La Fotosntesis

Comencemos por definir a la fotosntesis como "sntesis (formacin) con la ayuda de la luz". En realidad cuando hablamos de fotosntesis nos estamos refiriendo al proceso que llevan a cabo las plantas y otros microorganismos y que consiste, en trminos generales, en la formacin de materia orgnica mediante la luz. Como la materia orgnica contiene fundamentalmente carbono, hidrgeno y oxgeno, la fotosntesis se refiere mayoritariamente a la incorporacin de estos elementos, que proceden del CO2 y el agua, en materia orgnica. No debemos olvidar que la fotosntesis tambin se refiere a la reduccin de compuestos inorgnicos diferentes del CO2 como son el nitrato y el sulfato y su incorporacin, en aminocidos. Interaccin de la luz con los organismos vivos. Los organismos fotosintticos slo aprovechan una parte muy pequea de la energa que llega a la superficie terrestre, del orden del 0,1 %, es decir, un fotn de cada 1000 que caen sobre la superficie de la Tierra. A pesar de que slo una parte muy pequea de la energa es la que se absorbe por la planta, es tal el volumen de materia orgnica que se produce en toda la Tierra mediante la fotosntesis que, si fuera caa de azcar lo que se formara, se producira al ao una pila de ms de unos 3 km de altura y de 10 km de lado. Aproximadamente la mitad de la biomasa vegetal que se produce por fotosntesis lo hace en el ecosistema terrestre, mientras que la otra mitad lo hacen los ocanos. En trminos energticos, la produccin anual de biomasa es slo un orden de magnitud menor a las reservas de biomasa en forma de bosques, y combustibles fsiles demostradas, tales como el carbn, gas natural y petrleo, aunque posiblemente exista otro orden de magnitud mayor de reservas probables. Desde otro punto de vista podemos decir que la energa fijada por el reino vegetal es equivalente a unas diez veces el consumo industrial, a nivel mundial y unas 200

veces superior a los requerimientos energticos de la humanidad en forma de alimentos. Debe tenerse en cuenta, no obstante, que aunque el consumo individual de energa en forma de alimentos por un hombre es del orden de 100 W, el consumo de una bombilla elctrica, el hombre del mundo occidental necesita mucha ms energa para satisfacer su alto nivel de vida y confort, que es del orden de 10 kW. Podemos, por tanto, considerar que la vida en nuestro planeta se mantiene porque nos llega una energa de origen nuclear. De manera que, a pesar de la mala fama que la energa nuclear tiene en nuestra sociedad, nosotros dependemos y debemos nuestra existencia a ella. Bien es verdad que tenemos la salvaguarda de que tenemos a la central nuclear a una buena distancia de nosotros, unos 150 millones de Km de distancia y, adems, en un territorio donde nadie ha protestado. Historia del conocimiento de la fotosntesis Uno de los primeros pensamientos recogidos acerca de la funcin de hojas en las plantas se debe a Aristteles que dijo que stas tienen como misin dar sombra y proteger a las partes tiernas y dbiles de la planta, como son los brotes. Esa era una observacin sagaz pero errnea aunque compresible por nosotros si pensamos fue elaborada en un caluroso da de verano en Grecia. No poda imaginar Aristteles que las hojas eran una activa factora en la que se produce un activo intercambio de gases y fabricacin de material para la planta. Si nos referimos a la historia de la fotosntesis podemos decir que empieza poco despus de que se descubriera la composicin del aire. En 1648, es decir, cuando en Espaa andbamos luchando con los turcos, aproximadamente cuando viva el tatarabuelo de nuestro tatarabuelo. En esa poca el holands van Helmont cultiv una planta en un recipiente y comprob que la tierra perda mucho menos peso que lo que se incorporaba en la planta que, en caso de ser un rbol, era muy grande. Pens que el aumento de peso se deba al agua que haba que aadirle a la tierra durante todo el

crecimiento de la planta y dedujo, por lo tanto, que la masa de la planta proceda solamente del agua. Fue casi un siglo ms tarde cuando el clrigo ingls Stephan Hales reconoci que una parte del aire contribua a alimentar a la planta diciendo que el Creador haba puesto al aire para que respiraran los animales as como tambin las plantas. Se rompa as con la tesis de Aristteles que propona que las plantas se alimentaban exclusivamente del humus que contiene la tierra. En realidad los tres tenan razn porque la planta asimila agua, humus y una parte del aire. Hales tambin intuy que la luz tena un papel importante en el proceso, aunque no lleg a probarlo. Fue el pastor ingls inconformista y simpatizante con la Revolucin francesa Priestley, al que por este motivo, le saquearon su casa emigrando a Pensilvania, quien demostrar que en el aire haba un elemento, que llamara aire deflogisticado y posteriormente Lavoisier oxgeno. Priestley pudo demostrar que una planta restauraba el aire empobrecido por arder una vela en l. De esta manera se pudo explicar racionalmente por qu el aire de nuestro planeta se mantiene puro a pesar de que los hombres y animales lo consuman constantemente mediante la combustin y no se haga irrespirable. De acuerdo con sus observaciones ya dijo que ello hace que cualquier planta, por minscula y olvidada que se encuentre en un rincn de nuestro planeta contribuye a limpiar y purificar nuestra atmsfera. Un mdico de la corte de la emperatriz de Austria Mara Teresa, el holands Jan Higenhousz, impresionado por los descubrimientos de Priestley, al que haba odo en una conferencia que se dio en Londres, alquil en la primera ocasin que tuvo, que fue unos seis aos despus, una casita en Londres para hacer experimentos sobre el efecto de la luz en la accin limpiadora del aire que llevan a cabo las plantas. En un libro publicado en 1796 y titulado Experimentos con vegetales, descubrimiento del poder purificador del aire en la luz y de su envenenamiento en la oscuridad. Se deca que las plantas, a travs de las hojas y tallos verdes, purifican el aire tanto ms cuanto ms

expuestas estn a la luz y que en la oscuridad se desprenden gases muy nocivos. Por ese mismo tiempo el pastor suizo Jean Senebier public en Ginebra un tratado sobre la influencia de la luz solar para modificar los seres de tres reinos, sobre todo del vegetal. Hizo esencialmente la misma observacin que Hignehousz, pero aadi que la actividad de restauracin del aire por las plantas dependa de la presencia de "aire fijado" que es como se denominaba entonces al dixido de carbono. Quedaba por descubrir el otro reactivo implicado en la fotosntesis, que haba sido descrito cualitativamente por van Helmont, pero no medido: el agua. Nicolas de Saussure, tambin de Ginebra, midi cuidadosamente el peso de la planta y descubri que el peso de sta, junto con el del oxgeno desprendido, pesaban mucho ms que el "aire fijado" por la planta y que la diferencia era el agua que se aada a la tierra. Propuso la siguiente ecuacin:
luz

aire fijado

+ agua

--

aire vital

+ materia orgnica

planta verde

En esta ecuacin el aire fijado y la materia orgnica se deben a Senebier la inclusin del agua a Saussure La implicacin de luz y la planta verde, que se refiere, en realidad, a los cloroplastos, a Ingenhousz y el aire vital, el oxgeno, a Priestley. Queda un nombre que aadir al nacimiento de la fotosntesis y es el del mdico alemn Julius Robert Mayer que propuso que la energa luminosa se transforma en energa qumica. Las plantas no slo son creadoras de materia orgnica sino que son tambin los almacenadores de la energa que pasa a ser energa qumica. Se podra entonces escribir la ecuacin CO2 + H2O + luz -O2 + materia orgnica + energa qumica

l llam a la energa "poder" y a la energa qumica "diferencia qumica", pero ahora se puede considerar como correcto el planteamiento de la fotosntesis. Estos son los padres de la fotosntesis porque ellos plantearon todos los elementos que intervienen en dicho proceso. Son un ejemplo de interaccin entre los pueblos, puesto que hay un holands, un francs, un ingls, un suizo y un alemn. No se puede decir, sin embargo, que hubiera armona entre ellos, ya que el carcter y la situacin social de alguno de ellos, como Hingenhousz, un mdico imperial, era muy diferente de la de un discreto pastor protestante provinciano y paleto, como Senebier. Ha pasado mucho tiempo y la situacin, aunque sigue igual, algo ha mejorado. Una vez que se demostr que el dixido de carbono asimilado por las plantas se transformaba en almidn y que ello ocurra en los cuerpos clorficos o cloroplastos, ya estaba formulada la fotosntesis en sus trminos actuales, de acuerdo con la ecuacin: CO2 + H 2O ----(CH2O)n + O2

No obstante, se crey errneamente que el oxgeno que se desprenda proceda del CO2 y no del agua, como ocurre realmente. De hecho Otto Warburg, uno de los mayores cientficos en el estudio de la bioenergtica de todos los tiempos defendi esta tesis hasta su muerte, que fue en 1970. Debido a su gran prestigio cientfico y a su notable arrogancia sus opiniones equivocadas, como consecuencia, en gran medida a la ignorancia que profes respecto del trabajo de otros, hizo que se retrasara considerablemente el avance de este campo cientfico. Warburg haba introducido el alga unicelular Chlorella en los estudios de Fisiologa Vegetal debido a que es muy fcil de cultivar y a que se pueden producir grandes cantidades de material fotosinttico en relativamente poco

tiempo. A Warburg se deben, adems, las tcnicas manomtricas para la medida de procesos fisiolgicos. El aparato de Warburg ha estado presente en todos los laboratorios de bioqumica hasta hace unos 10 o 15 aos. En ellos se medan los cambios de volumen de los gases que se generaban en reacciones de respiracin o de fotosntesis ya que en dichos aparatos se podan iluminar las vasijas. Hoy da las medidas de oxgeno se hacen polarogrficamente mediante un sencillo aparato que se llama el electrodo de oxgeno y que no necesita la limpieza de las vasijas y su cuidadoso calibrado, que exiga mucho tiempo de manipulacin. Warburg midi el rendimiento cuntico de la fotosntesis en Chlorella y dijo que la reduccin de 1 mol de CO2 requera 4 quanta de luz. Es decir, que la rotura de 2 molculas de agua y la liberacin de 4 electrones del H que eran recuperados como poder reductor, requeran 4 fotones. Teniendo en cuenta la energa de los quanta a 680 nm y la energa qumica que se aprovechaba en el CO2 reducido resultaba un rendimiento del 70 %. Eso significara que la fotosntesis era un proceso que tiene lugar con un rendimiento mucho mayor que las mayora de las mquinas conocidas as como de otros procesos biolgicos. Eso levant mucha polmica y muchos se lanzaron a comprobar sus datos, pero l los ignor. Propona que en un mundo perfecto la fotosntesis debe ser perfecta y que podra llegar a un rendimiento cuntico de 3, es decir, cercano al 100 %. Ignor a su vez a los dems cientficos que, usando las tcnicas manomtricas que l haba desarrollado, obtenan rendimientos menores. Hoy da se acepta que el rendimiento cuntico de la fotosntesis es de 8 fotones por mol de CO2 fijado estando el rendimiento prximo al 30 %. Ello se debe, como se ver ms adelante, a que por cada electrn, o tomo de hidrgeno que se promueve son necesarios dos fotones de luz. Tambin se debe a Warburg el empleo de ciertos colorantes, como las quinonas, que eran utilizados como aceptores de electrones en reacciones de xido-reduccin y que han

facilitado la medida de tales reacciones debido al cambio de color que sufre dichos compuestos al cambiar de estado redox. Reacciones bsicas de la Fotosntesis. La fotosntesis puede formularse, en sus trminos actuales como la reaccin mediante la cual el dixido de carbono es asimilado por las plantas transformndolo en almidn y desprendiendo oxgeno molecular. Dicha reaccin tiene lugar en las plantas en los orgnulos cuerpos clorficos o cloroplastos, de acuerdo con la ecuacin: CO2 + H 2O ----(CH2O)n + O2

Dicha reaccin implica que se asimila el anhdrido carbnico, que procede del aire, adems de agua y, todo ello en presencia de la luz, que es un elemento indispensable para la fotosntesis. Otros organismos llevan a cabo el proceso de la fotosntesis, aunque no est formulada exactamente como se ha escrito ms arriba. Algunos organismos procariotas, como son las bacterias fotosintticas, no utilizan el agua como donador de electrones y, por tanto, no desprenden oxgeno. Otros procariotas, como son las cianobacterias, llevan a cabo una fotosntesis anloga a la de las plantas, es decir oxignica. Se puede dividir la fotosntesis en dos tipos de procesos: los que implican el aprovechamiento de la luz y su transformacin en energa qumica, lo que se denomina la fase luminosa de la fotosntesis, y aquella mediante la cual el anhdrido carbnico se fija mediante el consumo de ATP y NADPH, un proceso tpicamente bioqumico, y que se denomina fase oscura, no porque requiera la oscuridad, sino porque no se necesita la luz. No cabe duda que la medida del proceso completo de la fotosntesis resulta complejo ya que son muchos los requisitos exigidos. Por ello resulta esencial, para el estudio de dicho proceso, disponer de un ensayo ms

sencillo. Un ensayo que permita medir la fase luminosa independientemente de la oscura. Un paso transcendental en el desarrollo de la fotosntesis fue la formulacin que hizo van Niel en 1929 que consideraba que se trataba de un proceso redox en el que se produce la reduccin de CO2 y la oxidacin de H2O. Esta propuesta permite escribir la ecuacin de la fotosntesis en los trminos reales, tal como se acepta hoy da, es decir, que consiste en la reduccin del CO2, en realidad tambin del nitrato y nitrito, adems del sulfato, mediante donadores de hidrgeno o de electrones: CO2 + 2 H 2O + h -----[CH2O] + O2 + H 2O

Hay diferencias, como veremos, en lo que se refiere a la naturaleza de los donadores de electrones, pues, si bien en las plantas y cianobacterias se utiliza el agua, en las bacterias fotosintticas se utilizan otros compuestos tales como el SH2 o un compuesto orgnico: CO2 o bien: CO2 + + 2 H 2S 2 H 2A + + h ----h ----[CH2O]n [CH2O]n + 2 S + 2 A + + H 2O H 2O

Hasta este momento, y son slo unos cincuenta aos atrs, para estudiar la fotosntesis haba que usar clulas enteras. Si se intentaba fraccionarlas, se perda su capacidad para realizar reacciones fotoqumicas. La eleccin era sencilla: o clulas enteras con actividad fotosinttica o fracciones muertas. Esto cambi en los aos entre 1937 y 39 cuando Robin Hill recogi una antigua observacin de que las hojas secas y hechas polvo desprendan oxgeno al exponerlas a la luz. Este efecto duraba poco y poda ser prolongado si se aada a las hojas sales de hierro tales como el oxalato frrico. En realidad lo que estaba ocurriendo es que la sal de hierro se estaba reduciendo en la luz y se desprenda oxgeno. En lugar del oxalato de hierro se empezaron a usar las quinonas que

haba descrito Warburg o, el mejor de todos y que desde entonces se usa en todos los estudios de fotosntesis como el reactivo de Hill por excelencia, el ferricianuro, un compuesto con un potencial redox muy oxidante, estable, barato muy soluble y con propiedades cinticas muy apropiadas para reaccionar con los centros fotosintticos. Esta observacin es semejante a la que efectuaron los hermanos Buchner cuando rompieron las clulas de levaduras y observaron que el extracto produca la fermentacin de la glucosa que se consuma en el proceso al mismo tiempo que se desprenda CO2. Mediante la reaccin de Hill se podan separar los distintos procesos de la fotosntesis, al mismo tiempo que se poda iniciar una bsqueda del material ms adecuado para llevar a cabo el estudio de dichas reacciones. Se consigui aislar los cloroplastos del resto de la clula y demostrar que stos siguen produciendo la reaccin de Hill. Se escogi la espinaca porque era fcilmente asequible y porque presenta muchas ventajas adicionales, como es que se rompen con facilidad as como que no liberan fenoles y polifenoles que inactivan a los enzimas que se obtienen al romper las clulas. En este caso se podan estudiar las reacciones luminosas aisladas de las otras reacciones enzimticas acopladas a ellas. Tambin se poda evaluar y cuantificar el proceso puesto que se podan llevar a cabo estudios cinticos. En realidad lo que se produce es, ni ms ni menos, que la foto-oxidacin del agua. Ms adelante se comprob que tambin se poda sustituir el donador de electrones, que en el caso de los cloroplatos es el agua, por otros reactivos qumicos, tales como el DCPIP y el ascorbato. Se puede as medir flujo de electrones desde el ascorbato hasta el ferricianuro. Por otra parte, esta reaccin permiti resolver el problema de si lo que se rompe para dar oxgeno era el CO2 o el agua. Claramente se comprueba que, en ausencia de CO2, hay todava desprendimiento de oxgeno y que, por lo tanto, procede del agua.

Se propone un esquema para la fotosntesis como un proceso que tiene lugar a travs de reacciones fotoqumicas que llevan consigo procesos de xido-reduccin, junto con otros procesos enzimticos mediante los cuales se produce la reduccin del anhdrido carbnico y la oxidacin del agua. Es un paso adelante aunque, como veremos dentro de muy poco, est equivocado. Un experimento muy indicativo de lo que ocurre en la fotosntesis y que fue realizado y analizado con detalle proporcionando mucha informacin es el espectro de accin de la fotosntesis. Es sabido que la fotosntesis requiere luz, pero, de qu longitud de onda? es decir, cul es la actividad fotosinttica de una preparacin iluminada con una luz monocromtica de una determinada longitud de onda? Emerson describi que al iluminar las preparaciones con luz del orden de 680 nm para arriba se produca una bajada en la actividad de la fotosntesis. Esa bajada se compensaba al iluminar simultneamente con luz de baja longitud de onda y de alta longitud de onda. El efecto era superior a la suma de las actividades a las dos longitudes de onda. Ello llev directamente a proponer que en la fotosntesis participan dos fotosistemas que se excitan a dos longitudes de onda diferentes y que actan en paralelo. Por entonces se describi la espectroscopia diferencial como una tcnica muy poderosa. La razn es que en fotosntesis se trabaja con un material coloreado que cambia su espectro al actuar, es decir, al iluminarlo. Por ello, si se dispone de una tcnica que permita observar los cambios a una determinada longitud de onda mientras que se activa al iluminarlo con otra luz diferente y ms intensa, se pueden analizar los componentes de la reaccin. En realidad se esperaba detectar cambios en las clorofilas, cosa que no ocurri, pero permiti descubrir los citocromos, componentes fundamentales de los tejidos fotosintticos. En la poca de los aos 60 Hill y Bendall propusieron el expresivo esquema en Z de la fotosntesis que tanto xito ha tenido y en el que se aceptaba la existencia de dos fotosistemas adems de que justifica la energtica para la

formacin de ATP como consecuencia de la liberacin de energa en reacciones de transferencia de electrones entre los componentes de una cadena de transporte. De los dos citocromos presentes en las clulas de plantas el b6 poda ser utilizado en su forma oxidada como aceptor de electrones de lo que ahora llamamos el fotosistema II en la luz; mientras tanto, el citocromo f, en su forma reducida poda ser utilizado como donador de electrones por el que hoy se conoce como fotosistema I. El esquema en Z es, pues la consecuencia de unir las dos reacciones correspondientes a los dos fotosistemas. No obstante, en estas primeras etapas del estudio de la reaccin de Hill pareca que los cloroplastos eran incapaces de llevar a cabo la fotosntesis real. Pareca que slo podan reducir compuestos relativamente oxidantes, en concreto de potencial mayor de 0,00 V. No obstante se comprob despus que, si la reaccin se lleva a cabo con cuidado para que se eviten reacciones en la direccin opuesta, se pueden reducir compuestos muy reductores. En concreto se puede reducir el NADP+ cuyo potencial es - 0,34 V. En este caso deben estar presentes algunos componentes adicionales de la preparacin de cloroplastos, tales como una protena de hierro que se denomina ferredoxina as como una flavoprotena denominada ferredoxina-NADP+ reductasa y que en un primer momento se llam TNPN reductasa. Curiosamente estos hechos fueron descubiertos por Vishniac y Ochoa en 1951 en Nueva York y luego por Anthony San Pietro en la John Hopkins y Daniel Arnon en Berkeley. Se acepta por fin, que la fotosntesis consiste en la reduccin del NADP+ a NADPH. En muchas clulas en las que se lleva a cabo sntesis de compuestos de carbono, como es el caso de las clulas fotosintticas, se saba que eran necesarias tanto el NADPH como el ATP, un compuesto bien conocido como moneda energtica. Ya hemos visto que se puede producir NADPH como consecuencia del transporte de electrones en la fotosntesis, pero qu ocurre con el ATP? Otros investigadores haban indicado que los cloroplastos no

producen ATP quedando dicha funcin restringida a las mitocondrias. Sin embargo los tejidos fotosintticamente ms activos tenan pocas mitocondrias y deban producir mucho ATP para llevar a cabo su accin sintetizadora. Para investigarlo Daniel Arnon decide trabajar con cloroplastos aislados por el procedimiento que todava se usa y comprueba que se produce incorporacin de CO2 y que los productos formados son los productos conocidos de la fotosntesis. Esto quiere decir que los cloroplastos llevan tambin a cabo las reacciones enzimticas que consumen ATP y conducen a fijar el CO2. Entonces le aadieron a preparaciones de cloroplastos los precursores del ATP, el ADP y P y, en la luz y en presencia de CO2 tuvieron sntesis de carbohidratos. Se prob que haba sntesis de ATP en lo que se llam fosforilacin fotosinttica o fotofosforilacin. En este proceso no haba sntesis de NADPH. Ms adelante se prob que tambin poda haber sntesis de NADPH y de ATP en el mismo proceso, en cuyo caso deba haber ferredoxina y el enzima que entonces se llam TPN reductasa, en lo que se llam fotofosforilacin no cclica para distinguirla de la anterior que se denomin fotofosforilacin cclica. Quedaba por debatir, no obstante, que el rendimiento de la reaccin en las condiciones de laboratorio era siempre una fraccin pequea respecto de la que tiene lugar en las clulas de Chlorella intactas y responder a la pregunta de si estaba faltando algo en este sistema. Ms tarde Calvin utiliz el istopo radiactivo del carbono, el
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para marcar el CO2 y poder as establecer la ruta de

incorporacin de este compuesto en material orgnico, aunque ms tarde se comprob que hay plantas, las C4, que siguen otra ruta. No obstante, la diferencia radica slo en las primeras fases porque, en realidad las plantas C4 luego se comportan como las C3, como se sabe bien. Entramos ahora en un perodo, que se podra situar alrededor del 70, que se puede denominar como el del conocimiento a nivel molecular de la fotosntesis. Se va desvelando la naturaleza de los componentes de los aparatos

fotosintticos. Se han aislado los componentes de los cloroplastos y de las bacterias fotosintticas y se han manipulado las preparaciones de membranas fotosintticas para hacerlas cada vez ms simples, con menos componentes, de manera que den respuestas ms concretas a preguntas de cmo funcionan. Se podra considerar que es la poca de la espectroscopia rpida. Se quieren conocer los mecanismos de las reacciones luminosas. Es decir, los sucesos que ocurren una vez que el pigmento que lleva a cabo el proceso fotoqumico es excitado por la luz. Eso significa conocer la naturaleza de lo que se llam el aceptor primario de electrones. Es decir, cuando se excita la clorofila para dar su electrn a quin se lo da de los muchos componentes que hay en las membranas con las que se trabaja. De aqu la importancia de la composicin de la muestra. Se emplean detergentes que actan selectivamente sobre las membranas eliminando unos componentes u otros y afectando a la funcin de la membrana. Pero se quiere saber cul es el aceptor primario de electrones de cada uno de los fotosistemas que hay en los cloroplastos y las cianobacterias. Para ello se desarrollan mtodos que exciten a la clorofila de manera muy rpida e intensa, aparatos de lser, as como sistemas que permitan medir la transferencia de electrones que ha tenido lugar. Para ello se utilizan tcnicas espectrofotomtricas, que miden cambios de color de pigmentos o protenas coloreadas que hay en las membranas, o bien de EPR, que permiten medir aparicin de especies paramagnticas mediante una reaccin redox que afecta a un componente de la membrana fotosinttica. En otros apartados veremos la aplicacin de ambas tcnicas al estudio de la fotosntesis. En cualquier caso, ello llev consigo el descubrimiento de los diferentes componentes que intervienen en la fotosntesis, tales como los pigmentos P680 y P700, el P430 as como de los citocromos y centros sulfofrricos que participan en estas reacciones. Se planteaba, no obstante, un problema que hizo que se llegara a ralentizar el desarrollo en este campo debido a que siempre quedaba la duda de si el cambio que se observaba despus de la iluminacin de la muestra

corresponda a la reduccin del aceptor primario o de otro compuesto de la cadena que se encontraba despus, es decir, que el instrumento no era suficientemente rpido para captar el primero de los componentes de la cadena. Ello llev a desarrollar tcnicas ms y ms rpidas. Del milisegundo se pas al microsegundo, de ah al picosegundo y ahora estoamos en el fentosegundo y ello a base de resolver problemas cada vez ms complejos. Todos eso cambi de aspecto cuando en 1983 Deisenhoffer, Huber y Michel cristalizaron la molcula del centro fotosinttico de Rhodopseudomonas viridis una bacteria prpura cuyo centro es semejante al PS II de plantas y determinaron su estructura. EN los aos siguientes se ha ido determinado la estructura de los centros de reaccin PS I y PS II a niveles de resolucin suficiente para poder identificar a todos y cada uno de los pigmentos que intervienen en el proceso de fotosntesis. La informacin obtenida a partir de las estructuras de los complejos ha servido para confirmar los datos obtenidos a partir de las tcnicas espectroscpicas y que se refieren a la organizacin de los centros fotosintticos as como de los pigmentos que intervienen. Es de desatacar que prcticamente todas la informacin conocida anteriormente se ha visto confirmada por los datos de estructura. No es el final del camino. No se sabe cmo se lleva a cabo la fotosntesis, sino que ahora se pueden interpretar los resultados sobre una base real, de acuerdo a la naturaleza de los compuestos presentes en las estructuras de los centros fotosintticos.

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Composicin

organizacin

de

las

membranas

fotosintticas
Entre los organismos que llevan a cabo fotosntesis estn las bacterias fotosintticas, los organismos fotosintticos ms primitivos que tienen un aparato fotosinttico ms simple y que, como caracterstica interesante, utilizan otros materiales diferentes al agua como donadores de electrones. La fotosntesis se realiza mediante protenas y otros componentes que se encuentran en las membranas. Dichas membranas se denominan tilacoides y se extienden hacia el interior de las clulas procariotas donde se hace la fotosntesis. Las clulas fotosintticas eucariotas han adquirido un orgnulo especializado para esta funcin: el cloroplasto que, en realidad, es una cianobacteria englobada dentro de la propia clula habindose logrado una simbiosis muy provechosa para ambos entes vivos. De ese origen habla el hecho de que los cloroplastos mantienen todava una dotacin gnica en forma de DNA que han mantenido, reducido en parte, a travs de todos los millones de aos que ha durado dicha simbiosis. Parte de la dotacin gnica del cloroplasto se ha ido perdiendo a lo largo de los aos, por lo que muchas de las protenas de los cloroplastos deben incorporarse desde la propia clula porque han sido sintetizadas con la informacin gnica del ncleo. Los cloroplastos, que son orgnulos de gran tamao (unas 5 m de dimetro), poseen una membrana externa fcilmente permeable a los diferentes solutos que intervienen en la fotosntesis, un espacio intermembrana y una membrana interna mucho ms selectiva que la externa que se extiende hacia el interior del cloroplasto formando una compleja red de membrana que se denominan tilacoides. La funcin principal de las membranas de la envoltura del cloroplasto es controlar el flujo de metabolitos, lpidos y protenas dentro y fuera del CP. Adems, en ellas estn localizados los sistemas responsables de la sntesis, procesamiento y ensamblaje de los lpidos, pigmentos y protenas de la membrana. La membrana interna sirve de

barrera al paso de molculas grandes tales como las protenas del citoplasma al espacio entre membranas. Los tilacoides pueden formar unos saquitos, unos espacios cerrados que se apilan dando lugar a lo que se denominan los grana. El espacio del interior de los tilacoides es el lumen. Los tilacoides que no estn formando esas estructuras sino que estn uniendo unos grana con otros son lo que se denomina lamelas. Por ltimo, el espacio de la clula o el cloroplasto que est relleno por una solucin acuosa en donde se encuentran los enzimas que realizan la fase oscura de la fotosntesis se llama estroma y es el equivalente de la matriz mitocondrial. Los principales componentes del estroma son: - muchas (300) copias de DNA, ribosomas 70S, mRNA y otros elementos necesarios para la sntesis de protenas; - enzimas implicadas en la reduccin del carbono y nitrgeno - enzimas implicadas en la sntesis de los lpidos, porfirinas, terpenoides, quinonas y compuestos aromticos. - grnulos de almidn En organismos ms simples la fotosntesis tiene lugar en estructuras membranosas que no forman orgnulos cerrados, sino que estn integrados en la propia clula. Tal es el caso de las cianobacterias en donde las membranas del tilacoide estn repartidas en la clula. En el caso de bacterias fotosintticas la fotosntesis lo lleva a cabo la membrana que rodea a la clula. Las membranas de las bacterias fotosintticas se pueden romper mediante sonicacin liberando el contenido interior y volvindose a cerrar formndose lo que se conoce como cromatforos que son elementos muy tiles para el estudio de la fotosntesis. Constituyentes de las membranas del tilacoide Como todas las membranas celulares estn compuestas por lpidos protenas y pigmentos. Los lpidos de la membrana

fotosntesis difieren mucho de los del resto de la planta apoyando el origen procaritico de estos orgnulos. Los lpidos son de varias clases, aunque hay muy pocos fosfolpidos (5-10 % de fosfatidil-colina y fosfatidilglicerol), la mayora son mono y di-glactosil-diacil gliceroles sin carga (80 % repartidos en una 50 % de MGDG y 25 % de DGDG) y el resto son los sulfolpidos sulfoquinovosil-diacil gliceroles (5 %) y diglicil-trimetil homoserina DGTS. Las cadenas laterales de los lpidos contienen cidos grasos muy insaturados como el linoleco. Las protenas de la membrana son casi en su totalidad los componentes de los centros de reaccin fotosintticos y los componentes de las cadenas de transporte fotosinttico. Hay cinco complejos proteicos que atraviesan la membrana del tilacoide y que intervienen en la fotosntesis. Hay tres complejos que contienen clorofila: el PS I (que tiene asociado un complejo antena que capta la luz, el LHC I), el PS II, que lleva tambin asociadas algunas molculas de clorofila en lo que se conoce como la antena interna y el complejo LHC II, que est separado del PS II, aunque funciona generalmente acoplado con l. Los otros dos complejos no llevan clorofila y son el complejo citocromo b6f y la ATP sintasa. Hay un estudio interesante referente al papel de un lpido en una membrana en fotosntesis. El funcionamiento eficiente del LHC II requiere la formacin de trmeros y ello depende de la presencia de un fosfatidil-glicerol que contiene un cido graso de 16 tomos de carbono con una insaturacin en la posicin 11. La disminucin en el contenido de este cido graso provoca la disociacin de los trmeros y la menor capacidad de captar luz. Esta facultad la explotan algunas plantas de arroz que se aclimatan al fro disminuyendo la sntesis de este cido graso y evitando as el dao producido por la luz en estas condiciones de bajo rendimiento fotosinttico. Los pigmentos fotosintticos: absorcin de la luz

En las membranas es donde se realiza la fotosntesis. Por ello es necesario que existan en ese espacio pigmentos que recojan la luz, la primera fase para que se pueda llevar a cabo su transformacin en energa qumica. Un pigmento es cualquier sustancia capaz de absorber luz visible. El hecho de que las plantas utilicen la luz visible se debe no a que es la que tiene una mayor cantidad de energa, que corresponde la UV, sino que es aquella de la que mayor cantidad cae sobre la superficie de la Tierra. Es decir, aquella que produce una gran intensidad aunque de poca energa. Por otra parte, el hecho de que se utilice una energa de poca intensidad produce un menor dao en las estructuras biolgicas que lo soportan. La luz activa en la fotosntesis es la comprendida entre longitudes de onda entre 400 y 700 nm. Hay dos tipos de pigmentos en cuanto a su funcin, no a su composicin: antena y centros de reaccin que se refiere a que sean los encargados simplemente de captar la luz o los responsables de llevar a cabo la reaccin fotoqumica. Dichos pigmentos son fundamentalmente las clorofilas, de las cuales hay dos especies que difieren en la naturaleza de los sustituyentes del anillo de la porfirina, la a y la b. La clorofila, como pigmento de las plantas es la sustancia ms importante del mundo. Gracias a ella se produce la entrada de los alimentos en la cadena de alimentacin de todos los animales, incluyendo al hombre. Los pigmentos absorben la luz y se excitan. Luego pueden perder esa energa de tres maneras: calor, emisin de fluorescencia y fotoqumica. Existen tambin carotenos que tienen un espectro de absorcin complementario al de las clorofilas. En las cianobacterias y algas rojas existen tambin otros pigmentos accesorios que estn constituidos por una serie de pirroles lineales, son la ficobilinas, que poseen un color azulado-violeta. Las ficobilinas se unen covalentemente a protenas que se denominan ficobiliprotenas, muy abundantes y llamativas por su intenso color durante la preparacin de protenas de cianobacterias. El conjunto de pigmentos que incluye a las

clorofilas, los carotenos y las ficobilinas da lugar a un espectro de absorcin que es prcticamente el mismo del espectro solar que se recibe sobre la superficie de la tierra.

Centros de reaccin fotosintticos

Los centros de reaccin de la membranas prpura son las mejor conocidas y, de hecho son los complejos de membranas biolgicos mejor caracterizados. H. Michel en 1982 obtuvo los primeros cristales tridimensionales de los CR de la bacteria prpura no sulfurosa Rhodopseudomonas viridis, lo que permiti determinar la estructura de este complejo, que fue el primero en ser resuelto a escala atmica. y que les vali a Deisenhofer, Michel y Huber el premio Nbel de Qumica el ao 1988. La estructura est compuesta por cuatro polipptidos y catorce (14) cofactores. Las protenas son la L, M, H y C. Los cofactores son: 4 citocromos c, cuatro bacterioclorofilas b, 2 feofitinas, 1 hierro no hemnico, un carotenoide y dos quinonas. Los cuatro hemos estn covalentemente unidos a la subunidad C, todos los dems estn unidos no covalentemente a las subunidades L y M. La subunidad C es un lipoprotena que est anclada a la membrana por un diacil-glicerol que est covalentemente unido a una cistena del extremo amino terminal. El complejo tiene 11 hlices transmembrana, 5 en la L, 5 en la M y una en la H. Una gran parte de las Subunidades L y M estn asociadas por una simetra binaria con un eje perpendicular al plano de la membrana. Aos ms tarde se determin la estructura del CR de Rhodobacter spheroides. Las dos estructuras son muy semejantes excepto que la Subunidad C est ausente en spheroides. No se tienen cristales de Rhodobacter capsulatus, de la que se tiene mucha informacin gentica y bioqumica. Lo mismo ocurre con el PS II de plantas o cianobacterias. No obstante, utilizando la informacin

obtenida de las bacterias se puede extrapolar al caso del PS II y se pueden construir modelos sobre los que trabajar acerca de los mecanismos. Funcin de los pigmentos Los pigmentos forman dos ramas, cada una con 2 bacterioclorofilas, una bacteriofeofitina y una quinona. Cada una de la ramas va de lado a lado de la membrana comenzando por el 'par especial' que son dos molculas de clorofila que estn formando un par y que se encuentran en el lado del periplasma (la parte externa de la clula). A continuacin est la bacterioclofila accesoria, una bacteriofeofitina y una quinona. Solamente la rama asociada a la Subunidad L se utiliza para el transporte de electrones. En esta rama se encuentra la quinona QA, mientras que la QB est en la rama inactiva. Entre las dos quinonas se encuentra un hierro no hemnico. La luz es absorbida por los pigmentos de la LH antena o bien por el propio par especial. En el primer caso se transfiere la energa al par especial (D) en donde hay una molcula DL asociada a la Subunidad L y la otra DM asociada a la Subunidad M. Ambas estn relacionadas por un eje de simetra. La excitacin de las molculas D se traduce en la transferencia de un electrn a la clorofila accesoria B. Este fenmeno es lo que se conoce como separacin de carga y est estabilizada por la rpida transferencia del electrn a la feofitina A que se encuentra en la rama activa. El siguiente paso es la transferencia de un electrn perpendicular al plano de la membrana al aceptor primario de electrones, la quinona QA, que est unida a la Subunidad M. A continuacin se produce la transferencia de un electrn paralelo al plano de la membrana hasta la quinona QB, que est en la Subunidad L. Mientras que QA slo puede aceptar un electrn, QB puede acomodar dos que, despus de captar dos protones da lugar a un quinol que migra para ser reoxidado por otro complejo de membrana que ser estudiado en otro momento y que es el citocromo bc1, lo que lleva consigo la liberacin de

protones en el espacio periplsmico. La creacin del gradiente de membrana es lo que permite la sntesis de ATP por la ATPasa integrada en la membrana. Los electrones que han llegado al complejo cit bc1 vuelven al CR a travs de un citocromo pequeo y muy mvil que es el cit c2, que interacciona con la Subunidad C y que permite que se vuelva a reducir el par especial que haba sido oxidado en el proceso fotoqumico. El papel del carotenoide presente en este CR es proteger al CR de la fotooxidacin mediante el quenching del estado de triplete del donador primario de electrones, el par especial. Su proximidad a BB sugiere que la transferencia de energa desde el estado triplete del donador de electrones tiene lugar va BB. El sitio QB est profundamente embebido en el complejo del centro de reaccin. A pesar de ello deben llegar dos protones cuando se reduce para dar un quinol, por lo que le deben llegar los protones desde el citoplasma a travs de la protena. Es probable que implique residuos ionizables as como molculas de agua. Los protones se moveran a lo largo de una cadena de donadores de protones y aceptores conectados por puentes de hidrgeno. De hecho, en las estructuras descritas se pueden observar cadenas de molculas de agua que se encuentran a distancias de puentes de hidrgeno unas de otras.

Las preparaciones de PS II. El aislamiento de membranas de PS II que fueran capaces de desprender oxgeno fue el inicio de una corriente de trabajos que han ayudado a aclarar su estructura y el mecanismo. Las actividades del PS II deban estudiarse hasta entonces con preparaciones muy inestables de tilacoides con una relacin seal/ruido muy baja. Estas preparaciones estn limpias de PS I y casi libres de complejo citb6/f. Mas adelante, la manipulacin de las preparaciones de PS II condujo al aislamiento de complejos de submembrana capaces de desprender oxgeno, que se denominan PS II cores o centros de reaccin. El aislamiento de nuevas

preparaciones de PS II, as como de PS I u otras subfracciones da lugar, en muchos casos a que se avance un paso ms en el conocimiento del mecanismo de la fotosntesis. En otras palabras, podemos decir que la fotosntesis est muy ligada a la descripcin de nuevos mtodos de aislamiento de preparaciones ms limpias y an capaces de llevar a cabo las funciones de la fotosntesis. En todos los casos se trata de aislar un conjunto de protenas y cofactores que sean capaces de llevar a cabo una funcin, pero que, al mismo tiempo, estn libres de otras molculas de protena y pigmentos que no son necesarios para esa uncin. Para ello se emplean diferentes estrategias en las que se utilizan tcnicas cromatogrficas y tratamientos con detergentes, que producen la separacin de los protenas y pigmentos accesorios y la obtencin de una preparacin ms activa en una determinada funcin.

La estructura del PS II La estructura del PS II se presenta en estos momentos de manera muy detallada debido en gran medida, al gran esfuerzo que se ha realizado en los ltimos aos para poder desvelar la estructura cristalina de este importante y complejo sistema. La ltima estructura disponible de un PS II corresponde a la publicada en Science en Marzo de 2004 (Science 303, 1831-1838 (2004) por un grupo de japoneses junto con Jim Barber, del King College en Londres, que han resuleto el centro PS II de la cianobacteria Thermosynechococcus elongatus, a 3,5 de resolucin en donde se ha dado informacin detallada de la estructura del OEC as como del posible mecanismo de funcionamiento de dicho centro. Como hemos mencionado ms arriba, el PS II tiene una gran similitud con el centro de reaccin fotosinttico de bacterias, aunque en las bacterias no hay desprendimiento de oxgeno y, por tanto, no existe el centro que lleva a cabo dicha funcin en el PS II. El PS II que se observa en los cristales contiene un dmero en el que los dos monmeros son casi idnticos. El monmero contiene 19 protenas, que se nombran como D1 D2, codificadas por los genes psbA y psbD. Son similares a las

protenas L y M del centro de reaccin de bacterias. Las dos protenas son muy similares y parecen un heterodmero con una simetra dimrica. Ambas protenas tienen cinco (5) hlices transmembrana. En ellas es donde estn localizados los cofactores donde se lleva a cabo la reaccin fotoqumica. Se han comparado las secuencias de muchas de estas protenas y se encuentran muchos puntos en comn. El 80-85 % de la secuencia es homloga entre unas protenas y otras. En ambas D1 y D2 hay el mximo de conservacin en las regiones correspondientes a las hlices D y las CD. A estas protenas se unen varios cofactores, tales como las clorofilas del P680, el aceptor primario, la feofitina, un hierro no hemnico y las QA y QB as como los radicales TyrZ+ y TyrD+. Se considera que son importantes porque proporcionan los sitios para que se lleve a cabo la fotoqumica del PS II al coordinar dichos aminocidos los cofactores que intervienen en esas reacciones. Por ejemplo, las His que ligan los Mg del P680, as como los que ligan al Fe. Tambin el W254 en D2 y F255 en D1 que se propone que interaccionan con QA y QB estn conservados en todas las especies. Otro residuo conservado es la Tyr 161 de D1 que da el radical al reducir el P680+ Las protenas CD47 y CP43, tambin llamadas CAa-1 y CPa-2 son protenas integrales de la membrana del PS II. Estn codificadas por los genes psbB y psbC. Tienen varias molculas de clorofila y se pueden considerar como intermediarios en la transferencia de energa entre las protenas que captan la luz (LHC en las plantas, los ficobilisomas en cianobacterias y algas rojas y el centro de reaccin fotosinttico. Tambin hay mucha conservacin en las secuencias de las protenas entre especies distintas. Se deduce que hay seis (6) hlices transmembrana y un gran bucle que queda fuera de ella. Este bucle pudiera estar implicado en la unin al centro de evolucin de oxgeno porque al introducir algunos cambios en los bucles se observa un drstica disminucin de la capacidad de desprender oxgeno de estas preparaciones. La estructura de la CP 47 y la CP 43 son muy similares.

El citocromo b-559 El cit b0-559 es uno de los componentes del PS II ms enigmticos. Es un centro redox al que no se le conoce un papel funcional. Se propone que sirve para darle la estructura correcta al centro de reaccin ya que cuando se elimina el gen no se obtiene actividad ni se puede aislar el PS II. Adems, la cantidad de las protenas D1 y D2 es muy pequea. Lo mismo ocurre si se eliminan los residuos de His a los que se une el Fe. Hay dos subunidades que conforman al cit b y esto es poco frecuente para un citocromo. Presenta dos potenciales redox, el potencial alto es de + 370 mV, lo que es raro porque los citocromos tienen potenciales entre 0 y 100 mV. El potencial bajo es de 60-80 mV. La forma de bajo potencial est a veces asociada a formas daadas durante la preparacin. Se propone tambin que pueda tener un papel en la fotoproteccin del PS II. Mecanismo de transferencia de electrones en el PS II. Las reacciones del PS II estn promovidas por la luz y consisten en una serie de reacciones que llevan los electrones desde el agua hasta una molcula de quinona que abandona el PS II para contactar con el siguiente complejo en la cadena que es el complejo citocromo b6/f. Cuando se ilumina, se libera un electrn del P680, que es una molcula del par especial que se encuentra en el lado del lumen de la membrana. Dicho electrn salta en muy corto espacio de tiempo (2-20 ps) hasta la feofitina, a travs de una molcula de clorofila. La feofitina sera, pues, el aceptor primario de electrones del PS II. A continuacin el electrn pasa a una molcula de quinona que se encuentra firmemente unida a la membrana, la QA (aprox. 400 ps). Por ltimo, la quinona QA cede el electrn a QB (aprox. 100 s) pasando a travs de un tomo de hierro que est colocado entre las dos protenas D1 y D2 con las cuales est unido mediante cuatro His, mientras que la quinta valencia es un grupo de bicarbonato en el caso de PS II, mientras que en el centro de bacterias era un resto de Glu. La llegada del segundo electrn a la QB dispara la captacin de dos

protones, su salida del sitio donde se encuentra unida y su reposicin por una quinona procedente del pool de la membrana. La salida de un electrn desde el P680 genera un radical catinico, el p680+ que debe ser devuelto a su situacin original y eso ocurre mediante la cesin de un electrn por un grupo que no tiene caractersticas redox, como es la Tyr 161 de D1 a la que se ha denominado TyrZ. sta pasara a su vez a convertirse en un radical TyrZ . El radical tiene un potencial redox muy oxidante, que se ha estimado del orden de 1,3-1.4 V, lo que hace posible que sea capaz de extraer un electrn del oxgeno del agua. Simplemente, la reaccin fotoqumica ha generado un compuesto que es ms oxidante que el oxgeno para que se realice la reaccin de rotura de la molcula de agua. Contrasta este hecho con lo que se ha encontrado en bacterias, ya que en este organismo dicho radical el para especial genera un radical de tan slo 0,4 V que se reduce con un citocromo c.

La estructura del OEC Hace unos dos o tres millones de aos se produjo a travs de la evolucin un centro de reaccin fotosinttico que desprenda oxgeno al extraerlo del agua. De esta manera los organismos capaces de llevar a cabo esta reaccin disponan de una fuente inagotable de electrones y protones activados biolgicamente. Como consecuencia de esta reaccin de rotura de la molcula de agua el oxgeno se fue acumulando en la atmsfera y pudieron aparecer los organismos que respiran. Los primeros experimentos que abrieron una puerta en la investigacin acerca del mecanismo de la rotura de la molcula de agua fueron realizados por Joliot en 1969 utilizando flashes de corta duracin para iluminar cloroplastos de espinaca o clulas de Clorella que estaban adaptadas a la oscuridad. El resultado fue una prueba evidente de que el oxigeno se emite de una manera que evidencia un cierto ritmo. De hecho, el mximo de oxgeno desprendido aparece despus del tercer flash, y a partir del mximo se produce a los cuatro

flashes y as hasta que se rompe el ritmo y se alcanza un estado estacionario. La interpretacin que se hace de este experimento es que el complejo pasa por cuatro estados siendo cada uno propiciado por un fotn. As pasaran desde el estado S0 hasta el S4, cada uno despus de absorber un fotn. Otro experimento que permiti un avance se produjo al observar la seal de EPR correspondiente al Mn en las preparaciones de OEC, lo que asociaba este metal a dicha reaccin. Se ha utilizado la tcnica de EXAF (Extended Xray absorption fine structure) en donde la modulacin de la absorcin de rayos X se puede interpretar como densidad electrnica alrededor de un tomo. Con estas tcnicas se proponen una serie de estructuras, de entre las cuales hay una denominada dmero de dmeros que es la que tiene ms adeptos. En este modelo hay 4 Mn unidos por dos puentes dioxo en donde hay otros carboxilatos que unen los Mn. Hay una His de la protena que interviene uniendo el cluster. Tambin est posicionada muy cerca la Tyr 161 que es la que se convierte en el radical TyrZ+. Se observan las molculas de agua unidas a los Mn que reaccionarn en el proceso fotoqumico. La estructura del PS II desvelada en Marzo de 2004 muestra las densidades electrnicas que permiten identificar no slo los residuos de la protena implicados, sino tambin la naturaleza y posicin de los metales que intervienen. Indican que hay cuatro metales en un dominio mayor que podra ser un tetrahedro, mientras que hay un quinto metal en una regin extendida que se encuentra cercana. Mediante el examen de los mapas diferenciales de rayos X anmalos, que indican mucha diferencia entre el Ca y el Mn se propone que uno de los vrtices del cubo est ocupado por un Ca, mientras que el cuarto Mn est en la regin extendida cercana. Los restantes vrtices del cubo Mn3CaO4 estn ocupados por grupos oxo que conectan con los Mn. Los datos de cristalografa de rayos X indican que el Mn localizado en la regin extendida une una molcula de agua que sera la que sufre la oxidacin. El enlace 0=0 se

formara mediante un ataque nucleoflico desde una segunda molcula de agua que est ligada al tomo de Ca del cubo que puede actuar como un cido dbil del Lewis. La cadena de agua al sitio QB. El sitio QB est profundamente embebido en el complejo del centro de reaccin. Como debe protonarse durante el ciclo cataltico para dar una hidroquinona, debe captar dos protones y lo hace del lado del estroma, en este caso el citoplasma, por lo que se encuentra con una gran porcin de la protena que est en el camino. Por ese motivo se piensa que la protonacin se lleva a cabo a travs de residuos protonables de la protena as como con molculas de agua. Los protones podran as desplazarse a travs de una cadena de elementos que actan como aceptores y donadores de puentes de hidrgeno. En las estructuras cristalinas disponibles se pueden observar verdaderas cadenas de molculas de agua alineadas a lo largo de un canal que une el medio externo con el centro donde se encuentra en QB. Cada una de las molculas de agua se encuentra a una distancia que est ms o menos a la distancia de los puentes de hidrgeno. De esta manera llegaran los protones a la QB desde el citoplasnma y luego los perdera en el lumen, con lo que se establecera un flujo de protones desde el citoplasma o estroma al lumen, con la consiguiente bajada del pH en este espacio.

EL PS I
El PS I, o centro de reaccin fotosinttica I, es un complejo multienzimtico asociado a membrana que se puede denominar, de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC como una Plastocianina-ferredoxina oxidorreductasa en el sentido de que lleva a cabo una reaccin de transferencia de un electrn desde la plastocianina, cuyo potencial es de E'o = +380 mV, hasta la ferredoxina, cuyo potencial es de E'o = 420 mV. Eso significa que debe vencer una gran barrera termodinmica que es para lo que se utiliza la energa de la radiacin luminosa. Este proceso es muy eficiente puesto que

se puede decir que prcticamente el 43 % de la energa de del fotn rojo, de acuerdo con la luz absorbida, se transforma en energa qumica. En los ltimos aos se ha avanzado mucho en el conocimiento de la estructura y funcin del PS I as como de otros componentes de la fotosntesis. Se conoce la estructura de la plastocianina as como de la del citocromo c6 que la sustituye en aquellos organismos que se cultivan en ausencia de Cu y en presencia de Fe. Se conoce la estructura de la ferredoxina y flavodoxina, as como de la FNR de Anabaena y de otras cianobacterias. Es ms, recientemente, en el ao 2001 se ha publicado la estructura, a una resolucin de 2,5 , del PSI de una cianobacteria. Por otra parte en los ltimos aos se ha avanzado mucho en el conocimiento de la estructura y la funcin de muchos de los componentes del PS I, al mismo tiempo que se han clonado y se han llevado a cabo experimentos de mutagnesis en algunos de ellos, con lo que se empieza a comprender cmo interaccionan entre ellos y cmo participan en el transporte de electrones. Respecto a la nomenclatura de los genes que codifican las protenas del PS I es necesario aclarar que se ha estandarizado su nomenclatura, que consiste en utilizar las letras en cursiva psa y luego una letra que va desde la A a la M con maysculas. Las protenas se nombran siguiendo el mismo sistema, pero con letra normal y la primera en mayscula PsaA hasta la PsaM, pero tambin se nombran como PsIA. Arquitectura del centro PS I La organizacin de las diferentes subunidades del complejo as como de sus cofactores, ha sido determinada por cristalografa de rayos X a una resolucin de 2,5 A. El centro de PS I de cianobacterias aparece como un trmero de peso molecular 3 x 356.000. Esta forma est presente tambin in vivo. Cada monmero contiene 11 subunidades de protenas diferentes que coordinan ms de 100 cofactores. Las subunidades PsaA (en azul en la Figura) y el PsaB (en rojo en la Figura) comparten muchas similitudes en la

secuencia de protenas as como en su estructura. Contienen 11 hlices transmembrana cada una. En la estructura por rayos X correspondiente al PS I de la cianobacteria Synechococcuss elongatus, se observan dos dominios diferentes, el llamado dominio de conexin, que no sobresale ni por enzima ni por debajo de la membrana, y que sirve, aparentemente, para unir los monmeros en trmeros. El dominio mayor es el cataltico, que tiene salientes de unos 35 hacia el estroma o de unos 15 hacia el lumen y que contiene los componentes de la reaccin fotoqumica de separacin de cargas. Se supone tambin en este caso que la parte que sobresale hacia el estroma corresponde a los polipptidos hidroflicos, PsaC, D y E, que son las partes por las que interacciona el PS I con la Ferredoxina (ver Figura). Tambin hay una cavidad en el lado del lumen que podra corresponder al sitio de unin de la plastocianina o el citocromo c6. Se observan tres regiones ricas en densidad electrnica, que podran corresponder al centro sulfofrrico Fx, que forma parte del ncleo del PS I, y que sera el ms interno, mientras que los otros dos, los FA y FB, son parte de la subunidad PsaC. Hay un eje de simetra que comprende 22 de las hlices transmembrana, 8 hlices de superficie, los cofactores del sistema de transporte de electrones (excepto (FA y FB) y un par de molculas de clorofila de la antena de conexin. Este eje comprende a las subunidades PsaA y PsaB y pasa por el centro de hierro FX. 11 de las hlices transmembrana y 4 de la superficie son de las subunidades PsaA y PsaB. Todas tienen su pareja. No se puede saber cul es de A y cul es de B. En la Figura aparece la subunidad PsaF (en amarillo), una subunidad importante en plantas porque es el sitio de unin de la plastocianina. En cianobacterias no tiene esa funcin porque la interaccin con el PS I es diferente. Con respecto a los cofactores del PS I se puede decir que se han identificado ms de 100 molculas de clorofila que forman parte del PS I. A pesar de que se est lejos de conocer la funcin de todas ellas las que juegan un papel cataltico estn localizadas. As, hay un par de clorofilas cerca del eje de rotacin, prximas a la depresin del lado

del lumen, lo que indica que puede recibir electrones de la plastocianina o del citocromo c6. Seran dos planos de porfirina separados por unos 3,6 y que estn perpendiculares a la membrana. En la Figura se indica su localizacin as como los residuos que las rodean. Hay otras dos molculas de clorofila prximas, semejantes en posicin a otras que se han encontrado en la estructura del centro de reaccin de las membranas prpura por Deisenhoffer, Michel y Huber, que haran de puente de los electrones en su camino hacia el aceptor primario de electrones que se supone que es una molcula de clorofila que se encuentra como un monmero y relativamente cerca de las clorofilas accesorias. Forman dos ramas por las que podran pasar los electrones hacia el aceptor de electrones. No obstante, an no se ha resuelto cul es el papel de cada una de las ramas en este proceso de transferencia de electrones. Por analoga con las clorofilas del centro de reaccin de bacterias se propone que estos pigmentos accesorios participan en la reaccin de transferencia de electrones. El heterodmero PsaA/PsaB Las protenas PsaA y PsaB son las mayores del PS I. De hecho, se expanden de un lado a otro de la membrana y contienen un alto nmero de centros redox as como de pigmentos. Se conocen las secuencias de diferentes genes de dichas protenas, tanto de plantas como de cianobacterias. Llama la atencin el hecho de que son de un gran tamao: unos 740 y 734 Aa en Synechococcus, la A y B, lo que significa tamaos del orden de 81 kDa. Entre las dos protenas existe un 45 % de identidad. Otro hecho destacable es que la homologa entre las protenas A de eucariotas y cianobacterias es del 95 % y lo mismo ocurre con la PsaB que tambin es idntica en un 95 % entre diferentes especies. Eso significa que juegan una funcin anloga y muy especializada, lo que deja muy poco margen de variabilidad. Presentan tambin una gran semejanza en su estructura terciaria y cuaternaria. Ambas protenas son transmembrana, como se haba determinado anteriormente con anticuerpos especficos que permiten

determinar si un protena est expuesta al espacio luminal o estromal o a ambos, como sera este caso. Se detectan tambin dos cistenas en cada una de las protenas, lo que significa que el centro Fe/S, que se denomina Fx, el nico en el heterodmero, est soportado por ambas cadenas polipeptdicas, un hecho que resulta bastante inslito. Como consecuencia de la transferencia de la energa captada por las molculas de clorofila de las antenas, y mediante el mecanismo de transferencia de energa de Foster ya descrito, la energa llega a un pigmento donde queda atrapada al encontrarse en un nivel energtico ligeramente inferior. Este pigmento de propiedades diferentes, es un dmero de clorofila a que cambia su espectro alrededor de 698-700 al oxidarse, se pierde absorbancia a esta longitud de onda. Debido a ello se le denomina P700 y al excitarse puede perder un electrn quedando como una especie cargada P700+. La pregunta ahora sera a qu le da su electrn el P700? cul es el aceptor primario de electrones en el PS I, ese compuesto que fue buscado con tanta insistencia durante la dcada de los 70, como se ha citado ya varias veces. Hay acuerdo general acerca de que el aceptor es el llamado Ao, que consiste en una molcula de clorofila aislada y separada unos 12 A del par de clorofilas del centro de reaccin. Este proceso tiene lugar en tiempos muy cortos, del orden de 3 ps. De nuevo tiene lugar un proceso muy rpido como es la reoxidacin del Ao-. Al transferirle su electrn al siguiente componente de la cadena, una molcula de filoquinona (vitamina K1), que se denomina A1. Tambin este proceso transcurre en unos 30 ps. Este pigmento absorbe a 430 nm por lo que antes de identificarlo se le llam P430 y se propuso como aceptor primario de electrones del PS I. Ahora se denomina A1 y en su forma reducida sera A1-. En este punto se podra preguntar uno por qu no se produce la reaccin inversa, es decir reoxidacin del P700+ con el electrn de A1. Dicha reaccin no se observa a menos que se cumpla alguna de las dos siguientes condiciones artificiales: o bien que se haya extrado el centro Fx, o

bien que se hayan reducido previamente los centros Fx, FA y F B. Parece lgico, por tanto, que el siguiente componente de la cadena sea el centro Fe/S denominado Fx, que se encuentra a slo 12 de distancia del A1. Una razn que apoya la propuesta de que el centro Fx participa en la cadena de transporte de electrones es que si se cambia mediante mutagseis dirigida una de las cistenas que mantienen la agrupacin Fe/S por Ser, se forma un centro que contiene slo 3Fe/4S, que se puede reducir con ditionito aunque la transferencia hasta los centros FA y FB se ve alterada en parte. El PsaF La secuencia de diferentes genes que codifican a este polipptido indica que tiene una secuencia correspondiente a un pptido seal que justificara la localizacin que se le adscribe en el lado del lumen, a donde tiene que ser transportado una vez que se sintetiza en el estroma del cloroplasto. Tambin se observa una regin con una alta concentracin de cargas positivas. Por otra parte, los estudios de hidropata indican que hay una regin con fuerte contenido en aminocidos hidrofbicos que indicara que existe una hlice que atraviesa la membrana que servira para anclar la protena al heterodmero PsaA/PsaB. Esa hlice se cree que es la i de la estructura cristalina (en amarillo en la Figura). Respecto a la funcin del PsaF en el PS I se acepta como probado que sirve para fijar al donador de electrones la plastocianina o el citocromo c6 para que puedan ceder electrones al P700+. En cualquier caso esto plantea una interesante pregunta, que tambin se da en otros puntos del PS I, y es que si la PC y el Cit c6 juegan el mismo papel unindose a la misma cadena PsaF, cmo es que lo hacen teniendo unas estructuras tan diferentes. Apoyan esta propuesta experimentos cinticos y el hecho de que se ha unido covalentemente la PC a la PsaF en plantas superiores, lo mismo que ms recientemente, se ha hecho entre el cit c6 y la PsaF de cianobacterias. De todas formas existen algunos puntos de controversia acerca de esta propuesta que

habr que aclarar antes de que se d por definitivamente establecido el papel de la psaF en el Ps I. La protena PsaC Tiene 81 aminocidos en la mayora de los organismos de los que se conoce la secuencia. Entre ellas hay una muy alta analoga de secuencia existiendo pequeas variaciones entre las plantas monocotiledneas, las dicotiledneas y las cianobacterias. La eliminacin del gen da lugar a un fenotipo que es letal en cultivos fotoautotrficos, indicando que es un gen esencial para el aprovechamiento de la luz. La protena es ligeramente acdica con un pI de 5,5 y contiene 9 Cys ocho de las cuales se encuentran en dos agrupaciones del tipo CxxCxxCxxxCP, que son tpicas de protenas que tienen grupos sulfofrricos del tipo 4Fe/4S. La secuencia de la PsaC es muy similar a la de otras ferredoxinas o trozos de ellas. Tal es el caso de la de Azotobacter y otras bacterias y sulfobacterias. En aquellos casos en que se conoce la secuencia se comprueba que sta es muy similar en todas ellas. Una caracterstica estructural de estas protenas es que muestran dos dominios simtricos que tienen una estructura semejante y contienen cada uno a un centro Fe/S. En cada uno de los agrupamientos de cuatro Cys las tres primeras estn uniendo tomos de Fe mientras que el tercero lo hace con el Fe del otro centro. Debido a este hecho los dos dominios no se muestran como independientes sino que cooperan entre s para dar lugar a un eje binario. Esencialmente se puede decir que esta estructura es la mnima requerida para englobar a los dos centros sulfofrricos dado el pequeo tamao de la protena. En cualquier caso es de destacar el hecho de que, incluso en secuencias que fueran ms largas, por tener inserciones en algunas regiones, no se afectara la disposicin de los centros Fe/S debido al hecho de que la cuarta Cys, que enlaza al segundo centro, est situada necesariamente prxima al primer centro por estar en una agrupacin de secuencia concreta.

Con respecto a la funcin del PsaC est claro que tiene dos centros redox que participan en el transporte de electrones entre el Fx del PS I y la ferredoxina o la flavodoxina. Se podra considerar que su funcin es conseguir que los electrones salgan del ncleo hidrofbico del centro de reaccin y pasen a la regin del estroma, que es hidroflica. Ello se demuestra cuando se interrumpe la fotorreduccin del NADP+ al eliminar del PS I las subunidades PsaC, PsaD y PsaE. El transporte de electrones se restableca al aadir las protenas PsaC y PsaD al ncleo PS I-Fx. Ello indica, a su vez, que el Fx no puede dar electrones a la ferredoxina. Por otra parte en la protena de plantas se destruye el FB mediante tratamiento con HgCl2 y en ese caso no hay fotoreduccin de NADP+. Se propone que la secuencia de transferencia de electrones es Fx ---> FA ----> FB. La localizacin del FA ms cercano al Fx indica que sta es la secuencia, aunque los potenciales redox indicara la direccin opuesta. Para probar el orden de intervencin sera necesario alterar el potencial de uno de los centros y ver qu pasa con el transporte de electrones. Cuando se ha hecho la mutacin C14D se obtiene una protena con un centro FB de potencial -90, mientras que el del FA se mantiene en -520 mV. Por otro lado al hacer la mutacin C51D el potencial del FA pasa a ser -98 mV mientras que el del centro FB es de -580 mV. Ello indica, en primer lugar, que lo que determina el potencial del centro redox es la secuencia de la protena y concretamente en el entorno del centro redox. En segundo lugar que el cambio en uno de los centros no afecta al otro, lo mismo que no est determinado por el hecho de que al titular el segundo centro, el FB, ya se ha reducido el FA, que estar como FA-. Desgraciadamente no se han estudiado las protenas con centros 3Fe/4S en experimentos de reconstitucin del ncleo del PS I. El ideal sera ver si en aquellos sistemas en donde tenemos un sumidero en el centro FA o bien en el centro FB por haberles cambiado su potencial hacindolo ms positivo se detiene el transporte de electrones cuando est el otro centro reducido, en cuyo caso se concluira que el

centro alterado est despus del otro centro que se reduce. Si no est reducido el centro intacto querr decir que el centro alterado est antes del otro. Este tipo de experimentos tambin se estn intentando llevar a cabo utilizando centros en donde se integra un metal diferente al hierro, en cuyo caso se obtienen centros con potenciales diferentes. PsaD La secuencia del gen del PsaD muestra que corresponde a una protena de unos 135-150 aminocidos entre los cuales hay un enorme cantidad de Lys y Arg. La secuencia se encuentra bastante conservada entre las cianobacterias (del orden del 65 %) mientras que lo est algo menos con relacin a plantas superiores (55 %). El punto isoelctrico es muy alto, del orden de 9-9,5 aunque hay algunas que lo tienen ms bajo. Los perfiles de hidropata y experimentos de extraccin indican que la PsaD est fuera de la membrana del tilacoide y es muy soluble. La mayor abundancia de residuos bsicos en el extremo carboxilo hace pensar que esa porcin de la protena es la que establece el contacto con la ferredoxina (o flavodoxina) que son negativas. Al mismo tiempo se piensa que estar prxima a la PsaC formando una especie de capuchn. La funcin de la PsaD se ha adelantado al hablar de su estructura. Se propone que es el sitio de unin de la ferredoxina (o flavodoxina) al PS I. Esta propuesta, que se haca sobre la base de la abundancia de cargas positivas en la protena, se apoya en el hecho de que la ferredoxina se une covalentemente a la PsaD cuando se incuban con EDC. Se apoya tambin en el hecho de que cuando se utilizan + mutantes PsaD no tiene lugar la fotoreduccin del NADP y se recuperaba dicha capacidad al aadir PsaD pura. Curiosamente dicho requerimiento es menos estricto si se utiliza flavodoxina, lo que indica que esta protena no requiere a la subunidad PsaD para unirse al PS I. Una segunda funcin de la PsaD consiste en orientar adecuadamente a la subunidad PsaC para su unin al PS I.

Experimentos de eliminacin del gen aportan poca informacin adicional acerca de la funcin del PsaD. Dichos mutantes son incapaces de crecer en la luz. Cuando se asla el PS I de estos mutantes les faltan algunas subunidades, pero esto puede indicar que no las tengan in vivo o que la hayan perdido al aislar el PS I. Experimentos ms recientes indican que estn presentes las otras subunidades. PsaE La secuencia de aminocidos deducida a partir de la secuencia del gen de diferentes organismos muestra que la PsaE es una protena de 70-75 aminocidos con una masa molecular de 7-8 kDa y un alto grado de homologa entre ellas (unos 75 %). Se tiene una estructura de NMR para esta protena. Tiene un alto contenido en hoja ya que contiene cinco lminas . Es interesante sealar que en la

estructura se observa que la parte superior no contiene prcticamente aminocidos cargados sino que son polares o apolares, mientras que en la parte inferior existe un elevado nmero de residuos cargados. Esta diferente distribucin de los aminocidos segn el tipo a que pertenezcan podra deberse a su papel en la unin a PsaC, al heterodmero PsaA/PsaB o a protenas transportadoras de electrones solubles. Con respecto a la funcin de esta protena existen varias pruebas de que aumenta la velocidad de intercambio de electrones entre la ferrredoxina (o la flavodoxina) y el PS I. De nuevo son experimentos en los que se elimina el componente PsaE de la preparacin y se observan cinticas que suelen ser la mitad o la cuarta parte de la original. La adicin de la subunidad restaura parte de la actividad perdida. Sin embargo sta no puede ser la principal funcin de la subunidad ya que la ausencia del gen no causa un fenotipo letal. La discrepancia entre los datos bioqumicos (obtenidos con preparaciones de membranas) y los fisiolgicos (medidos con organismos enteros) sugiere que no es necesaria una eficacia del 100 % en la reaccin (en

este caso de transporte de electrones) para que un organismo crezca mejor. Una segunda funcin de la subunidad PsaE fue descubierta despus de que un mutante PsaE se observara que era ms sensible a la temperatura que la silvestre.

Todos estos datos nos han proporcionado una visin de la estructura del PS I as como de su funcin en el transporte de electrones en la fotosntesis. Hemos visto que en este momento se puede presentar una visin bastante coherente de este centro, de sus componentes as como de la funcin de cada uno de ellos. Se ha recorrido un largo camino y ya se puede prcticamente tener un idea de cmo funciona. No se esperan novedades en este campo. No obstante, son muchas las lagunas que an quedan por rellenar hasta que se pueda tener un cuadro completo de cmo funciona la fotosntesis.

El complejo citocromo b6/f

Las molculas de quinona reducidas en el PS II deben reoxidarse para generar los equivalentes de reduccin al mismo tiempo que se genera el ATP, los dos productos de la fotosntesis. Hemos visto en temas anteriores que los electrones que se extraan del agua en las reacciones dependientes del PS II deban llegar al PS I para terminar en el NADPH. La conexin entre los dos se realiza a travs del complejo cit b6/f. Se puede decir, por tanto, que el citocromo b6/f es una plastoquinona-plastocianina oxidoreductasa ya que transfiere electrones desde la plastoquinona hasta la plastocianina generando un gradiente de protones que sirve para la sntesis de ATP. En algunas algas la plastocianina se sustituye por citocromo tipo c, el citocromo c6 cuya sntesis depende de la presencia de hierro o cobre en el medio de cultivo. Ocurre igual en el otro proceso en el que se produce transformacin de energa biolgica, la respiracin. En la mitocondria hay otro complejo que se denomina el citocromo b/c1 que transfiere electrones desde la ubiquinona hasta el

citocromo c. Vemos, por tanto, la similitud de ambos sistemas, que est reflejada en una Figura. Complejos de este tipo se han encontrado, de hecho, en todas las mitocondrias y en muchas especies bacterianas. Se pensaba que slo estaran en la fotosintticas, pero se han encontrado en muchas ms. El complejo citocromo b6/f se requiere tambin para llevar a cabo la fotofosforilacin cclica. En este caso se transforma la energa captada por el PS I en un gradiente transmembrana que puede servir para la sntesis de ATP. La localizacin del complejo citocromo b6/f incluye la membrana de los grana y los tilacoides estromales, a diferencia de los PS I y PS II que estn distribuidos de manera irregular en estas membranas. De hecho encontramos una mayor cantidad de complejo en la parte final de los sacos de grana, justamente entre los PS I y PS II indicando su funcin de comunicacin entre ellos. Se he resuelto la estructura del complejo citocromo b6/f de la cianobacteria termfila Mastigocaldus laminosus a 3,0 de resolucin por el grupo de Bill ramer, de Purdue University Science, 302, 1009-1014 (2003). Se obtiene como un dmero, tal como se observa en la Figura, en donde cada monmero contiene cuatro subunidades proteicas grandes, que son el citocromo b6, con dos grupos hemo, el hemo bn y el hemo bp, cada uno coordinado a dos His; la Sid IV, relacionada con el citocromo b6, la protena Rieske, que contiene un centro sulfofrrico del tipo [2Fe-2S]; y el citocromo f, un citocromo del tipo c. Hay tambin otras cuatro subunidades altamente hidrofbicas, que son la PetG, PetL, PetM y PetN, as como una molcula de clorofila a, un -caroteno y una plastoquinona, lo que da lugar a un complejo de un peso molecular de 217 kD. Por otra parte, anteriormente, se haban determinado las estructuras de una forma trucada del citocromo f as como de la de la protena Rieske. Cada monmero presenta 13 hlices transmembrana que son 4 del citocromo b6, tres de la subunidad IV, y una en cada una de las protenas citocromo f, protena Rieske y las

subunidades PetG, -L, -M y N. Los dominios extrnsecos del citocromo f estn situados en el lado luminal de la membrana (lado p). Los dos monmeros forman una cavidad que se encuentra vaca en la interfase transmembrana y que est colocada en el lado estromal de la membrana y que se propone que sirve para el intercambio de quinonas en el complejo. El citocromo b6 El citocromo b6 y la subunidad IV son homlogas a las porciones N- y C- terminales del citocromo b del complejo citocromo bc1, de la misma manera que lo es la parte central que corresponde a la protena Rieske. Sin embargo, el citocromo f, que es un citocromo tipo c no es homloga al citocromo c1 del complejo bc1. Los dos hemos del citocromo b6 tienen un potencial que resulta peculiar para una protena de este tipo, ya que se les han asignado los valores de -50 y -150 mV para cada uno de ellos. No es casualidad que en mitocondrias ocurra prcticamente lo mismo donde los hemos del citocromo b tienen potenciales muy prximos a stos. Una sorpresa que ha resultado al resolver la estructura de este complejo consiste en que ha aparecido un nuevo grupo hemo que se encuentra asociado al hemo bn del citocromo b6. Dicho grupo hemo parece que no pertenece a ninguna familia de hemos, por lo que se propuesto, por el momento, el nombre de hemo x. El hemo x se encuentra unido covalentemente a la protena por una Cys del citocromo b6. El Fe del hemo no est coordinado a un residuo de la protena sino a una molcula pequea que se propone que es de agua. Dicha molcula de agua est unida por puentes de hidrgeno a un propionato del hemo bn as como a otro residuo del citocromo b6. La sexta valencia est vaca. Los planos casi perpendiculares de los hemos x y bn estn en contacto a travs de la unin por el puente propionatoagua, lo que implica que exista una transferencia de electrones eficiente entre los dos grupos hemo. Sobre la funcin del grupo hemo x se hablar ms adelante.

El citocromo f El citocromo f del complejo b6/f es un citocromo tipo c y, por lo tanto, tiene el grupo hemo unido covalentemente a dos cistenas de la protena, de acuerdo con el motivo CXXCH en la porcin amino terminal, que es comn a los citocromos f y c1. En los dos casos el extremo carboxilo de la protena est precedido por un trozo de unos 20 aminocidos hidrofbicos que se piensa que puedan ser el sitio de anclaje a la membrana. Para conseguir cristales de la protena de membrana se ha aprovechado el hecho de que en algunas especies la porcin de la hlice hidrofbica que produce el anclaje del citocromo a la membrana se elimina durante la purificacin de la protena siendo sta soluble en agua. Se da tambin le circunstancia muy favorable de que este fragmento contiene el grupo hemo y ste mantiene el mismo potencial redox que en la protena intacta, por lo que se puede asumir que la estructura es muy semejante a la de la protena nativa. Dicha estructura es muy diferente de las de otros citocromos en los que hay preferentemente hlices , mientras que en el citocromo f hay mayora de hojas . La protena est constituida por dos dominios de plegamiento diferentes. Uno que se encuentra en la parte superior de la molcula y que est constituido por los residuos 169 al 231, que est constituido casi exclusivamente por hojas y otro, constituido por los residuos 1 al 168 y del 232 al 246, que es el ms grande y donde se encuentra el hemo. En este dominio hay mayora de cargas positivas y es donde se encuentra la Lys 187 que ha sido descrita que se une covalentemente al Asp44 de la plastocianina, motivo por el cual se propone que es uno de los residuos que interacciona con la plastocianina. El grupo hemo se encuentra en la regin entre los dos dominios, aislado de la fase acuosa por un escudo muy amplio formado por una serie de aminocidos hidrofbicos y muchas Pro. La principal caracterstica del citocromo f es el sexto ligando del Fe, lo que lo diferencia tambin del citocromo

c1 ya que en ste es una His, mientras que en el citocromo f es el grupo -amino de la Tyr en la primera posicin. Se comprueba, al conocer esta estructura, que existe una gran variedad en lo que se refiere al sexto ligando de los hemos en los diferentes citocromos. En algunos de ellos, como es el caso del citocromo b5, es otra His (como el quinto ligando). Como se ha dicho antes en los citocromo c el sexto es una Met. Por ltimo, en una bacterioferritina el quinto y sexto ligando son Met. Parece que no hay relacin entre el tipo de hemo y el ligando. El extrao ligando que tiene esta protena implica otro hecho interesante y es que el centro redox de la protena no puede integrarse en sta hasta que no se haya eliminado el pptido seal para que se libere as el grupo NH2 de la Tyr1 y esto no ocurre hasta que la protena no es translocada hasta el lumen. Si, como parece, el hemo es una seal importante para que la protena se pliegue y esto no ocurre hasta que se le elimina el pptido seal, puede que sea la forma de regular el plegamiento para que la protena est desplegada antes de pasar la membrana. Se puede decir, por tanto, que el citocromo c y el f representan otros dos ejemplos de evolucin convergente, de los que ya hay varios en diferentes sistemas. Una vez determinada la estructura de este citocromo y conocido la naturaleza de los residuos que forman parte de l se puede proponer la forma en la que se produce el acoplamiento entre dicha protena y la plastocianina, tal como se propone en la Figura. El potencial redox del citocromo f est en la zona positiva, como es normal en los citocromos tipo c (E'o = + 0,37 V). De acuerdo con este valor el citocromo f se puede reducir con ascorbato, lo mismo que la protena Rieske, Por el contrario, el citocromo b slo puede reducirse con ditionito, lo que indica un potencial de reduccin mucho ms negativo. La protena Rieske.

Es una protena sulfofrrica con un centro 2Fe-2S que tiene un potencial inusualmente positivo por lo que puede reducirse con ascorbato. De hecho el alto potencial de estos grupos, que fueron ya descubiertos en mitocondrias, se debe a que el hierro tiene coordinado el N de una His, adems del S. Su unin a la membrana se hace por la porcin C-terminal, aunque el centro metlico se queda fuera. Mecanismo de transferencia de electrones y transporte de protones del complejo citocromo b6/f La funcin del complejo citocromo b6/f es hacer posible el paso de los electrones desde el fotosistema PS II, donde se produce la rotura de la molcula de agua, hasta el PS I, donde se produce la reduccin del NADPH. As mismo, el citocromo b6/f es el responsable de llevar a cabo el aprovechamiento de la energa que se libera en dicho proceso. Dicha energa se aprovecha para sintetizar una o varias molculas de ATP. Una vez que se conoce la estructura del complejo as como muchos otros aspectos relativos a la energtica de los procesos biolgicos es obligado intentar proponer un mecanismo que explique cmo se produce el proceso molecular de transformacin de la energa de la fotosntesis. Los cuatro centros del complejo funcionan en dos parejas, dos de ellos de potencial alto y dos de potencial relativamente bajo. La de potencial ms prximo a la quinona es la protena Rieske (+ 300 mV) y es la que recibe un electrn de la quinona, que despus pasa al citocromo f (+340 mV). La hiptesis quimiosmtica de Michel propone que la energa que se desprende en el proceso de transporte de electrones en el cloroplasto, lo mismo que en la mitocondria, se conserva mediante la formacin de un gradiente de protones consistente en la acumulacin de stos en un lado de la membrana. Los protones se acumularan en un lado de la membrana debido a que el paso de los electrones a travs del complejo citocromo b6/f provoca el paso de un cierto nmero de protones, an por determinar, de un lado al otro

de la membrana (del estroma, lado n al lumen, lado p). Hace muchos aos el propio P. Michel propuso un mecanismo que explicara cmo se produce transporte de protones al pasar los electrones por el complejo. Dicho mecanismo se conoce como el ciclo Q y sigue siendo vlido, a pesar del paso de los aos y de que en este tiempo se han conocido muchos detalles concernientes a los componentes de dicho complejo. El ciclo que se resume en los siguientes trminos: en el citocromo b6/f hay dos sitios diferentes con afinidad para las quinonas, cada uno con afinidad diferente por una especie redox de la quinona. As hay uno, que es el Qo por oxidado o outside (tambin llamado Qp por positivo) que est en un sitio de la membrana prximo al espacio intratilacoidal. A l se une preferentemente la quinona reducida. Hay otro denominado Qi que es por interior o sitio de reduccin de la quinona (tambin llamado Qn por negativo), que est en la porcin ms externa de la membrana. De acuerdo con este modelo una quinona reducida se une al Qo desde donde se transfiere un electrn a la protena Rieske para pasar a continuacin al citocromo f y luego a la plastocianina. Como consecuencia de esa reduccin se genera una semiquinona que es capaz de reducir al citocromo bp y ste rpidamente reduce al citocromo bn que est situado muy prximo y en el otro lado de la membrana (estn perpendiculares los planos a la membrana). El hemo bn reducido es capaz ahora de reducir una molcula de quinona hasta dar la semiquinona, lo que tiene lugar en el sitio Qi. Ahora tiene lugar otro ciclo cataltico mediante el cual llega de nuevo un electrn a travs del hemo bp y el hemo bn hasta la semiquinona que estaba en la posicin Qi quedando ahora reducida completamente y que se disocia ya que este sitio tiene afinidad por la quinona oxidada. Como consecuencia de los dos ciclos de oxidacin de las quinonas se produce el paso de dos electrones desde la quinona hasta la plastocianina, al mismo tiempo que cuatro protones pasan desde el estroma al interior del lumen. El primer par lo hace al reducirse la quinona con los

electrones de proceden del PS II y que son liberados al ceder la quinona los electrones al complejo bf siendo los protones impulsados hacia el lumen. El otro par de protones se transfiere al reducirse la quinona en el sitio Qi con los electrones procedentes del citocromo bn. La reaccin es QH2 + PCox QH2 + QH2 + PCox 2 PCox + + Q -QH --Q -Q + + Q PCrd + + PCrd QH + + QH2 2 H+ + + H+ H+

2 PCrd

Los protones que se utilizan para reducir una quinona en el PS II proceden del lado del estroma, mientras que se pierden por el lado del lumen. Por otro lado, los protones que se utilizan para reducir quinona oxidada as como la semiquinona, tal como se indica en las reacciones detalladas ms arriba, proceden tambin del lado del estroma.

Regulacin Puesto que la transferencia de electrones desde la quinona al complejo b6/f es lenta constituye en muchos casos el paso limitante en la Fotosntesis. Por eso puede ser un sitio a propsito para establecer un mecanismo de regulacin pudiendo actuar como un sensor del estado redox del cloroplasto o la clula fotosinttica. El mecanismo sera el siguiente: un nivel alto de quinona reducida indica que el PS II est funcionando muy eficientemente y que se est acumulando poder reductor. Entonces se activa una quinasa que fosforila a una protena del LHC II asociado normalmente al PS II, lo que hace que pierda afinidad por este fotosistema y lo gane por el PS I. De esta manera la acumulacin de poder reductor reduce el nmero de antenas del PS II y aumenta el del PS I, con lo que se produce un tirn de los electrones hacia el NADPH.

Plastocianina La conexin entre el complejo citocromo b6/f y el PS I se realiza a trabes de la protena de pequeo tamao conocida como plastocianina. Es interesante sealar que, mientras que las plantas slo tienen plastocianina para esta funcin, los organismos ms antiguos, como son las cianobacterias, tienen otra protena que puede cumplir el mismo papel: el citocromo c6. Eso sugiere algn tipo de evolucin convergente en la cual dos protenas de estructura muy diferente se han seleccionado para cumplir la misma funcin. Es decir, que la protena de hierro pudo ser sustituida por otra de cobre de forma que los organismos ms evolucionados la han adoptado como la nica necesaria para la funcin que realizan. La plastocianina es una protena de cobre que tiene un tomo metlico por un Mr de 10,5 kDa. Las protenas de Cu suelen ser de color azul y as es la plastocianina en el estado oxidado siendo el mximo a 600 nm como corresponde a una transicin de transferencia de carga del tipo Cys(S)Cu. Hay otras protenas de Cu con espectros similares, tales como la azurina y la estelacianina. La plastocianina de plantas y algas eucariotas est codificada por el gen petE en el ncleo, por lo que una vez sintetizada en el citoplasma debe transferirse al cloroplasto, lo que implica ser transportada a travs de las membranas de dicho orgnulo. La secuencia de aminocidos de las plastocianinas conocidas muestran una alta conservacin de residuos, especialmente los implicados en la unin del Cu que son dos His, una Cys y una Met as como una Tyr. Los residuos bsicos cambian mucho de una a otra especie cambiando tambin el pI de la protena que es casi de 4 en plantas y algas verdes, es casi neutra (6) en algunas cianobacterias y muy bsica en otras tal como Anabaena (9). La estructura cristalina de algunas plastocianinas se han determinado as como por RMN. En todos los casos es una especie de cilindro con el Cu en la parte norte metido en un bolsillo formado por residuos conservados e hidrofbicos

que estn prximos a la superficie pero no expuestos. Este bolsillo hidrofbico se ha propuesto, mediante experimentos de mutagnesis dirigida, que es el sitio de interaccin con el PS I. Se ha encontrado otro agrupamiento de residuos cidos que se encuentran en la regin este de la protena. Se propone que este parche negativo es el sitio de interaccin con el citocromo f y tambin que en Anabaena y otros organismos en los que la plastocianina tiene un pI bsico estos aminocidos cidos se han reemplazado por otros neutros. Citocromo c6 (antes denominado c553) Tiene un Mr de 10 kDa y un potencial redox de + 350 mV. Cumple la misma funcin que la plastocianina. Ambas tienen tamaos y potencial redox que son similares en las dos protenas. Las estructuras de la protena de varias especies se ha determinado recientemente y presenta muchas similitudes entre s. Basndose en la comparacin de las estructuras de la plastocianina y citocromo c6 de organismos diferentes se puede establecer una relacin evolutiva entre ellas que se han confirmado por datos de cintica en los que en el caso de los organismos ms primitivos se produce la reaccin por colisin simple, mientras que los ms evolucionados se hace mediante un reconocimiento y posterior reorganizacin para que se produzca la reaccin. Aspectos evolutivos de la fotosntesis Hace setenta aos se realizaron los experimentos que demostraban que en las plantas haba dos centros de reaccin implicados en la fotosntesis. Se denominaron PS I y PS II. Ms adelante se descubri que haba otros organismos procariotas que realizaban la fotosntesis. Se denominaron bacterias prpura y bacterias verdes y en ellas se produce la transformacin de la energa luminosa mediante centros de reaccin de otro tipo. Las diferencias principales con las plantas y cianobacterias es que en estas bacterias el proceso transcurre sin desprendimiento de oxgeno; slo tienen un centro de reaccin; finalmente,

el pigmento principal de la fotosntesis es la bacterioclorofila, (BChlo). Durante los aos 60 y 70 se produjeron muchos avances en el conocimiento de la fotosntesis de las bacterias prpura cuyas preparaciones eran relativamente fciles de obtener y se obtenan casi libres de otros pigmentos diferentes de los que se requieren para producir el proceso a estudiar. En estos momentos se puede afirmar que los hechos ms significativos a destacar del estudio comparativo acerca de la fotosntesis que llevan a cabo los diferentes organismos son los siguientes: 1) el centro de reaccin PS II de las plantas se parece en muchos aspectos al de las bacterias prpura. EN concreto las subunidades D1 y D2 son anlogas a las L y M de estas ltimas; 2) el centro de reaccin de las bacterias verdes as como de las descubiertas posteriormente de nominadas heliobacterias, es ms simple y homodimrico parecindose ms al centro de reaccin PS I de las plantas y cianobacterias. Hoy da se toda la comunidad cientfica acepta que los cloroplastos de las plantas que realizan fotosntesis surgi del atrapamiento de una cianobacteria por parte de una clula eucariota, lo que explica la gran similitud entre el PSI de cianobacterias y de plantas. Las subunidades PsaA, PsaB, la PsaC que tiene los centros sulfofrricos, as como la PsaD fueron heredados por los cloroplastos directamente de sus ancestros las cianobacterias. Posteriormente a la existencia de una simbiosis entre los cloroplastos y la clula eucariota se le aadieron a ste otras subunidades que son especficas del PS I. De hecho, las ltimas adquisiciones son las PsaG, PsaN y Psa H. Las heliobacterias y bacterias verdes sulfurosas poseen, por su parte, una versin econmica del centro de reaccin fotosinttico.