Captulo 12 cultivo primario

12.1 TIPOS DE CULTIVO DE CLULAS PRIMARIAS Un cultivo principal es la etapa del cultivo despus del aislamiento de las clulas, pero antes del primer subcultivo. Hay cuatro etapas a considerar: (1) adquisicin de la muestra, (2) aislamiento de los tejidos, (3) la diseccin y / o la desagregacin, y la cultura (4) despus de la siembra en el recipiente de cultivo. Despus del aislamiento, un cultivo de clulas primarias pueden ser obtenidos al permitir que clulas migren fuera de los fragmentos de tejido que se adhieren a un sustrato adecuado o mediante la desagregacin del tejido mecnicamente o enzimticamente para producir una suspensin de clulas, algunas de las cuales finalmente se adhieren al sustrato . Se parece ser esencial para la mayora de las clulas no transformadas normales, con la excepcin de las clulas hematopoyticas, para fijar a una superficie plana con el fin de sobrevivir y proliferar con la mxima eficiencia. Las clulas transformadas (vase la Seccin 18.5.1), por otra parte, particularmente clulas de tumores trasplantables animales, a menudo son capaces de proliferar en suspensin. Las enzimas utilizadas con ms frecuencia para la disgregacin del tejido son preparaciones crudas de tripsina, colagenasa, elastasa, pronasa, dispasa, DNasa, y la hialuronidasa, solos o en diversas combinaciones, por ejemplo, la elastasa y DNasa para el tipo de aislamiento de clulas II alveolar [Dobbs & Gonzalez, 2002 ], con colagenasa Dispasa [Booth & O'Shea, 2002], y la colagenasa con hialuronidasa Berry [& Friend, 1969; Seglen, 1975]. Hay otras enzimas, no mamferos, tales como Trypzean (Sigma), un recombinante, derivados del maz, la tripsina, TrypLE (Invitrogen), microbiano recombinante, y Accutase y Accumax (tecnologas innovadoras para mviles), tambin disponibles para la disgregacin primaria. Preparaciones crudas son a menudo ms xito que las preparaciones de enzimas purificadas, porque los primeros contienen otras proteasas como contaminantes, aunque estos ltimos son generalmente menos txicos y ms especficos en su accin. La tripsina y pronasa dar la desagregacin ms completa, pero puede daar las clulas. Colagenasa y dispasa, por otra parte, dar desagregacin incompleta, pero son menos nocivos. La hialuronidasa puede ser usado en conjuncin con colagenasa para digerir la matriz intracelular, y DNasa se utiliza para dispersar el ADN liberado de las clulas lisadas; ADN tiende a deteriorar la protelisis y promover reagregacin (vase la Tabla 13,4). Aunque cada tejido puede requerir un conjunto diferente de condiciones, ciertos requisitos son compartidos por la mayora de ellos: (1) La grasa y el tejido necrtico se eliminan mejor durante la diseccin. (2) El tejido debe ser picado finamente con instrumentos afilados para causar un dao mnimo.

(3) Las enzimas utilizadas para la disgregacin debera ser eliminado posteriormente por centrifugacin suave. (4) La concentracin de clulas en el cultivo primario debe ser mucho mayor que la normalmente utilizada para el subcultivo, porque la proporcin de las clulas del tejido que sobrevive en cultivo primario puede ser bastante bajo. (5) Un medio rico, tales como F12 de Ham, es preferible un medio simple, tal como MEM de Eagle, y, si el suero se requiere, bovino fetal a menudo da una mejor supervivencia que hace ternera o caballo. Aislamiento de tipos celulares especficos, probablemente requerir medios selectivos (6) desagrega embrionarias de tejido ms fcilmente, produce ms clulas viables, y prolifera ms rpidamente en cultivo primario que el tejido adulto. 12.2 AISLAMIENTO DEL TEJIDO Antes de intentar trabajar con el tejido humano o animal, asegrese de que su trabajo se encuadra dentro de las normas ticas mdicas o la legislacin vigente en la experimentacin con animales (vase la Seccin 7.9.1). Por ejemplo, en el Reino Unido, el uso de embriones o fetos ms all de un 50% de gestacin o incubacin se regula en los Experimentos con Animales (Procedimientos Cientficos) de la Ley de 1986. Trabajo con biopsias humanas o material fetal por lo general requiere el consentimiento del comit de tica local y el paciente y / o sus familiares (vase la Seccin 7.9.2). Nota de seguridad. Trabajo con el tejido humano debe llevarse a cabo a nivel de contencin 2 en un gabinete de seguridad biolgica de clase II (vase la Seccin 7.8.3). Un intento debe hacerse para esterilizar el sitio de la reseccin, con 70% de alcohol si el sitio es probable que estn contaminados (por ejemplo, la piel). Retire el tejido aspticamente y transferir la muestra al laboratorio de cultivo de tejidos en la diseccin BSS (DBSS) o medio de transporte (vase el Apndice I) tan pronto como sea posible. No disecar los animales en el laboratorio de cultivo de tejidos, como los animales pueden llevar a la contaminacin microbiana. Si un retraso en la transferencia del tejido es inevitable, puede mantenerse a 4 C durante un mximo de 72 h, aunque un mejor rendimiento por lo general ser el resultado de una transferencia ms rpida. 12.2.1 embrin de ratn Los embriones de ratn son una fuente conveniente de clulas no diferenciadas para cultivos de fibroblasto. A menudo se utilizan como capas de conexin (vase la fig. 14.2.3). 12.2.2 embrin de pollo Los embriones de pollo son ms fciles de diseccionar, ya que son ms grandes que los embriones de ratn en la etapa de desarrollo equivalente. Al igual que los embriones de ratn, embriones de pollo se utilizan para proporcionar cultivos de clulas mesenquimales predominantemente primarios para el anlisis de la proliferacin celular, para proporcionar capas alimentadoras, y

como un sustrato para la propagacin viral. Debido a su mayor tamao, es ms fcil para diseccionar rganos individuales para generar tipos especficos de clulas, tales como hepatocitos, msculo cardaco, y en el epitelio pulmonar. Como con embriones de ratn, el uso de embriones de pollo puede estar sujetos a la legislacin animal (por ejemplo, en el Reino Unido) y el trabajo con embriones que son ms de medio plazo puede requerir una licencia. 12.2.3 Humano material de biopsia Manipulacin humana material de biopsia presenta ciertos problemas que no se encuentran con el tejido animal. Por lo general, es necesario obtener el consentimiento (1) desde el comit tico hospitalario, (2) desde el mdico o cirujano, y (3) desde el donante o del paciente o los familiares del paciente (vase la Seccin 7.9.2). Adems, el muestreo de biopsia se realiza generalmente con fines de diagnstico, y por lo tanto las necesidades del patlogo deben cumplirse primero. Este factor es un problema menor si la reseccin quirrgica extensa o no patolgico del tejido (por ejemplo, cable, placenta o del cordn umbilical) est implicado. La operacin se realiza a menudo por un miembro del personal residente en un momento en que no siempre es conveniente para el laboratorio de cultivo de tejidos, por lo que algunos recoleccin formal o sistema de almacenamiento deben ser empleados para los momentos en que usted o alguien de su personal no puede estar all. Si la entrega a su laboratorio est dispuesto, entonces debe haber un sistema de recepcin de muestras, registro de datos sobre el origen, el tejido de origen, patologa, etc (ver seccin 12.3.11), y alertando a la persona que realizar la cultura que las muestras han llegado, de lo contrario, el material valioso se pueden perder o estropeado. Nota de seguridad. Human material de biopsia conlleva un riesgo de infeccin (ver Seccin 7.8.3), por lo que debe ser manejado bajo nivel 2 de contencin en un armario de la clase II de peligro biolgico, y todos los medios de comunicacin y los aparatos deben ser desinfectados despus de su uso en autoclave o inmersin en un desinfectante adecuado (vase la Seccin 7.8.5). El tejido debe ser examinado para infecciones accidentales, tales como la hepatitis, el VIH y la tuberculosis [en los Estados Unidos, EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos, 1993, en el Reino Unido, el Comit asesor sobre patgenos peligrosos, 1995b] a menos que el paciente ya ha sido la prueba de estas infecciones. 12.3 cultivo primario Varias tcnicas se han ideado para la desagregacin de tejido aislado para un cultivo primario. Estas tcnicas se pueden dividir en (1) tcnicas puramente mecnicos, que implican diseccin con o sin alguna forma de maceracin, y tcnicas (2) utilizando desagregacin enzimtica (Fig. 12,5). Explantes primarios son adecuados para cantidades muy pequeas de tejido; desagregacin enzimtica da un rendimiento mejor cuando ms tejido est disponible, y desagregacin mecnica funciona bien con los tejidos blandos, y en algunos tejidos ms firmes cuando el tamao de rendimiento theviable no es importante. 12.3.1 explante primario

La tcnica de explante primario fue el mtodo original desarrollada por Harrison [1907], Carrel [1912], y otros para iniciar un cultivo de tejido. Tal como se haba realizado, un fragmento de tejido se embebi en el plasma sanguneo o linftico, mezclado con suero heterlogo y extracto de embrin, y se coloca en un cubreobjetos que se invierte sobre un portaobjetos de concavidad. El plasma coagulado mantiene el tejido en su lugar, y el explante se podra examinar con un microscopio convencional. El suero heterlogo induce la coagulacin del plasma, y el extracto de embrin y el suero, junto con el plasma, suministra nutrientes y factores de crecimiento y la migracin celular estimulada desde el explante. Esta tcnica se utiliza todava pero ha sido reemplazado en gran medida por el mtodo simplificado descrito en el Protocolo de 12,4. Esta tcnica es particularmente til para pequeas cantidades de tejido, como biopsias de piel, para los que existe un riesgo de perder clulas durante la desagregacin mecnica o enzimtica. Sus desventajas radican en la adhesividad pobre de algunos tejidos y la seleccin de las clulas en el fruto. En la prctica, sin embargo, la mayora de las clulas embrionarias, en particular, migrar con xito. Colocacin de explantes. Tanto la adhesin y la migracin puede ser estimulada mediante la colocacin de un cubreobjetos de vidrio en la parte superior del explante, con el explante cerca del borde del cubreobjetos, o el plato de plstico puede ser rayado a travs del explante para sujetar el tejido en el matraz [Elliget y Lechner, 1992] (vase el Protocolo 23,9). Fijacin tambin puede ser promovida por el tratamiento de la plstico con polilisina o fibronectina (ver Secciones 8.4.11, 10.4.5, 14.2.1), la matriz extracelular (vase el Protocolo de 8,1), o capas alimentadoras (vase el Protocolo de 14,3). Histricamente, los cogulos de plasma se han usado para promover el apego. Colocar una gota de plasma sobre la superficie de plstico, y insertar el explante en ella. Esto debera inducir la coagulacin de plasma en unos pocos minutos, despus de lo cual se puede aadir medio. Alternativamente, se purific el fibringeno y la trombina se puede utilizar [Nicosia y Ottinetti, 1990]. 12.3.2 La desagregacin enzimtica Adhesin clula-clula en los tejidos est mediado por una variedad de homotpicos glicopptidos interactuantes (molculas de adhesin celular, o levas) (vase la Seccin 3.2.1), algunas de las cuales son dependientes de calcio (cadherinas) y por lo tanto son sensibles a los agentes quelantes tales como EDTA o EGTA. Integrinas, que se unen a la arginina-glicina-cido asprtico (RGD) en la matriz extracelular, tambin tienen Ca2 +-dominios de unin y se ven afectados por Ca2 + agotamiento. Membranas Intercellularmatrix y stano contener otras glicoprotenas, tales como la fibronectina y la laminina, que son sensible a la proteasa, y proteoglicanos, que son menos, pero a veces puede ser degradado por glicanasas, tales como hialuronidasa o heparinasa. El enfoque ms sencillo es proceder de una solucin de desagregacin simple a una solucin ms compleja (ver la Tabla 13,4) con tripsina solo o tripsina / EDTA como punto de partida, la adicin de otras proteasas para mejorar la disgregacin y eliminacin de tripsina si es necesario para aumentar la viabilidad. En general, el aumento de la pureza de una enzima dar un mejor control y una menor toxicidad con mayor especificidad, pero puede resultar en actividad desagregacin menos.

Desagregacin mecnica y enzimtica del tejido evita los problemas de seleccin por la migracin y se obtiene un mayor nmero de clulas que son ms representativos de todo el tejido en un tiempo ms corto. Sin embargo, as como la tcnica de explante primario selecciona sobre la base de la migracin celular, tcnicas de disociacin se seleccione la proteasa y mecnicas resistentes al estrs clulas. Tejido embrionario se dispersa ms fcilmente y da un rendimiento ms alto de la proliferacin de las clulas que el tejido recin nacido o de adulto. La creciente dificultad en la obtencin de clulas proliferantes viables con la edad se debe a varios factores, incluyendo el inicio de la diferenciacin, un aumento en el tejido conectivo fibroso y matriz extracelular, y una reduccin de la piscina clula indiferenciada proliferando. Cuando los procedimientos de mayor severidad son necesarios para desagregar el tejido (por ejemplo, ya tripsinizacin o aumento de la agitacin), los componentes ms frgiles del tejido puede ser destruido. En los tumores fibrosos, por ejemplo, es muy difcil obtener la disociacin completa con tripsina al tiempo que conserva las clulas viables de carcinoma. La eleccin de qu grado de tripsina a utilizar siempre ha sido difcil, ya que hay dos tendencias opuestas: (1) Mientras ms pura es la tripsina, menos txico se vuelve, y su accin es ms predecible, (2) ms cruda tripsina, ms eficaz es, a causa de otras proteasas. En la prctica, un experimento de prueba preliminar puede ser necesario para determinar el grado ptimo de rendimiento de clulas viables, como el equilibrio entre la sensibilidad a los efectos txicos y la capacidad de desagregacin puede ser difcil de predecir. Tripsina cruda es, con mucho, la enzima ms comn utilizado en el tejido desagregacin [Waymouth, 1974], ya que se tolera muy bien por muchas clulas y es eficaz para muchos tejidos. Actividad residual que queda despus del lavado se neutraliz por el suero del medio de cultivo, o por un inhibidor de tripsina (por ejemplo, soja inhibidor de tripsina) cuando es medio libre de suero utilizado. 12.3.3 Tripsina caliente Es importante reducir al mnimo exposicin de las clulas a tripsina activa con el fin de preservar la mxima viabilidad. Por lo tanto, cuando el tejido entero se est tripsinizaron a 37 C, las clulas disociadas se recogieron cada hora media, y tripsina se elimina por centrifugacin y se neutraliz con suero en medio. Esta tcnica es til para la desagregacin de grandes cantidades de tejido en un tiempo relativamente corto, en particular para los embriones de ratn enteros o embriones de pollo. No funciona tan bien con el tejido adulto, en el que hay una gran cantidad de tejido conectivo fibroso, y la agitacin mecnica puede ser perjudicial para algunos de los tipos de clulas ms sensibles, tales como el epitelio. Si la reagregacin se encuentra despus de la centrifugacin y resuspensin, se incuba en DNasa, 10-20 ug / ml, durante 10-20 min, y centrifugar. 12.3.4 La tripsinizacin con preexposicin fra

Una de las desventajas del uso de tripsina para desagregar tejido es el dao que puede resultar de la exposicin prolongada al tejido a tripsina a 37 C, de ah la necesidad de cosechar las clulas despus de 30 min-incubaciones en el mtodo de tripsina caliente en lugar de haberlos expuesto durante todo el tiempo (es decir, 3-4 h) necesaria para desagregar el tejido completo. Un mtodo sencillo de minimizar el dao a las clulas durante la exposicin es poner en remojo el tejido en tripsina a 4 C durante 6-18 h para permitir la penetracin de la enzima con actividad trptica poco (Tabla 12,1). Siguiendo este procedimiento, el tejido slo se requieren 20-30 min a 37 C para la disgregacin [Cole & Paul, 1966]. El mtodo de tripsina fro por lo general da un rendimiento ms alto de clulas viables, con una mejor supervivencia despus de 24 h de cultivo (vanse las Figs. 12,1, 12,10 y la Tabla 12,1), y preserva ms tipos de clulas diferentes a las del mtodo caliente (ver placas 2d, e y 3 ). Los cultivos de embriones de ratn contienen clulas epiteliales ms cuando se preparan por el mtodo en fro, y eritroides culturesfrom 13-das hgado fetal de ratn responden a la eritropoyetina despus de este tratamiento, pero no despus de que el procedimiento con tripsina caliente o desagregacin mecnica [Cole & Paul, 1966; Conkie, comunicacin personal]. El mtodo de tripsina fro tambin es conveniente, ya que no agitacin o centrifugacin y se requiere la incubacin a 4 C puede hacerse durante la noche. 12.3.5 rganos rudimentos de embriones del polluelo El mtodo de tripsina fra es particularmente adecuado para pequeas cantidades de tejido, tales como rganos embrionarios. Protocolo 12,7 da buenos culturas reproducibles de 10 - a embriones de pollo de 13-das con pruebas de varios tipos de clulas diferentes caractersticas del tejido de origen. Este protocolo constituye un buen ejercicio para la enseanza. Anlisis. Despus de 3-5 das, las clulas contratantes se puede observar en los cultivos del corazn, las colonias de clulas pigmentadas de la cultivo de retina pigmentada, y el comienzo de miotubos en cultivos de msculo esqueltico. Cultivo puede ser fijado y teido (vase el Protocolo de 16,2) para el examen futuro. 12.3.6 Otros procedimientos enzimticos Desagregacin de la tripsina puede ser perjudicial (por ejemplo, a algunas clulas epiteliales) o ineficaces (por ejemplo, para el tejido muy fibroso, tal como tejido conectivo fibroso), por lo que se han realizado intentos para utilizar otras enzimas. Debido a que la matriz extracelular contiene colgeno a menudo, particularmente en el tejido conectivo y muscular, la colagenasa ha sido la opcin obvia [Freshney, 1972 (carcinoma de colon); Speirs et al, 1996 (carcinoma de mama);. Chen et al, 1989 (rin). ; Booth y O'Shea, 2002 (intestino); Heald et al, 1991 (clulas de islotes pancreticos)] (vanse las Secciones 12.3.6, 23.2.6-23.2.8).. Otras proteasas bacterianas, tales como pronasa [Schaffer et al, 1997;. Glavin et al, 1996.] Y dispasa (Boehringer-Mannheim) [Compton et al, 1998;. Inamatsu et al, 1998.], Tambin han sido utilizados con diversos grados de xito. La participacin de los hidratos de carbono en la adhesin intracelular ha llevado al uso de hialuronidasa [Berry y Friend, 1969] y neuraminidasa en conjuncin con colagenasa. Otras

proteasas siguen apareciendo en el mercado (vase la Seccin 12.1). Con la seleccin disponible ahora, el cribado de muestras disponibles es la nica opcin si la tripsina, colagenasa, dispasa, pronasa, hialuronidasa, y DNasa, solos y en combinaciones, no demuestran tener xito. Algunas clulas, particularmente macrfagos, pueden adherirse a la primera matraz durante la incubacin con colagenasa. Transferir las clulas a un matraz de fresco despus de tratamiento con colagenasa (y posterior eliminacin de la colagenasa) elimina muchos de los macrfagos a partir del cultivo. El primer matraz se pueden cultivar tambin, si es necesario. Tripsinizacin ligera eliminara las clulas adherentes que no sean los macrfagos. Desagregacin en colagenasa ha demostrado ser particularmente adecuado para el cultivo de tumores humanos [Pfragner y Freshney, 2004], un ratn rin, humano adulto y fetal cerebro, el hgado (vase el Protocolo de 23,6), pulmn, y muchos otros tejidos, en particular epitelio [Freshney y Freshney , 2002]. El proceso es suave y no requiere agitacin mecnica o equipo especial. Con ms de 1 g de tejido, sin embargo, se vuelve tedioso en la etapa de diseccin y puede ser costoso, debido a la cantidad de colagenasa necesario. Tambin se libere la mayora de las clulas del tejido conectivo, lo que acenta el problema del crecimiento de fibroblasto, por lo que puede necesitar ser seguido por cultivo selectivo (ver Seccin 10.2.1) o separacin de clulas (vase el captulo 15). Los grupos discretos de clulas epiteliales producidas por desagregacin en colagenasa (vase el Paso 9 de Protocolo de 12,8) y por el mtodo de tripsina fra (ver placas 2, 3) puede ser seleccionado bajo un microscopio de diseccin y se transfirieron a pocillos individuales en una placa de microtitulacin, solo o con clulas C tratados con mitomicina irradiados o de conexin (ver las Secciones 14.2.3, 23.1.1, 23.1.4). 12.3.8 La desagregacin mecnica La derivacin de clulas de explantes primarios es un proceso relativamente lento y puede ser altamente selectiva. La digestin enzimtica es bastante ms trabajo intensivo, aunque, potencialmente, da un cultivo que es ms representativo del tejido. Como hay un riesgo de dao proteoltico a las clulas durante la digestin enzimtica, muchas personas han optado por utilizar la alternativa de desagregacin mecnica, por ejemplo, recoger las clulas que se desparraman cuando el tejido est cuidadosamente cortada [Lasfargues, 1973], al presionar el tejido diseccionado a travs de una serie de tamices para que poco a poco la malla de tamao reducido, o, alternativamente, obligando a los fragmentos de tejido a travs de una jeringa (con o sin una aguja de gran calibre) [Zaroff et al., 1961] o simplemente pipeteado varias veces (vase la figura. 12,13). Este procedimiento da una suspensin celular ms rpidamente que la digestin enzimtica, pero puede causar daos mecnicos. Raspado (derrame'''') (Fig. 12.13a) y tamizado (Fig. 12.13b) son probablemente las ms suaves mtodos mecnicos durante el pipeteado (Fig. 12.13d) y, en particular, con jeringa (Fig. 12.13c), son ms propensos a generar cizallamiento. Protocolo de 12,9 es un mtodo de desagregacin mecnica que se ha encontrado para ser un xito moderado con los tejidos blandos, tales como el cerebro.

Slo los tejidos blandos, tales como el bazo, el hgado embrionario, cerebro embrionario y adulto, y algunos tumores blandos humanos y animales, responden bien a esta tcnica. Incluso con el cerebro, para los cuales desagregacin bastante completa se puede conseguir fcilmente, la viabilidad de la suspensin resultante es inferior a la lograda con la digestin enzimtica, aunque el tiempo que puede ser mucho menor. Cuando la disponibilidad de tejido no es una limitacin y la eficiencia del rendimiento no es importante, puede ser posible producir, en un corto perodo de tiempo, ya que muchas clulas viables con desagregacin mecnica como con la digestin enzimtica, pero a expensas de muy el tejido mucho ms. 12.3.9 separacin de las clulas viables y no viables Cuando un cultivo primario adherente se prepara a partir de clulas disociadas, las clulas no viables se retiran en el primer cambio de medio. Con cultivos primarios se mantienen en suspensin, las clulas no viables se diluyen poco a poco cuando se inicia la proliferacin celular. Si es necesario, sin embargo, las clulas no viables pueden ser removidos de la primaria desagregar por centrifugacin de las clulas en una mezcla de metrizoato Ficoll y sodio (por ejemplo, Hypaque o Triosil) [Vries et al., 1973]. Esta tcnica es similar a la preparacin de linfocitos de sangre perifrica (vase el Protocolo de 27,1). Las clulas viables se acumulan en la interfaz entre el medio y el Ficoll / metrizoato, y las clulas muertas de formar un sedimento en el fondo del tubo. Este procedimiento se puede escalar hacia arriba o hacia abajo y trabaja con menores proporciones de densidad media a la suspensin celular (por ejemplo, 5 ml de suspensin celular en 1 ml de medio de densidad). 12.03.10 cultivo primario en resumen La desagregacin de los tejidos y la preparacin del cultivo primario constituyen la primera, y quizs la ms importante, la etapa en el cultivo de clulas con funciones especficas. Si las clulas necesarias se pierden en esta etapa, entonces la prdida es irrevocable. Muchos tipos diferentes de clulas pueden ser cultivadas mediante la eleccin de las tcnicas adecuadas (vase la Seccin 10.2.1 y en el captulo 23). En general, la tripsina es ms severa que la colagenasa, pero a veces es ms eficaz para crear una nica suspensin de clulas. Colagenasa no se disocia fcilmente las clulas epiteliales, pero esta caracterstica puede ser una ventaja para la separacin de las clulas epiteliales de las clulas del estroma. Desagregacin mecnica es mucho ms rpido que el procedimiento utilizando la colagenasa, pero daa las clulas ms. El mejor enfoque es probar las tcnicas descritas en los Protocolos 12.4-12.9 y seleccionar el mtodo que mejor funcione en su sistema. Si ninguno de estos mtodos tiene xito, intente utilizar otras enzimas, tales como pronasa, dispasa, Accutase y DNasa, y consultar la literatura para ver ejemplos de trabajos anteriores con el tejido en el que ests interesado. 12.3.11 Los registros primarios Independientemente de la tcnica utilizada para producir un cultivo, es importante mantener registros adecuados de origen de la cultura y derivacin, incluyendo la especie, el sexo, y el tejido

del que se derivan, cualquier patologa relevante, y los procedimientos utilizados para la disgregacin y primaria cultura (Tabla 12.2). Si est trabajando bajo buenas prcticas de laboratorio (BPL. Www.oecd.org/department/0, 2688, en 26 49 34381 1 1 1 1 1,00 html) las condiciones, entonces esos registros no son slo deseables, sino obligatorio [Administracin de Alimentos y Drogas de 1992, el Departamento de Sanidad y Seguridad Social, 1986, Organizacin para la EconomicCo de Cooperacin y Desarrollo, 2004]. Los registros se pueden mantener en un bloc de notas u otro archivo de copia de hojas de registro, pero es mejor en este momento para iniciar un registro en una base de datos informtica; este disco se convierte en el primer paso para mantener la procedencia de la lnea celular. El registro de base de datos no puede proceder ms all de la fase de cultivo primario, pero, mirando el extremo opuesto, podra ser la primera etapa en la creacin de un registro exacto de lo que se convertir en una lnea celular valioso. Si el registro se convierte en irrelevante, siempre se pueden eliminar, pero no puede, con cierta precisin, se crear ms adelante, si la lnea celular adquiere cierta importancia. Como puede ser necesario para autenticar el origen de una lnea celular en una etapa posterior en su ciclo de vida, en particular si se sospecha de contaminacin cruzada, es importante que guarde una muestra de tejido, sangre, o de ADN del mismo individuo en el momento de aislamiento de tejido para el cultivo primario. Esta muestra puede ser utilizada como material de referencia para la huella dactilar de ADN (vase la Seccin 16.6.2) o de ADN (vase la Seccin 16.6.3).