INTRODUO Nas ltimas dcadas temos vindo a assistir a vrias crises alimentares (dioxinas, encefalopatia espongiforme bovina, nitrofuranos

em frangos, etc.) que colocam em risco a sade dos consumidores mas ao mesmo tempo despertam a ateno dos mesmos para vrias questes relacionadas com a segurana dos alimentos consumidos. Estas crises alimentares no tm sido indiferentes tambm a entidades da UE, que tendem a investigar e legislar de modo a aumentar a segurana alimentar e ao mesmo tempo recuperar os nveis de confiana dos consumidores. Segundo dados publicados durante o ano de 2009 pela Autoridade Europeia para a Segurana Alimentar, Campylobacter o agente etiolgico mais frequentemente isolado em patologia gastrointestinal aguda em seres humanos por toda a Europa e, segundo outras fontes bibliogrficas, esta uma problemtica que tambm verificada nos outros continentes (Autoridade Europeia para a Segurana Alimentar [EFSA], 2009). Alguns estudos referem que, em pases desenvolvidos, estas bactrias causam gastroenterite com uma frequncia 2 a 7 vezes maior que bactrias como Escherichia coli O157:H7, Shigella spp. ou mesmo Salmonella spp., agentes etiolgicos que, ao contrrio do que acontece com Campylobacter spp., aparecem com maior destaque porque esto frequentemente associados a surtos (Allos, 2001). Para alm de ser o agente patognico mais frequentemente isolado em gastroenterites, a incidncia de campilobacteriose humana tem vindo a aumentar, tanto em pases desenvolvidos como em pases em vias de desenvolvimento. Acresce a isto o facto de estarem a surgir cada vez mais estirpes de Campylobacter spp. resistentes a antibiticos, com evidncias que sugerem o uso frequente deste tipo de frmacos como promotores de crescimento em animais de produo, em particular de fluoroquinolonas e macrlidos. Estas estirpes resistentes tm a sua virulncia aumentada uma vez que possuem uma maior capacidade de provocar doena e mesmo levar morte. Assim, torna-se importante testar vrias estirpes de Campylobacter spp. e averiguar a sua susceptibilidade a vrios antibiticos utilizados em medicina humana para o tratamento de infeces mais graves. Este trabalho integra-se num conjunto de estudos que pretende, alm de determinar a frequncia de estirpes de Campylobacter spp. em diferentes tipos de amostras, caracterizlas geneticamente identificando as espcies predominantes Campylobacter jejuni e Campylobacter coli e avaliar se so resistentes a um conjunto de antibiticos comummente utilizados em medicina humana para tratar doentes com infeces provocadas por este agente. Neste trabalho foram seleccionadas algumas estirpes isoladas e caracterizadas em trabalhos anteriores e foi avaliada a antibiorresistncia das mesmas utilizando o mtodo de difuso em disco. Com estes resultados pretendeu-se caracterizar e determinar quais as antibioresistncias apresentadas pelas estirpes de Campylobacter spp., isoladas de 1

amostras de frangos de produo intensiva colhidas num matadouro, e averiguar se as frequncias de antibioresistencia apresentadas sero ou no semelhantes s observadas em alguns pases, visto serem muito escassos actualmente dados publicados relativos a antibioresistncias de Campylobacter spp. isolados de fontes alimentares em Portugal.

1 - REVISO BIBLIOGRFICA Actualmente bactrias pertencentes ao gnero Campylobacter spp. constituem, entre os microrganismos causadores de toxinfeces alimentares uma das principais prioridades em termos de sade pblica (EFSA, 2005). No incio do ano de 2009, a EFSA apresentou os resultados relativos s notificaes realizadas pelos estados membros durante o ano de 2007. Nesta publicao, a EFSA referiu que as gastroenterites causadas por Campylobacter spp. foram mais uma vez a doena zoontica mais notificada na Unio Europeia, com 200507 casos confirmados reportados. A maioria dos estados membros reportou um aumento dos casos relativamente aos obtidos no ano anterior (EFSA, 2009). A salmonelose continua com o 2. lugar do mesmo ranking, sendo apresentados 151995 casos confirmados mas com uma tendncia de diminuio no nmero de notificaes fornecidos pelos EM nos ltimos 4 anos (EFSA, 2009). A Comisso Europeia j legislou no sentido de controlar agentes patognicos como a Salmonella spp., com o objectivo de diminuir os alvos ao longo da cadeia alimentar, principalmente ao nvel das populaes animais. Foram estabelecidos programas nacionais de controlo deste agente patognico para diminuir a prevalncia ao nvel das populaes animais e consequentemente reduzir a presena destes agentes ao longo de toda a cadeia alimentar (EFSA, 2005). Actualmente ainda existem poucos dados acerca da melhor maneira de prevenir infeces por Campylobacter spp. ao nvel da produo primria, dificultando assim o estabelecimento de objectivos reais e o desenho de programas de controlo (EFSA, 2005). 1.1 Campylobacter spp. Perspectiva microbiolgica Bactrias do gnero Campylobacter spp. so bastonetes curvos em forma de S ou em forma de espiral que possuem entre 0,2 a 0,8m de espessura e 0,5-8m de comprimento. So bactrias Gram negativas no formadoras de esporos, que podem formar corpos esfricos ou cocoides em culturas velhas ou nas expostas ao ar por perodos prolongados. Possuem um flagelo polar em uma ou em ambas as extremidades que lhes confere motilidade. As vrias espcies so microaerfilas, com um metabolismo do tipo respiratrio oxidase positivo. Entre outras caractersticas reduzem nitratos, so incapazes de oxidar ou fermentar hidratos de carbono e a maior parte das espcies reduz nitritos (Microbiological Safety of Food Funders Group [MSFFG], 2008). A temperatura ptima de crescimento varia entre os 35 e os 37C. No geral, so bactrias de crescimento lento (Allos, 2001).

1.2 Infeco por Campylobacter spp. em humanos Existem 16 espcies e 6 subespcies de Campylobacter spp. conhecidas. Destas, vrias so conhecidas por poderem causar patologia no ser humano mas as espcies termotolerantes, C. jejuni subespcie jejuni, C. coli e C. lari so consideradas as mais importantes. Destas a C. jejuni a responsvel pela maioria dos casos de gastroenterite, considerando-se que a C. coli seja responsvel somente por 3 a 5% dos casos (EFSA, 2005) A infeco por Campylobacter spp. em humanos referida ao longo da bibliografia como campilobacteriose. Os sinais clnicos geralmente associados a esta infeco incluem: dor abdominal, febre e diarreia, e por vezes vem ainda acompanhada de vmito. A dor abdominal e a febre geralmente precedem a diarreia. Esta pode variar entre profusa, aquosa e poder ou no vir acompanhada de sangue. Apesar da diarreia poder ser severa, a desidratao poder ser a nica consequncia da infeco em indivduos sem alteraes no funcionamento do sistema imunitrio. Clinicamente no possvel distinguir uma infeco por Campylobacter spp. de outra infeco gastrointestinal aguda como aquela produzida por outras bactrias como Salmonella, Shigella e Yersinia (Allos, 2001). O perodo de incubao varia entre 2 a 7 dias e a doena poder ter uma durao similar. Mesmo na ausncia de sinais clnicos, o microrganismo excretado nas fezes durante vrias semanas. A bacterimia como consequncia de infeco por Campylobacter spp. rara e na generalidade os doentes afectados por esta toxinfeco alimentar no necessitam de tratamento. Repouso e fluidoterapia so indicados para reverter a maior parte da sintomatologia desta doena, que acaba por ser autolimitante. O recurso a antibiticos raro e fica reservado para o tratamento de situaes mais severas. Os macrlidos so geralmente o grupo de antibiticos de eleio para o tratamento desta infeco mas as fluoroquinolonas esto tambm indicadas (Aarestrup & Engberg, 2001). Em muitos dos casos de gastroenterite, as fluoroquinolonas so preferidas quando se suspeita de infeco por Shigella spp.. No caso de bacterimia severa por Campylobacter spp. assim como em muitas infeces sistmicas, o tratamento de eleio so aminoglicosdeos intravenosos (Aarestrup & Engberg, 2001). No entanto, o aumento da ocorrncia de Campylobacter spp. resistentes a macrlidos e a fluoroquinolonas tem vindo a ser reportada em vrios pases e nestes casos outros antimicrobianos so usados para tratamento. A resistncia de determinadas estirpes isoladas principalmente a

fluoroquinolonas, tem vindo a ser evidenciado sendo considerado um problema mdico As complicaes associadas a campilobacteriose surgem raramente. No entanto, cerca de 1% dos doentes podero vir a ter manifestaes clnicas mais severas ocorrendo estas com maior frequncia em jovens e idosos. 4

A morte como consequncia de campilobacteriose rara mas pode acontecer quando h generalizao da doena em indivduos imunocomprometidos ou em pacientes muito jovens ou idosos. Estudos revelaram que a fatalidade das infeces por Campylobacter spp. anda na ordem dos 0,05 casos por cada 1000 infeces (Allos, 2001). Podem tambm ocorrer sequelas ps-infeco como sndrome de Guillain-Barr e artrite reactiva (Allos, 2001). Actualmente a sndrome de Guillain-Barr reconhecida como uma complicao ps infeco por Campylobacter jejuni mas a sua incidncia inferior a 1 caso por cada 1000 infeces (Allos, 2001). Esta sndrome caracterizada pela desmielinizao aguda dos nervos do sistema nervoso perifrico e, nos Estados Unidos da Amrica afecta cerca de 1-2 pessoas por cada 100000 habitantes (Allos, 2001). Estudos revelaram que o facto de sofrer de uma infeco por Campylobacter jejuni aumenta o risco de vir a desenvolver a Sndrome de Guillain-Barr (SGB) mas sabe-se j que a probabilidade de ocorrncia desta complicao mais provvel quando associada infeco do indivduo por um determinado sertipo de C. jejuni (Allos, 2001). A SGB que ocorre na sequncia de uma infeco por C. jejuni geralmente mais severa que a SGB que no tem relao com esta infeco, e manifesta-se clinicamente com leso axonal extensa com possibilidade de vir a necessitar de ventilao assistida e com um aumento da probabilidade do dano neurolgico poder vir a ser irreversvel (Allos, 2001). Em contraste, a severidade da infeco por C. jejuni no est associada com um aumento da possibilidade do paciente vir a sofrer da SGB. Os sinais neurolgicos que caracterizam o SGB surgem tipicamente cerca de 1 a 3 semanas aps o incio da sintomatologia associada infeco por C. jejuni, da pensar-se que exista um mimetismo entre os glicolpidos da membrana axonal ou das protenas da mielina do neurnio e alguma estrutura nos lipopolissacardeos da Campylobacter jejuni que causou a doena (Allos, 2001). Neste contexto, interessa sempre a identificao at ao nvel da espcie do isolado de Campylobacter spp. que causou a gastroenterite. Sabe-se j que uma infeco por C. jejuni surge como um factor de risco para um paciente vir a sofrer de complicaes como SGB ou artrite reactiva, enquanto que uma infeco por C. coli no se encontra na lista de factores de risco para qualquer uma das complicaes associadas campilobacteriose (Rner, Engvall, Andersson & Kaijser, 2004). Nos casos em que se suspeita de campilobacteriose, para verificar se a gastroenterite ou no causada por Campylobacter spp. e sabendo que este excretado nas fezes, utiliza-se como mtodo o seu isolamento directamente das fezes do doente (Allos, 2001). Existe a possibilidade de utilizar uma outra metodologia baseada na reaco de polimerase em cadeia (PCR), com extraces da amostra fecal, mas este mtodo de diagnstico ainda no utilizado como rotina (Allos, 2001) Tendo conhecimento do facto da C. jejuni ser resistente cefalotina (um antibitico ao qual a maior parte das outras bactrias que constituem a flora gastrointestinal susceptvel), um mtodo muito comum para o seu 5

isolamento em amostras fecais adicionar cefalotina ao meio de cultura. H no entanto, estirpes de Campylobacter spp., especialmente as que no pertencem espcie C. jejuni, que so susceptveis cefalotina e nestes casos utiliza-se o mtodo de filtrao para um meio sem cefalotina. Neste caso utilizado um filtro de 0,45-0,65m que bloqueia a passagem da maior parte das bactrias da flora gastrointestinal, deixando passar somente bactrias pequenas, como o caso da Campylobacter spp. (Allos, 2001). A campilobacteriose causada pela invaso do trato gastrointestinal por bactrias do gnero Campylobacter spp. Este microrganismo entra em contacto com o ser humano sobretudo atravs da ingesto de alimento ou gua contaminada. Vrios estudos referem que a ingesto de lquidos auxilia no bypass pelo estmago fazendo com que um nmero superior de microrganismos viveis atinja o intestino delgado, facilitando a ocorrncia de doena. O mecanismo pela qual C. jejuni e C. coli causam diarreia poder ser explicado pelos sinais clnicos. No caso de a diarreia ser secretria ou aquosa poder ser causada pela adeso destas bactrias mucosa na parte proximal do intestino delgado e tambm pela formao de uma enterotoxina. No caso de o doente apresentar sangue fresco nas fezes e clulas inflamatrias isto sugere invaso da mucosa intestinal e inflamao colorectal. Estudos anatomopatolgicos tm detectado em vrios doentes Campylobacter spp. na regio proximal do intestino delgado e leses no jejuno, edema da mucosa, hipermia e ulcerao do clon (International Commission on Microbiological Specifications of Foods [ICMSF], 1996) Tanto C. jejuni como C. coli, quando isoladas de fontes animais, clnicas (doentes com campilobacteriose) ou fontes alimentares, produzem uma enterotoxina citotnica

termoestvel com um peso molecular de 70000Da. Sabe-se tambm que cerca de 70% das espcies de C. jejuni e C. coli produzem tambm uma citotoxina que poder ser importante na patogenicidade da diarreia com sangue. Aos factores de virulncia citados (enterotoxina citotnica e citotoxina) acrescem ainda a motilidade rpida e a forma espiralada da C. jejuni que podero ajudar a penetrar na barreira mucosa gastrointestinal (International Commission on Microbiological Specifications of Foods [ICMSF], 1996). A verdadeira incidncia de campilobacteriose no conhecida e considera-se que seja 8 a 100 vezes superior ao nmero de casos reportado, uma vez que casos que apresentem sintomatologia clnica menos severa ficam muitas vezes por declarar, sem que seja realizado o isolamento da bactria ou que o indivduo chegue a ser consultado por um mdico (EFSA, 2005). A elevada incidncia de sintomatologia clnica associada a infeco por Campylobacter spp., assim como a durao da mesma e o possvel aparecimento de sequelas coloca esta toxinfeco alimentar na frente de todas as outras em importncia, quando analisada numa perspectiva de sade pblica, e com um impacto socioeconmico significativo que deve ser tomado em linha de conta (EFSA, 2005). 6

1.3 Campylobacter spp. em animais Os frangos so frequentemente colonizados por C. jejuni (65 a 95%), menos frequentemente por C. coli e raramente por outras estirpes de Campylobacter spp. A colonizao dos broilers est relacionada com a idade. A maior parte dos bandos negativa para este microrganismo at s 2 semanas de idade e, uma vez ocorrida a colonizao por Campylobacter spp., a transmisso por coprofagia extremamente rpida podendo 100% dos frangos ser colonizados num perodo de 72 horas. (Office International des Epizooties [OIE], 2008). Os bovinos, sunos e ovinos so tambm frequentemente colonizados por estirpes de Campylobacter spp., e essa colonizao maior para animais jovens do que para animais mais velhos. Nestes ltimos, os microrganismos so ocasionalmente detectados nas fezes, provavelmente devido aos baixos nveis de colonizao ou ento possvel excreo intermitente. Os bovinos e ovinos so primariamente colonizados por C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis e C. fetus, enquanto que os sunos so predominantemente colonizados por C. coli (OIE, 2008). 1.4 Epidemiologia A epidemiologia da transmisso de Campylobacter spp. considerada complexa e, uma vez que este gnero de bactria pode ser transmitida de animais para seres humanos e tambm destes para os animais, a doena causada pela infeco por esta bactria considerada uma zoonose (EFSA, 2009). Vrias bactrias do gnero Campylobacter spp. fazem parte da flora intestinal de muitos dos animais de produo, como galinhas, perus, sunos, bovinos e ovinos, sendo estes capazes de alojar tanto C. coli como C. jejuni sem sinais aparentes de doena. A transmisso deste tipo de bactria para seres humanos ocorre principalmente atravs do consumo de alimentos que contenham frango, leite no pasteurizado ou outro tipo de carnes (Yan, Pendrak, Foley & Powers, 2005). Um estudo realizado na Dinamarca onde foram recolhidas amostras ao nvel de matadouro avaliando-se a presena de Campylobacter spp., verificou-se que 47% dos bovinos, 46% dos sunos e 36% dos frangos estavam contaminados por este agente patognico. Outro estudo realizado no Reino Unido, demonstrou uma prevalncia de 32% para C. jejuni em amostras de fezes colhidas de vacas leiteiras saudveis. Estes animais contaminados por Campylobacter spp. podero dar origem contaminao do leite produzido nestas exploraes (Yan et al., 2005). Sabe-se que 90% das infeces por Campylobacter spp. em humanos foram causadas ou por C. jejuni ou por C. coli, sendo a frequncia com que o primeiro causa 7

infeco superior de C. coli. Este fenmeno contrasta com os resultados obtidos noutros pases desenvolvidos onde a maior parte das infeces causada por C. coli. Esta diferena entre os agentes etiolgicos poder reflectir diferenas nos padres de consumo de produtos de origem animal, uma vez que C. jejuni mais frequentemente isolada de frangos e bovinos e C. coli de sunos (Yan et al., 2005). A campilobacteriose pode ser contrada pelo ser humano tanto pelo contacto directo com animais infectados ou carcaas de animais contaminadas como atravs da ingesto de gneros alimentcios ou gua contaminados (Figura 1). A transmisso directa de indivduo para indivduo pode ocorrer mas no considerado um modo de transmisso importante em pases industrializados. Alm da transmisso alimentar dever ainda ser considerada a via de transmisso no alimentar. Esta inclui o contacto directo entre pessoas, contacto com animais de estimao, contacto ocupacional com animais de produo assim como o contacto com gua de recreio. Esta via de transmisso dever ser considerada mas o seu real contributo para o nmero de casos de campilobacteriose no foi at ao momento contabilizado (EFSA, 2005). A possibilidade dos animais de companhia, em particular os ces poderem ser uma fonte de Campylobacter spp. que origina doena em humanos tem vindo a ser investigada. Actualmente h j evidncia epidemiolgica de associao entre Campylobacter spp. em ces e doena em humanos, no entanto, ainda no so perceptveis os factores de risco associados transmisso (MSFFG, 2008). Figura 1: Vias de transmisso da Campilobacteriose (adaptado de Young et al., 2007)

A maior parte dos casos de campilobacteriose so espordicos. No entanto, tm sido reportados casos de infeco por Campylobacter spp. que surgiram por surtos. Resultados de vrios estudos demonstraram que alimentos de origem animal provenientes dos grupos de distribuio alimentar esto na origem da maior parte das infeces (Yan et al., 2005). Foi tambm demonstrado que cerca de 60% dos produtos contendo carne de frango recolhidos a este nvel da fileira comercial estavam contaminados com Campylobacter spp. Estas bactrias so ainda capazes de sobreviver em carne congelada mesmo aps longos perodos de congelao, o que torna este tipo de alimentos uma fonte de contaminao potencial no caso dos mesmos no serem adequadamente preparados antes de serem consumidos. Em muitos pases, o elevado nvel de contaminao que frangos e alimentos derivados apresentam aquando da sua exposio ao consumidor final contribui para o elevado nmero de casos de campilobacteriose reportado por todo o mundo. Deste modo, o consumo de carne de frango contaminada com Campylobacter spp. referido como a causa principal de campilobacteriose espordica. (Yan et al., 2005) A contaminao cruzada de alimentos prontos a consumir por manipuladores e consumidores, particularmente a contaminao com origem em produtos oriundos de frango cru, tambm parece ter um papel significativo no nmero de casos espordicos verificados. Comprovou-se que a Campylobacter spp. capaz de sobreviver por mais de 1 hora nas bancadas e em panos de cozinha e capaz de passar para outros alimentos que entrem em contacto com estas superfcies (Yan et al., 2005). No que se refere aos surtos, a fonte de infeco parece ser varivel. Tm sido reportados surtos com origem em consumo de carne de frango, de carne de outros animais e de gua ou leite contaminados com Campylobacter spp. (Yan et al., 2005). Segundo dados produzidos pela EFSA (2009), a transmisso de campilobacteriose diferente atendendo ao grau de desenvolvimento de um pas. Assim, em pases em vias de desenvolvimento, as vias de transmisso so complexas e multifactoriais e em pases desenvolvidos a campilobacteriose considerada uma toxinfeco alimentar cuja principal fonte so os frangos (EFSA, 2005). A contribuio das vrias fontes de transmisso dentro da Unio Europeia dependente do pas que se considerar e segue determinada sazonalidade, principalmente devido ao clima, padres de consumo, distribuio de gua destinada ao consumo humano, sistemas de produo de alimentos e implementao de medidas de controlo. A relao dose-resposta complexa e ainda no h dados cientficos capazes de a compreenderem completamente (Nauta et al., 2009). Sabe-se que existe uma grande variao na capacidade das estirpes de Campylobacter spp. causarem infeco e doena. A composio do bolo alimentar e o estado do sistema imunitrio do consumidor pode ter um grande impacto na probabilidade de ocorrncia de doena aps a ingesto de uma certa quantidade de Campylobacter spp. (Nauta et al., 2009). H no entanto autores que referem 9

que a dose infectante baixa, sendo necessrio um nmero de Campylobacter spp. na ordem das centenas, o suficiente para provocar doena (EFSA, 2005). Uma vez que o calor mata as bactrias Campylobacter spp. viveis, o consumo de carne de frango bem cozinhada parece ser uma boa medida de controlo para evitar infeces por esta bactria (Allos, 2001). 1.5 Campylobacter spp. no contexto Europeu

O sistema Comunitrio para a monitorizao e colheita de informao nos estados membros da Unio Europeia sobre agentes zoonticos, resistncia antimicrobiana e surtos de toxinfeco alimentar, baseado na Directiva 2003/99/EC do Parlamento Europeu e do Conselho, sendo nela referida a obrigatoriedade para a reunio anual de dados relevantes e comparveis nos temas acima citados. Os dados referentes a seres humanos so fornecidos pelos estados membros ao Centro de Preveno e Controlo de Doenas (ECDC) que posteriormente os cede EFSA. Esta entidade compila e publica anualmente os resultados do sistema de epidemiovigilncia comunitrio para as zoonoses sempre que possvel, relacionando-os com os dados fornecidos pelo ECDC. Os dados fornecidos incluem os dos 27 estados membros e de 4 pases europeus no pertencentes Unio Europeia: Noruega, Sua, Islndia e Liechtenstein. A EFSA organiza os dados em 3 publicaes, uma onde so compiladas as informaes relativas s zoonoses e aos agentes zoonticos, outra onde sumarizam as informaes relativas aos surtos de toxinfeces alimentares e uma ltima onde se fala da resistncia de agentes patognicos a antibiticos. No ano de 2009 foram j publicados os dados referentes a zoonoses e a surtos de toxinfeco alimentar referentes aos dados de 2007, estando os dados referentes a resistncia antimicrobiana ainda por publicar. Nas publicaes acima referidas, os dados apresentados pela EFSA para o nosso pas so escassos a ausentes para a maior parte dos tpicos abordados. No foram apresentados dados acerca dos casos de campilobacteriose reportados em humanos entre 2003 e 2007. Foram reportados dados referentes a Campylobacter spp. em carne de frango mas no em outro tipo de produto. Os dados de diferentes pases produzidos pela EFSA resultam de mtodos de amostragem e de isolamento diferentes o que os tornam no comparveis. Segundo dados publicados pela EFSA em Janeiro de 2009 no documento Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents in the European Union in 2007, em 2007 a infeco por Campylobacter spp. em humanos continua, semelhana do que foi verificado em anos anteriores, a ser a zoonose mais frequentemente notificada no contexto da Unio Europeia (UE) e, de um modo geral, o nmero de notificaes desta doena tem vindo a aumentar desde 2003. A salmonelose continua a ser em 2007, a segunda doena zoontica 10

com maior nmero de notificaes mas, ao contrrio do que tem sido reportado para Campylobacter spp., nos ltimos 4 anos, verificou-se uma tendncia para a diminuio do nmero de casos reportados. As Figuras 2 e 3 representam o enquadramento das infeces de Campylobacter spp. no homem e como agente etiolgico de surtos de toxinfeces pelas seguintes publicaes da EFSA de 2009 The community summary report on food-borne outbreaks in the European Union in 2007 e The community summary report on trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in the European Union in 2007. Figura 2 Taxa de notificao de zoonozes em casos confirmados de humanos no contexto da UE durante o ano de 2007 (adaptado de: EFSA, 2009)

Na publicao onde se discutem as principais causas de surtos de toxinfeco alimentar no contexto europeu, casos originados por Salmonella spp., por causa desconhecida ou com origem viral surgem frente dos surtos provocados por Campylobacter spp. (EFSA, 2009). Em 2007, Salmonella spp. foi responsvel por 39,2% de todos os surtos reportados (comprovados e suspeitos) com um decrscimo significativo desde 2006, onde figurava como responsvel por 53,9% dos surtos reportados. Se tivermos somente em conta os casos confirmados, no contexto europeu, a Salmonella foi responsvel por 29,1% dos surtos, enquanto que a Campylobacter spp. foi o agente etiolgico de 8,2% de todos os surtos reportados e de 6,5% dos surtos confirmados. 11

Figura 3 - Agentes etiolgicos de surtos de toxinfeces alimentares no contexto da UE (Adaptado de: EFSA, 2009)

Por outro lado, as infeces por Campylobacter spp. lideram o ranking de notificao de zoonoses em 2007 tal como pode ser observado na Figura 2. O diferente posicionamento das infeces causadas por Campylobacter spp. nos documentos referidos pode facilmente ser justificado pelo facto das infeces causadas por este microrganismo serem muito mais frequentes em casos isolados do que em surtos. Como podemos observar na Tabela 1, de um modo geral, ao nvel da Unio Europeia a notificao de casos confirmados de Campylobacter spp. tem vindo a aumentar desde 2003, tendo-se verificado um aumento significativo de 2006 para 2007. O ano de 2006 foi uma excepo, com a diminuio do nmero de casos confirmados reportados, em grande parte devido diminuio dos casos reportados pela Alemanha e pela Repblica Checa.

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Tabela 1 Casos de campilobacteriose reportados em humanos entre 2003 e 2007 e taxas de notificao para o ano de 2007 (adaptado de EFSA, 2009) Nmero de casos Total UE 200889 Casos confirmados 2007 200507 Casos confirmados por 100.000 habitantes 452 2006 175561

Casos confirmados 2005 195426 2004 183479 2003 139581

O aumento global das notificaes desta toxinfeco alimentar pode ser explicado pelo aumento do nmero de estados membros a notificar esta patologia, como consequncia do alargamento da Unio Europeia. Pensa-se tambm que este aumento seja devido ao aumento de notificao por ano de cada um dos estados membros. Este, por sua vez, poder no estar relacionado com um efectivo aumento do nmero de casos de Campylobacter spp. em cada um dos pases da EU, mas sim com uma consciencializao que advm em parte do aumento crescente do conhecimento em torno desta bactria, dos sndromes ps infeco associados e dos nveis crescentes de antibiorresistncia que se tm observado (EFSA, 2009). Em 2007, e pela observao da Tabela 2, a EFSA refere que houve uma diminuio dos casos de campilobacteriose considerados importados assim como uma diminuio dos casos de origem desconhecida. Tabela 2- Distribuio do nmero de casos de campilobacteriose confirmados em humanos pela origem (domsticos/importados) no ano de 2007 (adaptado de EFSA, 2009) Domsticos (%) 61,6 Importados (%) 6,8 Origem desconhecida (%) 31,6 Total (N) 200507

Total EU

J no que concerne aos casos domsticos, referido um aumento significativo comparativamente ao observado em 2006. Pases como a Sucia, Finlndia, Noruega e Islndia reportaram o maior nmero de casos de campilobacteriose com origem importada, isto com origem em pacientes com nacionalidade sueca, finlandesa, norueguesa ou islandesa mas adquiridos fora do pas de origem do doente (EFSA, 2009). Apesar dos dados fornecidos pela EFSA serem alarmantes, sabe-se que existe ainda um grande nmero de casos que continua a no ser reportado uma vez que o quadro clnico de campilobacteriose frequentemente moderado, no chegando os doentes a recorrer aos servios dos profissionais de sade. Crianas com menos de 5 anos tm as maiores taxas

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de notificao quando comparados com outros nveis etrios com cerca de 120 casos por cada 100000 habitantes (EFSA, 2009). Relativamente sazonalidade e tal como seria de esperar, os dados da EFSA referentes a 2007 (Figura 4) demonstraram que existe uma maior incidncia de campiloabcteriose nos meses de vero, de Junho a Agosto. Figura 4- Nmero de casos confirmados de campilobacteriose em humanos reportados por ms no ano de 2007 (adaptado de EFSA, 2009)

Em 2007, a estirpe C. jejuni foi mais uma vez a estirpe mais isolada em casos de campilobacteriose ao nvel dos estados membros (Tabela 3). Tabela 3- Distribuio dos isolamentos por estirpe de Campylobacter spp. em amostras de humanos no ano de 2007 (adaptado de EFSA, 2009) C. jejuni (%) Total EU 44,3 C. coli (%) 2,7 Outras estirpes identificadas (%) Estirpe desconhecida (%) 6,9 46

Em gneros alimentcios, os dados obtidos pela EFSA em 2007 no alteram o que j tinha sido concludo em anos anteriores. Assim, a maior proporo de amostras contaminadas por Campylobacter spp. foi mais uma vez reportada em carne de frango fresca, com uma frequncia de 26% em amostras de frango, obtida de resultados de contaminao que variavam entre 0 a 85%. O mesmo foi verificado em amostras de outro tipo de aves demonstrando que as mesmas podem tambm ser consideradas como um veculo de transmisso de Campylobacter spp. para seres humanos. Verificou-se mais uma vez em 2007 que a prevalncia de Campylobacter spp. em frangos s diminui ligeiramente do animal vivo para a carcaa, havendo uma manuteno dos valores durante processamento e at venda da carne ao consumidor final. 14

Em bovinos e em sunos no se verificou esta tendncia de contaminao. Nestas amostras foram detectadas grandes teores de Campylobacter spp. ao nvel do animal vivo mas verificou-se uma grande diminuio logo aps o abate e, frequncia de isolamento mantm-se baixa quando se fala de amostras de carne de bovino e de suno prontas para consumo. Em 2007, a ocorrncia de Campylobacter spp. em carne de porco fresca variou entre 0 a 1,1%. Isto sugere que tanto as carcaas de bovinos como as de sunos so menos contaminadas com material fecal ao nvel de matadouro e/ou que as estirpes de Campylobacter spp. encontram condies para a sua sobrevivencia desfavorveis nas carcaas destes animais. Noutro tipo de fontes alimentares esta bactria foi apenas ocasionalmente detectada (EFSA, 2007). Ao nvel das exploraes, a frequncia de Campylobacter spp. em populaes de aves e sunos elevada. Foram no entanto detectadas frequncias mais baixas em bandos de frango criados em alguns pases nrdicos e blticos ficando a noo de que haver mtodos de produo que conseguiram diminuir a frequncia deste agente ao nvel da explorao. Pode tambm encontrar-se Campylobacter spp. em exploraes de bovinos mas sempre com uma prevalncia inferior detectada em sunos e em aves (EFSA, 2007). Vrios estados membros testaram outro tipo de gneros alimentcios. Para o leite de vaca no pasteurizado a ocorrncia de Campylobacter spp. foi baixa (< 1%) na generalidade das amostras testadas. Foram analisados vrios tipos de pescado e nenhum deles se apresentou contaminado. Nos dados apresentados pela EFSA, entre as amostras provenientes de animais a C. jejuni claramente a estirpe com maior frequncia de isolamento em frangos e em bovinos e a C. coli foi a estirpe mais isolada em sunos (Figura 5).

Figura 5 - Distribuio das estirpes de Campylobacter isoladas em frangos, sunos e bovinos, 2007 (adaptado de EFSA zoonoses, 2009)

O consumo de leite cru e de gua contaminada tm sido identificados como os agentes causais de grandes surtos. 15

1.6 Campylobacter spp. caracterizao do posicionamento Portugus

A situao portuguesa no que diz respeito prevalncia e antibiorresistncia em estirpes de Campylobacter spp. no est completamente caracterizada. Existem poucos estudos e os seus resultados no so directamente comparveis ou porque o mtodo laboratorial escolhido foi diferente ou mesmo porque, apesar de serem relativos a Campylobacter spp., cada um tem um objectivo que no se cruza com o dos restantes. Os primeiros estudos conhecidos, realizados por Cabrita et al. (1992) relatam prevalncias de 60,2% em 59 amostras de frango, 59,1% em 65 amostras de sunos e demonstraram resistncias a vrios antibiticos mais baixas do que as verificadas em estudos mais recentes realizados por Mena et al. (2008). Apesar de serem escassos os estudos verificouse um aumento da percentagem de estirpes resistentes a vrios antibiticos, assim como da frequncia de Campylobacter spp. ao nvel das exploraes. Outro estudo realizado em vrios hospitais portugueses em 2008 por Vicente et al., 2008 demonstrou uma grande percentagem de estirpes resistentes a 3 fluoroquinolonas testadas (ciprofloxacina 80,5%, moxifloxacina 51,2%, gatifloxacina 47,2%). Os autores observaram que das 123 amostras testadas 110 correspondiam a isolados de C. jejuni e 13 a isolados de C. coli, o que foi de encontro aos resultados apresentados noutros pases. Durante este ltimo ano tm vindo a surgir vrios estudos a nvel nacional na sequncia do disposto na Directiva 2003/99/CE, e o Laboratrio Nacional de Investigao Veterinria (LNIV), envolveu-se num estudo base sobre a vigilncia harmonizada da prevalncia de Campylobacter spp. e das resistncias antimicrobianas das estirpes isoladas em bandos de frango na UE, a fim de ponderar a necessidade, a viabilidade, o custo e os benefcios de medidas de controlo a nvel comunitrio (Gomes, 2009). 1.7 Campylobacter spp. e resistncia a antibiticos

A resistncia de vrios tipos de bactrias patognicas a agentes antimicrobianos frequentemente utilizados constitui uma problemtica actual que alvo de discusso tanto no contexto de medicina veterinria como no de medicina humana. A ocorrncia de estirpes resistentes a um ou mais antibiticos tem vindo a reduzir a eficcia deste tipo de frmacos, limitando cada vez mais as opes teraputicas no maneio de doenas infecto-contagiosas. As principais consequncias do aparecimento de resistncias em bactrias que causam doenas em humanos incluem o aumento da frequncia de falhas teraputicas e da severidade das infeces, o que pode ser manifestado pelo aumento da durao da doena, aumento do nmero de manifestaes sistmicas, aumento dos casos que levam a hospitalizao e ainda por um aumento da mortalidade. 16

So necessrias 2 condies para que uma bactria desenvolva resistncia a antibiticos. Por um lado, o microrganismo tem que entrar em contacto com o antibitico e por outro tem que desenvolver um mecanismo de resistncia ao mesmo antibitico e transmiti-lo ou s clulas que o rodeiam ou s clulas filhas afectando as geraes futuras. Cada antibitico possui o seu modo de actuao. H antibiticos que tm como alvo a parede bacteriana (bacitracina, cefalosporinas e penicilinas), outros atingem a membrana celular (polimixinas), outros actuam sobre componentes que intervm na sntese proteica (aminoglicosdeos, cloranfenicol, tetraciclinas), ou sobre o RNA (rifamicina), ou DNA (cido nalidixico e quinolonas) ou ainda sobre algumas vias bioqumicas como a sntese de folato (sulfonamidas). Assim, quando surgem bactrias resistentes, estas normalmente possuem resistncia para um grupo de antibiticos especfico (Khachatourians, 1998). De um modo geral, a rpida evoluo da resistncia antimicrobiana uma resposta das bactrias s alteraes dramticas no seu ambiente introduzidas pelo uso de antibiticos (EFSA, 2005). As bactrias podem apresentar 2 tipos de resistncia a antimicrobianos. Quando a resistncia a antibiticos inerente a determinada espcie de bactrias e partilhada por todos os elementos dessa espcie designada por resistncia intrnseca ou resistncia natural. Nestes casos, o mecanismo de resistncia est relacionado com a baixa afinidade do antibitico pelas molculas alvo das bactrias, pela ausncia de molculas alvo, pela diminuio da entrada de antibitico para a clula bacteriana ou pela acumulao ou efluxo do frmaco para o exterior da clula bacteriana. Por outro lado, quando uma estirpe tipicamente susceptvel a determinado grupo de antimicrobianos e deixa de o ser diz-se que a resistncia adquirida (EFSA, 2005). Tal como pode ser visualizado na Figura 6, as bactrias partilham 3 tipos de mecanismos de resistncia adquirida: a inactivao directa da molcula activa, perda da susceptibilidade bacteriana ao antibitico por modificao do alvo de aco e a reduo da concentrao do frmaco que atinge a molcula alvo sem modificao do composto em si. Figura 6 Mecanismos de resistncia a antimicrobianos apresentados por bactrias (adaptado de EFSA, 2005)

RESISTNCIA INTRNSECA

RESISTNCIA ADQUIRIDA

Mutao - Ausncia de alvo celular - Baixa afinidade do alvo - Baixa permeabilidade - Mecanismos de efluxo Modificao do alvo 17 celular

Adio de Genes

- Inactivao do frmaco - Modificao do alvo - Mecanismos de efluxo

Apesar de ser razovel assumir que a transferncia de genes de microrganismos viveis ocorre para outros microrganismos em ambiente como o trato gastrointestinal, presume-se que a resistncia intrnseca possui um potencial mnimo de transmisso horizontal, enquanto que a resistncia adquirida mediada pela adio de genes considerada como tendo um maior potencial de transmisso horizontal (EFSA, 2005). As bactrias possuem vrios mecanismos para transmitir a outras bactrias (da mesma espcie ou de espcie diferente) os genes que codificam para as resistncias. Estes genes encontram-se em 2 locais especficos da clula bacteriana: no cromossoma e no material gentico extra-cromossoma como plasmdeos e transposes (Khachatourians, 1998). A resistncia adquirida ocorre atravs da adio de genes (aquisio de genes pela bactria atravs da incorporao de DNA exgeno) ou atravs da mutao dos genes bacterianos indgenas. As mutaes cromossmicas podem resultar em resistncia a antibiticos por vrios mecanismos. As mais frequentes so as mutaes em genes que codificam para as molculas alvo dos antibiticos, geralmente alterando o local de ligao do antibitico. Como exemplo deste tipo de mutaes temos as que alteram o gene que codifica para o local de ligao das penicilinas o que resulta num elevado nvel de resistncia para as penicilinas, mutaes nos genes que codificam para as subunidades 16S e 23S do rRNA tornando, por exemplo, Helicobacter pylori e Streptococcus pneumoniae resistentes, respectivamente, a tetraciclinas e eritromicina. Mutaes em regies de genes reguladores podem vir a contribuir para a resistncia a antimicrobianos levando sobreproduo de determinantes intrnsecos de resistncia como as bombas de efluxo ou mesmo do local de ligao do antibtico. Este tipo de mutao pode levar total inibio da aco do antibitico sobre a bactria. De um modo geral, a aquisio de resistncia por mutao de genes do cromossoma bacteriano representam um baixo nvel de propagao horizontal. A adio de genes ao genoma bacteriano surge como resultado da troca de material gentico entre bactrias. Apesar dos mecanismos de resistncia associados adio de genes se traduzirem, na maioria dos casos, em modificaes de origem enzimtica que inactivam a molcula, como o caso da produo de -lactamases ou de acetiltransferases, essa adio pode codificar tambm para outros mecanismos como a modificao dos locais de ligao ou o efluxo do frmaco. A presena de genes adicionados que codifiquem para resistncia a antibiticos, particularmente quando tm origem em elementos genticos mveis (plasmdeos), representam um potencial muito significativo para a disseminao horizontal de resistncia a antibiticos (EFSA, 2005). 18

Existem vrios mecanismos conhecidos para a transferncia horizontal de genes de resistncia a antibiticos. Estudos demonstram que a transferncia horizontal de genes pode ser amplamente responsvel pelas rpidas alteraes das caractersticas ecolgicas e patognicas das estirpes bacterianas (Ochman, Lawrence & Groisman, 2000). A aquisio e a perda de grandes fraces de material gentico pode introduzir variabilidade no genona bacteriano em muito pouco tempo. De entre os fragmentos de DNA capazes de serem transmitidos horizontalmente podemos referir plasmdeos, ilhas genmicas, bacteriofagos, assim como transposes e sequncias de insero (Velge et al., 2005). Todos estes elementos genticos mveis podem conferir vantagens ao microrganismo que deles puderem usufruir, principalmente em condies particulares de alterao do ambiente que o rodeia (Ochman et al., 2000). Tal como j foi referido, o desenvolvimento de resistncia a um ou mais antibiticos surge como consequncia da aquisio de material gentico do exterior da clula ou, da mutao de um ou mais genes do genoma bacteriano. No entanto, so consideradas efectivas as alteraes do material gentico bacteriano que originem modificaes metablicas e/ou estruturais, capazes de tornar o microrganismo mais resistente ao grupo de agentes antimicrobianos que est a exercer presso selectiva. Vrios estudos realizados neste mbito sugerem que o uso de antibiticos encoraja a seleco de estirpes resistentes e, ao mesmo tempo, a disseminao das resistncias adquiridas entre as vrias estirpes bacterianas permitindo o seu crescimento e multiplicao mesmo na presena de antibiticos (Aarestrup & Engberg, 2001; Khachatourians, 1998; Phillips et al., 2004, Yan et al., 2005). Apesar da primeira suspeita relativa ao aparecimento de estirpes bacterianas resistentes a antibiticos em humanos recair sobre o uso, ou melhor, uso excessivo de antibiticos em medicina humana, rapidamente surgiu a necessidade de realizar estudos em animais onde se demonstrasse a existncia de estirpes resistentes, e qual era o papel do uso de antibiticos em medicina veterinria no aparecimento das mesmas. Faltava a isto tudo relacionar as estirpes resistentes oriundas das exploraes pecurias com as isoladas em seres humanos no sendo possvel fazer a mesma avaliao em gneros alimentcios de origem animal. A rea que estabelece a relao entre o uso de antibiticos em medicina veterinria e o efeito nas bactrias que contaminam alimentos na cadeia alimentar muito complexa. Tm vindo a surgir vrios estudos que evidenciam que o uso de antibiticos em animais, tanto como agentes teraputicos como promotores de crescimento, leva a uma aumento do risco de ocorrerem transferncias de populaes de bactrias resistentes a antibiticos, provenientes dos animais de produo e capazes de resistir ao longo da comercializao dos gneros alimentcios de origem animal at entrarem em contacto com o ser humano,

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colocando-o em risco de ser infectado por estas estirpes (Luangtongkum, 2006; MSFFG, 2007) At publicao do Regulamento (CE) n.1831/2003 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de Setembro de 2003, relativo aos aditivos destinados alimentao animal, vrios antibiticos eram administrados em exploraes pecurias como promotores de crescimento, isto , eram continuamente adicionadas baixas concentraes destes frmacos ao alimento dos animais, permitindo aumentar o ganho de peso vivo dirio e consequentemente a produtividade. Neste Regulamento esta prtica foi sujeita a regras, uma vez que a partir de 1 de Janeiro de 2006, os antibiticos que no fossem coccidiostticos no estariam autorizados para utilizao como aditivos na alimentao animal. Tambm a Directiva 2003/99/CE relativa monitorizao de zoonoses e agentes zoonticos se refere problemtica da resistncia a antimicrobianos. Esta Directiva obriga os estados membros da Unio Europeia a monitorizar a resistncia antimicrobiana em agentes zoonticos e em outros agentes no caso de ter sido comprovado que estes colocam em risco a sade pblica. Obriga ainda monitorizao da evoluo da antibiorresistncia para Salmonella spp., e para Campylobacter spp. em bovinos, sunos, aves e produtos destes derivados. No caso das bactrias do gnero Campylobacter spp., h estirpes que so intrinsecamente resistentes a um determinado tipo de antibitico e outros que adquirem essa resistncia atravs de mutaes ou aquisio de genes que codificam vrios tipos de mecanismos de resistncia a antimicrobianos. C. coli e C. jejuni eram, at h alguns anos atrs, caracterizadas por serem invariavelmente susceptveis ao cido nalidxico, um antibitico pertencente ao grupo das fluoroquinolonas, sendo esta caracterstica muitas vezes utilizada a nvel laboratorial para caracterizar este tipo de bactrias (Aarestrup & Engberg, 2001). No entanto, a resistncia a antibiticos, nomeadamente s fluoroquinolonas tem vindo a aumentar nos ltimos anos. Aarestrup & Engberg (2001) reportaram o isolamento de estirpes resistentes a vrios grupos de antibiticos mas, os resultados que obtiveram especificamente para o grupo das fluoroquinolonas foram alarmantes. Desde os anos 80 que na Europa so reportados casos de resistncia a antibiticos em C. jejuni. Estudos de vrios pases demonstraram uma relao entre a aprovao do uso de fluoroquinolonas em animais de produo e o desenvolvimento de resistncia a fluoroquinolonas em Campylobacter spp. isolados de animais e de seres humanos (MSFFG, 2008; Aarestrup & Engberg, 2001). Surgiu na Holanda o primeiro estudo onde se documentou a ligao entre o uso veterinrio de fluoroquinolonas e o aparecimento de estirpes de Campylobacter spp. resistentes tanto em animais como em seres humanos (Aarestrup & Engberg, 2001). Neste pas, iniciou-se em 1987 a utilizao de enrofloxacina na produo animal. Enquanto que, 20

entre 1982 e 1983, no foram detectadas resistncias a fluoroquinolonas em estirpes provenientes de frangos, em igual perodo e em 1985 tambm no foram isoladas estirpes resistentes em humanos. Em 1987/1988 surgiram os primeiros estudos onde se reportavam percentagens de estirpes resistentes na ordem dos 8,7% isoladas em amostras provenientes de frangos. Estes resultados foram sendo seguidos de perto e, das amostras de frango analisadas, em 1989, 14% das estirpes isoladas demonstravam resistncia s fluoroquinolonas. Trs anos mais tarde surgiram j frequncias de 29%. A emergncia e aumento das estirpes resistentes isoladas em produtos alimentares avcolas e broilers foi seguida pela emergncia e subsequente aumento das estirpes resistentes isoladas em humanos: 8% em 1988, 11% em 1989 e 29% em 1997 (Aarestrup & Engberg, 2001). Esta tendncia foi tambm verificada em pases como ustria, Dinamarca, Finlndia, Frana, Itlia, Espanha, Tailndia, Reino Unido e Estados Unidos da Amrica. A ideia de que a resistncia a fluoroquinolonas tem vindo a aumentar entre os animais de produo, como consequncia do uso deste tipo de antibiticos nas exploraes pecurias, uma realidade. As estirpes resistentes presentes nos gneros alimentcios com origem nestes animais podem entrar em contacto com o ser humano, provocando infeces cujo tratamento poder ser dificultado. O aparecimento de resistncias em estirpes de Campylobacter spp. a antibiticos do grupo dos macrlidos foi reportado por vrios autores (Aarestrup & Engberg, 2001; Engberg et al., 2001; MSFFG, 2007; Yan et al., 2005). Foram detectados nveis mais elevados de resistncia para estes antibiticos em estirpes de C. coli isoladas de sunos. As estirpes isoladas de humanos demonstraram o mesmo tipo de resistncia. Os motivos associados ao aparecimento desta resistncia antimicrobiana ainda no esto bem esclarecidos, no entanto, pensa-se que podero estar associados com a existncia de uma frequncia de mutao muito superior em estirpes de C. coli, quando comparada com a de C. jejuni, ou com a elevada presso selectiva exercida pelo uso excessivo deste tipo de antibiticos nas exploraes, nomeadamente nas suiniculturas onde a frequncia de isolamento de C. coli muito superior de C. jejuni (Aarestrup & Engberg, 2001). De facto, nas suiniculturas um pouco por todo o mundo foi prtica comum utilizar a tilosina tanto como promotor de crescimento como agente teraputico. A sua utilizao indiscriminada poder estar relacionada com o aparecimento da resistncia a macrlidos que se tem vindo a observar em estirpes de Campylobacter spp. (Aarestrup & Engberg, 2001). Relativamente s resistncias apresentadas pelas estirpes de Campylobacter spp. sabe-se que a sua ocorrncia geralmente maior para C. coli do que para C. jejuni particularmente para macrlidos (Aarestrup & Engberg, 2001; Engberg et al., 2001; MSFFG, 2007; Yan et al., 2005). No que concerne aos vrios grupos de antibiticos, consensual que, entre as estirpes destas bactrias, a percentagem de resistncia a macrlidos e fluoroquinolonas elevada e que o mesmo acontece com os -lactmicos, trimetoprim e 21

sulfonamidas, enquanto que para outros antibiticos como as tetraciclinas, aminoglicosdeos e cloranfenicol a percentagem de estirpes resistentes relativamente baixa (Aarestrup & Engberg, 2001; Engberg et al., 2001; MSFFG, 2007; Yan et al., 2005).

1.7.1 Resistncia a fluoroquinolonas As fluoroquinolonas so classificadas em 4 geraes de modo a definir o seu espectro de aco. As quinolonas de segunda gerao, designadas por fluoroquinolonas tm origem nas quinolonas de primeira gerao e tm uma aco mais efectiva que as de primeira gerao sobre bactrias Gram-negativas. O seu modo de actuao baseia-se na inibio de 2 das enzimas envolvidas na sntese de DNA bacteriano: a DNA girase e topoisomerase IV (Lambert, 2005). Existem 3 mecanismos que podem conferir o fentipo de resistncia a

fluoroquinolonas em bactrias Gram-negativas: mutaes no local de ligao do antibitico; reduo da acumulao do antibitico no interior da clula bacteriana (ou por diminuio da permeabilidade da membrana externa ou por aumento do efluxo do frmaco) e pela proteco do alvo do antibitico mediada por uma protena Qnr. O gene qnr que tem origem em plasmdeos confere baixo nvel de resistncia para fluoroquinolonas mas no est descrito para estirpes de Campylobacter spp. (Payot et al., 2006). Em bactrias Gram-negativas, a DNA girase (tambm conhecida como topoisomerase II) e a topoisomerase IV so, respectivamente, os alvos primrio e secundrio das fluoroquinolonas. Estas enzimas so estruturas proteicas quaternrias de grandes dimenses e so constitudas por 2 pares de 2 subunidades GyrA e GyrB, no caso da DNA girase e, por 2 pares das 2 subunidades ParC e ParE para o caso da topoisomerase IV. A resistncia s fluoroquinolonas surge pela substituio de aminocidos nas topoisomerases, nomeadamente no local de ligao das fluoroquinolonas, designado na bibliografia por QRDR (quinolone resistance determining region). Para que uma estirpe bacteriana se torne resistente a fluoroquinolonas basta uma mutao no gene que codifica para uma das subunidades das topoisomerases II e IV, no entanto, mutaes adicionais no gene que codifica para gyrA, gyrB ou parC podem ir aumentando o nvel de resistncia da estirpe. No caso das estirpes de Campylobacter spp., o alvo secundrio das fluoroquinolonas (topoisomerase IV) parece estar ausente. Esta ausncia leva a que, tanto para C. jejuni como para C. coli, uma mutao no QRDR da subunidade GyrA seja suficiente para conferir o fentipo resistente a fluoroquinolonas (Luangtongkum et al., 2009; Payot et al., 2006). At ao momento, no foram encontradas em estirpes de Campylobacter spp. mutaes nos genes que codificam para a subunidade GyrB que confiram resistncia a fluoroquinolonas. Como j foi referido, os genes que codificam para a topoisomerase IV (parC/parE) esto tambm envolvidos na resistncia a fluoroquinolonas, mas estes genes no esto presentes nas estirpes de Campylobacter spp. e como tal no tm nenhum papel na aquisio de 22

resistncia neste tipo de microrganismo (Luangtongkum et al., 2009). Isto implica que, ao contrrio do que acontece com outras estirpes bacterianas (como Salmonella ou Escherichia coli) onde a aquisio de elevados nveis de resistncia a fluoroquinolonas s possvel aps a acumulao de mutaes nos genes gyrA e parC, em estirpes de Campylobacter spp. basta uma mutao ao nvel do gene que codifica para QRDR da GyrA para reduzir susceptibilidade da estirpe s fluoroquinolonas. A modificao da permeabilidade da membrana externa como um mecanismo de resistncia a fluoroquinolonas ainda no foi descrita para Campylobacter spp. No entanto, um sistema de efluxo, o sistema CmeABC, que confere resistncia intrnseca a mltiplos antibiticos (incluindo fluoroquinolonas, eritromicina, ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol), desinfectantes e corantes (incluindo o brometo de etdio) tem vindo a ser caracterizado por vrios autores neste gnero de bactrias. O opero cmeABC est amplamente distribudo em diferentes estirpes de Campylobacter spp. e expresso constitutivamente nas estirpes selvagens. Esta bomba de efluxo actua em sinergia com a mutao no gene gyrA para conferir alto nvel de resistncia a fluoroquinolonas. Foi caracterizado o regulador de transcrio CmeR da bomba de efluxo CmeABC que actua como um repressor. Uma mutao deste gene regulador leva a uma sobreexpresso da bomba de efluxo CmeABC originando altos nveis de resistncia a fluoroquinolonas, bastando apenas a deleco de um nico nucletido. Resta salientar que os isolados com uma sobreexpresso da bomba de efluxo CmeABC acumulam menos fluoroquinolona no seu citoplasma. (Alfredson & Korolik, 2007; Belanger & Shryock, 2007; Quinn et al., 2007; Luangtongkum et al., 2009). Todos os determinantes de resistncia a fluoroquinolonas em estirpes de Campylobacter spp. so codificados ao nvel do cromossoma. Determinantes de resistncia a este grupo de antibiticos mediados por plasmdeos no foram reportados neste gnero de bactrias (Luangtongkum et al., 2009). As fluoroquinolonas inibem a actividade da DNA girase e, na maior parte das estirpes bacterianas a resistncia devida a mutaes nos genes que codificam para esta enzima ou dos genes que codificam para a topoisomerase IV. No caso das estirpes de Campylobacter spp., a resistncia parece ser devida principalmente a mutaes do gene gyrA que codifica parte da subunidade A da DNA girase. Estudos demonstraram que as mutaes no gene gyrA nas posies Thr-86, Asp-90 e Ala-70 podero ser responsveis pela resistncia (Aarestrup & Engberg, 2001; Yan et al., 2005). A utilizao de fluoroquinolonas ou como agente teraputico ou como promotor de crescimento actua como uma presso selectiva que tende a aumentar o aparecimento de estirpes de Campylobacter spp. resistentes. No entanto, a no utilizao deste tipo de antibiticos no leva extino destas estirpes, que podem continuar a competir com as estirpes no resistentes permanecendo a sua populao estvel (Luangtongkum, 2006).

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1.7.2

Resistncia a macrlidos

Os macrlidos inibem o crescimento microbiano atravs da inibio da sntese proteica que provocada pela ligao destes antibiticos subunidade 50S dos ribossomas bacterianos, impedindo, somente pelo bloqueio fsico provocado pela sua presena, a elongao das cadeias polipeptdicas que esto a ser transcritas uma vez que provoca a libertao precoce do peptidil-tRNA ao nvel do tnel de entrada do ribossoma (Payot et al., 2006; Belanger & Shryock, 2007). A resistncia de bactrias a este tipo de antibiticos pode estar relacionada com os seguintes mecanismos: modificao do antibitico (por hidrlise do anel lactona do macrlido); modificao do local de ligao do antibitico por mutao ou metilao e efluxo do antimicrobiano para o exterior da clula microbiana. A modificao do antibitico ocorre por actividade de esterases e/ou fosfotransferases e foi identificada em Staphylococci. Para bactrias do gnero Campylobacter spp. somente os ltimos 2 mecanismos foram descritos (Aarestrup & Engberg, 2001; Yan et al.., 2005; Payot et al., 2006). A modificao do local de ligao dos macrlidos pode ser realizada atravs de metilao mediada por enzimas codificadas nos genes erm (erythtromycin ribosome methylase) ou atravs de mutao de genes que codificam para o referido local de ligao dos macrlidos. Este ltimo mecanismo mais frequentemente verificado em microrganismos e as estirpes de Campylobacter spp. utilizam-no em detrimento da metilao dos locais de ligao dos macrlidos (Payot et al., 2006). O local de ligao dos macrlidos ao nvel da subunidade 50S do ribossoma constitudo por pores de rRNA proveniente da subunidade 23S e por 2 protenas ribossomais designadas por L4 e L22 que formam parte do tnel de sada da cadeia polipeptdica em formao (Payot et al., 2006; Alfredson & Korolik, 2007, Luangtongkum et al., 2009). Assim, as bactrias adquirem resistncia a este grupo de antibiticos quando os genes que codificam para o local de ligao dos macrlidos ao nvel da subunidade 50S do ribossoma bacteriano sofrem uma mutao que impea a ligao dos mesmos. Nas estirpes de Campylobacter spp., mutaes no gene que codifica para a regio peptidiltransferase do domino V da subunidade 23S do rRNA ao nvel dos nucletidos 2074 e 2075 tm um papel importante no desenvolvimento de altos nveis de resistncia a macrlidos (Concentraes mnimas inibitrias (MIC) 128mg/L). (Belanger & Shryock, 2007; Gibreel & Taylor, 2006; Alfredson & Korolik, 2007; Luangtongkum et al., 2009). Cerca de 78 a 100% dos isolados resistentes alojam a mutao A2075G, nos restantes casos a mutao A2074C a mais frequentemente encontrada. Em bactrias que contenham mais do que um gene que codifica para a subunidade 23S do rRNA, o nvel de resistncia a macrlidos fica dependente do nmero de alelos mutantes. No caso das estirpes de Campylobacter spp. que contm 3 genes que codificam para a subunidade 23S do rRNA h tambm indicaes de que o nmero de alelos mutantes influencia a MIC. sabido que a maior parte dos isolados clnicos de Campylobacter spp. 24

com elevados nveis de resistncia a macrlidos contm 3 cpias do alelo mutado. (Belanger & Shryock, 2007) Em algumas estirpes bacterianas, mutaes nos genes que codificam para as protenas ribossomais L4 e L22 que afectam tambm a ligao dos macrlidos subunidade 50S do ribossoma podem vir a originar fentipos resistentes. As mutaes mais significativas nestas protenas so as que afectam os aminocidos das posies 63 a 74 da protena L4 e as modificaes da extremidade C da -hairpin (ou unidade beta-beta) da protena L22. Algumas das estirpes de Campylobacter spp. resistentes a macrlidos que contm mutaes ao nvel do gene que codifica para o rRNA da subunidade 23S contm tambm mutaes ao nvel dos genes que codificam para as protenas ribossomais L4 e L22, no entanto, estas mutaes parecem no estar relacionadas com o fentipo resistente a macrlidos uma vez que foi demonstrado que muitas das mutaes encontradas nos genes que codificam para estas protenas no tm repercusso nos locais de ligao dos macrlidos e estas mutaes foram encontradas em algumas estirpes que apresentavam resistncia a macrlidos mas tambm em estirpes no resistentes (Payot et al., 2006; Belanger & Shryock, 2007). O local de ligao dos macrlidos ao nvel do ribossoma bacteriano coincide com o local de ligao de outros antibiticos, nomeadamente licosamida e estreptogramina B e a modificao do local de ligao destes antibiticos pode originar o fentipo MLSB que implica resistncia aos 3 tipos de antibiticos citados. Em estirpes de Campylobacter spp., as mutaes que conferem resistncia para macrlidos, conferem resistncia para

lincosamidas mas no para as estreptogramina B, uma vez que este gnero de bactrias intrinsecamente resistente a este antibitico. Esta resistncia cruzada que se verifica em Campylobacter spp. para macrlidos e lincosamidas permite depreender que o uso de um destes antibiticos poder originar resistncia ao outro. Neste contexto, a prevalncia de estirpes de Campylobacter spp. resistentes isoladas do trato gastrointestinal de animais de produo poder ser o resultado tanto do uso de macrlidos como do uso de lincosamidas No entanto, a extenso com que isto acontece est dependente da espcie e do tempo durante o qual o antibitico usado. (Belanger & Shryock, 2007) A bomba de efluxo da famlia CmeABC que indicada na bibliografia como estando envolvida tanto na resistncia adquirida como na intrnseca a fluoroquinolonas, inclui muitas vezes macrlidos no grupo de frmacos que capaz de retirar do interior da clula bacteriana. (Payot et al., 2006; Belanger & Shryock, 2007). Um estudo refere que o bloqueio desta bomba de efluxo torna a estirpe de Campylobacter spp. testada susceptvel a macrlidos, indicando isto que, neste gnero de bactrias, a bomba de efluxo poder ter um papel importante na resistncia a este tipo de antibiticos (Payot et al., 2006). No que diz respeito especificamente eritromicina, um aumento da expresso deste tipo de bomba de efluxo confere baixos nveis de resistncia em Campylobacter spp. (MIC 8-16mg/L). Em 25

isolados de Campylobacter spp. com altos nveis de resistncia para macrlidos o aumento da expresso de bombas de efluxo relacionado com mutaes nos genes que codificam para o rRNA da subunidade 23S revelaram um aumento das MICs de macrlidos. Apesar de existirem alguns dados, o papel das bombas de efluxo na resistncia a macrlidos em estirpes de Campylobacter spp. est ainda para ser completamente esclarecida. Sabe-se j que em estirpes altamente resistentes que possuam tanto alteraes ribossmicas como um aumento do efluxo dos macrlidos, efectivamente a mutao ao nvel do gene que codifica para a subunidade 23S do rRNA que responsvel pelo fentipo de resistncia, uma vez que a inibio qumica do efluxo nestas estirpes acaba por diminuir a MIC mas no capaz de restaurar a susceptibilidade (Payot et al., 2006; Belanger & Shryock, 2007). Isto demonstra que a bomba de efluxo actua em sinergia com a mutao ao nvel do gene que codifica para a subunidade 23S do rRNA para conferir um elevado nvel de resistncia a macrlidos. Estudos genticos realizados (por MLST multilocus sequence typing e por AFLP amplified fragment length polymorphism) referem que podem existir reservatrios de Campylobacter spp. resistentes a macrlidos, independentes das fontes animais mais conhecidas. Pensa-se que a transmisso de humano para humano de estirpes Campylobacter spp. resistentes a macrlidos e de estirpes susceptveis existe e que ocorre com uma frequncia maior do que seria de esperar. (Belanger & Shryock, 2007) 1.7.3 Resistncia ao cloranfenicol A resistncia de estirpes bacterianas ao cloranfenicol normalmente mediada pela formao de enzimas que adicionam um grupo acetil ao antibitico impedindo a sua ligao ao ribossoma bacteriano. A formao desta enzima est associada presena de um gene cat (cloranfenicol acetiltransferase). Actualmente a resistncia ao cloranfenicol ainda no est difundida entre estirpes de Campylobacter spp. (Aarestrup & Engberg, 2001) 1.7.4 Resistncia a sulfonamidas As sulfonamidas so anlogos estruturais do cido p-aminobenzoco (PABA) e competem com este na utilizao da enzima dihidropteroato sintetase (DHPS) impedindo que o PABA seja incorporada no cido flico (Aarestrup & Engberg, 2001). A resistncia s sulfonamidas em bactrias Gram-negativas normalmente devida aquisio de uma variante da DHPS resistente a frmacos por transferncia horizontal (plasmdeo R) entre bactrias. A resistncia de C. jejuni a sulfonamidas est associada substituio mutacional de 4 resduos de aminocidos na DHPS, resultando na diminuio da afinidade para este tipo de antibitico (Aarestrup & Engberg, 2001; Yan et al., 2005) 1.7.5 Resistncia a tetraciclinas A resistncia s tetraciclinas poder ser mediada por 4 mecanismos: efluxo do frmaco para o exterior da bactria, modificao das tetraciclinas, alterao do local de ligao deste antibitico e mutao da subunidade 16S do rDNA. No entanto, a resistncia s tetraciclinas em estirpes de Campylobacter spp. conferida pelo gene tet(O), que est 26

presente na maior parte dos isolados desta bactria de animais de produo. O gene tet(O) codifica para uma protena de proteco ribossomal que reconhece a abertura A do ribossoma bacteriano e se liga a este, de tal modo que induz uma alterao da conformao que resulta na libertao da molcula de tetraciclina que se encontrava aqui ligada. Esta alterao da conformao do ribossoma mantm-se por um largo perodo de tempo permitindo que a etapa de elongao da cadeia polipeptdica continue sem interrupes (Mazi et al., 2008, Luangtongkum et al., 2009). O gene tet(O) foi estudado utilizando vrias tcnicas moleculares e atendendo sua constituio pensa-se que tenha sido adquirido por transferncia horizontal de bactrias como Enterococci, Streptococci e Streptomyces spp. sugerindo que este gene ter tido origem em bactrias Gram positivas (Aarestrup & Engberg, 2001; Luangtongkum et al., 2009). Na maior parte das estirpes de Campylobacter spp. o gene tet(O) codificado em plasmdeos, mas foram j detectadas estirpes onde uma cpia do gene se encontrava no cromossoma. A resistncia a tetraciclinas em C. jejuni est tambm associada a bomba de efluxo CmeABC (Luangtongkum et al., 2009). 1.7.6 Resistncia ao trimetoprim A actuao do trimetoprim baseia-se na ligao e inibio da enzima dihidrofolato reductase. A resistncia a este antibitico devida aquisio de genes dfr originrios de transferncia horizontal que no so inibidos pelo trimetoprim. Em estirpes de Campylobacter spp. foram detectados 2 tipos de genes que so considerados responsveis por mediar a resistncia s tetraciclinas (dfr1 e dfr9). Estes genes foram encontrados no cromossoma das bactrias tanto em transposes como em integres. Tanto a dfr1 como a dfr9 foram encontradas em bactrias Gram-negativas, principalmente em Enterobacteriaceae indicando que estirpes de Campylobacter spp. podem adquirir genes atravs deste grupo de bactrias. (Aarestrup & Engberg, 2001) 1.7.7 Resistncia a aminoglicosdeos A resistncia de Campylobacter spp. a aminoglicosdeos est relacionada com a produo de 3 tipos de enzimas: aminoglicosdeo fosfotransferase, aminoglicosdeo adeniltransferase ou aminoglicosdeo acetiltransferase que so codificadas em vrios genes deste microrganismo. Estes genes so adquiridos por transferncia horizontal entre bactrias (Aarestrup & Engberg, 2001; Yan et al., 2005). 1.7.8 Resistncia a -lactmicos Algumas estirpes pertencentes ao gnero Campylobacter spp. so intrinsecamente resistentes a alguns antimicrobianos, como o caso dos antibiticos -lactmicos, penicilinas e cefalosporinas. A produo de -lactamases por algumas destas estirpes permite que a fragmentao do anel -lactmico impea o efeito letal do antibitico sobre a bactria (Yan et al., 2005). Alm da produo das enzimas -lactamases, outros mecanismos de resistncia como a alterao das protenas de ligao das penicilinas e a impermeabilidade da bactria, podero ser responsveis pelo aparecimento de estirpes 27

resistentes a este grupo de antibiticos. No entanto, a produo de -lactamases parece ser responsvel pela resistncia das estirpes a antibiticos como amoxicilina, ampicilina e ticarcilina. No caso da penicilina G, piperacilina e cefalosporinas, o mecanismo de resistncia apresentado pelas C. coli e C. jejuni primariamente dependente da capacidade que estes antibiticos tm em se ligar s protenas de ligao das penicilinas e a sua baixa permeabilidade (Aarestrup & Engberg, 2001; Yan et al., 2005). As estirpes de Campylobacter spp. apresentam elevados nveis de resistncia principalmente para antibiticos do grupo das fluoroquinolonas, dos macrlidos e tambm para antibiticos como a vancomicina, rifampin, trimetoprim, amoxicilina, ampicilina, metronidazol, cefalosporinas e tetraciclinas (Aarestrup & Engberg, 2001; Allos, 2001). Para aminoglicosdeos e cloranfenicol, a frequncia de aparecimento de estirpes resistentes no geral baixa (Aarestrup & Engberg, 2001). Sabe-se que a resistncia a macrlidos e a fluoroquinolonas mediada por mutaes cromossmicas e no por genes adquiridos por transmisso horizontal o que poder indicar que as estirpes de Campylobacter spp. no possuem em grande extenso genes de resistncia adquiridos horizontalmente de outras bactrias. No entanto, a possibilidade de aquisio horizontal de material gentico de outras bactrias existe e vrios autores j identificaram genes pertencentes s bactrias Campylobacter spp., os quais existem naturalmente em outras estirpes de bactrias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Em C. jejuni e C. coli os mecanismos de resistncia mais frequentemente reportados para fluoroquinolonas e macrlidos so, respectivamente, a mutao no gene gyrA e a mutao no gene que codifica para a subunidade 23S do rRNA. Sabe-se no entanto que o efluxo de antibiticos para o exterior da clula mediado pelo sistema CmeABC tambm utilizado por algumas estirpes de Campylobacter spp. e que pode agir em sinergia com as mutaes acima referidas para conferir um elevado nvel de resistncia a fluoroquinolonas e a macrlidos. A sobrexpresso deste sistema de efluxo pode conferir Campylobacter spp. um fentipo de multirresistncia e mutaes associadas com esta sobreexpresso so designadas no repressor e na regio operador do mesmo repressor. Para alm dos mecanismos de resistncia em estirpes de Campylobacter spp. acima referidos existem outro tipo de mutaes e de sistemas de efluxo capazes de contribuir para o fentipo de resistncia a vrios antibiticos, no entanto, necessitam de ser melhor caracterizados em estudos futuros. 1.7.9 Multirresistncia O aparecimento de estirpes multirresistentes, nomeadamente de bactrias Gramnegativas, constitui actualmente uma problemtica muito discutida em medicina humana. Vrios mecanismos tm vindo a ser considerados responsveis pela multirresistncia 28

apresentada por vrias estirpes bacterianas, no entanto, uma famlia de 3 sistemas de efluxo pouco selectivos, tm vindo a ser reconhecidos como determinantes tanto para a apresentao de multirresitncia intrnseca como adquirida nestes microrganismos (Poole, 2004) Tipicamente a multirresistncia resulta da acumulao de mltiplas mutaes solitrias e/ou de genes que codificam para resistncias (integres), no entanto, estados de crescimento especficos como os biofilmes e mutaes solitrias que originam directamente alteraes na membrana celular externa ou expresso directa do sistema de efluxo de frmacos, podem tambm dar origem expresso fenotpica de multirresistncia (Poole, 2004) Dada a grande quantidade de substratos com que estes sistemas de efluxo so capazes de lidar, possvel que estes sejam capazes de eliminar do interior da clula bacteriana antibiticos que ainda nem sequer foram descobertos. Neste sentido, o futuro da teraputica antimicrobiana ter que ser dirigida para este sistema de efluxo sob pena de se esgotarem alternativas teraputicas que podero nunca atingir as concentraes ideais no citoplasma bacteriano de modo a ter efeito. 1.8 Mtodos para isolamento e identificao de Campylobacter spp. Em mamferos e aves, a deteco de colonizao intestinal por Campylobacter spp. baseada no isolamento do microrganismo nas fezes, zaragatoas rectais e/ou contedos do ceco (OIE, 2008). A utilizao de antibiticos selectivos no agar necessria para permitir o seu isolamento neste tipo de amostras. Um mtodo alternativo ao apresentado, que explorando a motilidade que caracteriza as estirpes de Campylobacter spp., a tcnica de filtrao. Tcnicas que contemplem o enriquecimento no so rotineiramente utilizadas para fazer isolamento de amostras fecais. Uma confirmao preliminar pode ser realizada recorrendo ao microscpio ptico, onde podem ser observados microrganismos pequenos em forma de S, se forem observados na sua fase de crescimento logartmica, enquanto que em colnias j envelhecidas so observadas predominantemente formas cocoides. (OIE, 2008). Observando este microrganismo em microscpio de contraste de fase, podem ser observados os movimentos em espiral que a caracterizam. A identificao fenotpica baseada em reaces de crescimento sob diferentes condies. Podem tambm ser utilizados testes bioqumicos e moleculares para caracterizar a estirpe at ao nvel da espcie. Para a determinao directa ao nvel da espcie, C. jejuni ou C. coli, pode recorrerse a variantes da tcnica de PCR. Os testes serolgicos no so utilizados por rotina para detectar a colonizao por estes microrganismos (OIE, 2008). Existem 2 procedimentos ISO (International Organization for Standardization) para deteco de Campylobacter spp.: o mtodo horizontal para deteco de Campylobacter spp. 29

termotolerante em alimentos para animais e para humanos e mtodo de isolamento deste microrganismo em guas. 1.8.1 Isolamento de Campylobacter spp. O isolamento de Campylobacter spp. pode ser realizado utilizando meios de cultura selectivos ou o mtodo de filtrao passiva. Para o isolamento de Campylobacter spp. de amostras fecais, cecais ou intestinais no h necessidade de realizar nenhum prtratamento. As amostras podem simplesmente ser semeadas num meio selectivo ou num meio no selectivo quando se utiliza o mtodo de filtrao. O enriquecimento est recomendado quando necessrio aumentar a sensibilidade do mtodo e geralmente utilizado em amostras de animais que apresentam baixas quantidades deste microrganismo nas fezes (bovinos, sunos, ovinos) ou quando se pretende isolar este microrganismo em amostras onde se considere que possa ter estado sujeito a condies ambientais stressantes (alimentos e condies de refrigerao). A enumerao de Campylobacter spp. pode depois ser realizada tanto pelo mtodo do nmero mais provvel como atravs da contagem directa em placa. Esto descritos na literatura vrios meios de cultura para Campylobacter spp. Estes meios podem ser divididos em 2 grupos: os que contm sangue e os que contm carvo. Estes componentes, carvo e sangue, so utilizados para remover os derivados txicos de oxignio, uma vez que as bactrias do gnero Campylobacter spp. so sensveis ao perxido de hidrognio e aos anies super xido produzidos nos meios de cultura. Os meios utilizados so muitas vezes suplementados com antibiticos, geralmente cefalosporinas, vancomicina ou trimetoprim, e com antifngicos (ciclohexemida ou anfotericina B) (OIE, 2008). A utilizao do mtodo de filtrao pressupe a mistura da amostra com um meio no selectivo, como o peptone broth suspension, numa diluio de 1:10 de modo a obter uma suspenso. 100l dessa suspenso devero ser filtrados num filtro de malha de 0.45 a 0.65m, durante 30 a 45 minutos a 37C. O filtrado obtido depois semeado e incubado em atmosfera microaerbia a 42C. 1.8.2 Incubao Os requisitos para que o crescimento de Campylobacter spp. seja optimizado incluem: i. Atmosfera Atmosfera contendo ambiente microaerbio (5-10% de oxignio e 5-10% de dixido de carbono) necessria para o crescimento ptimo destes microrganismos. ii. Temperatura de incubao As placas para o isolamento de Campylobacter spp. podero ser incubadas a 37 ou a 42C mas a temperatura mais frequentemente utilizada so os 42C uma vez 30

que a esta temperatura se minimiza o crescimento de contaminantes ao mesmo tempo que se fornecem condies ptimas para o isolamento de C. jejuni e C. coli. iii. Tempo Tanto C. jejuni como C. coli tm crescimento lento em meio slido e por este motivo o tempo de incubao normalmente de 48h. No entanto, h protocolos onde se cultivam as placas somente 24h. 1.8.3 Identificao de Campylobacter spp. ao nvel da espcie As bactrias do gnero Campylobacter spp. so fastidiosos o que as torna bioquimicamente inactivas. Elas obtm a sua energia de aminocidos ou intermedirios do ciclo dos cidos tricarboxlicos em vez de obterem energia directamente do metabolismo de carbohidratos. Isto faz com que muitos dos testes bioqumicos utilizados para caracterizar outras bactrias at ao nvel da espcie no tenham a mesma utilidade quando falamos de Campylobacter spp. No entanto, possvel sujeitar as colnias suspeitas a alguns testes bioqumicos como: catalase, oxidase, reduo de nitratos, hidrlise de hipurato, crescimento microaerbio a 25 e a 42C, crescimento aerbio a 37C. Poder ainda ser testada a susceptibilidade das estirpes ao cido nalidxico e cefalotina. A susceptibilidade ao cido nalidxico foi uma das caractersticas mais exploradas a nvel laboratorial para caracterizar estirpes de Campylobacter spp., no entanto, com o aparecimento de resistncias a este antibitico, os resultados obtidos so cada vez mais difceis de interpretar e a utilizao deste teste caiu em desuso. Nas tabelas que se seguem (Tabela 4 e 5) so referenciados os principais testes bioqumicos e os seus resultados para chegar espcie de Campylobacter spp. isolada. Nestas podemos verificar que a propriedade fenotpica de hidrlise do hipurato permite distinguir na maior parte das vezes C. jejuni de C. coli, no entanto, existem C. jejuni incapazes de hidrolisar hipurato e nestas somente possvel determinar a que espcies pertencem utilizando mtodos moleculares (OIE, 2008; Rner et el, 2004). Tabela 4 Testes de confirmao para Campylobacter spp. (adaptado de OIE, 2008)

Teste de confirmao Morfologia Motilidade Oxidase Crescimento aerbio a 42C Crescimento microaerbio a 25C

Resultados para Campylobacter spp. termoflica Pequenos bacilos em forma de S Presente e caracterstica (muito mveis e movimentos serpenteantes e de cambalhota) Positivo Negativo Negativo

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Tabela 5 - Caractersticas fenotpicas de estirpes de Campylobacter spp. responsveis por toxinfeces em humanos (adaptado de OIE, 2008)

Caractersticas Hidrlise do hipurato Hidrlise do acetato de indoxil

C. jejuni + +

C. coli +

C. lari -

1.8.4 Mtodos baseados em gentica molecular A utilizao de testes bioqumicos para caracterizar uma estirpe de Campylobacter spp. ao nvel da espcie pode ser suplementada, ou mesmo substituda por mtodos moleculares. Actualmente esto disponveis vrias tcnicas moleculares que permitem detectar Campylobacter spp. em vrios tipos de amostras e determinar a que espcie determinado isolado pertence. Como mtodos moleculares so referidos na bibliografia, entre outros, a utilizao do pleomorfismo do tamanho do segmento de restrio do rRNA da subunidade 23S, a anlise da sequncia do gene que codifica para a GTPase, o PCR multiplex para C. jejuni e C. coli, a deteco por PCR baseado em DNA, a anlise da regio varivel da subunidade 16S do rRNA, a hibridizao de DNA e tcnicas que combinam PCR e mtodos de hibridizao (Rner et al., 2004). 1.8.5 Testes imunolgicos Os testes serolgicos no so utilizados por rotina para detectar a contaminao por estes microrganismos. No entanto, j se encontram disponveis testes ELISA para serem utilizados em amostras de fezes com origem humana (OIE, 2008) 1.9 Testes de Susceptibilidade a Antibiticos (TSA) Na maioria dos casos de gastroenterite causada por Campylobacter spp. no h necessidade de recorrer a antibioterapia, uma vez que o curso da doena muitas vezes auto-limitante (Allos, 2001). No entanto, h possibilidade da patologia se tornar sistmica ou no caso do aparecimento de complicaes ps-infeco necessrio muitas vezes recorrer a antibioterapia. Alm disso, pacientes com dfices de aco no sistema imunitrio como grvidas, portadores do vrus da imunodeficincia humana HIV ou com sintomatologia severa devero ser tratadas com antibiticos. Em geral so utilizados 2 mtodos para avaliar a susceptibilidade microbiana a antibiticos: os mtodos de difuso e os de diluio (Aarestrup & Engberg, 2001). Ao avaliar vrios tipos de estudos realizados um pouco por todo o mundo verificamos que variantes de ambos os mtodos so utilizadas. Esto disponveis vrios protocolos normalizados para a execuo de testes de susceptibilidade microbiana a antibiticos para vrios tipos de microrganismos mas as linhas de orientao fornecidas pelo Clinical and Laboratory 32

Standards Institute (CLSI), anteriormente designado por National Committee Clinical Laboratory Standards (NCCLS), so as mais frequentemente utilizadas. Devido aos requisitos especficos de crescimento das estirpes de Campylobacter spp., nomeadamente o ambiente microaerbio para o seu crescimento, ainda no so conhecidos protocolos internacionalmente aceites para a realizao de TSA padro por parte de nenhuma entidade reconhecida para o efeito. Como consequncia, nos estudos consultados e para o objectivo de determinao da susceptibilidade a antimicrobianos em estirpes de Campylobacter spp. foram utilizados vrios mtodos de difuso (em disco, em tablets e o E-test) e de diluio (micro e macrodiluio em caldo e diluio em agar). Na maior parte da bibliografia consultada recomenda-se a utilizao de ambiente microaerbio e suplementao do meio de cultura com 5% de sangue e, quanto ao tipo de mtodo a utilizar, a maior parte refere a diluio em agar e o mtodo de difuso em placa (Aarestrup & Engberg, 2001). Actualmente o mtodo mais usado o diluio em agar suplementado com 5% de sangue cultivado em condies de microaerobiose. No entanto, como este mtodo requer muito tempo para a realizao da tcnica laboratorial, no realizado numa primeira abordagem. O teste E um mtodo que permite obter uma concentrao inibitria mnima e, para alguns microrganismos at considerado como o teste standard. No entanto, este mtodo no tem uma performance aceitvel quando trabalhamos com Campylobacter spp. devido s condies de microaerobiose necessrias para o crescimento deste

microrganismo. A microdiluio em caldo tem sido usada com sucesso em estirpes de Campylobacter spp. para determinar as concentraes mnimas inibitrias (MIC), no entanto, o mtodo de difuso em disco oferece a convenincia de ser mais fcil de realizar ao mesmo tempo que permite diminuir o tempo gasto com a tcnica e na generalidade considerado um bom teste para realizar um rastreio a vrias estirpes, tanto com relevncia clnica, como epidemiolgica e diagnstica. Existe um esforo comum para fornecer documentos de orientao e critrios de avaliao das antibioresistncias. Contudo, no caso de Campylobacter spp. muitos dos breackpoints para as MIC e dimetros dos halos de inibio esto em discusso.

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2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1. Objectivos do trabalho Com este trabalho pretendeu-se avaliar a susceptibilidade de vrias estirpes de C. coli e C. jejuni isoladas de amostras de frangos de produo intensiva recolhidas em matadouro, a um grupo de 11 antibiticos utilizando o teste de difuso em disco, de modo a determinar a percentagem de estirpes resistentes a cada um dos antibiticos e averiguar se o padro de antibiorresistncia o mesmo para C. coli e C. jejuni. Com os resultados deste trabalho pretende-se caracterizar e determinar quais as antibioresistncias apresentadas pelas estirpes de Campylobacter spp., e averiguar se as frequncias de antibioresistencia apresentadas sero ou no semelhantes s observadas em alguns pases, visto serem muito escassos actualmente dados publicados relativos a antibioresistncias de Campylobacter spp. isolados de fontes alimentares em Portugal. 2.2. MATERIAL E MTODOS 2.2.1 Isolados bacterianos Foram isolados um grupo de C. coli e C. jejuni de amostras de frango recolhidas em matadouro entre Dezembro de 2007 e Outubro de 2008. Considerando a rastreabilidade do bando, a amostragem foi realizada em amostras de intestinos (cecos), carcaas (peles de pescoo) e carne de peito num matadouro de frangos broiler em diferentes dias de trabalho. A deteco e isolamento das estirpes de Campylobacter spp. foi realizada segundo a norma EN/ISO 10272-1:2006 e as estirpes foram identificadas atravs de PCR multiplex (Dennis et al., 1999). Do grupo de estirpes isoladas foram seleccionadas 78 para serem caracterizadas quanto resistncia a um grupo de agentes antimicrobianos. Destas, 49 correspondiam a C. coli e 29 a C. jejuni. As estirpes seleccionadas para este ensaio pertenciam a 5 bandos de criadores diferentes e foram recolhidas 4 isolados de amostras do bando 1, 12 isolados do bando 2, 20 do bando 3, 19 do bando 4 e 23 do bando 5. Quanto ao tipo de amostra, das estirpes seleccionadas 18 correspondiam a amostras de cecos, 21 de carcaas (peles de pescoo) e 39 de peitos. Os isolados encontravam-se conservados em meio Brain Heart Infusion (Sharlau, Espanha) com 15% glicerol (Merck, Alemanha) a -80C, tendo sido posteriormente cultivadas em placa Colmbia agar sangue (Biomerieux, Frana) e incubadas a 42C, durante 48 horas em condies de microaerobiose produzida por gerador (GENbox microaer: BioMerieux, Frana). 2.2.2. Antibiticos utilizados No teste de difuso em disco foram escolhidos 11 antibiticos frequentemente utilizados em medicina humana para o tratamento de campilobacteriose e outros usados em 34

sistemas de monitorizao da resistncia a antibiticos entre estirpes de Campylobacter spp.: ampicilina (10g), tetraciclina (30g), cloranfenicol (30g), eritromicina (15g), gentamicina (120g,) ciprofloxacina (5g), norfloxacina (5g), cido nalidxico (10g), ofloxacina (5g), amoxicilina+cido clavulnico (20+10g) e trimetoprim-sulfametoxazol (25g) (BioMerieux, Frana). 2.2.3. Teste de susceptibilidade a antibiticos (TSA) O teste de susceptibilidade a antibiticos foi realizado utilizando o mtodo de difuso em disco em agar de Mueller-Hinton suplementado com 5% de sangue de ovelha (BioMerieux, Frana). O inculo foi preparado utilizando colnias frescas das estirpes seleccionadas e diludas em soluto fisiolgico estril de modo a obter um padro de MacFarland 3. A suspenso de Campylobacter spp. obtida foi inoculada superfcie, com auxlio de uma zaragatoa esterilizada, de modo uniforme utilizando malha apertada, nas placas de agar de Mueller-Hinton sangue. As placas foram incubadas a 42C, durante 48 horas em microaerofilia (10% CO2/ 6% O2) produzida por um gerador de microaerofilia (GENbox microaer: BioMerieux, Frana). Posteriormente foram medidos e registados os dimetros dos halos de inibio para cada um dos antibiticos e para cada uma das estirpes analisadas. Staphylococcus aureus 25923 ATCC e Enterococcus faecalis 29212 ATCC foram usados como controlo de qualidade. A categorizao da susceptibilidade foi realizada de acordo com as linhas de orientao dos seguintes documentos Performance Standards for Antimicrobial Disc and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals do National Committee of Clinical Laboratory Standards - NCCLS (2002), Comite de la Antibiogramme de la Societe Franaise de Microbiologie Recomendations 2008 da Societ Franaise de Microbiologie (2008). Figura 7 Halos de inibio apresentados por uma das estirpes de Campylobacter spp. analisadas

35

2.2.4 Anlise estatstica Para o tratamento descritivo dos resultados obtidos nos testes de antibioresistencia e o clculo das percentagens de acordo com a estirpe (C. coli, C. jejuni), a provenincia da amostra (peito, pele de pescoo, intestino) e o bando de origem (1, 2, 3, 4 e 5) foi utilizado o programa Microsoft Office Excel 2007 e SPSS Statistics 17.0. 2.3 APRESENTAO DOS RESULTADOS

Aps a realizao do trabalho laboratorial os dados obtidos foram agrupados tendo em conta vrias perspectivas de modo a possibilitar uma anlise mais abrangente do grupo que deu origem populao amostral. Assim, agruparam-se os dados evidenciando a estirpe (C. coli, C. jejuni), a provenincia da amostra (peito, pele de pescoo, intestino) e o bando de origem (1, 2, 3, 4 e 5). Posteriormente e sob uma perspectiva mais global da amostra organizaram-se os dados de modo a averiguar se haveriam estirpes que apresentavam resistncias mltiplas. Os resultados do trabalho no que diz respeito avaliao da susceptibilidade das estirpes de Campylobacter spp. aos 11 antibiticos avaliados so apresentados na Tabela 6. Nas 78 estirpes de Campylobacter spp. avaliadas foram observados frequncias de resistncia prximas dos 100% para os antibiticos do grupo das fluoroquinolonas. Para antibiticos como ampicilina, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol e eritromicina as estirpes apresentaram nveis de resistncia intermdios. As estirpes demonstraram tambm alguma susceptibilidade amoxicilina potenciada com cido clavulnico uma vez que os nveis de resistncia observados foram baixos. Tal como pode ser averiguado nas tabelas 6,8 e10 de apresentao de resultados nenhuma das estirpes utilizadas neste trabalho demonstrou resistncia nem gentamicina nem ao cloranfenicol. A Tabela 6 permitiu-nos avaliar a susceptibilidade aos antibiticos sob uma perspectiva da estirpe. Assim, dos 49 isolados de C. coli, foram encontrados nveis mais elevados de resistncia para as fluoroquinolonas testadas (norfloxacina, ofloxacina, cido nalidxico e ciprofloxacina). Para este grupo de antibiticos os isolados de Campylobacter coli demonstraram 100% de resistncia. Neste mesmo grupo de isolados, a frequncia de resistncia apresentada foi varivel, 87,76% para a tetraciclina, 83,67% para a ampicilina, 59,18% para o trimetoprim-sulfametoxazol, 46,94% para a eritromicina e 6,12% para a amoxicilina+cido clavulnico. Tal como pode ser observado na Tabela 6, relativamente aos 29 isolados de C. jejuni, os nveis mais elevados de resistncia foram observados para os antibiticos das fluoroquinolonas mas os nveis de resistncia observados foram inferiores aos detectados para as estirpes de C. coli. Ainda relativamente s estirpes de C. jejuni, as frequncias de resistncia aos restantes antibiticos foi varivel, 62,07% para a ampicilina e 36

tetraciclina, 31,03% para o trimetoprim-sulfametoxazol e 20,69% para a eritromicina. Para este grupo de isolados no foram detectadas resistncias para os antibiticos cloranfenicol, gentamicina e amoxicilina + cido clavulnico. Tabela 6 - Nmero e frequncia de estirpes de Campylobacter spp. isoladas em frangos resistentes a vrios antibiticos.
C. coli (n=49) 41 29 49 0 49 23 3 43 49 49 0 % 83,67 59,18 100,00 0,00 100,00 46,94 6,12 87,76 100,00 100,00 0,00 (n=29) 18 9 26 0 27 6 0 18 26 27 0 C. jejuni % 62,07 31,03 89,66 0,00 93,10 20,69 0,00 62,07 89,66 93,10 0,00 (n=78) 59 38 75 0 76 29 3 61 75 76 0 Total % 75,64 48,72 96,15 0,00 97,44 37,18 3,85 78,21 96,15 97,44 0,00

Antibitico Ampicilina Trimetoprimsulfametoxazol Norfloxacina Cloranfenicol Ofloxacina Eritromicina Amoxicilina+ cido clavulnico Tetraciclina Ciprofloxacina cido Nalidxico Gentamicina

A Tabela 7 agrupa os resultados de forma a evidenciar qual a estirpe que tem maior frequncia de isolamento em cada tipo de amostra. A anlise desta tabela permite-nos evidenciar que as estirpes de C. coli so isoladas com uma frequncia semelhante nas amostras testadas (30.62% para amostras de intestino, 36.73% para amostras de peito e 32.65% para amostras de pele de pescoo), enquanto mais de 70% das estirpes de C. jejuni foram isoladas de amostras de peito. Tabela 7 Frequncia de isolamento de C. coli e C. jejuni por tipo de amostra

Amostra Intestino (ceco) Carcaa (pele de pescoo) Peito

C. coli (n=49) 15 16 18 % 30,62 32,65 36,73 3 5 21

C. jejuni (n=29) % 10,34 17,24 72,42 (n=78) 18 21 39

Total % 23,08 26,92 50,00

Na Tabela 8 est evidenciada a resistncia a antibiticos na perspectiva da amostra que deu origem estirpe isolada. Esta tabela permite-nos observar que as 18 amostras de intestino analisadas demonstraram 100% de resistncia s fluoroquinolonas. Nas amostras de pele de pescoo e peito os nveis de resistncia s fluoroquinolonas so igualmente elevados e variam entre 95,24-100% e 94,87-97.44%, respectivamente. As amostras de ceco apresentaram para todos os antibiticos testados um nvel mais elevado de resistncia 37

do que os outros 2 tipos de amostra. As estirpes provenientes de amostras de carcaa apresentaram um nvel de resistncia maior parte dos antibiticos superior em percentagem quando comparadas com as provenientes de amostras de peito. O nvel de resistncia das estirpes provenientes de amostras de peito foi superior ao das estirpes provenientes de amostras de carcaa somente para os antibiticos: eritromicina e cido nalidxico. Tabela 8 Distribuio (%) das estirpes de Campylobacter spp. resistentes de acordo com o tipo de amostra (ceco, pele de pescoo e peito)

Antibitico Ampicilina Trimetoprimsulfametoxazol Norfloxacina Clorampenicol Ofloxacina Eritromicina Amoxicilina+ cido clavulnico Tetraciclina Ciprofloxacina cido Nalidxico Gentamicina

Intestino (ceco) (n=18) 14 14 18 0 18 10 1 16 18 18 0 % 77,78 77,78 100,00 0,00 100,00 55,56 5,56 88,89 100,00 100,00 0,00

Carcaa (pele de pescoo) (n= 21) % 16 9 20 0 21 6 1 17 20 20 0 76,19 42,86 95,24 0,00 100,00 28,57 4,76 80,95 95,24 95,24 0,00

Peito (n=39) 29 15 37 0 37 13 1 28 37 38 0 % 74,36 38,46 94,87 0,00 94,87 33,33 2,56 71,79 94,87 97,44 0,00 (n=78) 59 38 75 0 76 29 3 61 75 76 0

Total % 75,64 48,72 96,15 0,00 97,44 37,18 3,85 78,21 96,15 97,44 0,00

Nas Tabelas 9 e 10 os dados encontram-se organizados de acordo com o bando que deu origem ao isolado. Pelos resultados apresentados na Tabela 9 e 10 podemos caracterizar cada bando quanto frequncia de isolamento de cada uma das estirpes de Campylobacter spp e quanto s resistncias apresentadas para cada um dos antibiticos. Assim, nesta populao de amostras, a frequncia de isolamento de C. coli foi superior frequncia de isolamento de C. jejuni. Esta tabela permite-nos ainda salientar que a frequncia de isolamento de C. coli foi superior em todos os bandos com a excepo do bando 3 onde o isolamento de C. jejuni predominou largamente e do bando 2 onde a frequncia de isolamento de C. coli e C. jejuni foi igual. Da anlise da tabela 10 salientamos que nos bandos 1, 2 e 5 a frequncia de isolados resistentes s fluoroquinolonas foi de 100%. Ainda relativamente a este grupo de antibiticos, isolados do bando 4 apresentaram os valores mais baixos de resistncia. Para a ampicilina foram os bandos 2, 3 e 4 que apresentaram maiores nveis de resistncia. Relativamente ao antibitico trimetoprim-sulfametoxazol, isolados dos bandos 4 e 5 38

apresentaram os maiores nveis de resistncia. O bando 4 destaca-se por apresentar a maior parte das estirpes resistentes eritromicina, o que pode ser observado quando comparamos 52,63% de estirpes resistentes deste bando com o valor apresentado pela totalidade da amostra, 37,18%. No que concerne tetraciclina, o bando 3 destaca-se pois apresentam uma frequncia de isolados resistentes valor acima da mdia da populao amostral. Tabela 9 - Distribuio (%) das estirpes de Campylobacter spp. de acordo com o bando de origem

Estirpe C. coli C. jejuni

1 (n=4) % 4 100 0 0

2 (n=12) 6 6

% 50 50

3 (n=20) 6 14

% 30 70

Bando 4 (n=19) % 16 84,21 3 15,79

5 (n=23) 17 6 % 73,91 26,09

Total (n=78) % 49 62,82 29 37,18

Tabela 10 - Distribuio (%) das estirpes de Campylobacter spp. resistentes de acordo com o bando de origem

Bando Antibitico Ampicilina Trimetoprimsulfametoxazol Norfloxacina Cloranfenicol Ofloxacina Eritromicina Amoxicilina+ cido clavulnico Tetraciclina Ciprofloxacina cido Nalidxico Gentamicina (n=4) 2 0 4 0 4 3 0 4 4 4 0 1 % 50,00 0,00 100,00 0,00 100,00 75,00 0,00 100,00 100,00 100,00 0,00 (n=12) 10 5 12 0 12 0 0 8 12 12 0 2 % 83,33 41,67 100,00 0,00 100,00 0,00 0,00 66,67 100,00 100,00 0,00 (n=20) 17 9 19 0 19 9 1 18 19 20 0 3 % 85,00 45,00 95,00 0,00 95,00 45,00 5,00 90,00 95,00 100,00 0,00 (n=19) 16 11 17 0 18 10 0 16 17 17 0 4 % 84,21 57,89 84,21 0,00 84,21 52,63 0,00 84,21 89,47 89,47 0,00 (n=23) 14 13 23 0 23 7 2 15 23 23 0 5 % 60,87 56,52 100,00 0,00 100,00 30,43 8,70 65,22 100,00 100,00 0,00

Na Tabela 11 pretende-se evidenciar a existncia de estirpes de Campylobacter spp. com resistncia mltipla a antibiticos. A resistncia a todas as fluoroquinolonas um factor que comum a 96,15% dos isolados. Por outro lado a resistncia conjunta s fluoroquinolonas testadas e a tetraciclina uma caracterstica que partilhada por 78,21% dos isolados. Como j foi referido nenhuma das estirpes testadas apresenta resistncia a todos os antibiticos testados. H no entanto 2 estirpes que apresentaram resistncia a todos os antibiticos com a excepo do cloranfenicol e da gentamicina. Estas 2 estirpes correspondem a isolados de C. coli. Quando comparamos as 2 estirpes C. coli e C. jejuni 39

quanto ao padro de multirresistncia verificamos que a C. jejuni tende a ter frequncias de multirresistncia marcadamente inferior aos da C. coli em todos os tipos de multirresistncia avaliados. Podemos ainda salientar que muitas das estirpes de C. coli apresentaram resistncia simultnea s fluoroquinolonas e eritromicina, antibiticos utilizados muitas vezes no tratamento de infeces por estas bactrias em humanos (Allos, 2001). O mesmo tambm pode ser encontrado em estirpes de C. jejuni mas em frequncias

significativamente mais baixas. Tabela 11 - Distribuio (%) das estirpes de Campylobacter spp. que apresentam resistncia a vrios antibiticos

Multirresistncia
NA, CIP NA, CIP, NOR NA, CIP, NOR, OFX NA, CIP, NOR, OFX, ERI NA, CIP, NOR, OFX, TETRA NA, CIP, NOR, OFX, ERI, AM NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA, AMC NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA, AM NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA, STX NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA, AM, STX NA, CIP, NOR, OFX, ERI, TETRA, AMC, AM, STX Todos os antibiticos testados

C. coli (n=49) 49 49 49 23 43 21 23 2 21 13 11 2 0 % 100,00 100,00 100,00 46,94 87,76 42,86 46,94 4,08 42,86 26,53 22,45 4,08 0,00

C. jejuni (n=29) 26 26 26 6 18 6 5 0 5 2 2 0 0 % 89,66 89,66 89,66 20,69 62,07 20,69 17,24 0,00 17,24 6,90 6,90 0,00 0,00 75 75 75 29 61 27 28 2 26 15 13 2 0

Total (n=78) % 96,15 96,15 96,15 37,18 78,21 34,62 35,90 2,56 33,33 19,23 16,67 2,56 0,00

2.4 DISCUSSO

A produo animal moderna cria condies favorveis para a emergncia e para a disseminao de bactrias zoonticas como as do gnero Campylobacter spp. A utilizao de grandes quantidades de antibiticos como agentes teraputicos para o controlo de infeces tende a seleccionar estirpes de bactrias zoonticas resistentes aos antibiticos utilizados colocando em risco a sade do ser humano (Aarestrup & Engberg, 2001). Esta tendncia tem vindo a difundir-se e parece continuar a aumentar. Este estudo fornece alguns dados que permitem caracterizar a situao portuguesa actual no que diz respeito resistncia de estirpes de Campylobacter spp., isoladas de amostras de frango broiler na linha de um matadouro, a um grupo de antibiticos.

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Os nveis de antibiorresistncia observados neste estudo so alarmantes. Foram detectados elevados nveis de resistncia das estirpes para os antibiticos do grupo das fluoroquinolonas e em apenas 2 dos 11 antibiticos testados no foram detectadas resistncias (cloranfenicol e gentamicina). Os resultados deste estudo incluram-se apenas isolados de frangos provenientes de exploraes de carcter intensivo e parecem reflectir os obtidos por outros estudos nomeadamente os recentemente realizados em Portugal (Gomes et al., 2009). Aquando da anlise dos resultados na perspectiva do bando de origem verificamos que existe um padro para cada um dos bandos. Se analisarmos a tabela 10 rapidamente se cria a percepo que no bando 2 que se verifica a maior frequncia de isolados resistentes. Ainda nesta tabela verificamos que no mesmo bando 100% das estirpes foram resistentes a qualquer uma das 4 fluoroquinolonas testadas. J no bando 4 foram detectados os menores valores de resistncia para as fluoroquinolonas e que esse valor variou dependendo do tipo de fluoroquinolona testada. Estas diferenas de ocorrncia de estirpes resistentes entre bandos poder estar relacionada com o uso de agentes antimicrobianos na explorao de origem dos frangos (Luangtongkum et al., 2006). O maior ou o menor uso destes agentes cria uma presso de seleco bacteriana onde somente as estirpes capazes de sobreviver aos antibiticos utilizados sero capazes de transmitir as caractersticas de resistncia descendncia (Rner et al., 2004). Os resultados apresentados na Tabela 3 e 4 permitem-nos concluir que as caractersticas de antibiorresistncia e as estirpes de Campylobacter spp. so diferentes em cada um dos bandos analisados. H bandos como o 1, 4 e 5 onde clara a predominncia de C. coli e outros como o bando 3 onde indiscutvel a predominncia de C. jejuni. interessante observar que, apesar de este bando ser constitudo maioritariamente por C. jejuni e de vrios autores referirem que C. coli apresenta geralmente maiores percentagens de estirpes resistentes (Engberg et al., 2001; Yan et al., 2005), ele no apresenta menores frequncias de estirpes com resistncia a antibiticos comparativamente a outros bandos. Relativamente antibiorresistncia apresentada pelas estirpes de Campylobacter spp., os resultados variaram consoante o antibitico testado. Os resultados obtidos neste trabalho sobre antibiticos do grupo das fluoroquinolonas tendem a confirmar o que j est documentado por outros estudos realizados noutros pases, isto , as estirpes de Campylobacter spp. testadas apresentam um elevado nvel de resistncia s fluoroquinolonas (Aarestrup & Engberg, 2001; Andersen et al., 2006; Engberg et al., 2001; EFSA, 2005; Fallon et al.; MSFFG, 2007; Rner et al., 2004; Senz et al., 2000; Yan et al., 2005). O presente estudo apresentou resultados de 100% de resistncia para C. coli e frequncias de resistncia que variam entre 89,66% e 93,10% para C. jejuni, resultados similares aos documentados em Espanha por Senz et al. (2000), onde foram reportadas 98,7% e 100% de resistncia a fluoroquinolonas em isolados de C. jejuni e C. coli. em 41

amostras de frango. A frequncia encontrada no nosso estudo de resistncia a fluoroquinolonas foi maior para C. coli do que para C. jejuni indo tambm de encontro ao reportado por vrios autores (Aarestrup & Engberg, 2001; Andersen et al., 2006; Engberg et al., 2001; EFSA, 2005; Fallon et al.; MSFFG, 2007; Rner et al., 2004; Yan et al., 2005). A frequncia de resistncia a fluoroquinolonas maior em amostras colhidas do intestino dos frangos. Este facto poder estar relacionado com uma maior presso selectiva das bactrias existentes ao nvel do trato gastrointestinal aquando da ingesto de alimento medicado. Luangtongkum et al. (2006) observou, semelhana do que foi descrito para as tetraciclinas, que existiam bandos onde nunca foram utilizadas fluoroquinolonas mas que os nveis de resistncia para este tipo de antibitico eram muito similares aos encontrados em bandos onde existia um histrico de utilizao deste antibitico no passado. Assim, a utilizao por si s de antibiticos numa explorao avcola poder no ser o nico factor responsvel pelo aparecimento de estirpes de bactrias resistentes a fluoroquinolonas (Luangtongkum et al., 2006). Estas observaes sugerem que a populao de Campylobacter spp. resistentes estvel e capaz de ser transmitida entre bandos, persistindo nos mesmos, mesmo na ausncia da presso selectiva causada pelo uso de fluoroquinolonas na explorao. O conjunto de dados que o estudo de Luangtongkum et al. (2006) fornece revela a complexidade que inerente ocorrncia e disseminao de padres de antibiorresistncia de estirpes de Campylobacter spp. Mais, fica o alerta para as dificuldades que se iro sentir em tentativas de eliminao ou diminuio da frequncia de estirpes de Campylobacter spp. resistentes s fluoroquinolonas. O nvel de resistncia das estirpes testadas para a ampicilina foi muito elevado, 75,64%, resultados superiores aos observados em estudos realizados noutros pases (Andersen et al., 2006; Engberg et al., 2001;Fallon et al.; Rner et al., 2004). A resistncia de estirpes de Campylobacter spp. a este antibitico est relacionada com a produo de lactamases por muitas das estirpes de Campylobacter spp., no entanto, outros mecanismos de resistncia ampicilina podem ocorrer em simultneo como a modificao das protenas de ligao de penicilinas e cefalosporinas e, consequentemente a impermeabilidade da bactria a este antibitico. A existncia de uma bomba de efluxo de antibiticos para o exterior das bactrias pode ser considerado um terceiro mtodo de resistncia aos antibiticos -lactmicos (Fallon et al., 2003; Yan et al., 2005). Verificmos que a percentagem de isolados resistentes entre os diferentes locais de colheita da amostra no foi diferente,sendo contudo maior para isolados de C. coli do que para os de C. jejuni. Observou-se que o bando 5 apresentou uma percentagem de estirpes resistentes ampicilina inferior dos restantes bandos. Estes resultados podero reflectir a elevada utilizao de antibiticos -lactmicos na maior parte dos bandos estudados o que originou um aumento da presso selectiva sobre as estirpes que no possuem resistncia a estes antibiticos. 42

De um modo geral, ampicilina e outros -lactmicos no esto recomendados para o tratamento de infeces por Campylobacter spp. devido elevada frequncia de isolados resistentes a esta famlia de antibiticos (Fallon et al., 2003). Se compararmos a percentagem de resistncia de ambos os antibiticos -lactmicos testados no estudo, ampicilina 75,64% e amoxicilina+cido clavulnico 3,85%, verificamos que a potenciao da amoxicilina com cido clavulnico permite diminuir significativamente a percentagem de estirpes resistentes a este grupo de antibiticos. Todas as estirpes de C. jejuni foram sensveis amoxicilina + cido clavulnico e a frequncia de resistncia apresentada pelas C. coli foi baixa, 6,12%. Este estudo no revelou estirpes de Campylobacter spp. resistentes ao cloranfenicol ou gentamicina sendo coincidente com os resultados apresentados por outros autores (Fallon et al., 2003; Luangtongkum et al., 2006; Rner et al., 2004). No entanto, Senz et al. (2000) referenciaram que os nveis de resistncia gentamicina entre as estirpes de Campylobacter spp. isoladas de frangos em Espanha foi de 25%. Os baixos nveis de resistncia apresentados pelos isolados no presente trabalho para a gentamicina podero ser justificados pelo facto deste antibitico no ser utilizado por rotina na produo de frangos uma vez que normalmente utilizado na forma injectvel pois a sua absoro no trato gastrointestinal muito reduzida. Assim, e uma vez que as Campylobacter spp. colonizam o intestino, a rara utilizao da gentamicina permite que a presso selectiva neste tipo de bactrias seja baixa conferindo baixas frequncias de resistncia a este antibitico. O mesmo acontece com o cloranfenicol. Em Portugal, o uso deste antibitico no permitido em produo animal da que no tenham sido observados casos de estirpes resistentes. As tetraciclinas eram referidas no passado como uma alternativa teraputica para o tratamento de infeces por Campylobacter spp. em humanos. Vrios autores referem que eram tambm utilizadas escala mundial, tanto em doses teraputicas como em doses subteraputicas, em alimentos para animais de produo (Aarestrup & Engberg et al., 2001, Allos et al., 2001; Fallon et al., 2003; World Health Organization [WHO], 2001). Neste estudo foram detectados nveis de resistncia a tetraciclina na ordem dos 78,21% para a globalidade da amostra e 87,76% entre as estirpes de C. coli e 62,07% entre as de C. jejuni. Uma vez mais a percentagem de resistncia foi maior entre as estirpes de C. coli. Observando os resultados obtidos na perspectiva da amostra que lhes deu origem verificamos que a percentagem de estirpes isoladas de intestino apresentaram um valor de resistncia maior do que as amostras com outra origem. Este facto poder ser justificado pela utilizao deste tipo de antibiticos na forma de alimento medicado expondo a flora gastrointestinal dos frangos a uma presso selectiva muito grande, o que originou um grande nmero de estirpes resistentes (Luangtongkum et al., 2006). Podemos ainda observar que o padro de resistncia tetraciclina bastante diferente entre os bandos 43

estudados. Infelizmente no nos foi possvel obter o histrico de utilizao de antibiticos na explorao de origem do bando, o que no nos permite relacionar os dados obtidos no estudo com uma maior ou menor utilizao de determinado tipo de antibiticos. Vrios estudos revelaram que estirpes de Campylobacter spp. resistentes s tetraciclinas no so exclusivas das produes avcolas, tendo sido tambm detectadas em exploraes de vacas leiteiras (Luangtongkum et al., 2006). Alm disso, foram detectadas estirpes de Campylobacter spp. resistentes a tetraciclina em exploraes avcolas de produo biolgica onde nunca tinham sido utilizados este tipo de antibiticos. Luangtongkum et al. (2006) referem que uma vez que as tetraciclinas foram utilizadas durante dcadas como aditivos alimentares tanto em doses teraputicas como em doses subteraputicas, possvel que ao longo do tempo, algumas estirpes de Campylobacter spp. possam ter evoludo no sentido de ter adquirido resistncia intrnseca que transmitem verticalmente entre geraes, originado a disperso deste tipo de bactrias por vrios tipos de exploraes animais. O padro de resistncia que foi observado para a tetraciclina similar ao observado para o trimetoprim-sulfametoxazol, quando observamos os vrios tipos de amostra, apesar dos nveis de resistncia tetraciclina serem superiores aos observados para o trimetoprimsulfametoxazol. Para este ltimo antibitico, detectamos nveis de resistncia na ordem dos 48,72% para a globalidade da amostra e 46,94% entre as estirpes de C. coli e 20,69% entre as de C. jejuni. Uma vez mais foram detectados nveis de resistncia superiores para C. coli. Observando os resultados obtidos na perspectiva da amostra que deu origem estirpe verificamos que a percentagem de estirpes isoladas de intestino foi maior do que as amostras com outra origem. Ocorreram tambm algumas diferenas entre os bandos de origem das estirpes. A eritromicina considerada pelos vrios autores consultados o agente teraputico de eleio para o tratamento de infeces por Campylobacter spp. (Engberg et al., 2001; Luangtongkum et al., 2006). Neste estudo para os isolados de Campylobacter spp. foram detectados nveis de resistncia para a eritromicina na ordem dos 37,18% sendo resistentes e 46,94% entre as estirpes de C. coli e 20,69% as de C. jejuni. Tal como foi constatado por estudos realizados noutros pases (Fallon et al., 2003; Luangtongkum et al., 2006; Rner et al., 2004; Senz et al., 2000), observamos que a percentagem de resistncia foi maior para as estirpes de C. coli. Os resultados obtidos na perspectiva da amostra que lhes deu origem permitiram aferir que a percentagem de estirpes isoladas de intestino foi maior do que as amostras com outra origem. Estas observaes podem ser justificadas pela possvel utilizao de eritromicina na forma de alimento medicado expondo a flora gastrointestinal dos frangos a uma presso selectiva muito grande, o que originou um grande nmero de estirpes resistentes.

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Os primeiros sinais de estirpes resistentes eritromicina surgiram ainda nos anos 90 e, de modo a travar a disseminao desta tendncia foi banido, desde Julho de 1999, o uso de macrlidos como promotores de crescimento, nos pases pertencentes UE. (Fallon et al., 2003; Senz et al., 2000). Pezzotti et al. (2003) referem que em Itlia a percentagem de estirpes resistentes para eritromicina era de 3,1% para a C. jejuni e 45% para C. coli, resultados similares aos obtidos no presente estudo para as estirpes de C. coli. Num estudo realizado na Sucia por Rnner et al. (2004) observou-se que nenhuma das 100 estirpes isoladas de frangos e testadas para a eritromicina demonstraram resistncia. Na Dinamarca, Ardersen et al. (2006) obtiveram resultados semelhantes. Estudos como o realizado por Rner et al., 2004 demonstraram que o enveredar por polticas onde se restringe o uso de antibiticos na produo animal poder resultar numa diminuio drstica da prevalncia de estirpes de Campylobacter spp. resistentes a antibiticos. Este estudo foi realizado na Sucia, onde a proibio da utilizao de antibiticos como promotores de crescimento nas exploraes pecurias existe desde 1986, e demonstrou claramente que a maior prevalncia de estirpes resistentes a antibiticos provm de pacientes que viajaram para fora da Sucia, nomeadamente para o sudeste da Europa e para a Tailndia. Alm disso, as medidas preventivas implementadas neste pas podem ter contribudo para a baixa prevalncia de estirpes resistentes a antibiticos como as fluoroquinolonas e tetraciclinas, tanto provenientes de amostras colhidas em frangos como em amostras colhidas de humanos com campilobacteriose (33% no ano de 2004) (Rner et al., 2004). Voltando ao caso da eritromicina, o padro de antibiorresistncia para este antibitico varivel entre os pases europeus enquanto em pases nrdicos parece existir uma tendncia para a diminuio ou mesmo desaparecimento de estirpes de Campylobacter spp. resistentes a este antibitico. Em Portugal, interessa apostar na epidemiovigilncia de modo a verificar se a tendncia para a diminuio ou para o aumento de estirpes de Campylobacter spp. resistentes eritromicina uma vez que interessa manter esta alternativa teraputica para as infeces graves causadas por esta bactria. No grupo de estirpes testado verificou-se que a frequncia de isolamento de C. coli foi maior que a de C. jejuni, tal como ocorreu num estudo realizado na Itlia mas contrariando a tendncia encontrada na maioria dos estudos referenciados (Pezzoti et al., 2003). Este estudo partiu de amostras com estirpes j identificadas tendo sido caracterizada a frequncia de Campylobacter spp. na populao por Fraqueza et al. (2009). Neste estudo verificmos que o padro de antibiorresistncia para C. jejuni diferente do padro observado para a C. coli. Tal como verificado por Pezzotti et al. (2004), Aarestrup e Engberg (2001) e por Senz et al. (2000), as estirpes de C. coli apresentam um nvel mais elevado de resistncia para todos os antibiticos testados. Aquando da avaliao da resistncia em simultneo para um grupo de frmacos, verificmos que para qualquer das combinaes 45

testada a percentagem de resistncia das estirpes de C. coli foi sempre superior das C. jejuni. Mais, 2 das 78 estirpes testadas apenas demonstraram susceptibilidade gentamicina e ao cloranfenicol. Estas estirpes representam 2 isolados de C. coli. O padro de multirresistncia observado ao nvel das estirpes de C. coli poder estar relacionado com a presso selectiva exercida no global da populao. Assim, os dados podero indicar que uma maior frequncia de isolamento para uma estirpe poder estar associada a um maior nmero de bactrias sujeitas h mesma presso selectiva o que ter como consequncia uma maior percentagem de estirpes resistentes a vrios antibiticos (Lungtonghum et al., 2006). Esta teoria dever ser testada em estudos posteriores onde ser avaliada inicialmente a prevalncia para cada uma das estirpes a serem posteriormente testadas quanto antibiorresistncia. A resistncia em simultneo a vrios tipos de antibitico considerada relativamente rara (Fallon et al., 2003). Quando existe, pensa-se que esteja relacionada com a presena de uma bomba no selectiva que permita o fluxo dos antibiticos para o exterior da bactria (Fallon et al., 2003). Num estudo realizado durante 2002, foi identificada e caracterizada uma C. jejuni que continha uma bomba de fluxo de frmacos para o exterior codificada no gene cme B. Quando a mesma bactria no possua o gene cme B verificava-se um aumento da susceptibilidade da estirpe para ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina e tetraciclina, que variava entre 2 e 4 vezes (Fallon et al., 2003). No estudo verificmos que 96,15% das estirpes testadas demonstraram resistncia a pelo menos 4 antibiticos. Como j foi referido acima, 2 isolados de C. coli demonstraram resistncia a 9 dos antibiticos testados. Estas 2 estirpes devero ser sujeitas a uma anlise cuidada de modo a determinar qual o mecanismo de resistncia por elas apresentado. Neste trabalho foi recolhido um grande nmero de amostras num nico matadouro. O perodo de recolha de amostras foi alargado o que permitiu a recolha de amostras de vrios bandos provenientes de diferentes produtores. Apesar disso, e devido a constrangimentos financeiros e de tempo, este estudo utilizou apenas 78 amostras de entre muitas que poderiam ter sido testadas. Estas amostras foram seleccionadas aleatoriamente e somente depois foram caracterizadas quanto ao tipo de amostra que deu origem ao isolado, quanto ao bando de origem e quanto estirpe de Campylobacter spp. isolada. Este critrio de seleco foi utilizado no sentido de poder extrapolar os resultados obtidos para as restantes amostras e ao mesmo tempo definir o melhor desenho para estudos futuros envolvendo as restantes amostras. No que concerne a estudos futuros, a avaliao da antibiorresistncia poder ser realizada utilizando um menor nmero de antibiticos de modo a facilitar o trabalho laboratorial e a aumentar o nmero de amostras a serem processadas. Uma vez que 100% das estirpes utilizadas demonstraram o mesmo padro de antibiorresistncia para as 4 fluoroquinolonas utilizadas, de futuro poderia ser utilizado apenas um antibitico deste mesmo grupo. Das estirpes que mostraram susceptibilidade a alguma das fluoroquinolonas 46

todas correspondiam a isolados de C. jejuni. Atendendo a este facto e consultando bibliografia recente, onde se utiliza a ciprofloxacina na maior parte dos estudos, numa futura extenso deste trabalho s restantes amostras disponveis, na nossa opinio poder ser testado apenas um antibitico do grupo das fluoroquinolonas . Uma vez que para os antibiticos cloranfenicol e gentamicina no foi detectada nenhuma estirpe resistente, os mesmos podero no ser utilizados no seguimento deste estudo. Assim, e utilizando o teste de difuso em disco, numa futura extenso deste estudo utilizaria 6 antibiticos (ciprofloxacina, ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, eritromicina, amoxicilina+cido clavulnico e tetraciclina) antecipando a utilizao de uma nica placa de Petri por estirpe testada e incluindo os antibiticos para onde foram detectados diferentes padres de resistncia quando analisados os dados nas vrias perspectivas (bando de origem, tipo de amostra, estirpe de Campylobacter spp.) de modo a melhor caracterizar a populao amostral em cada uma das suas vertentes. A realizao de testes de susceptibilidade a antibiticos em bactrias com os requisitos de crescimento to especficos como os das estirpes de Campylobacter spp. ainda no se encontra padronizado o que torna por vezes difcil escolher qual a melhor metodologia de avaliao e os critrios para interpretao dos resultados obtidos. Entidades como o CLSI esto actualmente a trabalhar para fornecer tais orientaes. Esta padronizao da maior relevncia visto que a monitorizao dos padres de antibiorresistncia e a sua evoluo baseada na comparao de dados que deveriam ser obtidos utilizando um protocolo laboratorial semelhante. Importa referir que o Comite de lantibiogramme de la Societe Francaise de Microbiologie emitiu recomendaes em 2008 especficas para Campylobacter spp. que foram j foram seguidas para a realizao deste trabalho. O CLSI reconhece para alm do mtodo de diluio em agar como mtodo padro o mtodo de difuso em disco, para a avaliao in vitro da susceptibilidade a antibiticos em estirpes de Campylobacter spp. (CLSI, 2006; Luangtongkum, et al., 2007; McDermott et al., 2005). No entanto, este mtodo necessita que se invista muito tempo na execuo da tcnica laboratorial, alm de necessitar de equipamento especfico e de experincia na execuo de tcnicas laboratoriais mais complexas. Apesar das desvantagens

apresentadas, so tambm apontadas vantagens utilizao deste mtodo, nomeadamente o ser considerado um mtodo fivel, produzir dados facilmente reprodutveis e originar MIC quantitativas. Como alternativa a este mtodo surge o teste de difuso em disco que caracterizado por utilizar uma tcnica laboratorial de fcil execuo ao mesmo tempo que consome menos recursos financeiros comparativamente aos testes de diluio. Alm disso, estudos recentes demonstram que pode produzir resultados reprodutveis se utilizada uma tcnica laboratorial padronizada e os controlos de qualidade correctos. Luangtongkum et al. (2007) revelaram que existe um elevado nvel de correlao entre os dados obtidos pelo mtodo de diluio em agar e o mtodo de difuso em disco para aminoglicosdeos e 47

fluoroquinolonas. Revelou ainda que o grau de correlao para outros antibiticos testados como a ampicilina, a tetraciclina e a eritromicina relativamente baixo. 2.5 CONCLUSES

De acordo com a amostra e bando de origem das estirpes e o presumvel maior ou menor uso de agentes antimicrobianos na explorao podem ser observados diversos padres de resistncia antimicrobiana. Foi detectada uma elevada frequncia de resistncia a fluoroquinolonas entre as estirpes de Campylobacter spp. testadas, em particular para as estirpes de C. coli (100% de resistncia a norfloxacina, ofloxacina, cido nalidxico e ciprofloxacina). Mais de 60% das estirpes isoladas demonstraram resistncia a tetraciclinas e ampicilina. Neste estudo, C. coli demonstrou frequncia de resistncia superiores para eritromicina (46.9%) que as estirpes de C. jejuni (20.7%). Quase todas as estirpes isoladas demonstraram susceptibilidade amoxicilina potenciada com cido clavulnico. Os antibiticos cloranfenicol e gentamicina demonstraram serem activos contra as estirpes de Campylobacter spp. testadas. Relativamente aos bandos estudados, podmos verificar que a frequncia de resistncia aos diferentes antibiticos testados foi diferente para cada um dos bandos, o que poder estar relacionado com o uso mais ou menos frequente de antibiticos ao nvel da explorao de origem. Os resultados obtidos relativos s estirpes resistentes s fluoroquinolonas e h j grande percentagem de resistncia apresentada por C. coli eritromicina preocupante uma vez que para alm de o consumo de alimentos contaminados por Campylobacter spp. colocarem em risco a sade do consumidor poder ser cada vez maior o desafio de tratar pessoas com infeco por este tipo de bactrias. Perante este cenrio, impe-se um uso cada vez mais restritivo de antibiticos ao nvel das exploraes pecurias portuguesas e ao mesmo tempo a criao de mecanismos de vigilncia epidemiolgica onde seja caracterizado o padro e a evoluo da resistncia antimicrobiana e da prevalncia de estirpes de Campylobacter spp. Este sistema de epidemiovigilncia deveria estender-se a todos os pontos da cadeia alimentar assim como a amostras recolhidas em humanos infectados com esta patologia, de modo a caracterizar a situao portuguesa no que diz respeito a esta doena e ao mesmo tempo criar estratgias de controlo devidamente fundamentadas nestes dados com o objectivo de travar a evoluo desta zoonose. Alm disso, os mecanismos de vigilncia epidemiolgica devero utilizar critrios semelhantes aos utilizados nos restantes pases da Unio Europeia de modo a contextualizar a situao portuguesa no seio de uma Europa onde muitas vezes as tendncias so diferentes da realidade nacional.

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2.6 PERSPECTIVAS FUTURAS

notrio o realce que dado aos frangos como o principal factor de risco associado ao aparecimento de campilobacteriose em humanos (EFSA, 2009). Na nossa opinio, e uma vez que a situao portuguesa ainda no est devidamente caracterizada, seria interessante estender este estudo a outro tipo de exploraes pecurias envolvendo a caracterizao da situao tanto em matadouros como nas exploraes de origem dos animais. Assim, as suiniculturas, as exploraes de bovinos de corte, as exploraes leiteiras (bovinos, ovinos e caprinos) portuguesas necessitam de ser caracterizadas quanto prevalncia de estirpes de Campylobacter spp. com potencial patognico e quanto caracterizao do padro de antibiorresistncia, sendo que no caso das exploraes leiteiras o estudo deveria caracterizar tanto a populao animal como o leite. Seria ainda interessante comparar os resultados obtidos com a situao encontrada para os isolados recolhidos ao nvel bandos de broilers analisados ao nvel da explorao. Alm disso, seria relevante avaliar os mesmos parmetros nos produtos de origem animal comercializados pelos grupos de distribuio alimentar portugueses de modo a verificar as caractersticas das estirpes de Campylobacter spp. a que os consumidores portugueses esto realmente expostos. De modo a acompanhar todo o trajecto que este microrganismo pode percorrer, seria importante envolver os mdicos portugueses nestes estudos. A caracterizao das estirpes isoladas em pacientes com campilobacteriose e do padro de antibiorresistncia apresentado pelo microrganismo responsvel por esta patologia s ser possvel com a colaborao destes profissionais de sade. Nesta fase seria importante caracterizar as estirpes que originam os casos mais graves de campilobacteriose, nomeadamente quando necessrio recorrer ao internamento ou quando a infeco culmina com a morte do paciente. Muitos dos estudos que referimos anteriormente tm vindo a ser realizados em vrios pases mas na maior parte deles no se contemplam todas as fases citadas. Na nossa opinio, seria interessante criar um sistema de epidemiovigilncia efectivo em Portugal onde se produzissem dados acerca da prevalncia de Campylobacter spp. e dos seus padres de antibiorresistncia, onde fossem produzidos e analisados dados em todos os pontos da cadeia alimentar acima referidos, assim como em humanos j infectados com esta patologia, de modo a caracterizar a situao portuguesa no que diz respeito a esta doena e ao mesmo tempo criar estratgias de controlo devidamente fundamentadas nestes dados com o objectivo de travar a evoluo desta zoonose.

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