (ANEXO III) con una parte de los macerados para la realizacin de los cultivos bacteriolgicos en medio lquido de Barbour- Stoenner-Kelly modificado (medio BSK II). 2. Mediante condiciones de esterilidad, preparar tubos de vidrio de tapn de rosca con 6ml de medio BSK II. Se inoculan con 1ml de muestra. 3. Despus de 4 das de incubacin a 37C bajo condiciones de microaerofilia en jarra de anarerobiosis. Los cultivos primarios son suplementados con suero inactivado de 14

conejo al 6%

para continuar su incubacin en las condiciones previstas

anteriormente. (vase Anexo 6). 4. A la semana realizar subcultivos mediante la transferencia de 1ml de cultivo primario a un nuevo tubo con 6ml de medio BSK II suplementando con suero de conejo (6%) y conteniendo rifampicina (40 g/mL); ciprofloxacino (0,4 g/mL) y 5-fluorocitosina (230 g/mL). 5. A partir de estos primeros subcultivos, realizar nuevos cultivos secuencialmente cada semana, en las mismas condiciones referidas, hasta completar un periodo de incubacin de dos meses. Adems, debido al lento crecimiento de Borrelia sp, el cultivo primario debe ser subcultivado a los 15 y 30 das, por lo que cada una de las muestras genera un total de 10 viales de cultivo (figura 4) como control de crecimiento se utiliza en todos los ensayos la cepa B31 de B. burgdorferi (ATCC 35210). Para determinar la presencia del microorganismo en cada uno de los cultivos, se efecta semanalmente una evaluacin microscpica de una muestra homogeneizada de los mismos mediante las tinciones diferenciales referidas previamente.

Figura 4. Procedimiento de cultivo de fracciones de garrapatas en el medio BSK II

3.6 Extraccin de ADN: Amplificacin de ADN especfico (nested, PCR).

1. Posteriormente aplicar la Tcnica de PCR (nested, PCR), para analizar la presencia de ADN de Borrelia burgdorferi, en las garrapatas Ixdidos. 2. Realizar lotes de un nmero variable de individuos segn su tamao (lotes de 3, 4, 6, 8 y hasta 30 individuos cada uno) a fin de garantizar la presencia de ADN. 3. Para extraer el material genmico se lavan y preparan los ejemplares mediante el procedimiento antes mencionado de maceracin. 15

3.7 Obtencin de cidos nucleicos

1. Distribuir cada lote en tubos de microcentrifuga (Eppendorff) y descontaminarlo empleando una solucin alcohlica diluida en suero fisiolgico estril, introducindose sucesivamente y durante un minuto en diluciones al 95%, 70% y 35%. 2. Posteriormente se lavan mediante inmersin en tampn salino pH 8.2, durante 5 horas. 3. Dejarlo secar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 4. Lisar las garrapatas adicionando a cada tubo Eppendorff 100 l de tampn TE (1 mM Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH 7,5); 20 l de dodecil sulfato sdico (10% p/v) y 200 l de proteinasa K de una solucin 200 g/mL procedindose a la incubacin a 56C en bao de agua durante 24 horas. 5. Completar la lisis de los caros mediante el maceramiento en el tubo Eppendorf con una pipeta Pasteur estril, realizar movimientos repetidos de aplastado durante 1015minutos, con el fin de romper todas las estructuras somticas de la garrapata. 6. Al material obtenido adicionar 100 l de TE (1 mM Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH 7,5). 7. Realizar 2 extracciones con fenol-cloroformo-isomilalcohol 25:24:1. 8. Al sobrenadante recuperado adicionar 125 l de 7,5 M acetato amnico incubar en hielo durante 30 minutos. 9. Precipitar el ADN presente mediante la adicin de 2 volmenes de etanol absoluto a 20C e incubar a -40C durante 1 hora. 10. Recoger mediante centrifugacin a 13 000 rpm durante 15 minutos. 11. Lavar el precipitado con etanol al 70% y volver a centrifugar a 13 000 rpm durante 15 minutos. 12. Secar al aire durante 45-60 minutos. 13. En caso de comprobar la existencia de un sedimento en el tubo Eppendorf resuspender en 50 l de TE (1 mM Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH 7,5). 14. Para obtener ADN de la cepa control de B. burgdorferi (ATCC 35210) seguir el mismo procedimiento descrito anteriormente, utilizar la masa bacteriana obtenida en medio BSK II tras centrifugacin de 10 ml de medio lquido a 5.000 rpm y lavar el sedimento con 5 ml de TE. El sedimento se debe resuspender en 500 l de 15. tampn de lisis, incubar una hora a 37C.

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16. Evaluar todas las extracciones mediante electroforesis horizontal de un volumen de 20 l de muestra en gel de agarosa 1% y tampn 1X de TBE (Tris borato EDTA) teidos con una solucin de Bromuro de etidio (5 g/mL). 17. Visualizar en transluminador, con el fin de conocer la presencia y calidad del ADN obtenido.

3.8 Amplificacin y deteccin del ADN especifico de B. burgdorferi.

1. Amplificar mediante nested-PCR en los lisados de garrapatas, por su mayor sensibilidad. 2. Utilizar dos genes diferentes para su amplificacin, determinar una regin especifica dentro del gen que codifica la lipoprotena externa de membrana OspA y una secuencia especfica del gen que codifica la protena denominada flagelina. 3. Para la regin del gen OspA, los iniciadores que se emplean fueron los descritos por Guttman et al. (1996) siendo para la primera amplificacin los iniciadores Bb1 (23 mer 5-AAA AAA TAT TTA TTG GGA ATA GG- 3) y Bb2 (29 mer 5-GTT TTT TTG CTG TTT ACA CTA ATT GTT AA- 3) cuyo producto es un fragmento de 702-bp. Los iniciadores para la segunda amplificacin fueron Bb3 (16 mer 5-GGA GTA CTT GAA GGC G- 3) y Bb4 (18 mer 5-GCT TAA AGT AAC AGT TCC- 3) cuyo producto es un fragmento de 345-bp. En la tabla 1 se muestra la secuencia de bases del gen OspA y las posiciones de cada uno de los iniciadores sealados, con la regin de amplificacin.

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Tabla 1. Secuencia del gen OspA de B. burgdoferi, y localizacin de oligonucletidos cebadores.

4. Para la primera amplificacin se debe determinar un volumen final de 50 l, utilizar una mezcla de reaccin para cada una de las muestras compuesta por: 15 l de agua destilada desionizada; 5 l del tampn 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 l de 2,5 mM MgCl2, 1 l de una solucin 0,2 mM de dNTPs; 1 l del iniciador Bb1 (100 pmol) y 1 l del iniciador Bb2 (100 pmol) aadindose a la mezcla 20 l de ADN total y 0,5U (2 l) de Taq polimerasa. 5. Del producto de la primera amplificacin tomar 20 l para realizar la siguiente amplificacin para un volumen final de 50 l. 6. Utilizar una mezcla de reaccin para cada una de las muestras compuesta por: 15 l de agua destilada desionizada; 5 l tampn de la enzima Taq polimerasa 10 mM TrisClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 l de 2,5 mM MgCl2; 1 l de una solucin 0,2 mM de dNTPs; 1 l del iniciador Bb3 (100 pmol) y 1 l del iniciador Bb4 (100 pmol) 18

aadindose a la mezcla 20 l de ADN total y 0,5 U (2 l) de Taq polimerasa. las reacciones de amplificacin de las muestras y controles se realizan en un termociclador. 7. Los parmetros empleados para dichas reacciones se muestran en la tabla 2. 8. De acuerdo a lo propuesto por Lebech et al. (1993) y en paralelo en todas las muestras problema realizar un control interno de amplificacin, aadir un volumen de ADN de la cepa de B. burgdorferi B31, de modo que a 20 l de cada una de las mismas se adicionaron 15 l de ADN control a una dilucin 1:1000, mantenindose el volumen final de 50 l por sustitucin del volumen de agua. 9. El objeto de este control interno fue la determinacin del papel de posibles inhibidores presentes en los lisados de garrapatas. 10. Adems, en todos los ensayos de amplificacin se utilizar una muestra de ADN de la cepa B31 a igual dilucin. 11. Para la electroforesis de los amplificados se emplear geles de 2% de agarosa (BioRad 162-0125) en tampn 1X TBE pH 7,5 y un voltaje de 4,5 V/cm durante la primera media hora, tras la cual se increment a 6 V/cm aplicados durante 60 min. 12. Los geles se visualizan mediante el transiluminador referido previamente y fotografiados empleando el sistema Gelprinter (TDI) 13. Como marcadores de peso molecular se utiliz un patrn con 15 bandas de 8,5 a 0,35-kbp (DNA molecular weight VII Boehringer-Mannheim) y un patrn secuencial de 100 a 1000-bp (DNA molecular weight 100-bp ladder Boehringer-Mannheim).

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Tabla 2. Condiciones de amplificacin dela secuencia del gen OspA

14. Para la amplificacin de la secuencia gnica que codifica la protena flagelar de B. burgdorferi emplear los iniciadores descritos por Lebech et al. (1993). As, en la primera amplificacin se utilizaron los iniciadores F1 (21 mer) 5-ATT AAC GCT GCT AAT CTT AGT3 y F3 (20 mer) 5- GTA CTA TTC TTT ATA GAT TC-3 que amplifican un producto de 791-bp. Para la segunda amplificacin se utilizaron los iniciadores F6 (25 mer) 5-TTC AGG GTC TCA AGC GTC TTG GAC T-3 y F8 (25 mer) 5-GCA TTT TCA ATT TTA GCA AGT GAT G-3, que produce un fragmento de 275-bp (Tabla 3). 15. Para la primera amplificacin se determin un volumen final de 50 l, utilizando una mezcla de reaccin para cada una de las muestras compuesta por: 15 l de agua destilada desionizada; 5 l del tampn 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 l de 2,5 mM MgCl2; 1 l de una solucin 0,2 mM de dNTPs; 1 l del iniciador F1 (100 pmol) y 1l del iniciador F2 (100 pmol) aadindose a la mezcla 20l de ADN total y 0,5U (2l) de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim 1 647 679). 20

16. Del producto de la primera amplificacin se tomaron 15 l para realizar la siguiente amplificacin para un volumen final de 50 l, utilizando una mezcla de reaccin para cada una de las muestras compuesta por: 20 l de agua destilada desionizada; 5 l tampn de la enzima Taq polimerasa 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 l de 2,5 mM MgCl2, 1 l de una solucin 0,2 mM de dNTPs; 1 l del iniciador Bb3 (100 pmol) y 1 l del iniciador Bb4 (100 pmol) (TIB MOLBIOL. Syntheselabor) aadindose a la mezcla 20 l de ADN total y 0,5 U (2l) de Taq polimerasa. Las reacciones de amplificacin se realizaron en el termociclador indicado y empleando los parmetros para dichas reacciones que se muestran en la Tabla 3.

NOTA: Las condiciones de electroforesis y marcadores de peso molecular empleados fueron las mismas que las referidas previamente para el estudio de la lipoprotena OspA.

Tabla 3. Condiciones de las reacciones de amplificacin de la secuencia del gen de la flagelina.

17. Como en las amplificaciones de gen OspA, las muestras problemas fueron analizadas por duplicado, conteniendo una de ellas un control interno compuesto por ADN obtenido de la cepa de B. burgdorferi B31, de modo que a los 20 l de cada una de las muestras, se adicionaron 15 l de ADN control a una dilucin 1:1000, mantenindose el volumen final de 50 l por sustitucin del volumen de agua.

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Tabla 4. - Secuencia del gen de la flagelina de B. burgdorferi y localizacin de oligonucletidos cebadores utilizados.

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Nivel de bioseguridad requerido para el manejo de muestras. Bioseguridad Nivel 2. (Tomado y editado de Manual de Procedimientos de Tcnicas para el Diagnostico del Dengue. Organizacin Panamericana de la Salud 2002). Las prcticas de bioseguridad del nivel 2 son aplicables a laboratorios clnicos, de diagnstico, de docencia y en dependencias en las cuales se manipulan microorganismos de amplio espectro, de moderado riesgo, presentes en la comunidad y asociados a enfermedades humanas de diversa severidad, adems de que: a. El personal de laboratorio deber poseer entrenamiento especifico en el manejo de agentes patgenos, bajo la supervisin directa de un investigador competente. b. El acceso al laboratorio estar limitado durante las horas laborables. c. Debern tomarse precauciones extremas con el material cortante contaminado. d. Todo procedimiento que implique formacin de aerosoles infecciosos o salpicaduras deber ser conducido en cabinas biolgicas de seguridad o cualquier otro equipo de contencin fsica Los procedimientos deben estar escritos y colocados en un lugar visible. El personal del laboratorio debe conocer y entender claramente todas estas normas, y lo ms importante es seguirlas en cada momento. Una persona del laboratorio debe ser asignada para vigilar el cumplimiento de las normas de bioseguridad y para dirigir las acciones a seguir ante situaciones de accidentes, como exposicin a algn agente patgeno. Los trabajadores del laboratorio deben conocer la forma de transmisin de los agentes con los que trabajan y los peligros de la manipulacin de sustancias qumicas y biolgicas para evitar y disminuir cualquier posibilidad de contagio. Se debe asumir que todo con lo que se trabaja es potencialmente peligroso y mortal y que la seguridad es responsabilidad de cada persona en el laboratorio. Medidas de seguridad Limitar el acceso de personas ajenas al laboratorio. Descontaminar el rea de trabajo antes y despus de cada proceso tcnico.

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No comer, tomar, fumar y aplicarse cosmticos dentro del laboratorio. Las comidas y bebidas deben siempre estar fuera del laboratorio. La institucin debe proveer lugares adecuados para estos fines.

No pipetear con la boca. Utilizar guantes para trabajar con todo tipo de muestras potencialmente infectadas. Utilizar batas, uniforme u otras prendas apropiadas. No llevar la ropa de trabajo a otras reas fuera del laboratorio. Las jeringas y agujas deben ser desechadas en un recipiente de polietileno slido. Lavarse las manos despus de manipular material infeccioso o animales. Evitar la formacin de aerosoles. El trabajo con material infeccioso debe realizarse en flujo laminar o gabinete de seguridad. Los derrames deben limpiarse rpidamente cubrindolos con un pedazo de papel mojado en solucin desinfectante (hipoclorito de sodio al 0.1%). Las centrifugas deben estar equipadas con mecanismos de seguridad para que el material infeccioso no se disemine. Usar respiradores o mascaras en los cuartos donde se mantienen animales inoculados. Reportar derrames o accidentes. A las personas expuestas, se les debe dar un seguimiento y tratamiento previo si es necesario y este est disponible. Debe existir un manual de prcticas de seguridad en cada laboratorio, las personas deben ser adiestradas de acuerdo a este manual. Las puestas de laboratorio deben estar cerradas. Deben haber seales indicando el potencial peligro de contaminacin a la entrada del laboratorio y la indicacin de acceso restringido. El estado de salud debe checarse peridicamente.

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Referencias. Acha Pedro & Szyfres Boris. (2003) Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Vol. I Bacteriosis y Micosis. Tercera Edicin. Organizacin Panamericana de la Salud. Washington, DC. E.U.A. Pp. 94-99. Escudero Nieto, R, (1993) Diagnostico de laboratorio de la infeccin por Borrelia burgdoferi. Universidad complutense de Madrid. Departamento de Microbiologa. Garca Cruz, E., Guerrero Gonzlez, J., Mendoza Noguez, A., Cuevas Bucio, J., Garca Cruz, N. (2011) Enfermedad de Lyme reporte de caso. Medicina Interna de Mxico. Vol. 27. Nm. 1. Pp. 86-90. Gordillo-Prez, G., Torres, J., Solrzano-Santos, F., Garduo-Bautista, V., Tapia-Conyer, R., Muos, O. (2003) Estudio seroepidemiolgico de borreliosis de Lyme en la ciudad de Mxico y el noreste de la Republica Mexicana. Salud publica de Mxico / Vol. 45, No. 5. Pp. 351-355. Gordillo Prez, G. & Solrzano Santos, F. (2010) Enfermedad de Lyme. Experiencia en nios mexicanos. Bol Med Hosp Infant Mex. Vol. 67. Pp. 164-176. Guttman D, Wang P, Wang I, Bosler E, Luft B and Dykhuizen. Mltiple infections of Ixodes scapularis Tics by Borrelia burgdorferi as revelated by single strand conformation polymorphism analysis. Clinical Microbiol 1996; 34: 652 656. Lebech A-M, Clemmensen O, Hansen K. Comparison of in vitro culture, immunohistochemical staining, and PCR for detection of Borrelia burgdorferi in tissue from experimentally infected animals. J Med Microbiol 1993; 38: 38-43. Martnez, J. (1997). Presencia de anticuerpos para diferentes enfermedades del venado y otros rumiantes, en poblaciones de venado cola blanca texanus (Odcoileus virginianus texanus). Universidad Autnoma de Nuevo Len, Facultad de ciencias forestales. PP: 50. Mxico. Mills, J., Childs, J., Ksiazek, T., y Peters, C. (1998). Mtodos para trampeo y muestreo de pequeos mamferos para estudios virolgicos. Departamento de Salud y Servicios Humanos Servicio de Salud Pblica, Organizacin Panamericana de la Salud, Oficina Sanitaria Panamericana y Oficina Regional de la Organizacin Mundial de la Salud. Pp. 15-32. Navarro Garca, A., (2005) Borreliosis de lyme: estudio de posibles vectores Ixdidos y evaluacin de mtodos de diagnstico microbiolgico. Universidad de Valencia. Departamento de microbiologa y ecologa. Reid, F. (2009). Mammals of Central America & Southeast Mexico. 2 Edicin. Oxford University Press, Inc. Pp: 43-46. United States of America.

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Reyes-Novelo, E., Ruiz-Pia, H., Escobedo-Ortegn, J., Rodrguez-Vivas, I., BolioGonzlez, M., Polanco-Rodrguez, A., Manrique-Saide, P. (2011) Situacin actual y perspectivas para el estudio de las enfermedades zoonticas emergentes, reemergentes y olvidadas en la Pennsula de Yucatn, Mxico. Tropical and Subtropical Agroecosystems, Vol. 14. Pp. 35-54. Rodrguez Vivas, R. & Cob Galera, L. (2005) Tcnicas diagnsticas en parasitologa veterinaria. Segunda Edicin. Universidad Autnoma de Yucatn. Mxico. Pp. 126128. Skinner Taylor, C., Flores Gonzles, M., Esquivel Valerio, J., Salinas Melndez, J., Salinas Palacios, C., Rodrguez Amado, J., Garza Elizondo, M. (2007) Evidencia de la enfermedad de Lyme en una poblacin de alto riesgo del noreste de Mxico. Medicina Universitaria. Vol. 9. Nm. 36. Pp. 105-111.

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Anexos

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Anexo 1. Descripcin de la enfermedad de Lyme. La enfermedad en el hombre. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001). La caracterstica lesin cutnea, el eritema crnico migratorio (ECM), aparece de unos 3 a 20 das despus de la picadura de la garrapata. Esta lesin se inicia por una mcula o ppula roja que se va extendiendo. Los bordes estn bien marcados, la lesin central palidece y se forma un eritema circinado
(*1)

. El eritema puede ser recurrente, con

aparicin de lesiones secundarias en otras partes del cuerpo. Las lesiones cutneas pueden estar acompaadas durante varias semanas de malestar, fiebre, cefalalgia, rigidez de la nuca, mialgias, artralgias o linfoadenopata. El ECM constituye el primer estadio o fase de la enfermedad, que dura unas semanas pero puede recurrir. En el segundo estadio, transcurridas unas semanas o meses y con la diseminacin del agente, algunos pacientes manifiestan mltiples ECM, meningoencefalitis, neuropatas,

miocarditis, taquicardia atrioventricular. Los ataques de artritis de las grandes articulaciones pueden presentarse y repetirse durante varios aos, tomando a veces un curso crnico. Meses o aos despus puede instalarse el tercer estadio, que se da en algunos pacientes y se manifiesta a veces por acrodermatitis crnica atrfica y alteraciones neurolgicas y articulares. La enfermedad en los animales. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001). No se conoce el efecto de la infeccin por la espiroqueta en animales silvestres, pero es posible que se transmita de forma asintomtica. El sntoma predominante en el perro es una cojera debida a artritis en diferentes articulaciones, que puede ser migratoria. Las artralgias se acompaan muchas veces de fiebre, anorexia, fatiga y linfadenitis. La artritis generalmente es temporal, pero puede volverse crnica. En los equinos infectados se han observado diferentes sntomas como artritis, encefalitis, uveitis, dermatitis, y edema de los miembros, as como la muerte de potrillos asociada con la infeccin natural de yeguas preadas. Sin embargo, no se confirm la infeccin en ninguno de los casos descritos. En los bovinos tambin se asoci la infeccin por B. burgdorferi con la presencia de cojera
(*2)

. En un estudio serolgico por Western Blot, ELISA e inmunoflorescencia indirecta 28

realizado en 27 vacas lecheras de 17 rebaos de Minnesota y Wisconsin, se encontr que los ttulos serolgicos altos estaban asociados con artritis. Control. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001). Las nicas medidas de prevencin de la enfermedad consisten en evitar las reas endmicas y las picaduras de garrapatas. Las personas que se adentran en los focos naturales deben usar calzado y ropa protectora, que no siempre es fcil de imponer; los repelentes podran dar cierta proteccin. Conviene inspeccionar el cuerpo con frecuencia y eliminar las garrapatas adheridas mediante una traccin suave con una pieza que se aplica lo mas cercana posible de la piel. Es recomendable usar guantes durante esta operacin. Los perros deben inspeccionarse con frecuencia para eliminar las garrapatas; se debe proceder con el mismo cuidado que para el hombre. El uso de acaricidas en forma de polvo o collares es una buena medida preventiva. Se dispone actualmente de una vacuna comercial inactivada para perros, que se administra en 2 dosis con 3 semanas de intervalo y luego anualmente

(*1)

Circinado: se dice de las lesiones elementales de la piel cuando estn agrupadas de tal

forma que dibujan fragmentos de crculo cuyo centro est relativamente ileso.
(*2)

Cojera: Defecto, lesin o enfermedad que impide andar con regularidad. 29

Anexo 2. Formato de registro de captura de zarigeyas.

Procedimiento metodolgico de obtencin y manipulacin de muestras biolgicas para el diagnstico de la enfermedad de Lime.
Tabla de captura de zarigeyas Tipo de clima: Tipo de vegetacin: Localizacin:________________________ Coordenadas:_____________________________Nmero de transecto:______________________Fecha:______________________________ Nmero de trampa Colocacin Revisin Estadio Especie Otro Marca Recaptura Ectoparsitos Observaciones

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Anexo 3. Claves de identificacin de especies de zarigeyas (Reid, 2009). Didelphis marsupialis Nombre comn: Zarigeya comn, Tlacuache comn. HB 263-430 (13), T 295-450 (14), HF 42-69. E 45-60, Wt 0.6-2.4 kg (3 lb). Descripcin: De aspecto grande y desaliado. Parte dorsal negruzca, griscea y, en menor grado, blancuzca, parte ventral amarilla, anaranjada o crema. Pelaje tupido y grueso con base blanca, orejas sin pelo y completamente negras en los adultos. Cabeza plida con anillos oculares estrechos de color negro y una lnea central; mejillas color crema y amarillo anaranjado. Brillo ocular rojizo brillante. Todos los bigotes largos en el hocico y las mejillas son de color negro, la cola es ligeramente ms larga que la cabeza y el cuello; su base posee el mismo pelaje que el resto del cuerpo, y la porcin desnuda se compone de 1/3 de color negro, y un 2/3 blanco, a veces la misma proporcin de colores o completamente negra. Las piernas y las patas son negras. El cuarto dedo de las patas traseras es ms largo que el segundo y el tercero. Fuerte olor corporal (Figura 1). Especies similares: El Tlacuache de Virginia (Didelphis virginiana) tiene mejillas completamente blancas y algunos bigotes largos de color blanco en el hocico y las mejillas, generalmente su cola tiene una longitud menor a la de la cabeza y la cola; la porcin negra de la cola generalmente es ms larga que la blanca.

Delantera

Trasera

Figura 1. Didelphis marsupialis.

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Didelphis viginiana Nombre comn: Zarigeya comn, Tlacuache comn. HB 374-451 (16), T 282-370 (13), HF 50-65, E 49-63, Wt 1.1-2.5 kg (3.5 lb). Descripcin: De aspecto grande y desaliado, con una cola relativamente corta. Parte dorsal gris o blancuzca, raramente negruzco. Parte ventral blanca, crema o amarillenta. Pelo largo, tupido y grueso con base blanca. Orejas desnudas y negras, a veces con puntas blancas estrechas. Cara de color blanco con anillos oculares estrechos de color negro y una lnea central. Mejillas completamente blancas, bigotes largos en el hocico y mejillas color blanco y negro. Cola de la misma o menor longitud que la cabeza y la cola; base de la cola con el mismo pelaje que el cuerpo, la porcin desnuda es 2/3 negra y 1/3 blanca, a veces completamente negra. Piernas y patas negras. Dedos 3-5 de la pata trasera de la misma longitud. Poco olor corporal (Figura 2). Especies similares: Ver Didelphis marsupialis.

Figura 2. Didelphis virginiana.

Philander opossum Esta especie es mucho menos comn que D. virginiana y D. marsupialis, y se encuentra predominantemente en hbitats con poca urbanizacin, pero puede ser encontrado en jardines y huertos. Nombre comn: Tlacuache cuatro-ojos. 32

HB 253-315 (11), T 273-329M (12), HF 43-50, E 33-41, Wt 263-1400 g (1.7 lb). Descripcin: De tamao mediano. Parte dorsal color caf-gris oscuro a gris negruzco salpicado con pelos blancos, ligeramente brillosa. Parte ventral y punta de las patas color crema o amarillo. Pelo denso y ligeramente lanudo. Orejas negras, desnudas, con parches de color crema en sus bases. Cabeza negruzca, con manchas color crema encima de los ojos y mejillas crema. Brillo ocular rojizo brillante. El pelaje de la cola es similar al del cuerpo por los 30-50 mm basales, despus casi desnuda, compuesta por 2/3 de negro y el resto, que conforma la punta, de blanco (Figura 3). Especies similares: Especies del gnero Metachirus y Chironectes, pero slo este ltimo se encuentra en la regin ms surea de la pennsula, por el estado de Tabasco y parte de Belice. Su aspecto poco desaliado y sus manchas supraoculares lo distinguen de las otras 2 especies mucho ms abundantes en la pennsula, D. virginana y D. marsupialis.

Delantera Delantera

Tra Trasera

Figura 3. Philander opossum.

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Anexo 4. Identificacin de garrapatas machos y hembras. Diagnosis. Hembra: Poseen un escudo de menor tamao que abarca 1/3 del cuerpo con poro genital ventral. Cuernos y aurcula ausente; base capilar lateral inflada; frmula dental 2/2; coxa I robusta y bifurcada, espoln externo ligeramente curvado y muy afilada, y mucho ms largo que los cilndricos interno, coxas II-IV con grandes espuelas externas, redondeado apicalmente. Machos: El escudo se extiende a lo largo de todo el dorso del cuerpo y con ausencia de poro genital. Cuernos y aurcula ausente, base capilar lateral inflada; hipostoma similar a la hembra, pero ms pequea, coxa I robusto y bifurcada, espoln externo mas agudo y mucho mas largo que el interno; coxas II-IV esencialmente como las hembras.

Fotografas tomadas de artculo Examination of the Internal Morphology of the Ixodid Tick, Amblyomma maculatum Koch, (Acari: Ixodidae); a How-to Pictorial Dissection Guide.2009.

Garrapata hembra del Gnero Ixodes (Autor: Joe MacGown) 34

Garrapata macho del Gnero Ixodes (Autor: Joe MacGown)

Claves dicotmicas para el gnero Ixodes. Key to females. 1. Trochanters I-III with spurs..........................................................................2 Trochanters I-III without spurs..............................................................................................3 2. Hypostome large, broad, denticles 6/6 apically, then 5/5, 4/4 and 3/3 to base; auriculae distinct but rounded.............................................................................................. I. murreleti Hypostome narrow, denticles 4/4 apically, then 3/3 and 2/2 to base; auriculae sharpedged........................................................................................................ I. brunneus 3. Auriculae weakly developed or absent.....4 Auriculae prominent, usually as distinct ridges or recurved horns....................14

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4. In ventral view, basis capituli fl ared laterally but auriculae absent; coxa I robust and bifi d, posterior margin between internaland external spurs curved...........................................5 Ventrally, basis capituli not fl ared laterally; coxa I not as above..6 5. Coxa I with spurs about equal in length............................................................. I. loricatus Coxa I with external spur much longer than internal spur........................... I. luciae 6. Palps elongate, length:width ratio generally greater than 3:1...........7 Palps shorter, often thick and clublike, length:width ratio generally less than 3:1...11 7. Auriculae present as slight lateral ridges.......................................................................8 Auriculae absent.........................................................9 8. Cornua small but distinct; scutum almost circular, punctations larger

peripherally. I. scapularis Cornua absent; scutum oval with uniformly small punctations....... I. pacificus 9. Spurs of coxa I about equal in length; hypostome Christmas tree-shaped, not borne on median extension of basis capituli, denticles 3/3.......... I. angustus Apically, then 2/2 to base..............................................................................10 10. Internal spur of coxa I moderately long, overlapping anterior margin of coxa II; venter of basis capituli broad and elongate; legs normal..................... I. woodi Internal spur of coxa I long, overlapping half or more of coxa II; venter of basis capituli broad but not elongate; legs long, spiderlike.......... I. conepati 11. Basis capituli with prominent rounded hump on either side of

hypostome....................... I. texanus Basis capituli without rounded hump on either side of hypostome................................12 12. Dorsally, posterior margin of basis capituli sinuous......................... I. dampfi Dorsally, posterior margin of basis capituli nearly straight.................................13

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13. Cornua short but distinct; cervical grooves narrow and shallow but long, approaching posterolateral margins of scutum........................................................ I. cookei Cornua absent, but posterolateral corners slightly emphasized in some specimens; cervical grooves shallow and short, visible only posterior to middle of scutum ..................................................................................................................... I. rubidus 14. Hypostomal dentition 5/5 or 6/6...................................................................... I. dentatus Hypostomal dentition less than 5/5...........................................................................15 15. Auriculae as lateral saliences or ridges; scutum with conspicuous deep punctations near posterior margin................................................................................................ I. affinis Auriculae broadly rounded, or retrograde spurs or horns; scutum otherwise.16 16. Palpal segment I ventrally with a short, sharp spur....................................17 Palpal segment I lacking a ventral spur .......................................................................19 17. Hypostomal dentition 4/4 apically; transverse suture distinct....................... I. spinipalpis Hypostomal dentition 3/3 apically; transverse suture faint or absent.................18 18. Anterior margin of genital aperture smoothly curved; internal spur of coxa I overlapping anterior half of coxa II...................................................... I. sinaloa Anterior margin of genital aperture notched; internal spur of coxa I overlapping anterior margin of coxa II...................................................................... I. tovari 19. Auriculae broadly rounded..........................................20 Auriculae curved, retrograde horns...............................................................................22 20. External spurs absent on coxae I and II; scutal punctations chiefl y in lateral fi elds and posteriorly.................................................................................................... I. guatemalensis External spurs present on all coxae; scutal punctations evenly distributed...........21 21. Hypostome relatively broad, dentition 4/4 apically, then 3/3 and 2/2 to base................................................................................................. I. tamaulipas

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Hypostome relatively narrow, dentition 3/3 apically, then 2/2 to base........ I. tancitarius 22. Hypostome Christmas tree-shaped, attenuated and sharp; punctations distinct, moderate in number, and more or less evenly distributed................................. I. mexicanus Hypostome with sides almost parallel for much of length; punctations otherwise23 23. Punctations small and scattered...................................................................................24 Punctations large and numerous or clustered near posterior scutal margin..........25 24. Scutum widest near midlength, broadly rounded posteriorly............ I. cuernavacensis Scutum widest just anterior to midlength, narrowing posteriorly................... I. eadsi 25. Punctations large, numerous and evenly distributed..................................... I. bequaerti Punctations sparse and small over most of scutum, but with few to several large deep ones near posterior scutal margin...................................................................... I. boliviensis Key to males. 1. Trochanters I-III with small but distinct spurs.... I. brunneus Trochanters I-III without spurs........2 2. Large, elongate, heavily sclerotized ticks with wide lateral body folds; in ventral view, basis capituli fl ared laterally; coxa robust and bifi d, posterior margin between internal and external spurs curved..................................................3 Body neither elongate nor heavily sclerotized; ventrally, basis capituli not fl ared laterally; coxa I not as above.......................................................................4 3. External and internal spurs of coxa I equal or subequal in length.......... I. loricatus External spur of coxa I much longer than internal spur.............................. I. luciae 4. Basis capituli dorsally with 8-9 deep punctations in lateral fi elds, suggesting porose areas; coxa I with long, narrow internal spur but external spur absent; coxa II lacking spurs.................................................................... I. guatemalensis Without this combination of characters.............................................................................5 38

5. Hypostome with large, sharp lateral denticles, distinctly different from the smaller median denticles, which are arrayed in diagonal or transverse rows of crenulations....6 Lateral and median hypostomal denticles similar in structure...........................9 6. Central area of scutum posterior to pseudoscutum with a group of conspicuously large, deep punctations................................................................... I. affinis Scutal punctations arranged otherwise....................................................7 7. Pseudoscutum present, somewhat darker in color, and indicated by smaller punctations; larger punctations posteriorly............................................................................. I. spinipalpis Pseudoscutum usually absent; scutal punctations uniformly small, numerous, evenly distributed.........................................................................................8 8. Spiracular plate oval; median plate with small punctations................ I. pacificus Spiracular plate elongate; median plate with large punctations...................... I. scapularis 9. Internal spur of coxa I short or of only moderate length, barely reaching anterior margin of coxa II.........................................................................................10 Internal spur of coxa I long, extending to middle of coxa II or beyond........................13 10. Large tick, scutum usually at least 3 mm long; pseudoscutum present, its posterior margin indicated by an area devoid ofpunctations................ I. conepati Smaller tick, scutum usually < 2 mm long; pseudoscutum faint or absent....................11 11. Scutal punctations numerous, large and deep; scutal surface faintly

rugose. I. texanus Scutal punctations moderate in number and small, except in lateral areas..........12 12. Dental formula 3/3, crenulations large, arranged in overlapping rows.... I. angustus Dental formula 4/4, crenulations small, arranged in nonoverlapping rows.......... I. woodi 13. Cornua prominent; hypostome elongate, pointed.............................. I. tovari

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Cornua small or absent; hypostome not pointed......................................14 14. Scutal punctations numerous, moderately large and deep; punctations of median plate numerous but small.................................................................................................. I. cookei Larger scutal punctations confi ned to median and posterior areas; punctations of median plate large.....................................................................................15 15. Apex of hypostome notched........................... I. eadsi Apex of...................................................................................................................16 16. Hypostome with median crenulations arranged diagonally............................. I. dentatus Hypostome with median crenulations arranged transversely........................ I. bolivensis

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Anexo 5. Tcnicas de tincin.

Tincin de Gram: 1.- Sumergir el frotis fijado por calor en cristal violeta durante 1 minuto. 2.- Aadir una solucin yodada durante 3 minutos. 3.- Decolorar brevemente con alcohol (unos 30 segundos) 4.- Contrateir con safranina durante 1 2 minutos. Tincin de Giemsa: Procedimiento gota gruesa: 1.- Se deja secar la lmina durante 20 minutos. 2.- Se deshemoglobiniza con Azul de Metileno Fosfatado, sumergiendo la lmina por 5 segundos y se lava varias veces con buffer fosfatado. 3.- Se deja secar la lmina. 4.- Realizar la Coloracin de Giemsa preparando 1 gota de Colorante y 1ml de Buffer (Aprox. 3ml por cada lamina). Se colorea la lmina 15 minutos boca abajo. 5.- Se lava con agua y se deja secar. Procedimiento del extendido. 1.- Se deja secar la lmina durante 10 minutos. 2.- Se fija el extendido con alcohol metlico durante 3 a 5 minutos y se deja secar. 3.- Se realiza la Coloracin de Giemsa aadiendo 2 gotas de Giemsa y 1ml de Buffer Fosfatado (Aprox. 3 ml por cada lmina). 4.- Se colorea la lmina boca abajo durante 30 minutos y se lava con agua y se deja secar. La gota gruesa se usa para ver la concentracin del parsito y el extendido para ver la especie. 41

Tincin de MAY GRNWALD-GIEMSA 1. Preparar una extensin muy fina y dejar secar al aire. 2. Fijarla con Metanol (Reag. Ph. Eur.) PA-ACS-ISO (cd. 131091) durante 3 minutos. 3. Diluir 1 ml de Eosina-Azul de Metileno solucin segn May Grnwald DC (cd. 251416) con 1 ml de Tampn, Solucin pH 7,2 DC (cd. 252164). Mezclar bien. 4. Cubrir la preparacin con el colorante diluido, dejando actuar de 2 a 3 minutos. 5. Escurrir el exceso de colorante y, sin lavar, aadir Azur-Eosina-Azul de Metileno solucin segn Giemsa (lento) DC (cd. 251338) diluido de 1:10 a 1:20 con Tampn, Solucin pH 7,2 DC (cd. 252164) durante 15 minutos. 6. Diferenciar en agua destilada por agitacin durante 5 segundos. 7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

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Anexo 6. Elaboracin del Medio BSK II.

El medio de Kelly modificado es la siguiente: Agua destilada 900 ml

10 X CMRL 1066 sin glutamina y NaHC 100 ml (GIBCO) Neopeptona (Difco) 5 g/L

Fraccin V Srica de albmina bovina 50 g/L (Sigma) Yeastolate (Difco) Glucosa (Malinckrodt) Citrato sdico (Sigma) Piruvato sdico (Sigma) N-Acetil glucosamina (Sigma) Bicarbonato sdico (Sigma) 2 g/L 6 g/L 5 g/L 0.7 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L

Disolver todos los componentes en agitacin. Ajustar el pH a 7.6 con NaOH 1N Esterilizar el medio por filtracin al vaco. Utilizar un filtro de acetato de celulosa de Milipore con un tamao de poro de 0.2 m. Suplementar con 70 g/L de gelatina. Utilizar tubos de cristal estriles en los que se aadi 5mL del medio. Una vez sembrada cada muestra, aadir al medio suero de conejo esterilizado por filtracin, filtros de 0.22 m), para conseguir una solucin al 6% de suero de conejo. (Escudero, 1993).

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